Aus der

Abteilung für Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung

der Ruhr-Universität Bochum

Prof. Dr. med. R. Dermietzel

Regulation von Pannexin1 durch Phosphorylierung

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Laura Twardowski

aus Düsseldorf

2011

Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla

Referent: Prof. Dr. med. R. Dermietzel

Korreferent: PD Dr. rer. nat. H. Rottensteiner

Tag der Mündlichen Prüfung: 15.05.2012

Abstract Laura Twardowski Regulation von Pannexin1 durch Phosphorylierung Problem: Pannexin1 spielt eine wichtige Rolle bei physiologischen und pathologischen

Vorgängen, wie der Regulation der Immunabwehr, oder dem ischämischen Zelltod.

Mechanismen zur Regulation von Pannexin1-Kanal-Aktivität sind bisher noch wenig

erforscht. Da bekannt ist, dass der Lebenszyklus der aus der Gap junction-

Proteinfamilie stammenden und mit den Pannexinen nah verwandten Connexine auf

verschiedenste Weise durch Phosphorylierung gesteuert wird, wurden in vorliegender

Arbeit potentielle Phosphorylierungsstellen von Pannexin1 untersucht.

Methode: Mittels gezielter Mutagenese wurden neun potentielle

Phosphorylierungsstellen von Pannexin1 durch Aminosäureaustausch mutiert. Die

resultierenden Mutanten wurden mit Hilfe eukaryoter Expressionsvektoren in N2A-

Zellen exprimiert. Anhand von Western Blot-Analysen, konfokaler

Fluoreszenzmikroskopie und elektrophysiologischen Messungen wurden transfizierte

N2A-Zellen anschließend untersucht.

Ergebnis: Es zeigte sich, dass alle mit den verschiedenen Panx1-Mutanten

transfizierten Zellen potentiell überlebensfähig waren und funktionsfähige Panx1-

Kanäle bildeten. Phosphorylierung scheint somit kein Mechanismus zur Regulation der

Panx1-Biosynthese, oder des Transports der Kanäle zur Membran zu sein. Mutationen

der Aminosäuren Y10 im N-Terminus, sowie S343 und S328 im C-Terminus führten

zur Ausbildung eines permanent offenen Kanals und Zelltod. Zudem zeigten Y324F-

mutierte Panx1-Kanäle eine gesteigerte Leitfähigkeit. Die übrigen Mutationen

verursachten im Vergleich zum Pannexin1 Wildtyp-Kanal keine wesentlichen

Änderungen der Zelleigenschaften.

Diskussion: Pannexin1 ist sowohl an physiologischen als auch an pathologischen

Prozessen in Zellen beteiligt. Die vorgelegte Arbeit zeigt erstmals, dass

posttranslationale Phosphorylierung von Panx1 ein wichtiger Mechanismus zur

Regulation von Zelleigenschaften ist. Ein besseres Verständnis dafür, wie Pannexine

reguliert werden, kann einen wichtigen Beitrag zur Untersuchung und Therapie

Pannexin1 bedingter krankhafter Zustände, wie dem entzündungsinduzierten

neuronalen Zelltod im ischämischen Gehirn leisten.

I

Inhaltsverzeichnis

1   EINLEITUNG 1  

1.1   Gap Junctions 1  1.1.1   Connexine 3  1.1.2   Innexine 5  1.1.3   Pannexine 6  

2   ZIELSETZUNG 13  

3   MATERIAL 14  

3.1   Organismen 14  3.1.1   N2A-Zelllinie 14  

3.2   Vektoren 14  

3.3   Medien und Lösungen 14  3.3.1   Zellkulturmedien und Lösungen 14  3.3.2   Lösungen für die Protein-Biochemie 15  3.3.3   Lösungen für die Elektrophysiologie 15  

3.4   Chemikalien und Antikörper 16  3.4.1   Chemikalien 16  3.4.2   Antikörper 17  3.4.3   Verwendete Kits 17  

3.5   Geräte 18  3.5.1   Apparaturen für die Zellkultur 18  3.5.2   Apparaturen für die Protein-Biochemie 18  3.5.3   Apparatur für die Konfokalmikroskopie 18  3.5.4   Apparaturen für die Elektrophysiologie 18  

4   METHODEN 20  

4.1   Zellkultur 20  

4.2   Transfektion 20  

4.3   Vektoren 20  

4.4   Seitenspezifische Mutagenese 21  

4.5   Gelelektrophorese von Gesamtproteinextrakt 22  

4.6   Western Blot 22  

4.7   Konfokalmikroskopie 23  

II

4.8   Elektrophysiologie 23  4.8.1   Elektrophysiologie in transfizierten N2A-Zellen 23  4.8.2   Analyse elektrophysiologischer Daten 24  

5   ERGEBNISSE 26  

5.1   Expressionsanalyse 27  

5.2   Zelluläres Verteilungsmuster und Überlebenszeit 29  

5.3   Elektrophysiologie in N2A-Zellen 30  5.3.1   Vergleich der Untersuchungsmethoden IV-Kurve und Rampe 31  5.3.2   Einfluss der Vektoren pEGFP-N3 und pIRES2-EGFP auf die

Zelleigenschaften 33  5.3.3   Zelleigenschaften 35  5.3.4   Carbenoxoloneinfluss 39  

6   DISKUSSION 46  

6.1   Elektrophysiologische Analyse der Zelleigenschaften transfizierter N2A-Zellen 47  

6.2   Die Verwendung der Vektoren pEGFP-N3-m-Panx1 und pIRES2-EGFP-mPanx1 hat keinen Einfluss auf die Eigenschaften von mPanx1 48  

6.3   Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von Panx1 49  

6.3.1   Alle Mutanten bilden funktionsfähige Pannexin1-Kanäle aus 50  6.3.2   Die N-terminale Mutante Y10F führt zu strukturellen Veränderungen

des Panx1-Kanals 51  6.3.3   Mutationen putativer Phosphorylierungsstellen in der intrazellulären

Schleife von Panx1 haben keinen Einfluss auf die Eigenschaften des Kanals im Vergleich zu Panx1 wt 53  

6.3.4   C-Terminale Panx1-Phosphorylierungsstellen sind wichtig für die Regulation von Panx1-Kanaleigenschpaften 55  

7   ZUSAMMENFASSUNG 59  

8   LITERATURVERZEICHNIS 61  

9   ANHANG 69  

10   LEBENSLAUF 78  

III

Abkürzungsverzeichnis A Ampere

ACSF artifizielle cerebrospinale Flüssigkeit

APS Ammoniumpersulfat

Aqua dest. destilliertes Wasser

cAMP zyklisches Adenosin-Mono-Phosphat

Cbx Carbenoxolon

Cx Connexin

D-MEM Dulbecco´s modifiziertes Eagle Medium

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure (engl.

„ethylene diaminetetraacetic acid“)

EGFP enhanced green fluorescence protein

EGTA Ethylenglycoltetraessigsäure (engl.

„ethylene glycol tetraacetic acid“)

ER Endoplasmatisches Retikulum

FCS fetales Kälberserum (engl. „fetal calf

serum“)

FFA Flufenaminsäure

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-

ethansulfonsäure

Inx Innexin

IRES interne ribosomale Eintrittsstelle (engl.

„internal ribosome entrysite“)

IP3 Inositol-Tris-Phosphat

LCC Kanäle mit grosser Leitfähigkeit (engl.

„large conductance channels“)

LY Lucifer Yellow

m Maus

NEA nicht-essentielle Aminosäuren (engl.

„non-essential amino acids“)

nt nicht transfizierte Zellen

Panx Pannexin

IV

PBS Phosphatpuffer (engl. „phosphate

buffered saline“)

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid

Gelelektrophorese (engl. „sodium

dodecylsulfate polyacryamide gel

electrophoresis“)

TEMED N,N,N`,N`-Tetramethylethylendiamin

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

wt Wildtyp

V Volt

vo „vector only“

V

Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Auflistung von Vektoren, die mittels in vitro Rekombination gebildet

wurden. 14

Tabelle 2: Liste der Erstantikörper für die Western Blots. 17

Tabelle 3: Liste der Zweitantikörper für die Western Blots. 17

Tabelle 4: Oligonukleotide für die seitenspezifische Mutagenese. 21  

VI

Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Struktureller Vergleich der drei Gap junction-Proteinfamilien. 2

Abbildung 2: Struktureller Aufbau von Gap junctions. 4

Abbildung 3: Lokalisation potentieller Phosphorylierungsstellen. 26

Abbildung 4: Expressionsanalyse von mPanx1-Mutanten mit modifizierten potentiellen Phosphorylierungsstellen in N2A-Zellen. 28

Abbildung 5: Zelluläres Verteilungsmuster von mPanx1 und Überlebenszeit von mPanx1-Mutanten mit modifizierten potentiellen Phosphorylierungsstellen in N2A-Zellen. 29

Abbildung 6: Vergleich der Stimulationsprotokolle „IV-Kurven“ und „Rampen“ anhand der maximal ausgelösten Membranströme, gemessen in transfizierten N2A-Zellen. 32

Abbildung 7: Vergleich der Messergebnisse pIRES2-EGFP-mPanx1-transfizierter N2A-Zellen mit denen pEGFP-N3-mPanx1-transfizierter N2A-Zellen am Beispiel der Maximalströme der IV-Kurven. 34

Abbildung 8: Elektrophysiologische Charakterisierung der Panx1 wt und der mutierten mPanx1-Kanäle in N2A-Zellen mittels IV-Kurven. 35

Abbildung 9: Quantitative Analyse der mittleren maximalen Stromamplituden der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des Panx1 wt und seiner Mutanten in N2A-Zellen. 37

Abbildung 10: Quantitative Analyse der mittleren Eingangswiderstände der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des Panx1 wt und seiner Mutanten in N2A-Zellen. 38

Abbildung 11: Quantitative Analyse des mittleren S-Index von nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und dem Panx1 wt und seinen Mutanten in N2A-Zellen. 39

Abbildung 12: Einfluss von Cbx auf gemittelte IV-Kurven der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des mPanx1 wt seiner Mutanten in N2A-Zellen. 41

VII

Abbildung 13: Vergleich des Einflusses von Cbx auf die IV-Kurven der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des Panx1 wt und seine Mutanten in N2A-Zellen. 42

Abbildung 14: Quantitative Analyse des Cbx-Effekts auf die mittleren maximalen Stromamplituden der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo), und des Panx1 wt und seine Mutanten in N2A-Zellen. 44

Abbildung 15: Quantitative Analyse des Cbx-Effekts auf den mittleren S-Index der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des Panx1 wt und seine Mutanten in N2A-Zellen. 45  

1

1 Einleitung

1.1 Gap Junctions Die Entstehung vielzelliger Organismen erforderte die Entwicklung neuer

Kommunikationswege zwischen den Zellen eines Zellverbandes. Die Stelle, an

der die Zytoplasmata zweier benachbarter Zellen direkt mit einander in

Verbindung treten, wird als „Gap junction“ bezeichnet. Fast alle Zelltypen der

Vertebraten bilden Gap junctions aus, mit wenigen Ausnahmen: Erythrozyten,

Spermien und reife Skelettmuskelzellen kommunizieren nicht über Gap

junctions (Dermietzel und Spray, 1993). Der Begriff Gap junction bezeichnet

einen fleckförmigen Bereich einer Zellmembran, innerhalb dessen zahlreiche

Einzelkanäle nebeneinanderliegen. Die Entfernung zwischen den

aneinandergrenzenden Zellen im Gewebe, die normalerweise etwa 20 nm

beträgt, ist hier auf 3,5 nm verringert (Revel und Karnovsky, 1967). Die Gap

junctions überbrücken diese Entfernung, indem sich zwei

membrandurchspannende Hemikanäle der gegenüberliegenden Membranen

aneinander lagern. Sie bilden eine gemeinsame Kanalpore mit einem relativ

großen Durchmesser von bis zu 1,2 nm aus (Bennett und Zukin, 2004; s.

Review Maeda und Tsukihara, 2011). Aufgrund dieses relativ grossen

Durchmessers gelangen nicht nur Ionen direkt von einer Zelle in die nächste,

sondern auch Moleküle mit einer Größe von bis zu 1 kDa (s. Review Maeda

und Tsukihara, 2011). Dazu gehören Metabolite wie Glukose (Tabernero et al.,

1996), sekundäre Botenstoffe wie Kalzium, Inositoltriphosphat (IP3), oder

zyklisches Adenosin-Mono-Phosphat (cAMP) (Tsien und Weingart, 1974) und

Nukleotide (Pitts und Simms, 1977). Zudem ist über Gap junctions eine

bidirektionale Fortleitung von elektrischen Signalen möglich.

Entdecker der Gap junctions waren Furshpan und Potter, die 1959 bei der

Untersuchung von Flusskrebs Riesenmotorneuron-Synapsen nach elektrischer

Reizung eine kurze Latenz zwischen präsynaptischem Stimulus und

postsynaptischer Antwort beobachteten, die sich nicht durch chemische

Übertragung erklären ließ. Seither unterscheidet man in Neuronen chemische

2

und elektrische Synapsen, die Gap junctions. An elektrischen Synapsen sind

prä- und postsynaptische Zellen direkt miteinander verbunden, das heißt es

besteht eine zytoplasmatische Kontinuität. Vorteil eines solchen funktionellen

Synzytiums ist die unverzögerte Fortleitung elektrischer Signale, die z.B. für

Flucht- und Abwehrreaktionen von entscheidender Bedeutung sein kann. Bei

der Meeresschnecke Aplysia zum Beispiel kann ein Stimulus über elektrisch

gekoppelte Motorneurone eine synchronisierte Aktivierung der Tintendrüse und

Ausschüttung einer schützenden Tintenwolke bewirken (Carew und Kandel,

1976). Aber nicht nur die Funktion und Synchronisation neuronaler Netzwerke

(s. Review Zoidl und Dermietzel, 2002) bis hin zum epileptischen Anfall (Traub

et al., 2002; Volman et al., 2011), sondern auch die synchronisierte Aktivität von

Kardiomyozyten und glatten Muskelzellen, z.B. im Uterus, beruht auf der

schnellen elektrischen Signalfortleitung via Gap junctions. Eine veränderte

Anzahl, Zusammensetzung, Verteilung oder Aktivierung von Gap junctions im

Herzen kann infolgedessen zu Erkrankungen des Herzens, wie etwa einer

erhöhten Arrhythmogenität, oder Herzinfarkten führen (Kanno und Saffitz, 2001;

Severs et al., 2001; s. Review Salameh und Dhein, 2011).

Jeder Hemikanal besteht aus sechs identischen Protein-Untereinheiten, jede

dieser Untereinheiten wiederum aus vier Transmembrandomänen (Kumar und

Gilula, 1996).

Bisher konnten drei verschiedene Proteinfamilien identifiziert werden:

Connexine, Innexine und Pannexine.

Abbildung 1: Struktureller Vergleich der drei Gap junction-Proteinfamilien. In Vertebraten werden die Gap junctions von der Proteinfamilie der Connexine gebildet. Innexine und Pannexine gehören zu einer Superfamilie, sie kommen in Invertebraten und Vertebraten vor. Alle drei Proteintypen bestehen aus vier Transmembrandomänen (M1-M4), zwei extrazellulären Schleifen (EL1, EL2) und einer intrazellulären Schleife, sowie dem intrazellulär lokalisierten Amino- und Carboxyterminus. Connexine tragen in den extrazellulären Schleifen jeweils drei hochkonservierte Cysteine (markiert mit „C“), die für die interzelluläre Ausbildung der Gap junction essentiell sind. Innexine und Pannexine weisen hier dagegen lediglich jeweils zwei Cysteine auf. (Grafik freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Helga Schulze).

3

1.1.1 Connexine In Vertebraten werden Gap junctions von der Proteinfamilie der

„Connexine“ (Cx) gebildet. Das menschliche Genom enthält 21 Gene für

Connexine, das der Maus 20. Davon sind 19 sequenz-ortholog (Söhl und

Willecke, 2003). Man unterscheidet verschiedene Connexin-Typen, die mit

„Cx“ und einem Zusatz bezeichnet werden, der auf das vorhergesagte

Molekulargewicht des Connexins hinweist (Beyer et al., 1987). So hat zum

Beispiel das so genannte „Cx43“ ein Molekulargewicht von 43.036 Da. Alle

Connexine haben dieselbe Sekundärstruktur: sie bestehen aus vier α-helikalen

Transmembrandomänen, je einem intrazellulären C- und N-Terminus, sowie

einer intrazellulären und zwei extrazellulären Schleifen (Hertzberg et al., 1988; s.

Review Yeager und Harris, 2007). Die extrazellulären Schleifen tragen drei

hochkonservierte Cysteine, die für die interzelluläre Ausbildung der Gap

junctions essentiell sind (Kumar und Gilula, 1996; Bao et al., 2004). Die

Transmembrandomänen und die extrazellulären Schleifen sind hochkonserviert,

während die intrazelluläre Schleife und der C- und N-Terminus sowohl in ihrer

Länge als auch in ihrer Sequenz variieren können (s. Review Yeager und Harris,

2007). Aufgrund dieser Variationen werden die Connexine in drei Unterklassen

eingeteilt: α, β und γ. Sechs Connexine mit jeweils vier Transmembrandomänen

lagern sich zu einem „Connexon“, dem Hemikanal zusammen (Makowski et al.,

1977). Connexone können heteromer oder homomer sein und haben dann

jeweils unterschiedliche Eigenschaften (Elfgang et al., 1995). Als

„homomer“ bezeichnet man Connexone, die aus einem Typ Connexin bestehen,

als „heteromer“ dementsprechend solche, die aus verschiedenen Unterklassen

der Connexine zusammengesetzt sind (Dermietzel, 1998). Zwei Hemikanäle

aneinandergrenzender Zellen können letztlich eine Gap junction bilden. Diese

Kanäle können wiederum heterotyp oder homotyp sein. Als „homotyp“ werden

solche Gap junctions bezeichnet, die aus zwei identischen Hemikanälen

gebildet werden, „heterotyp“ sind Kanäle aus einer Kombination

unterschiedlicher Hemikanäle. Ihre Zusammensetzung scheint die Leitfähigkeit,

die Permeabilität und die Spannungsteuerung der Gap junctions zu

beeinflussen (Manthey et al., 2001).

4

Abbildung 2: Struktureller Aufbau von Gap junctions. (A) Jedes Connexin besteht aus vier Transmembrandomänen (M1-M4) und zwei extrazellulären Schleifen (EL1, EL2). Der N- und C-Terminus liegen intrazellulär. (B) Jeweils sechs Connexine lagern sich zu einem Connexon, dem Hemikanal zusammen. Zwei Connexone gegenüberliegender Zellen bilden die membrandurchspannende interzelluläre Gap junction. (C) Meist liegen in der Zellmembran mehrere Einzelkanäle fleckförmig in so genannten Gap junction Plaques zusammen. Die Entfernung zwischen aneinandergrenzenden Zellen ist hier von normalerweise 20 nm auf 3,5 nm verringert. In 1 und 3 sind homomere Connexone, die aus einem Typ Connexin bestehen, dargestellt, Beispiel 2 zeigt heteromere Connexone, die aus verschiedenen Connexinen gebildet werden. Wird eine Gap junction aus zwei Hemikanälen derselben Zusammensetzung geformt (Beispiel 1 und 2), so heißt dies homotyp, eine Zusammensetzung verschiedener Connexone zu einer Gap junction wird hingegen als heterotyp bezeichnet (Beispiel 3) (Grafik freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Helga Schulze).

Connexine existieren nicht nur als interzelluläre Gap junctions, also in

aneinandergrenzenden Zellmembranen, sondern auch als funktionelle

Hemikanäle nicht-kommunizierender Membranen. Die Hemikanäle sind hier

Kommunikationswege zwischen dem Zytoplasma und dem Extrazellulärraum

und haben z.B. an der Regulation des Zellvolumens, oder der parakrinen

Freisetzung von ATP, NAD+ oder Glutamat, Teil (Goodenough und Paul, 2003;

s. Review Goodenough und Paul, 2009). Neu synthetisierte Connexine werden

ko-translational in die Membran des endoplasmatischen Retikulums eingefügt

und oligomerisieren im Golgi-Apparat zu Hemikanälen. Von dort werden sie in

Transportvesikeln mittels Mikrofilamenten und Mikrotubuli zur Zellmembran

5

transportiert (Olk et al., 2009). Der Abbau von Connexonen erfolgt aus der

Mitte eines Gap junction Plaques in Vesikeln, die „annular junctions“ genannt

werden, sowohl lysosomal aus der Plasmamembran als auch proteosomal aus

dem endoplasmatischen Retikulum (Jordan et al., 2001; Laird, 2006). Da

Connexine eine sehr kurze Halbwertszeit zwischen 1,5 und 5 Stunden haben

(Laird, 2006), kann über die Geschwindigkeit von Synthese und Abbau der

Connexine auch direkt die Funktion der Zellen und Zellverbände reguliert

werden. Es sind sowohl verschiedenste transkriptionelle, als auch

posttranskriptionelle Regulationsmechanismen zur exakten Einstellung der

mRNA-Menge beschrieben (s. Review Sáez et al., 2003).

Die meisten Connexine sind Phosphoproteine (Cooper et al., 2000), so dass

weitere funktionelle Variabilität durch Phosphorylierung entsteht. Von der

Synthese, über den Transport zur Membran, den Zusammenbau, den Einbau in

die Membran, die Spannungssteuerung, bis zum Abbau der Kanäle werden

viele Phasen des Connexin-Lebenszyklus mittels Phosphorylierung gesteuert (s.

Review Sáez et al., 2003; s. Review Solan und Lampe, 2009).

