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Aus dem Institut für Experimentelle und Klinische Pharmakologie und Toxikologie
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Prof. Dr. med. Martin F. Fromm
ATP-Binding Cassette (ABC)-Transporter im humanen Myokard: Expressionsänderungen bei Herzinsuffizienz
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von Barbara Paulus
aus Ulm
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. J. Schüttler Referent: Priv.-Doz. Dr. O. Zolk Koreferent: Prof. Dr. M.F. Fromm Tag der mündlichen Prüfung: 01. August 2012
Für meinen Großvater
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung 6
2 Einleitung 8
2.1 Die Superfamilie der ABC-Transporter 8
2.1.1 Definition, Aufbau und Struktur 8
2.1.2 Die Superfamilie der ABC-Transporter und ihre pathophysiologische Bedeutung
10
2.1.2.1 ABCA-Familie 11 2.1.2.2 ABCB-Familie 11 2.1.2.3 ABCC-Familie 12 2.1.2.4 ABCD-Familie 15 2.1.2.5 ABCE und ABCF-Familie 15 2.1.2.6 ABCG-Familie 16
2.2 Herzinsuffizienz 18
2.2.1 Definition, Einteilung und Ursachen 18
2.2.2 Kardiomyopathien als Ursache einer Herzinsuffizienz 19 2.2.2.1 Dilatative Kardiomyopathie 19 2.2.2.2 Ischämische Kardiomyopathie 20
2.2.3 Die neurohumeralen Mechanismen in der Herzinsuffizienz – Die Bedeutung der natriuretischen Peptide ANP und BNP
20
2.2.4 Therapieprinzipien einer Herzinsuffizienz 21
2.3 ABC-Transporter am Herzen und ihre Bedeutung 23
3 Zielsetzung der Arbeit 25
4 Material und Methoden 26
4.1 Gewebeproben 26
4.2 Quantitative Real-time (TaqMan) RT-PCR 28
4.2.1 RNA-Isolierung 28
4.2.2 Reverse Transkription 29
4.2.3 Real-time PCR, Auswertung 29
4.2.4 Gelelektrophorese 32
4.3 Westernblot 32
4.3.1 Membranprotein-Extraktion 32
4.3.2 Elektrophorese, Elektrotransfer und Immunoblot 33
4.4 Zellkultur und stabile Transfektion von HEK- und MDCK-Zellen 34
4.5 Immunfluoreszenz-Färbung von Gewebeschnitten und MDCK-Zellen 34
4.6 FACS-Analyse 35
4.7 Transportassay 36
4.8 Statistische Auswertung 37
5 Ergebnisse 38
5.1 Die Expression der ABC-Transporter: Vergleich zwischen Herzgewebe
und extrakardialen Geweben
38
5.2 Die Expression der ABC-Transporter: Vergleich zwischen gesundem
und insuffizientem Myokard
41
5.2.1 Expressionsunterschiede auf mRNA-Ebene 41 5.2.1.1 ANP 41 5.2.1.2 ABCA-Familie 43 5.2.1.3 ABCB-Familie 44 5.2.1.4 ABCC-Familie 45 5.2.1.5 ABCD-, ABCE-, ABCF- und ABCG-Familie 46
5.2.2 Proteinexpression 48 5.2.2.1 ABCC5 48 5.2.2.2 ABCC7 50 5.2.2.3 ABCC8 51 5.2.2.4 ABCG2 52
5.2.3 Immunfluoreszenz 53 5.2.3.1 ABCC7 53 5.2.3.2 ABCC8 54 5.2.3.3 ABCG2 54
5.3 Die Transportfunktion von ABCG2 55
6 Diskussion 63
6.1 Fragestellung 63
6.2 Kardiale mRNA-Expression der ABC-Transporter 63
6.3 ABCC7 und seine Bedeutung für die Entstehung von Arrhythmien 65
6.4 Die Bedeutung der kardialen ATP abhängigen Kalium-Kanäle 66
6.5 ABCC5 und ischämische Präkonditionierung 67
6.6 ABCG2 und seine Transportfunktion 68
7 Literaturverzeichnis 71
8 Abkürzungsverzeichnis 87
9 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 90
10 Anhang 91
11 Danksagung 106
12 Lebenslauf 107
6
1 Zusammenfassung
Hintergrund und Ziele: ATP-Binding Cassette (ABC)-Transporter sind am
energieabhängigen transmembranären Export verschiedenster Substanzen aus der Zelle
beteiligt. Sie limitieren dadurch z.B. die Aufnahme von Xenobiotika ins Gewebe.
Einige ABC-Proteine sind Bestandteil von Ionenkanälen, wie dem Cystic Fibrosis
Transmembrane Conductance Regulator- (CFTR-) Chloridkanal oder dem KATP-
Kaliumkanal. Die Expression und physiologische Relevanz der meisten ABC-
Transporter im menschlichen Herzen ist bislang unbekannt. Daher wurde das
Expressionsmuster der 48 bisher klonierten funktionellen ABC-Transporter im
linksventrikulären Myokard von gesunden Spenderherzen und von explantierten
insuffizienten Herzen untersucht. Die Arbeitshypothese war, dass ABC-Transporter in
relevantem Ausmaß im menschlichen Herzen exprimiert werden und ihre
Expressionsänderung im insuffizienten Myokard eine pathophysiologische Bedeutung
haben könnte.
Methoden: Die Genexpression aller 48 menschlichen ABC-Transporter im
linksventrikulären Myokard und in nicht-kardialen Geweben wurde mittels real-time
RT-PCR quantifiziert. Die Gewebeproben stammten von 11 gesunden Spenderherzen
und von 20 explantierten insuffizienten Herzen (NYHA III-IV). Zum Vergleich wurden
ferner humane Gewebeproben von Plazenta, Gehirn, Niere und Leber untersucht. Die
Proteinexpression wurde mittels Western-Blot bestimmt. Zur Untersuchung der
Transportfunktion des Breast Cancer Resistance Proteins (BCRP, ABCG2) wurde
humanes ABCG2 in der polarisiert wachsenden epithelialen Madin-Darby canine
kidney (MDCKII) Zelllinie durch stabile Transfektion rekombinant überexprimiert.
Ergebnisse: Bis auf ABCC6 und ABCB11 konnten Transkripte aller Transporter im
Myokard nachgewiesen werden. Die Expression des ABCC7/CFTR-Chloridkanals war
auf mRNA- und Proteinebene in insuffizienten Herzen im Vergleich zu gesunden
Spenderherzen signifikant vermindert, während die Expression von ABCC8/SUR1, der
regulatorischen Untereinheit der KATP-Kanäle, und von ABCG2/BCRP, eine
Effluxpumpe für Xenobiotika, signifikant erhöht war. Im Vergleich zu gesunden
Spenderherzen war in insuffizienten Herzen die ABCG2 mRNA 3,8-fach (p<0,001) und
das BCRP Protein 2,0-fach (p<0,05) erhöht. Der PPAR-gamma-Agonist Rosiglitazon
konnte als neues Substrat und Inhibitor von BCRP identifiziert werden. Dagegen
7
zeigten in-vitro-Experimente in BCRP-überexprimierenden MDCKII-Zellen keinen
BCRP-abhängigen Transport der herzwirksamen Substanzen Aldosteron, Metoprolol,
Bisoprolol, Propranolol und Digoxin.
Schlussfolgerung: Die Expression fast aller ABC-Transporter im Herzen unterstreicht
ihre Bedeutung für dortige physiologische Vorgänge. Der Verlust von CFTR-Kanälen
und die veränderte Expression von SUR1 bei der Herzinsuffizienz trägt möglicherweise
zu einer veränderten Leitfähigkeit der CFTR Chlorid- und KATP Kaliumkanäle bei und
könnte somit das Risiko des Auftretens von kardialen Arrhythmien erhöhen. Die
veränderte Expression von Exportpumpen für Xenobiotika, wie BCRP, könnte einen
Einfluss auf die Aufnahme und Verteilung von Arzneistoffen im Herzen haben.
8
2 Einleitung
2.1 Die Superfamilie der ABC-Transporter
2.1.1 Definition, Aufbau und Struktur
ATP-Binding Cassette Transporter (ABC-Transporter) sind eine Gruppe von
Transmembranproteinen, die eine große Bandbreite an Substraten unter ATP-Verbrauch
gegen einen Konzentrationsgradienten über Zellmembranen transportieren. Bisher
konnten 48 humane ABC-Transporter genetisch identifiziert werden und die meisten
von ihnen sind zwischen den verschiedenen Spezies hochkonserviert (Linton et al.,
2007). Diese Transporter werden anhand ihrer Genstruktur, Aminosäurenabfolge und
phylogenetischen Analyse (Abb. 2.1) in sieben Subfamilien (A bis G) unterteilt.
Abbildung 2.1: Phylogenetischer Baum der humanen ABC-Transporter (Torky, 2005)
Viele dieser Transporter führen mittels ihrer Eigenschaft des Auswärtstransports von
Arzneistoffen zu Resistenzen gegenüber Zytostatika. Defekte einiger ABC-
Transportergene sind mit bestimmten Krankheiten assoziiert.
9
Den ABC-Transportern liegt eine gemeinsame Architektur zugrunde, die in der Regel
aus zwei Transmembrandomänen (TMD) besteht, die einen Transportkanal bilden und
mit ihren 6-11 membrandurchspannenden alpha-Helices für die Substratspezifität
verantwortlich sind, sowie aus zwei Nukleotidbindedomänen (NBD). Die NBDs
wiederum enthalten zwei kurze, charakteristische Peptidketten, das Walker A- und
Walker B-Motiv, die in allen ATP-bindenden Proteinen zu finden sind. Diese im
Zytoplasma lokalisierten NBDs liefern die für den Transport notwendige Energie durch
die Spaltung von ATP (Rosenberg et al., 2005). Die durch ATP-Hydrolyse gewonnene
Energie ermöglicht die für den aktiven Transport der Substrate benötigte
Konformationsänderung des Transporterproteins. Der Substrattransport ist
unidirektional und kann entgegen einem Konzentrationsgradienten erfolgen.
Ein funktionell aktives ABC-Protein benötigt in der Regel zwei NBDs und zwei TMDs,
die in verschiedenen Anordnungen vorkommen können. Eukaryotische ABC-
Transporter werden als Volltransporter mit je zwei NBD- und zwei TMD-Einheiten in
einem Polypeptidmolekül oder als Halbtransporter exprimiert, wobei letztere zur
Erlangung ihrer Funktionalität Homo- oder Heterodimere bilden müssen. Die meisten
Halbtransporter befinden sich in intrazellulären Membransystemen, wie Mitochondrien,
Peroxisomen, dem endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat (Klein et al.,
1999).
Des Weiteren lassen sich die Transportproteine anhand ihrer unterschiedlichen
Funktionsmechanismen einteilen. Es gibt Transporter, die die Energie aus der Hydrolyse
von ATP zum aktiven Transport verschiedener Substrate entgegen einem
Konzentrationsgradienten nutzen (Szakas et al., 2001), während andere sich durch eine
niedrige ATP-Hydrolyse auszeichnen und somit eher zur Transporterleichterung/-
regulation dienen. Als Beispiel hierfür seien ABCC7, ABCC8, ABCC9 und ABCA1
genannt (Bryan et al., 1999). Die spezifischen Substrate variieren zwischen den
Subfamilien. Zu ihnen gehören unter anderem Xenobiotika, Steroidhormone, Sterole,
Lipide, Ionen und Peptide (Solbach et al., 2006). Aber noch immer ist unser Wissen
über die endogenen und exogenen Substrate vieler ABC- Transporter unvollständig. Die
Funktionen einiger wichtiger ABC-Transporter finden sich in Tabelle 2.1
zusammengefasst.
10
Tabelle 2.1: Wichtige ABC-Transporter und ihre Funktion
Familie Mitglied Weitere Bezeichnungen
Transport/Funktion
ABCA ABCA1 ABC1 Cholesterinefflux
ABCA2 ABC2 Medikamentenresistenz
ABCA3 ABC3 Sekretion von Surfactant (?)
ABCA4 ABCR N-Retinylidien-PE-Efflux
ABCB ABCB1 MDR1 Zytostatikaresistenz, Efflux von Toxinen
ABCB2,3
TAP1,2 Peptidtransport
ABCB4 MDR3 Phosphatidylcholin-Flippase
ABCB11 BSEP Gallensalztransport
ABCC ABCC1,3
MRP1,3 Medikamentenresistenz
ABCC2 MRP2 Efflux von organischen Anionen
ABCC4,5
MRP4,5 Nukleosidtransport
ABCC7 CFTR Chloridkanal
ABCC8 SUR Sulfonylharnstoffezeptor, regulatorische Untereinheit des KATP-Kanals
ABCD ABCD1 ALD Regulation des ‘Very Long Chain Fat Acid Transporter’(VLCFA)
ABCE ABCE1 OABP, RNS4I Oligoadenylat bindendes Protein
ABCF ABCF1 ABC50 Kontrolle der Proteintranslation (?) ABCG ABCG1 ABC8, White Cholesterolefflux aus Makrophagen,
Lipidhomöostase in anderen Zellen
ABCG2 ABCP,MXR,BCRP Efflux von Toxinen, Arzneimittelresistenz
ABCG5 White3 Steroidtransport
ABCG8 Steroidtransport
2.1.2 Die Superfamilie der ABC-Transporter und ihre pathophysiologische
Bedeutung
Einige ABC Transporter, wie P-Glykoprotein, bilden funktionelle Barrieren gegen die
Aufnahme von Fremdstoffen in den Körper durch Lokalisation im Darmepithel oder
der Blut-Hirn-Schranke. In der Niere oder der Leber sorgen sie darüber hinaus für die
11
Ausscheidung von exogenen oder endogenen Substanzen (Fromm et al., 2004). Die
Aufgaben der ABC Transporter sind aber nicht nur auf den Export von Xenobiotica
beschränkt. Auf die verschiedenen Funktionen und Aufgaben der einzelnen ABC-
Transporter-Familien soll nun im Weiteren eingegangen werden.
2.1.2.1 ABCA-Familie
Die 12 Mitglieder der ABCA-Familie zeichnen sich durch unterschiedlichste
Funktionen aus. Die Mitglieder dieser Familie werden in 2 Gruppen unterteilt: ABCA5,
ABCA6, ABCA8, ABCA9 und ABCA19 befinden sich als Cluster auf Chromosom
17q24, während sich die anderen auf unterschiedliche Chromosomen verteilen (Dean et
al, 2001).
ABCA1 ist Vermittler des zellulären Cholesterin- und Phospholipideffluxes aus dem
Zellinneren z.B. von Makrophagen an die Membranoberfläche, wo diese von
Akzeptoren, wie beispielsweise HDL, gebunden werden. Mutationen im ABCA1 Gen
führen beim Menschen zur seltenen vererblichen Tangier-Krankheit, die sich durch ein
Fehlen von HDL-Proteinen auszeichnet (Borst et al., 2002).
ABCA4 ist ein Retina-spezifischer ABC-Transporter. Gendefekte führen zur Stargardt-
Krankheit, einer Retinopathie, die mit einer Ablagerung von Lipofuszin im
Retinaepithel einhergeht. Die zunehmende Ablagerung führt somit wahrscheinlich zu
einer Atrophie des Epithels. Die Funktionen der anderen ABCA-Transporter sind noch
weitestgehend unklar. ABCA7, ABCA9 und ABCA10 wird eine Rolle bei der
Lipidhomöostase und Lipidtransport im Immunsystem (bei Makrophagen) bzw. bei der
Monozytendifferenzierung zugeschrieben. ABCA13 ist eines der größten ABC-Proteine
(Dean et al., 2001).
2.1.2.2 ABCB-Familie
Die ABCB-Familie besteht aus 11 Mitgliedern, aus vier Voll- und sieben
Halbtransportern.
ABCB1, auch als P-Glykoprotein, MDR1 oder PGY1 bekannt, war der erste geklonte
ABC-Transporter. Er transportiert hydrophobe Substrate und Pharmaka verschiedenster
Art wie Colchicin, Etoposid, Adriamycin, Vinblastin und Steroide. Er findet sich in
vielen sekretorisch aktiven Geweben hoch exprimiert, wie Niere, Leber, Intestinum und
Nebenniere und dient dort v.a. der Exkretion potentiell toxischer Substanzen. Außerdem
ist er auch hoch exprimiert in hämatopoetischen Stammzellen exprimiert, um diese vor
Toxinen zu schützen. Des Weiteren ist der Transporter verantwortlich für die Entstehung
von Arzneimittelinteraktionen und Therapieresistenzen bei Tumoren (Dean, 2002).
12
Das ABCB2 (TAP1)-Gen liegt auf Chromosom 6p21.3 im HLA-Genkomplex. ABCB2
ist ein Halbtransporter, der ein Heterodimer bildet, um Peptide ins endoplasmatische
Retikulum zu transportieren, wo sie mit Klasse HLA-I-Molekülen auf der
Zelloberfläche exprimiert werden. Abcb2-defiziente Mäuse zeigen eine mangelnde
Antigenpräsentation, einen Mangel an Klasse HLA-I-Proteinen an der Oberfläche,
sowie einen Mangel an CD8+-Zellen. Einige Viren wie Herpes simplex interferieren mit
der Antigenpräsentation, indem sie die Funktion des TAP-Komplexes stören. Es wurden
Tumorzellen mit mutiertem TAP-Komplex gefunden und es ist eine angeborene
Immunschwäche mit mutiertem TAP1 beschrieben (Dean et al., 2001).
Der Genort für ABCB3 (TAP2) liegt auf Chromosom 6p21.3. Der Transporter bildet
Heterodimere mit ABCB2. Es ist eine rezessiv erbliche Form einer MHC-I-Defizienz
beschrieben (Dean, 2002).
ABCB4 (MDR3/PGY3) ist ein Volltransporter und zeigt eine große Homologie zu
ABCB1. ABCB4 wird v.a. in der kanalikulären Membran von Hepatozyten, aber auch
im Herz, Muskel und B-Zellen exprimiert. Er ist für den Phospholipidtransport
verantwortlich. Mutationen verursachen eine Form der progressiven familiären
intrahepatischen Cholestase (PFIC) 3 und sind mit intrahepatischer Cholestase während
der Schwangerschaft assoziiert. ABCB5 ist ein Volltransporter dessen genaue Funktion
noch unklar ist. ABCB6 ist ein Halbtransporter, der im Mitochondrium exprimiert wird.
ABCB6 ist eng verwandt mit ABCB7, der ebenfalls im Mitochondrium exprimiert wird.
Bei Patienten mit X-chromosomal vererbter sideroblastischer Anämie und Ataxie
wurden Genmutationen von ABCB7 gefunden. ABCB8 wird wie ABCB10 ebenfalls im
Mitochondrium exprimiert, ABCB9 dagegen in Lysosomen. Von allen drei Transportern
ist die genaue Funktion unbekannt (Dean et al., 2001).
ABCB11 ist strukturell mit ABCB1 verwandt, aber die Daten über seine genaue
Funktion was den Transport von Arzneistoffen angeht, sind widersprüchlich. Er ist für
den Transport von Gallensäuren aus Hepatozyten in die Galle verantwortlich.
Mutationen in ABCB11 spielen bei der Entstehung des Typ 2 der PFIC eine Rolle (Borst
et al., 2002).
2.1.2.3 ABCC-Familie
Zur ABCC-Familie, von denen einige Transporter auch als Multi Drug Resistance
Proteine (MRP) bezeichnet werden, gehören 12 Mitglieder mit einem weiten Spektrum
an Funktionen, wie Ionentransport, Oberflächenrezeptoren und Elimination von Toxinen
(Dean et al., 2001).
