Aus dem Institut für Humangenetik der Universität zu ... · Tabelle 6 Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie in der untersuchten Patientenkohorte.....35 Tabelle 7 Sprachentwicklung

Aus dem Institut für Humangenetik

der Universität zu Lübeck

Direktorin: Prof. Dr. med. Gabriele Gillessen-Kaesbach

Molekulargenetische Ursachen

von

mentaler Retardierung

mit

Epilepsie

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

- Aus der Sektion Medizin -

vorgelegt von

Charlotte Runge

aus Schleswig

Lübeck 2013

1. Berichterstatterin: Prof. Dr. med. Gabriele Gillessen-Kaesbach

2. Berichterstatter/Berichterstatterin: Priv.-Doz. Dr. med. Matthias Nitschke

Tag der mündlichen Prüfung: 31.10.2013

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 31.10.2013

-Promotionskommission der Sektion Medizin-

Inhaltsverzeichnis

3

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis ................................................................................................ 3

Verzeichnis der Abbildungen................................................................................ 6

Verzeichnis der Tabellen ...................................................................................... 6

Verzeichnis der Abkürzungen .............................................................................. 8

1. Einleitung ................................................................................................... 11

1.1. Epilepsie ............................................................................................. 11

1.2. Mentale Retardierung ......................................................................... 13

1.3. Syndromale Krankheitsbilder mit Epilepsie ......................................... 14

1.3.1. Das Angelman-Syndrom ................................................................. 14

1.3.2. Das Rett-Syndrom .......................................................................... 14

1.4. Bereits bekannte Gene – Differentialdiagnosen .................................. 15

1.4.1. Das CDKL5-Gen ............................................................................. 16

1.4.2. Das ARX-Gen ................................................................................. 17

1.4.3. Das SLC9A6-Gen ........................................................................... 18

1.4.4. Das TCF4-Gen ............................................................................... 19

1.5. Aufgaben und Zielsetzung .................................................................. 20

2. Material und Methoden ............................................................................... 21

2.1. Materialien .......................................................................................... 21

2.1.1. Patienten ........................................................................................ 21

2.1.2. Geräte ............................................................................................ 22

2.1.3. Chemikalien, Nukleotide, Enzyme .................................................. 22

2.1.4. Puffer, Medien, Lösungen ............................................................... 23

2.1.5. Verbrauchsmaterial ......................................................................... 23

2.1.6. DNA-Proben ................................................................................... 24

2.1.7. Computersoftware .......................................................................... 24

2.1.8. Internetressourcen .......................................................................... 24

2.2. Methoden ........................................................................................... 25

2.2.1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ............................................. 25

2.2.2. Gelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte ...................... 27

2.2.3. Aufreinigung des PCR-Produktes ................................................... 28

2.2.4. Sequenzierung nach Sanger .......................................................... 29

2.2.5. Auswertung der Sequenzen ............................................................ 30

2.2.6. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) .............. 30

2.2.7. Auswertung der Kapillarelektrophorese .......................................... 32

2.2.8. Etablierung der PCR für das TCF4-Gen ......................................... 33

Inhaltsverzeichnis

4

3. Ergebnisse ................................................................................................. 35

3.1. Auswertung und Darstellung der Vorbefunde ..................................... 35

3.1.1. Anamnese und klinische Befunde ................................................... 35

3.1.2. Befunde im Elektroenzephalogramm .............................................. 39

3.1.3. Befunde der Magnetresonanztomographie des Schädels (cMRT) .. 40

3.1.4. Familienanamnese ......................................................................... 40

3.1.5. Im Vorfeld durchgeführte genetische Untersuchungen ................... 41

3.2. Molekulargenetische Analysen ........................................................... 42

3.2.1. Sequenzanalysen ........................................................................... 42

3.2.1.1. Sequenzanalysen des CDKL5-Gens............................................... 42

3.2.1.2. Sequenzanalysen des TCF4-Gens ................................................. 45

3.2.1.3. Sequenzanalysen des ARX-Gens ................................................... 47

3.2.1.4. Sequenzanalysen des SLC9A6-Gens ............................................. 47

3.2.2. Ergebnisse der MLPA-Untersuchungen .......................................... 49

4. Diskussion .................................................................................................. 51

4.1. Diskussion des Phänotyps .................................................................. 51

4.2. Diskussion der molekulargenetischen Befunde .................................. 52

4.2.1. Molekulargenetische Befunde im CDKL5-Gen ................................ 52

4.2.2. Molekulargenetische Befunde im TCF4-Gen .................................. 55

4.2.3. Molekulargenetische Befunde im SLC9A6-Gen .............................. 56

4.3. Diskussion der Methoden ................................................................... 57

4.4. Diskussion der auffälligen Befunde der Array-CGH-Analysen in den

Vorbefunden .................................................................................................. 59

4.5. Weitere Differentialdiagnosen ............................................................. 59

4.6. Ausblick .............................................................................................. 62

5. Zusammenfassung ..................................................................................... 63

6. Literaturverzeichnis .................................................................................... 64

7. Anhänge ..................................................................................................... 74

7.1. Informationsblatt zur Studie ................................................................ 74

7.2. Einwilligungserklärung der Studie ....................................................... 76

7.3. Fragebogen der Studie ....................................................................... 78

7.4. Reaktionsbedingungen ....................................................................... 80

7.4.1. Das CDKL5-Gen ............................................................................. 80

7.4.2. Das ARX-Gen ................................................................................. 81

7.4.3. Das SLC9A6-Gen ........................................................................... 84

7.4.4. Das TCF4-Gen ............................................................................... 86

7.5. MLPA-Ansätze.................................................................................... 88

Inhaltsverzeichnis

5

7.6. Wachstum und Entwicklung in der untersuchten Patientenkohorte ..... 89

7.7. Therapieresistente Epilepsien – Überblick .......................................... 92

7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie

94

7.9. Ergebnisse der genetischen Untersuchungen .................................... 97

8. Danksagung ............................................................................................. 100

9. Lebenslauf ............................................................................................... 101

10. Erklärung .............................................................................................. 102

Eidesstattliche Versicherung ............................................................................ 102

Verzeichnis der Abbildungen

6

Verzeichnis der Abbildungen

Abbildung 1 PCR-Produkte von acht Proben auf 2%igem Agarose-Gel .......................43

Abbildung 2 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 17 des CDKL5-Gens. ...44

Abbildung 3 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des CDKL5-Gens ..........................45

Abbildung 4 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 0 des TCF4-Gens ........46

Abbildung 5 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 19 des TCF4-Gens ......47

Abbildung 6 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 15 des SLC9A6-Gens ..48

Abbildung 7 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 1 des SLC9A6-Gens. ...48

Abbildung 8 Ausschnitt aus dem MLPA-Ergebnisbogen ...............................................50

Verzeichnis der Tabellen

Tabelle 1 PCR-Ansatz für das Exon 1 des SLC9A6-Gens ...........................................27

Tabelle 2 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das Exon 1 des SLC9A6-

Gens ............................................................................................................................27

Tabelle 3 Sequenzieransatz für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens .............................29

Tabelle 4 Sequenzierprogramm für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens .......................30

Tabelle 5 Schematische Darstellung des PCR-Programms für MLPA ..........................32

Tabelle 6 Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie in der untersuchten

Patientenkohorte ..........................................................................................................35

Tabelle 7 Sprachentwicklung in der untersuchten Patientenkohorte zum Zeitpunkt der

Datenerhebung ............................................................................................................37

Tabelle 8 Dysmorphiezeichen und respiratorische Auffälligkeiten in der untersuchten

Patientenkohorte ..........................................................................................................37

Tabelle 9 Dysmorphiezeichen ......................................................................................38

Tabelle 10 Synthetische DNA-Oligonuleotide ...............................................................80

Tabelle 11 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das CDKL5-Gen

....................................................................................................................................80

Tabelle 12 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das CDKL5-Gen ........81

Tabelle 13 Sequenzieransatz für das CDKL5-Gen .......................................................81

Tabelle 14 Sequenzierprogramm für das CDKL5-Gen .................................................81

Tabelle 15 Synthetische DNA-Oligonukleotide .............................................................81

Tabelle 16 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das ARX-Gen 82

Tabelle 17 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 1&5 des ARX-

Gens ............................................................................................................................82

Verzeichnis der Tabellen

7

Tabelle 18 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 3 des ARX-Gens

....................................................................................................................................82

Tabelle 19 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2a, 2b & 4 des

ARX-Gens ....................................................................................................................83

Tabelle 20 Sequenzieransatz für das ARX-Gen ...........................................................83

Tabelle 21 Sequenzierprogramm für das ARX-Gen .....................................................83

Tabelle 22 Synthetische DNA-Oligonukleotide .............................................................84

Tabelle 23 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für Exon 2-16 des

SLC9A6-Gens ..............................................................................................................84

Tabelle 24 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2-16 des SLC9A6-

Gens ............................................................................................................................85

Tabelle 25 Sequenzieransatz für das SLC9A6-Gen .....................................................85

Tabelle 26 Sequenzierprogramm für das SLC9A6-Gen ...............................................85

Tabelle 27 Synthetische DNA-Oligonukleotide und Bedingungen für die PCR – TCF4-

Gen ..............................................................................................................................86

Tabelle 28 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das TCF4-Gen

....................................................................................................................................86

Tabelle 29 Sequenzieransatz für das TCF4-Gen .........................................................87

Tabelle 30 Sequenzierprogramm für das TCF4-Gen ....................................................87

Verzeichnis der Abkürzungen

8


A Adenin

ACTH Adrenocorticotropes Hormon

a.d. aqua destillata

ARX Aristaless-Related Homeobox

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaare

C Cytosin

CDKL5 Cyclin-dependent kinase-like 5

cDNA complementary DNA

CLB Clobazam

CLZ Clonazepam

cMRT craniale Magnetresonanztomographie

CT Computertomogramm

dATP 2‟-Desoxyadenosintriphosphat

dCTP 2‟-Desoxycytidintriphosphat

ddNTP 2‟,3‟-Didesoxyribonukleosidtriphosphat

del Deletion

dGTP 2‟-Desoxyguanosintriphosphat

DNA 2‟-Desoxyribonukleinsäure

dNTP 2‟-Desoxyribonukleosidtriphosphat

dTTP 2‟-Desoxythymidintriphosphat

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EEG Elektroenzephalogramm

ESM Ethosuximid

ExoSap Exonuklease / Shrimp Alkaline Phosphatase

FLB Felbamat

F-Primer forward primer (Vorwärts-Primer)

G Guanin

GTP Guanosintriphosphat

HPLC high performance liquid chromatography Wasser

Hz Hertz

kb Kilobasen (1000 bp)

LEV Levetiracetam

LGS Lennox-Gastaut-Syndrom


9

LM Lebensmonat

LTG Lamotrigin

M molar (mol / l)

Mb Mega-Basenpaare (106 bp)

MgCl2 Magnesiumchlorid

Min. Minuten

µl Mikroliter

MLPA Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

mRNA messenger RNA

MRT Magnetresonanztomographie

OXC Oxcarbazepin

PB Phenobarbital

PCR Polymerasekettenreaktion

PHT Phenytoin

PLP Pyridoxalphosphat

RNA Ribonukleinsäure

R-Primer reverse primer (Rückwärts-Primer)

RSP Risperidon

RUF Rufinamid

Sek. Sekunden

Ser Serin

SLC9A6 Sodium Like Channel 9A6

SNP Single Nucleotide Polymorphism

STM Sultiam

STP Stiripentol

T Thymin

Taq Thermus aquaticus

TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer

TCF4 Transcription Factor 4

TEMED NNNN-Tetramethylethylenediamine

Thr Threonin

TPM Topiramat

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

UBE3A ubiquitin-protein ligase E3A Gen

UTR untranslated region

UV Ultraviolett

V Volt


10

VGB Vigabatrin

Vol. Volumen

VNS Vagusnervstimulator

VPA Valproinsäure

ZNS Zonisamid

Einleitung

11

1. Einleitung

1.1. Epilepsie

Zerebrale Anfälle sind die Folge einer plötzlichen Funktionsstörung des Gehirns.

Aufgrund unterschiedlicher Ursachen kommt es dabei zu abnormem Auftreten und

Ausbreiten oder zu unzureichender Hemmung hirnelektrischer Aktivität. Von einer

Epilepsie spricht man nach dem Auftreten zumindest eines epileptischen Anfalls sowie

einer andauernden Veränderung im Gehirn, welche weitere Anfälle wahrscheinlich

macht (Fisher et al., 2005).

Ätiologisch werden die Epilepsien in symptomatische und idiopathische Formen

unterteilt. Bei den symptomatischen Formen liegt eine organische Störung des Gehirns

zugrunde, bei der idiopathischen Form ist keine Strukturstörung erkennbar.

Symptomatische Krampfanfälle können durch Fieber, Trauma, Tumoren oder auch

durch akute Stoffwechselstörungen verursacht werden. Sowohl symptomatische als

auch idiopathische Epilepsien können im Rahmen einer syndromalen Erkrankung

auftreten (Lindsay et al., 2010).

Der Ausschluss einer symptomatischen Ursache im Rahmen einer Hirnschädigung,

eines Tumors, eines Traumas, einer Infektion oder einer Stoffwechselerkrankung macht

eine genetische Ursache wahrscheinlich (Todt, 2004). Mehr als die Hälfte aller

Epilepsien werden auf eine genetische Ursache zurückgeführt (Pal et al., 2010).

Die epileptischen Anfälle werden grob in fokale (partiell, herdbezogene) und primär

generalisierte Anfälle unterteilt. Fokale Anfälle gehen von einem Herd im Gehirn aus

und können unter Umständen sekundär generalisieren. Bei primär generalisierten

Anfällen hingegen betrifft die pathologische neuronale Aktivität den gesamten Cortex

und geht in der Regel mit einem Bewusstseinsverlust einher. Zu den generalisierten

Anfällen werden tonisch-klonische, atonische (Sturzanfälle), tonische (symmetrische

Versteifungskrämpfe), klonische (beidseitige rhythmische Muskelzuckungen) und

myoklonische Anfälle (beidseitige Zuckungen bei erhaltenem Bewusstsein) sowie

Absencen (Bewusstseinsunterbrechungen von wenigen Sekunden) gerechnet (Lindsay

et al., 2010).

Zum Zeitpunkt der Geburt ist das Gehirn noch unzureichend entwickelt und bei den

meisten Neugeborenen ist zu diesem Zeitpunkt lediglich der intakte Hirnstamm

funktionsfähig. In der normalen postnatalen Entwicklung durchläuft das Gehirn einen

komplexen Reifeprozess, der mit sehr hoher neuronaler Erregbarkeit verbunden ist.

Während seiner Entwicklung ist das Gehirn ständiger Synaptogenese, Apoptose und

Myelinisierung ausgesetzt.

Einleitung

12

Gerade das sich entwickelnde Gehirn ist besonders anfällig für Krampfanfälle. In der

neonatalen und frühkindlichen Periode können Krampfanfälle durch schwerwiegende

Gründe verursacht werden, welche zu altersspezifischen epileptischen

Enzephalopathien führen. Bei der frühkindlichen epileptischen Enzephalopathie – early

infantile epileptic encephalopathy (EIEE) – handelt es sich um eine progrediente

neurologische Erkrankung, welche sich in kognitiver und motorischer Einschränkung

äußert und häufig mit schwerer geistiger Behinderung einhergeht (Asher und Scaglia,

2012).

Die frühkindlichen epileptischen Enzephalopathien sind eine Gruppe von

Erkrankungen, welche auch als altersabhängige Enzephalopathien beschrieben

werden. Sie beginnen innerhalb der ersten Wochen bis Monate des Lebens

(frühkindlich – infantile) mit therapieresistenten Krampfanfällen, zeichnen sich durch

wiederkehrende spontan auftretende Krampfanfälle (Epilepsie) und führen zu

tiefgreifenden Entwicklungsverzögerungen und geistiger Behinderung

(Enzephalopathie), da wichtige Meilensteine der Entwicklung des Gehirns nicht erreicht

werden können (Zupanc, 2009).

Die EIEE ist eine seltene Epilepsieform, die aus therapieresistenten Krampfanfällen,

tonischen Spasmen oder häufiger partiellen Anfällen und einem spezifischen Muster im

Elektroenzephalogramm (EEG), welches in den ersten Lebensmonaten auftritt, besteht

(Asher und Scaglia, 2012). Sie stellt den gemeinsamen Endweg einer heterogenen

Gruppe von genetischen, metabolischen oder strukturell bedingten Erkrankungen dar.

Im Säuglingsalter treten vor allem sogenannte Blitz-Nick-Salaam-Krämpfe (BNS-

Krämpfe), die auch infantile Spasmen genannt werden, auf. Dabei kommt es zu

blitzartigen, unwillkürlichen Muskelzuckungen (Myoklonien) mit Hochreißen der Arme,

Nickbewegungen des Kopfes und dem orientalischem Salaam-Gruß ähnelnden

tonischen Anfällen. Die Spasmen können von autonomen oder fokalen Aspekten wie

Atempausen und Blickdeviation begleitet sein. Im EEG kann sich eine sogenannte

Hypsarrhythmie zeigen, die aus diffusen gemischten Krampfpotentialen besteht. Die

Kombination von BNS-Krämpfen und einer Hypsarrhythmie im EEG wird als West-

Syndrom bezeichnet.

60% der Kinder mit persistierenden BNS-Krämpfen entwickeln im Alter von etwa 3-12

Monaten das sogenannte Lennox-Gastaut-Syndrom, das sich durch tonische oder

atonische Krampfanfälle und ein zunehmend synchrones EEG mit generalisierten

„slow-spikes“ und „slow-waves“ bei 1,5-2 Hz auszeichnet.

Viele Patienten mit einer im frühen Kindesalter beginnenden Epilepsie zeigen

Rückstände in der geistigen und motorischen Entwicklung. Eine persistierende

Enzephalopathie beeinflusst die Ausbildung der neuronalen Netzwerke in hohem Maße

Einleitung

13

und abnorme Synaptogenese und eine ungünstige Entwicklung sind meist die Folgen.

Das klinische Bild kann mit einem Wachstumsstillstand des Gehirns, welches zu

Mikrozephalie und Hirnatrophie führt, einhergehen. (Zupanc, 2009).

1.2. Mentale Retardierung

Mentale Retardierung wird generell als eine Behinderung definiert, die durch

signifikante Einschränkungen der intellektuellen Funktionen und des adaptiven

Verhaltens mit Beginn vor dem 18.Lebensjahr und einem Intelligenzquotienten von 70

oder weniger gekennzeichnet ist (American Psychiatric Association, 1994; Schalock et

al., 2010; Salvador-Carulla et al., 2011). Milde Formen der mentalen Retardierung, bei

einem Intelligenzquotienten (IQ) von 50 bis 70, werden von moderater (IQ <50) und

schwerer (IQ < 35) mentaler Retardierung abgegrenzt. In den industrialisierten

Nationen liegt die Prävalenz bei etwa 2% und ist einer der häufigsten Gründe für

humangenetische Beratungen (Ropers, 2006). Im englischen Sprachgebrauch wurde

der Begriff der mentalen Retardierung weitgehend durch intellectual disability ersetzt.

Im deutschen Sprachgebrauch hat sich allerdings bislang keine äquivalent zu

gebrauchende Neuerung durchgesetzt.

Konventionell wird mentale Retardierung (MR) in syndromale und nicht-syndromale MR

unterteilt. Syndromale MR wird dadurch charakterisiert, dass neben der geistigen

Behinderung weitere Veränderungen wie Dysmorphien oder Fehlbildungen vorliegen.

Bei nicht-syndromalen Formen der mentalen Retardierung sind kognitive

Einschränkungen die einzige Manifestation (Chelly et al., 2006).

Mentale Retardierung ist beim männlichen Geschlecht häufiger als beim weiblichen

Geschlecht, was mit der X-chromosomalen Vererbung von Gendefekten, die eine

wichtige Rolle in der Ätiologie von geistiger Behinderung spielen, in Verbindung

gebracht wird.

Sowohl eine Epilepsie als auch mentale Retardierung können isoliert oder im Rahmen

eines übergeordneten Krankheitsbildes auftreten. Bei einem Teil der Patienten mit

Epilepsie, mentaler Retardierung und eventuell zusätzlichen Auffälligkeiten wie

Mikrozephalie, kraniofazialen Dysmorphiezeichen und Bewegungsstörungen wurde die

genetische Ursache identifiziert. Dazu gehören unter anderen das Angelman-Syndrom,

welches zum ersten Mal 1965 von Harry Angelman beschrieben wurde (Angelman,

1965) und das erstmalig von Andreas Rett 1966 beschriebene Rett-Syndrom (Rett,

1966).

Einleitung

14

1.3. Syndromale Krankheitsbilder mit Epilepsie

1.3.1. Das Angelman-Syndrom

Das Angelman-Syndrom ist ein neurogenetisches Syndrom, welches sich durch eine

schwere geistige Behinderung, ein schweres Sprachdefizit, Phasen mit

unangemessenem Lachen, eine Skoliose, eine Ataxie, erworbene Mikrozephalie und

eine Epilepsie auszeichnet (Clayton-Smith und Laan, 2003, Williams, 2005). Bei

Patienten mit dem Angelman-Syndrom verlaufen die pränatale Entwicklung und Geburt

normal, bei Neugeborenen und Kleinkindern können jedoch Schwierigkeiten bei der

Nahrungsaufnahme auftreten. Meist wird im Alter von 6-12 Monaten eine

Entwicklungsverzögerung offensichtlich, wenn ein reduzierter Muskeltonus, eine

Rumpfataxie und häufiges Lächeln auftreten (Fiumura et al., 2010). Die Entwicklung

schreitet nur verzögert fort, jedoch ohne den Verlust erworbener Fähigkeiten. Weitere

Kriterien für die Diagnose des Angelman-Syndroms umfassen eine schwere mentale

Retardierung, und Verhaltensauffälligkeiten wie Schlafstörungen (Bruni et al., 2004,

Dagli et al., 2011).

Im Schädel-MRT oder Schädel-CT können eine milde kortikale Atrophie und

Myelinisierungsdefizite auffallen. Die Diagnose wird häufig erst nach mehreren

Wiedervorstellungen beim Neuropädiater gestellt, da typische klinische Merkmale wie

Krampfanfälle oder ruckartige Bewegungen sich erst im Verlauf einstellen. Das EEG ist

bei Patienten mit Angelman-Syndrom besonders charakteristisch und für die

Diagnosestellung hilfreich (Williams, 2005).

Das für das Krankheitsbild verantwortliche UBE3A-Gen liegt auf dem Chromosom 15

im Bereich 15q11-q13 und kodiert für das zelluläre Ubiquitin-Ligase-Enzym. Es gibt vier

genetische Mechanismen (maternale Deletion, paternale uniparentale Disomie 15q11-

q12, Imprinting-Defekte und Mutationen im UBE3A-Gen), die alle mit der Expression

des UBE3A-Gens interferieren und für das Angelman-Syndrom ursächlich sind (Kishino

et al.,1997; Matsuura et al., 1997).

Bei 10-15% der Individuen mit der klinischen Diagnose Angelman-Syndrom kann die

molekulare Ursache nicht identifiziert werden (Williams, 2005).

1.3.2. Das Rett-Syndrom

Das Rett-Syndrom ist eine X-chromosomal dominant vererbte gravierende

Entwicklungsstörung, die mit Epilepsie und mentaler Retardierung einhergeht und

erstmals 1966 von Andreas Rett beschrieben wurde (Rett, 1966). Etwa 1 von 10 000

Mädchen und wahrscheinlich 1 von 100 000 lebend geborenen Jungen sind betroffen

(Kerr und Stephonson, 1986; Kozinetz et al., 1993; Hagberg und Hagberg, 1997).

Einleitung

15

Hierbei zeigen sich dem Angelman-Syndrom ähnliche Symptome wie Ataxie, eine

erworbene Mikrozephalie, häufiges Lachen, eine fehlende Sprache, Skoliose sowie

Krampfanfälle mit pathologischem EEG-Muster (Noh et al., 2012).

Mutationen im MECP2-Gen, welches für das Methyl-CpG binding protein-2 kodiert,

wurden bei Rett-Patienten erstmals 1999 erwähnt (Amir et al., 1999). Bis zu 95% der

Patienten mit klassischem Rett-Syndrom haben eine Mutation im MECP2-Gen, welche

normalerweise de novo auftritt. Beim atypischen Rett-Syndrom finden sich hingegen

nur bei 40-60% der Patienten MECP2-Veränderungen (Glaze et al., 2010,Armani et al.,

2012). Studien konnten zeigen, dass der Großteil der Mutationen im MECP2-Gen auf

dem väterlichen X-Chromosom entsteht. Ob ein Zusammenhang mit dem väterlichen

Alter besteht, ist bislang nicht geklärt (Zhu et al., 2010, Ravn et al., 2011). In vielen

Fällen, in denen keine Veränderung im MECP2-Gen dem beschriebenen Krankheitsbild

zugrunde liegt, ist die Ursache für die Erkrankung unklar.

Die Kleinkinder, fast ausschließlich Mädchen, entwickeln sich bis zum 6.-18.

Lebensmonat scheinbar normal. Auf eine Phase, in der die Entwicklung stagniert,

folgen Rückschritte mit Verlust erworbener Fähigkeiten wie der expressiven Sprache

und motorischer Fertigkeiten. Zusätzlich entwickeln die Patienten stereotype

Handbewegungen, eine Mikrozephalie, Epilepsie, Autismus, intermittierende Hypo- und

auch Hyperventilationsepisoden sowie Lernschwierigkeiten und Gangstörungen (Kerr

und Stephonson, 1986). Jungen mit einer Mutation im MECP2-Gen können den

Phänotyp des Rett-Syndroms wie Mädchen (bei einem Karyotyp 47,XXY oder

somatischen Mosaik für die MECP2-Mutation) haben, einen Verlauf mit einer schweren

Enzephalopathie und Tod im Kindesalter haben oder weniger schwere Manifestationen

mit vorwiegend psychiatrischen Auffälligkeiten wie bipolare Störungen oder

Schizophrenie zeigen. Bei der dritten Gruppe werden Mutationen beschrieben, die nicht

bei Mädchen gefunden wurden. Es handelt sich um Mutationen, die bei Heterozygoten

wahrscheinlich sehr milde Auswirkungen haben (Moretti und Zoghbi, 2006).

Bei der Epilepsie bei Patienten mit Rett-Syndrom handelt es sich meist um generalisiert

tonisch-klonische und partiell-komplexe Anfälle, andere Anfallstypen wie fokal tonische

Anfälle wurden jedoch ebenfalls beobachtet (Zhu et al., 2010). Die Krampfanfälle

variieren je nach Mutation und sind mit dem klinischen Schweregrad des

Erscheinungsbildes assoziiert (Glaze et al., 2010).

1.4. Bereits bekannte Gene – Differentialdiagnosen

In den vergangenen Jahren wurden weitere Gene identifiziert, deren Veränderungen zu

einer Epilepsie mit mentaler Retardierung führen und daher eine wichtige

Einleitung

16

Differentialdiagnose zu den Krankheitsbildern Angelman-Syndrom und Rett-Syndrom

darstellen. Zu diesen Genen gehören die Gene CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6.

1.4.1. Das CDKL5-Gen

Das CDKL5-Gen ist in der Chromosomenregion Xp22 lokalisiert und besteht aus 23

Exons, von denen die ersten drei Exons nicht kodierend sind (Kalscheuer et al., 2003).

Es kodiert für das cdkl5-Protein (cyclin-dependent kinase like 5). Die genaue Funktion

dieses Proteins ist bis heute weitgehend unklar, allerdings wird eine Interaktion mit dem

MECP2-Gen beschrieben. (Carouge et al., 2010).

De novo aufgetretene Mutationen und Deletionen im X-chromosomal vererbten CDKL5-

Gen wurden in den letzten Jahren bei etwa 80 Patienten im Zusammenhang mit dem

atypischen Rett-Syndrom beschrieben. (Rademacher et al., 2011)Einige Mutationen

wurden mehrfach beschrieben (Castrén et al., 2011). Bislang wurde keine Korrelation

zwischen dem Ort der Mutation und der Schwere des Krankheitsbildes identifiziert (Mei

et al., 2010). Beide Geschlechter können von Veränderungen im CDKL5-Gen betroffen

sein (Elia et al., 2008, Fichou et al., 2009; Sartori et al., 2009). Die Symptomatik und

der Schweregrad der Erkrankung ist bei Jungen und Mädchen identisch (Van Esch et

al., 2007; Erez et al., 2009; Liang et al., 2011). Etwa 5% der männlichen Patienten und

14% der weiblichen Patienten mit epileptischer Enzephalopathie einer Untersuchung

von Liang et al. trugen pathogene CDKL5-Veränderungen (Liang et al., 2011). Diese

Veränderungen gelten als Ursache für eine früh beginnende therapieresistente

Epilepsie mit BNS-Krämpfen, tonischen und tonisch-klonischen generalisierten

Anfällen, Mikrozephalie, einer schweren psychomotorischen Entwicklungsverzögerung

und Bewegungsstörungen (Melani et al., 2011).

Im Vergleich zum klassischen Rett-Syndrom manifestiert sich die Epilepsie bei

Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen bereits im Alter von 2-3 Monaten meist in

Form von BNS-Krämpfen, die sich schließlich zu einer therapieresistenten oder schwer

behandelbaren Epilepsie entwickeln (Tao et al., 2004; Erez et al., 2009). In der

Zusammenschau der Literatur scheint es kein spezifisches EEG-Muster, das mit

Veränderungen im CDKL5-Gen assoziiert ist, zu geben (Buoni et al., 2006; Archer et

al., 2006; Pintaudi et al., 2008). Im kranialen CT bzw. MRT finden sich kortikale

Atrophie kombiniert mit hyperintensen Arealen der weißen Substanz im

Temporallappen, die mit Myelinisierungsstörungen zu vereinbaren sind (Bahi-Buisson

et al., 2008a). Liang et al. beschreiben eine milde Frontallappenatrophie (Liang et al.,

2011).