1.1.2 Innexine Innexine (Inx) wurden ursprünglich in Drosophila melanogaster und

Caenorhabditis elegans entdeckt und man nahm an, dass sie die strukturellen

Komponenten der Invertebraten Gap junctions seien (Phelan et al., 1998b;

Phelan und Starich, 2001). Der Name Innexin leitet sich von „Invertebraten

Analogon der Connexine“ ab. Heute weiß man, dass Innexine auch in

Vertebraten vorkommen, und vermutet, dass Innexine und Pannexine zu einer

Superfamilie gehören (Yen und Saier, 2007; Fushiki et al. 2010). Obwohl

Innexine keine Sequenzhomologie zu den Connexinen aufweisen, sind die

Proteinstrukturen dennoch ähnlich: genau wie Connexine bestehen Innexine

aus vier Transmembrandomänen, sowie intrazellulären N- und C-Termini

(Phelan und Starich, 2001). Im Gegensatz zu den Connexinen tragen Innexine

in ihren extrazellulären Schleifen jedoch nur zwei hochkonservierte Cysteine

(Phelan und Starich, 2001). Ihre physiologischen Eigenschaften ähneln

trotzdem denen der Connexine (Phelan et al., 1998a).

6

1.1.3 Pannexine Der Begriff „Pannexin“ leitet sich von griechisch „pan“ (alles, gesamt) und

lateinisch „nexus“ (Verbindung, Verknüpfung) ab und wurde von Panchin und

Mitarbeitern geprägt (Panchin et al., 2000), um die Innexine der Invertebraten

und ihre Vertebraten-Homologe als eine ubiquitär vorkommende Proteinfamilie

zusammenzufassen. Sowohl im Maus- als auch im menschlichen Genom sind

drei Pannexin-kodierende Gene vorhanden die als PANX1, PANX2 und PANX3

bezeichnet werden (Panchin et al. 2000). Die Panx1 mRNA kommt ubiquitär im

Körper vor, im zentralen Nervensystem, wie dem Cortex, dem Striatum, dem

Bulbus olfactorius, dem Hippocampus, dem Thalamus, dem Kleinhirn und der

unteren Olive konnte zusätzlich Panx2 mRNA nachgewiesen werden (Bruzzone

et al. 2003; Ray et al. 2005; Weickert et al., 2005). Auf zellulärer Ebene

unterscheidet sich jedoch die Verteilung der Panx1 und Panx2 mRNA: im

Hippocampus wird zum Beispiel sowohl Panx1 als auch Panx2 in GABAergen

Interneuronen exprimiert. Im Kleinhirn jedoch kommt Panx1 mRNA besonders

reichlich in der weißen Substanz vor während Panx2 mRNA in den Purkinje-

Zellen festgestellt werden konnte (Bruzzone et al., 2003). Panx3 mRNA scheint

dagegen nicht im ZNS vorzukommen sondern in der Haut, in Osteoblasten und

in Fibroblasten (Panchin et al., 2000; Bruzzone et al., 2003; Baranova et al.,

2004). Pannexine weisen, wie Innexine und Connexine auch, vier

Transmembrandomänen, eine intra- und zwei extrazelluläre Schleifen, sowie

einen intrazellulären N- und C-Terminus auf. Und wie Innexine, nicht jedoch

Connexine, tragen Pannexine nur jeweils zwei Cysteine in den extrazellulären

Schleifen (Phelan und Starich, 2001).

Neueren Untersuchungen von Dahl und Mitarbeitern (Ambrosi et al., 2010)

zufolge bilden sowohl Panx1, als auch Panx2 homomere Kanäle aus. Dabei

scheinen die homomeren Panx2-Kanäle keine hexamere Anordnung

aufzuweisen, wie dies für Panx1-Kanäle angenommen wird, sondern sie

scheinen oktamere Kanäle zu formen. Heteromere Kanäle aus Panx1 und

Panx2 sind dagegen sehr instabil und scheinen in vivo nicht funktionell zu sein.

Ob Panx3 ebenfalls homomere Kanäle ausbilden kann, bleibt fraglich.

Bruzzone et al. (2003) konnten in elektrophysiologischen Untersuchungen

zumindest keine funktionellen homomeren Panx3-Kanäle nachweisen.

7

Es ist erwiesen, dass Pannexine funktionelle nicht-junctionale Kanäle ausbilden

und so eine Aufgabe ähnlich normaler Ionenkanäle ausüben können, indem sie

das Zytoplasma einer Zelle mit dem Extrazellulärraum verbinden. Eine Funktion

als Gap Junction konnte dagegen bisher nicht nachgewiesen werden (Penuela

et al., 2007; Boassa et al., 2007; Sosinsky et al., 2011). Für Panx1 konnte

zudem von Zoidl und Mitarbeitern (Zoidl et al., 2007) mittels Western Blot und

elektronenmikroskopischer Immunhistochemie eine überwiegend

postsynaptische Lokalisation in Pyramidenzellen des Hippocampus gezeigt

werden. Dies unterstreicht die Funktion von Pannexinen als nicht-junctionale

Kanäle. Andererseits liegen sowohl Studien vor, die den Übertritt von

Farbstoffen von einer Zelle in die nächste über Pannexine, und damit Gap

junctions, beschreiben (Vanden Abeele et al, 2006), als auch solche, die einen

Farbstoffübertritt zwischen benachbarten Zellen verneinen (Huang et al., 2007).

Allerdings ist Panx1 unter physiologischen Bedingungen an extrazellulären

Positionen glykosyliert, was die Formation zweier Pannexin-Kanäle zu

funktionellen Gap junction verhindern kann (Boassa et al., 2007). Es ist also

wahrscheinlich, dass Pannexine in vivo ausschließlich als nicht-junctionale

Kanäle vorkommen.

Pharmakologische und physiologische Eigenschaften von Pannexinen Da zwei nicht verwandte Gap junction-Proteinfamilien in Vertebraten existieren,

ist anzunehmen, dass sie unterschiedliche Funktionen in Zellverbänden erfüllen.

Zur Unterscheidung zwischen Connexin- und Pannexin-Eigenschaften dienen

ihre pharmakologischen und physiologischen Merkmale. Flufenaminsäure

(FFA) ist ein bekannter Chlorid-Kanal-Blocker, der auch Connexin-Kanäle

reversibel blockiert (Harks et al., 2001). Pannexine werden dagegen kaum von

FFA beeinflusst, sondern effektiv durch Carbenoxolon (Cbx) reversibel blockiert.

Cbx blockiert zwar auch Connexone, aber nur in sehr hoher Konzentration.

Zudem ist der Cbx-Effekt bei Connexonen geringer, als bei Pannexonen

(Bruzzone et al., 2005; Weihong et al., 2009). 2004 wandten Bao et al. die

Patch-clamp-Technik an, um weitere Eigenschaften der Pannexin1-Kanäle in

Xenopus-Oozyten zu analysieren. Sie stellten fest, dass die

Einzelkanalleitfähigkeit bei ca. 500 pS liegt, während Connexin-Hemikanäle

lediglich eine Leitfähigkeit zwischen 18 pS (Cx32, Gomez-Hernandez et al.,

8

2003) und 220 pS (Cx43, Contreras et al., 2003) zeigen. Zudem stellte sich

heraus, dass die Pannexin1-Kanäle in fünf Öffnungszuständen vorkommen

können: Neben einem komplett offenen Zustand existieren vier weitere

Öffnungszustände mit geringerer Leitfähigkeit von 5%, 25%, 30% und 90% der

maximalen Leitfähigkeit (Bao et al., 2004). Da Pannexin-Kanäle eine sehr

große Kanalpore bilden, durch die wichtige Metabolite verloren gehen und

extrazelluläres Kalzium ungehindert einströmen könnte, liegen die Kanäle meist

in einem geschlossenen Zustand vor und die Öffnung des Kanals ist streng

reguliert. Bei einem negativen Haltepotential ist der Pannexin1-Kanal

geschlossen (Bruzzone et al., 2003), öffnet jedoch bei positiven

Haltepotentialen (Bao et al., 2004). Außerdem kann eine Öffnung des Kanals

durch mechanischen Stress (Bao et al., 2004), extrazelluläres ATP, Anstieg der

intrazellulären Kalziumkonzentration (Bruzzone et al., 2005), Sauerstoffmangel

oder Entzündungszustände hervorgerufen werden, während ein

zytoplasmatischer pH-Abfall zum Kanal-Verschluss führt (Locovei et al., 2006).

All diese Eigenschaften kommen, wenn überhaupt, nur in wenigen Connexonen

vor. Zusätzlich sind die Pannexin-vermittelten Ströme bei negativen

Haltepotentialen in Patch-clamp Versuchen grösser, als bei positiven

Haltepotentialen, so dass die Kanäle eine Gleichrichterfunktion ausüben

können (Bao et al., 2004).

Funktion von Pannexinen In tierischen Zellen hat Kalzium eine wichtige Bedeutung für die Erregbarkeit,

die Aktivierung von Enzymen und Hormonen, sowie als intrazellulärer second

messenger. Interzelluläre Kalziumwellen spielen eine Rolle in der Regulation

des Zilienschlags des Epithels der Atemwege (Sanderson et al., 1990), oder

der Modulation synaptischer Übertragung zwischen Neuronen (Newman, 2001).

Für die Fortleitung solcher Kalziumwellen über Zellgrenzen hinaus sind

Pannexine essentiell. Die mechanische Stimulation von Zellen führt zum

Anstieg intrazellulären IP3. IP3 kann seinerseits Kalzium aus IP3-sensitiven

Speichern freisetzen und über Gap junctions in benachbarte Zellen diffundieren,

wo es weitere Kalzium-Speicher öffnet und zur Ausbildung einer interzellulären

Kalziumwelle beiträgt (Sanderson et al., 1990). Bevor die Existenz von

Pannexinen bekannt war, nahm man an, dass die hierfür benötigten Kanäle aus

9

Connexonen gebildet werden. Connexine reagieren jedoch auf einen Anstieg

der intrazellulären Kalzium-Konzentration sehr sensitiv mit einem Verschluss

ihrer Kanalpore und könnten deshalb nur an einer sehr frühen Phase der

Kalziumwellen teilhaben (Sanderson et al., 1994). Pannexine andererseits

beantworten eine Erhöhung der intrazellulären Kalziumkonzentration mit einer

Öffnung ihrer Kanalpore und scheinen deshalb besser geeignet, Kalziumwellen

weiterzuleiten. Locovei et al. konnten 2006 nachweisen, dass Pannexin1-

Kanäle sowohl Kalziumwellen auslösen als auch fortleiten können. Mittels

elektrophysiologischer Ableitungen an Xenopus-Oozyten, die Pannexin und

P2Y1 exprimieren, konnten sie folgendes zeigen: Ein durch mechanischen

Stress geöffnetes Pannexon führt zur Freisetzung von ATP durch den

Pannexin-Kanal in den Extrazellulärraum. Extrazelluläres ATP aktiviert dann

einen purinergen Rezeptor vom Typ P2Y oder P2X, dies führt zum Anstieg der

intrazellulären IP3-Produktion und zur Freisetzung intrazellulären Kalziums. Mit

dem Anstieg des intrazellulären Kalziums werden weitere Pannexin-Kanäle

geöffnet und mehr ATP in den Extrazellulärraum freigesetzt, dort kann es zu

benachbarten Zellen diffundieren und diese über purinerge Rezeptoren

aktivieren. Diese Art der Ausbreitung von Kalziumwellen wäre also unabhängig

von der Existenz von Gap junctions und funktioniert auch mit Pannexinen, die

lediglich nicht-junctionale Ionenkanäle bilden.

Dieser Mechanismus der ATP-Freisetzung konnte schnell mit der bei Ischämie

auftretenden Kalzium-Dysregulation in Verbindung gebracht werden

(Thompson et al., 2006). Gleichzeitig können über Panx1- und P2X-Rezeptoren

G-Protein gekoppelte Rezeptoren aktiviert werden, die während und nach

ischämischen Bedingungen kardioprotektive Signalwege in den Zellen auslösen

(Vessey et al., 2011).

Die ATP-Freisetzung via Pannexin1-Kanäle scheint auch eine Rolle in der

Verarbeitung von Geschmacksinformationen in den Papillae vallatae der Maus

zu spielen. Vermutlich führt die Stimulation von Rezeptorzellen in

Geschmacksknospen zu einer Freisetzung von ATP durch Pannexin1-Kanäle.

Das ATP kann dann direkt afferente Axone der Geschmacksnerven oder

angrenzende präsynaptische Zellen aktivieren (Dando und Roper, 2009). Wie

die Pannexin1-Kanäle in den Geschmacksknospen aktiviert werden, konnten

2010 Huang und Roper aufdecken: eine Erhöhung der intrazellulären

10

Kalziumkonzentration oder eine Membrandepolarisation führen zur Öffnung der

Kanäle.

Außerdem kann ATP als lösliches „find-me“-Signal apoptotischer Zellen

Phagozyten anlocken und so zur Aufrechterhaltung der Gewebshomöostase

beitragen. 2010 konnten Chekeni et al. Pannexin1-Kanäle als Freisetzungsweg

für ATP in apoptotischen Zellen identifizieren. Pharmakologische Hemmung

des Panx1-Kanals konnte die ATP-Freisetzung vermindern, während die

Überexpression des Kanals zu einer verstärkten Freisetzung führte. Sie

identifizierten außerdem eine Caspasen-Schnittstelle in Panx1, die ebenfalls

eine wichtige Funktion in der Apoptose hat: Caspasen-Aktivität führt zur

Ausbildung eines permanent offenen Panx1-Kanals mit darauf folgendem

Zelltod.

Auch bei der Regulation der Immunabwehr spielt ATP und seine Freisetzung

via Pannexin1-Kanäle eine Rolle (Woehrle et al., 2010a; Woehrle et al., 2010b).

Pannexin1-Kanäle können als Reaktion auf einen Reiz mit hypertoner

Salzlösung ATP freisetzen. Das Nukleotid ATP führt über eine Bindung an P2X-

Rezeptoren zu einer gesteigerten T-Zell-Funktion, indem es z.B. die Produktion

des T-Zell-Wachstumsfaktors Interleukin-2 steigert. Die posttraumatische T-

Zell-Anergie und damit Immunsuppression wird somit über eine ATP-

Freisetzung über Pannexin1-Kanäle vermindert.

Kürzlich konnte mittels Patch-clamp-Technik eine weitere Funktion von

Pannexinen aufgedeckt werden: so genannte LCC-Kanäle („large conductance

channels“) wurden in kardialen Myozyten aufgrund ihrer pharmakologischen

Eigenschaften in elektrophysiologischen Experimenten und durch Expression

mittels adenoviraler Vektoren als Panx1-Kanäle identifiziert. Die Öffnung dieser

Kanäle könnte zu einem Kalziumeinstrom und Membrandepolarisationen mit

Auslösung spontaner Aktionspotentiale und damit arrhythmogener Aktivität im

Herzen beitragen (Kienitz et al., 2011).

Zusammenfassend kann man sagen, dass für Pannexin1 mittlerweile eine

Vielzahl an Funktionen sowohl in physiologischen, als auch in pathologischen

Reaktionen von Zellen auf verschiedenste Reize bekannt ist. So spielen, wie

bereits erwähnt, Panx1-Kanäle eine wichtige Rolle in der Freisetzung von ATP

und damit der Auslösung und Weiterleitung von Kalziumwellen, der Apoptose,

11

der Verarbeitung von Geschmacksinformationen, oder der Regulation der

Immunabwehr. Darüber hinaus wird für Panx1 eine Rolle in der Vasodilatation,

bei Entzündungsmechanismen, dem ischämischem Zelltod, der Epilepsie, und

der Tumorsuppression angenommen. Die spontane Öffnung von Panx1-

Kanälen im Herzen könnte außerdem zur Auslösung arrhythmogener Aktivität

beitragen.

Über die Aufgabe von Panx2 und Panx3 weiß man dagegen immer noch

wesentlich weniger. Um ihre Funktion im Gewebe bestimmen zu können,

müssen weitere Untersuchungen zu ihren physiologischen und

pharmakologischen Eigenschaften folgen. Einige wenige Versuche haben

bereits stattgefunden: Pannexin3 scheint die Chondrozyten-Proliferation und

Differenzierung im Knorpel zu regulieren. Zumindest konnte Panx3-mRNA in

der Knorpelwachstumszone nachgewiesen werden (Iwamoto et al. 2010). Die

Herunterregulation von Panx3 in Chondrozyten verhinderte die Differenzierung

spezieller Knorpelzellen (ATDC5), während die Transfektion mit Panx3-mRNA

die chondrogene Differenzierung förderte. Zudem konnte durch die Transfektion

mit Panx3-mRNA die Freisetzung von ATP in den Extrazellulärraum begünstigt

werden, so dass auch für den Panx3-Hemikanal eventuell eine Funktion in der

Freisetzung von ATP angenommen werden kann.

Panx3-mRNA konnte auch in der Haut nachgewiesen werden und könnte hier

für die Aufrechterhaltung der epidermalen Architektur zuständig sein. So

scheint die Überexpression von Panx3 in Keratinozyten der Rattenepidermis

zur Aufrechterhaltung des embryonalen Aufbaus der Epidermis zu führen

während die Überexpression von Panx1 eine Dysregulation der

Keratinozytendifferentierung auslöst (Celetti et al., 2010).

Auch Pannexin2 könnte eine Rolle bei der Differenzierung von Zellen spielen.

Swayne et al. konnten mit Hilfe kurzer Haarnadel-RNA im Jahr 2010 die Panx2-

Expression in Neuro2A-Zellen inhibieren und damit die Rate neuronaler

Differenzierung beschleunigen. Die posttranslationale Veränderung von Panx2

scheint also den Zeitpunkt mitzubestimmen, an dem Neuronenvorläuferzellen

sich zu differenzieren beginnen. In Gliomzellen könnte Panx2 außerdem als

negativer Wachstumsfaktor wirken, da die Panx2-Expression in

Genexpressionsanalysen von Lai et al. 2009 in C6 Gliom-Zellen von Ratten

12

erheblich herunterreguliert war. In vitro konnten Onkogenitätsparameter wie

Morphologie und die Zahl der Zell-Zell-Kontakte der Gliomzellen durch eine

verstärkte Panx2-Expression reduziert werden.

13

2 Zielsetzung

Pannexin1 spielt eine wichtige Rolle bei physiologischen und pathologischen

Vorgängen im Menschen wie z.B. der Regulation der Immunabwehr (Woehrle

et al., 2010a; Woehrle et al., 2010b), oder der Auslösung arrhythmogener

Aktivität im Herzen (Kienitz et al., 2010). Einblicke in die Art und Weise, wie

Pannexin1-Aktivität gesteuert wird, hat also einen bedeutenden Anteil an der

Erforschung solcher Prozesse.

Tatsächlich sind die Regulationsmechanismen von Pannexin1 bisher noch

nicht ausreichend untersucht, anders als etwa die Mechanismen

posttranslationaler Modifikation von Connexinen. Obwohl die Gap junction-

Proteinfamilien der Connexine und Pannexine keine Sequenzhomologie

aufweisen, ist ihre Sekundärstruktur gleich (Hertzberg et al., 1988; Phelan et al.,

1998a; Phelan und Starich, 2001) und sowohl Connexine, als auch Pannexin1

werden aus sechs Untereinheiten gebildet (Makowski et al., 1977; Boassa et al.,

2007). Es ist deshalb anzunehmen, dass die Kanaleigenschaften dieser beiden

Familien ähnlich reguliert werden. Während von Connexinen bekannt ist, dass

sie als Phosphoproteine eine große funktionelle Variabilität durch

Phosphorylierung erreichen können, weiß man in dieser Hinsicht noch wenig

über Pannexine (Review Sáez et al., 2003). Tatsächlich weisen die mittlere

zytoplasmatische Schleife und der C-Terminus Konsensus-Stellen für

Proteinkinasen auf, so dass man davon ausgehen kann, dass auch Pannexine

mittels Phosphorylierung in ihren Eigenschaften verändert werden können

(Barbe et al., 2006).

In vorliegender Arbeit wurde daher der Frage nachgegangen, ob Pannexin1

ebenfalls posttranslational phosphoryliert wird und welchen Einfluss diese

Modifikation auf die Zelleigenschaften hat. Zu diesem Zweck sollten potentielle

Phosphorylierungstellen in Panx1 mittels gezielter Mutagenese mutiert und mit

Hilfe eukaryoter Expressionsvektoren in N2A-Zellen transfiziert werden.

Anschließend sollten transfizierte Zellen anhand von Western Blot-Analysen,

konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und elektrophysiologischen Messungen

untersucht werden.

14

3 Material

3.1 Organismen

3.1.1 N2A-Zelllinie N2A-Zellen sind Neuroblastom-Zellen aus Mus musculus (Klebe und Ruddle,

1969). Sie wurden freundlicherweise von Dr. David Spray (Albert Einstein

College, NY, USA) zur Verfügung gestellt.

Der Umgang mit dieser Eukaryoten-Zelllinie erfolgte in einem lizensierten S1-

Labor der Abteilung für Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung der

Ruhr-Universität Bochum, Deutschland.

3.2 Vektoren Tabelle 1 enthält eine Übersicht über die in dieser Arbeit verwendeten Vektoren. Tabelle 1: Auflistung von Vektoren, die mittels in vitro Rekombination gebildet wurden.

Vektor Eingefügtes Gen

Verwendungszweck

pEGFP-N3 mPanx1 eukaryotischer Expressionsvektor für ein Fusionsprotein aus mPanx1 (N-Terminus) und EGFP (C-Terminus)

pIRES2-EGFP

mPanx1 eukaryotischer Expressionsvektor für mPanx1 und EGFP (Transkription von bicistronischer mRNA)

3.3 Medien und Lösungen

3.3.1 Zellkulturmedien und Lösungen Der Phosphatpuffer und die Trypsin-EDTA-Lösung wurden zum Passagieren

der Zellen benötigt.

Phosphatpuffer (PBS, phosphate buffered saline)

0, 138 M NaCl, 0,0028 M KCl, 0,01 M Na2HPO4, 0,0018 M KH2PO4, pH 7,4

15

3.3.2 Lösungen für die Protein-Biochemie Folgende Puffer wurden für die Gelelektrophorese und die Western Blots

benötigt:

Laemmli-Probenpuffer

2% SDS (Natriumdodecylsulfat), 10% Glycerol, 10% ß-Mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8

Laemmli-Laufpuffer

25 mM Tris-HCl pH 8,3, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, ad 1l Aqua dest.