13
ABCC1 (MRP1) wird in nahezu allen Geweben und vielen Tumorzelllinien und -
geweben exprimiert. Der Genort liegt auf Chromosom 16p13.1 und kodiert für einen
Volltransporter, der Glutathion-Konjugate aus der Zelle transportiert. Des Weiteren
transportiert ABCC1 Leukotriene, wie z.B. LTC4, und ist in Tumorzellen für die
Resistenzentwicklung gegenüber Zytostatika, wie z.B. Doxorubicin, Daunorubicin,
Vinristin und Colchicin verantwortlich. Das Gen von ABCC2 liegt auf Chromosom
10q24 und das Protein transportiert ähnlich wie ABCC1 eine Reihe von organischen
Anionen. Aber ganz im Gegensatz zur nahezu ubiquitären Expression von ABCC1 wird
ABCC2 nur in wenigen Geweben exprimiert, wie in der Leber, wo der Transporter für
die biliäre Ausscheidung endogener und exogener Metaboliten sorgt (Dean et al., 2001).
Mutationen in ABCC2 führen zum Dubin-Johnson Syndrom, einer seltenen autosomal-
rezessiv erblichen Exkretionsstörung von Bilirubinglukuroniden in die Gallengänge, die
mit konjugierter Hyperbilirubinämie einhergeht und v.a. im jungen Erwachsenenalter
auftritt (Dean, 2002).
ABCC3 transportiert wie ABCC1 und ABCC2 organische Anionen und wird v.a. in der
Leber exprimiert. Der Genort liegt auf Chromosom 17q21.3 und das Protein ist an der
Resistenzentwicklung gegen bestimmte Zytostatika beteiligt. ABCC4 ist wie ABCC5
eine Exportpumpe für organische Anionen. Die beiden Transporter besitzen aber noch
zusätzlich die Fähigkeit zum Transport von zyklischen Nukleotiden und ihrer Analoga.
Da Nukleosidanaloga häufig in der Krebs- und antiviralen Therapie verwendet werden,
könnte ABCC4 gerade bei der Resistenzentstehung während der medikamentösen HIV-
Therapie und Chemotherapie eine Rolle spielen (Dean et al., 2001).
ABCC5, dessen Genprodukt auch als MRP5 bekannt ist, liegt auf Chromosom 3q27 und
kodiert für ein 1437 Aminosäuren langes Transmembranprotein. In polarisiert
wachsenden Zellen findet es sich auf der basolateralen Seite. ABCC5 ist eng mit
ABCC4 verwandt und transportiert u.a. ebenfalls Nukleosidanaloga, im Gegensatz zu
ABCC4 cGMP allerdings mit höherer Affinität als cAMP. Des Weiteren ist ABCC5 als
Leber-Transporter zur Entgiftung von Glutathion-Konjungaten zur Entgiftung aus der
Leber beschrieben worden. Bisher beschriebene Inhibitoren von ABCC5 sind
Phosphodiesterasehemmer, wie z.B. Sildenafil und Urikosurika wie z.B. Probenecid.
Eine Überexpression von ABCC5 in Tumorgeweben wird durch Doxorubicin, Cisplatin
und Carboplatin induziert (Oguri et al., 2000). ABCC5 wird ubiquitär exprimiert, mit
der höchsten Expression im Skelettmuskel und Gehirn. Bisher ist keine humane
Erkrankung aufgrund von Mutationen im ABCC5-Gen beschrieben. Die genaue
14
physiologische und pathophysiologische Bedeutung von ABCC5 ist bisher noch nicht
genau aufgeklärt, aber durch den Transport von zyklischen Nukleotiden könnte ABCC5
bei der Relaxation glatter Muskelzellen, z.B. auch in den Koronargefäßen, eine
bedeutende Rolle für das Herz spielen (Dazert et al., 2003).
Der Genort von ABCC6 (MRP6) liegt auf Chromosom 16p13.1 und der Transporter
wird v.a. in Leber und Niere exprimiert. Eine Mutation in ABCC6 führt zu
Pseudoxanthoma elasticum, auch Grönblad-Strandberg-Syndrom genannt, einer
erblichen, degenerativen Systemerkrankung elastischer Gewebe in der Haut mit
kardiovaskulärer Beteiligung. Außerdem wird eine pathophysiologische Beteiligung
von Genpolymorphismen von ABCC6 an der Entstehung von Arteriosklerose und der
Beeinflussung von Triglycerid- und HDL-Spiegeln diskutiert (Dean et al., 2001).
Der ABCC7-Transporter ist auch als CFTR (cystic fibrosis transductance regulator)
bekannt. Das Gen liegt auf Chromosom 7q31.2 und kodiert für einen Proteinkinase A
(PKA)-abhängigen Cloridkanal. Das aus 1480 Aminosäuren bestehende Protein hat
mehrere funktionell bedeutsame Domänen: zwei nukleotidbindende Domänen (NBD),
eine regulatorische Einheit (R-Region) im Carboxyende und zwei
Transmembrandomänen. Die erste NBD dient der cAMP-vermittelten
Aktivitätsregulation, während die R-Region eine Bindungsstelle für Proteinkinase-A
und -C-Phosphorylierung besitzt. Mutationen in diesem Gen führen zur Zystischen
Fibrose (CF), auch Mukoviszidose genannt, einer bei Kaukasiern häufigen, mit einer
Wahrscheinlichkeit von 1:2500 auftretenden, autosomal-rezessiven erblichen
Stoffwechselstörung im Kindesalter. Sie ist charakterisiert durch eine generalisierte
Dysfunktion exokriner Drüsen in Lunge, Pankreas, Schweißdrüsen und Intestinum. Es
ist eine Vielzahl von Mutationen (bis zu 150) beschrieben, am häufigsten ist die
Deletion von Phenylalanin auf Position 508. Bei Patienten mit Mukoviszidose wurden
vermehrt auftretende kardiale Arrhythmien beobachtet, die sich nicht immer auf den
durch Umbau an der Lunge bedingten pulmonalen Hochdruck zurückführen lassen.
Somit liegt nahe, dass ABCC7 am Herzen an der Entstehung von kardialen Arrhythmien
durch Beeinflussung des Aktionspotentials und der Repolarisierungsphase beteiligt sein
könnte (Chen et al., 2004).
ABCC8, dessen Genprodukt auch Sulfonylharnstoffrezeptor 1 (Sulfonylurea Receptor 1,
SUR1) genannt wird, liegt auf Chromosom 11p15.1. ABCC8 bildet eine regulatorische
Untereinheit eines ATP-abhängigen Kaliumkanals und ist ein hochempfindlicher
Rezeptor für Sulfonylharnstoffe. Sulfonylharnstoffe werden in der Therapie von
15
Diabetes mellitus Typ 2 verwendet. Durch die Bindung an das ABCC8-Protein wird der
KATP-Kanal inhibiert und somit die Freisetzung von Insulin aus den beta-Zellen des
Pankreas gefördert. ABCC8 findet man somit vorwiegend im Pankreas, aber auch im
Herzen ist er detektiert worden, wo ABCC8 an der Regulation der KATP-abhängigen
Repolarisation beteiligt sein könnte (Dean et al., 2001).
Der Genort von ABCC9, auch als Sulfonylharnstoffrezptor 2 (SUR2) bekannt, befindet
sich auf Chromosom 12p12.1 und ist, ebenfalls wie ABCC8, eine regulatorische
Untereinheit des KATP-Kanals. Durch alternatives Spleißen werden zwei Isoformen von
SUR2 gebildet, SUR2A und SUR2B, mit jeweils unterschiedlichen pharmakologischen
Profilen. Auch SUR2 bindet Sulfonylharnstoffe, allerdings mit einer geringeren Affinität
als SUR1. SUR2 wird v.a. im Skelettmuskel exprimiert, wo er am Transport von
Glukose in den Muskel mitbeteiligt ist. Aber auch am Herzen wird er exprimiert, dort
v.a. die SUR2A Isoform (Chutkow et al., 1996, 2002, Yokoshiki et al., 1999).
ABCC10 ist auf Chromosom 6p21.1 lokalisiert. Die exakte Funktion dieses Transporters
ist unbekannt. Das ABCC11-Gen bildet mit ABCC12 ein Cluster auf 16q12.1. Während
die funktionelle Bedeutung von ABCC12 unbekannt ist, konnte in einer gegenüber
Nukleosidanaloga resistenten T-Zell-Leukämie-Zelllinie eine Überexpression von
ABCC11 gefunden werden (Dean et al., 2001).
2.1.2.4 ABCD-Familie
Alle Gene dieser Familie kodieren für Halbtransporter, die im Peroxisom Homo- bzw.
Heterodimere bilden. Das Gen für ABCD1 (ALD) befindet sich auf Xq28 und der in
Peroxisomen exprimierte Transporter ist für den Transport für überlange Fettsäuren ins
Peroxisom verantwortlich. Mutationen im ABCD1-Gen führen zur X-chromosomal
rezessiv vererbten Adrenoleukodystrophie. ABCD2 teilt sich mit ABCD1 dieselbe
Exon/Intron-Struktur und ist daher eng mit ihm verwandt. Er wird ebenfalls, wie auch
ABCD3 in Peroxisomen exprimiert. Mutationen im ABCD3-Gen wurden beim
Zellweger-Syndrom gefunden, aber weitere Untersuchungen konnten nicht bestätigen,
dass ABCD3 eine pathophysiologische Rolle bei der Entstehung dieser Krankheit spielt.
Ein weiteres Mitglied dieser Familie ist ABCD4. Dieses peroxismale Transporterprotein
weist strukturelle Übereinstimmungen mit den anderen drei Transportern auf. Die
genaue Funktion ist aber noch nicht geklärt (Dean et al., 2001).
2.1.2.5 ABCE- und ABCF-Familie
Der Genort von ABCE1 ist auf 4q31 lokalisiert. Das Gen kodiert für ein Protein mit
zwei ATP-bindenden Domänen, aber für keine TMD. Die mRNA von ABCE1 wird
16
konstitutiv in allen Geweben exprimiert. ABCE1 ist ein zytosolisches Protein, das keine
Transportfunktion besitzt. ABCE1 inhibiert die Ribonuclease L, ein Protein, das durch
durch Interferon aktiviert wird. Dieses Protein ist nur in Säugetieren existent. ABCE1
ist ebenfalls essentiell für die Assemblierung von Virus-Capsiden. Das Protein findet
sich hochkonserviert in allen eukaryontischen Spezies. Alle Eukaryonten besitzen nur
ein Mitglied der ABCE-Familie, bis auf die Pflanze Arabidopsis thaliana (Acker-
Schmalwand), die zwei ABCE-Transporter besitzt. Außerdem soll ABCE1 auch an der
Translation beteiligt sein, denn es bindet an die eukaryontischen Initiationsfaktoren eIF2
und eIF5 (Dean et al. 2001).
Die ABCF-Proteine besitzen ebenso wie die Proteine der ABCE-Familie keine TMD
und besitzen somit ebenfalls keine Membran-Transport-Funktion. Das Gen von ABCF1
ist auf Chromosom 6p21.33 lokalisiert innerhalb der Klasse I-HLA-Region (zwischen
HLA-E und HLA-A) und wird durch TNF-alpha Stimulation in den Zellen induziert.
Das Protein ist mit humanen Ribosomen und dem eIF2 assoziiert und ist daher ebenso
wie ABCE1 an der Translation beteiligt. ABCF2 und ABCF3 liegen beide auf
Chromosom 7q36, mit bisher noch ungeklärter Funktion (Dean et al., 2001).
2.1.2.6 ABCG-Familie
Die ABCG-Subfamilie besteht aus fünf Halbtransportern und einem weiteren, bisher nur
in der Maus identifizierten Vertreter, Abcg3. Alle Mitglieder der ABCG-Familie weisen
eine reverse Domänenstruktur auf, mit einer NBD am N-Terminus und einer TMD am
C-Terminus (Dean et al., 2001). Um ihre volle Funktionsfähigkeit zu erhalten müssen
zwei ABCG-Halbtransporter dimerisieren (Ewart et al., 2004).
Das ABCG1-Gen ist auf Chromosom 21q22.3 lokalisiert und ist sehr stark verwandt mit
dem Drosophila white Gen, einem Sehpigmenttransporter. Das Gen wird in Monozyten
durch Sterole induziert und das Transportprotein ist somit ähnlich wie ABCG5 und
ABCG8 in den Cholesterin-Efflux involviert (Dean et al., 2001). Der humane ABCG1-
Transporter transportiert auch Tryptophan. Es wird ihm daher eine Rolle bei der
Entstehung von neurologischen Krankheiten, die den Tryptophan- und
Serotoninstoffwechsel betreffen, zugeschrieben (Croop et al., 1997).
Das Gen für den ABCG2-Transporter, der auch Mitoxantrone Resistance Protein
(MXR), Breast Cancer Resistance Protein (BCRP) oder Placenta-Specific ABC Protein
(ABCP) genannt wird, hat seinen Genort auf Chromosom 4q22 und besteht aus 16
Exons und 15 Introns. Das Genprodukt ist ein 655 Aminosäure langes und 72,1 kD
schweres Transmembranprotein (Bailey-Dell et al., 2001). Es ist nahezu gesichert, dass
17
ABCG2 als Homodimer (Litman et al., 2002) oder Homotetramer (Xu et al., 2002)
funktioniert. Von ABCG2 werden zahlreiche Arzneistoffe (beispielsweise Mitoxantron,
Methotrexat und Topotecan) sowie auch Fluoreszenzfarbstoffe transportiert. Seine
Bezeichnung Breast Cancer Resistance Protein verdankt es der Tatsache, dass es u.a.
zuerst in der Brustkrebszelllinie MCF/AdrVp gefunden wurde (Doyle et al., 1998). Im
Laufe weiterer Untersuchungen wurde dieses Protein in verschiedensten Geweben,
Tumoren und Zelllinien lokalisiert und es stellte sich heraus, dass es im ursprünglichen
Entdeckungsort – der Brust – nicht sehr hoch exprimiert wird und auch nicht typisch für
dieses Gewebe ist. Sehr hoch wird ABCG2 dagegen in Synzytiotrophoblasten der
Plazenta exprimiert und sorgt dort somit für den Schutz des Fetus vor toxischen
Substanzen, die ABCG2-vermittelt wieder in den mütterlichen Blutkreislauf
zurücktransportiert werden (Allikmets et al., 1998). Ebenfalls eine hohe Expression
findet sich in bestimmten Subpopulationen von hämatopoetischen Stammzellen um
diese vor zytotoxischen Substanzen zu schützen (Zhou et al., 2005).
Eine bedeutende pathophysiologische Rolle spielt ABCG2 bei der Entstehung von
Zytostatikaresistenzen, denn wie oben beschrieben, sind viele Substrate von ABCG2
Zytostatika wie Mitoxantron und Topotecan. ABCG2 wird in verschiedenen soliden und
lymphatischen Tumoren hoch exprimiert und trägt somit zur Ausschleusung der
Medikamente aus den Tumorzellen bei (Ross et al., 1999).
Abcg3 ist eng verwandt mit ABCG2 und liegt auf Chromosom 4 der Maus. Es ist kein
Ortholog im humanen Genom bekannt (Dean et al., 2001).
Das ABCG4-Gen liegt auf Chromosom 11q23. Das Protein ist mit ABCG1 verwandt
und wird ebenso wie dieses durch Sterole und Retinoide induziert. Es wird in Milz,
Gehirn, Augen und Knochenmark hoch exprimiert (Dean et al., 2001).
Die Genorte von ABCG5 und ABCG8 liegen beide direkt nebeneinander auf
Chromosom 2p21 und werden beide vom selben Promotor reguliert. ABCG5 und
ABCG8 werden v.a. in Leber und Intestinum exprimiert und die beiden Halbtransporter
bilden zur Erlangung der vollen Funktion ein Heterodimer. Mutationen im Gen der
beiden Halbtransporter sind ursächlich für die Erbkrankheit der Sitosterolemie, die
durch einen fehlerhaften Transport von Fisch –und Pflanzensterolen und -cholesterolen
gekennzeichnet ist (Borst et al., 2002).
18
2.2 Herzinsuffizienz
2.2.1 Definition, Einteilung und Ursachen
Herzinsuffizienz bezeichnet die Unfähigkeit des Herzens, das vom Organismus
benötigte Herzzeitvolumen bei normalem enddiastolischem Ventrikeldruck zu fördern.
Dadurch kommt es zu einer verminderten körperlichen Belastbarkeit aufgrund der
ventrikulären Funktionsstörung. Es gibt verschiedenste Ursachen einer
Herzinsuffizienz, dazu gehören u.a. die koronare Herzerkrankung, arterielle Hypertonie,
Kardiomyopathien, Medikamente und andere seltene Krankheiten (Agguzzi et al.,
2004).
Die Herzinsuffizienz lässt sich anhand verschiedener Kriterien in unterschiedliche
Stadien einteilen, am bekanntesten und klinisch bedeutsamsten ist die Einteilung nach
der New York Heart Association (NYHA) Klassifikation entsprechend der
Leistungsfähigkeit der Patienten (Tabelle 2.2).
Tabelle 2.2: NYHA-Stadieneinteilung der Herzinsuffizienz
NYHA-Stadium Subjektive Beschwerden bei Herzinsuffizienz
Stadium I Herzerkrankung ohne körperliche Limitation. Alltägliche körperliche Belastung verursacht keine inadäquate Erschöpfung, Rhythmusstörungen, Luftnot oder Angina pectoris.
Stadium II Herzerkrankung mit leichter Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit. Keine Beschwerden in Ruhe. Alltägliche körperliche Belastung verursacht Erschöpfung, Rhythmusstörungen, Luftnot oder Angina pectoris.
Stadium III Herzerkrankung mit höhergradiger Einschränkung der körperlichen Leistungsfähigkeit bei gewohnter Tätigkeit. Keine Beschwerden in Ruhe. Geringe körperliche Belastung verursacht Erschöpfung, Rhythmusstörungen, Luftnot oder Angina pectoris.
Stadium IV Herzerkrankung mit Beschwerden bei allen körperlichen Aktivitäten und in Ruhe. Bettlägrigkeit.
Darüber hinaus können Patienten nach der Klassifikation der American Heart
Association, die mehr die Entstehung und Progredienz der Erkrankung berücksichtigt,
eingestuft werden (Hunt et al., 2001).
19
2.2.2 Kardiomyopathien als Ursache einer Herzinsuffizienz
Auf die Kardiomyopathien als Ursache einer Herzinsuffizienz soll im Folgenden näher
eingegangen werden, denn zur Untersuchung der ABC-Transporter standen Proben aus
linksventrikulärem humanen Myokard zur Verfügung, die entweder von Patienten mit
idiopathischer dilatativer Kardiomyopathie oder ischämischer Kardiomyopathie
stammten.
Kardiomyopathien sind Erkrankungen des Myokards, die mit einer kardialen
Dysfunktion einhergehen. Nach der WHO-Klassifikation trifft der Begriff „primäre
Kardiomyopathie“ nur auf Myokarderkrankungen zu, deren Ursache unbekannt ist. Man
unterscheidet dabei die dilatative, die hypertrophe, die restriktive und die
arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie. Von diesen primären sind die
spezifischen (sekundären) Kardiomyopathien zu unterscheiden. Beispiele dafür sind
ischämische, hypertensive, valvuläre, metabolische und endokrine Kardiomyopathie
sowie die alkoholische, medikamentös-toxische und peripartale Kardiomyopathie
(Aguzzi et al., 2004).