Einleitung

17

1.4.2. Das ARX-Gen

Das ARX-Gen kodiert für das Aristaless-related-homeobox-Protein. Der

Transkriptionsfaktor nimmt eine wichtige Rolle in der Embryogenese, speziell in der

Entwicklung des zentralen Nervensystems bei Proliferation und Differenzierung von

Interneuronen ein (Bienvenu et al., 2002, Kitamura et al., 2002). Es ist auf dem kurzen

Arm des X-Chromosoms (Xp22.13) lokalisiert und besteht aus fünf kodierenden Exons

(Strømme et al., 2002). Das arx-Protein setzt sich aus der Homeobox-Domäne sowie

der Aristaless-Domäne zusammen und enthält vier Polyalanin-Abschnitte. Die am

häufigsten identifizierte Mutation ist eine 24bp-Duplikation im Exon 2 und führt zu einer

Verlängerung des zweiten Polyalanin-Abschnitts (Kitamura et al., 2002, Suri, 2005). Die

Mutationen oder Deletionen treten familiär aber auch sporadisch auf. Gécz et al.

postulierten 2006, dass das eine Veränderung im ARX-Gen bei 9,5% der Patienten mit

X-chromosomaler mentaler Retardierung vorliege (Gécz et al., 2006).

Seit 2002 wurden zumindest zehn Formen von Entwicklungsstörungen im

Zusammenhang mit Mutationen im ARX-Gen beschrieben, die eine beeindruckende

Vielfalt des klinischen Erscheinungsbildes demonstrieren (Sherr, 2003, Gécz et al.,

2006, Shoubridge et al., 2010). Die intra- und interfamiliäre Pleiotropie sowie die

genetische Heterogenität sind ein Kennzeichen für ARX-Mutationen (Shoubridge et al.,

2010). Der Erbgang ist je nach Mutationsschweregrad X-chromosomal dominant oder

X-chromosomal rezessiv. Weibliche Trägerinnen der Mutationen sind vermutlich meist

phänotypisch unauffällig, in seltenen Fällen zeigen sie ein variables Erscheinungsbild

mit mentaler Retardierung, Epilepsie und Agenesie des Corpus Callosum sowie

Hyperreflexie (Scheffer et al., 2002, Marsh et al., 2009). Bei den männlichen

Betroffenen variiert das Erscheinungsbild und wird im Folgenden beschrieben.

Große Deletionen, Mutationen, die zum Abbruch des Proteins führen, und „missense“-

Mutationen in der Homeobox-Domäne verursachen die schwersten Phänotypen. Dazu

gehören Lissenzephalie mit abnormen Genitalien (X-linked lissencephaly with absent

corpus callosum and ambiguous genitalia - XLAG) (Kitamura et al., 2002), XLAG mit

Hydrozephalus und das Proud-Syndrom. Letzteres umfasst schwere mentale

Retardierung, eine therapieresistente Epilepsie, abnorme Genitalien sowie Agenesie

des Corpus callosum (Proud et al., 1992; Suri, 2005, Conti et al., 2011).

Andere Veränderungen im ARX-Gen führen zu Phänotypen wie das West-Syndrom,

welches aus BNS-Krämpfen, mentaler Retardierung und Hypsarrhythmie im EEG

besteht (Strømme et al., 2002) sowie mentale Retardierung, tonische Anfälle und

Dystonie ohne BNS-Krämpfe und das Ohtahara-Syndrom (frühkindliche epileptische

Enzephalopathie). Weiterhin ist das ARX-Gen ursächlich für das Partington-Syndrom.

Einleitung

18

Die klinischen Zeichen des Partington-Syndroms umfassen mentale Retardierung,

milde fokale Dystonien (meist der Hände) und eine Dysarthrie (Partington et al., 1988;

Turner et al., 2002).

1.4.3. Das SLC9A6-Gen

Das SLC9A6-Gen (Sodium Like Channel 9A6-Gen) besteht aus 16 Exons und ist auf

dem X-Chromosom im Bereich Xq26.3 lokalisiert. Das Gen kodiert für den

mitochondrialen Natrium-Wasserstoff-Ionentransporter NHE6, der unter anderem an

der Regulation des intrazellulären pH-Wertes beteiligt ist (Numata et al., 1998).

Mutationen im SLC9A6-Gen werden X-chromosomal vererbt und sind für das

Christianson-Syndrom und das X-chromosomale „Angelman-ähnliche-Syndrom“

verantwortlich. Über die Häufigkeit von Mutationen im SLC9A6-Gen gibt es bislang

keine genauen Daten.

Erstmals wurden Veränderungen im SLC9A6-Gen bei männlichen Patienten mit

geistiger Behinderung, Mikrozephalie, Epilepsie, Ataxie und Verhaltensauffälligkeiten,

die an das Angelman-Syndrom erinnerten, beschrieben (Gilfillan et al., 2008).

Mittlerweile wurden einige Familien mit männlichen Betroffenen aus mehreren

Generationen beschrieben (Christianson et al., 1999; Gilfillan et al., 2008, Garbern et

al., 2010). Seitdem haben sich drei unterschiedliche klinische Erscheinungsbilder

abgezeichnet (Strømme et al., 2011): Die häufigste Manifestationsform scheint ein X-

chromosomales an das Angelman-Syndrom erinnerndes Krankheitsbild zu sein. Die

zweite Form, auch als das Christianson-Syndrom bekannt, ist ebenfalls eine an das

Angelman-Syndrom erinnerndes Krankheitsbild (Christianson et al., 1999). Christianson

beschreibt bei den Patienten kraniofaziale Dysmorphiezeichen wie ein langes schmales

Gesicht mit einer langen Nase und eine Prognathie. Häufig wird über eingeschränkte

Augenbeweglichkeit berichtet, wobei vor allem Störungen der lateralen und vertikalen

Bewegungen vorliegen (Christianson et al., 1999). Hier zeigt sich bei älteren Patienten

ein etwas abweichender Phänotyp (Gilfillan et al., 2008, Schroer et al., 2010). Bei dem

dritten Phänotyp liegen eine kortikobasale Degeneration sowie Ablagerungen von Tau-

Proteinen einhergehend mit schwerer geistiger Behinderung und autistischem

Verhalten vor (Garbern et al., 2010).

Das klinische Erscheinungsbild der männlichen Betroffenen umfasst eine sekundäre

Mikrozephalie, Kleinwuchs, eine globale psychomotorische Entwicklungsretardierung

mit Ataxie einhergehend mit Muskelhypotonie und fehlender Sprachentwicklung

(Gilfillan et al., 2008). Die Patienten zeigen eine fröhliche Grundstimmung mit

Lachanfällen und häufigem spontanen Händeklatschen.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Str%C3%B8mme%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

Einleitung

19

Die meist therapieresistente bzw. schwer behandelbare Epilepsie beginnt im zweiten

Lebensjahr und besteht aus tonisch-klonischen Anfällen und Absencen. Mit

Verschlechterung der Anfallssituation verlieren viele der Patienten bereits erworbene

Fähigkeiten. Bei weiblichen Trägerinnen einer Veränderung im SLC9A6-Gen zeigen

sich Verhaltensauffälligkeiten und Lernschwierigkeiten.

Im cMRT finden sich eine fokale Atrophie sowie eine Hypoplasie des Vermis im

Kleinhirn und im weiteren Verlauf eine progressive Kleinhirnatrophie (Gilfillan et al.,

2008; Schroer et al., 2010).

1.4.4. Das TCF4-Gen

Das TCF4-Gen (Transcription Factor 4-Gen) ist auf Chromosom 18 im Bereich 18q21

lokalisiert und kodiert für den basis helix-loop-helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor 4. Das

Gen besteht aus 20 Exons.

Erstmals wurde das Pitt-Hopkins-Syndrom 1978 bei zwei nicht verwandten Patienten

mit geistiger Behinderung, einem breiten Mund und Hyperventilationsepisoden

beschrieben (Pitt und Hopkins, 1978). 2007 wurde die Haploinsuffizienz des TCF4-

Gens als eine Ursache für das Pitt-Hopkins-Syndrom erwähnt (Amiel et al., 2007;

Brockschmidt et al., 2007, Zweier et al., 2007).

Die Erkrankung wird autosomal dominant vererbt und beide Geschlechter können

gleichermaßen betroffen sein. Die bisher bekannten Fälle traten sporadisch auf und

wurden durch de novo-Mutationen verursacht (Amiel et al., 2007). Klinisch ähnelt das

Pitt-Hopkins-Syndrom dem Angelman-Syndrom und dem Rett-Syndrom hinsichtlich des

Verhaltens, der Schlafstörungen und der fröhlichen Grundstimmung (Takano et al.,

2010).

Patienten mit Pitt-Hopkins-Syndrom zeigen eine schwere psychomotorische

Retardierung mit fehlender Sprachentwicklung sowie charakteristische Gesichtszüge.

Sie haben ein grob wirkendes Gesicht mit tief liegenden Augen, einen breiten

Nasenrücken mit gebogener Nasenspitze, einen breiten Mund mit bogenförmiger

Oberlippe, weit auseinanderstehende Zähne und eine Prognathie. Die Ohren sind oft

antevertiert und dysplastisch. Mit steigendem Alter vergröbern die Gesichtszüge

zunehmend (Zweier et al., 2009).

Die Patienten entwickeln in der späten Kindheit Hyperventilationsepisoden mit darauf

folgenden Apnoen, die mit Zyanose einhergehen können (Zweier et al., 2007).

Zudem wurden bei einigen Patienten eine Epilepsie, eine sekundäre Mikrozephalie und

Wachstumsrückstand beschrieben. Im MRT wurden in manchen Fällen ein

hypoplastisches Corpus Callosum, auffällig gebogene Nuclei Caudati,

Ventrikelasymmetrien und Atrophie des frontalen bzw. parietalen Cortex beschrieben.

Einleitung

20

Muskelhypotonie und Obstipationsneigung sind ebenfalls zu finden (Zweier et al.,

2009). Zusätzlich wurden Muskelhypotonie, gastrointestinale Komplikationen und eine

fröhliche Grundstimmung mit Lachanfällen beschrieben (Peippo et al., 2006).

Zum Zeitpunkt des Beginns der Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit wurde davon

ausgegangen, dass das Pitt-Hopkins-Syndrom aufgrund der schweren mentalen

Retardierung, der Epilepsie und der Hyperventilationsepisoden eine wichtige

Differentialdiagnose zum Angelman- sowie zum Rett-Syndrom darstellte.

Whalen et al., definierten 2012 den Phänotyp des durch Veränderungen im TCF4-Gen

verursachte Pitt-Hopkins-Syndroms präziser mittels einer Analyse aller bisher in der

Literatur beschriebenen Patienten (79) und 33 neuer Patienten mit einer Veränderung

im TCF4-Gen. Demnach sind die wichtigsten Merkmale die bereits beschriebenen

charakteristischen Gesichtszüge, eine schwere motorische Entwicklungsverzögerung,

eine fehlende Sprache sowie stereotype Handbewegungen. Seltener sind

Hyperventilation, Angst oder Agitation, Hypotonie, Lächeln, ein ataktisches Gangbild

und Strabismus (Whalen et al., 2012).

1.5. Aufgaben und Zielsetzung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Vorkommen von genetischen

Veränderungen in den Genen TCF4, CDKL5, SLC9A6 und ARX bei Patienten mit

unterschiedlichen Formen von Epilepsie und mentaler Retardierung in einer Gruppe

von 34 Patienten zu untersuchen. Mutationen in diesen Genen führen häufig zu

Phänotypen, die eine häufige Differentialdiagnose zum Rett-Syndrom und Angelman-

Syndrom bei Patienten mit Epilepsie und mentaler Retardierung darstellen.

Zunächst etablierte ich die Bedingungen für PCR und Sequenzierung des TCF4-Gens

für den diagnostischen Gebrauch.

In einem zweiten Schritt sollten Patienten mit Veränderungen in den genannten Genen

klinisch näher charakterisiert werden. Die Ergebnisse sollten zur Systematisierung und

zum besseren Verständnis des jeweiligen Krankheitsbildes beitragen.

Nach der Auswertung der klinischen Daten, MRT-Untersuchungen, EEG-

Untersuchungen, im Vorfeld durchgeführter Diagnostik und einer ausführlichen

Anamnese wurde festgelegt, in welchen Genen und in welcher Reihenfolge eine

Mutationsanalyse der Gene TCF4, CDKL5, SLC9A6 und ARX durchgeführt wird. Dazu

verwendete ich die von mir für das TCF4-Gen entwickelten PCR- und

Sequenzierungsbedingungen sowie die im Institut bereits etablierten

Untersuchungsmethoden für die Gene CDKL5, SLC9A6 und ARX.

Material und Methoden

21

2. Material und Methoden

2.1. Materialien

2.1.1. Patienten

Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Kohorte setzt sich aus 34 Patienten mit

Epilepsie und mentaler Retardierung ohne bislang bekannte genetische Ursache

zusammen. Wir rekrutierten die Patienten über eine Anfrage an Sozialpädiatrische

Zentren, Epilepsiezentren und Neuropädiater in ganz Deutschland. Es wurden

Patienten mit einer Epilepsie und mentaler Retardierung gesucht, bei denen das

Angelman-Syndrom und das Rett-Syndrom ausgeschlossen worden war. Die Art der

Epilepsie war nicht näher eingeschränkt.

Die Patienten wurden aus Epilepsiezentren und von Pädiatern aus ganz Deutschland,

sowie aus England und Rumänien in diese Studie aufgenommen. Sie wurden entweder

im Institut für Humangenetik der Universität zu Lübeck oder in den zuweisenden

Ambulanzen vorgestellt, durch die behandelnden Ärzte evaluiert und dieser Studie

zugewiesen. Die Sorgeberechtigten der Patientinnen und Patienten wurden ausführlich

aufgeklärt und ein schriftliches Einverständnis wurde eingeholt (siehe 7.1 und 7.2).

Der Fragebogen diente der Systematisierung der klinischen Informationen über die

Patienten (siehe 7.3) und wurde von den betreuenden Ärzten ausgefüllt. Die

Informationen umfassen unter anderem Angaben zu Art und Beginn der Epilepsie,

EEG-Muster, das Vorhandensein morphologischer Veränderungen im Gehirn, klinische

Symptome wie Hyperventilationszustände, gastroösophagealer Reflux, häufige

Atemwegsinfektionen, Bewegungsstörungen und weitere Auffälligkeiten oder

Fehlbildungen.

Nach der Auswertung der klinischen Daten, cMRT-Untersuchungen, EEG-


Anamnese wurde entschieden, bei welchen Genen und in welcher Reihenfolge eine

Mutationsanalyse durchgeführt wird.

Das Projekt wurde von der Ethik-Kommission der Universität zu Lübeck am 12.05.2009

genehmigt (Aktenzeichen 09-079).


22

2.1.2. Geräte

BioDocAnalyze Geldokumentationssystem Biometra, Göttingen

Biometra T Gradient Cycler Biometra, Göttingen

Biophotometer 6131 Eppendorf, Hamburg

Centrifuge 5414 C, 5804 Eppendorf, Hamburg

Discovery Autoclavable Pipetten

(0,5-1µl, 2-2µl, 20-200µl, 100-1000µl) ABIMED Labortechnik, Langenfeld

Elektronische Waage IP 65 Sartorius AG, Göttingen

0,5-10µl Finnpipetten 4510 Thermo Fisher Scientific, München

Gene Power Supply GPS 200/400 Pharmacia Biotech, Freiburg

HE 99x submarine electrophoresis unit Amersham Biosciences, Schweiz

3100-Avant Genetic Analyzer Applied Biosystems, USA

3130xl Genetic Analyzer Applied Biosystems, USA

Mastercycler PE 9600 Eppendorf, Hamburg

Mikrowellengerät Micro 700 Hitachi, Japan

Multipette Stream Eppendorf, Hamburg

Oberflächenheizplatte IKA Combing RCT IKA Labortechnik, Staufen

2700 Thermal Cycler Applied Biosystems, USA

2720 Thermal Cycler Applied Biosystems, USA

UV-Strahler Chroma 43 Vetter GmbH, Wiesloch

Vortexschüttler MS 2 Minishaker IKA Labortechnik, Staufen

2.1.3. Chemikalien, Nukleotide, Enzyme

Agarose (Pulver) StarLab, Ahrensburg

Aqua destillata Merck, Darmstadt

Borsäure Merck,Darmstadt

DMSO (Dimethylsulfoxid) Roche, Penzberg

Ethidiumbromid (10mg/ml) Merck, Darmstadt

Ficoll 400 Pharmacia Biotech, Freiburg

GC Rich PCR System Roche, Mannheim

HiDi™ Formamide Applied Biosystems, USA

HPLC Wasser Merck, Darmstadt

Illustra™ Sephadex™ G-50 GE Healthcare, München

Low DNA Mass Ladder Invitrogen, USA

MP Taq Core Kits 10 MP Biomedicals, Eschwege

SALSA MLPA Kits P075-A1, P189-B1 MLPA Holland, Niederlande

TaqPolymerase 5U/µl Roche, Penzberg


23

Titriplex III (EDTA) Merck, Darmstadt

Tris MP Biomedicals, Eschwege

Xylencyanol Serva, Heidelberg

2.1.4. Puffer, Medien, Lösungen

3x Ficoll-Probenpuffer 145 μM Bromphenolblau

186 μM Xylencyanol

15 % (w/v) Ficoll 400

1x TBE-Puffer 36gTris

18,3g Borsäure

2,47g Titriplex III

auf 4 l aqua dest.

2%ige Agarosegel-Lösung 100 ml 1xTBE-Puffer

2g Agarosepulver

5µl Ethidiumbromid

2.5x TerminatorMix 1.1 Applied Biosystems, USA

5x Sequenzierpuffer Applied Biosystems, USA

2.1.5. Verbrauchsmaterial

Acetate Folie für Microtest Well Plates Sarstedt, Nümbrecht

Combitips Plus (0,1ml, 0,5ml) Eppendorf, Hamburg

Domed 8 Cap Strips Thermo Scientific, UK

Finntip Pipettenspitzen (0,5-10µl) Thermo Scientific, UK

Multiply®µ Strip Pro 8er Kette Sarstedt, Nümbrecht

96-Well PCR Plate nonskirted 0,2ml Thermo Scientific, UK

Multiscreen 96-Well Plates Millipore, Irland

Micro Amp Optical 96-Well Reaction Plate

with Barcode Applied Biosystems, USA

Multitest Plate 96-Well Vee Bottom Sarstedt, USA

MultiScreen Filter Plates Millipore, Irland

Pipettenspitzen Finntip 10-300µl Thermo Scientific, UK

Pipettenspitzen (-2µl) Fisher Scientific, Schwerte

Pipettenspitzen (2-200µl) Sarstedt, Nümbrecht

Pipettenspitzen (200-400µl) Sarstedt, Nümbrecht


24

Pipettenspitzen (-2µl) Eppendorf, Hamburg

Tubes (- 0,5, - 1,5, - 2ml) Sarstedt, Nümbrecht

2.1.6. DNA-Proben

Die DNA der 34 Patienten wurde teilweise im Institut für Humangenetik der Universität

Lübeck sowie teilweise in den einsendenden Laboren aus Blutproben extrahiert.

Die Kontroll-DNA-Proben stammen aus dem Institut für Humangenetik der Universität

Lübeck.

2.1.7. Computersoftware

3100 Avant Data Collection 2.0 Applied Biosystems, USA

Gene Mapper 3.5 Applied Biosystems, USA

Microsoft Word 2010 Microsoft

Microsoft Excel 2010 Microsoft

SequencePilot Module MLPA 3.3 JSI Medical Systems

SeqScape 2.5 Applied Biosystems, USA

Sequencing Analysis 5.2 Applied Biosystems, USA

Seqworks 1.03 beta Sven Opitz

2.1.8. Internetressourcen

Ensembl www.ensembl.org

GeneReviews www.genetests.org

Human Genome Browser Gateway genome.ucsc.edu/cgi-bin/ hgGateway

MRC Holland www.mrc-holland.com

Mutation T@ster www.mutationtaster.org

National Center for

Biotechnology Information (NCBI) www.ncbi.nlm.nih.gov

Online Mendelian Inheritance in Man

(OMIM) www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/

Datenbank der Einzelnukleotid-

Polymorphismen dbSNP www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP

NCBI Map Viewer www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview

Oligonucleotide Properties Calculator www.basic.northwestern.edu/

biotools/oligocalc.html

Datenbank der Publikationen www.pubmed.com

http://genome.ucsc.edu/cgi-

http://www.pubmed.com/


25

2.2. Methoden

Die im Folgenden beschriebenen Methoden wandte ich im Rahmen dieser Arbeit im

Labor an. Zunächst soll auf gängige molekulargenetische Methoden eingegangen

werden, um danach die Etablierung der PCR für das TCF4-Gen zu beschreiben.

2.2.1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR)

Die Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction- PCR) ist eine von Kary

Mullis entwickelte Methode, welche dazu dient, sehr kleine Mengen spezifischer DNA-

Fragmente in vitro exponentiell zu amplifizieren (Mullis et al., 1986).

Der Ablauf einer PCR setzt sich üblicherweise aus den Schritten Denaturierung,

Annealing (Anlagerung der Primer) und Elongation bei drei unterschiedlichen

Temperaturstufen zusammen. Dazu werden eine geringe Menge der zu

vervielfältigenden DNA (Template-DNA), zwei einzelsträngige aus etwa 20 Basen

bestehende Oligonukleotid-Primer, freie Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP und dTTP)

sowie eine hitzestabile DNA-Polymerase benötigt. Die gesamte Reaktion findet in

einem vollautomatisierten ThermoCycler statt.

Zunächst wird die genomische DNA durch Erhöhung der Temperatur auf 95°C in ihre

zwei Einzelstränge aufgetrennt (Denaturierung). Da die DNA zu Beginn der

Denaturierung noch in ihrer komplexen, hochmolekularen Struktur vorliegt, ist für den

initialen Schritt eine Zeit von fünf Minuten notwendig, damit auch GC-reiche Regionen

aufgetrennt werden.

Daraufhin erfolgt die Anlagerung der Primer an die ihnen komplementären DNA-

Einzelstränge. Bei den Primern handelt es sich um synthetisch hergestellte

Oligonukleotide aus etwa 20 Nukleotiden. Der Vorwärts-(F-)Primer und der Rückwärts-

(R-)Primer flankieren das zu vervielfältigende DNA-Fragment, wobei der F-Primer am

„sense“-Strang und der R-Primer am „antisense“-Strang bindet. Bei der Auswahl der

Primer gilt es einige Dinge zu beachten: Ihre Länge sollte bei etwa 20 Nukleotiden

liegen, sie sollten einen ausgeglichenen A/T- und G/C- Gehalt aufweisen und die

Schmelztemperatur eines F-und R-Primerpaares sollte nicht weiter als 5-10°C

auseinander liegen. Außerdem sollten „ungewöhnliche“ Basenfolgen wie polyA-

Sequenzen, polyT-Sequenzen und G/C-reiche Primer vermieden werden.

Für das Annealing wird die Temperatur im ThermoCycler auf die durch die

Zusammensetzung der Primer bestimmte Annealingtemperatur heruntergekühlt. Sie

liegt in der Regel um 55°C und damit knapp unter der errechneten Schmelztemperatur

der Oligonukleotide. Beim Annealing entsteht ein kurzer Abschnitt doppelsträngiger

DNA mit einem freien 3„-OH-Ende, was entsprechend verlängert werden kann.


26

Im dritten Schritt beginnt das hier verwendete Enzym Taq-Polymerase bei seinem

Aktivitätsoptimum von 72°C mit der Synthese von zwei komplementären DNA-Strängen

in 3„-Richtung (Elongation). Hierbei erkennt die Taq-Polymerase den Primer-DNA-

Komplex und synthetisiert den Gegenstrang ausgehend vom freien 3„-OH-Ende aus

den im Reaktionsansatz vorliegenden freien Nukleotiden (dATP, dCTP, dGTP und

dTTP) in 5„3„-Richtung. Die Desoxribonukleosidtriphosphate (dNTPs) dATP, dCTP,

dGTP und dTTP sollten hierbei in einem äquimolaren Verhältnis vorliegen. Eine

Pufferlösung sorgt für eine adäquate Reaktionsumgebung.

Die Elongationsdauer beträgt für 1000 Basenpaare etwa 60 Sekunden und hängt von

der verwendeten DNA-Polymerase ab. Die Taq-DNA-Polymerase stammt aus dem

thermophilen Bakterium Thermicus aquaticus und wird auch bei Temperaturen bis 95°C

nicht denaturiert oder inaktiviert. Die hier verwendete rekombinante, HPLC-gereinigte

Taq-DNA-Polymerase besitzt neben der 5„3„-DNA-Polymeraseaktivität eine 5„3„-

Exonukleasenaktivität, jedoch keine 3„5„ Exonukleaseaktivität. Die Fehlerrate des

Enzyms liegt mit einem Fehler bei 106 synthetisierten Basen relativ hoch, was in der

fehlenden 3„5„ Exonukleaseaktivität und damit der fehlenden postsynthetischen

Kontrolle (proof-reading-Mechanismus) begründet ist.

Der Zyklus aus Denaturierung, Annealing und Elongation wird üblicherweise 30-35 Mal

wiederholt. Dabei nimmt die amplifizierte DNA-Menge exponentiell zu.

Nach Beendigung des letzten Zyklus findet eine 7-minütige sogenannte Endelongation

statt, während der bis dahin eventuell unvollständige Produkte komplettiert werden.

Bei einem Großteil der PCR-Anwendungen liegt nach 30 Zyklen genügend Produkt für

die nachfolgenden Analyseschritte vor.

Da es sich bei der PCR um eine extrem empfindliche und für Kontamination anfällige

Methode handelt, ist es von äußerster Bedeutung, schon in diesem Schritt einen

Kontrollansatz (Negativprobe), der keine DNA enthält, mitzuführen.

Die PCR-Bedingungen für das Exon 1 des SLC9A6-Gens sind exemplarisch in Tabelle

1 und 2 gezeigt. Die PCR-Bedingungen für die übrigen Exons des SLC9A6-Gens sowie

für die Gene ARX, CDKL5 und TCF4 sind dem Anhang zu entnehmen.


27

Tabelle 1 PCR-Ansatz für das Exon 1 des SLC9A6-Gens

Konzentration Hersteller Volumen (in µl)

DNA 50 ng/µl 1,5

a.d. (HPLC) Merck 13,25

Puffer 5 x Roche 5

dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5

GC-rich Resolution 5 M Roche 2,5

F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1

R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1

Taq-Polymerase 5 U/µl Roche 0,25

Ansatzvolumen 25

Tabelle 2 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das Exon 1 des SLC9A6-

Gens

PCR-Schritt Temperatur in °C Zeit

30 Zyklen

Initialisierung 95°C 5 Min

Denaturierung

Annealing

Elongation

Elongation

95°C

60°C

72°C

30 Sek.

30 Sek.

1 Min.

72°C 20 Min.

Durchführung der PCR:

Die den Tabellen (s.o. sowie im Anhang) zu entnehmenden Reaktionsansätze wurden

in eine 96-Well Mikrotiterplatte gegeben. Dabei wurde die DNA vorgelegt und

anschließend wurde der Mix aus Primern, 10xPuffer, dNTPs und Taq-Polymerase

darauf pipettiert. Die Mikrotiterplatte wurde mit Deckelstrips verschlossen, in den

vorgeheizten ThermoCycler gestellt und das gewünschte PCR-Programm verwendet.

Die PCR-Bedingungen für das TCF4-Gen wurden im Rahmen der Laborarbeit für diese

Dissertation etabliert. Die PCR-Bedingungen für die übrigen Gene waren bereits

etabliert und konnten weitestgehend übernommen werden.

2.2.2. Gelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte

Die Agarose-Gelelektrophorese ist die einfachste und effektivste Methode, DNA-

Fragmente einer Größenordnung von 0,5-25 kb voneinander zu trennen und zu

identifizieren.

Die DNA wandert infolge der negativen Ladung ihrer Phosphatgruppen im elektrischen

Feld zur Anode. Aufgrund der Siebstruktur der Agarose bieten die Poren kleineren


28

Fragmenten weniger Widerstand. Somit durchlaufen große DNA-Fragmente

Agarosegele langsamer als kleine. Um die DNA-Fragmente im Agarosegel sichtbar zu

machen, wird während der Herstellung des Gels der Fluoreszenzfarbstoff

Ethidiumbromid hinzugegeben. Ethidiumbromid lagert sich an die DNA

beziehungsweise schiebt sich zwischen die Basen (Interkalation).

Die PCR-Produkte werden gemeinsam mit 3xFicoll in die Probentaschen des

Agarosegels gegeben. Als Größenmarker dient eine 100bp-DNA-Leiter (low mass

ladder), die bei jeder Elektrophorese aufgetragen wird.

Für die vorliegende Arbeit wurden die Agarosegele aus einer 2%igen Agaroselösung

hergestellt. Hierzu wurde das Agarosepulver mit dem 1x TBE-Elektrophoresepuffer

vermischt, im Mikrowellengerät aufgekocht und anschließend auf etwa 60°C abgekühlt.

Dann wurde die Lösung mit Ethidiumbromid versetzt. Aus der erkaltenden Lösung

wurden mithilfe eines Gelschlittens und Kämmen, die in einer als Form dienenden

Gelschale lagen, die Agarosegele gegossen. Die abgekühlten und fest gewordenen

Gele wurden in eine mit 1xTBE-Elektrophoresepuffer gefüllte Kammer gesetzt und die

Geltaschen wurden mit einem Mix aus 4µl DNA-Probe sowie 3µl 3xFicoll beladen. Die

Elektrophorese erfolgte unter konstanter Spannung von 120 V über 30 Minuten.

Im Anschluss wurde das Ergebnis der Elektrophorese unter UV-Licht mit dem

bioDocAnalyzer fotodokumentiert und die Qualität der PCR-Produkte ließ sich

beurteilen.

2.2.3. Aufreinigung des PCR-Produktes

Um in den der PCR folgenden Analyseschritten mit sauberen Produkten weiter zu

arbeiten, wurden die PCR-Produkte einer Aufreinigung unterzogen.

Die hierfür verwendete Lösung bereitet PCR-Produkte für die Sequenzierung vor,

indem aus der PCR noch vorhandene überschüssige dNTPs und Primer durch die in

der Lösung enthaltenen Enzyme hydrolysiert werden. Bei den Enzymen handelt es sich

um eine Exonuklease I und eine Shrimp Alkalische Phosphatase, die in einem Puffer

gelöst sind. Es sind zwei Inkubationsschritte notwendig. Im ersten Schritt findet bei

37°C für 15 Minuten die Aufreinigung statt und im zweiten Schritt werden die Enzyme

bei 80°C in 15 Minuten inaktiviert.