Transferpuffer

48 mM Tris, 39 mM Glycin, 0,037% SDS, 20% Methanol, ad 1l Aqua dest.

Lysispuffer

0,25 mM Natriumdesoxycholsäure, 150 mM NaCl, 2,0 mM EDTA, 0,1 mM Na3VO4, 10 mM NaF, 1 mM PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid), 1% Triton X 100, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4

3.3.3 Lösungen für die Elektrophysiologie ACSF (artifizielle cerebrospinale Flüssigkeit)

Die ACSF wurde zur Perfusion der N2A-Zellen während der

elektrophysiologischen Messungen verwendet.

Zunächst wurden 25 ml der Lösung A mit Aqua dest. auf 437,5 ml aufgefüllt und

10 min mit Carbogen (95% O2; 5% CO2) begast. Anschließend wurden 25 ml

der Lösung B hinzugegeben, es folgten weitere 10 min Carbogen-Begasung,

um den pH-Wert einzustellen. Die Carbogen-Begasung der Lösung wurde

Trypsin-EDTA-Lösung (PAA)

0,05% Trypsin, 0,02% EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure)

N2A-Kulturmedium Das N2A-Medium diente zur Kultivierung der N2A-Zellen. D-MEM (4,5 g/l Glucose, +L-Glutamin, +Pyruvat;

Gibco, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) + 5% FCS (fetales Kälberserum) + 1% L-Glutamin + 1% Penicillin/Streptomycin + 1% NEA (nicht essentielle Aminosäuren) + 1% Na+-Pyruvat

16

während der Perfusion der Zellen fortgesetzt um den pH-Wert konstant zu

halten und die Zellen mit Sauerstoff zu versorgen.

Lösung A 2,438 M NaCl, 0,049 M KCl, 0,039 M CaCl2, 0,025 M MgCl2, 0,024 M NaH2PO4, 0,244 M D-Glukose, 0,0078 M L-Ascorbat

Lösung B

0,488 M NaHCO3

Pipettenlösung Die Patch-Pipetten wurden mit folgender Pipettenlösung (Pelegrin et al., 2006)

gefüllt:

Stammlösung

0,147 M NaCl, 0,01 M HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure), 0,003 M MgCl2

Für die Messungen wurde 1 ml dieser Stammlösung in 10 ml Aqua dest. gelöst

und mit 0,038 g EGTA (Ethylenglycoltetraessigsäure) versetzt. Der pH-Wert

wurde anschließend mit KOH auf 7,3 eingestellt.

Pharmaka Carbenoxolon (3ß-Hydroxy-11-oxoolean-12-en-30-oic acid 3-hemisuccinate

disodium) ist ein Derivat der Glycyrrhizinsäure und wurde in einer Konzentration

von 20 µM als Kanal-Blocker eingesetzt.

3.4 Chemikalien und Antikörper

3.4.1 Chemikalien Acrylamid (AppliChem, Darmstadt, Deutschland), Ammoniumpersulfat (APS;

Sigma, Taufkirchen, Deutschland), Blocking Reagenz (Roche, Mannheim,

Deutschland), Calziumchlorid (J.T. Baker), Carbenoxolon (Sigma; MP

Biomedicals, Solon, OH, USA), D-Glukose (J.T. Baker, Freising, Deutschland),

Dinatriumhydrogenphosphat (J.T. Baker), Dulbecco´s modifiziertes Eagle

Medium (D-MEM; Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland), Effectene Transfection

Reagent Kit (Qiagen; Hilden, Deutschland), Ethylendiamintetraessigsäure

(EDTA, Titriplex III; Merck, Darmstadt, Deutschland),

Ethylenglycoltetraessigsäure (EGTA;), fetales Kälberserum (FCS; BiochromKG,

17

Berlin, Germany), Glukose (J.T. Baker), Glycin (AppliChem), Glycerin (J.T.

Baker), Hoechst 33342 (Invitrogen), Kaliumchlorid (Merck),

Kaliumdihydrogenphosphat (J.T. Baker), Kaliumhydroxid, L-Ascorbat, L-

Glutamin (PAA, Cölbe, Deutschland), Magnesiumchlorid (J.T. Baker), ß-

Mercaptoethanol (Sigma), Methanol (J.T. Baker), Natriumchlorid (J.T. Baker),

Natriumdodecylsulfat (SDS; AppliChem), Natriumdihydrogencarbonat (J.T.

Baker), Natrium-Pyruvat (PAA), Nicht essentielle Aminosäuren (NEA; PAA),

Odyssey Blocking Puffer (Licor Biosciences, Lincoln, NE, USA), Penicillin (PAA),

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF; Sigma), Penicillin/Streptomycin (PAA),

Tetramethylethylendiamin (TEMED; AppliChem), Tris(hydroxymethyl)-

aminomethan (Tris; AppliChem), Trypsin-EDTA (PAA), Tween20 (AppliChem)

3.4.2 Antikörper Tabelle 2 enthält eine Übersicht über die in dieser Arbeit für die Western Blots

verwendeten Erstantikörper. Tabelle 2: Liste der Erstantikörper für die Western Blots.

Name Spezies Hersteller Spezifität β-Actin (clone AC-15)

Maus Sigma β-Actin

Panx1 4515 Huhn Aves Labs (Tigard, OR, USA); freundliche Spende von Gerhard Dahl

mPanx1

Living Colors A.v. Peptide Antibody

Kaninchen Clontech EGFP, ECFP, EYFP

Die Zweitantikörper für die Western Blots sind in Tabelle 3 aufgelistet. Tabelle 3: Liste der Zweitantikörper für die Western Blots.

Name Spezies Hersteller

anti-chicken Cy 5.5 Ziege abcam

anti-mouse IRDye 800 Ziege Licor Biosciences

anti-rabbit IRDye 680 Ziege Licor Biosciences

3.4.3 Verwendete Kits Transfektion Effectene Transfection Reagent Kit

(Qiagen; Hilden, Deutschland)

18

3.5 Geräte

3.5.1 Apparaturen für die Zellkultur Inkubator Hera-cell (Heraeus, Hanau,

Deutschland)

Sterilbank LaminAir 1.2 (Heto-Holten, Allerød, Dänemark)

3.5.2 Apparaturen für die Protein-Biochemie Blotting-Kammer Trans-Blot SD Semi-dry Transfer Cell

(BioRad, Hercules, CA, USA)

Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

PerfectBlueTM Vertikales Doppelgelsystem Twin ExWs (peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, Deutschland)

Nitrozellulosemembran Hybond-ECL Nitrozellulosemembran (Amersham Biosciences, GE Healthcare, Buckinghamshire, GB)

Infrarot Western Blot Detektor System Odyssey Infrared Imaging System (Licor Biosciences)

3.5.3 Apparatur für die Konfokalmikroskopie Konfokales Laser Scanning Mikroskop LSM510-Meta (Zeiss)

3.5.4 Apparaturen für die Elektrophysiologie Fluoreszenz-Mikroskop Axioskop (Zeiss, Göttingen,

Deutschland)

Messpipetten Glass Capillary Tubing (1,5-1,1 mm, Typ G75150T-4, Warner-Instrument Corporation, Hamden, CT, USA)

Vertikalpuller PIP5 Vertikalpuller (HEKA, Lambrecht, Deutschland)

Verstärker Axopatch 200B (Axon Instruments, Forster City, CA, USA)

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Frequenzfilter Humbug 50/60 Hz Noise Eliminator

(Quest Scientific, North Vancouver, BC, Kanada)

AD/DA-Wandler CV 203 BU AD/DA-Wandler (Axon Instruments)

Software WinWCP Software (Strathclyde Institut für Pharmazie und Biomedizinische Wissenschaften, Universität Strathclyde, GB) SigmaStat (SysStat Software GmbH, San José, CA, USA)

20

4 Methoden

4.1 Zellkultur Die N2A-Zellen wurden bei 37°C und 5% CO2 in N2A-Kulturmedium in 10 cm

Ø-Kulturschalen in einem CO2-Inkubator kultiviert. Alle zwei bis drei Tage

wurden sie passagiert. Hierzu wurden die Zellen zunächst mit 5 ml PBS

gewaschen und anschließend in 1,5 ml Trypsin-EDTA für 5 min bei 37°C im

Wärmeschrank inkubiert. Mit Hilfe von N2A-Medium konnten die Zellen dann

suspendiert und vereinzelt werden. Die Zellen wurden für 5 min bei 200 g

zentrifugiert und anschließend in 5 ml Medium resuspendiert. 0,3 ml (dies

entspricht etwa 1,5x106 Zellen) dieser Suspension wurden dann zu 10 ml

Kulturmedium hinzugefügt und in 10 cm Ø-Kulturschalen ausgesät.

4.2 Transfektion Die transiente Transfektion der N2A-Zellen wurde mittels des Effectene

Transfection Reagent Kits (Qiagen) den Herstellerangaben folgend

durchgeführt. Für die elektrophysiologischen Versuche wurden 15 000 Zellen

auf poly-(L)-Lysin-beschichteten Deckgläschen ausgesät. Für die Herstellung

von Proteinextrakten wurden je 30 000 Zellen pro well in 24-well Platten in N2A-

Kulturmedium inkubiert. Am nächsten Tag wurde die transiente Transfektion mit

200-400 ng Plasmid-DNA durchgeführt. Weitere 24 Stunden später wurde das

Medium gewechselt, um zytotoxische Effekte der Transfektions-Reagenzien zu

minimieren.

4.3 Vektoren N2A-Zellen wurden mit zwei verschiedenen eukaryotischen

Expressionsvektoren transfiziert. Zum einen wurde der pIRES2-EGFP-mPanx1-

Vektor eingesetzt. Er enthält ein Expressionskassette zur bicistronischen

Expression der beiden Proteine mPanx1 (Pannexin 1 (Maus)) und EGFP

21

(enhanced green fluorescent protein). Zum andern wurde der pEGFP-N3-

mPanx1-Vektor genutzt der eine Expressionskassette beinhaltet die für ein

Fusionsprotein aus mPanx1 und C-terminal lokalisiertem EGFP kodiert.

4.4 Seitenspezifische Mutagenese Die seitenspezifische Mutagenese basiert auf einer von Carter im Jahr 1987

entwickelten Methode. Zur Untersuchung der Funktion möglicher

Phosphorylierungsstellen wurden mit Hilfe gezielter Mutagenese diejenigen

Aminosäuren im mPanx1 mutiert, die laut NetPhos 2.0 Server

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) einen Vorhersagewert von größer 0,5

hatten. Tabelle 4: Oligonukleotide für die seitenspezifische Mutagenese. Die mutierten Nukleotide sind mit fett gedruckten Großbuchstaben markiert. Die Sequenz ist in 5´ 3´Richtung angegeben.

Name DNA-Sequenz [5´- 3´] Aminosäure-Sequenz

Vorher-sagewert

mPanx1-Y10F ccacggagtTtgtgttctcgg LATEYVFSD 0,718 mPanx1-Y192F

ccacttcaagtTcccaatcgtgg SHFKYPIVE 0,663

mPanx1-Y324F

gtctgaaggctTcaatgacttgagcc KSEGYNDLS 0,941

mPanx1-T387A

cgtccctacagGccaagggagagg TSLQTKGED 0,780

mPanx1-S159A

ggctgccaagGCtgctcgagatttgg KAAKSARDL 0,998

mPanx1-S206A

caaaaaagaactctGCtcatttaatcatg KKNSSHLIM 0,728

mPanx1-S328A

ggctacaatgacttgGCcctctacaacc YNDLSLYNL 0,580

mPanx1-S343A

gtgagctcaaaGcgtacaagtgtctg SELKSYKCL 0,996

mPanx1-S405A

gatttggacctgAGcagcgaggctgc DLDLSSEAA 0,981

Die Plasmide mit der mutierten Pannexin-DNA wurden freundlicherweise von

Dr. Stefanie Bunse, Abteilung für Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung

der Ruhr-Universität Bochum, Deutschland, produziert und zur Verfügung

gestellt.

22

4.5 Gelelektrophorese von Gesamtproteinextrakt Mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese (SDS-PAGE) konnten

Proteine aus Proteinextrakten nach der von Laemmli 1970 eingeführten

Methode nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt werden (Laemmli, 1970).

Hierzu wurde das PerfectBlue vertikale Doppelgelsystem verwendet. Zur Lyse

von 30 000 transfizierten Zellen wurden 100 µl Lysispuffer auf die Zellen

gegeben. Anschließend wurde das Lysat bei 4°C und 13000 rpm für 5 min

zentrifugiert. Dann wurden 10 µl des Lysats mit 2,5 µl Laemmli-Probenpuffer

vermischt, für 5 min bei 95°C denaturiert und anschließend auf das Gel

aufgetragen. Die Gelelektrophorese wurde bei 30-40 mA durchgeführt. Um eine

Überhitzung des Gels zu vermeiden wurde eine Wasserkühlung (15°C)

angeschlossen.

Folgende Komponenten wurden benötigt:

Trenngel

8-10% Acrylamid, 380 mM Tris-HCl (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan), pH 8,8, 0,1% SDS, 0,08% TEMED (Tetramethylethylendiamin), 0,08% APS (Ammoniumpersulfat)

Kammgel

5% Acrylamid, 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1% SDS, 0,08% TEMED, 0,15% APS

4.6 Western Blot Im Anschluss an die elektrophoretische Auftrennung der Proteine nach ihrem

Molekulargewicht wurden die Proteine auf eine Nitrozellulosemembran

übertragen. Dazu wurden vier Transferpuffer-getränkte Whatmann Papiere in

die Blotting-Kammer gelegt und darauf die Nitrozellulosemembran und das

SDS-Gel platziert. Darauf folgten zwei weitere puffergetränkte Whatmann

Papiere. Der Proteintransfer erfolgte dann bei 250 mA für 1 h. Anschließend

wurde die Nitrozellulosemembran dreimal für jeweils 10 min mit PBS

gewaschen, bevor unspezifische Bindung der Antikörper an die

Nitrozellulosemembran mittels Odyssey Blocking Reagenz blockiert wurde (1 h

bei Raumtemperatur). Anschließend wurde der Erstantikörper zugegeben und

die Membran wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Am zweiten Tag wurden alle

23

ungebundenen Antikörper entfernt in dem die Membran dreimal für jeweils 10

min mit PBS-Tween 0,1% gewaschen wurde. Im Anschluss wurde die Membran

mit Zweitantikörper, verdünnt mit der Odyssey Blocking Reagenz, für 1 h bei

Raumtemperatur unter Lichtabschluss inkubiert. Die Membran wurde dann

dreimal für jeweils 10 min mit PBS gewaschen, um die ungebundenen

Zweitantikörper zu entfernen. Mit Hilfe des Odyssey Infrarot Imaging Systems

konnten die Signale dann detektiert und dokumentiert werden.

4.7 Konfokalmikroskopie Die Analyse konfokaler Bilder wurde mit dem LSM 510-Meta System

durchgeführt. Dieses war mit Argon- und Helium-Neon-Lasern, einer Laser-

Diode (Emissionswellenlänge: 405 nm), einem 40x (NA 1,4) und einem 63x (NA

1,4) Ölobjektiv und der LSM 510-Meta Software ausgestattet. Die Aufnahmen

wurden im „single track“-, „multi track“-, oder „online fingerprinting“-Modus

durchgeführt. Die Bilder konnten dann mit 1024x1024 Pixeln gespeichert und

als TIFF-Datei in AdobePhotoShop exportiert und bearbeitet werden.

4.8 Elektrophysiologie

4.8.1 Elektrophysiologie in transfizierten N2A-Zellen Alle Messungen wurden mittels der Patch-Clamp-Technik als

Ganzzellableitungen gemäß der von Neher und Sakmann (1976) entwickelten

Methode durchgeführt.

Die mit transfizierten N2A-Zellen bedeckten Deckgläschen wurden in die

Messkammer eingelegt, die bei einer Flussgeschwindigkeit von 2 ml/min

kontinuierlich mit ACSF durchspült wurde. Mittels dieses Zulaufs konnte

außerdem der Hemikanalblocker Carbenoxolon Bad-appliziert werden.

Messpipetten aus Borosilikatglas wurden mit einem Vertikalpuller so hergestellt,

dass sie nach Füllen mit der Pipettenlösung Impedanzen zwischen 6 und 9 MΩ

aufwiesen. Mit Hilfe des Fluoreszenz-Mikroskops wurden unter visueller

Kontrolle grün (EGFP) fluoreszierende und damit transfizierte Zellen

ausgewählt. Unter Durchlichtbeleuchtung konnten die ausgewählten Zellen

24

anschließend in die Ganzzellkonfiguration gebracht und über die Membran

fließende Ströme gemessen werden.

Als Hauptverstärker wurde der Axopatch 200B eingesetzt, mit Hilfe eines

zusätzlichen Frequenzfilters konnten zudem weitere Störsignale gefiltert werden.

Die verstärkten und gefilterten analogen Messdaten wurden über den AD/DA-

Wandler digitalisiert und zum Computer übertragen. Sie konnten hier mit der

Software „Win WCP“ sichtbar gemacht und für die spätere Analyse gespeichert

werden.

Zur Charakterisierung elektrophysiologischer Eigenschaften der abgeleiteten

Zellen wurden zunächst Strom-Spannungskurven (IV-Kurven) aufgenommen.

Dazu wurde das Membranpotential der Zelle auf -30 mV geklemmt und dann

Spannungssprünge zwischen -50 mV und +60 mV in 10 mV Schritten ausgelöst.

Die Spannungssprünge hatten dabei eine Dauer von 500 ms. Außerdem

wurden 200 ms dauernde, kontinuierlich ansteigende Stromrampen verwendet,

wobei die Zellen von -100 mV bis +80 mV depolarisiert wurden. Für jede Zelle

wurden zunächst abwechselnd je zwei IV-Kurven und Stromantworten auf die

Stromrampen unter Kontrollbedingungen in Anwesenheit normaler ACSF

gemessen, bevor eine kontinuierliche Bad-Applikation von Carbenoxolon für 8

min erfolgte. Um den Cbx-Effekt verfolgen zu können, wurde während der

Applikation alle 2 min je eine IV-Kurve und die Antwort auf eine

Spannungsrampe aufgenommen. Dabei wurden nicht nur die

elektrophysiologischen Parameter der abgeleiteten Zellen mit mutierten

Hemikanäle bestimmt, sondern zur Kontrolle auch die Eigenschaften von Zellen,

die entweder nur das EGF-Protein enthielten, oder EGFP-mPx1 transfiziert

waren.

Abgeleitete Zellen konnten außerdem mit Hilfe einer Mikroskopkamera

fotografiert und ihre Morphologie anschließend verglichen werden.

4.8.2 Analyse elektrophysiologischer Daten Zur späteren Charakterisierung der elektrophysiologischen Parameter

abgeleiteter Zellen wurde der maximal über die Zellen fließende Strom bei

Verwendung der Spannungsrampe bzw. aus den IV-Kurven vor und während

Cbx-Applikation bestimmt. Hieraus konnte der Cbx-Effekt in % errechnet

werden. Zellen, die eine prozentuale Abnahme der Maximal-Amplitude unter

25

Cbx von weniger als 20% gegenüber dem Kontrollwert in normaler ACSF

aufwiesen, wurden in die Auswertung nicht einbezogen. Dies geschah unter der

Annahme, dass solche Zellen keine ausreichende Expression der Pannexin1-

Kanäle aufwiesen. Dieses Auswahlkriterium wurde nicht auf die pEGFP-N3-

transfizierten Kontrollzellen, sowie auf die pIRES2-EGFP-transfizierten

Kontrollzellen angewendet, da diese Zellen keine Kanalproteine exprimieren

konnten. Folglich musste hier jeder vermeintliche Cbx-Effekt auf physiologische

oder pathologische Schwankungen der Membranleitfähigkeiten unabhängig von

Pannexin1-Kanälen zurückzuführen sein.

Außerdem wurde zur Beurteilung der Spannungsabhängigkeit der

Membranleitfähigkeit der so genannte „S-Index“ ermittelt. Hierzu wurde

zunächst die Steigung der IV-Kurve zwischen den ersten beiden

Spannungssprüngen von -60 bis -50 mV (sneg) und zwischen den letzten beiden

Spannungssprüngen von +50 bis +60 mV (spos) bestimmt. Der S-Index wurde

dann mittels folgender Gleichung berechnet:

𝑆 =𝑠!"# −  𝑠!"#  𝑠!"# +  𝑠!"#

Die ersten beiden Messwerte unter Kontrollbedingungen und die Messungen

nach vier, sechs und acht Minuten Carbenoxolon-Applikation wurden jeweils

vor Berechnung des Maximalstroms, bzw. des S-Index gemittelt.

Statistische Signifikanz zwischen den verschiedenen Versuchsgruppen wurde

unter Verwendung der Statistiksoftware SigmaStat mit Hilfe des Student´s T-

Test, des Mann-Whitney Rangsummentests, des „paired t-tests“ oder des

„signed rank tests“ bestimmt.

26

5 Ergebnisse

Aus Experimenten zur Regulation von Connexinen weiß man, dass diese im

Laufe ihres Lebenszyklusses vielfach posttranslational modifiziert werden. Viele

Connexine sind Phosphoproteine und die Phosphorylierung von Connexinen ist

ein wichtiges Mittel zur Regulation biologischer Prozesse in Zellen als

Anpassungsmechanismus an veränderte Umweltbedingungen (siehe Review

Solan und Lampe, 2009). Es ist anzunehmen, dass auch Pannexine

posttranslational modifiziert werden. Da sowohl der N- und C-Terminus, als

auch die intrazelluläre Schleife konservierte Konsensusstellen für Kinasen

aufweisen, ist es sehr wahrscheinlich, dass Pannexine ebenfalls

posttranslational phosphoryliert werden (Barbe et al., 2006). Mit Hilfe gezielter

Mutagenese wurden für diese Arbeit potentielle Phosphorylierungsstellen in

mPanx1 mutiert. Alle mutierten Aminosäuren hatten dabei laut NetPhos2.0

Server einen Vorhersagewert von grösser 0,5. Das Panx1 wurde an insgesamt

neun Stellen genetisch verändert: Drei Tyrosine wurden zu Phenylalanin (Y10F,

Y192F und Y324F), ein Threonin zu Alanin (T387A) und fünf Serine zu Alanin

(S159A, S206A, S328A, S343A und S405A) mutiert, dabei wurde pro Plasmid

nur eine Mutation eingebracht.