Als Beispiel für eine primäre Kardiomyopathie sei im Folgenden nun die dilatative
Kardiomyopathie und für eine sekundäre Kardiomyopathie die ischämische
Kardiomyopathie näher aufgeführt.
2.2.2.1 Dilatative Kardiomyopathie (DCM)
Kennzeichnend ist eine Dilatation und systolische Dysfunktion des linken oder beider
Herzventrikel bei zunehmender Herzinsuffizienz und Arrhythmie. Kardinalsymptome
sind Kardiomegalie, Zeichen einer relativen Klappeninsuffizienz und Stauungszeichen.
Klinisch zeigen die Patienten typische Zeichen einer Rechts- bzw. Linksherzinsuffizienz
mit Dyspnoe, Müdigkeit, Palpitationen und peripheren Ödemen. Das Endokard ist
häufig diffus oder fleckförmig verdickt und mit parietalen Thromben besetzt.
Mikroskopisch wirken die Herzmuskelfasern unregelmäßig angeordnet. Trotz bizarrer
Kernformen sind die Myozyten oft normal breit. In der Hälfte der Fälle findet sich eine
feinnetzige oder feinfleckige Fibrosierung (Bäumer et al., 2000).
Die DCM ist das Endstadium einer heterogenen Gruppe von Erkrankungen. Als
bekannte Ursachen seien die Myokarditis, eine koronare und hypertensive
Herzerkrankung, Endokrinopathien und Stoffwechselerkrankungen, Alkoholabusus und
die Zytostatikatherapie genannt. Hiervon abzugrenzen ist die idiopathische DCM, deren
genauer pathogenetischer Mechanismus noch nicht aufgeklärt ist. Bei 20% der Patienten
20
besteht eine familiäre Häufung mit variablen Vererbungsmustern (Aguzzi et al., 2004).
Die Erkrankung zeigt eine unaufhaltsame Progredienz. Diese ist abhängig von der
Therapie sowie von Risikofaktoren wie Alter, Ejektionsfraktion, ventrikuläre
Arrhythmien und erhöhte Serumkatecholaminspiegel. Die Inzidenz der Erkrankung liegt
bei 5-8 pro 100 000 Einwohner pro Jahr und ist in den Industrieländern zunehmend. Es
sind v.a. Männer mittleren Alters betroffen.
2.2.2.2 Ischämische Kardiomyopathie (ICM)
Die ischämische Kardiomyopathie (ICM) gehört zu den spezifischen (sekundären)
Kardiomyopathien und präsentiert sich klinisch und morphologisch als dilatative
Kardiomyopathie mit einer verminderten Ventrikelkontraktion. Ursachen, Risiken,
Pathophysiologie und Pathomorphologie der Gefäßwände entsprechen denen der
koronaren Herzerkrankung (KHK). Multiple Mikroinfarkte führen zur Entstehung
dieser Kardiomyopathie, die durch das Ausmaß der koronaren Herzerkrankung und ihre
ischämischen Folgeschäden aber nicht vollständig erklärt werden kann (Aguzzi et al.,
2004).
Durch die kurzzeitigen Ischämien des Myokards kommt es zur Präkonditionierung des
Herzmuskels gegenüber prolongierten Ischämien. Hierbei spielen erhöhte
Stickstoffmonoxid (NO) -und cGMP-Konzentrationen im Herzmuskel eine große Rolle
(Murry et al., 1986, Rakhit et al, 2000).
2.2.3 Neurohumerale Mechanismen bei Herzinsuffizienz - Die Bedeutung der
natriuretischen Peptide ANP und BNP
Herzinsuffizienz bedeutet eine verminderte Leistungsfähigkeit des Myokards und
betrifft meist den linken Ventrikel. Dadurch kommt es zu einer Verminderung des
Herzzeitvolumens und einer Minderversorgung des restlichen Organismus mit
Sauerstoff. Um den Bedürfnissen des Körpers gerecht zu werden, werden
herzmechanische und systemische Kompensationsmechnismen in Gang gesetzt. Zu den
systemischen Kompensationsmechanismen gehören neurohumorale Mechanismen, die
über eine Erhöhung des Sympathikotonus darauf ausgelegt sind, das Herzzeitvoumen
und den Blutdruck wieder anzuheben. In der Endstrecke der Sympathikusaktivierung
mit der Aktivierung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems, steht somit eine
Steigerung der Wasser- und Salzresorption. Diese systemischen Veränderungen werden
von Veränderungen auf molekularer Ebene begleitet. Dazu gehört das sogenannte
21
Remodelling, also der strukturelle Umbau des Herzens. Bedingt durch neurohumorale
und mechanische Stimuli kommt es zu Umbauvorgängen, die zu einer Hypertrophie und
Katecholaminrefraktärität der Myokardzelle führen und letztendlich in einer
Fibrosierung des Myokards enden. Zusätzlich werden im Myokard fetale
Genprogramme reaktiviert, die im Ventrikel zu einer erhöhten Expression des atrialen
natriuretische Peptids (ANP) und des 'brain natriuretic peptide' (BNP) führen, deren
Bildung im gesunden adulten Herzen lediglich im Vorhof und nicht im Ventrikel erfolgt.
Diese sogenannten natriuretischen Peptide sind die Gegenspieler des Renin-
Angiotensin-Aldosteron-Systems und werden im gesunden Herzen ausschließlich in den
Vorhöfen gebildet und bei vermehrter Dehnung der Vorhöfe ausgeschüttet und führen
dadurch zu einer Steigerung der Diurese. Bei Patienten mit Herzinsuffizienz kommt es
durch die oben genannte Aktivierung fetaler Genprogramme zu einer Bildung von ANP
und BNP auch im Ventrikel. Bereits bei asymptomatischen Patienten mit
linksventrikulärer Dysfunktion sind die Plasmakonzentrationen von ANP und BNP
erhöht. Daher wurde die Plasmakonzentration von BNP in der klinischen Routine in den
letzten Jahren aufgrund dieser Regulation bei Herzinsuffizienz zu einem wichtigen
laborchemischen Prädiktor kardiovaskulärer Mortalität (Bäumer et al., 2000).
2.2.4 Therapieprinzipien einer Herzinsuffizienz
Die Therapie der Herzinsuffizienz beruht auf mehreren Faktoren. Zunächst sollte eine
allgemeine Therapie eingeleitet werden, die auf Minimierung der Risikofaktoren durch
z.B. Gewichtsreduktion, Salzrestriktion, Alkoholkarenz und Nikotinabstinenz beruht.
Des Weiteren sollte die zugrunde liegende Erkrankung therapiert werden. Wichtig dabei
v.a. ist die Hypertonie-Einstellung.
ACE-Hemmer (Prilate) sind in jedem Stadium indiziert. Durch Blockade des
Angiotensin Converting Enzymes (ACE) verhindern sie die Bildung von Angiotensin
(AT) II, einem potenten Vasokonstriktor. Somit wird der periphere Widerstand gesenkt
und damit auch die ventrikuläre Nachlast. Die durch AT II induzierte Stimulation des
sympathoadrenergen Systems wird vermindert. Durch Drosselung der Aldosteron- und
ADH-Sekretion kommt es zur Volumenabnahme und damit zur Verminderung des
Füllungsdrucks im Herzen. Durch Verhinderung des Remodellings kann es zur
Rückbildung einer linksventrikulären Hypertrophie kommen. In verschiedenen Studien
wurde eine signifikante Prognoseverbesserung (CONSENSUS-, SOLVD-Studie) sowie
eine Senkung der kardiovaskulären Mortalität bei Risikopatienten (HOPE-Studie)
22
festgestellt. Als Nebenwirkung tritt häufig trockener Reizhusten auf. Kontraindiziert
sind ACE-Hemmer bei Nierenarterienstenosen, Niereninsuffizienz sowie in
Schwangerschaft und Stillzeit. Bei Nebenwirkungen kann man als Alternative AT1-
Rezeptorblocker (Sartane) einsetzen. Diuretika werden ab NYHA-Stadium II als
Basistherapeutika eingesetzt. Standard sind Thiazide und Schleifendiuretika. Als
prognoseverbessernd bei schwerer Herzinsuffizienz haben sich Aldosteron-
Antagonisten (Spironolacton) erwiesen. Sie können die Mortalität im NYHA-Stadium
III-IV signifikant senken. Die Nebenwirkungen sind vielfältig. Allen voran stehen
Elektrolytstörungen, Hypovolämie und Stoffwechselstörungen. Bestimmte beta-Blocker
können ergänzend ab NYHA-Stadium II eingesetzt werden, stadienunabhängig bei Z.n.
Herzinfarkt und bei Hypertonie. Dazu gehören Carvedilol, Metoprolol und Bisoprolol.
Sie schützen das Herz vor toxischer Katecholaminwirkung, verhindern die
Downregulation von beta-Rezeptoren und senken die Herzfrequenz. Müdigkeit,
Bradykardie, Erregungsleitungsstörungen, Impotenz, Asthma bronchiale,
Linksherzinsuffizienz und Hypoglykämien unter Diabetes mellitus-Therapie sind
unerwünschte Nebenwirkungen. Herzglykoside sind bei chronisch systolischer
Linksherzinsuffizienz ab NYHA-Stadium III sowie bei Tachyarrhythmie bei
Vorhofflimmern in jedem Stadium indiziert. Durch Hemmung der Na+/K+-ATPase
wirken sie positiv inotrop und bathmotrop, sowie negativ chronotrop und inotrop. Sie
verbessern die klinische Symptomatik und das subjektive Empfinden beim Patienten,
besitzen aber keinen Einfluss auf die Gesamtletalität. Die therapeutische Breite bei den
Herzglykosiden ist gering und sie besitzen zahlreiche Wechselwirkungen mit anderen
Medikamenten. Sie sind u.a. Substrate von ABCB1 (P-Glykoprotein). Um eine
Digitalisintoxikation zu vermeiden sollten regelmäßige Plasmaspiegelkontrollen
durchgeführt werden. Des Weiteren können Antikoagulanzien indiziert sein, u.a. bei
einer Ejektionsfraktion <30 % und Vorhofflimmern. Antiarrhythmika und Nitrate sind
keine Basistherapeutika, werden jedoch bei entsprechenden Indikationen eingesetzt.
Hierbei sind die Nitrate besonders zu erwähnen. Durch die Gabe von organischen
Nitraten wird die Wirkung des Endothelfaktors Stickstoffmonoxid (NO) imitiert. NO
wird physiologisch als Botenstoff von Endothelzellen freigesetzt und ruft nach
Diffusion durch Zellmembranen eine Aktivierung der Guanylatcyclase hervor. Durch
den daraufhin steigenden intrazellulären Gehalts an cGMP, kommt es zur Erschlaffunng
von Muskelzellen, v.a. in der glatten Gefäßmuskulatur. Durch die Erweiterung der
Kapazitätsgefäße nimmt das venöse Blutangebot an das Herz ab, die Vorlast sinkt,
23
ebenso wie die Nachlast. Dadurch kommt es zu einer Verbesserung der myokardialen
Sauerstoffbilanz (Lüllmann et al., 2003).
2.3 ABC-Transporter im Herzen und ihre Bedeutung
Nur für einige ABC Transporter gibt es bisher genaue Daten und Hinweise, dass sie für
(patho-)physiologische Vorgänge am Herzen relevant sein können. Dies betrifft v.a.
solche ABC-Proteine, die an der Elektrolythomöostase beteiligt sind, z.B. der CFTR-
Chloridkanal und die regulatorischen Untereinheiten SUR1/SUR2 der KATP-Kanäle,
sowie Transporter der ABCC-Familie, die an dem Efflux von cGMP beteiligt sind.
Diese ABC-Proteine sind u.a. auch an der sogenannten ischämischen
Präkonditionierung (ischemic preconditioning, IPC) am Herzen beteiligt und werden im
Folgenden nun näher besprochen.
Durch kleine Infarkte in der Endstrombahn der Koronargefäße steigt die Toleranz des
Myokards gegenüber prolongierten Ischämiezuständen (Murry et al., 1986, Yellon et al.,
1998). Diese Toleranzentwicklung wird über eine Bradykinin-Ausschüttung im
minderperfundierten Bereich, die wiederum zu einer Aktivierung der
Stickstoffmonoxid(NO)-Synthese in den Kardiomyozyten und somit zu einer Erhöhung
des intrazellulären cGMP-Spiegels führt, ausgelöst. Der erhöhte cGMP-Spiegel führt
einerseits zu einem verminderten Kalziumeinstrom sowie andererseits zu einer
Aktivierung der Phosphodiesterase Typ 2 (PDE 2). Diese beiden Mechanismen senken
über die Dilatation von glatten Muskelzellen den Sauerstoffbedarf der Kardiomyozyten
(Parrat et al., 1995, Rakhit et al., 2000, Gallo et al., 2001).
Da es Hinweise gibt, dass die Kardiomyozyten - im Gegensatz zu anderen Muskelzellen
- keine Phosphodiesterase Typ 5 (PDE 5) enthalten (Wallis et al., 1999), wird vermutet,
dass der Hauptweg zur Senkung des intrazellulären cGMP-Spiegels der
Auswärtstransport ist, für den u.a. ABCC5 verantwortlich ist (Jedlitschky et al., 2000).
Dazu passen die Ergebnisse von Dazert et al. aus dem Jahr 2003, die in Kardiomyozyten
bei Patienten mit ischämischer Kardiomyopathie eine erhöhte Expression von ABCC5
nachweisen konnten. Somit könnte ABCC5 eine wichtige Rolle bei der ischämischen
Präkonditionierung spielen.
Auch andere Mitglieder der ABCC-Familie sind unter ischämischen Bedingungen
bedeutend für Kardiomyozyten. ABCC7, auch bekannt als CFTR (cystic fibrosis
transmembrane transductance regulator), kann das Aktionspotential am Herzen unter
ischämischen Bedingungen reduzieren und dadurch u.a. den intrazellulären
24
Kalziumspiegel und somit den Zellschaden zu minimieren (Chen et al., 2004).
In verschiedenen Arbeiten konnte für die ATP-abhängigen Kaliumkanäle, deren
Untereinheiten u.a. von ABCC-Transportergenen, von ABCC8 und ABCC9, codiert
werden, eine kardioprotektive Rolle nachgewiesen werden (Chutkow et al., 1996 und
2002, Yokoshiki et al., 1999). Unter ischämischen Bedingungen können sie das
Aktionspotential, ebenso wie ABCC7, verkürzen und den zytosolischen
Kalziumeinstrom vermindern. Des Weiteren konnten bei Patienten, die an
Herzinsuffizienz und kardialen Arrhythmien leiden, Mutationen im ABCC9-Gen, das für
das SUR2-Protein, einem Bestandteil des ATP-abhängigen Kaliumkanals, kodiert,
nachgewiesen werden (Kane et al. 2005).
Auch Mutationen in anderen ABC-Transportergenen können zu Kardiomyopathien
führen. So entwickeln Abca5-/- knock-out-Mäuse im ausgewachsenen Stadium eine
dilatative Kardiomyopathie (Kubo et al., 2005). Die Funktion von ABCA5 an sich ist
noch weitgehend ungeklärt. Der Transporter wurde v.a. in Lysosomen gefunden. Hierzu
passend sind Beobachtungen, dass es bei lysosmalen Speicherkrankheiten zu einem
vermehrten Auftreten von dilatativer Kardiomyopathie kommt (Guertl et al., 2000).
Zusammenfassend weisen die bisherigen Befunde darauf hin, dass bestimmte ABC-
Transporter eine bedeutende physiologische und pathophysiologische Rolle am Herzen,
z.B. in Zusammenhang mit der kardialen Ischämie und Reperfusion, spielen. Für den
Arzneistofftransport relevante ABC-Transporter könnten darüber hinaus für die
Verteilung und Verfügbarkeit von Arzneistoffen im Herzen von Bedeutung sein. Viele
Funktionen der ABC-Transporter, gerade am menschlichen Herzen, sind allerdings noch
ungeklärt. Bisher fehlt eine vollständige Übersicht der ABC-Transporter-Expression im
Herzen. Außerdem ist unklar, inwieweit sich das Expressionsprofil der ABC-
Transporter in insuffizienten von dem in gesunden Herzen unterscheidet. Dazu soll
diese Arbeit einen Beitrag leisten.
25
3 Zielsetzungen der Arbeit
Diese Arbeit hatte folgende Zielsetzungen:
1. Zunächst sollte eine Übersicht über das Expressionsprofil aller bekannten ABC
Transporter auf mRNA-Ebene in menschlichem Herzgewebe erstellt werden. Der
Vergleich der Expression der ABC-Transporter im normalen menschlichen
linksventrikulären Myokard und in nicht-kardialen menschlichen Geweben sollten
erste Hinweise auf ihre physiologische Bedeutung im Herzen liefern.
2. Außerdem wurde die Frage bearbeitet, ob sich die Expression von ABC-Proteinen
in einem fortgeschrittenen klinischen Stadium der Herzinsuffizienz verändert.
Solche Expressionsänderungen könnten von pathophysiologischer Bedeutung sein.
3. ABCG2, eine Effluxpumpe für Arzneistoffe die - wie in dieser Arbeit gezeigt - im
insuffizienten Myokard gesteigert exprimiert wird, könnte die Arzneistoffaufnahme
und –Wirkung im Herzen beeinflussen. Daher wurde im Zellmodell untersucht,
inwieweit herzwirksame Arzneistoffe mit ABCG2 als Substrat oder Inhibitor
interagieren.
26
4 Material und Methoden
4.1 Gewebeproben
Die Untersuchungen wurden an humanem Herzgewebe vorgenommen. Insgesamt
standen 31 Gewebeproben aus linksventrikulärem Myokard zur Verfügung. Davon
stammten 11 Proben von gesunden Spenderherzen (Gewebesammlung Prof. T.
Eschenhagen, Institut für Experimentelle Pharmakologie und Toxikologie
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf), die aufgrund einer
Blutgruppeninkompatibilität oder aus chirurgischen Gründen nicht transplantiert werden
konnten (NF=non-failing). Eine Erkrankung der Herzen wurde anamnestisch und durch
2-dimensionale Echokardiographie ausgeschlossen.
Die weiteren 20 Proben stammten aus explantierten Herzen von Patienten mit
terminaler Herzinsuffizienz (NYHA-Stadium III-IV), die entweder unter ischämischer
(ICM, n=5) oder dilatativer Kardiomyopathie (DCM, n=15) litten (Gewebesammlung
Prof. T. Eschenhagen). Alle Patienten gaben ihr schriftliches Einverständnis vor der
Operation für die Verwendung ihrer Herzen. Die Proben der Herzgewebebank wurden
ausschließlich in pseudonymisierter Form verwendet (positives Votum der Ethik-
Kommission bei der Ärztekammer Hamburg, Az. 532/116/9.7.1991).
Alle Proben wurden sofort nach Entnahme in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei
-80°C gelagert oder in 4% Formalin fixiert.