Für den Aufreinigungsschritt wurden 5µl PCR-Produkt, welches nach Bedarf verdünnt

wurde, und 2µl ExoSAP in eine 96-Well Mikrotiterplatte gegeben und für 30 Minuten im

ThermoCycler wie oben beschrieben behandelt.


29

2.2.4. Sequenzierung nach Sanger

Bei der DNA-Sequenzierung nach Sanger werden die aufgereinigten PCR-Produkte

zunächst denaturiert (Sanger et al.,1977). Zwar kann auch doppelsträngige DNA

verwendet werden, die Ergebnisse mit einzelsträngiger DNA sind jedoch weitaus

besser, da sie längere Sequenzen liefert. Nach der Denaturierung bindet am 3„-Ende

des zu sequenzierenden Abschnittes ein Primer, an welchem mittels einer DNA-

Polymerase ein zum DNA-Fragment komplementärer Strang synthetisiert wird. Dafür

werden einerseits im Reaktionsansatz enthaltene 2„-Desoxynukleotide (dNTPs) sowie

zusätzlich mit einer Fluoreszenzgruppe markierte sogenannte 2„3„-Didesoxynukleotide

(ddNTPs) eingebaut. Dem ddNTP fehlt die notwendige Hydroxylgruppe am dritten C-

Atom der Ribose, an welche üblicherweise das nächste Nukleotid geknüpft wird. Daher

bricht die Amplifikation nach jedem Einbau eines ddNTPs ab und am Ende der

Sequenzierreaktion liegen unterschiedliche lange DNA-Fragmente vor. Für die

basenspezifische Markierung werden vier verschiedene Fluoreszenzgruppen

verwendet.

Im automatischen Sequenziergerät wird eine Gelkapillare mit den Reaktionsprodukten

geladen. Ein Laser regt die markierten ddNTPs zur Fluoreszenz an. Das

Fluoreszenzmaximum für jeden der vier Farbstoffe liegt bei einer anderen Wellenlänge.

Diese Informationen werden digital aufgezeichnet und die ausgelesene Sequenz wird

gespeichert. Der DNA-Abschnitt wird in farbigen Peaks (Ausschlägen) dargestellt.

Nach der ExoSAP-Behandlung werden die zu sequenzierende DNA zusammen mit

dem Primer (Vorwärts- oder Rückwärts-Primer) in eine 96Well- Mikrotiterplatte

vorgelegt, der separat vorbereitete Mix dazu pipettiert und die Platte verschlossen in

den ThermoCycler gestellt.

Die Sequenzierbedingungen für das SLC9A6-Gen sind exemplarisch in den Tabellen 3

und 4 gezeigt. Die Sequenzierbedingungen für die Gene ARX, CDKL5 und TCF4 sind

dem Anhang zu entnehmen.

Tabelle 3 Sequenzieransatz für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens


ExoSAP-Produkt ca. 10 ng/µl 1

5x SeqPuffer Applied Biosystems 1,5

F- oder R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,5

2,5x Terminator Mix 1.1 Applied Biosystems 1

a.d. (HPLC) Biomers 6

Ansatzvolumen 10


30

Tabelle 4 Sequenzierprogramm für die Exons 1-16 des SLC9A6-Gens


25 Zyklen

Initialisierung 96°C 1 Min.

Denaturierung

Annealing

Elongation

96°C

60°C

60°C

10 Sek.

5 Sek.

1 Min.

Im Anschluss an die Sequenzierung werden die Produkte mit 10µl HPLC-Wasser

verdünnt und 10µl des verdünnten Produktes werden über der Sephadexsäule

aufgereinigt.

Die Sephadexaufreinigung wird eingesetzt, um Nukleotide und Salze von DNA-

Fragmenten zu trennen und funktioniert nach dem Prinzip der Gelfiltration. Moleküle

von einer Größe bis zu 20bp können die Matrix aus Dextran- und

Epichlorhydrinmolekülen nicht passieren, die größeren Sequenzprodukte jedoch schon.

Hierfür wurden die Kammern einer Multiscreen-Filterplatte mit 45µl Sephadex™-G50-

Pulver sowie 300µl pro Kammer HPLC a.d. befüllt und für etwa 2 Stunden zum Quellen

bei Raumtemperatur gelagert. Danach wurde das überschüssige Wasser bei 2900

Umdrehungen/Minute abzentrifugiert und 10µl der verdünnten Sequenzprodukte über

der Sephadexsäule mittels Zentrifugation bei 2900 Umdrehungen/Minute für 5 Minuten

filtriert. Im letzten Schritt wurden 10µl HiDi™-Formamide in eine Micro Amp Optical

96Well- Messplatte vorgelegt und etwa 5µl aufgereinigte Sequenzprobe dazu pipettiert.

Die Proben wurden bei 12-18 Sekunden Injektionszeit im 3130xl Genetic Analyzer

mittels kapillarelektrophoretischer Auftrennung gemessen.

2.2.5. Auswertung der Sequenzen

Mithilfe der Programme „Sequencing Analysis“ und „Seq Scape“ erfolgte die

Auswertung der digitalisierten Sequenzdaten. Die Daten wurden mit den

Referenzsequenzen aus genetischen Datenbanken verglichen. Zusätzlich wurden die

Sequenzdaten manuell mit der jeweiligen Referenzsequenz abgeglichen. Von jedem

DNA-Abschnitt wurden die Vorwärts- und die Rückwärts-Sequenz ausgewertet.

2.2.6. Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)

MLPA wurde 2002 als neue vielseitig anwendbare Methode zur schnellen Analyse von

Duplikationen und Deletionen eingeführt (Schouten et al., 2002). Mithilfe MLPA lassen

sich in einem Ansatz Variationen in der Kopienzahl von bis zu 45 unterschiedlichen

Sequenzabschnitten erfassen und analysieren (Slater et al., 2003). Dabei wird die

Menge vorhandener bestimmter DNA-Abschnitte ins Verhältnis zur entsprechenden


31

Menge bei gesunden Testpersonen (Kontrolle) gesetzt. Bei MLPA werden nicht DNA-

Fragmente sondern die Sonden, welche den zu untersuchenden DNA-Fragmenten der

Proben komplementär sind, amplifiziert und quantifiziert. Ob die Sonden amplifiziert

werden, hängt davon ab, ob die Zielsequenzen der Sonden in der DNA-Probe enthalten

sind. Jede Sonde setzt sich aus zwei Oligonukleotiden zusammen, die an benachbarte

Lokalisationen der Zielsequenz hybridisieren. Die Sonden werden gebunden und

können danach amplifiziert werden. Alle gebundenen Sonden besitzen identische

Endsequenzen am 5„- und 3„-Ende, was die Benutzung von nur einem Primerpaar

während der nachfolgenden PCR erlaubt. Die Größe des Amplifikationsproduktes liegt

zwischen 130 und 480 Basenpaaren und ist spezifisch für jede Sonde (Schouten et al.,

2002).

Für die Untersuchung der Gene CDKL5 und ARX wurde das Kit SALSA®-MLPA®-Kit

P189-B1 und für das Gen TCF4 das SALSA®-MLPA®-Kit P075-A1 verwendet. Mittels

des SALSA®-MLPA®-Kits P075-A1 wurde außerdem das Gen FOXG1 untersucht und

mittels des SALSA®-MLPA®-Kits P 189-B1 zusätzlich das NTNG1-Gen.

Kurz zusammengefasst besteht die MLPA aus folgenden Schritten:

1. Denaturierung

2. Hybridisierung

3. Ligation

4. Amplifizierung / PCR

Um die zu untersuchenden Sequenzen zu amplifizieren, wird ein Mix von MLPA®-

Sonden zu den Proben gegeben. Jede Sonde ist zu einer bestimmten Zielsequenz

komplementär. Die Sonden bestehen aus zwei Teilen, nämlich zwei Oligonukleotiden,

welche sofort aneinander angrenzend hybridisieren, und jeweils eine der Sequenzen

enthalten, die vom Primerpaar erkannt wird. Nach der Hybridisierung an ihre

spezifischen Ziele werden die zwei „Hemi-Sonden“ durch zwei spezifische Ligase-

Enzyme gebunden. Das resultierende Produkt der Ligase-Reaktion enthält beide

Primersequenzen in einem Fragment und wird während der PCR exponentiell

vervielfältigt. Im Gegensatz zu diesem vollständigen Produkt enthalten Sonden, welche

in der Ligasereaktion nicht gebunden wurden, lediglich eine einzige Primersequenz. Sie

wurden folglich nicht exponentiell amplifiziert und erzeugen während der Messung im

Kapillarsequenzierer kein Fluoreszenzsignal. Daher ist die Entfernung der nicht-

gebundenen Sonden vor der Messung nicht notwendig.

Für die vorliegende Arbeit wurden 2µl der DNA-Proben (DNA-Gehalt 50ng/µl) in eine

Mikrotiterplatte vorgelegt, zunächst mit 3µl a.d. verdünnt und dann in verschlossener


32

Mikrotiterplatte fünf Minuten lang bei 98°C denaturiert. Für die Hybridisierungsreaktion

wurden je 1,5µl SALSA-Probemix (Sonden-Mix) und Pufferlösung hinzugefügt. Nach

einer einminütigen Inkubation bei 95°C wurden die Sonden bei 60°C 16 Stunden lang

hybridisiert.

Dann wurde bei 54°C 32µl des zuvor angesetzten Ligase-65 Mix auf die hybridisierten

Proben gegeben, für 15 Minuten bei 54°C inkubiert und anschließend die Ligase 5

Minuten lang bei 98°C hitzeinaktiviert.

In einer neuen Mikrotiterplatte wurden 10µl Polymerase-Mix, welcher Primer, dNTPs

und Polymerase enthält, vorgelegt, um danach den MLPA-Ligationsansatz hierauf zu

pipettieren. Der PCR-Ansatz wurde im ThermoCycler unter folgenden Bedingungen

behandelt:

Tabelle 5 Schematische Darstellung des PCR-Programms für MLPA


35 Zyklen

Denaturierung

Annealing

Elongation

Elongation

95°C

60°C

72°C

30 Sek.

30 Sek.

1 Min.

72°C 20 Min.

Eine detaillierte Aufführung des MLPA-Ansatzes findet sich im Anhang in 7.5 MLPA-

Ansätze.

Im Anschluss an die PCR wurden 20µl MLPA-Produkt über der Sephadexsäule

(beschrieben unter 2.2.4 Sequenzierung) aufgereinigt und 1:5 mit a.d. verdünnt. 3µl des

aufgereinigten, verdünnten Produktes wurden für die Messung im 3100xl Genetic

Analyzer mit je 9µl mit HiDi® -Formamide verdünntem ROX 500 in eine Messplatte

gegeben. Nach der Denaturierung bei 98°C für 3-4 Minuten wurden die Proben im

Kapillarsequenziergerät aufgetrennt und die Analysedaten digitalisiert.

Die Auswertung erfolgt anhand der Signalhöhe des Ergebnisses des

Sequenziergerätes, was dem Vergleich des Gendosismusters der Patienten mit dem

gesunder Kontrollpersonen entspricht.

2.2.7. Auswertung der Kapillarelektrophorese

Mithilfe der Programme „Gene Mapper“ sowie „SequencePilot“ erfolgte die Auswertung

der digitalisierten Daten aus den kapillarelektrophoretischen Messungen der MLPA. Die

Analyse erfolgt anhand der Signalhöhe bzw. -fläche. Dabei werden die Gendosismuster

der Patienten mit denen gesunder Kontrollpersonen verglichen


33

2.2.8. Etablierung der PCR für das TCF4-Gen

Meine Aufgabe im Rahmen der Laborarbeit bestand neben der molekulargenetischen

Untersuchung der Gene CDKL5, ARX, SLC9A6 und TCF4 in der Etablierung der PCR-

Bedingungen für das TCF4-Gen.

Für die Entwicklung einer PCR-Routineanalytik müssen valide PCR-Methoden etabliert

werden. Dies setzt die Kenntnis relevanter DNA-Sequenzen voraus, welche in

Datenbanken zur Verfügung stehen. Das Prinzip des PCR-Verfahrens ist im Abschnitt

2.2.1 Die Polymerasekettenreaktion (PCR) beschrieben. Für das TCF4-Gen etablierte

ich die PCR-Bedingungen neu.

Häufig ist es problematisch, ein DNA-Fragment spezifisch, das heißt ohne die

Entstehung zusätzlicher unspezifischer Nebenprodukte, zu amplifizieren. Die Spezifität

und Effizienz der PCR hängen von etlichen Parametern wie Temperatur, Anzahl der

Zyklen, Reaktionsdauer und der verwendeten DNA-Polymerase ab. Von

entscheidender Bedeutung sind die Primer und ihre Hybridisierungstemperatur. Die

Grundvoraussetzung für eine erfolgreiche PCR ist das Design optimaler Primer

(Mülhardt, 2006). Bei der Etablierung der PCR-Bedingungen für das TCF4-Gen wurde

darauf geachtet, eine Primer-Länge von 18-30 Basen nicht zu überschreiten und ein

ausgewogenes Verhältnis von Guanidin und Cytosin (40-60%) zu Adenin und Thymin

einzuhalten. Ebenso sollten möglichst nicht mehr als vier gleiche Basen hintereinander

vorliegen. Durch optimale Primer-Länge und ein ausgewogenes Basen werden

Leserasterverschiebungen und Fehlhybridisierungen vermieden. Die

Schmelztemperatur eines Primerpaares sollte 55-80°C betragen, damit ausreichend

hohe Annealingtemperaturen möglich sind (Scheinert, 1997).

Schließlich sollten Primer möglichst wenig komplementär zueinander sein, um sich

nicht gegenseitig als Template zu dienen. Die Sequenz muss möglichst spezifisch für

das gewünschte PCR-Produkt sein, damit die Primer nur an der richtigen Stelle

hybridisieren. Diesem potentiellen Problem entgeht man über hohe

Annealingtemperaturen, wenn es der Aufbau der Primer erlaubt.

Die Schmelztemperatur gibt Auskunft darüber, bei welcher Temperatur fünfzig Prozent

des Primers nicht mehr an das Template bindet, jedoch nicht, ab wann der Primer

zuverlässig hybridisiert. Daher sollte die Hybridisierungstemperatur 5-10°C niedriger als

die errechnete Schmelztemperatur Tm gewählt werden.

Die Schmelztemperatur Tm errechnet sich nach folgender Gleichung:

Tm= 4x (Anzahl G bzw. C) + 2x (Anzahl A bzw. T)

Diese Gleichung gilt für kurze Primer von etwa 20 Basen, wie sie in der vorliegenden

Arbeit verwendet wurden (Mülhardt, 2006).


34

Die Primer wurden entsprechend der aufgeführten Kriterien ausgesucht. Zunächst

wurden die optimalen Annealingtemperaturen berechnet und die ersten PCRs mit

Kontroll-DNA durchgeführt. Außerdem wurde die PCR einiger Exons in Cyclern, die

Temperaturgradienten ermöglichen, durchgeführt, um die errechnete

Annealingtemperatur zu überprüfen und gegebenenfalls zu korrigieren. Die PCR-

Bedingungen, bei denen sich optimale Produkte ergaben, sind dem Abschnitt 7.4.4 im

Anhang zu entnehmen.

Ergebnisse

35

3. Ergebnisse

3.1. Auswertung und Darstellung der Vorbefunde

In der vorliegenden Arbeit wurden zunächst die mittels eines Fragebogens erhobenen

klinischen Daten aus der Vorgeschichte der Patienten ausgewertet.

3.1.1. Anamnese und klinische Befunde

In die Studie wurden 13 (38,2%) Jungen und 21 (61,8%) Mädchen im Alter von 20

Monaten bis 49 Jahren aufgenommen. Auswahlkriterien für die Aufnahme in die Studie

waren eine schwer behandelbare oder therapieresistente Epilepsie und eine mentale

Retardierung. Die Art der Epilepsie wurde nicht näher eingegrenzt.

Die Schwangerschaft verlief bei 25/33 Müttern (76%) komplikationslos, bei 8/33(24%)

traten Komplikationen auf. Zu den Komplikationen gehörten Gestationshypertonie,

Plazentainsuffizienz, ein pathologisches Cardiotokogramm (CTG) in der 28.

Schwangerschaftswoche, ein Pneumothorax, bei zwei Müttern vorzeitige

Wehentätigkeit mit drohender Frühgeburt, Harnwegsinfekte der Mutter sowie

Komplikationen aufgrund einer Prothrombin-Mutation (Faktor-II-Mutation) bei einer

Mutter.

Die Entbindung erfolgte bei 21/31 (67,8%) Patienten spontan vaginal. 10/31 (32,2%)

wurden per Sectio entbunden, zwei Kaiserschnitte davon wurden sekundär aufgrund

eines pathologischen CTG während der Geburt durchgeführt, eine weitere Sectio wurde

aufgrund des Verdachts auf eine intrauterine Infektion bei grünem Fruchtwasser

durchgeführt.

In der Neugeborenen- und Säuglingszeit traten bei 16/30 (53,3%) Patienten

Fütterungsprobleme auf, bei 14/30 (46,7%) Patienten nicht. Bei 11 der Patienten mit

Fütterungsproblemen lag eine muskuläre Hypotonie vor, eine Patientin hatte

Fütterungsprobleme aufgrund einer Kiefer-Gaumen-Spalte.

Der Muskeltonus war bei insgesamt 17/29 (58,6%) Patienten erniedrigt (hypoton), bei

11/29 (38%) normal und eine Patientin (3,4%) hatte eine muskuläre Hypertonie.

Tabelle 6 Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie in der untersuchten

Patientenkohorte

primär sekundär nein keine Angabe

Mikrozephalie 1/27 (3,7%) 9/27 (33,3%) 17/27 (63%) 7/34

Kleinwuchs 0/26 3/26 (11,5%) 23/26 (88,5%) 8/34

Dystrophie 0/25 3/25 (12%) 22/25 (88%) 9/34

Ergebnisse

36

Tabelle 6 bietet eine Zusammenfassung zu Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie

der Patienten. Dazu wurden die Körpermaße zum Zeitpunkt der Geburt und die

Körpermaße zum Zeitpunkt der Datenerhebung ausgewertet. Im Anhang findet sich

eine detaillierte Tabelle mit den Körpermaßen zum Zeitpunkt der Geburt sowie zum

Zeitpunkt der Datenerhebung.

Liegen der frontookzipitale Kopfumfang unterhalb der 3.Perzentile oder mehr als zwei

Standardabweichungen unterhalb des Altersdurchschnitts für Geschlecht und

ethnologischer Herkunft sowie ein Missverhältnis zwischen Gesichts- und Hirnschädel

vor, spricht man von Mikrozephalie (Hay Jr et al., 2007).

Ein kleiner Kopfumfang kann mit einer verzögerten Entwicklung und Wachstum des

Gehirns einhergehen. In dem Zusammenhang können Symptome wie eine

Entwicklungsverzögerung oder neurologische Auffälligkeiten wie beispielsweise

Krampfanfälle und Spastiken auftreten (Hay Jr et al., 2007).

Kleinwuchs wird als eine Körpergröße unter der 3.Perzentile definiert (Zabranski, 2007).

Dystrophie beschreibt in diesem Zusammenhang eine Gedeihstörung aufgrund der

Grunderkrankung der Patienten. Bei keinem der Patienten liegt eine primäre, also

konnatale Dystrophie vor, eine sekundäre im Verlaufe der Erkrankung wird von 3 (12%)

entwickelt. Ursächlich dafür können beispielsweise eine unkontrollierte Anfallssituation

oder Hypalimentation sein.

18/33 (54,4%) Patienten konnten frei laufen. Auffällig ist, dass diejenigen Patienten, die

das freie Laufen erlernten, es mit durchschnittlich 24 Monaten und damit etwa 12

Monate später als gesunde Kinder erlernten.

12/28 (43%) der Patienten entwickelten stereotype Handbewegungungen wie

„Waschbewegungen“, Händereiben oder sie führten Hände und Finger häufig zum und

in den Mund.

17/30 (57%) Patienten hatten eine Bewegungsstörung. Bei sechs Patienten wurde

diese als eine Ataxie, bei zwei als eine Dyskinesie, bei vier Patienten als eine Dystonie

und bei zwei weiteren als eine Spastik beschrieben.

Bei Dystonien und Dyskinesien handelt es sich um repetititve, unwillkürliche

Muskelkontraktionen, die entweder Rumpf, Körper oder Extremitäten in bestimmte

Haltungen zwingen oder zu abnormen Bewegungsabläufen führen. Die

Bewegungsstörungen werden häufig bei Patienten mit Veränderungen in den Genen

CDKL5,ARX,TCF4 und SLC9A6 beschrieben.

Bei 11/31 (35,5%) Patienten wird von einem Verlust erworbener Fähigkeiten berichtet.

Dazu gehören eine Verschlechterung des Gangbildes, ein Verlust der aktiven Sprache

oder Verlernen von Greifen und freiem Sitzen.

Tabelle 7 bietet einen Überblick über die sprachliche Entwicklung der Patienten.

Ergebnisse

37

Tabelle 7 Sprachentwicklung in der untersuchten Patientenkohorte zum Zeitpunkt der

Datenerhebung

Häufigkeit Prozent

Expressive Sprache

Keine 20/31 64,5%

Einzelne Wörter 8/31 25,8%

Mehrwortsätze 3/31 9,7%

Keine Angabe 3/34

Sprachverständnis

Sehr eingeschränkt bis fehlend 18/30 60%

Einzelne Aufforderungen 9/30 30%

Gut 3/30 10%

Keine Angabe 4/34

In Tabelle 8 sind Angaben über die Häufigkeit von Dysmorphiezeichen,

Hyperventilationszuständen und Neigung zu Infekten der Luftwege zusammengefasst.

Tabelle 8 Dysmorphiezeichen und respiratorische Auffälligkeiten in der untersuchten

Patientenkohorte

Ja Nein Keine Angabe

Dysmorphiezeichen 6/28 (21,4%) 22/28 (78,6%) 6/34

Organfehlbildungen 0/28 28/28 (100%) 6/34

Hyperventilationszustände 2/31 (6,4%) 29/31 (93,6%) 3/34

Häufige Luftwegsinfekte 10/32 (31%) 22/32 (69%) 2/34

Bei 6/28 Patienten wurde von den untersuchenden Ärzten über Dysmorphiezeichen

berichtet. Fünf dieser Patienten werden ausführlicher beschrieben.

Patientin 2 hat einen leichten Hypertelorismus, eine breite Mundspalte, breite

Zahnzwischenräume und lange dünne, spitz zulaufende Finger (sogenanntes

„Tapering“). Diese Merkmale wären mit den Auffälligkeiten bei Pitt-Hopkins-Syndrom,

das häufig durch Mutationen im TCF4-Gen verursacht wird, zu vereinbaren.

Bei Patientin 6 liegt eine milde Syndaktylie der zweiten und dritten Zehe beidseits vor.

Dieser Befund ist auch bei dem gesunden Onkel und bei dem Cousin der Patientin

väterlicherseits beschrieben. Die Anomalie hat somit mit hoher Wahrscheinlichkeit

keinen Krankheitswert.

Bei Patient 9 werden tiefliegende Augen mit dichten, geschwungenen Wimpern, ein

kurzes Philtrum, eine milde Retrognathie, prominente Schneidezähne und spitz

zulaufende Finger beschrieben.

Ergebnisse

38

Patient 13 hat eine hohe, vorgewölbte Stirn, kleine, tiefliegende Augen und leicht

splitternde Fußnägel.

Bei der Patientin 14 wurden eine prominente Stirn, tief liegende Augen und ein

Telekanthus beschrieben. Sie hatte einen hohen, schmalen Gaumen, weit

auseinanderstehende, relativ kleine Zähne und eine dünne Oberlippe. Außerdem

standen die Ohren etwas ab, die Nase war relativ kurz und sie hatte ein langes

Philtrum. Die Mamillen waren invertiert.

Tabelle 9 fasst die zum Zeitpunkt der Datenerhebung beschriebenen

Dysmorphiezeichen zusammen.

Tabelle 9 Dysmorphiezeichen

Bei 2/31 Patienten wird über Hyperventilationszustände berichtet.

Hyperventilationsepisoden werden im Zusammenhang mit dem Pitt-Hopkins-Syndrom

beschrieben. 10/31 (31%) Patienten hatten häufige Infekte der oberen Atemwege.

Alle 34 Patienten dieser Studie haben eine Epilepsie, bei 27/32 (84,4%) handelt es sich

um therapieresistente Anfälle. Fünf Patienten haben eine Epilepsie, welche nach vielen

Therapieversuchen schließlich auf eine Behandlung anspricht. Die Anfälle bestehen bei

ihnen aus myoklonischen Anfällen, die teilweise auch nachts auftreten, tonischen

Anfällen sowie fokalen und komplex fokalen Anfällen mit sekundärer Generalisierung.

Bei zwei dieser Patienten entwickelte sich die Epilepsie im ersten Lebensjahr, bei den

weiteren drei Patienten traten die ersten Anfälle nach dem zweiten Lebensjahr auf. Alle

Pat. Dysmorphiezeichen

2 leichter Hypertelorismus, breite Mundspalte, breite Zahnzwischenräume, lange

dünne Finger mit angedeutetem Tapering.

4 auffällig breiter Mund

6 Mikrozephalie, milde Syndaktylie 2-3 beidseits an den Füßen, auch beim Bruder

und Neffen des Vaters

9 tiefliegende Augen mit dichten geschwungenen Wimpern, kurzes Philtrum, milde

Retrognathie, prominente obere Schneidezähne, Finger spitz zulaufend

13 hohe vorgewölbte Stirn, kleine, tiefliegende Augen.

Die Fußnägel splittern leicht.

14 Prominente Stirn, tief liegende Augen, Telekanthus, hoher, schmaler Gaumen,

weit auseinanderstehende, relativ kleine Zähne, dünne Oberlippe, etwas

abstehende Ohren, insbesondere rechts. Nase relativ kurz, Philtrum lang.

Invertierte Mamillen.

Ergebnisse

39

fünf Patienten werden mit Valproat therapiert, bei zwei Patienten wird zusätzlich

Sultiam bzw. Ethosuximid gegeben.

10/32 Patienten mit einer therapieresistenten Epilepsie haben BNS-Krämpfe in ihrer

Anamnese. Bei ihnen begann die Epilepsie im Alter zwischen zwei Lebensmonaten und

zwei Lebensjahren. Sieben dieser Patienten entwickelten im Verlauf eine komplexe

Epilepsie, die sich aus verschiedenen Anfallsarten zusammensetzt, wie zum Beispiel

die Epilepsie von Patient 13. Er entwickelte im 4.Lebensmonat BNS-Anfälle, die in ein

Lennox-Gastaut-Syndrom übergingen. Zum Zeitpunkt der Anamnese lag eine

multifokale Epilepsie mit komplex-fokalen, einfach-fokalen, generalisierten tonisch-

klonischen Anfällen sowie Nickanfällen vor. Teilweise traten die Anfälle im Schlaf auf,

teilweise waren sie tonisch einhergehend mit Zyanose sowie Hypersalivation. Das EEG

zeigte bei diesem Patienten einen temporalen Fokus auf der linken Seite, einzelne fokal

beginnende Anfälle sowie eine multifokale hypersynchrone Aktivität in Form von „sharp-

waves“, links und rechts „spike-polyspike-waves“ mit wiederholter Generalisierung.

Die Tabelle im Abschnitt 7.7. Therapieresistente Epilepsien - Überblick zeigt eine

Zusammenschau der Merkmale der Epilepsien der Patienten, bei denen eine

therapieresistente Epilepsie besteht.

21/30 (70%) Patienten hatten eine schwere mentale Retardierung, 8/30 (27%) eine

moderate und bei einem Patienten wurde eine milde mentale Retardierung

beschrieben. Von den Patienten mit therapieresistenter Epilepsie haben 19/27 eine

schwere mentale Retardierung. Schwer behandelbare bzw. therapieresistente

Epilepsien können für eine Entwicklungsverzögerung und mentale Retardierung

verantwortlich sein.

Die Patienten mit therapieresistenten Epilepsien wurden alle mit einer unterschiedlich

aufgebauten Kombinationstherapie behandelt. Dabei wurden auch Antiepileptika

zweiter Wahl hinzugezogen, nachdem die Medikamente erster Wahl bei der

betreffenden Epilepsieform nicht anschlugen. Die Medikation der Patienten mit

therapieresistenter Epilepsie sowie der Grad der mentalen Retardierung ist der Tabelle

im Abschnitt 7.7. Therapieresistente Epilepsien - Überblick zu entnehmen.

3.1.2. Befunde im Elektroenzephalogramm

Die EEG-Befunde wurden im Rahmen der regelmäßigen Untersuchungen durch die

betreuenden Ärzte erhoben und schriftlich übermittelt. Sie sind der Tabelle im Abschnitt

7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie zu

entnehmen.

Ergebnisse

40

Die Befunde reichten von unauffälligen Befunden ohne epilepsietypische Aktivität über

leicht abnorme interiktale Grundrhythmen zu schweren Allgemeinveränderungen und

pathologischen Wach-, Dösigkeits- und Schlafableitungen.

Die EEG-Befunde der fünf Patienten, deren Epilepsie nicht therapieresistent ist, sind

bei drei Patienten unauffällig oder zeigen leichte Allgemeinveränderungen. Dazu gehört

ein zu langsamer oder diskontinuierlicher Grundrhythmus. Die anderen zwei Patienten

mit einer auf Valproat ansprechenden Epilepsie haben links fokale, fronto-zentrale

epilepsietypische Muster bei einer komplex-fokalen Epilepsie mit linkshemisphärischen

Dämmerattacken und teilweiser sekundärer Generalisierung sowie pathologische

Wach-, Dösigkeits- und Schlafableitungen mit generalisierten „polyspike-wave“-

Paroxysmen mit klinischen Myoklonien.

Auch die EEG-Befunde der Patienten mit einer therapieresistenten Epilepsie sind

vielfältig.