Abbildung 3: Lokalisation potentieller Phosphorylierungsstellen. In der Grafik ist die Struktur des Panx1 schematisch dargestellt. Alle potentiellen Phosphorylierungsstellen sind farbig markiert und liegen intrazellulär. In Rot sind Tyrosine, in Blau Serine und in Gelb ein Threonin hervorgehoben. (Grafik freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Helga Schulze).

27

5.1 Expressionsanalyse Zum Nachweis der Expression von mPanx1 in transfizierten N2A-Zellen wurde

ein Western Blot durchgeführt. Mit Hilfe spezifischer Erst- und Zweitantikörper

konnten so die mPanx1-Proteine markiert und mittels Odyssey Infrarot Imaging

System dargestellt werden. Für alle Versuche wurden N2A-Zellen entweder mit

dem pIRES2-EGFP- oder dem pEGFP-N3-Vektor transfiziert, die jeweils für den

Panx1 Wildtyp (wt), oder eine der neun Mutanten kodierten. Außerdem wurde

zur Kontrolle jeweils nur der leere Vektor ohne Information für den Panx1-Kanal

transfiziert. Der pIRES2-EGFP-mPanx1-Vektor ermöglicht eine bicistronische

Expression der Proteine mPanx1 und EGFP, und der pEGFP-N3-mPanx1-

Vektor die Expression von Fusionsproteinen aus mPanx1 und C-terminal

lokalisiertem EGFP. Zusätzlich wurden auch nicht transfizierte Zellen eingesetzt

(nt). Zur Kontrolle der aufgetragenen Proteinmenge wurde das β-Aktin aus den

Proben ebenfalls Antikörper gefärbt.

In Abbildung 4 sind die Western Blots gezeigt, dabei ist in Grafik 4 A der

Western Blot der Proteinlysate von den N2A-Zellen, die mit dem pIRES2-

EGFP-Vektor transfiziert waren und in B der Western Blot der Lysate von den

Zellen, die pEGFP-N3 transfiziert waren abgebildet. Grundlegende

Unterschiede waren zwischen den beiden eingesetzten Vektoren aus den

Western Blots nicht zu erkennen. In beiden Western Blots waren für die nicht

transfizierten Kontrollen und die mit dem leeren Vektor transfizierten Zellen

keine spezifischen Banden zu erkennen, damit war in diesen Zellen kein Panx1

nachweisbar. Anhand der Aktinbande ließ sich für alle aufgetragenen Proben

nachweisen, dass Protein aufgebracht wurde. In beiden Blots zeigten die

meisten Mutanten und der Wildtyp außerdem zwischen 36 und 55 kDa bei den

mit dem pIRES2-EGFP-Vektor-transfizierten Zellen und zwischen 55 und 95

kDa bei den mit dem pEGFP-N3-Vektor-transfizierten Zellen, das von Boassa et

al. (2007) als „multiple band pattern“ beschriebene Muster aus Mehrfachbanden,

das für Panx1 typisch ist. Die oberen beiden Banden repräsentierten dabei die

glykosylierten Formen, die untere die nicht glykosylierte Form des Panx1-

Proteins. Die oberste Bande, die die voll glykosylierte Form des Panx1-Proteins

kennzeichnete, wies dabei auf eine Lokalisation von Panx1 in der

Plasmamembran bei den meisten Mutanten (Panx1-Y192F, Y324F, S206

28

Abbildung 4: Expressionsanalyse von mPanx1-Mutanten mit modifizierten potentiellen Phosphorylierungsstellen in N2A-Zellen. (A) Western Blot-Analyse transfizierter N2A-Zellen. Zur Expression der verschiedenen Mutanten wurde hier der Vektor pIRES-EGFP genutzt. Zur Kontrolle dienten Panx1 (wt) sowie nicht transfizierte Zellen (nt). (B) Western Blot-Analyse transfizierter N2A-Zellen. Zur Expression der verschiedenen Mutanten wurde hier der Vektor pEGFP-N3 verwendet. Als Kontrolle dienten Panx1 (wt) sowie pEGFP transfizierte Zellen (pEGFP-N3). Die Panx1-typischen Mehrfachbanden („multiple band pattern“), die verschiedenen Glykosilierungsstufen entsprechen, waren bei den meisten Mutanten und dem wt zu erkennen.

S328A) und den Panx1 wt exprimierenden Zellen hin. Dass dieses „multiple

band pattern“ bei den pEGFP-transfizierten Zellen zwischen 55 und 95 kDa

gelagert war, und nicht zwischen 36 und 55 kDa, war auf die größere Masse

des Fusionsproteins aus mPanx1 am N-Terminus und EGFP am C-Terminus

zurückzuführen. Für einige Mutanten waren keine, bzw. nur schwache Banden

zu erkennen, so z.B. für die Panx1-Y10F-Mutante, die S343A- und die S405A-

Mutante. Bei den pEGFP-N3-Vektor-transfizierten Zellen war zudem kein Signal

für die T387A-Mutante abzulesen und bei den pIRES2-EGFP-Vektor-

transfizierten Zellen nur ein sehr schwaches für die S159A-Mutante. Allein aus

den Western Blots ist nicht unterscheidbar, ob hier insgesamt ein niedrigeres

Expressionslevel des Kanals vorlag, oder ob der Transport des Kanals zur

Membran gestört war. Deshalb wurden zusätzlich von transfizierten Zellkulturen

mit dem Konfokalmikroskop Fluoreszenzmikrofotografien aufgenommen.

29

5.2 Zelluläres Verteilungsmuster und Überlebenszeit Um das zelluläre Verteilungsmuster der Pannexin-Kanäle in den Mutanten im

Vergleich zu den Panx1 wt exprimierenden Zellen bestimmen zu können,

wurden die N2A-Zellen, wie oben beschrieben, mit dem pEGFP-N3-Vektor, der

für die unterschiedlichen Mutanten bzw. mPanx1 als Kontrolle kodierte,

transfiziert und 48 h, bzw. 96 h nach der Transfektion mit dem

Konfokalmikroskop (Abbildung 5) dargestellt. In der Abbildung 5 ist außerdem

zu erkennen, wie überlebensfähig die Panx1-Mutanten exprimierenden Zellen

im Vergleich zu den Panx1 wt exprimierenden Zellen waren.

Abbildung 5: Zelluläres Verteilungsmuster von mPanx1 und Überlebenszeit von mPanx1-Mutanten mit modifizierten potentiellen Phosphorylierungsstellen in N2A-Zellen. N2A-Zellen wurden mit pEGFP-N3-mPanx1 für den Wildtyp, und für die Mutanten transfiziert. 48 h, bzw. 96 h nach der Transfektion wurden die Zellen immunzytochemisch gefärbt und mikroskopisch analysiert. Die Kerne wurden mit Hoechst 33342 gefärbt (rot). Ausser bei der mPanx1-Y10F-Mutante, war das pEGFP-mPanx1-Protein in der Membran der Zellen lokalisiert. Die mPanx1-Y10F- und -S343A-Mutanten zeigten eine verminderte Überlebenszeit, da nach 96h überwiegend nicht-transfizierte Zellen gefunden werden konnten. Die verschiedenen Mutanten wiesen eine unterschiedliche Zellgrösse auf, die sich jedoch auf die physiologischen Eigenschaften nicht auswirkte. Balken = 10 µm (Grafik erstellt mit freundlicher Unterstützung von S. Bunse).

30

Schon 48 h nach der Transfektion war die Lokalisation des pEGFP-Panx1-

Proteins an der Zelloberfläche (pEGFP-N3-mPanx1-wt, -Y192F, Y324F, S159A,

S206A, S328A, S343A, S405A) zu erkennen. Das Y10F- und T387A-Panx1-

Protein war hingegen nicht in der Zellmembran nachzuweisen. Eine Ursache

hierfür könnte eine Störung des Transports des Panx1-Proteins zur Membran

sein oder es könnte insgesamt eine niedrigere Expressionsrate vorliegen. Nach

96 h war im Vergleich zu den Panx1 wt exprimierenden Zellen und auch zu den

anderen Mutanten die Gesamtzahl der pEGFP-N3-Y10F und -S343A

transfizierten Zellen geringer. Da bei der Y10F-, und auch bei der S343A-

Mutante, folglich die Überlebensfähigkeit der Zellen herabgesetzt war, ist eine

andere Erklärung für die geringe Menge Panx1-Protein in der Zellmembran

wahrscheinlicher. Alle Zellen, die das Panx1-Y10F-Protein stark exprimierten

waren vermutlich zum Zeitpunkt der Aufnahme schon abgestorben so dass nur

schwach exprimierenden Zellen, die wenig Panx1-Protein gebildet hatten, in

den Bildern zu erkennen waren. Zusätzlich war die Fluoreszenzintensität bei

der S405A-Mutante stärker als beim Wildtyp.

Oben beschriebene Versuche bestätigen, dass von einer Membranständigkeit

des mPanx1-wt-Proteins und der mutierten Varianten in den transfizierten N2A-

Zellen ausgegangen werden konnte und damit dieses Expressionssystem für

elektrophysiologische Untersuchungen der Phosphorylierungsmutanten in N2A-

Zellen verwendet werden konnte.

5.3 Elektrophysiologie in N2A-Zellen Mittels Western Blot-Analysen und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie konnten

eindeutige Hinweise darauf gewonnen werden, dass mit den

Expressionsvektoren für Panx1 und die mutierten Varianten transfizierte N2A-

Zellen potentiell überlebensfähig waren und Pannexin-Kanäle ausbildeten.

Bisher konnte kein Unterschied zwischen Zellen, die mit dem pEGFP-N3-Vektor

und solchen, die mit dem pIRES2-EGFP-Vektor transfiziert waren, festgestellt

werden.

Um die elektrophysiologischen Eigenschaften der Panx1-Mutanten im Vergleich

zum Panx1 wt untersuchen zu können, wurden die Expressionsvektoren in

N2A-Zellen transfiziert. Die GFP-Fluoreszenz konnte in den Ableitexperimenten

31

als Marker für erfolgreich transfizierte N2A-Zellen genutzt werden. Von solchen

grün fluoreszierenden Zellen wurden zunächst Strom-Spannungskurven, im

Folgenden mit „IV-Kurven“ bezeichnet, mittels Ganzzellableitungen

aufgenommen. Die Zellen wurden dafür auf ein Membranpotential von -30 mV

geklemmt. Dann wurde das Membranpotential in Spannungssprüngen mit einer

Dauer von 250 ms von zunächst -50 mV in 10 mV-Schritten stufenweise auf

+60 mV geändert. Zusätzlich wurden Stromverläufe bei kontinuierlich

ansteigendem Haltepotential über eine Dauer von 200 ms aufgenommen und

die Zellen dabei von -100 mV auf + 80 mV depolarisiert. Diese Stromverläufe

werden im Folgenden mit „Rampe“ bezeichnet. Jeweils im Anschluss wurde der

Ionenkanal-Blocker Carbenoxolon Bad-appliziert und sein Einfluss auf die

abgeleiteten Ganzzellströme während der Messung der IV-Kurven und der

linearen Spannungsverläufe bestimmt.

5.3.1 Vergleich der Untersuchungsmethoden IV-Kurve und Rampe Zur Bestimmung der elektrophysiologischen Eigenschaften von transfizierten

N2A-Zellen wurden bei den Ganzzellableitungen sowohl IV-Kurven als auch

Strom-“Rampen“ aufgezeichnet. Mit Hilfe der IV-Kurven kann der maximal über

die Zelle fließende Strom und die Spannungsabhängigkeit der Leitfähigkeit

gemessen werden. Unter Verwendung der Stromrampen kann dagegen besser

die Öffnungskinetik der Kanäle bestimmt werden.

Es stellte sich die Frage, welches Stimulationsprotokoll besser zur Analyse der

Zelleigenschaften transfizierter N2A-Zellen geeignet ist. In der statistischen

Auswertung aller Einzelzelldaten zeigte sich, dass für die Werte aus den

Stromrampen genauso häufig signifikante Unterschiede zwischen den Panx1-

Mutanten und den Panx1 wt exprimierenden Zellen festzustellen waren, wie für

die Werte aus den IV-Kurven (s. Tabelle A 2 im Anhang). Ein Vergleich der

Maximalströme, gemessen in den IV-Kurven und Rampen, ist in Abbildung 6

grafisch dargestellt.

Die Maximalströme zeigten für die Messungen in den IV-Kurven und Rampen

gleiche Tendenzen. So war der Maximalstrom der Zellen, die nur mit dem

Vektor transfiziert wurden („vector only“, vo), sowohl in den IV-Kurven, als auch

in den Rampen, signifikant kleiner als in den Panx1 wt exprimierenden Zellen

32

Abbildung 6: Vergleich der Stimulationsprotokolle „IV-Kurven“ und „Rampen“ anhand der maximal ausgelösten Membranströme, gemessen in transfizierten N2A-Zellen. Dargestellt sind Ströme der EGFP-transfizierten Zellen als Kontrolle (vo, „vector only“), der mPanx1 Wildtyp-transfizierten Zellen (wt), und der Mutanten. Für die Abbildung wurden die Werte aus den Messungen aller Zellen gemittelt, die mit dem pIRES2-EGFP-Vektor, bzw. dem pEGFP-N3-Vektor transfiziert waren. (Hellgraue Balken) Mittels Ganzzellableitungen wurden IV-Kurven von N2A-Zellen gemessen. Die Zellen wurden dazu auf -30 mV geklemmt und in Spannungssprüngen von jeweils +10 mV wurde das Membranpotential von -50 mV auf +60 mV angehoben. (Schwarze Balken) Messung von Rampen in N2A-Zellen mittels Ganzzellableitungen. Über die Dauer von 200 ms wurden Zellströme auf eine kontinuierlich von -100 mV bis +80 mV ansteigende, Spannungsrampe gemessen. Für die IV-Kurven und Rampen zeigten die Maximalströme gleiche Tendenzen. Anzahl der Zellen: vo 24; Panx1-wt 17; Panx1-Y192F 12; Y324F 10; T387A 7; S159A 13; S206A 12; S328A 17; S343A 9; S405A 13. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001.

(P = 0,001 für die IV-Kurven, bzw. P = 0,003 für die Rampen). Ausserdem

waren für beide Stimulationsprotokolle die Ströme der Panx1-Y342F (P = 0,022

für die IV-Kurven; P = 0,023 für die Rampen), der Panx1-S328A (P = 0,005; P =

0,010 im Rangsummentest) und der Panx1-S343A-Zellen (P < 0,001)

signifikant grösser, als in den Panx1 wt exprimierenden Zellen.

Da die Zellen bei den Messungen für die Bestimmung der IV-Kurven über

längere Zeit auf einem konstanten Membranpotential gehalten werden, und sich

somit ein „steady-state“-Zustand einstellt, lassen sich mit dieser Messmethode

die Amplituden der ausgelösten Ströme zuverlässiger bestimmen. Dies erlaubt

eine verlässlichere Analyse der Spannungsabhängigkeit der exprimierten

Panx1-Kanäle und der Einflüsse von Blockern, insbesondere bei der

Untersuchung der Panx1-Mutanten auf mögliche Veränderungen infolge

geänderter Phosphorylierung. Deshalb sind in die folgenden quantitativen

Auswertungen nur die Ergebnisse aus den Messungen der IV-Kurven

eingegangen.

33

5.3.2 Einfluss der Vektoren pEGFP-N3 und pIRES2-EGFP auf die Zelleigenschaften

Die elektrophysiologischen Messungen wurden zunächst mit N2A-Zellen

durchgeführt, die mit dem pEGFP-N3-Vektor transfiziert waren. In diesen

Versuchen enthielt jede fluoreszierende Zelle Fusionsproteine aus Panx1 und

EGFP. Da nicht ausgeschlossen werden konnte, dass bei der Verwendung des

Fusionsproteins die Funktion des Pannexins durch das EGF-Protein beeinflusst

wurde, wurden die Versuche zusätzlich mit dem pIRES2-EGFP-Vektor

wiederholt. Dieser Vektor kodiert für ein bicistronisches mRNA-Transkript,

anhand dessen die Proteine Panx1 und EGFP separat von einander translatiert

werden. So konnte ein möglicher Einfluss des EGFP auf die Funktion des

Panx1 ausgeschlossen werden. Um einen möglichen Einfluss der verwendeten

Vektoren auf die Zelleigenschaften zu untersuchen, wurden die Ergebnisse aus

den Messungen der pIRES2-EGFP-mPanx1-wt-Zellen mit Hilfe des Student´s

T-Tests mit den Ergebnissen aus den Messungen der pEGFP-N3-mPanx1-wt-

Zellen verglichen. Die Ergebnisse aus den Messungen der nur mit den

verschiedenen Vektoren transfizierten Zellen wurden auf die gleiche Weise

statistisch gegenüber gestellt (s. Tabelle A 1 Anhang). Für die nur mit dem

Vektor transfizierten Zellen konnte für zwei Messparameter ein signifikanter

Unterschied zwischen den Vektoren festgestellt werden, zum einen für die

Maximalströme der Rampen (P = 0,009) und zum anderen für den Cbx-Effekt

auf den S-Index (P = 0,003), berechnet aus den Rampen. Dieser Unterschied

kann jedoch nicht auf einen Einfluss des Vektors auf den Panx1-Kanal

zurückzuführen sein, da diese Zellen kein Panx1-Protein exprimierten. Auch im

Vergleich der Ergebnisse aus den Messungen der Panx1-Wildtypzellen

ergaben sich signifikante Unterschiede zwischen den verwendeten Vektoren.

Abweichungen waren für die Maximalströme, gemessen in den IV-Kurven (P =

0,014) und die S-Indizes, berechnet aus den IV-Kurven (P = 0,018) und den

Rampen (P = 0,023) signifikant. Hier war ein Einfluss des verwendeten Vektors

auf die Eigenschaften des exprimierten Kanals folglich nicht auszuschließen.

Vergleicht man jedoch die Ergebnisse für die Messungen an den Panx1-

Mutanten transfizierten Zellen, so ist kein systematischer, und damit relevanter

Einfluss der Vektoren auf die Kanaleigenschaften der Panx1-Proteine

feststellbar.

34

Abbildung 7: Vergleich der Messergebnisse pIRES2-EGFP-mPanx1-transfizierter N2A-Zellen mit denen pEGFP-N3-mPanx1-transfizierter N2A-Zellen am Beispiel der Maximalströme der IV-Kurven. Quantitative Analyse des Maximalstroms bei Depolarisation auf +60 mV. In (hellgrau) sind die Daten der pIRES2-EGFP-transfizierten Zellen gekennzeichnet, in (dunkelgrau) die der pEGFP-N3-transfizierten Zellen. Zwischen den Ergebnissen der Zellen, die mit dem Vektoren pIRES2-EGFP bzw. pEGFP-N3 transfiziert waren, war kein systematischer Unterschied erkennbar. Ein relevanter Einfluss der Vektoren auf die Kanaleigenschaften transfizierter Zellen war nicht festzustellen. Anzahl der pIRES2-EGFP-transfizierten Zellen: vo 9; wt 8; Y192F 5; Y324F 5; T387A 4; S159A 6; S206A 6; S328A 9; S343A 4; S405A 6. Anzahl der pEGFP-N3-transfizierten Zellen: vo 10; wt 9; Y192F 7; Y324F 5; T387A 3; S159A 7; S206A 6; S328A 7; S343A 5; S405A 7.

In Abbildung 7 sind exemplarisch die Maximalströme der IV-Kurven, gemessen

in N2A-Zellen, die mit dem pIRES2-EGFP-Vektor transfiziert waren, solchen

gegenübergestellt, die mit dem pEGFP-N3-Vektor transfiziert waren. Aus der

Grafik ist kein systematischer Unterschied zwischen den Vektoren erkennbar,

der mit dem für die Transfektion verwendeten Vektor korreliert. Es gab sowohl

Mutanten, bei denen die pIRES2-EGFP transfizierten Zellen einen größeren

Maximalstrom zeigten, als die pEGFP-N3 transfizierten Zellen (wt; Panx1-

S159A; S328A; S343A), als auch umgekehrte Fälle (vo; Panx1-Y192F; Y324F;

T387A; S206A; S405A) (die Messwerte können der Tabelle A 8 und Tabelle A

13 im Anhang entnommen werden). Außerdem zeigten die einzelnen Mutanten,

unabhängig vom verwendeten Vektor für die einzelnen Messparameter

gleichartige Ergebnisse (s. Tabelle A 8 bis A 16 im Anhang). So war der

Maximalstrom der Panx1-S343A für beide Vektoren signifikant grösser, als der

Maximalstrom der Panx1 wt exprimierenden Zellen (pIRES2-EGFP-Panx1-

S343A P = 0,005; pEGFP-N3-S343A P = 0,003). Ein relevanter Einfluss der

35

Verwendung unterschiedlicher Vektoren auf die Kanaleigenschaften der

exprimierten Proteine konnte somit ausgeschlossen werden und in alle weiteren

Auswertungen gehen die Ergebnisse aller abgeleiteten Zellen ein, unabhängig

vom verwendeten Vektor.