27
Tabelle 4.1: Übersicht über die Herkunft der Spenderherzen Patient
Nr. Alter
Geschlecht Diagnose NYHA-
Stadium LVEF
% CI
(l/min x m2) Pharmaka
1 44 M NF (SAB) n.d. 2 49 F NF (CIC) n.d. 3 52 M NF (ICB) n.d. 4 50 F NF (SAB) n.d. 5 19 M NF(HT) n.d. 6 36 M NF(ICB) n.d. 7 52 M NF (ICB) n.d. 8 19 M NF (HT) n.d. 9 54 M DCM III-IV 2.7 ABCDGR 10 47 M DCM IV 16 2.1 ACDGN 11 65 M DCM IV DNOR 12 42 M DCM III-IV 2.3 ADN 13 47 M DCM IV 25 2.2 ADGNR 14 33 M DCM III 40 3.5 ADGN 15 59 M DCM III-IV 1.7 ADGN 16 50 M DCM III-IV 2.8 ACDGN 17 16 M DCM IV 2.2 ADGNO 18 37 M DCM III 15 ADGR 19 62 M DCM IV <20 2.2 ADGR 20 56 M DCM III 25 ADGN 21 35 F DCM IV 20-30 1.9 ADGNOR 22 54 M ICM III-IV n.d. 23 66 M ICM III-IV 16 1.9 ACD 24 57 M ICM III-IV DGNR 25 61 F ICM III-IV 20 n.d. 26 64 M ICM III-IV 20-30 ADNO 27 46 M ICM III-IV n.d. 28 62 M ICM IV DGNR 29 64 M ICM III-IV 1.8 ADGNOR 30 57 M ICM III-IV n.d. 31 54 M ICM III-IV 20 1.5 ABDGNR
Legende: LVEF=linksventrikuläre Ejektionsfraktion; CI=Herzindex; Diagnose: ICB=intracranielle Blutung; SAB= subarachnoidale Blutung; CIC=zerebrale Ischämie; SHT=Schädel-Hirn-Trauma; DCM=idiopathische dilatative Kardiomyopathie; ICM=ischämische Kardiomyopathie; NF=gesundes Spenderherz; Medikation: A=Angiotensin Converting Enzyme-Inhibitor oder Angiotensin II Rezeptor Antagonisten; B=ß-Blocker; C=Calcium-Kanal Blocker; D=Diuretika; G=Herzglykoside; N=Nitrate; R=Antiarrhythmika (außer ß-Blocker); O=Dopamin/Dobutamin; n.d.=unbekannt.
28
4.2 Quantifizierung real-time (LightCycler) RT-PCR
4.2.1 RNA-Isolierung
Die RNA wurde mit Modifikationen nach der Methode von Chomczynski und Scacchi
(1987) präpariert. Die Zellen bzw. Gewebe wurden unter Erhaltung der Integrität der
RNA in einer monophasischen Lösung aus Phenol und Guanidinisothiozyanat (Trizol,
GIBCO BRL Life Technologies, Ebersberg) lysiert. Die so gewonnene RNA war
weitgehend frei von Proteinen und DNA.
Zur Vorbereitung wurden jeweils 50-100 mg des tiefgefrorenen Gewebes mit einem
Mörser in flüssigem Stickstoff pulverisiert, in TRIZOL-Reagenz aufgenommen und 2 x
für 30 sec bei 1400 U/min mit einem Glas-Teflon-Potter (Potter S, Braun Biotech,
Melsungen) homogenisiert. Anschließend wurden die Proben bei 12 000 x g für 10 min
bei 4°C zentrifugiert, um Fett, Polysaccharide, extrazelluläres Material zu trennen. Um
die Dissoziation der Nukleoproteinkomplexe zu komplettieren, wurde der geklärte
Überstand für 5 min bei 15-30° C inkubiert und dann pro ml mit 0,2 ml Chloroform
versetzt. Die Proben wurden nochmals bei max. 12 000 x g für 15 min bei 4°C
zentrifugiert. Nach der Zentrifugation bildeten sich 3 Phasen in den Proben: eine untere
rote Chloroform-Phenol Phase, eine Interphase und eine obere farblose wässrige Phase,
die die RNA enthielt. Der wässrige Überstand wurde in ein neues Eppendorf-Cup
überführt und um die RNA herauszulösen wurde die Lösung mit 0,5 ml Isopropanol pro
ml Reagenz versetzt.
Die Proben wurden für 10 min bei 15-30° C inkubiert und für weitere 10 min bei max.
12 000 x g und 4° C zentrifugiert. Das RNA-Präzipitat bildete nun am Boden des Cups
ein Pellet.
Der Überstand wurde nun abgesaugt und das RNA-Pellet mit 75% Ethanol gewaschen
(1 ml Ethanol pro ml Trizol-Reagenz). Zum Schluss wurde das RNA-Pellet kurz
getrocknet und dann in Diethyl-Pyrocarbonat- (DEPC-) H2O resuspensiert und für 10
min bei 55-60°C inkubiert. Die photometrische Bestimmung des RNA-Gehaltes wurde
in einer Verdünnung von 1:25 bei einer Wellenlänge von 260 nm (Absorptionsmaximum
für RNA) durchgeführt (Smart Spec 3000, Bio Rad, München). Zur Bestimmung des
Reinheitsgrades der isolierten RNA wurde gleichzeitig die optische Dichte bei 280 nm
(Absorptionsmaximum für Proteine) gemessen und der Quotient OD 260/OD 280
gebildet, der bei allen Messungen zwischen 1,8 und 2,0 lag. Die Aufbewahrung der
RNA bis zur weiteren Verwendung erfolgte bei –80°C.
29
4.2.2 Reverse Transkription
Für die reverse Transkription wurde das Superscript III First Strand Synthesis System
(M-MLV Reverse Transkriptase, Invitrogen) und Random-Hexamer-Primer nach
folgendem Pipettierschema verwendet:
Tabelle 4.2: Pipettierschema einer Reversen Transkriptase (RT) (50 µl) Komponenten für die RT-PCR Volumen in µl Endkonzentration RT-Buffer 10x 5 1x Hexamer-Primer 2,5 50 µM dNTP 2,5 10 mM MgCl2 10 25 mM DTT 5 0,1 M H2O 15 - RNAse Inhibitor 2,5 40 U/µl Reverse Transkriptase 2,5 200 U/µl RNA 5 4 ng/µl Gesamtvolumen 50 - Zur Durchführung der reversen Transkription wurde der Mix für 50 min bei 40°C
inkubiert und anschließend die Reverse Transkriptase durch erneute Inkubation bei
85°C für 5 min inaktiviert. Nach Abkühlung auf Eis wurde zu jedem Ansatz 1 µl E.coli
RNAse H (2 U/µl) hinzugefügt und erneut bei 37°C für 10 min inkubiert. Die Ansätze
wurden auf 4°C heruntergekühlt und bis zur weiteren Verwendung bei –20°C gelagert.
4.2.3 Real-time PCR, Auswertung
Für die Polymerase Ketten Reaktion (PCR) werden Oligonukleotid-forward- und
reverse-Primer benötigt, die an den DNA-Strang binden und den zu amplifizierenden
Bereich eingrenzen. Als katalysierende Polymerase wird bei einer PCR meistens die
Taq-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus verwendet. Diese
Polymerase hat den Vorteil aufgrund ihrer Thermostabilität im ersten Schritt einer PCR
die Denaturierung der DNA zu überstehen. Nach der Denaturierung liegt die DNA als
Einzelstrang vor. Im nächsten Schritt kommt es zur Anlagerung der Primer (Annealing).
Darauf folgt die Synthese der DNA durch die Taq-Polymerase. Denaturierung,
Annealing und DNA-Synthese werden in einer PCR zyklisch wiederholt. Eine PCR
besitzt eine sigmoidale Kinetik. Im linearen Bereich führt jeder erneute Zyklus zu einer
Verdopplung der DNA. Im Plateaubereich ist die abnehmende Konzentration an
Oligonukleotiden (dNTPs) der limitierende Faktor. Es kommt nicht mehr zur
30
Verdopplung der DNA.
Das Light Cycler System erlaubt eine quantitative und qualitative online PCR mit Hilfe
des Farbstoffes Sybr Green I. Dieser fluoresziert nur, wenn er an Doppelstrang DNA
(dsDNA) gebunden ist. Der Beginn der exponentiellen Produkt-Zunahme, der linearen
Logphase der PCR, wird aufgrund der Fluoreszenzzunahme bestimmt und entspricht
dem sogenannten 'crossing point'. Dieser korreliert mit der Anfangskonzentration der zu
amplifizierenden cDNA-Sequenz und kann deshalb zur Quantifizierung der Transkripte
herangezogen werden. Im Anschluss an die letzte Elongationsphase der PCR wurde
jeweils eine Schmelzkurvenanalyse zur Identifizierung des spezifischen Produktes
durchgeführt. Jedes PCR-Produkt besitzt eine charakteristische Schmelztemperatur TM,
die sowohl von seiner Länge als auch vom GC-Gehalt abhängig ist. Es wurde ein
Mastermix (LightCycler FastStart DNA Master plus SYBR Green I, Roche Applied
Science) angesetzt, von dem jeweils 18 µl in den speziell für den Light Cycler
konzipierten Glaskapillaren vorgelegt wurden. Dazu wurden je 2 μl cDNA bzw. H2O für
die Wasserkontrolle pipettiert. Der Mastermix für 33 Ansätze setzte sich wie folgt
zusammen:
Tabelle 4.3: Mastermix für die Light Cycler PCR (33 Ansätze) Komponenten für den Mastermix Volumen in µl
1a Fast Start Enzyme 14,8 1b DNA Master Reaction Mix 107,2
Primer 1 (100 µmol/l) 54,5 Primer 2 (100 µmol/l) 54,5
H2O 363 cDNA (je Ansatz) 2
Tabelle 4.4: Protokoll für die Polymerase Ketten Reaktion (PCR)
1. Denaturierung 95°C 10 min 2. Amplifikation ( 45 Zyklen)
1. Denaturierung 2. Annealing der Primer
3. Extension
95°C
Charakteristische Schmelztemperatur
Tm-5°C 72°C
10 sec
0-10 sec
25 sec pro Basenpaar
3. Schmelzkurven 1. Denaturierung 2. Annealing 3. Schmelzen
95°C 65°C
65°C-95°C
0 sec 15 sec
0,1°C/sec 4. Kühlung 40°C 30 sec
31
Für die verwendeten Primersequenzen siehe Tabelle 10.1 des Anhangs.
Nach der ∆∆CT-Methode lässt sich mathematisch die Anzahl der amplifizierten
Moleküle des Zielgens in einer PCR beim Erreichen des CT-Wertes für ein Zielgen wie
folgt beschreiben:
(1) XT = X0 * (1 + EX)CT,X = konst. (K)
XT = Anzahl der amplifizierten Moleküle des Zielgens
X0 = Startkopienzahl des Zielgens
EX = Effizienz der PCR des Zielgens
CT,X = Thresholdwert des Zielgens
Die Formel für die Referenzgene lautet:
(2) RT = R0 * (1 + ER)CT,R = konst. (K)
RT = Anzahl der amplifizierten Moleküle des Referenzgens
R0 = Startkopienzahl des Referenzgens
ER = Effizienz der PCR des Referenzgens
CT,R = Thresholdwert des Referenzgens
Dividiert man beide Gleichungen durch einander, ergibt sich:
(3) XT / RT = X0*(1+EX)CT,X / R0*(1+ER)CT,R = konst. (K)
Setzt man die Effizienzen beider PCRs als gleich voraus und bezieht jede Probe noch
auf einen Kalibrator (z.B. Nullstundenwert oder gesunde Probanden) ergibt sich
folgende Formel:
(4) XN = K * (1 + E)-∆CT
XN = X0 / R0
∆CT = CT,X – CT,R
E = Effizienz
Wenn man jeden XN-Wert durch den XN-Wert eines Kalibrators (z.B. Nullstundenwert
oder Material von gesunden Probanden) dividiert, ergibt sich folgende Formel:
(5) XN,X / XN,kal = (1 + E)-∆∆CT
∆∆CT = ∆CT,X – CT,kal
kal = Kalibrator
Die Konzentration des Zielgens normalisiert auf eine endogene Referenz
(Housekeeping-Gen) und in Relation zu einem Kalibrator gesetzt, lässt sich
näherungsweise wie folgt berechnen:
32
(6) XN,kal = 2-∆∆CT
Voraussetzung ist, dass die Amplifikationseffizienz des Ziel- und des Houskeeping-
Gens annähernd gleich ist. Die Amplifikationseffizienz wurde mit Hilfe einer cDNA-
Verdünnungsreihe bestimmt. Die ∆CT-Werte (CT-Werte des Housekeeping-Gens
subtrahiert vom CT-Werte des Zielgens) werden gegen den Zehnerlogarithmus der
eingesetzten cDNA Konzentration aufgetragen. Die Steigung der Regressionsgeraden
sollte kleiner 0,1 sein, da dann annähernd gleiche Amplifikationseffizienzen des
Housekeeping-Gens und des Zielgens vorliegen.
4.2.4 Gelelektrophorese
Die Gelelekrophorese diente der Kontrolle der PCR-Amplifikate, um die Identität der
PCR-Produkte zu gewährleisten und eine mögliche Verunreinigung durch
chromosomale DNA-Artefakte auszuschließen. Die PCR-Produktlänge wurde mit Hilfe
eines DNA-Längenstandards (100 bp Marker, Peqlab Erlangen), der zusammen mit den
Proben gelelektrophoretisch aufgetrennt wurde, ermittelt. Die Elektrophorese erfolgte in
horizontalen Gelen mit 2%-Agarose, die durch Kochen in 1 x TBE-Puffer gelöst wurde.
Nach Abkühlung auf ca. 40°C wurden 0,5 μl Ethidiumbromid (10 mg/ml) zugesetzt, das
in dsDNA interkaliert, die dadurch im UV-Licht fluoresziert. Je 10 μl der Amplifikate
wurden mit 5 μl Bromphenolblau-Puffer gemischt und in die Slots pipettiert. Die
Elektrophorese erfolgte bei RT unter einer konstanten Spannung von 2-9 V/cm. Die
Gele wurden mit dem Geldoc 200-System und der Quantity One Software (Biorad)
analysiert.
4.3 Westernblot
4.3.1 Membranprotein-Extraktion
MDCK-Zellen wurden in 50 mmol/l Tris-HCl (pH 7,4), 150 mmol/l NaCl, 1% Triton X-
100, 1% Deoxycholat, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), 5 mol/l Ethylen-Diamin-
Tetraacetic-Acid (EDTA) und Proteaseinhibitoren lysiert. Die bei –80°C gelagerten
Gewebeproben wurden in flüssigem Stickstoff pulverisiert, im Homogenisierungspuffer
[50 mmol/l Tris-HCl (pH 7.4), 150 mmol/l NaCl, 1 mmol/l EDTA] mit
Proteaseinhibitoren (1 mmol/l PMSF, 1 µg/ml Aprotinin und 1% Triton X-100)
extrahiert und in 10 mmol/l Tris-HCl (pH 7,5), 150 mmol/l NaCl und 1 mmol/l EDTA
33
mit Proteinaseinhibitoren homogenisiert. Danach folgte eine Zentrifugation bei 1000 x g
für 30 min bei 4°C um überschüssige Zellbestandteile und Kernmaterial zu entfernen.
Der Überstand wurde erneut zentrifugiert (100 000 x g für 60 min bei 4°C) um die
Membranfraktionen zu erhalten. Das Membranpellet wurde in Lysepuffer [50 mmol/l
Tris HCl (pH 7.4), 1% Nonidet P-40, 0,25% Sodiumdeoxycholat, 150 mmol/l NaCl und
1 mmol/l EGTA] mit Proteaseinhibitoren (Complete Protease Inhibitors, Roche Applied
Science) resuspendiert.
4.3.2 Elektrophorese, Elektrotransfer und Immunoblot
Die extrahierten Membranfraktionen der MDCK-Zellen bzw. aus humanem Myokard
wurden dann über ein denaturierendes, diskontinuierliches SDS-Polyacrylamidgel nach
ihrem Molekulargewicht aufgetrennt (Mini Protean System, BioRad). Die Migration der
Proteine in einer Polyacrylamidmatrix während der Elektrophorese ist von der Größe
der Proteine abhängig und ermöglicht so eine Auftrennung der Proteine nach ihrem
Molekulargewicht.
Zuerst wurde ein Trenngel (7,5% oder 10%) gegossen und darauf nach dessen
Aushärten ein Sammelgel (5%), in dem durch einen Kamm Taschen zur Beladung mit
den Proben freigehalten wurden. Die Taschen wurden dann mit jeweils 50-150 µg der
denaturierten Proteinproben geladen. Zur späteren Zuordnung der molekularen Größe
der Proteine wurde eine Spur mit einem Molekulargewichtsstandard (RotiMark, Roth)
beladen.
Die Elektrophorese wurde mit 10 mA/Gel gestartet und während des Laufens auf ca.
20-25 mA/Gel erhöht, wobei die Spannung einen Wert von 200 V nicht überschritt.
Wenn die Lauffront die Unterkante erreicht hatte (nach ca. 100 min), wurde die
Elektrophorese beendet. Die im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennten Proteine wurden
anschließend im Nassblotverfahren (Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell,
BioRad) in einem Tris-Glycin-Puffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol) auf
eine PVDF-Membran übertragen.
Die Absättigung unspezifischer Bindungsstellen auf der Membran erfolgte mit 5% in
TBST (Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20) gelöstem Magermilchpulver für
60 min bei Raumtemperatur. Die Inkubation der primären, gegen das jeweilige Protein
spezifischen Antikörper erfolgte über Nacht unter leichtem Schütteln bei 4°C.
34
Tabelle 4.5: Übersicht der verwendeten primären Antikörper
Protein Verdünnung Hersteller Klon-Nr. Sek. AK Verdünnung ABCG2 1:200 Alexis BXP-21 anti-mouse 1:10.000 ABCC5 1:200 Chemicon M5-I1 anti-mouse 1:10.000 ABCC7 1:200 Santa Cruz H-182 anti-mouse 1:10.000 ABCC8 1:200 Santa Cruz C-16 anti-mouse 1:10.000
Nach dreimaligem Waschen mit TBST für je 10 min folgte die Inkubation (1 h) mit
einem Peroxidase-gekoppelten Sekundär-Antikörper in 5% Trockenmilch/TBST. Die
Verdünnungen der einzelnen Antikörper sind der Tabelle 4.5 zu entnehmen.
Anschließend wurde noch einmal für je 10 min in TBST gewaschen und danach die
Membran für 5 min mit dem ECL Plus Western Blot Detetction Kit (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg) inkubiert, das ein Substrat der Peroxidase enthält, welches
nach Umsetzung eine Chemolumineszenz zeigt. Zur Visualisierung wurden Filme, je
nach Stärke der Lumineszenz für 30 sec bis 20 min belichtet und sofort entwickelt.
4.4 Zellkultur und und stabile Transfektion von MDCK-Zellen
ABCG2 cDNA im pCMV6-XL5-Vektor von der Firma Origene (Kat.-Nr. SC117127)
wurde in den Expressionsvektor pcDNA3.1/Hygro(-) (Invitrogen) umkloniert. MDCKII
(Mardin Darby canine kidney) Zellen wurden mit ABCG2-pcDNA3.1/ Hygro(-) stabil
transfiziert und BCRP-exprimierende Zellen wurden mit Hygromycin selektioniert.
Mittels real-time RT-PCR und Immunoblots wurden einzelne Klone auf das Ausmaß
ihrer ABCG2/BCRP-Expression untersucht. Der Klon mit der höchsten Expression
(MDCK-ABCG2) wurde für weitere Untersuchungen verwendet. Als Kontrollen
dienten transfizierte Zellen mit dem pcDNA3.1/Hygro(-)Vektor (MDCK-Kontrolle). Für
die Transportassays wurden die Zellen als Monolayer auf semiporösen Filtern
(Transwell) gezüchtet.