Die EEG-Befunde stellen eine Bandbreite von Mustern dar. Bislang sind in der Literatur

für die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Krankheitsbilder wenige EEG-Muster

beschrieben. Lediglich für Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen sind

mittlerweile genauere Untersuchungen vorhanden. Melani et al. berichten davon, dass

Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen besonders lang andauernde Anfälle, die

sich als tonisch-klonische Anfälle mit tonisch-klonisch-myoklonischen Manifestationen

darstellen, haben (Melani et al., 2011)

3.1.3. Befunde der Magnetresonanztomographie des Schädels (cMRT)

Bei Untersuchungen im cMRT ergaben sich bei 10/30 (33,3%) Patienten keine

Auffälligkeiten. 20/30 (66,7%) haben hingegen pathologische Befunde. Davon zeigen

11/20 eine Atrophie des Gehirns, die teilweise global oder supratentoriell ist. Drei

Patienten haben komplexe Hirnfehlbildungen. Die cMRT-Befunde sind im Anhang im

Abschnitt 7.8 zusammengefasst.

Eine Atrophie der weißen und grauen Substanz, eine Hypoplasie oder Agenesie des

Corpus callosum oder Myelinisierungsstörungen geben Hinweise auf ein

übergeordnetes Krankheitsbild.

3.1.4. Familienanamnese

Bei vier Patienten wurde von Auffälligkeiten in der Familienanamnese berichtet.

Die Mutter von Patient 9 war an einer juvenilen myoklonischen Epilepsie erkrankt und

zudem besteht eine Epilepsie bei mehreren der Familienmitglieder. Der Patient 9 hatte

eine auf Valproat ansprechende idiopathische, atypische generalisierte Epilepsie mit

myoklonischen Anfällen sowie einzelnen fiebergebundenen komplex fokalen Anfällen.

Ergebnisse

41

Laut Symptomatik der Mutter und des Patienten kann ein Zusammenhang zwischen

ihren Symptomen und den Symptomen des Patienten bestehen. Es werden autosomal

dominante, autosomal rezessive sowie multifaktorielle Vererbungsmuster im

Zusammenhang mit juveniler myoklonischer Epilepsie beschrieben (Gardiner, 2005;

Alfradique und Vasconcelos, 2007). Im Falle des Patienten 9 ist eine genetische

Erkrankung wahrscheinlich. Da jedoch keine weiteren Informationen zu den übrigen

Familienmitgliedern vorliegen, ist es schwierig, eine genaue Aussage über einen

möglichen Erbgang und die genetische Grundlage zu treffen.

Die Mutter von Patientin 14 hatte drei Fehlgeburten. Bei den Feten lagen Fehlbildungen

vor. Die Patientin hat zwei gesunde Geschwister. Im Rahmen der Diskussion wird

genauer auf die Patientin eingegangen.

Der Großvater väterlicherseits der Patientin 18 erkrankte im neunten Lebensjahr an

einer nicht näher beschriebenen Epilepsie. Es ist nicht sehr wahrscheinlich, dass die

Erkrankung des Großvaters dieselbe Ursache hat wie die der Patientin.

Zwei Cousins ersten Grades von Patientin 26 sowie ein Kind in der weiteren

Verwandtschaft hatten eine ähnliche Symptomatik wie die Indexpatientin. Da die

Verwandtschaft in Serbien lebte, konnte leider kein näherer Kontakt aufgenommen

werden. Die Patientin hat komplex fokale und sekundär generalisierte Anfälle, die

medikamentös nicht kontrolliert sind.

3.1.5. Im Vorfeld durchgeführte genetische Untersuchungen

Bei 22/34 (64,7%) Patienten wurde im Vorfeld eine Chromosomenanalyse

durchgeführt, welche bei 9/22 einen unauffälligen männlichen Chromosomensatz 46,XY

und bei 13/22 einen unauffälligen weiblichen Chromosomensatz 46,XX ergab. Damit

wurden größere chromosomale Aberrationen als Ursache für die klinische Symptomatik

im Vorfeld ausgeschlossen.

Ein Angelman-Syndrom wurde bei 8/9 Patienten im Vorfeld ausgeschlossen, bei 25/34

Patienten wurde in dieser Rubrik des Fragebogens keine Angabe gemacht.

Bei 11/14 Patienten wurde das MECP2-Gen auf Veränderungen, die zum Rett-

Syndrom führen, untersucht. Bei 3/14 Patienten wurde die Untersuchung im Hinblick

des Rett-Syndroms nicht durchgeführt und bei 20/34 Patienten liegen keine Angaben

vor.

Außerdem wurde bei 20/34 (59%) Patienten eine Array-CGH-Untersuchung

durchgeführt. Mittels Array-CGH-Analyse lassen sich Chromosomenveränderungen

nachweisen, die so klein sind, dass sie in der konventionellen Chromosomenanalyse

nicht erkannt werden können. Dabei werden Verluste von Chromosomenanteilen

(Deletionen) sowie Hinzugewinne derselben (Duplikationen) genomweit detektiert.

Ergebnisse

42

17/20 Array-CGH-Analysen waren unauffällig, bei drei Analysen wurden auffällige

Befunde erhoben. Bei Patient 5 fand sich in der Chromosomenregen 10q21.1 eine

74,11 kb große Deletion. Die Karyotypformel nach ISCN lautet arr10q21.1.(55,351,192-

55,276,981)x1 (nach NCBI 36/hg18). Die Veränderung liegt ebenfalls bei der

phänotypisch unauffälligen Mutter vor.

Bei Patientin 8 fand sich in der Array-CGH-Analyse eine 133,3 kb große Deletion in der

Chromosomenregion Xq13.3. Die Karyotypformel lautet arrXq13.2(74,016,050-

74,149,351)x1 (nach NCBI 36/hg18). Ob die Eltern untersucht wurden, ist nicht

bekannt.

Bei Patient 12, der an einer fokalen Epilepsie mit sekundärer Generalisierung leidet,

fand sich eine Auffälligkeit, die ebenso bei der klinisch unauffälligen Mutter besteht. Da

keine näheren Informationen zu dem Befund der Array-CGH-Untersuchung vorliegen,

lassen sich lediglich Vermutungen anstellen. Es besteht die Möglichkeit, dass die

Veränderung auf dem X-Chromosom lokalisiert ist. Insbesondere in diesem Fall könnte

die Veränderung für das Krankheitsbild des Sohnes ursächlich sein.

3.2. Molekulargenetische Analysen

3.2.1. Sequenzanalysen

Die Reihenfolge der Sequenzanalysen der Gene CDKL5, TCF4, ARX und SLC9A6

wurde nach der Auswertung der klinischen Daten, cMRT-Untersuchungen, EEG-


Anamnese der Patienten festgelegt.

Zur Orientierung diente die Auswertung des Fragebogens (siehe Abschnitt 3.1.). Eine

zusammenfassende Übersicht über die erhobenen Befunde im Rahmen der

genetischen Untersuchungen bietet die Tabelle Ergebnisse der genetischen

Untersuchungen im Abschnitt 7.9. im Anhang.

3.2.1.1. Sequenzanalysen des CDKL5-Gens

Das CDKL5-Gen wurde zunächst bei Patienten mit sich früh manifestierenden BNS-

Krämpfen, tonischen und tonisch-klonisch generalisierten Anfällen, Mikrozephalie sowie

Bewegungsstörungen untersucht. Als Beispiel dient hier Patientin 11, bei der sich die

Epilepsie im 3. Lebensmonat manifestierte und zunächst aus BNS-Krämpfen bestand.

Später veränderte sich die Epilepsie zu tonischen und myoklonischen Anfällen. EEG-

Befunde zeigten bei der Patientin eine Hypsarrhythmie. Die Patientin hat eine

Mikrozephalie und eine dystone und spastische Bewegungsstörung.

Ergebnisse

43

Im Laufe der genetischen Untersuchungen wurden die 20 kodierenden Exons des

CDKL5-Gens bei allen 34 Patienten mittels PCR amplifiziert und anschließend

sequenziert, sofern Mutationen im CDKL5-Gen nicht im Vorfeld ausgeschlossen

worden waren (Pat.1, 3, 8, 10, 27).

In der vorliegenden Arbeit wird Bezug auf das CDKL5-Transkript ENST00000379989

der Datenbank ensembl.org genommen.

Überprüft wurde die Spezifität der PCR durch Agarose-Gelelektrophorese wie

beispielhaft für die Exons 6-8 des CDKL5-Gens in Abbildung 1 gezeigt.

Abbildung 1 PCR-Produkte von acht Proben auf 2%igem Agarose-Gel

M: Längenstandard (100 bp DNA-Ladder); ▼:Leerkontrolle

Nach der 30minütigen elektrophoretischen Auftrennung der PCR-Produkte bei 120 mA

sind die Fragmente, welche die Exons 6,7 und 8 beinhalten, erkennbar. Ihre Länge

beträgt zwischen 200 und 400bp, wie am Längenstandard M zu erkennen. Die Länge

der Fragmente, in denen die Exons 6,7 und 8 enthalten sind, liegt entsprechend bei

290, 297 und 282 bp wie durch die Primer festgelegt wurde.

Bei den Patienten 18, 20 und 23 zeigte sich im Exon 17 im CDKL5-Gen in der

Sequenzierung die Veränderung c.2372A>C. Bei Probe 18 liegt sie in heterozygoter,

bei den Proben liegt sie 20 und 23 in homozygoter Form vor. Dabei handelt es sich um

den bekannten Einzelnukleotid-Polymorphismus (single nucleotide polymorphism, SNP)

rs35478150. Diese Veränderung ist eine Missense-Veränderung, da der

Basenaustausch zum Codon CCA anstelle von CAA führt. Dadurch wird im Protein die

Aminosäure Glutamin durch Prolin ersetzt. Die Veränderung c.2372A>C hat jedoch laut

SNP-Datenbank keine Auswirkungen auf die Funktion des Proteins und kommt auch

bei gesunden Kontrollen vor.

Abbildung 2 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Chromatogramm.

Ergebnisse

44

Abbildung 2 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 17 des CDKL5-Gens.

Links: Der Sequenzausschnitt der Proben 18, 20 und 23 zeigt den Basenaustausch c.2372A>G

im Exon 17 des CDKL5-Gens.

Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Wildtyp-Sequenz.

Exon 14 des CDKL5-Gens bei dem Patienten 9 (männlich) ließ sich mittels PCR, trotz

unterschiedlicher PCR-Bedingungen nicht amplifizieren.

Bei der Patientin 35 zeigte sich die Veränderung IVS17-1G>A (c.2277-1G>A) im Intron

16 des CDKL5-Gens in heterozygotem Zustand. Abbildung 3 zeigt den entsprechenden

Ausschnitt aus dem Elektropherogramm.

Die Patientin wurde 2009 von Dr. med. Tilman Polster (Neuropädiatrie, Epilepsie-

Zentrum Bethel) klinisch untersucht. Bei der Patientin besteht eine schwere

psychomotorische Retardierung und eine therapieresistente Epilepsie.

Während der Schwangerschaft kam es zu frühzeitiger Wehentätigkeit, die Geburt

erfolgte per Sectio in der 38+5 Schwangerschaftswoche. Das Geburtsgewicht betrug

3940 g (90.-95.Pz.), die Geburtslänge 55 cm (96.Pz) und der Kopfumfang 36 cm

(90.Pz.). Bereits nach der Geburt bestanden Fütterungsprobleme. Zeitgleich mit dem

Beginn der Epilepsie im dritten Lebensmonat fiel eine Entwicklungsverzögerung auf.

Nach dem ersten Anfall traten über eine Zeitspanne von neun Monaten täglich 5-7

Anfälle auf. Die Anfälle bestanden aus unterschiedlichen fokalen Anfällen tonischer und

klonischer sowie generalisiert tonisch-klonischer Symptomatik.

Die Patientin entwickelte eine muskuläre Hypotonie und stereotype Handbewegungen.

Sie ist schwer psychomotorisch retardiert. Die Epilepsie ist unter der Gabe von

Lamotrigin und Oxcarbazepin therapieresistent.

Im Alter von 4 ½ Jahren zeigte das Mädchen keinerlei Sprachentwicklung. Freies

Laufen ist seit dem Alter von 3 8/12 Jahren möglich. Es besteht eine Gangataxie.

Ergebnisse

45

In der Kernspintomographie finden sich links eine frontale kortikale Dysplasie sowie

bilateral eine verzögerte Myelinisierung. Das EEG zeigt eine generalisierte und links

frontale und links zentrale intermittierende Verlangsamung sowie multifokale

epilepsietypische Potentiale in Form von „sharp-waves“ und „poly-spikes“.

Im Vorfeld wurden molekulargenetische Untersuchungen im Hinblick auf ein Angelman-

Syndrom sowie ein Rett-Syndrom durchgeführt, welche sich unauffällig zeigten. Eine

Array-CGH Untersuchung zeigte sich ebenfalls unauffällig. Die Familienanamnese ist

unauffällig.

Abbildung 3 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des CDKL5-Gens

Links: Sequenzausschnitt mit der heterozygoten Austausch17-1G>A bei Probe 35

Mitte: Sequenzausschnitt des Intron 16-Exon 17-Überganges bei der Mutter der Patientin.

Rechts: Sequenzausschnitt des Intron 16-Exon 17-Überganges bei dem Vater der Patientin.

Um die Relevanz der bei der Patientin 35 gefundenen Veränderung zu klären, wurde

bei den Eltern das Exon 17 des CDKL5-Gens einschließlich der Exon-Intron-Übergänge

sequenziert. Bei den Eltern der Patientin zeigte die Sequenzanalyse des Exon 17 des

CDKL5-Gens keine Abweichung von der Wildtypsequenz. Der Austausch 17-1G>A ist

somit bei der Patientin de novo entstanden.

3.2.1.2. Sequenzanalysen des TCF4-Gens

Bei Patienten mit Hyperventilationsepisoden, postnataler Wachstumsretardierung,

kraniofazialen Dysmorphien sowie stereotypen Bewegungen der Hände und

Auffälligkeiten im MRT des Schädels wurde zunächst eine Analyse des TCF4-Gens

durchgeführt.

Der Phänotyp von Patient 4 erinnert an Patienten mit Mutationen im TCF4-Gen. Neben

einer früh beginnenden Epilepsie hat er eine breite Mundspalte und breite

Zahnzwischenräume, führt Waschbewegungen der Hände aus und steckt häufig die

Ergebnisse

46

Hände oder Finger in den Mund. Mehrmals am Tag treten bei ihm

Hyperventilationsepisoden auf.

Die 20 kodierenden Exons des TCF4-Gens wurden bei allen 34 Patienten der Studie

mittels PCR amplifiziert und anschließend sequenziert. In der vorliegenden Arbeit wird

Bezug auf das TCF4-Transkript ENST00000398339 der Datenbank esembl.org

genommen.

Bei 34 der 34 sequenzierten Proben (100%) wurde im Exon 0 des TCF4-Gens der

Einzelnukleotid-Polymorphismus rs611326 mit der Veränderung c.28G>C, gefunden.

Hierbei handelt es sich um eine Normvariante. Alle Patienten waren homozygot für das

Allel c.28G>C Mittlerweile wird jedoch in der Datenbank dbSNP die Base Cytosin

anstelle von Guanin als Referenz angeben. Abbildung 4 zeigt den entsprechenden

Ausschnitt aus dem Elektropherogramm sowie die Angaben der Datenbanken.

Abbildung 4 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 0 des TCF4-Gens

Links: Sequenzausschnitt mit dem SNP c.28G>C in homozygotem Zustand.

Rechts: Der Ausschnitt aus dem Exon 0 des TCF4-Gens zeigt die Sequenz aus der Datenbank

db SNP.

Bei 20 der 34 Patienten (59%) wurde im Exon 19 die Veränderung c.2226A>G, bekannt

als SNP rs8766 gefunden. 6 Patienten (18%) sind homozygot für die Veränderung und

14 Patienten (41%) sind heterozygot für das Allel c.2226A>G.

Bei der Veränderung handelt es sich um eine stille Mutation. Somit führt sie zu keiner

Änderung in der Aminosäuresequenz des Proteins. Die Sequenzausschnitte sind

Abbildung 5 zu entnehmen.

Ergebnisse

47

Abbildung 5 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 19 des TCF4-Gens

Links: Der Sequenzausschnitt der homozygoten SNP-Variante G/G im TCF4-Gen.

Mitte: Der Sequenzausschnitt der heterozygoten SNP-Variante A/G im TCF4-Gen.

Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Variante A/A in homozygotem Zustand.

3.2.1.3. Sequenzanalysen des ARX-Gens

In der vorliegenden Arbeit wurde die DNA aller 13 männlichen Patienten auf Mutationen

und Deletionen im ARX-Gen hin untersucht, da heterozygote Frauen keinen

erkennbaren Phänotyp zeigen. Patienten mit Mutationen und Deletionen im ARX-Gen

zeigen eine große klinische Variabilität. Daher wurden keine besonderen Kriterien für

die Wahrscheinlichkeit für eine ARX-Veränderung ausgearbeitet. Bei den

Untersuchungen mittels PCR und anschließender Sequenzierung zeigte sich keine

Abweichung vom Wildtyp des ARX-Gens.

3.2.1.4. Sequenzanalysen des SLC9A6-Gens

Bislang gibt es nur wenige beschriebene männliche Patienten Veränderungen im

SLC9A6-Gen. Der Phänotyp und seine Variabilität sind bislang noch wenig bekannt.

Den Patienten mit Veränderungen in den anderen untersuchten Genen sind die globale

psychomotorische Entwicklungsretardierung mit Ataxie, eine Mikrozephalie und eine

meist therapieresistente bzw. schwer behandelbare Epilepsie sowie eine fehlende

Sprachentwicklung gemeinsam. Für die Wahrscheinlichkeit für eine SLC9A6-

Veränderung wurden keine besonderen Kriterien ausgearbeitet.

Die 16 kodierenden Exons des SLC9A6-Gens wurden bei 32 Patienten dieser Studie

mittels PCR und Sequenzierung untersucht.

Das Exon 14 ließ sich bei der Patientin 31 mittels PCR nicht amplifizieren.

Im Exon 15 des SLC9A6-Gens des Patienten 23 zeigte sich der bekannte

Einzelnukleotid-Polymorphismus c.1755C>T (rs2307131). Durch den Basenaustausch

entsteht das Codon AGT anstelle von AGC. Es gibt keine Veränderung in der

Ergebnisse

48

Aminosäuresequenz des Proteins, da es sich um eine stille Mutation handelt. In

Abbildung 6 ist der entsprechende Ausschnitt aus dem Chromatogramm dargestellt.

Abbildung 6 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 15 des SLC9A6-Gens

Links: Sequenzausschnitt mit dem homozygoten SNP c.1755C>T bei Patient 23.

Rechts: Der Ausschnitt aus dem Exon 15 des SLC9A6-Gens zeigt die Wildtyp-Sequenz.

Im Exon 1 des SLC9A6-Gens zeigte sich bei der Patientin 14 der Basenaustausch

c.25G>T in heterozygotem Zustand. Die Abbildung 7 zeigt den entsprechenden

Ausschnitt aus dem Chromatogramm.

Abbildung 7 Ausschnitt aus dem Chromatogramm des Exons 1 des SLC9A6-Gens.

Links: Der Sequenzausschnitt der Probe 14 zeigt die Veränderung c.25G>T im Exon 1 des

SLC9A6-Gens.

Mitte: Der Ausschnitt zeigt die Sequenz der Mutter, die ebenfalls die Veränderung c.25G>T im

Exon 1 des SLC9A6-Gens trägt.

Rechts: Der Ausschnitt zeigt die Wildtyp-Sequenz des Vaters im Exon 1 des SLC9A6-Gens.

Der Basenaustausch im Exon 1 führt zu dem Codon TCA anstelle von GCA in der

Wildtypsequenz. Im Protein wird deshalb an der Position 9 die Aminosäure Alanin

durch Serin ersetzt (p.A9S). Um die Relevanz der gefundenen Veränderung beurteilen

zu können, wurde Exon 1 des SLC9A6-Gens bei den Eltern der Patientin sequenziert.

Ergebnisse

49

Bei der Mutter fand sich im Exon 1 des SLC9A6-Gens ebenfalls die Veränderung

c.25G>T(p.A9S). Bei dem Vater zeigte sich im Exon 1 des SLC9A6-Gens keine

Abweichung von der Wildtypsequenz. Außerdem wurden Untersuchungen zur X-

Inaktivierung bei der Patientin und ihrer Mutter durchgeführt. Bei der Patientin zeigte

sich ein Inaktivierungsmuster von 69:31 und bei der Mutter ein X-Inaktivierungsmuster

von 60:40. Sowohl bei der Patientin als auch bei der Mutter zeigte sich keine relevante

Verschiebung des X-Inaktivierungsmusters im Blut.

3.2.2. Ergebnisse der MLPA-Untersuchungen

Im Anschluss an die Sequenzanalysen wurden alle DNA-Proben mit der MLPA-

Methode auf Duplikationen und Deletionen in den Exons der Gene CDKL5, ARX und

TCF4 hin untersucht. Zum Zeitpunkt der Laborarbeit lag kein MLPA-Kit für das

SLC9A6-Gen vor.

Bei den Proben 8, 9 und 33 war die DNA-Qualität für das MLPA-Kit P189-B1 (CDKL5-

und ARX-Gen) nicht ausreichend und es konnte auch nach erneuter Verdünnung der

Stock-DNA kein Ergebnis für diese drei Proben erzielt werden. Bei der Probe 4 lag

dieses Problem ebenfalls bei der Anwendung des MLPA-Kits P075-A1(TCF4-Gen) vor.

Im MLPA-Kit P075-A1 sind neben den Sonden für das TCF4-Gen auch Sonden für das

FOXG1-Gen enthalten. Veränderungen im FOXG1-Gen sind für die kongenitale

Variante des Rett-Syndroms verantwortlich. Bei der Patientin 32 zeigte sich eine

Deletion des FOXG1-Gens. Im Bereich des TCF4-Gens zeigte sich keine Veränderung.

Die Abbildung 8 zeigt den entsprechenden Ausschnitt aus dem Elektropherogramm.

Bei der Mutter und dem Vater zeigten die Untersuchungen ein unauffälliges Ergebnis,

somit liegt bei den Eltern keine Deletion im FOXG1-Gen vor. Damit ist die Deletion bei

der Patientin de novo aufgetreten. Parallel zu den Untersuchungen im Rahmen dieser

Arbeit wurde im Institut für Humangenetik in Kiel bei der Patientin 32 eine Array-CGH-

Analyse durchgeführt, in welcher sich ebenfalls bei der Patientin eine 1,894451 Mb

große Deletion in der Chromosomenregion 14q12 zeigte. Die Deletion enthält das Gen

FOXG1.

Ergebnisse

50

Abbildung 8 Ausschnitt aus dem MLPA-Ergebnisbogen

Oben: Die Sonden für das FOXG1-Gen wurden bei Probe 32 nicht amplifiziert. Die fehlenden

Sonden sind durch die blauen Balken markiert.

Unten links: Bei der Mutter wurden alle Sonden des TCF4-Gens sowie des FOXG1-Gens

amplifiziert.

Unten rechts: Beim Vater der Patientin 32 wurden ebenfalls alle Sonden des TCF4-Gens sowie

des FOXG1-Gens amplifiziert.

Diskussion

51

4. Diskussion

Im Rahmen der Dissertation habe ich mich mit der Frage beschäftigt, wie häufig

Veränderungen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6 für schwer

behandelbare oder therapieresistente frühkindliche Epilepsien und mentale

Retardierung ursächlich sind. Hierzu untersuchte ich die DNA-Proben von 34 nicht

verwandten Patienten mit frühkindlicher Epilepsie und mentaler Retardierung. Bei einer

Patientin wurde eine in der Literatur bislang nicht beschriebene de novo Mutation im

CDKL5-Gen identifiziert. Bei einer weiteren Patientin wurde mittels MLPA eine Deletion

des Gens FOXG1 identifiziert, die ebenfalls in einer diagnostisch durchgeführten Array-

CGH-Untersuchung nachgewiesen wurde.

4.1. Diskussion des Phänotyps

Die 34 Patienten wurden aus Epilepsiezentren und von Pädiatern aus ganz

Deutschland, sowie aus England und Rumänien in diese Studie aufgenommen. Neben

der Einsendung einer Blutprobe oder bereits extrahierter DNA wurde der im Anhang

enthaltene Fragebogen ausgefüllt. Die Patienten wurden von Ärzten und

Humangenetikern untersucht und beurteilt. Sieben Patienten wurden im Institut für

Humangenetik der Universität Lübeck untersucht und in die Studie aufgenommen.

Die Kriterien für die Aufnahme waren eine frühbeginnende schwer behandelbare oder

therapieresistente Epilepsie und mentale Retardierung unterschiedlicher Ausprägung.

Die Art der Epilepsie wurde nicht näher eingegrenzt. Dadurch entstand eine sowohl

phänotypisch als auch ätiologisch heterogene Kohorte. Weitere Einschränkungen

hätten faziale Dysmorphiezeichen, respiratorische Auffälligkeiten oder

Bewegungsstörungen sein können. Es wurden jedoch bewusst keine weiteren

Einschränkungen für die Aufnahme in die Studie gewählt, um herauszufinden, ob es

weitere Symptome oder Zeichen bei Patienten mit den untersuchten Krankheitsbildern

gibt. Außerdem sollte herausgefunden werden, ob es bislang unbekannte Symptome,

die mit dem Phänotyp assoziiert sind, gibt. Die Patienten, bei denen im Rahmen meiner

Dissertation eine Genveränderung diagnostiziert wurde, zeigen einen Phänotyp, der mit

den neuesten Erkenntnissen der Literatur vereinbar ist.

In der Zusammenschau der Befunde des Fragebogens wird ersichtlich, dass der

Phänotyp vorwiegend neurologisch und weniger dysmorphologisch definiert wurde. Der

Stellenwert der dysmorphologischen Zeichen nimmt bei den untersuchten Patienten

eher eine kleine Rolle ein. Manchmal zeigt sich jedoch aufgrund des hohen

Wiedererkennungswertes ein starker Hinweis auf ein Krankheitsbild.

Diskussion

52

4.2. Diskussion der molekulargenetischen Befunde

In dieser Arbeit wurden die kodierenden Anteile der Gene CDKL5, TCF4 und SLC9A6

bei allen Patienten sowie das ARX-Gen bei allen männlichen Patienten im Hinblick auf

Mutationen, Deletionen und Duplikationen hin untersucht. Um größere exonale

Duplikationen und Deletionen auszuschließen, wurden im Anschluss die

Sequenzierung MLPA-Untersuchungen der Gene CDKL5, ARX und TCF4 durchgeführt.

Für das Gen SLC9A6 stand zum Zeitpunkt der Laborarbeit kein kommerziell

erhältliches MLPA-Kit zur Verfügung.

4.2.1. Molekulargenetische Befunde im CDKL5-Gen

Bei der Untersuchung des CDKL5-Gens konnte im Exon 17 bei insgesamt drei von 29

untersuchten Proben der Einzelnukleotid-Austausch c.2372A>C (p.Q791P), in der

Datenbank dbSNP unter der Nummer rs35478150 geführt wird, identifiziert werden. Der

Einzelnukleotid-Polymorphismus wurde von Tao bereits bei gesunden Kontrollpersonen

in der Literatur beschrieben (Tao et al., 2004) und hat mit hoher Wahrscheinlichkeit

keine klinische Relevanz.

In der japanischen Population wird der Polymorphismus mit einer Häufigkeit von 0,012

für die Variante A/C heterozygot angegeben. Eine Untersuchung im Raum Houston,

Texas, ergab eine Häufigkeit von 0,012 für die Variante A/A homozygot (NCBI db SNP,

2009a). Bislang fehlen Angaben zu großen Populationsstudien in der europäischen

Bevölkerung. Der Polymorphismus liegt in der untersuchten Gruppe häufiger vor als er

in den Populationsstudien ermittelt wurde. Daraus lässt sich schließen, dass das

Kollektiv bezüglich des genetischen Hintergrundes verschieden ist. Am ehesten ist dies

mit der geringen Fallzahl sowie der europäischen Population zu begründen.

Bei Patient 9 ließ sich das Exon 14 im CDKL5-Gen mittels PCR nicht amplifizieren. Mit

der MLPA-Untersuchung konnte aufgrund der mangelhaften DNA-Qualität kein

Untersuchungsergebnis und damit eine Kontrolle des Befundes erzielt werden. Leider

war es nicht möglich, eine neue Blutprobe des Patienten zu erhalten.

Es gibt zwei mögliche Ursachen für die nicht mögliche Amplifikation des Exons 14 bei

Patient 9. Die erste Möglichkeit besteht in einer hemizygoten Deletion des Exon 14 im

CDKL5-Gen. Diese Vermutung ließe sich mittels der MLPA-Methode bestätigen. Dann

wären alle Sonden für das Exon 14 des CDKL5-Gens deletiert. Leider stand uns keine

neue Blutprobe zur Verfügung, um diese Hypothese zu bestätigen.

Andererseits könnte eine Sequenzvariation im Bereich der Primerbindungsstelle

vorliegen. Somit könnte der PCR-Primer nicht binden und es entstünde kein PCR-

Produkt. Würde hingegen ein anderer Primer mit einer anderen Bindungsstelle

Diskussion

53

verwendet werden, wäre ermittelbar, ob dann ein PCR-Produkt entsteht. Auch diese

Möglichkeit ließe sich mittels MLPA-Methode bestätigen. Exon 14 würde dargestellt

werden, da die Sonden für das Exon 14 anders als für die Primer für die PCR liegen.

Aus den Vorbefunden des Patienten 9 geht hervor, dass bei ihm zum Zeitpunkt der

Datenerhebung eine seit dem zweiten Lebensjahr bestehende unter Valproat

kontrollierte myoklonische Epilepsie mit einzelnen fiebergebundenen Anfällen und eine

moderate mentale Retardierung besteht. Bei der Mutter besteht eine juvenile

myoklonische Epilepsie und zwei Cousinen mütterlicherseits sowie ein Kind einer der

Cousinen sind ebenfalls an Epilepsie erkrankt.

Typische Merkmale von Patienten mit pathogenen Veränderungen im CDKL5-Gen sind

jedoch die früh, meist vor dem sechstem Lebensmonat beginnende Epilepsie, die sich

zu einer komplexen überwiegend therapieresistenten epileptischen Enzephalopathie

entwickelt, Bewegungsstörungen, eine schwere geistige Behinderung, Hypotonie und

stereotype Handbewegungen (Evans et al., 2005, Pintaudi et al., 2008, Russo et al.,

2009, Tao et al., 2004, Weaving et al., 2004). Der Phänotyp von Patienten 9 ist mit

einer pathogenen Veränderung im CDKL5-Gen wenig vereinbar und eine Veränderung

im CDKL5-Gen als Ursache für das klinische Bild des Patienten ist eher als

unwahrscheinlich anzunehmen.