5.3.3 Zelleigenschaften Zur Charakterisierung der Zelleigenschaften von Zellen die mutierte Panx1-

Kanäle, EGFP-mPanx1, oder nur EGFP, exprimierten, wurden zunächst Strom-

Spannungskurven bestimmt. Mit der mPanx1-Y10F-Mutante konnten keine

Experimente durchgeführt werden, da nach 48 h keine Zellen gefunden werden

konnten, die eine deutliche EGFP-Fluoreszenz aufwiesen. Offensichtlich

überlebten mPanx1-Y10F-transfizierte N2A-Zellen bis zu diesem Zeitpunkt nicht.

Die Daten aus den Messungen der IV-Kurven unter Kontrollbedingungen

wurden für die Erstellung der Abbildung 8 für die nur mit dem Vektor

transfizierten Zellen (vo), die mPanx1-transfizierten Zellen (wt) und die

Mutanten jeweils gemittelt und grafisch aufgetragen.

Die nur mit dem Vektor transfizierten Zellen (vo) zeigten über alle

Abbildung 8: Elektrophysiologische Charakterisierung der Panx1 wt und der mutierten mPanx1-Kanäle in N2A-Zellen mittels IV-Kurven. Darstellung der IV-Kurven unter Kontrollbedingungen, berechnet aus den gemittelten Werten der N2A-Zellen, die nur mit dem Vektor (vo, schwarz), mPanx1 (wt, rosa), oder den Vektoren für die Mutanten (farbig) transfiziert waren. Die Kontrollen zeigten eine lineare Strom-Spannungs-Beziehung, die Panx1 wt und die Mutanten exprimierenden Zellen eine exponentielle. Anzahl der Zellen: vo 14; wt 14; Y192F 8; Y324F 8; T387A 6; S159A 11; S206A 15; S328A 8; S343A 10; S405A 9.

36

Spannungssprünge von -50 bis +60 mV einen linearen Stromverlauf (schwarze

Kurve). Sowohl die den Panx1 Wildtyp als auch die die Mutanten

exprimierenden Zellen (farbige Kurven) wiesen dagegen einen exponentiellen

Anstieg der IV-Kontrollkurve bei positiven Potentialen auf.

Die Befunde der nur mit dem Vektor transfizierten Zellen und der Panx1 wt

exprimierenden Zellen entsprechen damit früheren Studien von Bruzzone et al.

(2003), die elektrophysiologische Untersuchungen an Xenopus-Oozyten als

Expressionssytem durchführten. Bunse et al. (2010) konnten diese Strom-

Spannungsbeziehungen auch in N2A-Zellen als Expressionssystem

nachweisen. Die exponentielle Steigung der IV-Kurve der Panx1-transfizierten

Zellen ist auf die spannungsabhängige Öffnung der Panx1-Kanäle bei

Membranpotentialen positiver als 20 mV zurückzuführen. Die hier gezeigten IV-

Kurven können folglich als Beleg dafür dienen, dass alle aufgeführten Mutanten

einen funktionsfähigen Panx1-Kanal ausbildeten.

Auffällig waren zudem die sehr großen Maximalströme der mPanx1-S343A-

und der S328A-Mutanten, bei denen Ströme mit einer Amplitude von bis zu

1800 pA in einzelnen Zellen abgeleitet werden konnten, im Vergleich zu

maximalen Strömen von bis zu 490 pA bei den Panx1 wt exprimierenden Zellen.

Um die elektrophysiologischen Eigenschaften der mutierten und der wt Panx1-

Kanäle besser vergleichen zu können, wurden grundlegende Parameter aus

den IV-Kurven berechnet und quantitativ analysiert. Dazu gehörte die Analyse

des Maximalstroms, gemessen zwischen -30 und +60 mV, wie sie in Abbildung

9 dargestellt ist. Aus der Abbildung 9 ist zu erkennen, dass die maximalen

Stromamplituden der mPanx1-Y324F-Mutante mit 434,77 (± 334,97) pA

signifikant grösser waren (P = 0,022), als die der Panx1 wt exprimierenden

Zellen (213,67 ± 130,31 pA). Noch grösser waren die Maximalströme der

mPanx1-S328A- (573,86 ± 471,83 pA; P = 0,005) und der S343A-Mutanten

(773,01 ± 404,37 pA; P < 0,001 im Rangsummentest). Im Gegensatz dazu

waren die Ströme der nur mit dem Vektor transfizierten Zellen signifikant kleiner

(90,05 ± 53,73 pA; P = 0,001 im Rangsummentest), als die der Panx1 wt

exprimierenden Zellen. Diese Mutanten zeigten also, im Vergleich zum Panx1

Wildtyp eine gesteigerte Leitfähigkeit der Panx1-Kanäle.

37

Abbildung 9: Quantitative Analyse der mittleren maximalen Stromamplituden der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des Panx1 wt und seiner Mutanten in N2A-Zellen. Die mittleren maximalen Stromamplituden wurden für Spannungssprünge von -30 bis +60 mV aus den IV-Kurven ermittelt. Die Maximalströme der mPanx1-Y324F-, S328A- und S343A-transfizierten Zellen waren signifikant grösser, als die der Panx1 wt exprimierenden Zellen. Die der Kontrollen (vo) signifikant kleiner. Anzahl der Zellen: vo 19; wt 17; Y192F 12; Y324F 10; T387A 7; S159A 13; S206A 12; S328A 16; S343A 9; S405A 13.* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001.

Die maximalen Amplituden der übrigen mutierten Zellen (Y192F, T387A, S159A,

S206A, S405A) unterschieden sich hingegen nicht signifikant von denen der

Panx1 wt exprimierenden Zellen.

Der Eingangswiderstand der mPanx1-S328A exprimierenden N2A-Zellen

(744,65 ± 398,32 MΩ; P = 0,003) und der der mPanx1-S343A-Mutanten

(466,56 ± 277,89 MΩ; P < 0,001) war im Vergleich zu den Panx1 wt

exprimierenden Zellen (1304,16 ± 569,50 MΩ) signifikant kleiner. Die restlichen

Mutanten und die nur den Vektor exprimierenden Zellen unterschieden sich

dagegen nicht signifikant von den Panx1 wt exprimierenden Zellen (Werte s.

Tabelle A 3 im Anhang). Dieser Umstand ist darauf zurückzuführen, dass die

Berechnung des Eingangswiderstands zwischen -60 und -50 mV erfolgt,

während die Kanäle erst bei ca. -20 mV, nah am Ruhepotential, öffnen. Obwohl

der Maximalstrom der Y324F-Mutante wesentlich grösser war, als der der

Panx1 wt exprimierenden Zellen, liess sich zwischen diesen beiden Zell-

Populationen kein signifikanter Unterschied für den Eingangswiderstand

feststellen. Mit 1077,88 (± 669,54) pA war der Eingangswiderstand jedoch

38

Abbildung 10: Quantitative Analyse der mittleren Eingangswiderstände der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des Panx1 wt und seiner Mutanten in N2A-Zellen. Aus dem Kehrwert der Steigung der IV-Kurve zwischen -60 und -50 mV liess sich der Eingangswiderstand der Zellen berechnen. Der Eingangswiderstand war bei den mPanx1-S328A- und den -S343A-transfizierten N2A-Zellen signifikant kleiner, als der der Panx1 wt exprimierenden Zellen. Anzahl der Zellen: vo 15; wt 15; Y192F 12; Y324F 10; T387A 7; S159A 13; S206A 12; S328A 16; S343A 9; S405A 13. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001.

kleiner, als der der Panx1 wt exprimierenden Zellen. Die niedrigen

Eingangswiderstände der S328A- und S343A-Mutanten deuten, genau wie die

großen Maximalamplituden, auf eine gesteigerte Kanal-Leitfähigkeit im

Vergleich zu den Panx1 wt exprimierenden Zellen hin.

Zusätzlich konnte zur Beurteilung der Spannungsabhängigkeit der

Membranleitfähigkeit von transfizierten Zellen der S-Index aus der Steigung der

IV-Kurve ermittelt werden. Ein S-Index zwischen 0 und 1,0 zeigt eine größere

Steigung im Bereich positiver Membranpotentiale an, Werte um 0 eine

konstante Steigung und Werte von 0 bis -1,0 eine größere Steigung im

negativen Membranpotentialbereich der IV-Kurve. In Abbildung 11 ist der S-

Index der nur den Vektor exprimierenden Zellen sowie des mPanx1 wt und

seiner Mutanten gezeigt. Der S-Index der nur mit dem Vektor transfizierten

Zellen war mit 0,05 (± 0,42) im Mittel signifikant kleiner (P < 0,001), als der der

Panx1 wt exprimierenden Zellen (0,60 ± 0,26). Dies ist erklärbar durch die

lineare Steigung der IV-Kurve der nur den Vektor exprimierenden Zellen im

39

Abbildung 11: Quantitative Analyse des mittleren S-Index von nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und dem Panx1 wt und seinen Mutanten in N2A-Zellen. Der S-Index wird aus der Steigung der IV-Kurve ermittelt und dient der Beurteilung der Spannungsabhängigkeit der Membranleitfähigkeit. Aufgrund des linearen Anstiegs der IV-Kurve der nur den Vektor exprimierenden Zellen, im Vergleich zum exponentiellen Anstieg der Kurve der Panx1 wt exprimierenden Zellen, war der S-Index der nur den Vektor exprimierenden Zellen signifikant kleiner, als der der Panx1 wt exprimierenden Zellen. Die Mutanten unterschieden sich im S-Index nicht signifikant von den Panx1 wt exprimierenden Zellen. Anzahl der Zellen: vo 18; wt 15; Y192F 12; Y324F 10; T387A 7; S159A 13; S206A 12; S328A 16; S343A 9; S405A 13. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001.

Vergleich zur exponentiellen Steigung in der IV-Kurve der Panx1 wt

exprimierenden Zellen. Die IV-Kurve der mPanx1 exprimierenden Zellen stieg

bei Spannungen über -20 mV exponentiell an, da die spannungsabhängigen

Panx1-Kanäle öffneten. Die Mutanten unterschieden sich nicht signifikant von

den Panx1 wt exprimierenden Zellen, allerdings war der S-Index der S328A-

(0,71 ± 0,14) und der der S343A-Mutante (0,68 ± 0,14) grösser, als der S-Index

der Panx1 wt exprimierenden Zellen.

5.3.4 Carbenoxoloneinfluss Zur weiteren Charakterisierung der Eigenschaften von mit mutiertem Panx1

transfizierten Zellen wurde außerdem der Einfluss des Ionenkanal-Blockers Cbx

getestet.

Für die Erstellung der Abbildung 12 wurden die Daten aus den Messungen der

IV-Kurven der mit den Vektoren für Panx1 wt und seine Mutanten transfizierten

40

Zellen, sowie nur mit dem Vektor transfizierte N2A-Zellen jeweils gemittelt und

grafisch aufgetragen. Die IV-Kurven wurden zunächst unter

Kontrollbedingungen und dann nach Bad-Applikation von 20 µM Carbenoxolon

aufgenommen. Erwartungsgemäß zeigten die nur mit dem Vektor transfizierten

Zellen über alle Spannungssprünge von -50 bis +60 mV auch hier einen

linearen Stromverlauf. Sie wurden vom Einsatz des Kanalblockers nicht

beeinflusst, die linearen IV-Kurven überlagern sich in der Abbildung 12 A. Die

Panx1 wt exprimierenden Zellen und alle Mutanten (B bis J) wiesen dagegen

einen exponentiellen Anstieg der Kontrollkurve bei positiven Potentialen auf.

Nach Applikation von Cbx konnte bei allen Mutanten und den Panx1 wt

exprimierenden Zellen eine Abnahme der maximalen Amplitude und der

Steigung beobachtet werden.

41

Abbildung 12: Einfluss von Cbx auf gemittelte IV-Kurven der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des mPanx1 wt und seinen Mutanten in N2A-Zellen. IV-Kurven, erstellt aus den gemittelten Werten der Messungen von Zellen, die (A) nur mit dem EGF-Protein (vo), (B) sowie mPanx1 (wt) und (C-J) den Vektoren für die Mutanten transfiziert waren. Die IV-Kurven wurden jeweils unter Kontrollbedingungen und nach der Bad-Applikation von 20 µM Cbx aufgezeichnet. Während Cbx keinen Einfluss auf die vo-Zellen hatte, verminderte der Kanalblocker die maximalen Amplituden und die Steigung der IV-Kurve der mPanx1-transfizierten Zellen. Anzahl der Zellen für die Kontrollmessungen: vo 14; wt 14; Y192F 8; Y324F 8; T387A 6; S159A 11; S206A 15; S328A 8; S343A 10; S405A 9. Anzahl der Zellen für die Messungen nach Applikation von 20 µM Cbx: vo 13; wt 14; Y192F 8; Y324F 6; T387A 6; S159A 11; S206A 14; S328A 8; S343A 9; S405A 9.

42

Vergleicht man alle IV-Kurven der nur den Vektor exprimierenden Zellen mit

denen der Panx1 wt exprimierenden Zellen und der Mutanten (Abbildung 13),

so fällt auf, dass die Steigung der IV-Kurve bei allen Mutanten und den Panx1

wt exprimierenden Zellen nach Einsatz von Cbx nahezu linear war. Außerdem

haben die Maximalamplituden etwa auf die Hälfte des Ursprungswerts

abgenommen (z.B. wt Kontrolle 213,67 ± 130,32 pA zu wt nach Cbx-Applikation

102,66 ± 64,55 pA). Der Kanal-blockierende Effekt von Cbx ist daran zu

erkennen, dass sich die IV-Kurven der Y324F- (hellblau), S206A- (dunkelblau)

und S405A-Mutanten (grünblau), der Panx1 wt (rosa) und der nur den Vektor

exprimierenden Zellen (schwarz) nach Applikation des Blockers überlagerten.

Hier wurden die Ströme über die Panx1-Kanäle durch Zugabe des Ionenkanal-

Blockers vollständig gehemmt. Die Ströme über die mutierten Panx1-Kanäle

der S328A- (grün) und der S343A-Mutante (gelb) konnten mittels Cbx dagegen

nicht komplett blockiert werden. Zudem fällt bei der S343A-Mutante (gelb), und

in geringerem Maße auch bei der S328A-Mutante (grün), auf, dass die IV-Kurve,

bei Spannungen kleiner als -20 mV, sehr viel steiler anstieg, als die der

Abbildung 13: Vergleich des Einflusses von Cbx auf die IV-Kurven der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des Panx1 wt und seine Mutanten in N2A-Zellen. Darstellung der gemittelten IV-Kurven der vo- (schwarz) und mPanx1-wt (rosa) transfizierten Zellen, sowie der Mutanten (farbig) nach Applikation von 20 µM Cbx. Cbx blockierte die Ströme über die Panx1-Kanäle der Y324F-, S206A-, S405A- und wt-Zellen komplett. Der mutierte Panx1-Kanal der S343A-exprimierenden, und in geringerem Maße auch der S328A-exprimierenden Zellen, öffnete schon bei negativen Membranspannungen und konnte mit Cbx nicht komplett blockiert werden. Anzahl der Zellen: vo 13; wt 14; Y192F 8; Y324F 6; T387A 6; S159A 11; S206A 14; S328A 8; S343A 9; S405A 9.

43

übrigen Zellen. Der mutierte Panx1-Kanal der S343A- und eventuell auch der

der S328A-Zellen war folglich schon bei sehr niedrigen Membranspannungen

geöffnet und durch Cbx in der verwendeten Konzentration nicht blockierbar.

Eine weitergehende Darstellung des Cbx-Effekts auf die Maximalamplituden ist

in Abbildung 14 gezeigt. Die maximalen Stromamplituden, in % des

Ausgangswertes, konnten nach Applikation von 20 µM Cbx aus den IV-Kurven

für Spannungssprünge von -30 auf +60 mV berechnet werden. Der

blockierende Effekt von Carbenoxolon war bei allen Zellen, die mutierte Panx1-

Kanäle exprimierten und den Panx1 wt exprimierenden Zellen zu beobachten:

die mittleren maximalen Amplituden waren nach Cbx-Applikation auf ca. 50%

vermindert (s. Tabelle A 4 im Anhang). Im Gegensatz dazu waren die

Restamplituden der nur den Vektor exprimierenden Zellen nach Zugabe von

Cbx mit 103,45% (± 61,96%) grösser als die der übrigen Zellgruppen. Dieser

Wert ist mit P = 0,001 im Rangsummentest signifikant verschieden von den

Panx1 wt exprimierenden Zellen. Cbx konnte hier nicht wirken, da keine Panx1-

Kanäle vorhanden waren. Zwischen den Zellen, die mit mutierten Panx1

transfizierte waren und den Panx1 wt exprimierenden Zellen konnte hingegen

kein signifikanter Unterschied im Cbx-Effekt festgestellt werden. Die Y324F-

(42,22 ± 13,65%), S328A- (47,57 ± 15,04%) und die S343A-Mutante (45,93 ±

18,89%) wiesen jedoch eine kleinere Restamplitude auf, als die Panx1 wt

exprimierenden Zellen (52,39 ± 14,99%). Bei diesen Mutanten konnte Cbx

einen größeren Anteil des Stroms blockieren, als bei den Panx1 wt

exprimierenden Zellen. Die Einwirkung von Cbx auf die Panx1 wt

exprimierenden Zellen (P < 0,001 im paired t-test) und alle Mutanten (s. Tabelle

A 1) führte zu einer signifikanten Verminderung der Maximalamplituden im

Vergleich zu den Amplituden unter Kontrollbedingungen. Bei den nur mit dem

Vektor transfizierten Zellen veränderten sich die Amplituden dagegen nicht

signifikant nach Cbx-Applikation (P = 0,626 im paired t-test).

44

Abbildung 14: Quantitative Analyse des Cbx-Effekts auf die mittleren maximalen Stromamplituden der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo), und des Panx1 wt und seine Mutanten in N2A-Zellen. Dargestellt sind die maximalen Amplituden in % des Ausgangswertes, nach Applikation von 20 µM Cbx. Sie wurden aus den IV-Kurven für Spannungssprünge von -30 mV auf +60 mV ermittelt. Die Panx1 wt und seine Mutanten exprimierenden Zellen wiesen nach Zugabe von Cbx eine signifikante Verminderung der maximalen Amplituden um ca. 50% auf im Vergleich zu den maximalen Amplituden unter Kontrollbedingungen. Auf die maximalen Amplituden der nur den Vektor exprimierenden Zellen hatte Cbx hingegen keinen Einfluss. Die Restamplituden dieser Zellen waren deshalb signifikant verschieden von denen der Panx1 wt transfizierten Zellen. Anzahl der Zellen: vo 18; wt 17; Y192F 12; Y324F 10; T387A 7; S159A 13; S206A 12; S328A 16; S343A 9; S405A 13. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001.

Die quantitative Analyse des Effekts von 20 µM Cbx auf den S-Index, berechnet

aus den Steigungen der IV-Kurven, ist in Abbildung 15 dargestellt. Bei allen

Zellen, die mit mutiertem Panx1 transfiziert waren und den Panx1 wt

exprimierenden Zellen verminderte sich der S-Index nach Applikation von

Carbenoxolon, die Steigung der IV-Kurve wurde im positiven Bereich weniger

exponentiell. Die spannungsabhängige Öffnung der Panx1-Kanäle bei

Potentialen positiver, als -20 mV konnte also durch Cbx vermindert werden. Für

alle Zellen konnte nach Einwirkung des Blockers ein S-Index von kleiner 0,5

berechnet werden (s. Tabelle A 4 im Anhang). Der S-Index der S343A-Mutante

verminderte sich auf -0,01 (± 0,29). Dieser Wert war mit P = 0,002 signifikant

verschieden vom S-Index der Panx1 wt exprimierenden Zellen (0,42 ± 0,31)

nach Cbx-Applikation. Die Steigungen der IV-Kurven der S343A-Mutante waren

45

Abbildung 15: Quantitative Analyse des Cbx-Effekts auf den mittleren S-Index der nur den Vektor exprimierenden Zellen (vo) und des Panx1 wt und seine Mutanten in N2A-Zellen. Dargestellt ist der S-Index unter Kontrollbedingungen (dunkelgrau) und nach Applikation von 20 µM Cbx (hellgrau), ermittelt aus der Steigung der IV-Kurven. Bei allen Mutanten und den Panx1 wt exprimierenden Zellen verminderte sich der S-Index nach Cbx-Applikation. Bei der S343A-Mutante war der S-Index nach Cbx-Applikation signifikant kleiner, als der Panx1 wt exprimierender Zellen. Anzahl der Zellen für die Kontrollmessungen: wt 15; Y192F 12; Y324F 10; T387A 7; S159A 13; S206A 12; S328A 16; S343A 9; S405A 13. Anzahl der Zellen für die Messungen nach Applikation von 20 µM Cbx: wt 17; Y192F 12; Y324F 10; T387A 7; S159A 13; S206A 12; S328A 15; S343A 9; S405A 11 * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001.

somit nach Einwirkung des Ionenkanal-Blockers bei negativen

Membranspannungen sehr steil. Dies lässt, wie in Abbildung 13 ebenfalls zu

erkennen ist, darauf schließen, dass der mutierte Panx1-Kanal der S343A-

Mutante schon bei Membranspannungen kleiner -20 mV geöffnet und bei

negativeren Membranspannungen weniger effektiv durch Cbx blockierbar war,

als der der Panx1 wt und der mutierten Panx1 exprimierenden Zellen. Ein

Vergleich des S-Index unter Kontrollbedingungen mit dem nach Cbx-Applikation

mittels „paired t-test“ ergab für einige Mutanten signifikante Unterschiede. So

wurden die IV-Kurven der Y192F-, Y324F-, T387A-, S159A-, S328A- und der

S343A-Mutanten (s. Tabelle A 2 im Anhang) signifikant linearer, die

spannungsabhängige Öffnung des Panx1-Kanals signifikant vermindert.