4.5 Immunfluoreszenz-Färbung von Gewebeschnitten und MDCK-Zellen
Die Lokalisation der Transporter im Gewebe und in den MDCK-Zellen erfolgte mittels
Immunfluoreszenzfärbung und konfokaler Mikroskopie. Dafür wurden 5 µm dicke
Kryoschnitte der Gewebeproben bzw. auf Objektträgern kultivierte MDCK-ABCG2-
und Kontrollzellen untersucht. Nach Inkubation mit dem primären Antikörper (Tab. 4.6)
wurden die Schnitte bzw. die MDCK-Zellen mit einem mit Alexa Fluor 488
konjugierten sekundären Antikörper (1:1000, Molecular Probes) inkubiert. Alle
35
Antikörper wurden in 5% Trockenmilch/TBST verdünnt, die Verdünnungen sind der
Tabelle 4.6 zu entnehmen. Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 gegengefärbt. F-Actin,
als Bestandteil von Muskelzellen, wurde mit Alexa Fluor 555 konjugierten Phalloidin
sichtbar gemacht. Die Immunfluoreszenz wurde mit einem konfokalen Zeiss Axiovert
Mikroskop und der Zeiss LSM 5 Pascal Software dokumentiert.
Tabelle 4.6: Übersicht über die für die Immunfluoreszenz verwendeten Antikörper
Protein Verdünnung Hersteller Klon-Nr. ABCG2 1:200 Alexis BXP-21 ABCC5 1:100 Chemicon M5 I-1 ABCC7 1:200 Santa Cruz H-182 ABCC8 1:200 Santa Cruz C-16
4.6 FACS-Analyse
Adhärente HEK-ABCG2- und HEK-Kontroll-Zellen wurden mit Natriumcitrat-Lösung
(135 mmol/l Kaliumchlorid, 15 mmol/l Natriumcitrat) in Suspension gebracht und
abzentrifugiert. Die in vorgewärmtem Optimem-Medium (Invitrogen) resuspendierten
Zellen wurden mit oder ohne BCRP-Inhibitor (10 µM Fumitremorgin C) oder
Testsubstanz (Rosiglitazon 0,01-100 µM) für 60 min präinkubiert, bevor das
fluoreszierende BCRP Substrat Pheophorbid A (10 µM) hinzugefügt wurde. Die
Inkubation mit Pheophorbid A erfolgte für 1 h bei 37°C und wurde durch rasches
Abkühlen auf Eis und sofortiger Entfernung des Mediums durch zweimaliges Waschen
der abzentrifugierten Zellpellets mit je 1 ml eiskaltem PBS gestoppt. Die Zellen wurden
anschließend in 2,5% FBS (fötales Rinderserum) in PBS resuspendiert. Die
intrazelluläre Akkumulation von Pheophorbid A wurde mittels Durchflusszytometrie
(FACScan Zytometer, Becton Dickinson) bestimmt. Exzitations- und
Emissionswellenlängen für Pheophorbid A lagen bei 488 bzw. 650 nm. Die Fluoreszenz
in den getesteten Populationen von mindestens 10 000 Zellen wurde durch Berechnung
der mittleren Fluoreszenz im Histogrammplot bestimmt.
Es wurde auch untersucht, ob die Substanz Rosiglitazon in dem für die Messung
verwendeten Exzitationswellenlängenbereich eine Eigenfluoreszenz aufweist, die die
korrekte Bestimmung der intrazellulären Substratakkumulation beeinflusst hätte. Die
von Rosiglitazon ausgehende Fluoreszenz war aber vernachlässigbar gering.
36
4.7 Transportassay
MDCK-ABCG2- bzw. MDCK-Kontroll-Zellen wurden auf semiporösen Filtern
(Transwell) ausgesät. Transportexperimente wurden durchgeführt sobald die Zellen auf
der Membran einen konfluenten Monolayer bildeten. Eine Stunde vor dem Start des
Transportexperiments wurde das Medium in jedem Kompartment durch serumfreies
Medium (Optimem, Invitrogen) ersetzt. Für die Transportversuche wurde das Medium
dann mit frischen 800 µl Optimem mit Zugabe von 0,01 µM, 0,1 µM bzw. 1 µM von
jeder einzelnen Substanz, ersetzt und zwar entweder in das basale oder apikale
Kompartiment des Transwell-Systems. Nach 1, 2, 3 und 4 Stunden wurden Aliquots von
je 100 µl dem jeweils gegenüberliegenden Kompartiment entnommen und die
Konzentration gemessen. Der Transport wurde prozentual zur zugefügten Menge
berechnet. Die Berechnung des Permeabilitätskoeffizienten erfolgte nach folgender
Formel:
Papp=dQ/dt*1/(A*C0) [cm/s]
dQ/dt (μmol/s)=initiale Transportrate nach 60 min
C0 (μmol/cm3)=initiale Konzentration im Entnahmekompartment
A (cm2)=Fläche des Monolayers
Die Substanz [14C]PhIP (Toronto Research Chemicals) wurde mit einer Konzentration
von 1 µmol/l als BCRP-Substrat verwendet. Die folgenden Substanzen in den
aufgeführten Konzentrationen wurden auf ihren BCRP-vermittelten Transport
untersucht:
Tabelle 4.7: Substanzen für den BCRP-Transport. Bis auf Metoprolol und Bisoprolol sind diese radioaktiv markiert.
Substanz Konzentration [3H]Aldosteron 0,1 μmol/l
[3H]Digoxin 0,01 μmol/l
[3H]Propranolol 1 μmol/l
[3H]Rosiglitazon 1 μmol/l
Bisoprolol 1 μmol/l
Metoprolol 0,1 μmol/l
Die Inhibition eines möglichen BCRP- oder P-Glykoprotein-vermittelten Transports
37
über konfluente MDCK-BCRP Monolayer erfolgte auf die gleiche Weise mit dem
BCRP-Inhibitor Fumitremorgin C (10 µmol/l) bzw. dem P-Glykoprotein-Inhibitor PSC-
833 (1 µmol/l, Novartis, Basel). Proben von je 100 µl wurden jede Stunde vom
gegenüberliegenden Kompartiment über 4 h hinweg entnommen, und die
Konzentrationen der radioaktiv markierten Substanzen wurden mittels
Szintillationszählung ermittelt. Die Konzentrationen von Metoprolol und Bisoprolol
wurden durch HPLC (high-performance liquid chromatography) bestimmt. Diese
Messungen führte Herr Daniel Auge in unserem Institut durch. Dextrorphan wurde als
interner Standard zur mobilen Phase der Proben in einer Verdünnung von 5:1
hinzugefügt. Das Injektionsvolumen betrug jeweils 100 µl. Die HPLC wurde mit einer
CC125/4 Nucleosil 120-3 C8 Hauptsäule und einer Vorsäule (Macherey&Nagel, Düren)
durchgeführt. Die mobile Phase bestand aus Acetonitril, Tetrahydrofuran und einer
wässrigen Pufferlösung im Verhältnis 2:1:17. Die Pufferlösung war zusammengesetzt
aus einem 0,02 mol/l Phosphatpuffer und 0,27 g/l 1-Octansulfonsäure-Natriumsalz, die
mit Phosphorsäure auf einen ph-Wert von 3,3 eingestellt wurde. Die Flussrate betrug 1-
1,5 ml/min, die Temperatur der Säule wurde bei 23°C konstant gehalten. Die
fluorometrische Messung erfolgte bei den Exzitations- und Emissionswellenlängen von
225 bzw. 310 nm. Abhängig von Anzahl der Proben wurden in jeden Lauf mindestens
vier Qualitätskontrollen mit verschiedenen Konzentrationen miteinbezogen.
4.8 Statistische Auswertung
Die Daten sind als arithmetische Mittelwerte +/- dem Standardfehler des Mittelwertes
(SEM) dargestellt. Der statistische Vergleich der Mittelwerte zweier unverbundener
Stichproben erfolgte mit dem Student’s t-Test. Der Vergleich mehrerer unverbundener
Stichproben wurde mit dem einfaktoriellen ANOVA-Test (Analysis of Variance) und
dem Post-Hoc Bonferroni-Test durchgeführt. Die Berechnung des
Korrelationskoeffizienten erfolgte nach Pearson. Die Änderung der Transporter-mRNA-
Expression im insuffizienten Myokard gegenüber gesundem Myokard wurde mit dem
One-Sample t-Test geprüft. Alle Berechnungen erfolgten mit dem Computerprogramm
Prism4 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA). Ein p-Wert kleiner als 0,05
(=p*) wurde als signifikant angenommen.
38
5 Ergebnisse
5.1 Die Expression der ABC-Transporter: Vergleich zwischen Herzgewebe und
extrakardialen Geweben
Die Gewebeproben aus linksventrikulärem Myokard wurden mittels real-time RT-PCR
auf die mRNA-Expression von ABC-Transportern hin untersucht. Die PCR-Amplifikate
wurden wie in 4.2.4 beschrieben, mittels Gelelektrophorese kontrolliert, um eine
eventuelle Coamplifikation z.B. von chromosomaler DNA auszuschließen. Insgesamt
ließ sich mit dieser Methode die mRNA von 46 der 48 bekannten ABC-Transporter
detektieren. Die Abb. 5.1 fasst die Ergebnisse in einer Heatmap-Darstellung zusammen.
Lediglich die mRNA der Transporter ABCC6 und ABCB11 konnte in keiner der
linksventrikulären Myokardproben detektiert werden. Transkripte von ABCG5 und
ABCG8 konnten nur in einigen, aber nicht in allen Gewebeproben detektiert werden.
Die mRNA von ABCG5 wurde in 83%, die von ABCG8 in 50% der Gewebeproben
detektiert.
Es wurde weiterhin die mRNA-Expression der ABC-Transporter in nicht-kardialen
humanen Geweben und Zelllinien mittels real-time RT-PCR bestimmt und mit der
Expression in linksventrikulärem Myokard verglichen. Folgende Gewebe und Zelllinien
wurden untersucht: menschliches Gehirn, Leber, Niere und Plazenta sowie die
Kolonkarzinom-Zelllinie Caco-2 und die embryonalen Nierenzelllinie HEK-293. Der
nicht im Myokard exprimierte Transporter ABCC6 war hingegen in der Niere, Leber,
Plazenta sowie in Caco-2-Zellen exprimiert. Die ebenfalls nicht im Myokard
nachweisbare ABCB11 mRNA ließ sich dagegen ausschließlich in der Leber detektieren.
Von ABCB11 ist bekannt, dass es im menschlichen Körper als Gallensäuretransporter
fungiert (Dean et al., 2001). Auch die mRNA von ABCG5 und ABCG8, die sich wie
oben beschrieben in kardialem Gewebe nur mäßig detektieren ließ, konnte gut
exprimiert in hepatischen Gewebeproben nachgewiesen werden. ABCG5 und ABCG8
bilden dort Homo- und Heterodimere und werden in der Literatur als für die Sekretion
von Sterinen in die Galle zuständig beschrieben (Dean et al., 2001). ABCG5 und
ABCG8 waren ebenfalls in menschlichen Nierengewebeproben als auch im
menschlichen Gehirn hoch exprimiert detektierbar. Die Genorte für ABCG5 und ABCG8
liegen auf dem Chromosom 2p21 direkt nebeneinander, was eine gemeinsame
Genregulation und das sehr ähnliche Expressionsmuster erklären könnte (Dean et al.,
2001).
39
Einige der untersuchten ABC-Transporter wurden im linksventrikulären Myokard im
Vergleich zu den anderen untersuchten humanen Geweben auffallend niedrig
exprimiert. Dies galt insbesondere für die mRNA von ABCB1, auch unter dem Namen
P-Glykoprotein bekannt, und für ABCG2 (= Breast Cancer Resistance Protein, BCRP).
Beide oben genannte Transportproteine pumpen unter ATP-Verbrauch Xenobiotika und
Arzneistoffe aus der Zelle und sind die für die Entstehung von
Medikamentenresistenzen in Säugetierzellen verantwortlich. Deren kardiale Expression
war ca. 1/1000 geringer als in anderen untersuchten Geweben und Zelllinien wie Leber,
Plazenta, Niere und Gehirn.
Einige Transporter waren in den Myokardproben im Vergleich zu den anderen
untersuchten Gewebeproben vergleichsweise hoch exprimiert. Die mRNA von ABCD2
zum Beispiel wurde fast ausschließlich in humanem Herz und Gehirn exprimiert. Dieses
Transportprotein wird wie die übrigen drei Mitglieder der ABCD-Familie in der
peroxisomalen Membran exprimiert und ist für den Transport langkettiger Fettsäuren in
die Peroxisomen verantwortlich (Dean et al., 2001).
Für eine dritte Gruppe von Transportern war die Expressionsstärke in allen untersuchten
Geweben und Zelllinien sehr ähnlich. Dies galt insbesondere für die Transporter der
ABCE/F-Familie. Im Gegensatz zu den meisten anderen ABC-Transportern enthalten
die ABCE/F-Proteine keine Transmembran-Domänen, sondern bestehen aus zwei
miteinander verknüpften Nukleotid-bindenden Domänen. Somit nehmen diese ABC-
Proteine keine klassische Transportfunktion wahr. Nach bisherigen Daten ist ABCE1 ein
Inhibitor der RNAse L, während ABCF-Proteine in die Kontrolle der Proteintranslation
involviert sind (Dean et al., 2001).
40
Abbildung 5.1: Vergleichende Übersicht des mRNA-Expressionsniveaus aller ABC-Transporter in humanen Geweben und Zelllinien. Es ist die relative Expressionsstärke jeweils bezogen auf das Expressionsniveau in gesundem lenksventrikulärem Myokard (=100%) in einer Heatmap-Darstellung angegeben. NF = linksventrikuläres Myokard von gesunden Spenderherzen; CM = linksventrikuläre Myokardproben von insuffizienten Herzen (NYHA III-IV).
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 2A
C9 2B C10 C11 C12
NF CM
Hirn Leber Niere
Plazenta Caco-2
HEK-293
D1 D2 D3 D4 E1 F1 F2 F3 G1 G2 G4 G5 G8 NF CM
Hirn Leber Niere
Plazenta Caco-2
HEK-293
ABC
ABC
A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A12 A13 NF CM
Hirn Leber Niere
Plazenta Caco-2
HEK-293
B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 NF CM
Hirn Leber Niere
Plazenta Caco-2
HEK-293
ABC
ABC
< 1%≥1 bis <3%
≥3 bis <10%≥10 bis <30%
≥30 bis <300%≥300 bis <1000%
≥1000 bis <3000%≥3000 bis <10000%
≥10000%
nicht detektierbardetektierbar
mRNA-Expressionrelativ zu NF
41
5.2 Die Expression der ABC-Transporter: Vergleich zwischen gesundem und
insuffizientem Myokard
In den initial erfolgten Untersuchungen der mRNA-Expression der ABC-Transporter
ging es zunächst darum, welche Transkripte der ABC-Transporter sich im Myokard
überhaupt detektieren lassen und wie sich deren Expressionsniveaus im Herzen im
Vergleich zu nicht-kardialen Geweben und Zelllinien verhalten. Im Weiteren soll der
Vergleich der Expressionsniveaus zwischen gesundem und insuffizientem Herzen
einerseits auf mRNA-Ebene, aber dann auch auf der für die Funktion der Transporter
entscheidende Proteinebene erfolgen.
5.2.1 Expressionsunterschiede auf mRNA-Ebene
5.2.1.1 ANP
ANP wird bei normaler Herzfunktion vor allem von den Vorhöfen gebildet, bei der
Herzinsuffizienz allerdings auch vermehrt ventrikulär exprimiert und freigesetzt. Wir
verglichen die linksventrikuläre mRNA-Expression von ANP in gesunden Herzen mit
der Expression in insuffizienten Herzen. Die Messungen erfolgten in denselben Proben,
die zuvor für die Untersuchung der Genexpression der ABC-Transporter verwendet
wurden. In unseren Gewebeproben von Patienten mit Herzinsuffizienz im NYHA-
Stadium III-IV ließ sich erwartungsgemäß eine signifikante Zunahme der ANP-
Expression im Vergleich zu den Proben aus gesundem Myokard nachweisen. In diesem
Kontrollexperiment konnten, wie in Abb. 5.2 gezeigt, die bisherigen Erkenntnisse über
die Expression von ANP auf mRNA-Ebene bei Herzinsuffizienz nachvollzogen werden.
42
Abbildung 5.2: ANP-Expression in insuffizientem linksventrikulärem Myokard im Vergleich zu Kontrollproben aus gesunden Spenderherzen (=NF). Die Daten wurden auf die jeweilige Expression des Houskeeping-Gens GAPDH normiert. DCM = dilatative Kardiomyopathie (n=15), ICM = ischämische Kardiomyopathie (n=5); **p<0,01, ***p<0,001.
*** 60
40
20
0 AN
P m
RN
A/G
APD
H m
RN
A in
%
**
NF DCM ICM
43
5.2.1.2 Transporter der ABCA-Familie
Die Gene für die Transporter ABCA6, ABCA8, ABCA9 und ABCA10 befinden sich in
einem Cluster auf Chromosom 17q24. Für diese Transporter zeigte sich eine
signifikante (p<0,05-0,01) Expressionssteigerung um das 1,84-2,23-fache in
insuffizientem Myokard verglichen mit gesundem Kontrollgewebe, während die
mRNA-Expression der übrigen Transporter der ABCA-Familie unverändert war (Abb.
5.3).
Abbildung 5.3: Darstellung der prozentualen Veränderung der mRNA-Expression der ABCA-Transporter in linksventrikulärem Myokard von insuffizienten Herzen (n=20) im Vergleich zu gesunden Spenderherzen (n=11); *p<0,05, **p<0,01.
44
5.2.1.3 Transporter der ABCB-Familie
Die Genexpression der ABCB-Transporter war insgesamt im insuffizienten Myokard im
Vergleich zu gesunden Kontrollen nur mäßig verändert. Eine signifikante (p<0,05-0,01)
Expressionsabnahme um bis zu 30% ließ sich für ABCB2, ABCB6 und ABCB9
detektieren. Eine Expressionszunahme für ABCB4 und ABCB5 in insuffizienten Herzen
wurde beobachtet, diese erwies sich allerdings nicht als signifikant (Abb. 5.4).
Abbildung 5.4: Darstellung der prozentualen Veränderung der mRNA-Expression der ABCB-Transporter in linksventrikulärem Myokard von insuffizienten Herzen (n=20) im Vergleich zu gesunden Spenderherzen (n=11). ABCB11 war in humanen Herzen nicht detektierbar (=n.d.); *p<0,05, **p<0,01.
45
5.2.1.4 Transporter der ABCC-Familie
Im Vergleich der ABCC-Transporterexpression von gesundem und krankem Myokard in
Hinblick auf die Expression von Transportern der ABCC-Familie ließen sich die
auffälligsten Veränderungen für ABCC3, ABCC5, ABCC7 und ABCC8 nachweisen. Das
Expressionsniveau von ABCC8 war in insuffizienten Herzen 3,99-fach erhöht (p<0,01),
während die mRNA-Expression von ABCC3, ABCC5 und ABCC7 auf 37%, 47% bzw.
28% der Expression in gesunden Kontrollen signifikant vermindert war (Abb. 5.5).
Abbildung 5.5: Darstellung der prozentualen Veränderung der mRNA-Expression der ABCC-Transporter in linksventrikulärem Myokard von insuffizienten Herzen (n=20) im Vergleich zu gesunden Spenderherzen (n=11). ABCC6 war in humanen Herzen nicht detektierbar (=n.d.); **p<0,01, ***p<0,001.