Bei Patientin 35 zeigte sich in der Sequenzanalyse des CDKL5-Gens der heterozygote

Austausch eines Basenpaares im Intron 16, ein Basenpaar entfernt von Exon 17.

Bislang wurde diese Veränderung nicht in der Literatur beschrieben. Jedoch wurden

bereits sehr ähnliche Sequenzvariationen als sogenannte Splice-Site-Mutationen im

CDKL5-Gen nachgewiesen (Weaving et al., 2004; Evans et al., 2005; Archer et al.,

2006). Die in der Literatur beschriebenen Veränderungen liegen wie die bei Patientin

35 identifizierte Veränderung jeweils ein Basenpaar vor Beginn eines Exons des

CDKL5-Gens. Das Onlineprogramm "Mutation T@ster" klassifiziert diese Veränderung

als mutmaßlich pathologisch aufgrund der Veränderung innerhalb der Splice-Site, die

wahrscheinlich zu einem cdkl5-Protein führt, in welchem das Exon 17 fehlt,

(http://www.mutationtaster.org/).

In der Zusammenschau mit dem klinischen Phänotyp (siehe 3.2.1.1) und den

erhobenen unauffälligen Befunden bei den Eltern der Patientin ist davon auszugehen,

dass es sich bei der Veränderung IVS17-1G>A (c.2277-1G>A) im CDKL5-Gen um eine

pathogene Mutation handelt, welche bei der Patientin 35 de novo entstanden ist und als

Ursache für ihre Symptomatik anzusehen ist.

Wie bei vielen Patienten, von denen in der Literatur berichtet wurde, wurde bei der

Patientin 35 zunächst ein Rett-Syndrom ausgeschlossen und hinsichtlich des

Angelman-Syndroms kein pathologischer Befund erhoben. Die Patientin zeigt mit der

Diskussion

54

frühbeginnenden therapieresistenten Epilepsie, der schweren psychomotorischen

Retardierung, einer muskulären Hypotonie, stereotypen Handbewegungen, keinerlei

Sprachentwicklung und einer Gangataxie die typischen Symptome von Patienten mit

CDKL5-Mutationen (Evans et al., 2005, Pintaudi et al., 2008, Russo et al., 2009, Tao et

al., 2004, Weaving et al., 2004). Castrén et al. zeigten, dass Patienten mit CDKL5-

Mutationen eine in den ersten sechs Lebensmonaten beginnende Epilepsie aufweisen

wie es bei Patientin 35 zutrifft. Dies unterscheidet sie von Patienten mit einem durch

MECP2-Mutationen verursachten Rett-Syndrom (Castrén et al., 2011).

Bei einigen Patienten mit CDKL5-Mutationen wurden wie bei unserer Patientin

Veränderungen im Schädel-MRT beschrieben (Córdova-Fletes et al., 2010, Liang et al.,

2011). Andere Autoren beschreiben, dass Patienten mit CDKL5-Mutationen keine

Veränderungen im MRT des Schädels aufweisen (Archer et al., 2006, Artuso et al.,

2010 Erez et al., 2009). Bei Patientin 35 besteht aufgrund der MRT-Befunde der

Verdacht auf eine fokale kortikale Dysplasie links.

Die Beschreibungen des elektroklinischen Bildes von Patienten mit pathogenen

Veränderungen im CDKL5-Gen sind in der Literatur vielfältig. Sie umfassen infantile

Spasmen (Kalscheuer et al., 2003), eine myoklonische Enzephalopathie (Buoni et al.,

2006) und eine in drei Stadien verlaufende Enzephalopathie (Bahi-Buisson et al.,

2008b). Die Patientin entwickelte im dritten Lebensmonat eine Epilepsie mit

unterschiedlichen fokalen Anfällen tonischer und klonischer sowie generalisiert tonisch-

klonischer Symptomatik. Von einem ähnlichen Bild berichten Melani et al., die

elektroklinische Befunde im ersten Lebensjahr von Patienten mit CDKL5-Mutationen

untersucht haben (Melani et al., 2011). Das Langzeit-EEG der Patientin 35 zeigte im

Alter von 3 ½ Jahren eine generalisierte und links frontal bzw. links zentral

intermittierende Verlangsamung, multifokale epilepsietypische Potentiale in Form von

Sharp-Waves und Polyspikes.

Im Alter von vier Jahren zeigt sich bei ihr ein Bild aus infantilen Spasmen, Absencen,

tonische Anfälle mit Nickbewegungen des Kopfes sowie längere tonische Anfälle. Das

interiktale EEG der Patientin 35 zeigt im Alter von 4 Jahren eher generalisierte

Auffälligkeiten bei häufigen infantilen Spasmen. Ein klares Bild mit drei Phasen in der

Entwicklung der epileptischen Enzephalopathie ist bei der Patientin bislang nicht

beschrieben.

Bahi-Buisson et al. beschrieben zwölf Patienten mit initial normaler Hintergrundaktiviät

und sich im Alter von sechs Monaten bis drei Jahren anschließender Verschlechterung

im EEG (Bahi-Buisson et al., 2008b.)

Liang et al. identifizierten bei 5% der männlichen und 14% der weiblichen Patienten mit

epileptischer Enzephalopathie pathogene Veränderungen im CDKL5-Gen (Liang et al.,

Diskussion

55

2011). Die Patienten dieser Studie wurden wie bei Liang et al. aufgrund ihrer

epileptischen Enzephalopathie bestehend aus therapieresistenter oder schwer

behandelbarer Epilepsie und moderater bis schwerer Entwicklungsverzögerung

untersucht.

4.2.2. Molekulargenetische Befunde im TCF4-Gen

Bislang wurden über 100 pathogene TCF4- Veränderungen in der Literatur mit

beschrieben, es sind jedoch keine genauen Daten zur Prävalenz oder Inzidenz

vorhanden. Rosenfeld et al. untersuchten während einer 17-monatigen Untersuchung

13186 Proben von Patienten mit geistiger Behinderung mittels Array-CGH und konnten

insgesamt sieben Personen identifizieren, die eine Deletion, welche das TCF4-Gen

einschloss, trugen. Davon ausgehend schätzen die Autoren die Häufigkeit des Pitt-

Hopkins-Syndroms für den US-Bundesstaat Washington auf 1:34000-1:41000

(Rosenfeld et al., 2009).

Bei der Untersuchung des TCF4-Gens wurde in dieser Studie bei 20/34 Patienten

(59%) im Exon 19 der Einzelnukleotid-Austausch c.2226A>G (rs8766) nachgewiesen.

18% der Patienten haben die Variante G/G homozygot und 41% haben die Variante

A/G heterozygot.

Angaben zur Häufigkeit in der europäischen Population des SNPs fehlen bislang. In

einer gemischten afroamerikanischen-kaukasischen Population wird der

Polymorphismus mit einer Häufigkeit von 0,133 für die homozygote Variante A/A

angeben, die heterozygote Variante A/G hat eine Häufigkeit von 0,469. Der

Polymorphismus ist damit in der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Gruppe in der

heterozygoten Variante A/G etwas seltener als in der gemischten Population. Allerdings

liegen Daten zu mehreren Populationen vor, in denen die Varianten in unterschiedlicher

Verteilung vorkommen. Die Populationen sind jedoch nicht näher beschrieben (NCBI db

SNP, 2009b). Der Einzelnukleotid-Polymorphismus wurde 2007 von Brockschmidt et al.

bei einer Patientin mit einer 0,5 Mb umfassenden Mikrodeletion auf Chromosom

18q21.2, welche das 5„-Ende des TCF4-Gens umfasste, in heterozygoter Form

nachgewiesen. Bei den gesunden Eltern lag die heterozygote Variante A/G

beziehungsweise die homozygote Variante A/A vor (Brockschmidt et al., 2007). Die

Veränderung hat keine klinische Relevanz, da es sich um eine stille Mutation handelt

und sie in der gesunden Kontrollpopulation vorkommt.

Zwei Patienten (Patient 2 und 4) dieser Gruppe erfüllten die von Zweier et al.

definierten Kriterien für das Pitt-Hopkins-Syndrom-Screening. Wenigstens zwei der drei

folgenden Auffälligkeiten sollten zutreffen: schwere mentale Retardierung,

Auffälligkeiten bei der Atmung sowie die für ein Pitt-Hopkins-Syndrom typischen

Diskussion

56

fazialen Dysmorphiezeichen (Zweier et al., 2007). Bei beiden Patienten wurden die

häufigen Ursachen für das klinische Erscheinungsbild ausgeschlossen, eine pathogene

TCF4-Veränderung tragen beide ebenfalls nicht. Dies stützt die Aussage von

Kalscheuer et al. (Kalscheuer et al., 2008). Die Autoren nehmen an, dass TCF4-

Mutationen in einem weitaus variableren Phänotyp resultieren als bis heute bekannt ist.

Die Variabiliät erkläre sich in der zugrunde liegenden Veränderung des TCF4-Gens und

des resultierenden Proteins. Bei einem zumindest teilweise funktionellen Protein treten

weniger schwere Auswirkungen auf den Phänotyp auf.

Zudem wurden kürzlich homozygote sowie compound-heterozygote Veränderungen in

den Genen CNTNAP2 und NRXN1 als mögliche Ursache für eine dem Pitt-Hopkins-

Syndrom ähnelnde schwere Entwicklungsverzögerung mit früh beginnender Epilepsie

identifiziert (Strauss et al., 2006; Jackman et al., 2009; Zweier et al., 2009), die

autosomal rezessiv vererbt wird.

4.2.3. Molekulargenetische Befunde im SLC9A6-Gen

Mutationen im SLC9A6-Gen wurden bislang nur bei männlichen Patienten beschrieben.

Dabei sind Frauen gesunde Anlageträgerinnen oder sie haben Lernschwierigkeiten und

Verhaltensauffälligkeiten (Christianson et al., 1999; Gilfillan et al., 2008). Angaben über

die Häufigkeit von Patienten mit Mutationen im SLC9A6-Gen bei Patienten mit

Epilepsie gibt es bislang nicht. Fichou identifizierte einen männlichen Patienten mit der

Variante c.25G>T und dem daraus resultierenden Aminosäuretausch Alanin zu Serin

im Protein (Fichou et al., 2009). Bei Alanin an der Position 9 des Proteins handelt es

sich um eine höchst konservierte Aminosäure bei Säugern, was für die wichtige Rolle in

der Proteinfunktion spricht (Fichou et al., 2009).

Die bei der Patientin 14 im Exon 1 des SLC9A6-Gens gefundene maternal vererbte

Missense-Veränderung c.25G>T führt zum Aminosäureaustausch p.A9S im gebildeten

Protein. Das Vorhersageprogramm "Mutation T@ster" nimmt keine Beeinträchtigung

der Proteinfunktion an und die Veränderung wird als Polymorphismus eingestuft.

Um die Relevanz der gefundenen Veränderung bei der Patientin 14 im SLC9A6-Gen

weiter abzuklären, wurde zunächst das Exon 1 bei den Eltern der Patientin sequenziert,

wobei sich bei der gesunden Mutter ebenfalls die Veränderung c.25.G>T(p.A9S) fand.

In seltenen Fällen kann es vorkommen, dass Veränderungen auf dem X-Chromosom,

die üblicherweise nicht zu einer klinischen Symptomatik bei Frauen führen, eine

klinische Bedeutung bekommen. Dies geschieht im Falle eines verschobenen X-

Inaktivierungsmusters. Sowohl bei der Patientin als auch bei der Mutter zeigte sich

keine relevante Verschiebung des X-Inaktivierungsmusters im Blut.

Diskussion

57

Nach der Synopse der erhobenen Befunde im SLC9A6-Gen sowie der Untersuchung

des X-Inaktivierungsmusters ist davon auszugehen, dass es sich bei der Veränderung

c.25G>T im SLC9A6-Gen um einen Polymorphismus handelt, der für die Symptomatik

der Patientin nicht ursächlich ist.

Bei der Patientin 31 ließ sich das Exon 14 im SLC9A6-Gen mittels PCR nicht

amplifizieren. Eine homozygote Deletion des Exons 14 ist als höchst unwahrscheinlich

anzunehmen. Homozygote Deletionen im SLC9A6-Gen wurden in der Literatur bislang

nicht beschrieben. Um der Ursache für diesen Befund auf den Grund zu gehen, könnte

man theoretisch eine quantitative PCR-Untersuchung oder eine hochauflösende Array-

CGH-Untersuchung durchführen. Eine Alternative wäre das Design anderer Primer für

Exon 14 bzw. für den Intron-Exon Übergang, um Veränderungen in der

Primerbindungsstelle auszuschließen. Leider war es im Rahmen der Arbeit nicht

möglich, diesen Fragen nachzugehen.

4.3. Diskussion der Methoden

In dieser Arbeit habe ich mehrere molekulargenetische Untersuchungsmethoden wie

PCR mit anschließender Sequenzierung sowie Sequenzanalyse und MLPA angewandt.

Die DNA-Sequenzierung erfasst Mutationen in den untersuchten Genabschnitten, sie

umfasst jedoch keine quantitative Beurteilung des Genmaterials und damit keine

Duplikationen oder Deletionen in heterozygotem Zustand. Im Anschluss wurden die

MLPA-Untersuchungen durchgeführt, bei der es sich um eine Methode zur relativen,

quantitativen Darstellung von bis zu 50 Nukleinsäurefragmenten in nur einem Ansatz

handelt. Mit ihr werden Duplikationen, Deletionen und heterozygot vorliegende

Punktmutationen erfasst. Bei der PCR mit anschließender Sequenzierung und MLPA

handelt sich generell um gut etablierte und verlässliche Methoden, die lange

Anwendung in der Praxis finden.

Mögliche Mutationen in regulatorischen Elementen der Gene wurden nicht untersucht

und können daher nicht ausgeschlossen werden. Außerdem wurden die 5„-und 3„-

untranslatierten Regionen (UTR) nicht auf Veränderungen gescreent.

Eine alternative Herangehensweise zur Identifikation von Deletionen ganzer Exons

oder Gene wäre die quantitative PCR von jedem Exon oder die Array-CGH-Methode.

Als problematisch gestaltete sich die Anfälligkeit der MLPA-Methode für

Verunreinigungen. Die zu untersuchende DNA wurde teilweise im hiesigen Institut für

Humangenetik aus Vollblut extrahiert, teilweise wurde die bereits extrahierte DNA

eingesendet. In den verschiedenen Einsende-Laboren werden unterschiedliche

Reagenzien zur Extraktion der DNA verwendet. Gerade bei in externen Laboren

Diskussion

58

extrahierter DNA gestaltete sich die Durchführung der MLPA-Methode als schwierig

und führte dazu, dass es teilweise leider nicht möglich war, Befunde zu erheben.

Bei etwa 80-90% der klinisch diagnostizierten, komplexen durch genetische

Veränderungen verursachten Krankheiten wird heute die zugrunde liegende Gen-

Variation nicht gefunden, da im Rahmen der bislang üblichen „Gen-für-Gen“-

Sequenzierung nach Sanger wegen der hohen Kosten und des großen Zeitaufwandes

häufig nur wenige Gene untersucht werden können.

Die Methode der üblichen „Gen-für-Gen“-Sequenzierung nach Sanger stößt an

Kapazitätsgrenzen bei einer Syntheselänge von über 1000-1200 bp nach dem

spezifischen Primer. Im Rahmen des Humanen Genom Projektes wurde die

sogenannte „Shot-Gun“-Sequenzierung entwickelt, mit der es möglich ist, längere

Fragmente zu sequenzieren (Venter et al., 2003). Das Prinzip der „Parallel“-

Sequenzierung, welches bei der „Shot-Gun“-Sequenzierung angewandt wird, gilt auch

bei der Hochdurchsatz-Sequenzierung („Next Generation Sequencing“), die in jüngster

Zeit entwickelt wurde. Sie ermöglicht die gleichzeitige Sequenzierung aller kodierenden

Sequenzen der menschlichen Gene innerhalb von nur sieben Tagen, was auch als

Exom-Sequenzierung bezeichnet wird. (Biskup, 2010).

Zur Diagnostik von Erkrankungen, die Veränderungen in unterschiedlichen Gene

ausweisen, bietet sich die gleichzeitige Sequenzierung mehrerer für diese Krankheit in

Betracht kommender Gene an. Dazu werden im Rahmen der Hochdurchsatz-

Sequenzierung Diagnostik-Panels genutzt, mit denen sämtliche für eine Krankheit in

Frage kommenden Gene zugleich auf einer Sequenzierplattform gezielt sequenziert

und anschließend ausgewertet werden (Zhang et al., 2011). So gibt es inzwischen

bereits ein Diagnostik-Panel zur Identifikation genetischer Ursachen von Epilepsie

(Biskup, 2010) und mentaler Retardierung. Diese Technik stand bei Beginn meiner

Dissertation noch nicht zur Verfügung. Sie bietet sich für die Patienten dieser Studie an,

da es sich um eine unspezifische heterogene Gruppe handelt.

Für die „Whole-Exome“- und „Whole-Genome“-Sequenzierung ist jedoch zu bedenken,

dass durch die noch schnellere Hochdurchsatz-Sequenzierung auch neue, bis jetzt

nicht zu beantwortende Fragen aufkommen können. Dazu gehören die

Sequenzvariationen, die gefunden werden, deren Bedeutungen bislang nicht bekannt

sind sowie belastende Zufallsbefunde mit schwerwiegenden Konsequenzen für

Patienten und ihre Angehörigen. Es besteht ebenso die Möglichkeit, dass trotz der

Hochdurchsatz-Sequenzierung vieler Gene die Ursache für die Erkrankung nicht

gefunden wird.

Mittlerweile etabliert sich das „Next Generation Sequencing“ auch in der Praxis zur

Sequenzierung neuer Gene sowie genomweiter Resequenzierungs- oder

Diskussion

59

Methylierungs-Analysen. Deshalb weckt diese neue Methode Hoffnung auf höhere

Aufklärungsquoten genetisch bedingter Erkrankungen und ist zudem auf eine

effizientere, kostengünstigere und schnellere Art und Weise als bislang möglich. Die

Wahrscheinlichkeit, dass die genetische Ursache von Epilepsien mit Hilfe dieser

Methoden gefunden wird, erhöht sich dadurch deutlich.

4.4. Diskussion der auffälligen Befunde der Array-CGH-Analysen in den

Vorbefunden

Bei drei Patienten lagen auffällige Array-CGH-Analysen aus Untersuchungen in

auswärtigen Laboren vor. Bei Patient 5 und seiner phänotypisch gesunden Mutter ist

ein Abschnitt von etwa 74kb auf dem Chromosom 10 deletiert. In diesem Abschnitt ist

das PCDH15-Gen enthalten. Veränderungen des Gens sind mit der autosomal-

rezessiven Form des Usher-Syndroms Typ I assoziiert. Das Usher-Syndrom geht mit

einer früh einsetzenden Innenohrschwerhörigkeit und einem später einsetzenden

Verlust des Sichtfeldes einher. Damit ist der Befund aus der Array-CGH-Untersuchung

nicht ursächlich für das klinische Erscheinungsbild des Patienten, bei dem eine

myoklonische Epilepsie seit dem zweiten Lebensjahr, eine schwere mentale

Retardierung, häufige Lachanfälle und der Verlust erworbener Fähigkeiten im

Vordergrund stehen.

Bei Patientin 8 wurde mit der Array-CGH-Untersuchung eine etwa 130kb große

Deletion auf dem X-Chromosom nachgewiesen. Ob die Veränderung bei dem Vater

oder der Mutter des Patienten ebenfalls vorliegt, ist nicht bekannt. In dem deletierten

Bereich liegt das Gen KIAA2022. Cantagrel et al. beschreiben zwei miteinander

verwandte männliche Patienten mit einer Inversion auf die X-Chromosom, bei denen

sich einer der beiden Bruchpunkte innerhalb des KIAA2022-Gens befindet. Neben

anderen Auffälligkeiten zeigten die beiden Patienten eine Entwicklungsverzögerung,

infantilen Autismus, eine schwere mentale Retardierung sowie eine fehlende

Sprachentwicklung. Die Konduktorinnen dieser familiären Inversion werden als klinisch

unauffällig beschrieben (Cantagrel et al., 2004). Dass ein Zusammenhang dieser

Deletion und der klinischen Symptomatik der Patientin besteht, ist zum jetzigen

Zeitpunkt als unwahrscheinlich anzunehmen.

4.5. Weitere Differentialdiagnosen

Bei 2 von 34 untersuchten Patientinnen und Patienten mit einer schwer behandelbaren

oder therapieresistenten Epilepsie und mentaler Retardierung konnte die zugrunde

liegende genetische Ursache im Rahmen meiner Arbeit gefunden werden.

Diskussion

60

Viele der Gene, deren Veränderung zu den in dieser Arbeit beschriebenen

Krankheitsbildern führen, sind bislang nicht bekannt. Zudem gibt es viele Gene, die

oder deren Produkte miteinander agieren.

Pathogene Veränderungen bzw. Deletionen des FOXG1-Gens sind für die kongenitale

Variante des Rett-Syndroms verantwortlich (Ariani et al., 2008; Bahi-Buisson et al.,

2010; Le Guen et al., 2011; Kortüm et al., 2011).

Zum klinischen Erscheinungsbild gehören laut Kortüm et al. postnatale

Wachstumsverzögerung mit Mikrozephalie, eine schwere geistige Behinderung mit

verzögerte oder ausbleibender Sprachentwicklung, Defiziten im Sozialverhalten,

Bewegungsstörungen wie Stereotypien und Dyskinesien, Epilepsie, Schlafstörungen,

Episoden mit häufigem Weinen, wiederholte Aspirationen sowie ein gastro-

ösophagealer Reflux. Die Untersuchung des FOXG1-Gens bietet sich bei Patienten mit

mentaler Retardierung, erworbener Mikrozephalie, frontaler Pachygyrie oder

Hypoplasie des Corpus Callosum (Kortüm et al., 2011) sowie nach Ausschluss von

Veränderungen im MECP2-Gen und im CDKL5-Gen an (Philippe et al., 2010). Die

EEG-Ableitungen zeigen ein multifokales Muster mit „spikes“ und „sharp waves“ mit

gelegentlicher paroxysmaler Aktivität (Ariani et al., 2008). Der klinische Phänotyp

überschneidet sich teilweise mit dem des Angelman-Syndroms, des Rett-Syndroms,

des Pitt-Hopkins-Syndroms und den SLC9A6-assoziierten Syndromen. Dennoch

unterscheidet sich die Symptomatik durch Dyskinesien, Auffälligkeiten im MRT und

darin, dass es keine Rückschritte in der Entwicklung sowie keine respiratorischen

Arrhythmien gibt, vom Rett-Syndrom (Kortüm et al., 2011; Le Guen et al., 2011). Die

Tatsache, dass bei einer der Patientinnen während der Untersuchungen für die

vorliegende Arbeit die Deletion des FOXG1-Gens mittels Array-CGH-Analyse

identifiziert wurde und durch MLPA bestätigt wurde, zeigt, dass Veränderungen im

FOXG1-Gen bzw. Deletionen des Gens bei männlichen und weiblichen Patienten mit

den charakteristischen Merkmalen auf jeden Fall differentialdiagnostisch in Betracht

kommen.

Unlängst wurde die Haploinsuffizienz des MEF2C-Gens (Le Meur et al., 2010) durch

Deletion als Ursache für ein ähnliches Krankheitsbild mit schwerer mentaler

Retardierung, Fehlen der expressiven Sprache, muskuläre Hypotonie, stereotypen

Handbewegungen, kraniofazialen Dysmorphiezeichen und einer Epilepsie identifiziert.

MEF2C kodiert für ein Protein, welches in der Neurogenese eine wichtige Rolle der

Regulation der exzitatorischen Synapsen einnimmt (Barbosa et al., 2008). Im Rahmen

einer weiteren Dissertation, die im Institut für Humangenetik Lübeck verfasst wurde,

wurde die DNA der Patienten dieser Studie mittels Sequenzierung und MLPA auf

Diskussion

61

Veränderungen im MEF2C-Gen hin untersucht. In dieser Kohorte fand sich keine

Veränderung im MEF2C-Gen.

Wie bereits in Abschnitt 4.2., der Diskussion der molekulargenetischen Befunde,

erwähnt, wurden homozygote bzw. heterozygote Veränderungen der Gene CNTNAP2

sowie NRXN1 als Ursache für das Pitt-Hopkins-like Syndrom 1 bzw 2 identifiziert

(Gregor et al., 2011). Im Gegensatz zum Pitt-Hopkins-Syndrom liegen keine

charakteristischen fazialen Dysmorphiezeichen vor. Die Patienten sind meist schwer

geistig behindert und haben in der Regel eine eingeschränkte Sprachentwicklung.

Ebenso werden bei zwei Patienten mit heterozygoten Defekten des CNTNAP2-Gens

Verlust der Sprache und der Rückschritte der motorischen Entwicklung mit Beginn der

Epilepsie beschrieben (Gregor et al., 2011). Es besteht eine Diskrepanz zwischen der

schweren Sprachentwicklungsstörung und der relativ milden Verzögerung der

motorischen Entwicklung im Vergleich zu Patienten mit klassischem Pitt-Hopkins-

Syndromen oder auch Patienten mit Veränderungen im CDKL5-Gen. Bei allen

Patienten mit heterozygoten CNTNAP2- Veränderungen besteht eine früh beginnende

Epilepsie (Strauss et al., 2006; Jackman et al., 2009; Zweier et al., 2009). Im Vergleich

zu Patienten mit Veränderungen der im Rahmen dieser untersuchten Arbeit haben die

Patienten keine Mikrozephalie, sondern sind in Relation zum Gesamtkörpermaß eher

makrozephal (Strauss et al., 2006). Dieser Aspekt stellt somit einen wichtigen

differentialdiagnostischen Faktor dar. Ebenso sind Auffälligkeiten in der Atmung, fokale

zerebrale Malformationen sowie Verhaltensauffälligkeiten wie autistische Züge und

stereotype Bewegungen beschrieben.

Eine weitere Differentialdiagnose ist das durch pathogene Veränderungen im ZEB2-

Gen verursachte Mowat-Wilson-Syndrom, welches Gemeinsamkeiten mit dem Pitt-

Hopkins-Syndrom aufweist. Dazu gehören schwere mentale Retardierung und ähnliche

charakteristische Gesichtszüge. Variable Symptome sind Corpus-Callosum-Agenesie,

Epilepsie, angeborene Herzfehler, Mikrozephalie, Kleinwuchs, Hypotonie und Morbus

Hirschsprung (Garavelli und Mainardi, 2007).

Eine wichtige Rolle nimmt außerdem die Array-CGH-Analyse als Screeningmethode

ein. Bei 20/34 der Patienten wurde im Vorfeld bzw. während der Studie eine Array-

CGH-Analyse durchgeführt. Mittels Array-CGH-Analyse werden häufig Veränderungen

gefunden, die bislang nicht als für ein Erkrankungsbild ursächlich beschrieben wurden.

In den deletierten oder duplizierten Regionen sind meist so viele Gene enthalten, dass

ein Zusammenhang der Veränderung mit den Symptomen wahrscheinlich ist. So findet

sich bei Kindern mit mentaler Retardierung und unauffälliger konventioneller

Chromosomenanalyse in etwa 10% eine Mikroaberration, die den Phänotyp erklärt

(Sagoo et al., 2009). Mittels Array-CGH-Untersuchungen wurden Kandidatengene

Diskussion

62

identifiziert, deren Veränderung ein ähnliches Krankheitsbild verursachen wie

Mutationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6.

4.6. Ausblick

Betrachtet man diese Studie rückblickend, so fällt auf, dass die Kohorte mit 34

Patienten zu anderen großen Untersuchungen in diesem Bereich im Vergleich recht

klein ist. Aus Kapazitätsgründen war es jedoch nicht möglich, eine größere Gruppe zu

untersuchen. Es ist denkbar, dass mehr ursächliche Mutationen in einer nach

strengeren Kriterien definierten Kohorte gefunden worden wären. Darauf wurde

bewusst verzichtet, um herauszufinden, ob die in der Literatur beschriebenen

Phänotypen variabler sind als bisher angenommen. Dazu ist eine Kohorte notwendig,

für die die Einschlusskriterien nicht so strikt gehalten sind, bislang nicht bekannte

Merkmale der Krankheitsbilder zu identifizieren.

Epilepsie ist ein häufiges Krankheitsbild in der humangenetischen Sprechstunde und

für mehr als die Hälfte der Epilepsien wurde bereits eine genetische Ursache gefunden

(Pal et al., 2010). Dennoch sollte bedacht werden, dass die genetischen Ursachen für

Epilepsie sehr heterogen und vielfältig sind. Während der experimentellen Phase

meiner Dissertation erhöhte sich die Zahl der Gene, deren Veränderungen eine

Epilepsie verursachen, beträchtlich. Die Einführung des „Next-Generation-Sequencing“

wird in nächster Zeit zu deutlich höheren Aufklärungsquoten beitragen.

Zudem ist davon auszugehen, dass viele weitere Gene in nächster Zeit identifiziert

werden, die im Zusammenhang mit Epilepsie und geistiger Behinderung stehen.

Bei dieser Kohorte würden sich Untersuchungen mit einem sogenannten „Epilepsie-

Panel“ mittels „Next-Generation-Sequencing“ geradezu anbieten, da es sich um eine

unspezifische heterogene Gruppe handelt.

Zusammenfassung

63

5. Zusammenfassung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Häufigkeit von Mutationen, Deletionen und

Duplikationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und SLC9A6 bei Patienten mit

frühbeginnender Epilepsie und mentaler Retardierung zu untersuchen. Zudem sollte

nach Möglichkeit das klinische Erscheinungsbild von Patienten mit Veränderungen in

den untersuchten Genen genauer definiert werden.