46

6 Diskussion

Pannexin1-Kanäle konnten bisher mit verschiedenen pathologischen

Vorgängen beim Menschen in Verbindung gebracht werden. So kann

Neurodegeneration aufgrund von Entzündungen im post-ischämischen Gehirn,

bei Diabetes, oder M. Alzheimer auf eine Öffnung neuronaler Pannexin1-

Kanäle und den damit einhergehenden neuronalen Zelltod zurückgeführt

werden (Orellana et al., 2011). Auch für die Ausbildung bleomyzininduzierter

Lungenfibrose ist eine entzündungsbedingte Aktivierung von Pannexin1-

Kanälen als ursächlich anzunehmen (Riteau et al., 2010).

Ein besseres Verständnis der Regulation von Pannexinen kann deshalb einen

wichtigen Beitrag zur Erkennung und Therapie solcher Erkrankungen leisten.

Von Connexinen ist bereits bekannt, dass die posttranslationale Modifikation

durch Phosphorylierung, die ein wichtiges Mittel zur Regulation biologischer

Prozesse in Zellen darstellt verschiedene funktionelle Eigenschaften der

Connexin-Kanäle beeinflussen kann (Solan und Lampe, 2009). Da Pannexine

ebenfalls Phosphoproteine sind und Pannexine und Connexine die gleiche

Sekundärstruktur aufweisen, war davon auszugehen, dass auch Pannexine

phosphoryliert werden (Barbe et al., 2006). In vorliegender Arbeit wurden

deshalb mit Hilfe gezielter Mutagenese neun potentielle

Phosphorylierungsstellen von Pannexin1 mutiert und die daraus entstandenen

Panx1-Mutanten weitergehend untersucht.

Für N2A-Zellen, die mit den Expressionsvektoren für mPanx1 oder eine der

erzeugten Mutanten transfiziert waren, konnte mittels Western Blot und

konfokaler Fluoreszenzmikroskopie nachgewiesen werden, dass die meisten

Zellen potenziell überlebensfähig waren und Pannexin-Kanäle ausbildeten. Um

mögliche funktionelle Veränderungen zu charakterisieren, schloss sich eine

Untersuchung elektrophysiologischer Eigenschaften transfizierter Zellen an.

47

6.1 Elektrophysiologische Analyse der Zelleigenschaften transfizierter N2A-Zellen

Zur Untersuchung elektrophysiologischer Eigenschaften transfizierter N2A-

Zellen wurden Ganzzellableitungen mit zwei verschiedenen

Stimulationsprotokollen durchgeführt. Einerseits 500 ms andauernde

Spannungspulse, mit denen das Membranpotential der Zellen schrittweise von

-50 mV auf +60 mV eingestellt wurde, und andererseits Stromrampen, bei

denen das Haltepotential kontinuierlich von -100 mV auf +80 mV geändert

wurde. Es stellte sich die Frage, welches Stimulationsprotokoll besser zur

Analyse der Zelleigenschaften geeignet ist. Bei Verwendung der

Spannungspulse können besser der maximal über die Zelle fließende Strom

und die Spannungsabhängigkeit der Leitfähigkeit bestimmt werden.

Stromrampen erlauben hingegen auch die Ermittlung der Öffnungskinetik von

Ionenkanälen, abgesehen von prinzipiellen Limitierungen der Ganzzell-Methode.

Für die Ergebnisse aus den elektrophysiologischen Experimenten war kein

relevanter Unterschied zwischen den beiden Stimulationsprotokollen

feststellbar. Die Zellen, die mit den mutierten Panx1-Kanälen transfiziert waren,

zeigten für beide Untersuchungsmethoden gleiche Zelleigenschaften und

signifikante Unterschiede zwischen den Mutanten und den Panx1 wt

exprimierenden Zellen waren für beide Protokolle gleich häufig. Bei

Verwendung der Spannungspulse wurde das Membranpotential der

abgeleiteten Zelle jedoch über längere Zeit konstant gehalten, so dass sich ein

„steady-state“-Zustand einstellen und die Zellströme so zuverlässiger bestimmt

werden konnten. Dagegen kann die Spannungsabhängigkeit von Ionenkanälen

mittels Stromrampen nur unzureichend und auch nur qualitativ untersucht

werden, da verzögert reagierende Kanäle bei schnellen Änderungen des

Membranpotentials möglicherweise nicht erfasst werden. Auf die Darstellung

der Ergebnisse aus den Messungen der Stromrampen wurde in dieser Arbeit

deshalb zugunsten der Analyse der Daten aus den Spannungspulsen verzichtet.

Für die Beschreibung der elektrophysiologischen Eigenschaften der

transfizierten N2A-Zellen wurden daher aus den Stromantworten auf die

Spannungspulse Strom-Spannungsbeziehungen (IV-Kurven) bestimmt.

Eine zuverlässige und quantitative Analyse der Öffnungskinetik von einzelnen

Ionenkanälen erfolgt außerdem besser mit Hilfe von Einzelkanalmessungen,

48

anhand derer auch Öffnungszustände, Öffnungswahrscheinlichkeiten und

Inaktivierungszeiten von Kanälen bestimmt werden können.

Einzelkanalmessungen waren für die überblickartige Untersuchung mutierter

potentieller Phosphorylierungsstellen, wie sie in vorliegender Arbeit erfolgen

sollte, jedoch nicht geeignet. Zudem muss für eine Einzelkanalmessung ein

Stück der Membran aus der Zellwand herausgerissen werden und alle

Komponenten, die für die Phosphorylierung benötigt werden, würden so

verloren gehen. Es wäre also nicht feststellbar, ob die erzeugten Mutationen zu

veränderter Phosphorylierung führten.

6.2 Die Verwendung der Vektoren pEGFP-N3-m-Panx1 und pIRES2-EGFP-mPanx1 hat keinen Einfluss auf die Eigenschaften von mPanx1

Zur Transfektion von N2A-Zellen mit mutierten Pannexin1-Kanälen wurden zwei

verschiedene Expressionsvektoren eingesetzt. Zum einen der pEGFP-N3-

mPanx1-Vektor, der für Fusionsproteine aus mPanx1 und C-terminal

lokalisiertem EGFP kodierte, und zum andern der pIRES2-EGFP-mPanx1-

Vektor, der eine bicistronische Expression von mPanx1 und EGFP ermöglichte.

Aus früheren Arbeiten ist bereits bekannt, dass der C-Terminus eine wichtige

Rolle bei der Regulation von Kanal-Eigenschaften spielt. Untersuchungen an

Cx43 ergaben beispielsweise, dass eine Verkürzung des C-Terminus zu einer

intrazellulären Retention des Proteins und folglich verminderter Gap junction-

Bildung im Herzen führen und damit Vorhofflimmern auslösen kann (Thibodeau

et al., 2010). Auch von Pannexinen weiß man, dass eine Verkürzung des C-

Terminus veränderte Kanaleigenschaften verursachen kann. So bildet eine

Spaltung des Pannexin1-C-Terminus an einer spezifischen Caspase-

Schnittstelle über die Ausbildung eines permanent offenen Kanals einen

Zwischenschritt der Apoptose (Chekeni et al., 2010).

Um die Messergebnisse richtig interpretieren zu können, musste ein Einfluss

des EGFP am C-Terminus auf den Pannexin1-Kanal in Versuchen mit dem

pEGFP-N3-mPanx1-Vektor ausgeschlossen werden. Bisher wurde allerdings

von keiner Arbeitsgruppe ein Einfluss eines C-terminalen Markers, oder einer

Verlängerung des C-Terminus auf die Eigenschaften des Panx1-Kanals

49

beobachtet (Chekeni et al., 2010; unveröffentlichtes Material unserer

Arbeitsgruppe). Lediglich eine Verkürzung des Carboxy-Terminus zwischen den

Aminosäurepositionen 370-380 (unveröffentlichtes Material unserer

Arbeitsgruppe; Chekeni et al., 2010), bzw. Mutationen von Aminosäuren im C-

Terminus (Bunse et al., 2010; Wang und Dahl, 2010) führten zu veränderten

Zelleigenschaften. Deshalb sollte die Verwendung des pEGFP-N3-mPanx1-

Vektors keinen Einfluss auf die Zelleigenschaften haben.

Ein Vergleich der elektrophysiologischen Messungen von pEGFP-N3-mPanx1-

transfizierten Zellen mit denen von pIRES2-EGFP-mPanx1-transfizierten Zellen

ergab zudem keinen systematischen Unterschied, der mit dem für die

Transfektion verwendeten Vektor korreliert hätte. So waren z.B. die maximalen

Amplituden der IV-Kurven von Zellen die carboxyterminale Mutanten

exprimierten, nicht immer dann grösser, wenn der pEGFP-N3-mPanx1-Vektor

verwendet wurde. Bei den Y324F-, T387A- und S405A-Mutanten war zwar der

Maximalstrom der pEGFP-N3-mPanx1-transfizierten Zellen grösser, als der der

pIRES2-EGFP-mPanx1-transfizierten Zellen, bei den S328A- und S343A-

Mutanten war es jedoch umgekehrt. Zellen, die mit den Vektoren für mutierte

Panx1-Kanäle transfiziert waren, zeigten außerdem, unabhängig vom

verwendeten Vektor, gleichartige Tendenzen für die verschiedenen

Messparameter.

Darüber hinaus zeigte auch die Expressionsanalyse mittels Western Blot

keinen Unterschied zwischen den eingesetzten Vektoren. Bei allen Panx1

transfizierten Zellen, unabhängig vom eingesetzten Expressionsvektor, konnte

eine Membranständigkeit des Pannexin1-Kanals nachgewiesen werden.

Somit konnte umgekehrt auch ein Einfluss des separat vom Panx1-Kanal

translatierten EGFP-Proteins auf die Zelleigenschaften pIRES2-EGFP-mPanx1-

transfizierter Zellen ausgeschlossen werden.

6.3 Phosphorylierung spielt eine wichtige Rolle in der Regulation von Panx1

Die meisten Connexine sind Phosphoproteine und die Phosphorylierung von

Connexinen kann mit verschiedenen Mechanismen zur Regulation zellulärer

Kommunikation in Verbindung gebracht werden (Lampe und Lau, 2000). So

50

spielt Phosphorylierung eine wichtige Rolle in allen Abschnitten des Connexin-

Lebenszyklusses, wie der Biosynthese, dem Transport zur und den Einbau des

Proteins in die Membran, der Ausbildung von Gap junctions, dem Öffnen und

Schließen des Hemikanals und der Gap junctions, sowie dem Abbau des

Kanals (s. Review Sáez et al., 2003; Sáez et al., 2005; Solan und Lampe, 2009).

Pannexine sind gleichfalls Phosphoproteine und auch hier könnte der

Phosphorylierung eine wesentliche Bedeutung in der Regulation ihres

Lebenszyklusses zukommen (Barbe et al., 2006).

6.3.1 Alle Mutanten bilden funktionsfähige Pannexin1-Kanäle aus Die Überlebensfähigkeit der neun, an potentiellen Phosphorylierungsstellen des

Pannexin1-Kanals mittels gezielter Mutagenese erzeugten Mutanten und die

Lokalisation des Kanals in der Zellmembran transfizierter N2A-Zellen konnten

mittels Western Blot und konfokalen Aufnahmen nachgewiesen werden. Alle

Zellen, die mutierte Panx1-Kanäle exprimierten zeigten außerdem in den

Strom-Spannungs-Kurven ein Antwortverhalten ähnlich dem der Panx1 wt

exprimierenden Zellen, da sie alle bei positiven Membranpotentialen einen

exponentiellen Anstieg der IV-Kurve aufwiesen. Im Unterschied dazu zeigten

Zellen, die mit dem leeren Vektor transfiziert waren, hier einen linearen

Stromverlauf. Keine der neun Mutationen führte also zu einer Störung der

Ausbildung eines funktionsfähigen Pannexin1-Kanals. Die Biosynthese der hier

untersuchten Pannexin1-Kanäle und ihr Transport zur Zellmembran sind

folglich nicht eingeschränkt. Dieses Ergebnis ist überraschend, da von

Connexinen bekannt ist, dass Phosphorylierung ein wichtiger Mechanismus zur

Regulation des Transports zur Membran ist (Musil und Goodenough, 1991;

Martin et al., 2001). So konnte für Cx43 das Serin an Position 373 als wichtige

Lokalisation posttranslationaler Phosphorylierung zur Steuerung des

Proteintransports zur Membran identifiziert werden (Park et al., 2007). Auch die

Expression von Connexinen wird mittels Phosphorylierung kontrolliert (Salameh

et al., 2009). Es ist also erstaunlich, dass die in dieser Arbeit untersuchten

Phosphorylierungsstellen von Pannexin1 keine Aufgabe in Biosynthese und

Transport zu haben scheinen. Allerdings konnten im Rahmen dieser Arbeit

nicht alle potentiellen Phosphorylierungsstellen in Pannexin1 untersucht werden,

da die Mutagenese des Serin 394, das laut Netphos2.0 Server ebenfalls einen

51

Vorhersagewert von grösser 0,5 hatte, nicht erfolgreich war. Eine

posttranslationale Modifikation dieser Aminosäure könnte also zur Regulation

von Biosynthese und Transport von Bedeutung sein. Die Untersuchung der

Eigenschaften einer mPanx1-S394A-Mutante sollte deshalb in weiteren

Experimenten noch folgen. Außerdem ist es möglich, dass zur Regulation

dieser Prozesse die Phosphorylierung einer einzelnen Aminosäure nicht

ausreichend ist, sondern mehrere Aminosäuren gleichzeitig phosphoryliert

werden müssen. Hier könnten Studien mit Pannexin1-Kanälen, die an

mehreren potentiellen Phosphorylierungsstellen gleichzeitig mutiert sind,

weitere Erkenntnisse bringen.

6.3.2 Die N-terminale Mutante Y10F führt zu strukturellen Veränderungen des Panx1-Kanals

Innerhalb des N-Terminus des Pannexin1-Proteins gab es lediglich eine

Aminosäure, die als potentielle Phosphorylierungsstelle vorhergesagt wurde,

das Tyrosin an Position Y10. Es wurde mit Hilfe gezielter Mutagenese zu

Phenylalanin mutiert. Die Western Blot-Analyse dieser Mutante zeigte nur sehr

schwache Banden, so dass man annehmen könnte, dass hier der Kanal nicht in

die Zellmembran, oder das endoplasmatische Retikulum, eingebaut wurde. Wie

die Analyse mit Hilfe des Konfokalmikroskops zeigte, wiesen die Zellen

außerdem eine stark verkürzte Überlebenszeit von weniger als 96 h auf. Auch

in einer durchflusszytometrischen Untersuchung dieser Mutante war der Anteil

toter Zellen 24 h nach Transfektion grösser als der lebender Zellen

(unveröffentlichte Ergebnisse unserer Arbeitsgruppe). Aus diesem Grund waren

elektrophysiologische Messungen an mPanx1-Y10F transfizierten N2A-Zellen

nicht möglich. Bei einer Wiederholung der Experimente mit transfizierten

Xenopus-Oozyten (S. Bunse, pers. Mitteilung) zeigten sich die Oozyten jedoch

als überlebensfähiger als die N2A-Zellen und elektrophysiologische Messungen

waren möglich. Letale Mutanten führen in N2A-Zellen möglicherweise prinzipiell

früher zum Zelltod als in Oozyten da die N2A-Zelllinie weniger robust ist. Die

schwachen Banden in der Western Blot-Analyse sind also vermutlich darauf

zurückzuführen, dass stark exprimierende N2A-Zellen früh abstarben und für

die Blot-Analyse Protein aus Zellen ohne oder mit nur geringer Panx1-

Expression eingesetzt wurde. Um den Einbau des mutierten Kanals in die

52

Zellmembran von mPanx1-Y10F transfizierten Zellen endgültig nachweisen zu

können, müssten allerdings weitere immunzytochemische Untersuchungen von

transfizierten N2A-Zellen oder injizierten Oozyten folgen.

Auch in Versuchen mit injizierten Oozyten war die Überlebenszeit der Y10F-

Mutanten mit ca. 40 h gegenüber mehr als 100 h bei den Wildtyp-Zellen stark

herabgesetzt. Durch den Einsatz von Cbx konnte die Überlebenszeit jedoch auf

über 80 h verdoppelt werden (S. Bunse, pers. Mitteilung). Dieses Ergebnis lässt

auf eine gesteigerte Kanal-Aktivität der Y10F-Mutante schließen. Der

Zusammenbruch transmembranärer Ionengradienten, oder der Anstieg

intrazellulären Kalziums, sowie der Verlust wichtiger Metabolite durch eine

dauernde Öffnung des Kanals bei Ruhemembranpotentialen war vermutlich die

Ursache für den schnellen Zelltod transfizierter Zellen. Die gesteigerte

Leitfähigkeit des Panx1-Y10F-Kanals war auch in den elektrophysiologischen

Untersuchungen an injizierten Oozyten nachweisbar. Denn Maximalstrom, Cbx-

Effekt und Ruhemembranpotential waren bei der Y10F-Mutante signifikant

grösser, der Haltestrom jedoch signifikant niedriger, als bei den Panx1 wt

exprimierenden Oozyten (S. Bunse, pers. Mitteilung). Um die gesteigerte

Leitfähigkeit weitergehend zu untersuchen, könnten Farbstoffaufnahme-

Versuche mit Lucifer Yellow (LY) durchgeführt werden. Oozyten, die wt Panx1-

Kanäle exprimieren, nehmen spontan kein LY auf, da Panx1-Kanäle am

Ruhepotential geschlossen sind. Würden die Y10-F-Mutanten eine LY-

Aufnahme induzieren und wäre die Farbstoffaufnahme außerdem durch Cbx

blockierbar, so würde dies ebenfalls für das Vorhandensein dauernd geöffneter

Pannexin-Kanäle sprechen.

Es gibt verschiedene Erklärungsmöglichkeiten für eine gesteigerte Leitfähigkeit

der Y10F-Mutante. So könnte durch veränderte Phosphorylierung die

Offenwahrscheinlichkeit der Panx1-Kanäle, oder ihre mittlere Öffnungsdauer

vergrößert sein. Wahrscheinlicher ist jedoch ein Einfluss der N-terminalen

Mutation auf die Struktur des Kanals und eine daraus resultierende

Kanalöffnung am Ruhemembranpotential (z.B. durch Verlust der

Spannungsabhängigkeit für die der N-Terminus eine wichtige Rolle spielt).

Aufgrund der Ergebnisse einer SCAM-Analyse der Panx1-Struktur durch Wang

und Dahl (2010) kann davon ausgegangen werden, dass in Pannexin1 der N-

Terminus strukturelle Aufgaben erfüllt und nicht an der Bildung der Kanalpore

53

beteiligt ist. Dies steht im Gegensatz zu den Erkenntnissen aus

Untersuchungen an Connexinen. Für Cx26 konnte aufgrund von Analysen der

Kristallstruktur eine Beteiligung der N-terminalen Aminosäuren an der

Formation des cytoplasmatischen Anteils der Pore ermittelt werden (Maeda et

al., 2009).

Wenn in Pannexin1 also der N-Terminus wichtig für die korrekte Faltung des

Proteins und den Transfer, bzw. die Faltung im endoplasmatischen Retikulum,

den Transport zur, sowie die Funktion in der Plasmamembran hat (Wang und

Dahl, 2010), so hat auch die in dieser Arbeit untersuchte N-terminale Y10F-

Mutante einen Einfluss auf die Struktur des Pannexin1-Kanals. Und die

veränderte Struktur führt, unabhängig von Phosphorylierungseffekten, zur

Ausbildung eines Kanals mit größerer Leitfähigkeit oder größerer

Offenwahrscheinlichkeit. Dies könnte in Einzelkanalmessungen weitergehend

untersucht werden.

6.3.3 Mutationen putativer Phosphorylierungsstellen in der intrazellulären Schleife von Panx1 haben keinen Einfluss auf die Eigenschaften des Kanals im Vergleich zu Panx1 wt

Die Serine S159 und S206, sowie das Tyrosin Y192 sind potentielle

Phosphorylierungsstellen, die in der intrazellulären Schleife lokalisiert sind. Die

beiden Serine wurden zu Alanin und das Tyrosin zu Phenylalanin mutiert. In der

Western Blot-Analyse transfizierter N2A-Zellen konnten für diese drei Mutanten

die Pannexin1-typischen Mehrfachbanden („multiple band pattern“)

nachgewiesen werden, so dass man davon ausgehen kann, dass hier

membranständige Kanäle gebildet wurden. Zwar konnten für die pIRES2-

EGFP-mPanx1-S159A transfizierten N2A-Zellen nur sehr schwache Banden

festgestellt werden, jedoch ist hier die als Kontrolle dienende β-Aktin-Bande

ebenfalls nur sehr blass, so das anzunehmen ist, dass insgesamt nur wenig

Protein aufgebracht wurde. Konfokalmikroskopisch konnte die Lokalisation des

Panx1-Proteins an der Zelloberfläche dieser mutierten Zellen bestätigt werden

und ihre Überlebenszeit entsprach der der Panx1 wt exprimierenden Zellen.

Auch in den elektrophysiologischen Untersuchungen und quantitativen

Analysen unterschieden sich diese Mutanten nicht von den Panx1 wt

exprimierenden Zellen. Die Phosphorylierung von Aminosäuren der

54

intrazellulären Schleife kann folglich nicht zur Regulation von

Kanaleigenschaften, wie Leitfähigkeit, Spannungsabhängigkeit, oder die

Blockierbarkeit durch Cbx von Bedeutung zu sein. Ein Einfluss auf andere

Eigenschaften, wie die Kalzium-, oder pH-Abhängigkeit des Kanals ist im

Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht untersucht worden und damit nicht

ausgeschlossen. Hier sollten weitere Experimente folgen, um die Funktion

intrazellulärer potentieller Phosphorylierungsstellen besser beurteilen zu

können.

Von Connexinen weiß man, dass Phosphorylierungstellen in der intrazellulären

Schleife für die Regulation von Bedeutung sind (Solan und Lampe 2009). So

konnte für die Connexine35 und 36 festgestellt werden, dass Phosphorylierung

am Serin 110 in der intrazellulären Schleife zu verminderter elektrischer

Kopplung über Gap junctions führt (Urschel et al., 2006; Kothman et al., 2007).