Änd
erun
g de
r mR
NA
-Exp
ress
ion
(% v
on N
F)
46
5.2.1.5 Transporter der ABCD-, ABCE-, ABCF- und ABCG-Familie
ABCD1, der einen peroxismalen Transporter für langkettige Fettsäuren kodiert, wies in
insuffizienten Herzen eine signifikant niedrigere Expression (-27%, p<0,05) auf als in
gesunden Herzen. Die mRNA-Expressionsniveaus der übrigen Mitglieder der ABCD-
Familie sowie der ABCE und ABCF-Transporter zeigten keinen signifikanten
Unterschied zwischen gesunden und insuffizienten Herzen. ABCG1 wies eine
signifikant niedrigere Expression (-31%, p<0,01) in insuffizienten Herzen auf, während
für die mRNA von ABCG2 im insuffizienten Herzen eine signifikant höhere Expression,
und zwar um 260% im Vergleich zu gesundem Myokard (p<0,001), zu detektieren war.
Die Daten sind in der Abb. 5.6 zusammengefasst. Die ABCG2 mRNA-Expression
korrelierte signifikant mit der linksventrikulären ANP-mRNA-Expression (Abb. 5.7;
Pearson p<0,001).
Abbildung 5.6: Darstellung der prozentualen Veränderung der ABCD-, ABCE-, ABCF- und ABCG-Transporter in linksventrikulärem Myokard von insuffizienten Herzen (n=20) im Vergleich zu gesunden Spenderherzen. ABCG5 und ABCG8 waren in humanen Herzen nicht detektierbar (=n.d.); *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001.
Änd
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(% v
on N
F)
47
Abbildung 5.7: Korrelation der ANP (x-Achse) und ABCG2 mRNA-Expression (y-Achse) in linksventrikulären Gewebeproben von insuffizienten explantierten Herzen (CM) und gesunden Spenderherzen (NF). Korrelationskoeffizient nach Pearson r=0,62; p<0,0005.
r=0.63 p=0.0005 CM
4
3
2
1
0
0.1 1 10 100 ANP mRNA (relative Expression)
ABCG2
Expression (relati
ve Expression)
4
3
2
1
0
0.1 1 10 100
NF
CM
ANP mRNA (relative Expression)
AB
CG
2 m
RN
A (r
elat
ive
Expr
essi
on)
48
5.2.2 Proteinexpression
Mittels Westernblot wurde die Proteinexpression solcher ABC-Transporter untersucht,
die auf mRNA-Ebene die größten Expressionsunterschiede zwischen insuffizienten und
gesunden Herzen zeigten, nämlich ABCC5, ABCC7, ABCC8 und ABCG2. Die
Untersuchung der Proteinexpression diente der Klärung der Frage, ob die
Veränderungen auf transkriptioneller Ebene direkte Auswirkungen auf die Menge des
exprimierten Transportproteins haben. Da nur die in die Zellmembran integrierten
Transporter funktionell aktiv sind, wurde deren Expression in der Membranfraktion der
Herzgewebe bestimmt.
5.2.2.1 ABCC5
ABCC5 konnte mit dem verwendeten Antikörper in den Membranfraktionen aus
Myokardproben als Protein mit dem erwarteten Molekulargewicht von 161 kDa
spezifisch detektiert werden. Als Ladungskontrolle wurde die Menge des
Standardproteins Calsequestrin (CSQ) bestimmt und die Daten darauf normiert. Die
Expression von ABCC5 war im insuffizienten Myokard signifikant (p<0,01), wie in
Abb. 5.8 dargestellt, um 55% im Vergleich zu gesunden Kontrollen vermindert. Diese
geringere Expression auf Proteinebene korreliert mit der bereits auf mRNA-Ebene
nachgewiesenen niedrigeren Expression um 53% im insuffizienten Myokard.
49
Abbildung 5.8: Proteinexpression von ABCC5 im insuffizienten linksventrikulären Myokard (CM, n=20) im Vergleich zu gesunden Herzen (NF, n=11). Die Expression wurde auf das in Zellen exprimierte Standardprotein Calsequestrin (CSQ) normiert. Links: Repräsentativer Westernblot. Rechts: Quantitative Auswertung nach Densitometrie der Blots; **p<0,01.
NF CM 0
1
2
**
ABCC5
CSQ
NF CM
50
5.2.2.2 ABCC7
Für ABCC7 konnte in insuffizientem Myokard eine um 28% niedrigere Expression
nachgewiesen werden. Das Gen von ABCC7 ist sehr groß und kodiert in 27 Exons für
ein 6,5 Kilobasen großes Transkript, von dem ein Protein aus 1480 Aminosäuren
gebildet wird. Es wird im endoplasmatischen Retikulum synthetisiert und das zunächst
noch unreife und unglykosylierte Proteinprodukt im Sinne einer postranslationalen
Modifikation zu einem reifen Protein glykosyliert. Immunoblots, inkubiert mit dem
anti-CFTR Antikörper, wiesen 3 verschiedene Banden auf: eine obere Bande bei
ungefähr 180 kDa entspricht dem reifen (maturen), während die beiden unteren Banden
bei ungefähr 140-150 kDa den unreifen (immaturen) ABCC7 Chlorid-Kanalproteinen
entsprechen (Zaman et al., 2001). Die Expression des reifen Proteins nahm im Vergleich
zu den Kontrollen aus gesunden Spenderherzen in insuffizienten Herzen signifikant um
52% ab (p<0,01, Abb. 5.9).
Abbildung 5.9: Proteinexpression von ABCC7 im insuffizienten linksventrikulären Myokard (=CM, n=20) im Vergleich zu gesunden Spenderherzen (=NF, n=11). Die Expression wurde auf das in Zellen exprimierte Standardprotein Calsequestrin (CSQ) normiert. Links: Repräsentativer Westernblot. Rechts: Quantitative Auswertung nach Densitometrie der Blots; **p<0,01.
NF CM 0
1
2
**
NF CM
CSQ
reifes ABCC7 unreifes ABCC7
51
5.2.2.3 ABCC8
Der Transporter ABCC8, auch als Sulfonylharnstoffrezeptor 1 (SUR 1) bezeichnet,
bildet eine regulatorische Untereinheit des ATP-abhängigen Kaliumkanals (KATP). Auf
mRNA-Ebene ließ sich dieser Transporter, im Gegensatz zu den vorher genannten
ABCC-Transportern ABCC5 und ABCC7 in insuffizientem Myokard signifikant um das
fast Vierfache höher exprimiert detektieren (p<0,05). Auf Proteinebene konnte dies
bestätigt werden. Dort ließ sich für das Transporterprotein von ABCC8 in insuffizienten
Herzen eine zweifach höhere Expression als in gesunden Herzen nachweisen (p<0,05;
Abb. 5.10).
Abbildung 5.10: Proteinexpression von ABCC8 im insuffizienten linksventrikulären Myokard (=CM, n=20) im Vergleich zu gesunden Spenderherzen (=NF, n=11). Die Expression wurde auf das in Zellen exprimierte Standardprotein Calsequestrin (CSQ) normiert. Links: Repräsentativer Westernblot. Rechts: Quantitative Auswertung nach Densitometrie der Blots; *p<0,05.
NF CM 0
1
2
3
4 *
ABCC8
CSQ
NF CM
52
5.2.2.4 ABCG2
Für ABCG2 ließen sich ähnliche Ergebnisse wie für ABCC8 nachweisen. Im Gegensatz
zu ABCC8 ist ABCG2 nicht an der Elektrolytregulation beteiligt, sondern für den
Transport von Xenobiotika, dies beinhaltet den Transport von Arzneistoffen,
verantwortlich. Dieser Transporter spielt zudem in der Resistenzentstehung von
Tumorgewebe gegen therapeutisch wichtige Zytostatika eine bedeutende Rolle. Der
monoklonale Antikörper BXP-21 detektiert eine spezifische Bande in der erwarteten
Höhe von ca. 72 kDa. Als Positivkontrolle mit dem Nachweis eines ebenfalls 72 kDa
großen Proteins wurde ein Proteinextrakt aus der menschlichen Plazenta verwendet. In
der Plazenta wird ABCG2 bekanntlich in den apikalen Membranen von
Synzytiotrophoblasten relativ hoch exprimiert (Allikmets et al., 1998). ABCG2 war in
insuffizientem Myokard im Vergleich zu gesundem Myokard signifikant zweifach höher
exprimiert (p<0,05, Abb. 5.11). Dieser Befund korreliert mit der veränderten Expression
von ABCG2 auf mRNA-Ebene.
Abbildung 5.11: Proteinexpression von ABCG2 im insuffizienten linksventrikulären Myokard (=CM, n=20) im Vergleich zu gesunden Spenderherzen (=NF, n=11). Die Expression wurde auf das in Zellen exprimierte Standardprotein Calsequestrin (CSQ) normiert. Links: Repräsentativer Westernblot. Rechts: Quantitative Auswertung nach Densitometrie der Blots; *p<0,05.
NF CM 0
1
2
3
4 *
Plazenta
ABCG2
CSQ
NF CM
53
5.2.3 Immunfluoreszenz
Als ein Schritt zur Abschätzung der pathophysiologischen Bedeutung der Transporter,
deren Expression im insuffizienten gegenüber gesundem Myokard deutlich verändert
ist, ist die Klärung der Frage nach ihrer Gewebelokalisation von Bedeutung. Die
Lokalisation im insuffizienten linksventrikulären Myokard wurde für ABCC7 (CFTR),
ABCC8 (SUR1) und ABCG2 mittels Immunfluoreszenz untersucht.
Zunächst erfolgte die Inkubation der Kryoschnitte mit einem gegen den jeweiligen
ABC-Transporter gerichteten und bereits im Westernblot charakterisierten spezifischen
primären Antikörper und anschließender Inkubation mit einem grün-fluoreszierenden
(Alexa Fluor 488) sekundären Antikörper.
Kontrollschnitte wurden mit Präimmunserum inkubiert. In allen Schnitten war eine für
Herzmuskelgewebe charakteristische Hintergrundfluoreszenz auffällig. F-Actin in
Kardiomyozyten und glatten Muskelzellen wurden mit Alexa Fluor 555-konjugiertem
Phalloidin (rote Fluoreszenz) sichtbar gemacht. Die Kerngegenfärbung erfolgte mit dem
blau fluoreszierenden Farbstoff Hoechst 33342.
5.2.3.1 ABCC7
In den Gewebeschnitten von insuffizienten Herzen zeigte sich eine Immunoreaktivität
gegen ABCC7 mit einer spezifischen Fluoreszenz in den Endothelzellen von kleinen
Gefäßen, sowie etwas schwächer im Sarkolemm von Kardiomyozyten (Abb. 5.12).
Hingegen ließ sich ABCC7 in den Kontrollschnitten nur sehr schwach durch
Immunfluoreszenz detektieren.
Abbildung 5.12: Immunfluoreszenz von ABCC7. Im ersten Bild ist die deutliche Expression von ABCC7 (grün fluoreszierend) in den Endothelzellen eines kleinen Gefäßes (Pfeile) dargestellt. Im zweiten Bild sieht man die Expression von ABCC7 (grün) in Kardiomyozyten. Rot fluoreszierende Gegenfärbung von F-Actin in Gefäß- und Herzmuskelzellen und blau fluoreszierende Gegenfärbung der Zellkerne. Rechts: Mit Präimmunserum inkubierte Kontrollschnitte.
54
5.2.3.2 ABCC8
Für ABCC8 ließ sich in der Immunfluoreszenzfärbung eine deutliche Expression dieses
Transporters in Endothelzellen von kleinen Gefäßen sowie in der Zellmembran von
Kardiomyozyten nachweisen (Abb. 5.13). In mit Präimmunserum inkubierten
Kontrollschnitten zeigte sich dagegen keine spezifische Fluoreszenz.
Abb. 5.13: Immunfluoreszenz von ABCC8. Im ersten Bild ist die deutliche Expression von ABCC8 (grün fluoreszierend) in den Endothelzellen eines kleinen Gefäßes (Pfeile) dargestellt. Im zweiten Bild sieht man die Expression von ABCC8 (grün) in Kardiomyozyten. Rot fluoreszierende Gegenfärbung von F-Actin in Gefäß- und Herzmuskelzellen und blau fluoreszierende Gegenfärbung der Zellkerne. Rechts: Mit Präimmunserum inkubierte Kontrollschnitte (links ein Gefäßanschnitt, rechts Herzmuskelzellen).
5.2.3.3 ABCG2
Nach Inkubation der Gewebeschnitte von insuffizienten Herzen mit dem spezifischen
ABCG2-Primärantikörper BXP-21 und dem Alexa Fluor 488-konjugierten
Sekundärantikörper wiesen diese eine starke Färbung der Kapillarendothelien auf (Abb.
5.14). Das Sarkolemm von Kardiomyozyten zeigte sich ebenfalls deutlich gefärbt.
Abbildung 5.14: Immunfluoreszenz von ABCG2. Im ersten Bild ist die deutliche Expression von ABCG2 (grün fluoreszierend) in den Endothelzellen eines kapillären Gefäßes (Pfeilspitzen) dargestellt. Man sieht ebenfalls deutlich die Grünfärbung der Kardiomyozyten. Rot fluoreszierende Gegenfärbung von F-Actin in Gefäß- und Herzmuskelzellen und blau fluoreszierende Gegenfärbung der Zellkerne. Rechts: Mit Präimmunserum inkubierter Kontrollschnitt.
55
5.3 Die Transportfunktion von ABCG2
Da sich der Transporter ABCG2 in den bisherigen Untersuchungen als einer der
Transporter erwies, dessen Expression sich in kranken Herzen mit am deutlichsten auf
mRNA- sowie auf Proteinebene veränderte, sollten nun für diesen Transporter genauere
Untersuchungen bezüglich seines Transportprofils einiger herzwirksamer Medikamente
erfolgen. ABCG2 ist für seine Resistenzbildung gegen bestimmte Arzneistoffe bekannt.
Während die bisherigen Untersuchungen die Bedeutung von ABCG2 für den Efflux von
Zytostatika aus Tumorzellen im Fokus hatten, ist vergleichsweise weniger über seine
Bedeutung als Effluxtransporter für andere Arzneistoffe bekannt.
Für die Transportversuche wurden polarisiert wachsende Mardin-Darby canine kidney
(MDCK) Zellen mit stabiler Überexpression des humanen ABCG2 verwendet. Die
Zelllinie wurde durch Nachweis der ABCG2-Überexpression im Westernblot (Abb.
5.15) und durch Immunfluoreszenz (Abb. 5.16) charakterisiert. Die Behandlung der
MDCK-ABCG2-Zellen mit Natrium-Butyrat (5 mM über 24h), einem
Histondeactylase-Inhibitor und Induktor der Genexpression, führte zu keiner weiteren
Steigerung der rekombinanten ABCG2-Proteinexpression.
Abb. 5.15: Proteinexpression der transfizierten Zellen. Dargestellt ist die Proteinexpression von ABCG2 in den transfizierten MDCK-Zellen im Vergleich zu nicht-transfizierten Kontrollzellen mittels Westernblot, einmal mit und einmal ohne Zugabe von Natrium-Butyrat. Man sieht in den transfizierten Zellen eine Bande unterhalb von 77kDa, die dem ABCG2-Protein entspricht. Zum Vergleich wurde Lysat aus humaner Plazenta dargestellt, die eine hohe ABCG2-Expression aufweist, untersucht. GAPDH wurde als Ladekontrolle detektiert.
Humane Plazenta
GAPDH
77 kDa ABCG2
- + - + 5 mM Butyrat
MDCKII MDCKII ohne ABCG2 mit ABCG2
56
Zur Lokalisation von ABCG2 in den transfizierten MDCKII-Zellen wurden die
transfizierten Zellen nach Immunfluoreszenz-Färbung mittels konfokaler
Laserscanningmikroskopie untersucht. Es zeigte sich, dass die Expression von ABCG2
auf die apikale Membran begrenzt war (Abb. 5.16).
Abbildung 5.16: ABCG2-Immunfluoreszenz (grün) in MDCKII-ABCG2-Zellen. Rot: Gegenfärbung mit Propidiumiodid. Man sieht eine deutliche Färbung der MDCK-Zellen. In den Schnittbildern entlang der z-Achse wird die apikale Lokalisation des Transporters in den Zellen deutlich.
Zur funktionellen Charakterisierung der MDCKII-ABCG2 Zelllinie erfolgte zunächst
ein Transportversuch mit dem prototypischen ABCG2-Substrat PhIP in An- oder
Abwesenheit des ABCG2-Inhibitors Fumitremorgin C.
Der transepitheliale Transport des ABCG2-Substrats PhIP war in den mit ABCG2-
transfizierten MDCKII-Zellen deutlich in apikaler Richtung erhöht (Papp [basal-apical]
27,5±3,1 cm/s * 10-6) und lag im Vergleich zu den Vektor Kontrollzellen (Papp [basal-apical]
18,6±0,7 cm/s * 10-6; Papp [apical-basal] 16,9±1,8 cm/s * 10-6) in basolateraler Richtung
deutlich niedriger (Papp [apical-basal] 2,1±0,1 cm/s * 10-6).
In Anwesenheit des spezifischen ABCG2-Inhibitors Fumitremorgin-C war der
asymmetrische Transport von PhIP in apikaler Richtung vollständig aufgehoben und
entsprach dem in MDCK-Kontrollzellen.
57
Abb. 5.17: Transzellulärer Transport des ABCG2-Substrats PhIP in MDCK-ABCG2 Monolayer in Ab- oder Anwesenheit des ABCG2-Inhibitors Fumitremorgin C sowie in vektortransfizierten MDCK-Kontrollzellen. a->b: Translokation vom apikalen in das basolaterale Kompartment, b->a: Translokation vom basolateralen ins apikale Kompartment.
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
80 80 80
60 60 60
40 40 40
20 20 20
0 0 0
MDCK-ABCG2 MDCK-ABCG2 +10µM Fumitremorgin C
MDCK-Kontrolle
b->a a->b
b->a a->b
b->a a->b
Zeit (h) Zeit (h) Zeit (h)
PhIP
-Tra
nspo
rt (%
)
PhIP
-Tra
nspo
rt (%
)
PhIP
-Tra
nspo
rt (%
)
58
Für Aldosteron, Propranolol, Metoprolol und Bisoprolol konnte kein gerichteter
transzellulärer Transport nachgewiesen werden (Abb. 5.18). Diese Substanzen wiesen in
den ABCG2-transfizierten Zellen in beide Richtungen, also von apikal nach basolateral,
sowie von basolateral nach apikal, annähernd gleiche Transportraten auf.
Abbildung 5.18: Transzellulärer Transport der Substanzen Aldosteron, Propranolol, Metoprolol und Bisoprolol in MDCK-ABCG2 Monolayer. a->b: Transport vom apikalen in das basolaterale Kompartment, b->a: Transport vom basolateralen ins apikale Kompartment
MDCK-ABCG2 MDCK-ABCG2
MDCK-ABCG2 MDCK-ABCG2
Zeit (h) Zeit (h)
Zeit (h) Zeit (h)
0 1 2 3 4 5
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
0 1 2 3 4 5
Ald
oste
ron-
Tran
spor
t (%
)
Prop
rano
lol-T
rans
port
(%)
Met
opro
lol-T
rans
port
(%)
Bis
opro
lol-T
rans
port
(%)
25
20 25 20
15 15 10 10
5 5
0 0
0 0
b->a a->b
b->a a->b
b->a a->b b->a
a->b
40 40
30 30
20 20
10 10
59
In transfizierten MDCK-ABCG2-Zellen wurde für Digoxin ein gerichteter Transport in
apikaler Richtung beobachtet (Abb. 5.19). Dieser gerichtete Transport wurde auch in
den MDCK-Kontrollzellen gesehen.