Grundlage der Untersuchungen waren DNA-Proben von 34 Patienten mit Epilepsie und

mentaler Retardierung. Die Patienten zeigten neben der frühbeginnenden Epilepsie

und der mentalen Retardierung verschiedene Auffälligkeiten. Viele der Patienten hatten

eine muskuläre Hypotonie, Fütterungsprobleme in der Säuglingszeit und entwickelten

später Bewegungsstörungen wie Ataxie und Dyskinesien und stereotype

Handbewegungen. Die Epilepsie war meist schwer behandelbar bzw. therapieresistent.

Die EEGs waren überwiegend hochgradig pathologisch und wiesen auf ein

übergeordnetes Krankheitsbild hin. Die kranialen MRTs zeigten sich ebenfalls zu einem

Großteil auffällig, wenn auch unspezifischer.

Die klinischen, radiologischen und genetischen Vorbefunde der Patienten wurden im

Rahmen dieser Arbeit ausgewertet und bewertend zusammengefasst. Anschließend

wurden die DNA-Proben der Patienten mittels Sanger-Sequenzierung und MLPA auf

Mutationen, Deletionen und Duplikationen in den Genen CDKL5, ARX, TCF4 und hin

untersucht. Die kodierenden Abschnitte des SLC9A6-Gens wurden bei allen Proben nur

mittels Sanger-Sequenzierung analysiert.

In dieser Studie wurde bei einer Patientin eine pathogene Mutation im CDKL5-Gen

gefunden. Durch die MLPA-Untersuchung wurde bei einer weiteren Patientin eine

Deletion des FOXG1-Gens identifiziert. Beide Phänotypen der Patienten sind mit den in

der Literatur beschriebenen Phänotypen vereinbar.

Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit ist zu betonen, dass bei der

Untersuchung von DNA auf Veränderungen in den oben genannten Genen darauf

geachtet werden sollte, dass häufige Ursachen für eine schwere mentale Retardierung

und eine frühbeginnende Epilepsie im Vorfeld ausgeschlossen werden sollten. Dazu

gehören das Rett-Syndrom sowie das Angelman-Syndrom.

Veränderungen in den analysierten Genen stellen insgesamt eine seltene Ursache für

frühbeginnende Ursache für Epilepsie und mentale Retardierung dar.

Literaturverzeichnis

64

6. Literaturverzeichnis

1. Alfradique I, Vasconcelos M (2007) Juvenile myoclonic epilepsy. Arq Neuropsiquiatr.

65(4-B):1266-1271.

2. American Psychiatric Association (1994) Task force on DSM-IV: diagnostic and

statistical manual of mental disorders: DSM IV. Washington, DC: American psychiatric

association.

3. Amiel J, Rio M, de Pontual L, Redon R, Malan V, Boddaert N, Plouin P, Carter NP,

Lyonnet S, Munnich A, Colleaux L (2007) Mutations in TCF-4, encoding a class I basic

helix-loop-helix transcription factor, are responsible for Pitt-Hopkins syndrome

associated with autonomic dysfunction. Am J Hum Genet. 80:988-993.

4. Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY (1999) Rett

syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding

protein 2. Nat Genet. 23:185-188.

5. Angelman H (1965) 'Puppet children'. A report on three cases. Dev Med Child Neurol.

7: 681-688.

6. Archer HL, Evans J, Edwards S, Colley J, Newbury-Ecob R, O'Callaghan F, Huyton M,

O'Regan M, Tolmie J, Sampson J, Clarke A, Osborne J (2006) CDKL5 mutations

cause infantile spasms, early onset seizures, and severe mental retardation in female

patients. J Med Genet. 43:729-734.

7. Ariani F, Hayek G, Rondinella D, Artuso R, Mencarelli MA, Spanhol-Rosseto A,

Pollazzon M, Buoni S, Spiga O, Ricciardi S, Meloni I, Longo I, Mari F, Broccoli V,

Zappella M, Renieri A (2008) FOXG1 is responsible for the congenital variant of Rett

Syndrome. Am J Hum Genet. 83:89-93.

8. Armani R, Archer H, Clarke A, Vaseduvan P, Zweier C, Ho G, Williamson S,

Cloosterman D, Yang N, Christodoulou J (2012) Transcription Factor 4 and Myocyte

Enhancer Factor 2C mutations are not common causes of Rett Syndrome. Am J Hum

Genet. 158A:713-719.

9. Artuso R, Mencarelli MA, Polli R, Sartori S, Ariani F, Pollazzon M, Marozza A, Cilio

MR, Specchio N, Vigevano F, Vecchi M, Boniver C, Dalla Bernardina B, Parmeggiani

A, Buoni S, Hayek G, Mari F, Renieri A, Murgia A (2010) Early-onset seizure variant of

Rett syndrome: Definition of the clinical diagnostic criteria. Brain Dev. 32:17-24.

10. Asher YJT, Scaglia F (2012) Molecular bases and clinical spectrum of early infantile

epileptic encephalopathies. Eur J Med Genet. 55:299-306.

11. Bahi-Buisson N, Nectoux J, Rosas-Vargas H, Milh M, Boddaert N, Girard B, Cances

C, Ville D, Afenjar A, Rio M, Héron D, N'guyen Morel MA, Arzimanoglou A, Philippe C,

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Amiel%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rio%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22de%20Pontual%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Redon%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Malan%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boddaert%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Plouin%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carter%20NP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lyonnet%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Munnich%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Colleaux%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Amir%20RE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20den%20Veyver%20IB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wan%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tran%20CQ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Francke%20U%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zoghbi%20HY%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Archer%20HL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Evans%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Edwards%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Colley%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Newbury-Ecob%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22O%27Callaghan%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Huyton%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22O%27Regan%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tolmie%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sampson%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Clarke%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Osborne%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ariani%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hayek%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rondinella%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Artuso%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mencarelli%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spanhol-Rosseto%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pollazzon%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Buoni%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spiga%20O%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ricciardi%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Meloni%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Longo%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mari%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Broccoli%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zappella%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Renieri%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Artuso%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mencarelli%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Polli%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sartori%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ariani%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pollazzon%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Marozza%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cilio%20MR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cilio%20MR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Specchio%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vigevano%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vecchi%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boniver%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dalla%20Bernardina%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Parmeggiani%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Parmeggiani%20A%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hayek%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mari%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Renieri%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Murgia%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bahi-Buisson%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nectoux%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rosas-Vargas%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Milh%20M%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Girard%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cances%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cances%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ville%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Afenjar%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rio%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22H%C3%A9ron%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22N%27guyen%20Morel%20MA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arzimanoglou%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Philippe%20C%22%5BAuthor%5D


65

Jonveaux P, Chelly J, Bienvenu T (2008a) Key clinical features to identify girls with

CDKL5 mutations. Brain 131:2647-2661.

12. Bahi-Buisson N, Kaminska A, Boddaert N, Rio M, Afenjar A, Gérard M, Giuliano F,

Motte J, Héron D, Morel MA, Plouin P, Richelme C, des Portes V, Dulac O, Philippe C,

Chiron C, Nabbout R, Bienvenu T. (2008b) The three stages of epilepsy in patients

with CDKL5 mutations. Epilepsia 49(6):1027-1037.

13. Bahi-Buisson N, Nectoux J, Girard B, van Esch H, de Ravel T, Boddaert N, Plouin P,

Rio M, Fichou Y, Chelly J, Bienvenu T (2010) Revisiting the phenotype associated

with FOXG1 mutations: two novel cases of congenital Rett variant. Neurogenetics

11:241-249.

14. Barbosa AC, Kim MS, Ertunc M, Adachi M, Nelson ED, McAnally J, Richardson JA,

Kavalali ET, Monteggia LM, Bassel-Duby R, Olson EN (2008) MEF2C, a transcription

factor that facilitates learning and memory by negative regulation of synapse numbers

and function. Proc Natl Acad Sci USA. 105: 9391-9396.

15. Bienvenu T, Poirier K, Friocourt G, Bahi N, Beaumont D, Fauchereau F, Ben Jeema L,

Zemni R, Vinet MC, Francis F, Couvert P, Gomot M, Moraine C, van Bokhoven H,

Kalscheuer V, Frints S, Gecz J, Ohzaki K, Chaabouni H, Fryns JP, Desportes V,

Beldjord C, Chelly J. (2002) ARX, a novel Prd-class-homeobox gene highly expressed

in the telencephalon, is mutated in X-linked mental retardation. Hum Mol Genet. 11:

981-991.

16. Biskup S (2010) Hochdurchsatz-Sequenzierung in der Humangenetischen Diagnostik.

J Lab Med. 34:305-309.

17. Brockschmidt A, Todt U, Ryu S, Hoischen A, Landwehr C, Birnbaum S, Frenck W,

Radlwimmer B, Lichter P, Engels H, Driever W, Kubisch C, Weber RG (2007) Severe

mental retardation with breathing abnormalities (Pitt-Hopkins syndrome) is caused by

haploinsufficiency of the neuronal bHLH transcription factor TCF4. Hum Mol Genet.

16:1488-1494.

18. Bruni O, Ferri Sleep disturbances in Angelman syndrome: a questionnaire study.R,

D'Agostino G, Miano S, Roccella M, Elia M (2004) Brain Dev. 26:233-240.

19. Buoni S, Zannolli R, Colamaria V, Macucci F, di Bartolo RM, Corbini L, Orsi A,

Zappella M, Hayek J (2006) Myoclonic encephalopathy in the CDKL5 gene mutation.

Clin Neurophysiol.117:223-227.

20. Cantagrel V, Lossi AM, Boulanger S, Depetris D, Mattei MG, Gecz J, Schwartz CE,

Van Maldergem L, Villard L (2004) Disruption of a new X linked gene highly expressed

in brain in a family with two mentally retarded males. J Med Genet. 41:736-742.

21. Carouge D, Host L, Aunis D, Zwiller J, Anglard P (2010) CDKL5 is a brain MeCP2

target gene regulated by DNA methylation. Neurobiol Dis. 38:414-424.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jonveaux%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chelly%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bienvenu%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bahi-Buisson%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kaminska%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Boddaert%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rio%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Afenjar%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=G%C3%A9rard%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Giuliano%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Motte%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=H%C3%A9ron%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Morel%20MA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Plouin%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Richelme%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=des%20Portes%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dulac%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Philippe%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Chiron%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nabbout%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bienvenu%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18266744

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Barbosa%20AC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kim%20MS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ertunc%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Adachi%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nelson%20ED%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McAnally%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Richardson%20JA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kavalali%20ET%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Monteggia%20LM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bassel-Duby%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Olson%20EN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Poirier%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Friocourt%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bahi%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Beaumont%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fauchereau%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ben%20Jeema%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zemni%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vinet%20MC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Francis%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Couvert%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gomot%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moraine%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Bokhoven%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kalscheuer%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Frints%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gecz%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ohzaki%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chaabouni%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fryns%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Desportes%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Beldjord%20C%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brockschmidt%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Todt%20U%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ryu%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hoischen%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Landwehr%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Birnbaum%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Frenck%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Radlwimmer%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lichter%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Engels%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Driever%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kubisch%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Weber%20RG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bruni%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15130689

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ferri%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15130689

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=D%27Agostino%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15130689

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Miano%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15130689

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Roccella%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15130689

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Elia%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=15130689

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15130689


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zannolli%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Colamaria%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Macucci%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22di%20Bartolo%20RM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Corbini%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Orsi%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zappella%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hayek%20J%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cantagrel%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lossi%20AM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boulanger%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Depetris%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mattei%20MG%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schwartz%20CE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20Maldergem%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Villard%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carouge%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Host%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aunis%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zwiller%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Anglard%20P%22%5BAuthor%5D


66

22. Castrén M, Gaily E, Tengström C, Lähdetie J, Archer H, Ala-Mello S (2011) Epilepsy

caused by CDKL5 Mutations. Eur J Paediatr Neurol. 15:65-69.

23. Chelly J, Khelfaoui M, Francis F, Chérif B, Bienvenu T (2006) Genetics and

pathophysiology of mental retardation. Eur J Hum Genet. 14:701-713.

24. Christianson AL, Stevenson RE, van der Meyden CH, Pelser J, Theron FW, van

Rensburg PL, Chandler M, Schwartz CE (1999) X-linked severe mental retardation,

craniofacial dysmorphology, epilepsy, ophthalmoplegia, and cerebellar atrophy in a

large South African kindred is localized to Xq24-q27. J Med Genet. 36:759-766.

25. Clayton-Smith J, Laan L (2003) Angelman syndrome: a review of the clinical and

genetic aspects. J Med Genet. 40: 87–95.

26. Conti V, Marini C, Gana S, Sudi J, Dobyns WB, Guerrini R (2011) Corpus callosum

agenesis, severe mental retardation, epilepsy, and dyskinetic quadriparesis due to a

novel mutation in the homeodomain of ARX. Am J Med Genet. 155A:892-897.

27. Córdova-Fletes C, Rademacher N, Müller I, Mundo-Ayala JN, Morales-Jeanhs EA,

García-Ortiz JE, León-Gil A, Rivera H, Domínguez MG, Kalscheuer VM (2010) CDKL5

truncation due to a t(X;2)(p22.1;p25.3) in a girl with X-linked infantile spasm syndrome.

Clin Genet. 77(1):92-96.

28. Dagli A, Buiting K, Williams CA (2012) Molecular and Clinical Aspects of Angelman

Syndrome. Mol Syndromol. 2:100-112.

29. Elia M, Falco M, Ferri R, Spalletta A, Bottitta M, Calabrese G, Carotenuto M,

Musumeci SA, Lo Giudice M, Fichera M (2008) CDKL5 mutations in boys with severe

encephalopathy and early-onset intractable epilepsy. Neurology. 71(13):997-999.

30. Erez A, Patel AJ, Wang X, Xia Z, Bhatt SS, Craigen W, Cheung SW, Lewis RA, Fang

P, Davenport SL, Stankiewicz P, Lalani SR (2009) Alu-specific microhomology-

mediated deletions in CDKL5 in females with early-onset seizure disorder.

Neurogenetics. 10:363-369.

31. Evans JC, Archer HL, Colley JP, Ravn K, Nielsen JB, Kerr A, Williams E,

Christodoulou J, Gécz J, Jardine PE, Wright MJ, Pilz DT, Lazarou L, Cooper DN,

Sampson JR, Butler R, Whatley SD, Clarke AJ (2005) Early onset seizures and Rett-

like features associated with mutations in CDKL5. Eur J Hum Genet. 13:1113-1120.

32. Fichou Y, Bahi-Buisson N, Nectoux J, Chelly J, Héron D, Cuisset L, Bienvenu T (2009)

Mutation in the SLC9A6 gene is not a frequent cause of sporadic Angelman-like

syndrome. Eur J Hum Genet. 17:1378-1380.

33. Fisher RS, van Emde Boas W, Blume W, Elger C, Genton P, Lee P, Engel J Jr (2005)

Epileptic seizures and epilepsy: Definitions proposed by the International League

against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia.

46:470-472.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Khelfaoui%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Francis%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ch%C3%A9rif%20B%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Christianson%20AL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stevenson%20RE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20der%20Meyden%20CH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pelser%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Theron%20FW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Rensburg%20PL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Rensburg%20PL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chandler%20M%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Conti%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Marini%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gana%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sudi%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dobyns%20WB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guerrini%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=C%C3%B3rdova-Fletes%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rademacher%20N%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=M%C3%BCller%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mundo-Ayala%20JN%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Morales-Jeanhs%20EA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Garc%C3%ADa-Ortiz%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Le%C3%B3n-Gil%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rivera%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dom%C3%ADnguez%20MG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Kalscheuer%20VM%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19807736

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=cdkl5%20truncation%202009

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dagli%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22670133

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Buiting%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22670133

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Williams%20CA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=22670133


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Elia%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Falco%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ferri%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spalletta%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bottitta%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Calabrese%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carotenuto%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Musumeci%20SA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lo%20Giudice%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fichera%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Erez%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Patel%20AJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wang%20X%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Xia%20Z%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bhatt%20SS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Craigen%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cheung%20SW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lewis%20RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fang%20P%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Davenport%20SL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stankiewicz%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lalani%20SR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fichou%20Y%22%5BAuthor%5D




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22H%C3%A9ron%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cuisset%20L%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fisher%20RS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Emde%20Boas%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Blume%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Elger%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Genton%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lee%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Engel%20J%20Jr%22%5BAuthor%5D


67

34. Fiumara A, Pittalà A, Cocuzza M, Sorge G (2010) Epilepsy in patients with Angelman

syndrome. Ital J Pediatr. 36:31.

35. Garavelli L, Mainardi PC (2007) Mowat Wilson Syndrom. Orphanet J Rare Dis. 2:42.

36. Garbern JY, Neumann M, Trojanowski JQ, Lee VM, Feldman G, Norris JW, Friez MJ,

Schwartz CE, Stevenson R, Sima AA (2010) A mutation affecting the sodium/proton

exchanger, SLC9A6, causes mental retardation with tau deposition. Brain. 133:1391-

1402.

37. Gardiner M (2005) Genetics of ididopathic generalized epilepsies. Epilepsia.

46(Suppl.):15-S20.

38. Gécz J, Cloosterman D, Partington M (2006) ARX: a gene for all seasons Curr Opin

Genet Dev. 3:308-316.

39. Gilfillan GD, Selmer KK, Roxrud I, Smith R, Kyllerman M, Eiklid K, Kroken M,

Mattingsdal M, Egeland T, Stenmark H, Sjøholm H, Server A, Samuelsson L,

Christianson A, Tarpey P, Whibley A, Stratton MR, Futreal PA, Teague J, Edkins S,

Gecz J, Turner G, Raymond FL, Schwartz C, Stevenson RE, Undlien DE, Strømme P

(2008) SLC9A6 Mutations Cause X-linked Mental Retardation, Microcephaly,

Epilepsy, and Ataxia, a Phenotype Mimicking Angelman Syndrome. Am. J. Hum.

Genet. 82:1003-1010.

40. Glaze DG, Percy AK, Skinner S, Motil KJ, Neul JL, Barrish JO, Lane JB, Geerts SP,

Annese F, Graham J, McNair L, Lee HS (2010) Epilepsy and the natural history of Rett

syndrome. Neurology. 74:909-12.

41. Gregor A, Albrecht B, Bader I, Bijlsma EK, Ekici AB, Engels H, Hackmann K, Horn D,

Hoyer J, Klapecki J, Kohlhase J, Maystadt I, Nagl S, Prott E, Tinschert S, Ullman R,

Wohlleber E, Woods G, Reis A, Rauch A, Zweier C (2011) Expanding the clinical

spectrum associated with defects in CNTNAP2 and NRXN1. BMC Medical Genetics.

12:106.

42. Hagberg B, Hagberg G (1997) Rett syndrome: epidemiology and geographical

variability. Eur Child Adolesc Psychiatry.6:5-7.

43. Hay Jr. W, Levin M, Sondheimer J, Deterding R (2007) Current Diagnosis & Treatment

in Pediatrics. 18 Ausgabe. Lange Medical Books/Mc Graw-Hill. New York.

44. Jackman C, Horn ND, Molleston JP, Sokol DK (2009) Gene associated with seizures,

autism, and hepatomegaly in an Amish girl. Pediatr Neurol 40:310-313.

45. Kalscheuer VM, Tao J, Donnelly A, Hollway G, Schwinger E, Kübart S, Menzel C,

Hoeltzenbein M, Tommerup N, Eyre H, Harbord M, Haan E, Sutherland GR, Ropers

HH, Gécz J (2003) Disruption of the serine/threonin kinase 9 gene causes severe X-

linked infantile spasms and mental retardation. Am J Hum Genet. 72:1401-1411.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fiumara%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20398390

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pittal%C3%A0%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20398390

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cocuzza%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20398390

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sorge%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20398390


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Garbern%20JY%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Neumann%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Trojanowski%20JQ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lee%20VM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Feldman%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Norris%20JW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Friez%20MJ%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stevenson%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sima%20AA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=G%C3%A9cz%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16650978

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cloosterman%20D%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16650978

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Partington%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=16650978



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gilfillan%20GD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Selmer%20KK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Roxrud%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Smith%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kyllerman%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Eiklid%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kroken%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mattingsdal%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Egeland%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stenmark%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sj%C3%B8holm%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Server%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Samuelsson%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Christianson%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tarpey%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Whibley%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stratton%20MR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Futreal%20PA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Teague%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Edkins%20S%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Turner%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Raymond%20FL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schwartz%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stevenson%20RE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Undlien%20DE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Str%C3%B8mme%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Glaze%20DG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Percy%20AK%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Skinner%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Motil%20KJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Neul%20JL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Barrish%20JO%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lane%20JB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Geerts%20SP%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Annese%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Graham%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=McNair%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Lee%20HS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20231667

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Glaze%20Epilepsy%20and%20the%20natural%20history%20of%20Rett%20syndrome

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kalscheuer%20VM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tao%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Donnelly%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hollway%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schwinger%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22K%C3%BCbart%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Menzel%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hoeltzenbein%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tommerup%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Eyre%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Harbord%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Haan%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sutherland%20GR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ropers%20HH%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22G%C3%A9cz%20J%22%5BAuthor%5D


68

46. Kalscheuer VM, Feenstra I, Van Ravenswaaij-Arts CM, Smeets DF, Menzel C,

Ullmann R, Musante L, Ropers HH (2008) Disruption of the TCF4 gene in a girl with

mental retardation but without the classical Pitt-Hopkins syndrome. Am J Hum Genet.

146A:2053-2059.

47. Kerr A, Stephonson J (1986) A study of the natural history of Rett syndrome in 23

girls. Am J Med Genet. 1:77-83.

48. Kishino T, Lalande M, Wagstaff J (1997) UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman

syndrome. Nat Genet. 15:70-73.

49. Kitamura K, Yanazawa M, Sugiyama N, Miura H, Iizuka-Kogo A, Kusaka M, Omichi K,

Suzuki R, Kato-Fukui Y, Kamiirisa K, Matsuo M, Kamijo S, Kasahara M, Yoshioka H,

Ogata T, Fukuda T, Kondo I, Kato M, Dobyns WB, Yokoyama M, Morohashi K (2002)

Mutation of ARX causes abnormal development of forebrain and testes in mice and X-

linked lissencephaly with abnormal genitalia in humans. Nat Genet. 32:359-369.

50. Kortüm F, Das S, Flindt M, Morris-Rosendahl DJ, Stefanova I, Goldstein A, Horn D,

Klopocki E, Kluger G, Martin P, Rauch A, Roumer A, Saitta S, Walsh LE, Wieczorek

D, Uyanik G, Kutsche K, Dobyns WB (2011) The core FOXG1 syndrome phenotype

consists of postnatal microcephaly, severe mental retardation, absent language,

dyskinesia, and corpus callosum hypogenesis. J Med Genet. 48:396-406.

51. Kozinetz CA, Skender ML, MacNaughton N, Almes MJ, Schultz RJ, Percy AK, Glaze

DG (1993) Epidemiology of Rett Syndrome: a population-based registry. Pediatrics.

91:445-450.

52. Le Guen T, Bahi-Buisson N, Nectoux J, Boddaert N, Fichou Y, Diebold B, Desguerre I,

Raqbi F, Daire VC, Chelly J, Bienvenu T (2011) A FOXG1 mutation in a boy with

congenital variant of Rett syndrome. Neurogenetics. 12:1-8.

53. Le Meur N, Holder-Espinasse M, Jaillard S, Goldenberg A, Joriot S, Amati-Bonneau P,

Guichet A, Barth M, Charollais A, Journel H, Auvin S, Boucher C, Kerckaert JP, David

V, Manouvrier-Hanu S, Saugier-Veber P, Frébourg T, Dubourg C, Andrieux J,

Bonneau D (2010) MEF2C haploinsufficiency caused by either microdeletion of the

5q14.3 region or mutation is responsible for severe mental retardation with stereotypic

movements, epilepsy and/or cerebral malformations. J Med Genet. 47:22-29.

54. Liang JS, Shimojima K, Takayama R, Natsume J, Shichiji M, Hirasawa K, Imai K,

Okanishi T, Mizuno S, Okumura A, Sugawara M, Ito T, Ikeda H, Takahashi Y, Oguni

H, Imai K, Osawa M, Yamamoto T (2011) CDKL5 alterations lead to early epileptic

encephalopathy in both genders. Epilepsia. 52:1835-1842.

55. Lindsay K, Bone I, Fuller G (2010) Epilepsy. In Neurology and Neurosurgery

Illustrated. 5. Auflage. Churchill Livingstone. Philadelphia. S. 92-105.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Feenstra%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20Ravenswaaij-Arts%20CM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Smeets%20DF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Menzel%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ullmann%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Musante%20L%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kishino%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lalande%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wagstaff%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kitamura%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yanazawa%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sugiyama%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miura%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Iizuka-Kogo%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kusaka%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Omichi%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Suzuki%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kato-Fukui%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kamiirisa%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Matsuo%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kamijo%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kasahara%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yoshioka%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ogata%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fukuda%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kondo%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kato%20M%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yokoyama%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Morohashi%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kort%C3%BCm%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Das%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Flindt%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Morris-Rosendahl%20DJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stefanova%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goldstein%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Horn%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Klopocki%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kluger%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Martin%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rauch%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Roumer%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Saitta%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Walsh%20LE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wieczorek%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wieczorek%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Uyanik%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kutsche%20K%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kozinetz%20CA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Skender%20ML%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22MacNaughton%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Almes%20MJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schultz%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Percy%20AK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Glaze%20DG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Glaze%20DG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Le%20Guen%20T%22%5BAuthor%5D




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fichou%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Diebold%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Desguerre%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Raqbi%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Daire%20VC%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Le%20Meur%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Holder-Espinasse%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jaillard%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goldenberg%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Joriot%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Amati-Bonneau%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guichet%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Barth%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Charollais%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Journel%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Auvin%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boucher%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kerckaert%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22David%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22David%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Manouvrier-Hanu%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Saugier-Veber%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fr%C3%A9bourg%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dubourg%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Andrieux%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bonneau%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liang%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shimojima%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Takayama%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Natsume%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shichiji%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hirasawa%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Imai%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Okanishi%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mizuno%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Okumura%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sugawara%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ito%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ikeda%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Takahashi%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oguni%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oguni%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Imai%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Osawa%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yamamoto%20T%22%5BAuthor%5D


69

56. Marsh E, Fulp C, Gomez E, Nasrallah I, Minarcik J, Sudi J, Christian SL, Mancini G,

Labosky P, Dobyns W, Brooks-Kayal A, Golden JA (2009) Targeted loss of Arx results

in a developmental epilepsy mouse model and recapitulates the human phenotype in

heterozygous females. Brain.132:1563-1576.

57. Matsuura T, Sutcliffe JS, Fang P, Galjaard RJ, Jiang YH, Benton CS, Rommens JM,

Beaudet AL (1997) De novo truncating mutations in E6-AP ubiquitin-protein ligase

gene (UBE3A) in Angelman syndrome. Nat Genet. 15:74-77.

58. Mei D, Marini C, Novara F, Bernardina BD, Granata T, Fontana E, Parrini E, Ferrari

AR, Murgia A, Zuffardi O, Guerrini R (2010) Xp22.3 genomic deletions involving the

CDKL5 gene in girls with early onset epileptic encephalopathy. Epilepsia. 51:647-54.

59. Melani F, Mei D, Pisano T, Savasta S, Franzoni E, Ferrari AR, Marini C, Guerrini R

(2011) CDKL5 gene-related epileptic encephalopathy: electroclinical findings in the

first year of life. Dev Med Child Neurol. 53:354-360.

60. Moretti P, Zoghbi HY (2006) MeCP2 dysfunction in Rett Syndrome and related

disorders. Curr Opin Genet Dev. 16:276-281.

61. MRC-Holland (2011) MRC Holland. Abgerufen am 18. Juni 2011 von http://www.mrc-

holland.com

62. Mülhardt, C (2006) Die Standard-PCR. In: Der Experimentator Molekularbiologie/

Genomics. 5.Auflage. Elsevier Spektrum Akademischer Verlag. München. S.80-91.

63. Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H (1986) Specific enzymatic

amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp

Quant Biol. 51:263-273.

64. ncbi db SNP (2009a) Entrez db SNP. Abgerufen am 20. Juni 2011 von

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/snp_ref.cgi?rs=35478150

65. ncbi db SNP (2009b) Entrez db SNP. Abgerufen am 20. März 2012 von


66. Noh GJ, Asher YJT, Graham Jr JM (2012) Clinical review of genetic epileptic

encephalopathies. Eur J Med Genet. 55:281-298.

67. Numata M, Petrecca K, Lake N, Orlowski J (1998) Identification of a mitochondrial

Na+/H+ exchanger. J Biol Chem. 273:6951-6959.

68. Pal DK, Pong AW, Chung WK (2010) Genetic evaluation and counseling for epilepsy.

Nat Rev Neurol. 6:445-453.

69. Partington MW, Mulley JC, Sutherland GR, Hockey A, Thode A, Turner G (1988) X-

linked mental retardation with dystonic movements of the hands. Am J Med Genet.

30:251-262.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Marsh%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fulp%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gomez%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nasrallah%20I%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Minarcik%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sudi%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Christian%20SL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Mancini%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Labosky%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dobyns%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Brooks-Kayal%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Golden%20JA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19439424

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Marsh%202009%20ARX

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Matsuura%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sutcliffe%20JS%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Galjaard%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jiang%20YH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Benton%20CS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rommens%20JM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Beaudet%20AL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Marini%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Novara%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bernardina%20BD%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Granata%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fontana%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Parrini%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ferrari%20AR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ferrari%20AR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Murgia%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zuffardi%20O%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Guerrini%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19780792


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Melani%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mei%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pisano%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Savasta%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Franzoni%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ferrari%20AR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Marini%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guerrini%20R%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moretti%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zoghbi%20HY%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mullis%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Faloona%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Scharf%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Saiki%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Horn%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Erlich%20H%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Numata%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Petrecca%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lake%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Orlowski%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Partington%20MW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mulley%20JC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sutherland%20GR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hockey%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thode%20A%22%5BAuthor%5D



70

70. Peippo MM, Simola KO, Valanne LK, Larsen AT, Kähkönen M, Auranen MP, Ignatius

J (2006) Pitt-Hopkins syndrome in two patients and further definition of the phenotype.

Clin Dysmorphol. 15:47-54.

71. Philippe C, Amsallem D, Francannet C, Lambert L, Saunier A, Verneau F, Jonveaux P

(2010) Phenotypic variability in Rett syndrome associated with FOXG1 mutations. J

Med Genet. 47:59-65.