Außerdem wurde beschrieben, dass die Phosphorylierung zweier Serine einen

größeren Effekt hat, als die alleinige Modifikation einer Stelle. Es ist deshalb

anzunehmen, dass auch bei Pannexinen ein Phosphorylierungseffekt eventuell

erst durch Veränderung mehrerer Positionen beobachtet werden kann.

In bisher unveröffentlichten Versuchen unserer Arbeitsgruppe mit injizierten

Xenopus-Oozyten konnte außerdem festgestellt werden, dass die S206A-

Mutante eine signifikant größere Leitfähigkeit hatte, als die Panx1 wt

exprimierenden Zellen (S. Bunse, pers. Mitteilung). Es ist also möglich, dass die

Phosphorylierungsstellen der intrazellulären Schleife doch eine wichtige

Funktion in der Regulation der in dieser Arbeit untersuchten Zelleigenschaften

haben, und lediglich mit der verwendeten N2A-Zelllinie nicht detektiert werden

konnte. N2A-Zellen sind Neuroblastomzellen und die Expression neuronaler

Komponenten in diesen Zellen ist gegeben. Sie könnten im Vergleich zu den

Xenopus-Oozyten andere, z.B. spannungsabängige Ionenkanäle exprimieren,

die dazu führen, dass Pannexin1-vermittelte Ströme zumindest teilweise

maskiert werden.

Es gibt verschiedene Erklärungsmöglichkeiten für die gesteigerte Leitfähigkeit

mutierter N2A-Zellen. So könnten, durch einen erhöhten Transport von Kanälen

zur Membran oder einen verminderten Abbau, insgesamt mehr Kanäle in der

Membran vorhanden sein, so dass pro Zeiteinheit mehr Kanäle gleichzeitig

geöffnet wären. Auch eine gesteigerte Offenwahrscheinlichkeit, oder eine

55

längere mittlere Öffnungsdauer, sowie eine höhere Einzelkanalleitfähigkeit

könnten zu einer gesteigerten Leitfähigkeit beitragen. Für Connexine sind all

diese Mechanismen als Folge von Phosphorylierung bekannt (Moreno et al.,

1992; van Veen et al., 2000; Cottrell et al., 2003; Review Račkauskas et al.,

2010). Darüber hinaus konnte erhöhte Hemikanal-Leitfähigkeit als Folge von

Mutationen einzelner potentieller Phosphorylierungsstellen in Connexinen mit

seltenen Krankheiten in Verbindung gebracht werden. So wird die Okulo-dento-

digitale Dysplasie auf eine erhöhte Cx43-Hemikanal-Leitfähigkeit zurückgeführt.

Die mutierten Aminosäurepositionen G138R und G143S führen bei dieser

Krankheit zu einem veränderten Phosphorylierungszustand des Proteins,

dadurch kommt es zu einem verminderten Abbau von Cx43 und in Folge

dessen zu einer erhöhten Zahl von Kanälen in der Membran mit letztlich

gesteigerter Leitfähigkeit (Dobrowolski et al., 2007).

6.3.4 C-Terminale Panx1-Phosphorylierungsstellen sind wichtig für die Regulation von Panx1-Kanaleigenschaften

Fünf potentielle Phosphorylierungsstellen sind im C-Terminus von Pannexin1

lokalisiert und wurden ebenfalls mittels gezielter Mutagenese verändert. Das

Tyrosin Y324 wurde zu Phenylalanin, die Serine S328, S343 und S405, sowie

das Threonin T387 zu Alanin mutiert. Es ist bekannt, dass bei Connexinen

insbesondere der C-Terminus zur Regulation von Zelleigenschaften

phosphoryliert wird (Warn-Cramer et al., 1996; Review Solan und Lampe, 2009;

Review Račkauskas et al., 2010), deshalb wurde vermutet, dass auch bei

Pannexinen die Phosphorylierung des C-Terminus wichtig ist.

Die mPanx1-Y324F- und S405A-transfizierten N2A-Zellen verhielten sich

jedoch in den Experimenten ähnlich wie die Mutanten der intrazellulären

Schleife (s. 6.3.3), also sehr ähnlich den Panx1 wt exprimierenden Zellen. Bei

Expression der Y324F-Mutante waren die maximalen Ströme in den IV-Kurven,

und damit die Leitfähigkeit, signifikant grösser, als die der Panx1 wt

exprimierenden Zellen. Dieses Ergebnis konnte durch Messungen an Xenopus-

Oozyten (S. Bunse, pers. Mitteilung) bestätigt werden. Hier ergab sich darüber

hinaus für beide Mutanten eine größere Leitfähigkeit als für die Panx1 wt

exprimierenden Zellen. Folglich spielt auch bei diesen Mutanten, wie bei den

Mutanten der intrazellulären Schleife, Phosphorylierung eine Rolle in Transport

56

und Abbau der Kanäle, oder Kanaleigenschaften, wie Offenwahrscheinlichkeit,

mittlerer Öffnungsdauer und Einzelkanalleitfähigkeit. Bei der S405A-Mutante

konnte zudem eine starke Fluoreszenzintensität und ausgeprägte

Membranlokalisation in den fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen

festgestellt werden. Dies würde auf eine erhöhte Anzahl von Kanälen an der

Zelloberfläche, entweder durch einen schnelleren Transport zur Membran oder

einen verlangsamten Abbau, hindeuten. „Pulse-chase“- Experimente in

Verbindung mit Zellfraktionierung könnten weiteren Aufschluss über den hier

überwiegenden Mechanismus geben, denn mit dieser Methode kann der Weg

einzelner neu synthetisierter Verbindungen durch die Zelle verfolgt werden.

Panx1-T387A-transfizierte N2A-Zellen glichen in den elektrophysiologischen

Messungen ebenfalls den Panx1 wt exprimierenden Zellen, zeigten jedoch

Auffälligkeiten in den konfokalen Aufnahmen und den Western Blot-Analysen.

Konfokalmikroskopisch konnte nur wenig Panx1-Protein in der Zellmembran

nachgewiesen werden und bei den Blot-Analysen pEGFP-N3-mPanx1-T387A-

transfizierter Zellen konnten nur sehr schwache Banden abgelesen werden.

Deshalb wurden von unserer Arbeitsgruppe zusätzlich Versuche zu den

Überlebensraten von T387A-exprimierenden Oozyten durchgeführt (S. Bunse,

pers. Mitteilung). Hier zeigte sich eine erhöhte Sterberate von ca. 30%

innerhalb von 40 h nach Injektion (gegenüber wenigen Prozent bei den Panx1

wt exprimierenden Zellen) und eine Verlängerung der Überlebenszeit unter Cbx.

Eine mögliche Erklärung für die Ergebnisse aus den konfokalmikroskopischen

Aufnahmen und der Western Blot-Analyse wäre also, dass, ähnlich wie bei der

Y10F-Mutante, viele Zellen zum Untersuchungszeitpunkt bereits abgestorben

waren und nur Zellen eingesetzt wurden, die eine geringe Expressionsrate

aufwiesen. Dies unterstützen auch die Ergebnisse aus den

elektrophysiologischen Messungen injizierter Oozyten (S. Bunse, pers.

Mitteilung). Hier waren die maximalen Amplituden signifikant grösser und das

Ruhemembranpotential signifikant kleiner, als bei den Panx1 wt exprimierenden

Zellen. Eine erhöhte Kanal-Aktivität am Ruhemembranpotential mit Verlusten

von Metaboliten und dem Zusammenbruch transmembranärer Ionengradienten

könnte also auch hier für den schnellen Zelltod verantwortlich sein.

Die S343A- und die S328A-Mutante waren von den C-terminalen Mutanten am

auffälligsten. Bei der S343A-Mutante konnte in der Western Blot-Analyse nur

57

sehr schwache Banden gefunden werden und in den konfokalen Aufnahmen

konnte zwar Panx1-Protein an der Zelloberfläche nachgewiesen werden, die

Überlebenszeit war jedoch stark vermindert. Auch in Versuchen zur

Überlebenszeit injizierter Oozyten (S. Bunse, pers. Mitteilung), konnte eine

stark eingeschränkte Überlebensrate festgestellt werden. Schon 40 h nach

Injektion waren alle Oozyten, die die S343A-Mutante exprimierten, degeneriert.

Überraschenderweise konnte die Überlebenszeit auch in Anwesenheit von Cbx

nicht wesentlich verlängert werden. Entsprechend den Ergebnissen aus den

Versuchen zu den Überlebensraten injizierter Oozyten zeigten S343A-

transfizierte N2A-Zellen Auffälligkeiten in den elektrophysiologischen

Messungen. Mit bis zu 1800 pA in einzelnen Messungen waren die maximalen

Stromamplituden sehr groß und der Eingangswiderstand war signifikant kleiner,

als bei den Panx1 wt exprimierenden Zellen. Für diese Ergebnisse ist

vermutlich ebenfalls eine gesteigerte Aktivität des Panx1-S343A-Kanals

verantwortlich. Diese Aktivität ist atypisch, da der Kanal schon bei

Membranspannungen von kleiner -20 mV öffnete. Ein ähnliches Verhalten ist

von humanem Cx26 bekannt, das schon bei Membranpotentialen von -50 mV

öffnet (Gonzáles et al., 2006). Interessanterweise erhöhen einige Mutationen in

Cx26, die zu verschiedenen Hautkrankheiten und genetisch bedingter Taubheit

führen, ebenfalls die Hemikanal-Leitfähigkeit (Lee et al., 2009). Man könnte

vermuten, dass Mutationen von Panx1 genauso zu hereditären Krankheiten

führen können. Zur Bestätigung dieser Annahme müssen allerdings weitere

Untersuchungen über physiologische und pathologische Eigenschaften von

Pannexin1 folgen.

Auffallend war in den elektrophysiologischen Messungen, ähnlich wie in den

Versuchen zur Oozyten-Überlebenszeit, eine inkomplette Blockade durch Cbx.

Denn in den IV-Kurven wiesen die Ströme auch nach Cbx-Applikation noch

eine exponentielle Steigung bei positiven Potentialen auf. Trotzdem war die

Restamplitude nach Cbx-Applikation prozentual kleiner als die der Panx1 wt

exprimierenden Zellen, allerdings war dieser Unterschied nicht signifikant. Der

S-Index verminderte sich hingegen sogar signifikant gegenüber dem der Panx1

wt exprimierenden Zellen. Cbx scheint hier einen größeren Anteil des Stroms

blockiert zu haben, als bei den Panx1 wt exprimierenden Zellen. Man könnte

sich vorstellen, dass die Mutation S343A in einem veränderten

58

Kanaldurchmesser, geänderter Ladung der Kanalpore, oder anderen

Inaktivierungszeiten resultiert. Welcher Mechanismus tatsächlich für die extrem

große Leitfähigkeit und die inkomplette Blockade durch Cbx ursächlich ist, ist

mit heutigem Wissen nicht zu bestimmen, da die Wirkungsweise von Cbx noch

unbekannt ist. Hier müssen weitere Experimente zum besseren Verständnis

folgen.

Die S328A-Mutante verhielt sich im Prinzip wie die S343A-Mutante nur dass sie

in den konfokalmikroskopischen Aufnahmen und den Western-Blot-Analysen

unauffällig war. Untersuchungen von Oozyten-Überlebensraten (S. Bunse, pers.

Mitteilung) ergaben auch für diese Mutante eine eingeschränkte Überlebenszeit

und in den elektrophysiologischen Messungen zeigte sich eine sehr große

maximale Stromamplitude bei erniedrigtem Eingangswiderstand, was ebenfalls

auf eine erhöhte Leitfähigkeit schließen lässt. Auch hier war nur eine

inkomplette Blockade mit Cbx zu erreichen. Ob bei den S328A-transfizierten

Zellen hierfür der gleiche Mechanismus ursächlich ist, wie bei den S343A-

Mutanten, ließe sich z.B. mit Einzelkanalmessungen in weiteren Experimenten

bestimmen.

Zusammenfassend kann also gesagt werden, dass Phosphorylierung wichtig

für die Regulation von Panx1-Kanaleigenschaften ist. Aus den Ergebnissen

dieser Arbeit kann geschlossen werden, dass die Biosynthese und der

Transport der Kanäle zur Plasmamembran nicht qualitativ mittels

Phosphorylierung gesteuert werden. In Abhängigkeit von der Lokalisation

mutierter Aminosäuren im Protein konnten jedoch veränderte Zelleigenschaften

festgestellt werden. Die N-terminale Mutation an der Position Y10 führte zu

strukturellen Änderungen des Panx1-Kanals mit erhöhter

Einzelkanalleitfähigkeit und frühem Zelltod, während Mutationen in der

intrazellulären Schleife sich in N2A-Zellen wie Panx1 wt exprimierenden Zellen

verhielten. Die Mutationen Y324F, S328A und S343A im C-Terminus führten

ebenfalls zu einer erhöhten Leitfähigkeit transfizierter N2A-Zellen, die hier

jedoch auf Phosphorylierungseffekte zurückzuführen ist, welche eine erhöhte

Offenwahrscheinlichkeit, längere mittlere Öffnungsdauer, oder größere

Einzelkanalleitfähigkeit induzierte.

59

7 Zusammenfassung

Pannexine gehören, zusammen mit den Connexinen und Innexinen, zur Gap

junction-Proteinfamilie. Während Connexine gut untersucht sind, sind die

Regulationsmechanismen von Pannexinen noch nicht vollständig erforscht. Da

die Sekundärstruktur der Proteine (Hertzberg et al., 1988) und der Aufbau des

Connexin- und Pannexin-Kanals vergleichbar sind (Makowski et al., 1977;

Boassa et al., 2007), kann jedoch davon ausgegangen werden, dass die

Kanäle ähnlich reguliert werden. Angesichts der Tatsache, dass sowohl

Connexine, als auch Pannexine Phosphoproteine sind (Musil und Goodenough,

1992; Barbe et al., 2006) und der Connexin-Lebenszyklus mittels

Phosphorylierung reguliert wird (s. Review Sáez et al., 2003), sollte in dieser

Arbeit die Funktion potentieller Phosphorylierungsstellen in Panx1 untersucht

werden. Zu diesem Zweck wurden neun Aminosäuren in Panx1 mittels gezielter

Mutagenese verändert und die resultierenden Mutanten mit Hilfe eukaryoter

Expressionsvektoren in N2A-Zellen exprimiert. Unter Einsatz von Western Blot-

Analysen, konfokaler Fluoreszenzmikroskopie und elektrophysiologischen

Messungen wurden transfizierte Zellen untersucht.

Es zeigte sich, dass alle mit den unterschiedlichen Mutanten transfizierten

Zellen potentiell überlebensfähig waren und funktionsfähige Pannexin-Kanäle

gebildet wurden. Phosphorylierung scheint somit kein Mechanismus zur

Regulation der Panx1-Biosynthese oder des Transports der Kanäle zur

Membran zu sein. Während fünf der Mutationen keine Änderungen der

elektrophysiologischen Zelleigenschaften transfizierter N2A-Zellen bewirkten,

verursachte die Expression der N-terminalen Mutante Y10F und der C-

terminalen Mutanten S343A und S328A in N2A-Zellen, vermutlich über die

Ausbildung eines permanent offenen Kanals, einen frühen Zelltod. Die C-

terminale Y324F-Mutante führte zudem zu einer gesteigerten Leitfähigkeit

transfizierter N2A-Zellen. Vergleichbare Daten konnten auch aus bisher

unveröffentlichten Versuchen unserer Arbeitsgruppe mit Xenopus-Oozyten

gewonnen werden. Da bekannt ist, dass der N-Terminus in Panx1 strukturelle

Aufgaben erfüllt (Wang und Dahl, 2010), resultierten die veränderten

60

Kanaleigenschaften der Y10F-Mutante aus ihrem Einfluss auf die

Proteinstruktur. Die gesteigerte Kanal-Aktivität der C-terminalen Mutanten war

hingegen auf eine veränderte Regulation mittels Phosphorylierung

zurückzuführen.

In dieser Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass posttranslationale

Phosphorylierung ein wichtiger Mechanismus zur Regulation der Panx1-

Kanaleigenschaften ist. Da Panx1 in physiologischen und pathologischen

Prozessen, wie der Steuerung der Immunabwehr (Woehrle et al., 2010), oder

dem post-ischämischen Zelltod (Orellana et al., 2011) eine wichtige Rolle spielt,

kann ein besseres Verständnis für Panx1-Regulationsmechanismen einen

Beitrag zur Untersuchung und Therapie solcher Vorgänge leisten.

61

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9 Anhang

Abbildung A 1: Vergleich der Panx1 verschiedener Wirbeltier-Arten. Konservierte potentielle Phosphorylierungsstellen sind farbig markiert. In Rot sind Tyrosine, in Blau Serine und in Gelb das Threonin hervorgehoben. Punkte markieren konservierte Aminosäuren, Bindestriche stehen für Lücken. (Grafik freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. S. Bunse)

Absolutwerte und Standardabweichungen der elektrophysiologischen

Messungen, sowie P-Werte der statistischen Auswertung: Tabelle A 1: Statistischer Vergleich der Messwerte aus den Messungen pIRES2-EGFP-mPanx1-transfizierter N2A-Zellen mit denen aus Messungen pEGFP-N3-mPanx1-transfizierter Zellen mittels Student´s T-Test

wt Student´s T-Test

vo Student´s T-Test

IV-Kurve Eingangswiderstand P = 0,721 P = 0,408 Maximalstrom P = 0,014 P = 0,237 S-Index P = 0,018 P = 0,425 Cbx-Effekt P = 0,094 P = 0,391

(Rangsummentest) Cbx-Effekt auf den S- P = 0,227 P = 0,064

70

Index Rampe Maximalstrom P = 0,183 P = 0,009 S-Index P = 0,023 P = 0,715 Cbx-Effekt P = 0,969 P = 0,137 Cbx-Effekt auf den S-Index

P = 0,268 P = 0,003

Tabelle A 2: Statistischer Vergleich der Messwerte aus den IV-Kurven und Rampen jeweils nach Cbx-Applikation mit denen unter Kontrollbedingungen mittels paired t-test

Gemittelte Werte aus den Messungen beider Expressionsvektoren IV-Kurve Rampe

Maximalstrom S-Index Maximalstrom S-Index vo P = 0,626 P = 0,063 P = 0,009 P = 0,114 wt P < 0,001 P = 0,125 P < 0,001 P = 0,714 Y192F P < 0,001 P = 0,001 P < 0,001 P = 0,273 Y324F P = 0,009 P = 0,003 P = 0,005 P = 0,700 T387A P = 0,006 P = 0,040 P = 0,007 P = 0,720 S159A P < 0,001

(signed rank test) P = 0,032 P < 0,001

(signed rank test) P = 0,399

S206A P < 0,001 (signed rank test)

P = 0,181 P < 0,001 (signed rank test)

P = 0,613

S328A P < 0,001 P < 0,001 P = 0,003 P = 0,221 S343A P = 0,002 P < 0,001 P = 0,003 P = 0,016 S405A P < 0,001

(signed rank test) P = 0,442 P < 0,001

(signed rank test) P = 0,993

Tabelle A 3: Gemittelte Absolutwerte und Standardabweichungen aus den IV-Kurven beider Vektoren, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

Gemittelte Werte beider Expressionsvektoren IV-Kurven

Eingangswiderstand Maximalstrom S-Index Mittelwert ± Standard-abweichung [MΩ]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standard-abweichung [pA]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standard-abweichung

Student´s T-Test

vo 1644,16 ± 894,49

P = 0,226 90,05 ± 53,73

P = 0,001 (Rangsum-mentest)

0,05 ± 0,42 P < 0,001

wt 1304,86 ± 569, 50

213,67 ± 130,31

0,60 ± 0,26

Y192F 1259,72 ± 917,94

P = 0,877 298,45 ± 137,868

P = 0,103 0,66 ± 0,12 P = 0,436

Y324F 1077,88 ± 669,54

P = 0,372 434,77 ± 334,97

P = 0,022 0,63 ± 0,25 P = 0,730

T387A 1497,37 ± 954,60

P = 0,559 231,41 ± 103,52

P = 0,752 0,67 ± 0,07 P = 0,489

S159A 1202,60 ± 720,48

P = 0,678 338,81 ± 398,46

P = 0,738 (Rangsum-mentest)

0,57 ± 0,20 P = 0,795

71

S206A 1312,18 ± 504,13

P = 0,972 322,31 ± 364,30

P = 0,550 (Rangsum-mentest)

0,64 ± 0,29 P = 0,693

S328A 744,65 ± 398,32

P = 0,003 573,86 ± 471,83

P = 0,005 0,71 ± 0,14 P = 0,121

S343A 466,56 ± 277,89

P < 0,001 773,01 ± 404,37

P < 0,001 (Rangsum-mentest)

0,68 ± 0,14 P = 0,387

S405A 1346,84 ± 844,08

P = 0,877 212,75 ± 269,22

P = 0,336 (Rangsum-mentest)

0,46 ± 0,17 P = 0,119

Tabelle A 4: Gemittelte Absolutwerte und Standardabweichungen aus den IV-Kurven beider Vektoren nach Cbx-Applikation, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

Gemittelte Werte beider Expressionsvektoren IV-Kurven nach Cbx-Applikation

Cbx-Effekt auf den Maximalstrom (% vom Ausgangswert)

Cbx-Effekt auf den S-Index

Mittelwert ± Standardabweichung [%]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 103,45 ± 61,96 P = 0,001 (Rangsum-mentest)

0,36 ± 0,36 P = 0,614

wt 52,39 ± 14,99 0,42 ± 0,31 Y192F 48,84 ± 8,10 P = 0,462 0,37 ± 0,21 P = 0,683 Y324F 42,22 ± 13,65 P = 0,091 0,26 ± 0,24 P = 0,171 T387A 50,76 ± 17,43 P = 0,818 0,43 ± 0,28 P = 0,936 S159A 49,03 ± 14,62 P = 0,543 0,36 ± 0,26 P = 0,580 S206A 56,72 ± 14,18 P = 0,441 0,50 ± 0,20 P = 0,400 S328A 47,57 ± 15,04 P = 0,363 0,27 ± 0,42 P = 0,151