Abbildung 5.19: Transzellulärer Digoxin-Transport im MDCK-ABCG2 Monolayer im Vergleich zu Kontrollzellen. a->b: Transport von apikal nach basolateral, b->a: Transport von basolateral nach apikal.
b->a a->b
b->a a->b
10 10
15 15
5 5
0 0 Dig
oxin
-Tra
nspo
rt (%
)
Dig
oxin
-Tra
nspo
rt (%
) 0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
MDCK-ABCG2 MDCK-Kontrolle
Zeit (h) Zeit (h)
60
Im Gegensatz dazu konnte ein signifikanter Transport von Rosiglitazon in apikaler
Richtung (Papp [basal-apical] 36,0±1,2 cm/s * 10-6; P app [apical-basal] 23,4±1,2 cm/s * 10-6; n=5,
p<0,0001) beobachtet werden, der vollständig mit dem ABCG2-Inhibitor
Fumitremorgin-C, aber nicht mit dem P-Glykoprotein-Inhibitor PSC-833 gehemmt
werden konnte (Abb. 5.20 und 5.21).
Abbildung 5.20: Rosiglitazon-Transport im MDCK-ABCG2 Monolayer im Vergleich zu den Kontrollzellen. Ein deutlicher apikaler Transport in den transfizierten Zellen ist zu erkennen. a->b: Transport von apikal nach basolateral, b->a: Transport von basolateral nach apikal.
Abbildung 5.21: Rosiglitazon-Transport im MDCK-ABCG2 Monolayer, einmal mit dem ABCG2-Inhibitor Fumitremorgin-C im Vergeich mit dem P-Glykoprotein-Inhibitor PSC-833. Eine deutliche Hemmung des Transports unter Fumtremorgin-C im Vergleich zu PSC-833 ist zu erkennen. a->b: Transport von apikal nach basolateral, b->a: Transport von basolateral nach apikal.
0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 Zeit (h) Zeit (h)
b->a
a->b
b->a
a->b
Ros
iglit
azon
-Tra
nspo
rt (%
)
Ros
iglit
azon
-Tra
nspo
rt (%
)
Ros
iglit
azon
-Tra
nspo
rt (%
)
0 1 2 3 4 5 0 1 2 3 4 5
b->a a->b
b->a a->b
Zeit (h) Zeit (h)
60 60
60 60
50 50
50 50
40 40
40 40 30 30
30 30 20 20
20 20
10 10
10 10 0 0
0 0
MDCK-ABCG2 MDCK-Kontrolle
MDCK-ABCG2 +10 µM Fumitremorgin C
MDCK-ABCG2 + 1 µM PSC-833
Ros
iglit
azon
-Tra
nspo
rt (%
)
0 1 2 3 4 5 Zeit (h)
0 1 2 3 4 5 Zeit (h)
61
Des Weiteren führt Rosiglitazon in mit ABCG2 stabil transfizierten HEK-Zellen zu
einer Akkumulation des fluoreszierenden ABCG2-Substrats Pheophorbid A, die
durchflusszytometrisch quantifiziert wurde (Abb. 5.22). Der maximale hemmende
Effekt von Rosiglitazon (100 µM) auf den ABCG2-abhängigen Pheophorbid A-
Transport betrug 93% (IC50 25,0 µM), der durch Fumitremorgin-C (10 µM) erzielbaren
Hemmung (Abb. 5.23). Im selben experimentellen Ansatz wurde auch Propafenon als
Inhibitor von ABCG2 getestet. Propafenon erwies sich als ein schwacher Inhibitor mit
einem IC50 -Wert von 285 µM.
Abbildung 5.22: Mittels FACS-Analyse ermittelter inhibitorischer Effekt von Rosiglitazon auf den ABCG2-abhängigen Efflux des ABCG2-Substrates Pheophorbid A (10 µM) in ABCG2-transfizierten HEK-Zellen. Dargestellt ist schwarz: der Pheophorbid A-Gehalt in HEK-ABCG2-Zellen ohne Inhibitor, rot: Pheophorbid A-Gehalt in HEK-ABCG2-Zellen nach Zugabe von 100 µM Rosiglitazon, blau: Pheophorbid A-Gehalt in HEK-ABCG2-Zellen nach Zugabe von 10 µM Fumitremorgin-C.
HEK-ABCG2
Kontrolle
+ Rosiglitazon (100 µM)
+ Fumitremorgin-C (10
µM)
100 101 102 103 104
Counts 200
160
120
80
40
0
62
Abbildung 5.23: Konzentrationsabhängige Inhibition des ABCG2-vermittelten Transports des ABCG2-Substrats Pheophorbid A in ABCG2-transfizierten HEK-Zellen durch Rosiglitazon und Propafenon. Die Daten wurden durch FACS-Analysen, wie exemplarisch in Abb. 5.22 gezeigt, generiert. n=3; *p<0,05.
63
6 Diskussion
6.1 Fragestellung
In dieser Arbeit ging es im ersten Schritt darum, eine Übersicht über die Expression der
ABC-Transporter im menschlichen Myokard zu erstellen und somit der Bedeutung der
ABC-Transporter für physiologische Vorgänge im menschlichen Herzgewebe
näherzukommen. Welche ABC-Transporter werden im menschlichen Myokard
überhaupt exprimiert, wie ist ihre Verteilung im Vergleich zu nicht-kardialen Geweben
zu beurteilen? Gibt es Expressionsunterschiede zwischen gesundem und insuffizientem
Myokard? Welche Rückschlüsse lassen sich auf die pathophysiologischen Vorgänge bei
der Entstehung der Herzinsuffizienz ziehen und inwieweit sind ABC-Transporter daran
beteiligt? Inwiefern spielen ABC-Transporter eine Rolle bei der Verteilung von
Arzneistoffen im Herzen?
6.2 Kardiale mRNA-Expression der ABC-Transporter
Die Zielsetzung dieser Arbeit war zunächst die Expression aller ABC-Transporter im
menschlichen Myokard systematisch zu erfassen. Mittels PCR konnten 46 von 48
Transportern im Herzen detektiert werden, lediglich die Transporter ABCC6 und
ABCB11 ließen sich nicht im Myokard nachweisen. ABCC6 wird v.a. in Leber und
Niere exprimiert, ABCB11 ist die in der Leber exprimierte kanalikuläre Exportpumpe
für Gallensalze (Gerloff et al., 1998). Transkripte der Steroltransporter ABCG5 und
ABCG8 konnten in einigen, aber nicht in allen Herzgewebeproben nachgewiesen
werden. Übereinstimmend mit der Literatur fand sich die höchste Expression dieser
Transporter in der Leber. Ihre Gen-Loci befinden sich auf Chromosom 2p21, wo sie
direkt nebeneinander liegen. Diese chromosomale Organisation könnte das auffallend
ähnliche Expressionsmuster der zwei Transporter in den Geweben und ihre ähnliche
Regulation, z.B. die Induktion ihrer Expression durch Cholesterol (Dean et al., 2001),
erklären.
Interessant war die in allen Geweben gleichmäßige Expressionstärke der Transporter
der ABCE und ABCF-Familie. Diese Mitglieder der ABC-Transporter sind im
eigentlichen Sinne keine Transporter, denn sie besitzen keine Transmembrandomänen
und sind somit zytosolische Proteine. Es wird vermutet, dass sie Regulatoren von
Translation und Transkription sind, also für die Zelle elementare Vorgänge regulieren
64
(Kerr et al., 2004). Das könnte wiederum ihre konstitutive Expression in allen Geweben
und Zellen ohne erkennbare Spezifität für ein bestimmtes Organ erklären.
Im Vergleich der mRNA-Expression zwischen gesundem und krankem Myokard fand
sich für die ABCA-Familie in den insuffizienten Herzen ABCA6, ABCA8, ABCA9 und
ABCA10 signifikant vermehrt. Die besondere chromosomale Organisation dieser Gene,
die zusammen in einem Cluster auf Chromosom 17q24 lokalisiert sind, könnte ihre
gemeinsam veränderte Expression durch gemeinsame Regulationsmechanismen
erklären. Da weder Substrate noch Funktion der ABCA6 und ABCA8-9-Transporter
vollständig bekannt sind, ist eine Interpretation unserer Befunde gegenwärtig nicht
möglich. ABCA5, ein in den Lysosomen lokalisierter Transporter, wurde mit der
Entwicklung von Herzerkrankungen in Zusammenhang gebracht. Mäuse mit einer
Deletion des Abca5-Gens entwickeln eine dilatative Kardiomyopathie und versterben
vorzeitig an den Folgen der Herzinsuffizienz (Kubo et al., 2005). In unserer Studie ließ
sich keine relevante Expressionsänderung von ABCA5 in insuffizienten Herzen im
Vergleich zu normalen Spenderherzen nachweisen. Die Bedeutung des lysosomalen
Transortproteins für die Entstehung von Kardiomyopathien des Menschen bleibt somit
unklar.
Einer der am besten untersuchten ABC-Transporter ist ABCB1, auch als P-Glykoprotein
bekannt. Er ist u.a. für den zellulären Export verschiedenster Arzneistoffe und für die
Entstehung von Arzneimittelresistenzen verantwortlich. Wie vorbeschrieben (Dean et
al., 2001) war ABCB1 auch in unserer Studie in Leber, Plazenta und Niere besonders
hoch exprimiert. Die mRNA-Expression im Myokard war dagegen äußerst niedrig, so
dass ABCB1 im Herzen aufgrund seiner geringen Expression die Verteilung von
Arzneistoffen im Myokard vermutlich nicht beeinflusst.
Diese Studie zeigte erstmalig, dass kardiale Ionenkanäle, wie ABCC7 (Chloridkanal)
und ABCC8 (regulatorische Untereinheit des ATP-abhängigen Kaliumkanals), im
insuffizienten Herzen auf mRNA- sowie auf Proteinebene verändert exprimiert sind.
Basierend auf der Annahme, dass die Verteilung der kardialen Kalium- und
Chloridkanäle die zelluläre Erregbarkeit und die sogenannte ischämische
Präkonditionierung (ischemic preconditioning, IPC) maßgeblich beeinflussen, könnten
merkliche Veränderungen ihrer Expression zur Entstehung von Arrhythmien beitragen
und die Ischämieresistenz der Zellen beeinflussen. Daher soll nun auf diese Transporter
im Einzelnen weiter eingegangen werden.
65
6.3 ABCC7 und seine Bedeutung für die Entstehung von Arrhythmien
Nach unseren Befunden ist in insuffizientem linksventrikulärem menschlichem
Myokard die Expression von CFTR/ABCC7 auf ca. die Hälfte der Expression im
gesunden Kontrollmyokard vermindert. Das „Remodelling“ des CFTR-Kanals wurde
zuvor in einem Tiermodell der Herzinsuffizienz untersucht (Wong et al., 2000). Hierzu
wurde die ABCC7-Expression im linksventrikulären Myokard von Kaninchen, bei
denen durch kombinierte Druck- und Volumenbelastung eine Herzinsuffizient ausgelöst
worden war, mittels in-situ mRNA-Hybridisierung untersucht. Es fand sich eine
Änderung des epikardial-endokardialen Gradienten der ABCC7 mRNA-Expression mit
einer signifikanten Abnahme der epikardialen Expression. Umgekehrt fand sich eine
Zunahme der ANP mRNA-Expression im hypertrophierten Ventrikel mit einer
präferentiellen Reexpression im subendokardialen Gewebe. Das Expressionsmuster von
ABCC7 und ANP im hypertrophierten, insuffizienten Herzen entsprach dem zuvor im
embryonalen Herzen des Kaninchens beobachteten Expressionsmuster und wurde als
Rückkehr eines fetalen Expressionsphänotyps auch des CFTR-Kanals im
hypertrophierten insuffizienten Myokard gedeutet (Wong et al. 2000, Wong et al. 2000).
Das Genprodukt von ABCC7, ein membranständiger Cl--Kanal, ist unter basalen
Bedingungen geschlossen und kann Proteinkinase A (PKA) und Proteinkinase C (PKC)
–abhängig aktiviert werden. Seine wesentliche physiologische Bedeutung im Herzen
liegt darin, dass der CFTR-Chloridkanal die mit der β-adrenergen Stimulation
verbundene Verlängerung der Aktionspotenzialdauer vermindert oder antagonisiert
(Duan et al. 2005). Demnach verhindert eine Aktivierung des CFTR-Chloridkanals eine
exzessive Verlängerung des Aktionspotenzials und schützt das Herz vor frühen
Nachdepolarisationen, die durch Aktivierung der Ca2+-Kanäle in der Folge der β-
adrenergen Stimulation auftreten können. Darüber hinaus scheint CFTR eine Rolle bei
der ischämischen Präkonditionierung zu spielen. Das Phänomen der ischämischen
Präkonditionierung ist ein endogener myokardprotektiver Mechanismus, bei dem
wiederholte kurze Ischämieperioden das Myokard gegenüber vollständigen
Gefäßverschlüssen weniger vulnerabel machen. Der Knockout des Abcc7-Gens in
Mäusen hob den protektiven Effekt der ischämischen Präkonditionierung auf (Chen et
al. 2004). Unter Berücksichtigung der postulierten physiologischen Funktion ist
anzunehmen, dass die beobachtete Expressionsabnahme des CFTR-Kanals im
66
insuffizienten linken Ventrikel bei den Patienten das Auftreten von Arrhythmien
begünstigen und die Wirksamkeit der ischämischen Präkonditionierung herabsetzten
könnte (Duan et al., 2005).
6.4 Die Bedeutung der kardialen ATP abhängigen Kalium-Kanäle
Die zwei Gene ABCC8 und ABCC9 kodieren für die zwei bekannten regulatorischen
Untereinheiten des ATP-abhängigen Kaliumkanals, ABCC8 für SUR1 und ABCC9 für
SUR2 (Chutkow et al., 1996, 2002). Alternatives Spleißen von ABCC9 führt zu zwei
funktionell relevanten Isoformen, SUR2A und SUR2B (Yokoshiki et al., 1999). Jeweils
4 KIR6- (welche die eingentliche Ionophore bilden) und SUR-Untereinheiten bilden den
oktameren Proteinkomplex eines KATP-Kanals. In den Herzmuskelzellen ist SUR2A und
in den Gefäßmuskelzellen SUR2B die vorherrschende SUR-Isoform. SUR2A ist jedoch
nicht die einzige funktionelle Isoform im Herzen. mRNA und Protein von
ABCC8/SUR1 werden -in geringerem Ausmaß- ebenfalls im Herzen exprimiert (diese
Studie, Inagaki et al., 1995, Morrisey et al., 2005). Der größere Anteil der nativen KATP-
Kanäle im Sarkolemm der Ventrikelzellen enthält allein SUR2A Proteine, während ein
kleinerer Anteil aus einer Kombination aus SUR1 und SUR2A Proteinen besteht
(Yokoshiki et al., 1999). In unserer Studie ließ sich nun interessanterweise eine deutlich
höhere mRNA- und Protein-Expression von ABCC8/SUR1 in erkranktem Myokard
nachweisen, während sich gerade die Expression der mRNA der im Herzen am
häufigsten vorkommenden Isoformen von ABCC9, der Herzmuskeltyp SUR2A und der
glattmuskuläre Typ SUR2B, in gesundem und krankem Herzen auf einem
vergleichbarem Niveau befanden.
Die Öffnungswahrscheinlichkeit der KATP-Kanäle wird in erster Linie über den
intrazellulären ATP/ADP-Quotienten reguliert, wodurch der Energiestoffwechsel einer
Zelle mit ihrer elektrischen Aktivität verbunden wird. Nach experimentellen Befunden
kann es unter veränderten metabolischen Bedingungen im Herzen zu einer Aktivierung
von KATP-Kanälen kommen. Die Bedeutung ihrer Aktivierung liegt möglicherweise in
einer Gewebeprotektion und dem Schutz vor Arrhythmien (Flagg et al., 2005,
McPherson et al., 1993). Studien an Mäuseherzen (Flagg et al., 2005) konnten zeigen,
dass eine Überexpression entweder von SUR1 oder von SUR2 zu einer auffälligen
Reduktion von sarkolemmalen Kaliumströmen führt. Demnach führt eine Veränderung
des SUR1/SUR2 Expressionsverhältnisses zu einer gestörten KATP-Kanalfunktion. Die
67
Extrapolation dieser experimentellen Befunde auf die beobachtete Änderung des
SUR1/SUR2-Expressionsverhältnisses im insuffizienten Myokard ließe eine
Dysfunktion der kadialen KATP-Kanäle bei Patienten mit Herzinsuffizienz erwarten. Die
Einordnung der von uns nachgewiesenen Expressionsänderung von SUR1 im
menschlichen insuffizienten Myokard und die genaue klinische und funktionelle
Bedeutung sind allerdings noch unklar und bedürfen weiterer Klärung.
6.5 ABCC5 und ischämische Präkonditionierung
ABCC5 und auch ABCC4 sind für den Efflux von Nucleotidmonophosphaten aus der
Zelle verantwortlich und nehmen somit aufgrund des besonderen Substratspektrums
unter den bisher bekannten ABC-Transportern eine Sonderstellung ein. Es wurde
gezeigt (Jedlitschky et al., 2000), dass das ABCC5-Genprodukt, auch bekannt als Multi
Drug Resistance Protein 5 (MRP5), eine hohe Affinität für cGMP aufzeigt (Km = 2 µM),
dagegen aber eine niedrigere für cAMP (Km = 400 µM). Der ATP-abhängige Transport
für cGMP konnte außerdem direkt in Membranvesikeln im menschlichen Herzen
nachgewiesen werden (Dazert et al., 2003). Die genaue biologische Funktion von
ABCC5 ist allerdings noch unbekannt. Es wird aber aufgrund der bisher bekannten
experimentellen Daten angenommen, dass ABCC5 eine wichtige Rolle in der
Ausschleusung von zyklischen Nukleotiden spielt und somit die intrazelluläre
Konzentration von cGMP im Herzen mitbestimmt. Dies könnte eine bedeutende Rolle
bei der sogenannten ischämischen Präkonditionierung (IPC) am Herzen spielen. Durch
kleine Infarkte in der Endstrombahn der Koronargefäße steigt die Toleranz des
Myokards gegenüber prolongierten Ischämiezuständen (Murry et al., 1986, Yellon et al.,
1998). Durch die Ischämien ausgelöst, aktiviert u.a. eine gesteigerte Bradykininsynthese
den NO-Spiegel in den Kardiomyozyten und erhöht den intrazellulären cGMP-Spiegel,
was einerseits den Kalziumeinstrom durch L-Typ-Kalziumkanäle erhöht (Gallo et al.,
2001) und andererseits die cGMP-abhängige Phosphodiesterase Typ 2 (PDE2) aktiviert.
Diese beiden Mechanismen senken den Sauerstoffverbrauch in den Kardiomyozyten
und der Herzmuskel wird somit zur besseren Toleranz von ischämischen Zuständen
präkonditioniert (Parratt et al., 1995, Gallo et al., 2001, Keef et al., 2001). Da gerade,
wie beschrieben, dabei die intrazelluläre Konzentration von cGMP eine zentrale Rolle
bei der IPC einnimmt, kann man sich gerade für den Transporter ABCC5, durch seine
Fähigkeit zur Ausschleusung von und seine hohe Affinität zu cGMP einen Beitrag zur
68
ischämischen Präkonditionierung vorstellen. Die im Vergleich zu anderen, nicht-
kardialen Geweben relativ hohe Expression von ABCC5 im menschlichen Myokard
impliziert eine wichtige Rolle von ABCC5 für die physiologischen Funktionen des
Herzmuskels. Dazert et al. (2003) wiesen ebenfalls eine vergleichsweise hohe
Expression von ABCC5 im Herzmuskel im Vergleich zu anderen Geweben nach. Im
Gegensatz zu unseren Befunden steht allerdings die von Dazert et al. gefundene höhere
Expression der mRNA von ABCC5 im linksventrikulären Myokard von Patienten mit
ischämischer Kardiomyopathie im Vergleich zu gesunden Kontrollgeweben. Die
diskrepanten Befunde sind schwer zu erklären. Möglicherweise beeinflusst eine
unterschiedliche Pharmakotherapie in den Patientenkollektiven das Ergebnis. Auch für
ABCC5 ist daher die genaue klinische und funktionelle Bedeutung noch unklar und
bedarf weiterer Klärung.