72. Pintaudi M, Baglietto MG, Gaggero R, Parodi E, Pessagno A, Marchi M, Russo S,

Veneselli E (2008) Clinical and electroencephalographic features in patients with

CDKL5 mutations: two new Italian cases and review of the literature. Epilepsy Behav.

12:326-31.

73. Pitt D, Hopkins I (1978) A syndrome of mental retardation, wide mouth and intermittent

overbreathing. Aust Paediatr J. 14:182-184.

74. Proud VK, Levine C, Carpenter NJ (1992) New X-linked syndrome with seizures,

acquired micrencephaly, and agenesis of the corpus callosum. Am J Med Genet.

43:458-466.

75. Rett A (1966) Über ein eigenartiges hirnatrophisches Syndrom bei Hyperammoniamie

in Kindesalter. Med Wschr. 116:723-738.

76. Rademacher N, Hambrock M, Fischer U, Moser B, Ceulemans B, Lieb W, Boor R,

Stefanova I, Gillessen-Kaesbach G, Runge C, Korenke GC, Spranger S, Laccone F,

Tzschach A, Kalscheuer VM (2011) Identification of a novel CDKL5 exon and

pathogeneic mutations in patients with severe mentale retardation, early-onset

seizures and Rett-like features. Neurogenetics. 12:165-167.

77. Ravn K, Roende G, Duno M, Fuglsang K, Eiklid KL, Tümer Z, Nielsen JB, Skjeldal OH

(2011) Two new Rett syndrome families and review of the literature: expanding the

knowledge of MECP2 frameshift mutations. Orphanet J Rare Dis. 6:58.

78. Ropers HH (2006) X-linked mental retardation: many genes for a complex disorder.

Curr Opin Genet Dev. 16:260-269.

79. Rosenfeld JA, Leppig K, Ballif BC, Thiese H, Erdie-Lalena C, Bawle E, Sastry S,

Spence JE, Bandholz A, Surti U, Zonana J, Keller K, Meschino W, Bejjani BA, Torchia

BS, Shaffer LG (2009) Genotype-phenotype analysis of TCF4 mutations causing Pitt-

Hopkins syndrome shows increased seizure activity with missense mutations. Genet

Med. 11:797-805.

80. Russo S, Marchi M, Cogliati F, Bonati MT, Pintaudi M, Veneselli E, Saletti V, Balestrini

M, Ben-Zeev B, Larizza L (2009) Novel mutations in the CDKL5 gene, predicted

effects and associated phenotypes. Neurogenetics. 10:241-250.

81. Sagoo GS, Butterworth AS, Sanderson S, Shaw-Smith C, Higgins JP, Burton H (2009)

Array CGH in patients with learning disability (mental retardation) and congenital

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Peippo%20MM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Simola%20KO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Valanne%20LK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Larsen%20AT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22K%C3%A4hk%C3%B6nen%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Auranen%20MP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ignatius%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ignatius%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Philippe%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Amsallem%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Francannet%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lambert%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Saunier%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Verneau%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jonveaux%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Baglietto%20MG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18063413

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gaggero%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18063413

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Parodi%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18063413

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pessagno%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18063413

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Marchi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18063413

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Russo%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18063413

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Veneselli%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=18063413



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Proud%20VK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Levine%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Carpenter%20NJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rademacher%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hambrock%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fischer%20U%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moser%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ceulemans%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lieb%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boor%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stefanova%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gillessen-Kaesbach%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Runge%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Korenke%20GC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spranger%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Laccone%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tzschach%20A%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Roende%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21878110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Duno%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21878110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fuglsang%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21878110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Eiklid%20KL%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21878110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=T%C3%BCmer%20Z%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21878110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Nielsen%20JB%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21878110

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Skjeldal%20OH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21878110




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rosenfeld%20JA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Leppig%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ballif%20BC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Thiese%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Erdie-Lalena%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bawle%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sastry%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Spence%20JE%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bandholz%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Surti%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zonana%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Keller%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Meschino%20W%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bejjani%20BA%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Torchia%20BS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Torchia%20BS%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shaffer%20LG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19938247

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rosenfeld%20pitt%20hopkins%20syndrome

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Rosenfeld%20pitt%20hopkins%20syndrome

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Russo%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Marchi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Cogliati%20F%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bonati%20MT%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pintaudi%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Veneselli%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Saletti%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Balestrini%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Balestrini%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ben-Zeev%20B%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Larizza%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19241098

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sagoo%20GS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Butterworth%20AS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sanderson%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shaw-Smith%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Higgins%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Burton%20H%22%5BAuthor%5D


71

anomalies: updated systematic review and meta-analysis of 19 studies and 13,926

subjects. Genet Med. 11:139-146.

82. Salvador-Carulla L, Reed GM, Vaez-Azizi LM, Cooper SA, Martinez-Leal R, Bertelli M,

Adnams C, Cooray S, Deb S, Akoury-Dirani L, Girimaji SC, Katz G, Kwok H,

Luckasson R, Simeonsson R, Walsh C, Munir K, Saxena S (2011) Intellectual

developmental disorders towards a new name, definition and framework for "mental

retardation/intellectual disability" in ICD-11. World Psychiatry. 10:175-180.

83. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-terminating

inhibitors. Proc Nat Acad Sci. 74:5463-5467.

84. Sartori S, Di Rosa G, Polli R, Bettella E, Tricomi G, Tortorella G, Murgia A. (2009) A

novel CDKL5 mutation in a 47, XXY boy with the early-onset seizure variant of Rett

syndrome. Am J Med Genet. 149A:232-236.

85. Schalock R, Borthwick-Duffy SA, Bradley VJ, Buntinx WHE, Coulter D., Craig EM,

Gomez SC, Lachapelle Y, Luckasson R, Reeve A, Shogren KA, Snell ME, Spreat S,

Tassé MJ, Verdugo-Alonso MA, Wehmeyer M, Yeager MH (2010) Intellectual

Disability: Definition, Classification, and Systems of Supports. 11 Ausgabe. American

Association on Intellectual and Developmental Disabilities. Washington.

86. Scheffer IE, Wallace RH, Phillips FL, Hewson P, Reardon K, Parasivam G, Stromme

P, Berkovic SF, Gecz J, Mulley JC (2002) X-linked myoclonic epilepsy with spasticity

and intellectual disability: mutation in the homeobox gene ARX. Neurology. 59:348-

356.

87. Scheinert P (1997) Primerdesign und Wahl stringenter Reaktionsbedingungen. Bio

Techniques. 4:52-54.

88. Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, Zwijnenburg D, Diepvens F, Pals G (2002)

Relative quantification of 40 nucleic acid sequences by multiplex ligation-dependent

probe amplification. Nucleic Acids Res. 30:e57.

89. Schroer RJ, Holden KR, Tarpey PS, Matheus MG, Griesemer DA, Friez MJ, Fan JZ,

Simensen RJ, Strømme P, Stevenson RE, Stratton MR, Schwartz CE (2010) Natural

History of Christianson syndrome. Am J Med Genet. 152A:2775-2783.

90. Sherr EH (2003) The ARX story (epilepsy, mental retardation, autism, and cerebral

malformations): one gene leads to many phenotypes. Curr Opin Pediatr. 15:567-571.

91. Shoubridge C, Fullston T, Gécz J (2010) ARX spectrum disorders: making inroads into

the molecular pathology.Hum Mutat. 31:889-900.

92. Slater HR, Bruno DL, Ren H, Pertile M, Schouten JP, Choo KH (2003) Rapid, high-

throughput prenatal detection of aneupoidy using a novel quantitative method (MLPA).

J Med Genet. 40:907-916.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Salvador-Carulla%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reed%20GM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vaez-Azizi%20LM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cooper%20SA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Martinez-Leal%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bertelli%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Adnams%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cooray%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Deb%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Akoury-Dirani%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Girimaji%20SC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Katz%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kwok%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Luckasson%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Simeonsson%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Walsh%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Munir%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Saxena%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sanger%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nicklen%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Coulson%20AR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sartori%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Di%20Rosa%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Polli%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bettella%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tricomi%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tortorella%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Murgia%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Scheffer%20IE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wallace%20RH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Phillips%20FL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hewson%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reardon%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Parasivam%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stromme%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stromme%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Berkovic%20SF%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mulley%20JC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schouten%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McElgunn%20CJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Waaijer%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zwijnenburg%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Diepvens%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pals%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sherr%20EH%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=14631200

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Shoubridge%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20506206

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Fullston%20T%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20506206

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=G%C3%A9cz%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20506206


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Slater%20HR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bruno%20DL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ren%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pertile%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schouten%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Choo%20KH%22%5BAuthor%5D


72

93. Strauss KA, Puffenberger EG, Huentelmann MJ, Gottlieb S, Dobrin SE, Parod JM,

Stephan DA, Morton DH (2006) Recessive symptomatic focal epilepsy and mutant

contactin-associated protein-like 2. N Engl J Med 354:1370-1377.

94. Strømme P, Mangelsdorf ME, Scheffer IE, Gécz J (2002) Infantile spasms, dystonia,

and other X-linked phenotype caused by mutations in Aristaless related homeobox

gene, ARX. Brain Dev. 24:266-268.

95. Strømme P, Dobrenis K, Sillitoe RV, Gulinello M, Ali NF, Davidson C, Micsenyi MC,

Stephney G, Ellevog L, Klungland A, Walkley SU (2011) X-linked Angelman-like

syndrome caused by Slc9a6 knockout in mice exhibits evidence of endosomal-

lysosomal dysfunction. Brain.134:3369-3383.

96. Suri M (2005) The phenotypic spectrum of ARX mutations. Dev Med & Child Neur.

47:133-137.

97. Tao J, Van Esch H, Hagedorn-Greiwe M, Hoffmann K, Moser B, Raynaud M, Sperner

J, Fryns JP, Schwinger E, Gécz J, Ropers cHH, Kalscheuer VM. (2004). Mutations in

the X-linked Cyclin-Dependent Kinase-Like 5 (CDKL5/STK9) Gene Are Associated

with Severe Neurodevelopmental Reatardation. Am J Hum Genet.75:1149-1154.

98. Takano K, Lyons M, Moyes C, Jones J, Schwartz CE. (2010). Two percent of patients

suspected of having Angelman syndrome have TCF4 mutations. Clin Genet. 78:282-

288.

99. Todt H (2004). Epilepsie. In C. Speer, & M. Gahr, Pädiatrie. 2.Auflage. Springer

Medizin Verlag. Heidelberg. S. 281-292.

100. Turner G, Partington M, Kerr B, Mangelsdorf M, Gecz J (2002) Variable expression

of mental retardation, autism, seizures, and dystonic hand movements in two families

with an identical ARX gene mutation. Am J Med Genet. 112:405-411.

101. Van Esch H, Jansen A, Bauters M, Froyen G, Fryns JP (2007) Encephalopathy

and bilateral cataract in a boy with an interstitial deletion of Xp22 comprising the

CDKL5 and NHS genes. Am J Med Genet. 143A:364-369.

102. Venter JC, Levy S, Stockwell T, Remington K, Halpern A (2003) Massive

parallelism, randomness and genomic advances. Nat Genet. 33:219-227.

103. Weaving LS, Christodoulou J, Williamson SL, Friend KL, McKenzie OL, Archer H,

Evans J, Clarke A, Pelka GJ, Tam PP, Watson C, Lahooti H, Ellaway CJ, Bennetts B,

Leonard H, Gécz J (2004) Mutations of CDKL5 cause a severe neurodevelopmental

disorder with infantile spasms and mental retardation. Am J Hum Genet. 75:1079-

1093.

104. Whalen S, Héron D, Gaillon T, Moldovan O, Rossi M,Devillard F, Giuliano F,

Soares G, Mathieu-Dramard M, Afenjar A, Charles P, Mignot C, Burglen L, Van

Maldergem L, Piard J, Aftimos S, Mancini G, Dias P, Philip N, Goldenberg A, Le

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Str%C3%B8mme%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mangelsdorf%20ME%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Scheffer%20IE%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Str%C3%B8mme%20P%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Dobrenis%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Sillitoe%20RV%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Gulinello%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ali%20NF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Davidson%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Micsenyi%20MC%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Stephney%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Ellevog%20L%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Klungland%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Walkley%20SU%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=21964919


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tao%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20Esch%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hagedorn-Greiwe%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hoffmann%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moser%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Raynaud%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sperner%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sperner%20J%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schwinger%20E%22%5BAuthor%5D





http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Partington%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kerr%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mangelsdorf%20M%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Van%20Esch%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jansen%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bauters%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Froyen%20G%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Venter%20JC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Levy%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Stockwell%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Remington%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Halpern%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Weaving%20LS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Christodoulou%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Williamson%20SL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Friend%20KL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McKenzie%20OL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Archer%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Evans%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Clarke%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pelka%20GJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tam%20PP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Watson%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lahooti%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ellaway%20CJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bennetts%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Leonard%20H%22%5BAuthor%5D



73

Merrer M, Rio M, Josifova D, Van Hagen JM, Lacombe D, Edery P, Dupuis-Girod S,

Putoux A, Sanlaville D, Fischer R, Drévillon L, Briand-Suleau A, Metay C, Goossens

M, Amiel J,Jacquette A, Giurgea I (2012) Novel Comprehensive Diagnostic Strategy in

Pitt-Hopkins Syndrome: Clinical Score and Further Delineation of the TCF4 Mutational

Spectrum. Hum Mutat. 33:64-72.

105. Williams C (2005) Neurological Aspects of the Angelman syndrome. Brain Dev.

27:88-94.

106. Zabranski S (2007) Krankheiten der innersekretorischen Drüsen und

Wachstumsstörungen. In F. Sitzmann. Pädiatrie 3. Ausgabe. Georg Thieme Verlag.

Stuttgart. S.198-229.

107. Zhang J, Chiodini R, Badr A, Zhang G (2011) The impact of next-generation

sequencing on genomics. J Genet Genomics. 38:95-109.

108. Zhu X, Li M, Pan H, Bao X, Zhang J, Wu X (2010) Analysis of the parental origin of

de novo MECP2 mutations and X chromosome inactivation in 24 sporadic patients

with Rett syndrome in China. J Child Neurol. 25:842-848.

109. Zupanc ML (2009) Clinical Evaluation and Diagnosis of Severe Epilepsy

Syndromes of Early Childhood. J Child Neurol. 24(8S):6S-14S.

110. Zweier C, Peippo MM, Hoyer J, Sousa S, Bottani A, Clayton-Smith J, Reardon W,

Saraiva J, Cabral A, Gohring I, Devriendt K, de Ravel T, Bijlsma EK, Hennekam RC,

Orrico A, Cohen M, Dreweke A, Reis A, Nurnberg P, Rauch A (2007)

Haploinsufficiency of TCF4 causes syndromal mental retadation with intermittent

hyperventilation (Pitt-Hopkins Syndrome). Am J Hum Genet. 80:994-1001.

111. Zweier C, Sticht H, Bijlsma EK, Clayton-Smith J, Boonen SE, Fryer A, Greally MT,

Hoffmann L, den Hollander NS, Jongmans M, Kant SG, King MD, Lynch SA, McKee

S, Midro AT, Park SM, Ricotti V, Tarantino E, Wessels M, Peippo M, Rauch A (2009)

Further delineation of Pitt-Hopkins syndrome: phenotypic and genotypic description of

16 novel patients. J Med Genet. 45:738-744.

112. Zweier C, de Jong EK, Zweier M, Orrico A, Ousager LB, Collins AL, Bijlsma EK,

Oortveld MA, Ekici AB, Reis A, Shenk A, Rauch A (2009) CNTNAP2 and NRXN1 are

mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the

level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85(5):655-66.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zhang%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chiodini%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Badr%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zhang%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Li%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20207612

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Pan%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20207612

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Bao%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20207612

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Zhang%20J%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20207612

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Wu%20X%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=20207612

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zupanc%20ML%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zweier%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Peippo%20MM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hoyer%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sousa%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bottani%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Clayton-Smith%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reardon%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Saraiva%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cabral%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gohring%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Devriendt%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22de%20Ravel%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bijlsma%20EK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hennekam%20RC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Orrico%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cohen%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dreweke%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reis%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nurnberg%20P%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zweier%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sticht%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bijlsma%20EK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Clayton-Smith%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Boonen%20SE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fryer%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Greally%20MT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hoffmann%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22den%20Hollander%20NS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jongmans%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kant%20SG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22King%20MD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lynch%20SA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McKee%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McKee%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Midro%20AT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Park%20SM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ricotti%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tarantino%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wessels%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Peippo%20M%22%5BAuthor%5D


Anhänge

74

7. Anhänge

7.1. Informationsblatt zur Studie

INFORMATIONSBLATT

für Eltern zum Forschungsprojekt

„Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“

Sehr geehrte Eltern,

bei Ihrem Kind bestehen eine geistige Behinderung und eine Epilepsie. Trotz

umfangreicher Diagnostik wurde die Ursache dieser Symptomatik bislang nicht

gefunden. In jüngster Zeit wurden einige neue Gene gefunden, deren Veränderungen

eine geistige Behinderung und eine Epilepsie verursachen. Es handelt sich um die

Gene SLC9A6, FOXG1, TCF4, ARX und CDKL5. Im Rahmen der hier aufgeführten

Studie werden wir bei Patienten mit geistiger Behinderung und Epilepsie ungeklärter

Ursache eines oder mehrere der o.g. Gene auf Veränderungen hin untersuchen. Dabei

ist es möglich, dass bei einem Teil dieser Patienten eine Genveränderung gefunden

wird und somit ein besseres Verständnis für das jeweilige Krankheitsbild möglich ist.

Wir würden uns freuen, wenn Sie durch die molekulargenetische Analyse einer DNA-

Probe von Ihrem Kind und ggf. von Ihnen zur Durchführung dieser Studie beitragen

würden. Bevor Sie sich entscheiden, an diesem Forschungsprojekt teilzunehmen,

sollten Sie dieses Informationsblatt aufmerksam lesen und eventuell verbleibende

Fragen mit Ihrem Arzt in Ruhe besprechen.

Für die Studie werden lediglich Blutproben (ca. 5-10 ml Blut) von Ihrem Kind und ggf.

von Ihnen benötigt. Das Risiko einer Blutentnahme ist aus medizinischer Sicht gering.

Gelegentlich kann es zu einem Hämatom (blauer Fleck), zu einer Thrombophlebitis

(oberflächliche Venenentzündung) oder ganz selten zu einer Nervenverletzung

kommen. Die bei Ihnen und Ihrem Kind entnommenen Proben werden kodiert, so dass

für die beteiligten Wissenschaftler im Labor keine Rückschlüsse auf die Person möglich

sind (sogenannte Pseudonymisierung). Die Kodierung und Lagerung der Proben

erfolgen am Institut für Humangenetik. Es ist eine Befristung der Nutzung sowohl der

Proben als auch der daraus gewonnenen Daten auf 25 Jahre vorgesehen.

Neben der Asservierung (Lagerung) und Untersuchung der DNA-Proben ist auch eine

möglichst detaillierte Erfassung klinischer Daten Ihres Kindes (einschließlich

fotographischer Aufnahmen in einzelnen Fällen) vorgesehen.

Anhänge

75

Sollten weitere Personen aus Ihrer Familie betroffen sein, würden wir gerne Kontakt zu

ihnen aufnehmen. Für das Projekt wären dann ein Stammbaum sowie Blutproben von

weiteren Familienmitgliedern sehr wünschenswert. Durch die Teilnahme leisten Sie und

Ihre Angehörigen möglicherweise einen großen Beitrag, dass die Ursachen von

geistiger Behinderung mit Epilepsie besser aufgeklärt und verstanden werden.

Eine Veröffentlichung der Forschungsergebnisse in Fachzeitschriften oder auf

Kongressen unter Verwendung vollständig anonymisierter Daten soll nach Abschluss

der Untersuchungen erfolgen. Es werden alle Richtlinien des Datenschutzes dafür

eingehalten. Trotz aller Sorgfalt bei unseren wissenschaftlichen Arbeiten möchten wir

betonen, dass Untersuchungen im Rahmen von Forschungsprojekten grundsätzlich

nicht den Qualitätsanforderungen genügen können, die routinemäßig durchgeführte

Tests erfüllen müssen. Sollten sich bei diesen Untersuchungen sichere Ergebnisse zum

Krankheitsbild Ihres Kindes ergeben, so haben Sie das Recht auf eine eingehende

Beratung. Daher können Sie ausdrücklich angeben, ob Sie in einem solchen Fall eine

Kontaktaufnahme von unserer Seite wünschen oder nicht. Aus dem Projekt entstehen

weder für Sie noch für Ihre Krankenkasse Kosten.

Die Teilnahme an dieser Studie ist freiwillig. Sie können jederzeit Ihr Einverständnis zur

Teilnahme widerrufen, ohne dass dadurch Nachteile für Sie oder Ihr Kind entstehen.

Nach Beendigung Ihrer Teilnahme werden keine weiteren Daten bei Ihnen oder Ihrem

Kind erhoben. Alle bisherigen Daten werden unwiderruflich anonymisiert, d. h. sie

können nicht mehr anhand der Daten identifiziert werden. Die gesammelten Daten

setzen sich zusammen aus den Namen, den Geburtsdaten, der Adresse, dem

einsendenden Arzt und dem medizinischen Befund Ihres Kindes. Für die Beteiligung

Ihres Kindes an dieser Studie möchten wir Ihnen sehr herzlich danken. Für Rückfragen

stehen wir Ihnen telefonisch oder persönlich gerne zur Verfügung.

Mit freundlichen Grüßen

Prof. Dr. med. G. Gillessen-Kaesbach Dr. med. Irina Stefanova

Ärztin für Kinderheilkunde und Humangenetik Ärztin

Anhänge

76

7.2. Einwilligungserklärung der Studie

EINWILLIGUNGSERKLÄRUNG

zur Aufbewahrung und Verwendung von genetischem Untersuchungsmaterial für

Forschungszwecke

Den beigefügten Text (Informationsblatt zum Forschungsprojekt „Molekulargenetische

Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“) habe ich gelesen, zur Kenntnis

genommen und eine Kopie erhalten. Ich bin über das Vorhaben, eine Probe von mir

und meinem Kind für die Erforschung genetischer Ursachen von mentaler Retardierung

in Kombination mit einer Epilepsie zu verwenden, durch Herrn/Frau

………………………………………………………… ausführlich aufgeklärt worden. Ich

stimme der Nutzung von pseudonymisierten Proben von mir und meinem Kind für

wissenschaftliche Zwecke freiwillig zu. Ich stimme auch der Veröffentlichung der in der

Studie erhobenen Daten in vollständig anonymisierter Form zu. Ferner bin ich damit

einverstanden, dass die Ärzte am Institut für Humangenetik Einsicht in für die Studie

relevante medizinische Vorbefunde meines Kindes erhalten dürfen.

Kodierung und Lagerung der Proben erfolgen im Institut für Humangenetik und

unterliegen der ärztlichen Schweigepflicht sowie den Richtlinien des Datenschutzes.

Dritte erhalten keinen Einblick in Originalunterlagen. Mir ist bekannt, dass ich meine

Zustimmung sowohl zur Aufbewahrung der Proben als auch der daraus gewonnenen

Daten jederzeit ohne Angabe von Gründen widerrufen kann, ohne dass mir oder

meinem Kind dadurch Nachteile im Hinblick auf die Behandlung oder das Verhältnis zu

den behandelnden Ärzten entstehen. In diesem Falle werden sowohl die DNA-Proben

als auch die daraus gewonnenen personenbezogenen Daten umgehend vernichtet.

Die Blutproben von mir und meinem Kind stelle ich für die Erforschung genetischer

Ursachen von mentaler Retardierung und Epilepsie unter Schutz eines Pseudonyms

zur Verfügung und erlaube die Nutzung für 25 Jahre.

Sollten sich aus der Analyse der pseudonymisierten Probe ein für die Gesundheit

meines Kindes wichtiger Befund ergeben, so ist eine Kontaktaufnahme seitens der

Ärzte des Institutes für Humangenetik

□ erwünscht

□ nicht erwünscht.

Anhänge

77

Ort und Datum …………………………………………………..

Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Kindes …………..……

Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Mutter …………...……

Name/Vorname …………………………………...Geburtsdatum d. Vaters ………………...

Adresse der Eltern und des Kindes: ………………………………………………………….

…………………………………………………………………………………………………….

…………………………………………………………………………………………………….

Unterschrift d. Mutter…..………..…….Unterschrift d. Vaters …...…………………………

…………….…………………………………………………..…………………………………

Name oder Stempel des Arztes/der Ärztin Unterschrift des/der behandelnden

Arztes/Ärztin

Anhänge

78

7.3. Fragebogen der Studie

FRAGEBOGEN

zur Erfassung klinischer und diagnostischer Daten

bei Patienten mit Epilepsie und mentaler Retardierung

zum Projekt „Molekulargenetische Ursachen von mentaler Retardierung mit Epilepsie“

Name des Patienten………………………………………………………………………

Geburtsdatum……………………………….…… Geschlecht: □ männlich □ weiblich

Betreuender Arzt / Einsender ……………………………………………………………

Schwangerschaft

Erkrankungen der Mutter oder andere Komplikationen……………………………….

Medikamenteneinnahme……………………Alkohol, Nikotin, Drogen:……………….

Entbindung

Art der Entbindung………………………SSW bei Entbindung……….……………….

Gewicht……………….…Länge…………………………………………………………..

KU…………...……………APGAR………………………………………………………..

Neugeborenen- und Säuglingszeit

Fütterungsprobleme? □ nein □ ja Muskeltonus? □ normal □ herabgesetzt □ erhöht

Sonstiges………………………………………..…………………………………………

Entwicklung

Motorisch:

Ist freies Laufen möglich? □ nein □ ja und zwar seit ………………………………….

Expressive Sprache: □ keine □ einzelne Wörter □ Mehrwortsätze □………………..

Sprachverständnis: □ schlecht □ einzelne Aufforderungen □ gut □………………….

Wachstum: aktuelle Körpermaße vom (Datum ) oder mit (Alter) ……………………

Gewicht…………………………… Größe……………………………………Kopfumfang

…………………………………..

War/ist ein Verlust erworbener Fähigkeiten feststellbar? □ nein □ ja

Mentale Retardierung: □ mild □ moderat □ schwer

Epilepsie:

besteht seit:……………………………………………………………………………...

Art der Anfälle…………………………………………………………………………...

Therapieresistent? □ nein □ ja

Therapie………………………………………………………………………………….

Bestehen kraniofaziale Dysmorphiezeichen? □ nein □ ja und zwar ..…………….

Anhänge

79

Besteht/bestand ein gastro-ösophagealer Reflux? □ nein □ ja

Bestehen Organfehlbildungen? □ nein □ ja und zwar ............................................

Bestehen stereotype Handbewegungen? □ nein □ ja

Besteht eine Bewegungsstörung? □ nein □ ja und zwar ….……………………….

Bestehen Hyperventilationszustände? □ nein □ ja

Leidet/litt der Patient an häufigen Luftwegsinfekten? □ nein □ ja

Sonstiges: ……………………………………………………………………………….

Familienanamnese

Gibt es Familienmitglieder, die eine ähnliche Symptomatik aufweisen?

□ nein □ ja und zwar …………………………………………………………………...

Im Vorfeld durchgeführte Diagnostik

Chromosomenanalyse (Befund)………………………………………………………

Im Hinblick auf Angelman-Syndrom: □ nicht durchgeführt

□ unauffällig

□ auffälliger Befund

Im Hinblick auf Rett-Syndrom: □ nicht durchgeführt

□ unauffällig

□ auffälliger Befund

Array-CGH-Analyse (od. SNP-Array) …………………………………………......…

Weitere molekular- oder zytogenetische Diagnostik: ………………………………

EEG (Befund) ……..……………………………………………………………………

MRT (Befund) …………………………………………………………………………..

Stoffwechseldiagnostik …..……………………………………………………………

Weitere Diagnostik ………………..……………………………………………………

Anhänge

80

7.4. Reaktionsbedingungen

7.4.1. Das CDKL5-Gen

Tabelle 10 Synthetische DNA-Oligonuleotide

Exon Vorwärts-(F-)Primer

5‘3„

Rückwärts-(R-)Primer

5‘3„

Ann.-

Temperatur

Produkt-

länge (bp)

3 gttcccaccaaccagtgag ggagagtgagacccaaattg 60°C 360

4 gagaagcaatgtcagtatagcag tcagataaggaatgctcaacctg 60°C 219

5 acactctggcttcttgctactctgtcc agtgtctgaccagctagatcc 60°C 265

6 gaagtactcaaagcagaaggtga aagaatcgggcaaatgtgcac 60°C 290

7 gctctgtattggatgaattattctag gacagtaacatgtgaaatactcttaac 60°C 297

8 ctaattagatgctattacagtgatc actcaaaagaatgttcctctacc 60°C 282

9 gcccatgcgagaacagtcattaca gcaaatgacaatagaatcagcag 60°C 280

10 agccttcttttcacatggaac gaacaatgactcaaatactgcag 60°C 389

11 tctgcaacactcacaagcacg gcaggctatggtcacatgtag 60°C 237

12 gactttgtaatgttcttaacgatc ctaattgcatcatttaagcagcc 60°C 281

13-I ttgtgtgtcagctattgaggg ggtatgttgttgttggtgagatc 60°C 284

13-II tgcacaccaaaacctaccaagc gcttttggccttggtcctgtagg 65°C 329

13-III gagtcggcatagctatattgacac gaatggctactgtccatgtgc 65°C 351

13-IV aacgctggactcacgtcgaac accctcatcacatccctcgtac 58°C 357

14 ctggttatggtcctagttctacc cttatttgtgggagactgggt 60°C 292

15 cataggcaatattgtcatcaatgtg aggcgacagtgtaggtgagaag 60°C 277

16 gaaaagtccatcagtgacttac ggacactaaaaagctcatccaga 58°C 247

17 ttcttcccggctataggaacc actttgattgccaagtgcaaagtg 60°C 301

18 ctcctcttgggtgtggttgc ctcaggacagttactggagag 60°C 254

19 acccagtcacctcacctctaag ccagctgttcagagtaggaag 60°C 387

20 actctggtcaatgggatgtgg gtttcattcagtagtctagggtc 60°C 253

21 tcactgtcaccttggcttcag gtgtggcctgaacatctgcat 60°C 368

22 agaatgcatgtggccttctgctc aaggaaaactcaacctcagcg 65°C 329

Tabelle 11 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das CDKL5-Gen


DNA 50 ng/µl 1,0


Puffer 5 x Qbiogene 2,5




Taq-Polymerase 5 U/µl Qbiogene 0,1

Ansatzvolumen 25

Anhänge

81

Tabelle 12 Schematische Darstellung des PCR-Programms für das CDKL5-Gen


35 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

Elongation

95°C

Je nach Exon

72°C

30 Sek.

30 Sek.

1 Min.

72°C 20 Min.