(Rangsum-mentest)

S343A 45,93 ± 18,89 P = 0,349 -0,01 ± 0,29 P = 0,002 S405A 51,94 ± 13,24 P = 0,933 0,39 ± 0,27 P = 0,836

Tabelle A 5: Gemittelte Absolutwerte und Standardabweichungen aus den Rampen beider Vektoren, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

Gemittelte Werte beider Expressionsvektoren Rampen

Maximalstrom S-Index Mittelwert ± Standardabweichung [pA]

Student´s T-Test Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 182,58 ± 87,50 P = 0,003 0,08 ± 0,37 P < 0,001 wt 319,16 ± 164,85 0,56 ± 0,21 Y192F 435,48 ± 195,00 P = 0,094 0,59 ± 0,13 P = 0,697 Y324F 588,60 ± 411,32 P = 0,023 0,61 ± 0,19 P = 0,588 T387A 332,28 ± 131,88 P = 0,854 0,51 ± 0,14 P = 0,534 S159A 485,14 ± 453,05 P = 0,357

(Rangsummentest) 0,47 ± 0,34 P = 0,395

S206A 392,51 ± 299,22 P = 0,413 (Rangsummentest)

0,64 ± 0,19 P = 0,286

72

S328A 676,79 ± 539,19 P = 0,010 (Rangsummentest)

0,60 ± 0,19 P = 0,599

S343A 893,97 ± 446,17 P < 0,001 (Rangsummentest)

0,63 ± 0,23 P = 0,434

S405A 331,32 ± 327,71 P = 0,427 (Rangsummentest)

0,45 ± 0,29 P = 0,229

Tabelle A 6: Gemittelte Absolutwerte und Standardabweichungen aus den Rampen beider Vektoren nach Cbx-Applikation, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

Gemittelte Werte beider Expressionsvektoren Rampen nach Cbx-Applikation

Cbx-Effekt auf den Maximalstrom (% vom Ausgangswert)

Cbx-Effekt auf den S-Index

Mittelwert ± Standardabweichung [%]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 77,39 ± 29,45 P = 0,013 (Rangsum-mentest)

0,27 ± 0,35 P = 0,018

wt 52,64 ± 14,66 0,56 ± 0,28 Y192F 58,03 ± 12,65 P = 0,312 0,44 ± 0,50 P = 0,435 Y324F 50,98 ± 13,69 P = 0,773 0,66 ± 0,21 P = 0,349 T387A 55,02 ± 15,30 P = 0,725 0,45 ± 0,42 P = 0,478 S159A 49,59 ± 15,14 P = 0,582 0,54 ± 0,24 P = 0,881 S206A 57,58 ± 9,97 P = 0,338 0,60 ± 0,25 P = 0,660 S328A 56,13 ± 13,33 P = 0,489 0,58 ± 0,18 P = 0,798 S343A 58,92 ± 18,55 P = 0,352 0,39 ± 0,14 P = 0,106 S405A 49,55 ± 12,12 P = 0,543 0,41 ± 0,35 P = 0,229

Tabelle A 7: Statistischer Vergleich der Messwerte aus den IV-Kurven und Rampen nach Cbx-Applikation mit denen unter Kontrollbedingungen gemessen in pIRES-EGFP-transfizierten N2A-Zellen mittels paired t-test

pIRES2-EGFP-transfizierte N2A-Zellen IV-Kurve Rampe

Maximalstrom S-Index Maximalstrom S-Index vo P = 0,219 P = 0,390 P = 0,065 P = 0,961 wt P = 0,002 P = 0,046 P = 0,001 P = 0,088 Y192F P = 0,007 P = 0,008 P = 0,005 P = 0,141 Y324F P = 0,061 P = 0,002 P = 0,022 P = 0,159 T387A P = 0,041 P = 0,101 P = 0,057 P = 0,123 S159A P = 0,095 P = 0,015 P = 0,052 P = 0,642 S206A P = 0,001 P = 0,019 P = 0,015 P = 0,468 S328A P = 0,016 P < 0,001 P = 0,046 P = 0,038 S343A P = 0,057 P = 0,025 P = 0,125 P = 0,104 S405A P = 0,014 P = 0,867 P = 0,021 P = 0,020

73

Tabelle A 8: Mittelwerte und Standardabweichungen aus den IV-Kurven pIRES2-EGFP-transfizierter N2A-Zellen, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test und Rangsummentest

pIRES2-EGFP-transfizierte N2A-Zellen IV-Kurve

Eingangswiderstand Maximalstrom S-Index Mittelwert ± Standard-abweichung [MΩ]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standard-abweichung [pA]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standard-abweichung

Student´s T-Test

vo 2041,91 ± 1311,83

P = 0,074 74,35 ± 53,40

P < 0,001 -0,04 ± 0,40 P < 0,001

wt 1245,01 ± 767,88

291,99 ± 134,48

0,73 ± 0,22

Y192F 1954,75 ± 947,45

P = 0,181 214,33 ± 104,15

P = 0,297 0,76 ± 0,08 P = 0,827

Y324F 1175,54 ± 509,13

P = 0,866 401,26 ± 269,35

P = 0,346 0,79 ± 0,09 P = 0,589

T387A 1618,78 ± 833,87

P = 0,471 201,51 ± 69,03

P = 0,242 0,68 ± 0,09 P = 0,669

S159A 1191,34 ± 769,74

P = 0,904 358,90 ± 423,77

P = 0,679 0,64 ± 0,16 P = 0,383

S206A 1459,62 ± 323,70

P = 0,543 252,62 ± 94,71

P = 0,553 0,76 ± 0,06 P = 0,751

S328A 727,22 ± 470,97

P = 0,171 719,90 ± 573,57

P = 0,058 0,72 ± 0,13 P = 0,874

S343A 398,07 ± 257,74

P = 0,066 931,32 ± 485,26

P = 0,005 0,66 ± 0,13 P = 0,537

S405A 1654,09 ± 1029,49

P = 0,366 (Rangsum-mentest)

111,00 ± 39,06

P = 0,008 0,42 ± 0,19 P = 0,015

Tabelle A 9: Mittelwerte und Standardabweichungen aus den IV-Kurven pIRES2-EGFP-transfizierter N2A-Zellen nach Cbx-Applikation, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

pIRES2-EGFP-transfizierte N2A-Zellen IV-Kurve nach Cbx-Applikation

Cbx-Effekt auf den Maximalstrom (% vom Ausgangswert)

Cbx-Effekt auf den S-Index

Mittelwert ± Standardabweichung [%]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 100,32 ± 37,64 P = 0,002 -0,69 ± 0,60 P = 0,402 wt 45,92 ± 15,78 0,32 ± 0,4 Y192F 48,39 ± 8,13 P = 0,755 0,32 ± 0,16 P = 0,997 Y324F 35,71 ± 9,73 P = 0,223 0,42 ± 0,14 P = 0,593 T387A 44,58 ± 18,88 P = 0.898 0,36 ± 0,36 P = 0,850 S159A 49,61 ± 9,94 P = 0,626 0,40 ± 0,20 P = 0,641 S206A 59,44 ± 12,91 P = 0,113 0,62 ± 0,10 P = 0,097 S328A 52,39 ± 13,64 P = 0,379 0,42 ± 0,19 P = 0,499 S343A 54,33 ± 12,58 P = 0,378 0,13 ± 0,14 P = 0,385 S405A 49,95 ± 17,04 P = 0,655 0,35 ± 0,34 P = 0,885

74

Tabelle A 10: Mittelwerte und Standardabweichungen aus den Rampen pIRES2-EGFP-transfizierter N2A-Zellen, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

pIRES2-EGFP-transfizierte N2A-Zellen Rampe

Maximalstrom S-Index Mittelwert ± Standardabweichung [pA]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 130,59 ± 76,17 P = 0,001 0,03 ± 0,31 P < 0,001 wt 376,65 ± 165,78 0,68 ± 0,20 Y192F 321,25 ± 164,70 P = 0,569 0,65 ± 0,15 P = 0,779 Y324F 488,82 ± 217,14 P = 0,435

(Rangsum-mentest)

0,70 ± 0,13 P = 0,870

T387A 291,89 ± 124,73 P = 0,392 0,55 ± 0,16 P = 0,273 S159A 460,75 ± 470,02 P = 0,644 0,41 ± 0,50 P = 0,191 S206A 333,28 ± 92,01 P = 0,576 0,68 ± 0,15 P = 0,967 S328A 838,91 ± 663,90 P = 0,075 0,66 ± 0,15 P = 0,846 S343A 1085,72 ± 572,39 P = 0,007 0,72 ± 0,29 P = 0,783 S405A 194,99 ± 74,72 P = 0,029 0,32 ± 0,17 P = 0,006

Tabelle A 11: Mittelwerte und Standardabweichungen aus den Rampen pIRES2-EGFP-transfizierter N2A-Zellen nach Cbx-Applikation, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

Tabelle A 12: Statistischer Vergleich der Messwerte aus den IV-Kurven und Rampen nach Cbx-Applikation mit denen unter Kontrollbedingungen gemessen in pEGFP-N3-transfizierten N2A-Zellen mittels paired t-test

pEGFP-N3-transfizierte N2A-Zellen IV-Kurve Rampe

Maximalstrom S-Index Maximalstrom S-Index vo P = 0,904 P = 0,118 P = 0,033 P = 0,089 wt P = 0,004 P = 0,575 P = 0,003 P = 0,067 Y192F P < 0,001 P = 0,047 P = 0,003 P = 0,464 Y324F P = 0,124 P = 0,110 P = 0,103 P = 0,165 T387A P = 0,173 P = 0,332 P = 0,166 P = 0,175

pIRES2-EGFP-transfizierte N2A-Zellen Rampe nach Cbx-Applikation

Cbx-Effekt auf den Maximalstrom (% vom Ausgangswert)

Cbx-Effekt auf den S-Index

Mittelwert ± Standardabweichung [%]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 88,07 ± 19,20 P = 0,002 0,05 ± 0,24 P = 0,006 wt 52,80 ± 19,12 0,48 ± 0,31 Y192F 57,51 ± 12,50 P = 0,673 0,17 ± 0,62 P = 0,256 Y324F 43,55 ± 9,75 P = 0,342 0,53 ± 0,17 P = 0,729 T387A 48,54 ± 13,05 P = 0,699 0,24 ± 0,44 P = 0,296 S159A 55,63 ± 14,34 P = 0,767 0,51 ± 0,20 P = 0,867 S206A 66,53 ± 18,95 P = 0,207 0,61 ± 0,32 P = 0,462 S328A 59,85 ± 19,95 P = 0,432 0,57 ± 0,20 P = 0,804 S343A 68,47 ± 21,49 P = 0,227 0,38 ± 0,11 P = 0,557 S405A 52,33 ± 16,88 P = 0,963 0,51 ± 0,38 P = 0,879

75

S159A P = 0,016 (signed rank test)

P = 0,264 P = 0,016 (signed rank test)

P = 0,501

S206A P = 0,031 (signed rank test)

P = 0,548 P = 0,031 (signed rank test)

P = 0,977

S328A P = 0,009 P = 0,011 P = 0,003 P = 0,818 S343A P = 0,036 P = 0,010 P = 0,010 P = 0,119 S405A P = 0,016

(signed rank test) P = 0,408 P = 0,016

(signed rank test) P = 0,345

Tabelle A 13: Mittelwerte und Standardabweichungen aus den IV-Kurven pEGFP-N3-transfizierter N2A-Zellen, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test und Rangsummentest

pEGFP-N3-transfizierte N2A-Zellen IV-Kurve

Eingangswiderstand Maximalstrom S-Index Mittelwert ± Standard-abweichung [MΩ]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standard-abweichung [pA]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standard-abweichung

Rangsum-mentest

vo 1543,72 ± 838,16

P = 0,576 104,19 ± 52,64

P = 0,216 0,13 ± 0,45 P = 0,114

wt 1357,22 ± 369,51

144,04 ± 80,94

0,44 ± 0,21

Y192F 763,28 ± 506,23

P = 0,021 358,54 ± 132,32

P = 0,001 0,59 ± 0,09 P = 0,099

Y324F 980,23 ± 851,81

P = 0,833 (Rangsum-mentest)

468,29 ± 420,84

P = 0,083 (Rangsum-mentest)

0,47 ± 0,25 P = 0,803

T387A 1335,48 ± 1273,57

P = 0,965 271,25 ± 144, 35

P = 0,078 0,64 ± 0,02 P = 0,134

S159A 1584,5 ± 1254,99

P = 0,634 287,99 ± 390,25

P = 0,290 (Rangsum-mentest)

0,54 ± 0,21 P = 0,498

S206A 1164,73 ± 634,17

P = 0,490 391,99 ± 520,91

P = 0,263 (Rangsum-mentest)

0,51 ± 0,37 P = 0,662

S328A 767,06 ± 316,00

P = 0,006 386,10 ± 211,66

P = 0,007 0,70 ± 0,17 P = 0,021

S343A 521,35 ± 310,14

P = 0,002 646,36 ± 324,53

P = 0,003 (Rangsum-mentest)

0,69 ± 0,16 P = 0,042

S405A 1083,48 ± 605,33

P = 0,304 299,97 ± 352,79

P = 0,216 0,50 ± 0,16 P = 0,553

Tabelle A 14: Mittelwerte und Standardabweichungen aus den IV-Kurven pEGFP-N3-transfizierter N2A-Zellen nach Cbx-Applikation, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

pEGFP-N3-transfizierte N2A-Zellen IV-Kurve nach Cbx-Applikation

Cbx-Effekt auf den Maximalstrom (% vom Ausgangswert)

Cbx-Effekt auf den S-Index

Mittelwert ± Standardabweichung [%]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 106,27 ± 80,00 P = 0,093 0,51 ± 0,35 P = 0,985 wt 58,15 ± 12,35 0,51 ± 0,19 Y192F 49,16 ± 8,71 P = 0,125 0,42 ± 0,23 P = 0,407

76

Y324F 48,73 ± 14,79 P = 0,226 0,09 ± 0,21 P = 0,003 T387A 58,99 ± 14,09 P = 0,923 0,51 ± 0,18 P = 0,945 S159A 54,24 ± 23,60 P = 0,233 0,35 ± 0,30 P = 0,154 S206A 54,00 ± 16,07 P = 0,581 0,39 ± 0,21 P = 0,278 S328A 41,36 ± 15,41 P = 0,030 0,11 ± 0,55 P = 0,058 S343A 39,21 ± 21,62 P = 0,056 -0,12 ± 0,35 P < 0,001 S405A 53,65 ± 10,06 P = 0,488 0,43 ± 0,23 P = 0,499

Tabelle A 15: Mittelwerte und Standardabweichungen aus den Rampen pEGFP-N3-transfizierter N2A-Zellen, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

pEGFP-N3-transfizierte N2A-Zellen Rampe

Maximalstrom S-Index Mittelwert ± Standardabweichung [pA]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 229,38 ± 70,86 P = 0,486 0,11 ± 0,43 P = 0,036 wt 268,05 ± 155,11 0,45 ± 0,17 Y192F 517,07 ± 181,63 P = 0,010 0,54 ± 0,11 P= 0,247 Y324F 688,37 ± 555,54 P = 0,110

(Rangsum-mentest)

0,51 ± 0,21 P = 0,570

T387A 386,12 ± 145,70 P = 0,275 0,45 ± 0,12 P = 0,963 S159A 459,64 ± 458,64 P = 0,177 0,49 ± 0,21 P = 0,542 S206A 451,75 ± 425,56 P = 0,252 0,60 ± 0,22 P = 0,163 S328A 468,36 ± 221,53 P = 0,051 0,51 ± 0,21 P = 0,545 S343A 740,56 ± 293,63 P = 0,002 0,56 ± 0,15 P = 0,264 S405A 448,18 ± 419,07 P = 0,251 0,54 ± 0,34 P = 0,540

Tabelle A 16: Mittelwerte und Standardabweichungen aus den Rampen pEGFP-N3-transfizierter N2A-Zellen nach Cbx-Applikation, sowie die P-Werte des statistischen Vergleichs der Mutanten mit dem Wildtyp mittels Student´s T-Test

pEGFP-N3-transfizierte N2A-Zellen Rampe nach Cbx-Applikation

Cbx-Effekt auf den Maximalstrom (% vom Ausgangswert)

Cbx-Effekt auf den S-Index

Mittelwert ± Standardabweichung [%]

Student´s T-Test

Mittelwert ± Standardabweichung

Student´s T-Test

vo 67,77 ± 34,50 P = 0,220 0,52 ± 0,29 P = 0,372 wt 52,51 ± 10,48 0,57 ± 0,24 Y192F 58,41 ± 13,73 P = 0,345 0,66 ± 0,25 P = 0,955 Y324F 58,42 ± 13,73 P = 0,382 0,82 ± 0,14 P = 0,211 T387A 63,66 ± 15,85 P = 0,185 0,73 ± 0,19 P = 0,619 S159A 47,85 ± 16,80 P = 0,221 0,57 ± 0,28 P = 0,604 S206A 56,12 ± 12,07 P = 0,548 0,60 ± 0,18 P = 0,689 S328A 51.88 ± 9,63 P = 0,905 0,60 ± 0,15 P = 0,677 S343A 51,29± 13,32 P = 0,852 0,39 ± 0,18 P = 0,068 S405A 47,18 ± 6,51 P = 0,259 0,42 ± 0,33 P = 0,057

Danksagung An erster Stelle möchte ich Herrn Professor Dr. R. Dermietzel für die

Überlassung des Themas dieser Arbeit, die Möglichkeit in seinem Labor zu

arbeiten und die Übernahme des Referats danken.

Weiterhin danke ich Herrn PD Dr. M. Schmidt und Frau Dr. S. Bunse für die

Betreuung meiner Arbeit, ihre unaufhörliche Diskussionsbereitschaft, die

Beantwortung aller Fragen und dafür, dass sie meine Arbeit Korrektur gelesen

haben. Frau Dr. S. Bunse möchte ich insbesondere für die Herstellung der

Plasmide und die Hilfe bei den konfokalen Aufnahmen danken, Herrn Dr. M.

Schmidt für die Hilfe bei Problemen mit den elektrophysiologischen Messungen.

Auch bei Frau Dr. K. Engelhardt möchte ich mich dafür bedanken, dass Sie

meine Arbeit Korrektur gelesen hat.

Mein Dank gilt außerdem Helga Schulze für ihre Hilfe bei der Bildgestaltung,

Christiane Zoidl, Jeannette Willms, Sabine Peuckert und Sabine Schreiber-

Minjoli für ihre Hilfe in labortechnischen Angelegenheiten und PD Dr. G. Zoidl

für seine Ratschläge und sein Interesse an meiner Arbeit.

Außerdem danke ich meinen Eltern, meiner Schwester und Florian Blumeroth,

die immer für mich da sind.

10 Lebenslauf

Persönliche Daten Name Laura Twardowski Geburtsdatum 12.07.1981 Geburtsort Düsseldorf, Deutschland Familienstand ledig

Schulbildung 1988 - 1992 Grundschule Bruchfeld, Hattingen 1992 - 2001 Gymnasium Waldstrasse, Hattingen Abschluss: Abitur

Hochschulausbildung 10/2001 - 09/2003 Studiengang Biologie (Diplom), Heinrich-Heine-

Universität Düsseldorf Abschluss: Vordiplom

10/2004 - 10/2006 Studiengang Biologie (Diplom), Ruhr-Universität-Bochum Abschluss: Diplom Thema der Diplomarbeit: „Mechanismen lokaler Hemmung im Visuellen System der Ratte“, angefertigt im Lehrstuhl für Allgemeine Zoologie und Neurobiologie bei PD Dr. M. Schmidt

10/2003 - 12/2010 Studiengang Medizin, Ruhr-Universität- Bochum Approbation 12/2010

seit 06/2008 Experimentelle Doktorarbeit im Studiengang Medizin, Ruhr-Universität Bochum, Abteilung für Neuroanatomie und Molekulare Hirnforschung bei Prof. Dr. R. Dermietzel Thema: „Regulation von Pannexin1 durch Phosphorylierung“

Praktische Tätigkeiten

09/2004 Teilnahme an den Forschungsprojekten „Postnatale Chromosomenanalyse“ und „Suche nach neuen Mutationen in hereditären Neuropathien“ am Institut für Medizinische Biologie und Humangenetik der Karl-Franzens Universität Graz (Österreich) mit IFMSA (International Federation of Medical Students´ Association)

11/2005 - 02/2006 Studentische Hilfskraft im Studienfach Biologie, Ruhr-Universität Bochum

03/2007 Famulatur bei Herrn R. Höffken, niedergelassener Facharzt für Psychotherapeutische Medizin und Facharzt für Kinder- und Jugendpsychiatrie, Duisburg

06/2007 - 10/2007 Wissenschaftliche Hilfskraft im Studienfach Biologie, Ruhr-Universität Bochum

07/2007 Studienaufenthalt im Rahmen der Doktorarbeit am Institut für Medizinische Grundlagenforschung der Universität von Oslo (Norwegen)

09/2007 Famulatur im Universitätskrankenhaus „Mater Misericordiae“ des Universitäts Colleges Dublin (Irland) im Fachbereich Pneumologie und Transplantationsmedizin

02/2008 Famulatur bei Dr. R. Müller, niedergelassener Facharzt für Radiologie, Hattingen

03/2008 Famulatur bei Dr. D. Metzler, niedergelassener Facharzt für Strahlentherapie, Hattingen

09/2008 Famulatur im Piteå Älvdals Krankenhaus (Schweden) in der Abteilung für Innere Medizin

08/2009 - 07/2010 Praktisches Jahr im Marien-Hospital Witten (Innere Medizin, Chirurgie, Gynäkologie)

seit 04/2011 Assistenzärztin in der Abteilung für Labormedizin des Robert-Bosch-Krankenhauses in Stuttgart