6.6 ABCG2 und seine Transportfunktion
In unserer Studie war die ABCG2 mRNA-Expression in insuffizentem Myokard
deutlich erhöht, was sich mit Ergebnissen der Studie von Meissner et al. (2006) deckt.
Das erhöhte mRNA Expressionsniveau korrelierte mit einer erhöhten Proteinexpression
von ABCG2 im insuffizienten Herzen. ABCG2 spielt bei der Entstehung von
Arzneimittelresistenzen eine bedeutende Rolle. ABCG2 besitzt die Fähigkeit die
Resorption, die Verteilung, den Metabolismus, die Ausscheidung sowie die Toxizität
von Arzneistoffen und Xenobiotika zu beeinflussen (Mao et al., 2006). ABCG2 ist in
der Plazenta mit am höchsten exprimiert (Doyle et al., 2003), wo es in der
Plazentaschranke den Übertritt von toxischen Substanzen von dem mütterlichen in den
kindlichen Kreislauf verhindert.
Die ABCG2 Expression ist im linksventrikulären Myokard im Vergleich zur Plazenta
relativ gering. Die vorherrschende Expression des Transporters im Kapillarendothel des
Herzens lässt dennoch vermuten, dass ABCG2 möglicherweise den Eintritt von
toxischen Substanzen, wie Anthrazykline oder Mitoxantron, sowie herzwirksamer
Arzneistoffe in das Herzgewebe limitiert (Meissner et al. 2006).
Zytostatika wurden bisher am intensivsten in Hinblick auf ihre Substrateigenschaften
für ABCG2 untersucht, da die Überexpression von ABCG2 in Tumoren für die
Entwicklung von Zytostatikaresistenzen verantwortlich gemacht wird. Dagegen sind
herzwirksame Substanzen bisher kaum auf ihre Substrateigenschaften für ABCG2
69
untersucht worden. Bisherige Daten zeigen, dass ABCG2 und P-Glykoprotein zwar
überlappende, aber nicht identische Substratspektren aufweisen (Doyle et al., 2003,
Haimeur et al., 2004). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die P-Glykoprotein-Substrate
Digoxin und das endogene Steroid Aldosteron nicht von ABCG2 transportiert werden,
was frühere Befunde bestätigt (Pavek et al., 2005, Seelig et al., 1998).
Studien an Caco-2- Kolonkarzinomzellen identifizierten Bisoprolol und Carvedilol als
P-Glykoprotein-Substrate (Bachmakov et al., 2006). In unseren Transportversuchen
konnte die Vermutung, dass Beta-Blocker ebenfalls ABCG2 Substrate sind, nicht
bestätigt werden. Untersucht wurden Propranolol, Metoprolol und Bisoprolol. Keine
dieser Substanzen wies einen signifikanten ABCG2-abhängigen transzellulären
Transport in MDCK-ABCG2-Zellen auf.
Jedoch konnte der PPAR-gamma-Agonist Rosiglitazon als Substrat und als potenter
Inhibitor von ABCG2 identifiziert werden. Weitere Arzneistoffe, die bereits vorher als
ABCG2 Inhibitoren beschrieben wurden, sind die Protonenpumpeninhibitoren
Omeprazol und Pantoprazol (Breedveld et al., 2004). Deren inhibitorische Potenz
(IC50=36 µM für Omeprazol und 13 µM für Pantoprazol) war vergleichbar mit der
inhibitorischen Potenz von Rosiglitazon (IC50=24 µM).
Rosiglitazon gehört zur Gruppe der Glitazone, die als Agonisten am Transkriptions-
regulierenden Rezeptor vom PPAR-gamma-Typ (peroxisome proliferator-activated
receptor, Subtyp gamma) wirken und die Insulinempfindlichkeit verschiedener Gewebe,
v.a. des Fettgewebes und der Skelettmuskulatur steigern. Da bei Patienten mit Typ 2
Diabetes mellitus die Insulinresistenz im Zentrum des pathophysiologischen
Geschehens steht, kann die Verbesserung der Insulinwirkung zu einer Normalisierung
der Glucosekonzentration führen. Als Nebenwirkungen der Glitazone werden unter
anderem die Entstehung von peripheren Ödemen sowie eine Abnahme des Hämatokrits
durch eine Flüssigkeitsretention beobachtet. Dies kann zu einer Entstehung bzw.
Verschlechterung einer bestehenden Herzinsuffizienz führen, weshalb der Gebrauch von
Glitazonen bei Herzinsuffizienz kontraindiziert ist. Nach einer Metaanalyse von Lago et
al., 2007 im Lancet erschienen, führen Glitazone zu der Entstehung bzw.
Verschlechterung einer Herzinsuffizienz. Lipscombe et al. (2007) beobachteten unter
Glitazon-Einnahme eine signifikant erhöhte Rate von Herzinfarkten, ein signifikant
erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz sowie ein schlechteres
Überleben im Vergleich zur Therapie mit anderen oralen Antidiabetika. Rosiglitazon
70
wurde daher vom Markt genommen. Diskrepant hierzu standen hoffnungsvolle
tierexperimentelle Studien. Hier konnte z.B. für Rosiglitazon in Hasen mit Diät-
induzierter Hypercholesterinämie und Myokardischämie ein protektiver Effekt
beobachtet werden. Rosiglitazon konnte signifikant die postischämische Apoptose im
Myokard reduzieren und die funktionelle Erholung verbessern (Liu et al., 2004).
ABCG2 beeinflusst relevant, wie in dieser Studie gezeigt, die Verteilung von
Rosiglitazon, insbesondere im insuffizienten Herzen. Für Pioglitazon konnte ebenfalls
im Vergleich zu Glimepirid eine kardioprotektiver Effekt im Sinne einer Abnahme des
Fortschreitens der koronarer Arteriosklerose beobachtet werden (Nissen et al., 2008).
In Zusammenschau aller bisherigen Daten und Befunde bleibt somit der
kardioprotektive Effekt der Glitazone weiterhin umstritten.
Eine Inhibition von ABCG2 könnte die Verfügbarkeit solcher Arzneistoffe im Herzen
erhöhen, die Substrate von ABCG2 sind. Andererseits könnte die Hemmung von
ABCG2 im Herzen die Reparaturmechanismen nach einem Myokardinfarkt schwächen.
Diese Schlussfolgerung lässt sich aus Ergebnissen transgener Tierexperimente ziehen.
Abcg2-Knockout-Mäuse zeigten im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen nach einem
Myokardinfarkt ein signifikant schlechteres Überleben, was auf eine Dysfunktion und
ein eingeschränktes Überleben mikrovaskulärer Endothelzellen des Herzens
zurückgeführt wurde. Eine Hemmung von ABCG2 führte zu einer Akkumulation von
Protoporphyrin IX, was zu einem schlechteren Überleben der Zellen unter oxidativem
Stress führte (Higashikuni et al., 2010).
Somit lässt sich zusammenfassend sagen, dass die in dieser Arbeit nachgewiesene
Expression fast aller ABC-Transporter im Herzen, ihre Bedeutung für dortige
physiologische Vorgänge unterstreicht. In Zusammenschau mit den Daten aus dieser
Studie sowie den vorliegenden Daten aus in-vitro- und tierexperimentellen Studien,
lässt sich postulieren, dass Expressionsveränderungen dieser Transporter in der
Herzinsuffizienz Auswirkungen auf die Herzfunktion haben, wie z.B. auf die
Arrhythmogenese, das IPC und die Endothelfunktion. Auch die nachgewiesene
veränderte Expression von Exportpumpen für Xenobiotika, wie BCRP, könnte einen
Einfluss auf die Aufnahme und Verteilung von Arzneistoffen, insbesondere im
insuffizienten Herzen, haben.
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8 Abkürzungsverzeichnis 3H Tritium (Isotop des Wasserstoffs)
14C Radioaktives Isotop des Kohlenstoffs
A Fläche (cm2)
ABC ATP-Bindungs-Kassette (ATP-binding cassette)
ANP Atriales Natriuretisches Peptid
ATP Adenosintriphosphat
BCRP Breast Cancer Resistance Protein
bp Basenpaare
C Konzentration
cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat
Caco Kolonkarzinomzellen
cDNA copy DNA, DNA Kopie eines RNA Stückes
CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
cGMP zyklisches Guanosinmonophosphat
Ci Curie
DCM Dilatative Kardiomyopathie
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EGTA Ethylenglykol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N’,N’,-tetraacetat
FACS Durchflusszytometrie
FBS Fötales Rinderserum
g Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s2)
GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
h Stunde (hour)
HEK-293 Menschliche embryonale Nierenzelllinie
HPLC Hochdrucksflüssigkeitschromatographie (high performance liquid chromatography)
I Strömung, Stromstärke
IC50 Konzentration einer Hemmsubstanz, die eine halbmaximale Inhibition bewirkt
ICM Ischämische Kardiomyopathie
KATP-Kanal ATP-abhängiger Kaliumkanal
kDa kilo-Dalton
Kir Inward-Rectifying Kalium-Kanal
Km Michaelis-Konstante
l Liter
M Molarität (mol/l)
MDCK-Zellen Madin-Darby canine kidney Zellen
MDR Multi-Drug Resistance
min Minute
mM Millimolar (10-3)
mRNA Boten-(messenger-)RNA
MRP Multidrug Resistance-Related Protein
µM Micromolar (10-6)
n number (Anzahl)
NBD Nukleotid-bindende Domäne
nm Nanometer (10-9)
NYHA New York Heart Association
P Permeabilität
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
pH negativer dekadischer Logarithmus der Wasserstoffionenkonzentration
PhIP 2-Amino-1-Methyl-6-Phenylimidazol[4,5-B]Pyridine
PKA Proteinkinase A
PKC Proteinkinase B
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
PPAR Peroxisom Proliferator aktivierter Rezeptor
PSC-833 (=Valspodar) Ciclosporinderivat, P-Glykoprotein Inhibitor
RNA Ribonucleinsäure
rt RT-PCR Real time Reverse Transkriptase Polymerasekettenreaktion
SDS Natriumdodecylsulfat
sec Sekunde
SUR Sulfonylharnstoffrezeptor
TBST Tris-Buffered Saline Tween-20, Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween-20
Tris Hydroxymethylaminomethan
9 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
Die im Rahmen dieser Dissertation erhobenen Daten wurden im Mai 2008 in Naunyn-
Schmiedeberg's Archives of Pharmacology publiziert:
Solbach TF*, Paulus B*, Weyand M, Eschenhagen T, Zolk O, Fromm MF. ATP-binding
cassette transporters in human heart failure. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.
2008;377:231-43
*Geteilte Erstautorenschaft
Außerdem wurden Teile der Arbeit im März 2006 auf der Jahrestagung der Deutschen
Gesellschaft für experimentelle und klinische Pharmakologie und Toxikologie
vorgestellt:
Paulus B, Solbach TF, Fromm MF, Engmann S, Zolk O. ATP-Binding cassette (ABC)
transporters in human hearts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol.
2006;372(Supplement 1):137
10 Anhang
Tab. 10.1: Sequenzen der verwendeten Primer
Gene Alias Forward primer, 5'3' Reverse primer, 5'3' Accession no.
ABCA1 ABC1 tactggtttggcgaggaaag gaggtgatctggccctcata NM_005502 ABCA2 ABC2 tatcacagcatgcccaccta atggccacgatgatgaagat NM_001606 ABCA3 ABC3 gtacgacaactgctcgtcca aaagcgggaaaagggaagta NM_001089 ABCA4 ABCR gaaaagaccgagcccctaac aatgcggtgatctggttctc NM_000350 ABCA5 tcaaagggataccagccaac agaacaggggtccattccag NM_018672 ABCA6 tgagcagctgaatgttcctg tggtcaggaggacacctctc NM_080284 ABCA7 gcacctcagcatgggatact gtttgttccctccgctgtag NM_019112 ABCA8 catgcaatgccaaaagattg aatgtaaggtgggcaactcg NM_007168 ABCA9 gactgctggattggatcctc agcctatgccccatttcttc NM_080283 ABCA10 cttagcccttttgccttcac ccatggccatctttatcagg NM_080282 ABCA12 agcacggaagcacttgtctc tgcggtggggaatagttaaa NM_015657 ABCA13 gtgtgttgccgttattgtcg gcatggtacaaaggccaaag NM_152701 ABCB1 PGY1,
MDR1 tggagagatcctcaccaagc ttcctgtcccaagatttgct NM_000927 ABCB2 TAP1 ttgcagggagaggtgtttg gacactgatccccagagcat NM_000593 ABCB3 TAP2 cggataccaccctgatgagt gatctcccgaagcacttcct NM_000544 ABCB4 PGY3,
MDR3 acaggcagctctggataagg ggatctggcttcctgatgtc NM_000443 ABCB5 gcggcattatcgagaccata gagctcctttttcccctacc XM_291215 ABCB6 tacaacgccgagagttacga agcacatagtccccaacctg NM_005689 ABCB7 ctctgttagcggctcaggtc catgccaacatgtcctctttt NM_004299 ABCB8 tggaagctcttctggcagtt ataagcaggtgggtgctgag NM_007188 ABCB9 gcatcgtcatccagaaaagc gcggttctcatcaaagaagc NM_019625 ABCB10 gcattttgcctatccagctc ctgggtttagctgacggatg NM_012089 ABCB11 BSEP gtcgattagtccagggcaga aggcaaacaacactggttcc NM_003742 ABCC1 MRP1 ggatttttgctgtggatcgt accagccagaaagtgagcat NM_004996 ABCC2 MRP2 gagctggcccttgtactcac tgaaattggaaagtgccaca NM_000392 ABCC3 MRP3 ggcagctactcagaggagga gctgtggcctcgtctaaaac NM_003786 ABCC4 MRP4 aatacccttggttccccttg cctggtgtgcatcaaacagt NM_005845 ABCC5 MRP5 ctcatcctgtccatcgtgtg cggtaattcaatgcccaagt NM_005688 ABCC6 MRP6 gtggtgtttgctgtccacac acgacaccagggtcaacttc NM_001171 ABCC7 CFTR gccgacactttgcttgctat agaggcagaaggtcatccaa NM_000492 ABCC8 SUR1 gcaagtcctcgctccttcta ctccacagtggcatttagca NM_000352 ABCC9 SUR2 ttggtaggcttgggtcttct ttgatctccccttcttgtgg NM_005691 SUR2A SUR2A tggatgaggcaacagcttc attcttgtgggcgaacaaat NM_005691 SUR2B SUR2B tggatgaggcaacagcttc cattttcctgagccaagagg NM_020297 ABCC10 MRP7 gagaacctgcgactccttga gtcagggacagggcataaga NM_033450 ABCC11 MRP8 cctgagctccatccatgtct agtagggggtggaggaaatg NM_032583 ABCC12 aacagagacgcaagccaaat tgttcaagttcaggctgtcg NM_033226 ABCD1 ALD atgcatctgctcatcacagg tgcatgtcctccactgagtc NM_000033 ABCD2 ALDL1 ggcttccaggctaaacttca gatcccgaagacttccaaga NM_005164 ABCD3 PXMP1 gacccttggaacacttcgag tcgccattctttgcttttct NM_002858 ABCD4 PXMP1
L tggagcacatgaggacagac gaccagggtgctaagctctg NM_005050
ABCE1 RNASELI ggttacaccccagagcaaaa ccaaaacttcacctggacga NM_002940
ABCF1 ABC50 aaaaggagcctcccaaacaa atgagcggagatgctgaact NM_001090 ABCF2 agagagggtcgtgagcgata gagttgacttccctgctcca NM_005692 ABCF3 aatggggctgggaagtctac tggtgacggtactcctcctc NM_018358 ABCG1 White aggtggtctcgctgatgaaa gttgtggtaggttgggcagt NM_207630 ABCG2 BCRP,
MXR1 ggcagatgccttcttcgtta gaagccatgacagccaagat NM_004827 ABCG4 White2 gagacctgaaccccatgttg ggacaggaaggtcctcttga NM_022169 ABCG5 White3 tgctgaacgctgtgaatctg atatccaaatcgggcaacct NM_022436 ABCG8 White4 cctgtcctcgctacagcaat gctttccacacaggtgtcct NM_022437 GAPDH aaggtgaaggtcggagtcaa atgacaagcttcccgttctc NM_002046 ANP tgctggaccatttggaaga ggcagatcgatcagaggagt NM_006172
11 Danksagung Hiermit danke ich meinem Doktorvater Prof. Martin F. Fromm für die Vergabe des
Promotionsthemas.
Ich danke v.a. Oliver Zolk, für die exzellente Betreuung und seine Geduld, meinem
Coautor und Mitstreiter Thomas Solbach für die Zusammenarbeit am Paper, Sven
Engmann für seine Hilfsbereitschaft im Labor und Einweisung in Technik und
Arbeitsvorgänge und Rasti Krajcik für die gute Stimmung, die er in der Arbeitsgruppe
verbreitet hat. Mein Dank gilt auch den anderen Arbeitsgruppen des pharmakologischen
Instituts, Erlangen, für ihre freundliche Zusammenarbeit und selbstverständliche
Hilfsbereitschaft.
Mein besonderer Dank gilt meiner Mutter, Maria Paulus und Markus Wittich, die mich
geduldig und liebevoll im Studium und während der Doktorarbeit begleitet und
unterstützt und diese somit erst ermöglicht haben.
Lebenslauf
Name: Barbara Maria Paulus
Geburtstag: 24.10.1982
Geburtsort: Ulm
Eltern: Maria Paulus, wohnhaft in Nürnberg, Grundschullehrerin
Jochen Lebert, wohnhaft in Gunzenhausen, Kunsterzieher
Schulischer Werdegang
1989 - 1993 Grundschule Pfuhl
1993 – 2002 Bertha-von-Suttner Gymnasium Neu-Ulm
28.06.2002 Allgemeine Hochschulreife
Beruflicher Werdegang
WS 2002/03 Studium der Philosophie an der Universität Freiburg
Seit SS 2003 Medizinstudium an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
09.03.2005 Physikum
SS 2008 - 2009 Medizinstudium an der Universität Hamburg
09.12.09 Approbation als Ärztin
Seit Februar 2010 Assistenzärztin in der Weiterbildung im Fach Neurologie am Krankenhaus Buchholz (Nordheide)
Famulaturen
September 2005 Praxis für Anästhesie, Potsdam
März 2006 Klinik für Chirurgie, AK St. Georg, Hamburg
Februar 2007 Klinik für Neurorehabilitation, Lingen
März 2007 Klinik für Neurologie, AK St. Georg, Hamburg
Juni 2007 Klinik für Innere Medizin, Reinbek
Juni 2008 Klinik für Palliativmedizin, Köln
Praktisches Jahr
18.08.2008-19.07.2009
1.Tertial: Klinik für Innere Medizin am St. Adolf Stift, Reinbek 2.Tertial: Klinik für Chirurgie am AK Altona, Hamburg 3. Tertial: Klinik für Neurologie am Albertinen Krankenhaus, Hamburg