Tabelle 13 Sequenzieransatz für das CDKL5-Gen







Ansatzvolumen 10

Tabelle 14 Sequenzierprogramm für das CDKL5-Gen


25 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

96°C

50°C

60°C

20 Sek.

15 Sek.

4 Min.

7.4.2. Das ARX-Gen

Tabelle 15 Synthetische DNA-Oligonukleotide


5‘3‘


5‘3‘

Ann.-Temperatur Produkt-

länge (bp)

1 ggcagaaaggcacaaagatcgc gccctgatttggatgtttggtg 55°C 397

2a gtggagaaagaggccaaggcg ctgcgggtggtggcaccggcacc 64°C-62°C-60°C 630

2b aagtcgtaccgcgagaacg cacccttgctcacccaaactac 64°C-62°C-60°C 721

3 aaatagttggcactccagggg gagagagagagatgggtt 58°C 294

4 aacaacctgaggccaaagagg ctttgacccaacctcagagactg 64°C-62°C-60°C 606

5 tgacctggaaccggttccctg ccaaatggaaacagaggaccagc 55°C 742

Anhänge

82

Tabelle 16 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das ARX-Gen

Exon 1 & 5 Exon 3 Exon 2a,2b,&4


DNA 50 ng/µl 1,0 2 2

a.d. (HPLC) Merck 16,3 17,9 7

Puffer 10x Qbiogene 2,5 2,5 5

dNTPs Je 10 mM Qbiogene 0,5 0,5 0,5

GC-rich resolution Je 5 M Roche - - 8

F-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 1 1

R-Primer 10 pmol/µl Biomers 1 1 1

DMSO Roth 2,5 - -

Taq-Polymerase 5 U/µl Qbiogene 0,2 0,1 0,5

Ansatzvolumen 25 25 25

Tabelle 17 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 1&5 des ARX-Gens


35 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

Elongation

95°C

55°C

72°C

30 Sek.

30 Sek.

30 Min.

72°C 7 Min.

Tabelle 18 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 3 des ARX-Gens


30 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

Elongation

95°C

58°C

72°C

30 Sek.

30 Sek.

30 Min.

72°C 10 Min.

Anhänge

83

Tabelle 19 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2a, 2b & 4 des ARX-

Gens


3 Zyklen

3 Zyklen

30 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

Denaturierung

Annealing

Elongation

Denaturierung

Annealing

Elongation

Elongation

98°C

64°C

72°C

40 Sek.

1 Min.

1 Min. 30 Sek.

98°C 40 Sek.

62°C 1 Min.

72°C 1 Min. 30 Sek.

98°C 40 Sek.

60°C 1 Min.

72°C 1 Min. 30 Sek.

72°C 10 Min.

Tabelle 20 Sequenzieransatz für das ARX-Gen





2,5x Terminator Mix

1.1

Applied Biosystems 2

a.d. (HPLC) Biomers 4,5

Ansatzvolumen 10

Tabelle 21 Sequenzierprogramm für das ARX-Gen


25 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

96°C

50°C

60°C

20 Sek.

15 Sek.

4 Min.

Anhänge

84

7.4.3. Das SLC9A6-Gen

Tabelle 22 Synthetische DNA-Oligonukleotide


5‘3„


5‘3„ Ann.-Temperatur

Produkt-

länge (bp)

1 gcgcctgtgggtgcgtgtgacctg gaacgtaggccgagcagggcc 60°C 628

2 gagctacagggaactaccgtaag gttgtacagacatatccatttc 55°C 486

3 gcacagtaatgttcttgcctttg gaacagcccatttctgaagtgtc 55°C 284

4 gcatttcatattagcatagcatag cttattacctacgtgaatattg 55°C 299

5 ggattagtcacaaagtactac gtatctaatcatgaattctac 55°C 322

6 ctctcagagtcatctactgag gcctcattcttccaaatgtttc 55°C 298

7 cttgctagccagatacattgcagg gggcaccaaaccctatgcagaac 55°C 524

8 ctgagatttctgtgttagagaagc gatccacttggagcaaaattg 55°C 305

9 cagacaaagcctataatctactgtg gtaaaaaagacttctattttg„ 55°C 252

10 cgtctccacatttgctcccttc gtattcttatgaaccacatac 55°C 352

11 caccatcttgagtgtatagtc gttacatcaagctggcacacgc 55°C 257

12 gaacgtgctttcttgctctg ctggaaagatatccctcaaagtc 55°C 439

13 gtagttgcctgacaatgtatatg ggttgaagtttatagtagattgttttc 55°C 198

14 gcagcctgagtaatagaggtg gtttccttttccacagcactgatg 55°C 442

15 gccctttgctgtcctccgaag cagtgactcatccacagagcag 55°C 289

16 ggactttagactttatcctgagg catgcactgggacttttaggtag 55°C 492

Tabelle 23 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für Exon 2-16 des

SLC9A6-Gens


DNA 50 ng/µl 1,0


Puffer 5 x Qbiogene 2,5




Taq-Polymerase 5 U/µl Qbiogene 0,1

Ansatzvolumen 25

Anhänge

85

Tabelle 24 Schematische Darstellung des PCR-Programms für Exon 2-16 des SLC9A6-

Gens


35 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

Elongation

94°C

55°C

72°C

30 Sek.

30 Sek.

1 Min.

72°C 7 Min.

Tabelle 25 Sequenzieransatz für das SLC9A6-Gen







Ansatzvolumen 10

Tabelle 26 Sequenzierprogramm für das SLC9A6-Gen


25 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

96°C

60°C

60°C

10 Sek.

5 Sek.

1 Min.

Anhänge

86

7.4.4. Das TCF4-Gen

Tabelle 27 Synthetische DNA-Oligonukleotide und Bedingungen für die PCR – TCF4-Gen

Tabelle 28 Schematische Darstellung des PCR-Reaktionsansatzes für das TCF4-Gen


DNA 50 ng/µl 1,

a.d. (HPLC) Merck je nach Taq-Menge

Puffer 5 x MP Biomedicals 2,5

dNTPs Je 10 mM MP Biomedicals 0,5

F-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,7

R-Primer 10 pmol/µl Biomers 0,7

Taq-Polymerase 5 U/µl MP Biomedicals je nach Exon

Ansatzvolumen 25


5‘3„


5‘3„

Taq-

Menge

(in µl)

Ann.-

Temperatur

Produkt-

länge (bp)

0 cgaacagtgcccattctcttg gccatggtggccatgggagatc 0,05 55°C 354

1 ccagactaccagtaccatcttctaac ctaatttctgtgtttttagtagagac 0,05 58°C 255

2 ccagtctccaaaaatccgattgtg cctactggtttctagctgaagtg 0,05 55°C 254

3 ctctaagctgtttggtaacagtatg gccaaaaacatacaattgag 0,05 60°C 342

4 ggcaacaggagattaatttgaaac gagaaacacaccttctgtttgtc 0,05 60°C 237

5 ggaggggagaagttttggtagtgg cagaacctctgtctaggacatgg 0,05 60°C 275

6 gagcagtagatgtctgttacctg gtttaaaatgcatcatctaatttag 0,05 55°C 235

7 gtactaacaatcagttgggagg gaagtctccaggctgacaactgag 0,05 60°C 352

8 gtggtatcatctagaagtctttg gataaacgtgctgctctgggcg 0,1 60°C 252

9 cttcttatataagaatggagcttg ctgccccatctgtgacattaag 0,05 55°C 259

10 ggcagtcattttcaagtatatg gagtccttgtgtatatgcatgg 0,05 58°C 312

11 cattgtaaaatagagagttgtgag tgcctaattgctattcagttatg 0,05 55°C 330

12 gtgagtaaatggaccaggaatag gactatatactggaagcttcag 0,1 60°C 331

13 gcgttgacaacttcgtagtttag gagtttccacctacaaaatcagg 0,05 60°C 249

14 catcattgccattgccatttcc ggagagtaaaggagactgaac 0,05 60°C 253

15 catgtatttagaaacacagtgtg gcaacaatagtatctatatctg 0,05 55°C 385

16 catcaggtcctcttggcctctgg agggatgaacaccaagaggctgg 0,05 64°C 301

17 gtctgctggcagccttgcaatc gaatagtttcttcccgttctgttc 0,05 60°C 324

18 gaagaaaacaaagtaatgtagacacc ggaaacaattctttggaatgatgc 0,05 60°C 435

19 gtcagacacgcaagaagagtgc ctgtcaatttgggtgaaattcac 0,1 60°C 317

Anhänge

87

Tabelle 29 Sequenzieransatz für das TCF4-Gen





2,5x Terminator Mix 1.1 Applied Biosystems 0,5

a.d. (HPLC) Biomers 6,5

Ansatzvolumen 10

Tabelle 30 Sequenzierprogramm für das TCF4-Gen


25 Zyklen


Denaturierung

Annealing

Elongation

96°C

60°C

60°C

10 Sek.

5 Sek.

1 Min.

Anhänge

88

7.5. MLPA-Ansätze

Hersteller Volumen (in µl)

Hybridisierungsansatz

DNA 50 ng/µl 2

a.d. (HPLC) Merck 3

SALSA Proben-Mix MRC-Holland 1,5

MLPA-Buffer MRC-Holland 1,5

Ansatzvolumen 8 µl

Ligase-Mix

a.d. (HPLC) Merck 25

Ligase-65 Buffer A MRC-Holland 3

Ligase-65 Buffer B MRC-Holland 3

Ligase-65 MRC-Holland 1

Ansatzvolumen Je 32 µl Mix

Polymerase-Mix


SALSA PCR-Primer MRC-Holland 2

SALSA Enzym-Dilution

Buffer

MRC-Holland 2

SALSA Polymerase MRC-Holland 0,5

Ansatzvolumen Je 10 µl Mix

PCR-Ansatz

a.d. (HPLC) Merck 26

10x SALSA PCR-Buffer MRC-Holland 4

MLPA-Ligationsansatz 10

Polymerase-Mix 10

Ansatzvolumen 50 µl

Anhänge

89

7.6. Wachstum und Entwicklung in der untersuchten Patientenkohorte

bei Entbindung bei Datenerhebung

Pat. Geburtsdatum Geschlecht SSW Gewicht Größe Kopfumfang Alter Gewicht Größe Kopfumfang

1 02.01.1997 ♀ 42 3200 g

(- 1SD)

49 cm

(-1,5 SD)

37cm

(+1,3 SD)

11

Jahre

Keine

Angabe

141 cm

(-0,6 SD)

53 cm

(+0,5 SD)

2 09.02.1996 ♀ 34 2090 g

(-0,4 SD)

42 cm

(-1,2 SD)

keine Angabe 12,5

Jahre

41 kg

(-0,6 SD)

144 cm

(-1,7 SD)

51,5 cm

(-0,9 SD)

3 10.07.2002 ♂ 40+3 3340 g 52 cm 37 cm 5

Jahre

16,5 kg 110 cm 48,5 cm

4 11.05.1997 ♂ Termin 3200 g 52 cm keine Angabe 11

Jahre

29 kg

10.Perze

ntile

133 cm

3.Perz.

3. Perz.

5 23.03.2006 ♂ 41+3 4170 g 52 cm 36,5 cm 3,5

Jahre

15 kg 104 cm 46,7 cm

6 12.10.2007 ♀ 36+6 2880 g 52 cm 34,5 cm 21 LM 15kg

(>97.Pz.)

91 cm

(97.Pz.)

44 cm

(Mikrozephalie)

7 26.11.1979 ♀ 41+4 3950 g 56 cm 38 cm 30

Jahre

65 kg 169 cm keine Angabe

8 07.11.2006 ♀ 40 3050 g 51 cm 32 cm 3

Jahre

18,2 kg 103 cm 49,2 cm

9 27.05.2002 ♂ 40 3110 g 49 cm 37 cm 7

Jahre

30kg

(+0,9 SD)

118 cm

(-1,8SD)

52 cm

10 02.09.1999 ♀ 36 2770 g 48 cm 31 cm 10

Jahre

30 kg 137 cm 50 cm

11 29.11.1990 ♀ 36 keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe 19

Jahre

25 kg 155cm Mikrozephalie

Anhänge

90



12 09.03.2007 ♂ 40+1 3830 g 51 cm 38 cm 2,5

Jahre

14 kg 91 cm 50 cm

13 16.12.2003 ♂ 41+2 3640 g 53 cm 36 cm 6 Jahre 19,9 kg 109 cm 51,3 cm

14 23.10.2006 ♀ 41 3990 g

(-1,2 SD )

55 cm

(+1,2 SD)

36 cm

(+0,8 SD)

4 Jahre 17,6 kg

(+0,5 SD)

105 cm

(+0,3SD)

48 cm

(-1,7 SD)

15 26.08.2007 ♂ 39 2780 g 51 cm 35 cm 3 Jahre keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe

16 12.06.2006 ♀ 41 3060 g 53 cm 33 cm 4 Jahre keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe

17 22.01.2005 ♀ keine

Angabe

3070 g 51 cm 34 cm 6 Jahre 13 kg keine

Angabe

keine Angabe

18 17.08.2007 ♀ 36 2756 g 48,5 cm 32 cm 3 Jahre keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe

20 14.08.1980 ♀ Termin keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe 29

Jahre

47 kg keine

Angabe

keine Angabe

21 04.04.2001 ♂ 39 3400 g 50 cm 34,5 cm 8 Jahre 27,2 kg 125,6 cm 51,7 cm

22 05.07.1994 ♂ 41 3420 g 52 cm 36 cm 15

Jahre

50 kg 184 cm 57 cm

23 09.12.2002 ♂ 38+1 3470 g 53 cm 35 cm 7 Jahre

27 kg 120 cm 52 cm

24 11.12.2007 ♂ 41+2 3260 g 52 cm 34,5 c 3 Jahre keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe

Anhänge

91



25 10.11.1962 ♀ 14 d

vor

Termin

2450 g 49 cm 35 cm 41 Jahre 44 kg 150 cm keine Angabe

26 08.04.1999 ♀ Termin keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe 12 Jahre 30 kg 136 kg keine Angabe

27 23.09.2008 ♀ 38+3 2890 g 49 cm 35 cm 15

Monate

8,7

kg

75 cm 45 cm

28 22.09.2009 ♂ Termin

+9

keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe 20

Monate

keine

Anga

be

keine

Angabe

absteigend

29 21.04.2009 ♀ 38 3790 g 52 cm 35 cm 7 Monate 8,35

kg

75 cm 43 cm

30 15.04.2003 ♂ keine

Angabe

keine

Angabe

keine

Angabe

keine Angabe 9 Jahre 30 kg 119 cm 50cm

31 16.09.2006 ♀ 36 2350 g 45 cm keine Angabe 3 Jahre 16 kg 101 cm 50 cm

32 25.04.2002 ♀ keine

Angabe

3200 g keine

Angabe

keine Angabe 7 Jahre 18 kg 116 cm 43,5 cm

33 14.08.2009 ♀ 36 2790 g 51 cm 35 cm 21

Monate

8,9

kg

66 cm 43 cm

34 09.08.1993 ♀ 40 3600 g keine

Angabe

keine Angabe 17 Jahre 60 kg 170 cm 53 cm

35 27.10.2005 ♀ 38+5 3940 g 55 cm 36 cm 4 Jahre 16 kg 116 cm keine Angabe

SSW: Schwangerschaftswoche; d: Tage

Anhänge

92

7.7. Therapieresistente Epilepsien – Überblick

Pat Geburtsdatum

Alter zum

Zeitpunkt der

Evaluation

Epilepsiebeginn Art der Anfälle Medikation Mentale

Retardierung

1 02.01.1997 14 Jahre 3.LM

BNS-Krämpfe, seit 11.Lebensjahr tägliche

Krampfanfälle, besonders in

Einschlafphase

ACTH, LEV, VNS schwer

3 10.07.2002 5 Jahre 5.LM Myoklonien im Gesichtsbereich, tonische

Anfälle, BNS-Anfälle CLZ, VPA, ACTH schwer

4 11.05.1997 11 Jahre 2.LM Im 2.LM zyanotischer Kramfanfall, mit 11

Jahren tägliche Krampfanfälle STM, FLB, RUF, VNS schwer

5 23.03.2006 3 Jahre 23.LM Myoklonien keine Angabe schwer

6 12.10.2007 21 Monate 1.LM Tonische Anfälle mit Spasmen PB, ACTH, STM, TPM, LEV,

Dexamethason, VPA, VGB, Folsäure schwer

7 26.11.1979 30 Jahre 5.LM Hypomotorische Anfälle, asymmetrisch

tonische Anfälle OXC, LTG, CLB mild

10 02.09.1999 10 Jahre 2.LJ BNS-Anfälle, fokale Anfälle ZNS, VPA, LTG, STM, LEV schwer

11 29.11.1990 19 Jahre 3.LM BNS-Anfälle, tonische, myoklonische

Anfälle LEV,VPA, LTG schwer

12 09.03.2007 30 Monate 5.LM Fokal mit sekundärer Generalisierung LEV, ZNS moderat

15 26.08.2007 3 Jahre 4.LM Tonische Anfälle, Myoklonien VPA, ESM moderat

16 12.06.2006 4 Jahre 1.LM Komplex fokale, tonische Anfälle, tonisch-

klonische Anfälle LEV,ZNS,CLB schwer

17 22.1.2005 6 Jahre 2.LJ Zuckungen keine Angabe k.A.

18 17.08.2007 3 Jahre keine Angabe Tonische Anfälle, Myoklonien, tonisch-

klonische Anfälle mit Zyanose PB, OXC, ketogene Diät schwer

20 14.08.1980 29 Jahre 4.LM BNS-Anfälle RUF, LEV, ZNS schwer

Anhänge

93

Pat Geburtsdatum

Alter zum

Zeitpunkt der

Evaluation

Epilepsiebeginn Art der Anfälle Medikation Mentale

Retardierung

21 04.04.2001 8 Jahre 9.LM

BNS-Anfälle, myoklonische Anfälle,

Absencen, tonische Anfälle (Lennox-

Gastaut-Syndrom)

CLB, LTG, RSP schwer

22 05.07.1994 15 Jahre 4.LM BNS-Anfälle, tonische, tonisch-klonische

Anfälle, Absencen, atypische Absencen

PLP, STM, VGB, VPA, LTG, OXC,

CBZ, PB, PHT, TPM, LEV, RUF, STP,

ACTH

schwer

23 09.12.2002 7 Jahre 4.LM Myoklonien, Grand-Mal-Anfälle, Absencen VPA, LEV, ESM, LTG, STM, TPM,

CLB, Brom, ZNS schwer

24 11.12.2007 3 Jahre 7.-8.LM Tonische Anfälle VPA, STM, VGB schwer

25 10.11.1962 49 Jahre 3.LM Tonisch-klonische, tonische, komplex-

partielle Anfälle CLB, CBZ, STP schwer

26 08.04.1999 12 Jahre 18.LM Komplex fokale, sekundär generalisierte

Anfälle

CBZ,VPA,OXC,TPM, LTG, LEV, PHT,

LCM moderat

27 23.09.2008 15 Monate 8.LM BNS-Anfälle PLP, CLB, VPA,STM, VGB, TPM,

Dexamethason moderat

28 22.09.2009 20 Monate 2.LM Multifokale Anfälle PTH, PB, CBZ, TPM, VGB, LEV, CLZ,

PLP, Folsäure k.A.

29 21.04.2009 7 Monate 3.LM Fokale Anfälle VPA, VGB schwer

30 15.04.2003 9 Jahre 19.LM Fokale, sekundär generalisierte Anfälle TPM, RUF, LEV schwer

31 16.09.2006 3 Jahre 7.LM Komplex fokale, sekundär generalisierte

Anfälle VPA, PB moderat

32 25.04.2002 7 Jahre 6.LM Fokal, sekundär generalisiert TPM, CBZ, OXC schwer

33 14.08.2009 21 Monate 5.LM BNS-Krämpfe STM, PLP, VGB, Dexamethason, LEV k.A.

34 09.08.1993 17 Jahre 7.-8.LM Tonisch-klonische, fokale Anfälle TPM, OXC schwer

35 27.10.2005 5 Jahre 3.LM BNS-Krämpfe LTG,OXC schwer

Anhänge

94

7.8. Befunde im Elektroenzephalogramm und in der Magnetresonanztomographie

Pat. Geburtsdatum EEG cMRT

1 02.01.1997 Zerebrale Anfallsbereitschaft; komplex fokale Epilepsie mit schlafgebunden

Anfällen

Unauffälliger Befund

2 09.02.1996 Links fokale, fronto-zentrale epilepsietypische Muster Unauffälliger Befund

3 10.07.2002 Pathologisches iktales EEG mit Dämmerattacken und Versivanfällen des Kopfes

bei generalisierter „poly-spike"-Aktivität mit ausgeprägten interiktalen, multifokalen

und links temporal betonten, epilepsietypischen Mustern

Globale Hirnatrophie, fleckförmige

Marklagerläsionen, Arachnoidalzyste

4 11.05.1997 Mittelgradige Allgemeinstörung, flache polymorphe Thetawellen 5-7Hz, über lange

Strecken keine epilepsietypischen Muster. Anfall mit generalisiert irregulären

„spike-slow-waves“, linksseitige „polyspike-waves“, rechts eher mehr polymorphe

höhere Delta-Wellen

Keine Angabe

5 23.03.2006 Keine Angabe Atrophie der weißen und grauen Substanz

6 12.10.2007 Irreguläre generalisierte „sharp-waves“ und „poly-spike waves“ Komplexe massive supratentorielle Atrophie,

bilaterale Polymikrogyrie, Verkalkungen entlang

Sulcus centralis

7 26.11.1979 Bifrontale sharp-waves, fraglich links frontal betont Glioseareal im Gyrus frontalis superior, Zustand

nach Entzündung/Trauma

8 07.11.2006 Pathologische Wach-,Dösigkeits- und Schlafableitung mit generalisierten „poly-

spike-wave“-Paroxysmen mit klinischen Myoklonien

Unauffällig

9 27.05.2002 Leicht abnormes EEG durch relativ raschen und relativ weit nach vorn reichenden

Grundrhythmus. Kein pathologischer Befund, keine epilepsietypische Aktivität.

Unauffällig

10 02.09.1999 Generalisierte „sharp-wave-Komplexe“ Unauffällig

11 29.11.1990 Lennox- Gastaut- Syndrom („spike-waves-Varianten“) Pachygyrie, inkomplette Lissenzephalie,

Balkendysgenesie

12 09.03.2007 Keine Angabe

Supratentorielle Hemiatrophie

Anhänge

95


13 16.12.2003 Links temporaler Fokus, einzelne fokal beginnende Anfälle; multifokale

hypersynchrone Aktivität mit „sharp-waves“, „spike-poly-spike-waves“ beidseits mit

wiederholter Generalisierung

Inkomplette Rotation der Hippocampi beidseits

14 23.10.2006 Unauffällig Myelinisierungsdefizit

15 26.08.2007 Parietookzipital diskontinuierlicher EEG Status im Schlaf, 70% der Zeit im Wachen,

Grundrhythmus für das Alter zu langsam, leichte Allgemeinveränderung

Hirnatrophie

16 12.06.2006 Keine Angabe Mäßig ausgeprägte Hirnrindenatrophie, bifronto-

temporo-parietal, zunehmende Markatrophie,

erweiterte innere Liquorräume

17 22.01.2005 Keine Angabe Keine Angabe

18 17.08.2007 Keine Angabe Reduzierte Myelinisierung, Hirnatrophie fronto-

parietal

20 14.08.1980 Delta-Herd rechts temporal , seltener links temporal Hirnatrophie, nicht ätiologisch einzuordnen

21 04.04.2001 Fokale und generalisierte „sharp-waves“ und Allgemeinveränderung Betonte äußere Liquorräume, o.p.B.

22 05.07.1994 Lennox- Gastaut-Syndrom mit „sharp-slow-waves” Unauffällig

23 09.12.2002 Generalisierte „sharp-wave“-Komplexe Unauffällig

24 11.12.2007 Keine Angabe Unauffällig

25 10.11.1962 Unregelmäßige Grund-/Hintergrundaktivität, „spike-waves“, „sharp-waves“

bifrontozentral

Frontal betonte Volumenminderung des

Großhirns und Kleinhirnatrophie

26 08.04.1999 Rechts temporaler bis frontaler Herdbefund Unauffällig

27 23.09.2008 Hypsarrhythmie Milde Atrophie

28 22.09.2009 Multifokale posteriore Prädominanz Progressive cerebrale Atrophie

29 21.04.2009 Epilepsietypische Potentiale Komplexe Hirnfehlbildung, Polymikrogyrie

30 15.04.2003 Isolierte rechts fokale epilepsietypische Muster ohne herdförmige Verlangsamung

bei noch normaler Grundaktivität

Keine Angabe

31 16.09.2006 2 Foci unabhängig, links und rechts temporo-posterior Myelinisierungsverzögerung bitemporal betont

Anhänge

96


32 25.04.2002 Pathologische Verlangsamung, „sharp-waves“ temporal beidseits Hirnatrophie, erweiterte äußere und innere

Liquorräume

33 14.08.2009 Hypsarrhythmie Unauffällig

34 09.08.1993 Keine Angabe Keine Angabe

35 27.10.2005 Interiktales EEG zeigte eher generalisierte Auffälligkeiten, nicht lokalisierbar Verdacht auf fokale kortikale Dysplasie links

frontal

Anhänge

97

7.9. Ergebnisse der genetischen Untersuchungen

Sequenzanalysen MLPA

Pat. CDKL 5 TCF 4 ARX SLC9A6 CDKL5/ARX TCF4/FOXG1

1 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326),

Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht

durchgeführt unauffällig unauffällig unauffällig


Exon 19: c.2226A>G(rs8766)

nicht



Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig

4 unauffällig Exon 0: c.28G>C(rs611326),

Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig

keine Auswertung

möglich

5 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig

6 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) nicht





Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht

durchgeführt unauffällig

keine Auswertung

möglich unauffällig

9 Exon 14 nicht amplifizierbar Exon 0: c.28G>C(rs611326),

Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig

keine Auswertung





durchgeführt unauffällig unauffällig

keine Auswertung

möglich

Anhänge

98





13 unauffällig Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig


Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht

durchgeführt

Exon 1

c.25G>T(p.A9S) unauffällig unauffällig

15 unauffällig Exon 19: c.2226A>G (rs8766) unauffällig unauffällig unauffällig unauffällig





18 Exon 17: c.2372A>C

(rs35478150) Exon 0: c.28G>C (rs611326)

nicht


20 Exon 17: c.2372A>C

(rs35478150) Exon 0: c.28G>C (rs611326)

nicht






23 Exon 17: c.2372A>C

(rs 35478150) Exon 0: c.28G>C (rs611326) unauffällig

Exon 15: c.1755C>T

(rs 2307131) unauffällig unauffällig





Anhänge

99




Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht



Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht









Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht

durchgeführt

Ex. 14 kein PCR-

Produkt unauffällig unauffällig


Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht

durchgeführt unauffällig unauffällig FOXG1-Deletion


Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht

durchgeführt unauffällig

keine Auswertung



Exon 19: c.2226A>G (rs8766)

nicht

durchgeführt nicht durchgeführt unauffällig unauffällig

35 IVS17-1G>A

(c.2277-1G>A) Exon 0: c.28G>C (rs611326)

nicht

durchgeführt nicht durchgeführt unauffällig unauffällig

Danksagung

100

8. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bei allen bedanken, die an der Entstehung

dieser Arbeit beteiligt waren.

Mein großer Dank gilt Frau Professor Gillessen-Kaesbach für die Überlassung des

Themas, die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und für die Ermöglichung dieser Arbeit.

Ebenso möchte ich meiner Betreuerin Frau Dr. Irina Hüning, geb. Stefanova, für die

engagierte Betreuung danken, dafür dass sie immer als Ansprechpartnerin erreichbar

war und mir vielmehr als nur das Fachgebiet der Dissertation eröffnet hat.

Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Institutes für Humangenetik der Universität

Lübeck danke ich für die herzliche Aufnahme und die Unterstützung.

Besonderer Dank gilt Frau Heike Böttger und Frau Sabine Purmann, die mich während

der experimentellen Phase in die Labortechniken einführten und mir mit kompetenter

Unterstützung und unermüdlicher Geduld bei allen Problemen zu Seite standen.

Ich danke allen betreuenden Ärzten der im Rahmen dieser Arbeit untersuchten

Patienten für die Übersendung der Proben und der klinischen Daten.

Meiner Familie danke ich von Herzen für die Ermöglichung meines Medizinstudiums

und die Unterstützung während dieser Arbeit.

Ich danke dem Evangelischen Studienwerk Villigst e.V. für die Unterstützung meines

Studiums und insbesondere Herrn Prof. Knut Berner für die Ermutigung diese Arbeit

aufzunehmen.

Lebenslauf

101

9. Lebenslauf

Erklärung

102

10. Erklärung

Das Projekt wurde von der Ethik-Kommission der Universität zu Lübeck am 12.05.2009

genehmigt (Aktenzeichen 09-079).

Eidesstattliche Versicherung

Ich versichere ausdrücklich, dass ich die Arbeit selbstständig und ohne fremde Hilfe

verfasst, andere als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel nicht benutzt und

die aus den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen einzeln

nach Ausgabe (Auflage und Jahr des Erscheinens), Band und Seite des benutzten

Werkes kenntlich gemacht habe.

Ferner versichere ich, dass ich bisher nicht oder gleichzeitig andernorts einen

Zulassungsantrag gestellt habe oder die Dissertation vorgelegt habe. Ich habe mich

bislang keinem anderen Promotionsverfahren unterzogen.

Unterschrift: ………………………………………………..

Documents

Aus dem Institut für Humangenetik der Universität zu ... · Tabelle 6 Mikrozephalie, Kleinwuchs und Dystrophie in der untersuchten Patientenkohorte.....35 Tabelle 7 Sprachentwicklung