Aus der Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin ... · infektiöser (z.B. Trauma, Verbrennung, Pankreatitis) Natur sein kann. Diese systemische Diese systemische Reaktion ist

Aus der Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin, Notfallmedizin und Schmerzmedizin

(Direktor Univ.- Prof. Dr. med. Klaus Hahnenkamp)

der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

Thema: Tierexperimentelle Untersuchung des Einflusses von aktiviertem Protein C auf die

mesenteriale Plasmaextravasation und Leukozyten- Endothel- Interaktion bei Endotoxinämie

Inaugural – Dissertation

zur

Erlangung des akademischen

Grades

Doktor der Medizin

(Dr. med.)

der

Universitätsmedizin

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

2015

Vorgelegt von: Michael Schade geb. am: 13.03.1983 in: Greiz

2

Dekan: Prof. Dr. med. dent. Reiner Biffar

1. Gutachter: Prof. Dr. Christian Lehmann

2. Gutachter: PD Dr. Birnbaum

Ort, Raum: Greifswald, Seminarraum L02.22

Tag der Disputation: 16.12.2015

3

Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG..............................................................................................................................................71.1 GESCHICHTEDERSEPSIS........................................................................................................................................71.2 BEGRIFFSDEFINITIONEN........................................................................................................................................71.3 EPIDEMIOLOGIEDERSEPSIS.................................................................................................................................81.4 PATHOPHYSIOLOGIEDERSEPSIS.......................................................................................................................11

Überblick..........................................................................................................................................................111.4.1 DieMikrozirkulationwährendderSepsis.........................................................................................161.4.2 AktiviertesProteinC...................................................................................................................................261.4.3

2 AUFGABENSTELLUNG.........................................................................................................................283 MATERIALUNDMETHODEN.............................................................................................................293.1 VERSUCHSTIERE...................................................................................................................................................293.2 VERSUCHSABLAUF................................................................................................................................................29

OperativeTechniken...................................................................................................................................303.2.13.3 UNTERSUCHUNGSMETHODEN............................................................................................................................31

Endotoxinmodell...........................................................................................................................................313.3.1 Intravitalmikroskopie................................................................................................................................323.3.2 Extravasation.................................................................................................................................................333.3.3 Leukozyten-Endothel-Interaktion........................................................................................................333.3.4 Laborparameter...........................................................................................................................................343.3.5 StatistischeMethoden................................................................................................................................353.3.6

4 ERGEBNISSE...........................................................................................................................................364.1 INTRAVITALMIKROSKOPIE..................................................................................................................................36

Extravasation.................................................................................................................................................364.1.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion........................................................................................................384.1.2

4.2 LABORPARAMETER..............................................................................................................................................41 Laktat................................................................................................................................................................414.2.1 Zytokine............................................................................................................................................................434.2.2

4.3 HÄMODYNAMIK....................................................................................................................................................47 MittlererarteriellerBlutdruck...............................................................................................................474.3.1 Herzfrequenz..................................................................................................................................................484.3.2 Atemfrequenz.................................................................................................................................................504.3.3 Temperatur.....................................................................................................................................................514.3.4

5 DISKUSSION............................................................................................................................................535.1 INTRAVITALMIKROSKOPIE..................................................................................................................................53

Plasmaextravasation..................................................................................................................................535.1.1 Leukozyten-Endothel-Interaktion........................................................................................................555.1.2

5.2 LABORPARAMETER..............................................................................................................................................58 Laktat................................................................................................................................................................585.2.1 Zytokine............................................................................................................................................................595.2.2

5.3 HÄMODYNAMISCHEPARAMETER......................................................................................................................63 MittlererarteriellerBlutdruck...............................................................................................................635.3.1 Herzfrequenz..................................................................................................................................................645.3.2 Atemfrequenz.................................................................................................................................................655.3.3 Temperatur.....................................................................................................................................................665.3.4

5.4 LIMITATIONEN......................................................................................................................................................676 ZUSAMMENFASSUNG...........................................................................................................................707 LITERATURVERZEICHNIS..................................................................................................................71

4

Abbildungsverzeichnis

Abb.1:Leukozyten-Endothel-Interaktionen.......................................................................................18

Abb.2:Gerinnungskaskade..........................................................................................................................22

Abb.3:Versuchsablauf...................................................................................................................................30

Abb.4:Plasmaextravasation........................................................................................................................36

Abb.5:TemporäradhärentenLeukozyten............................................................................................38

Abb.6:FestadhärenteLeukozyten...........................................................................................................39

Abb.7:Laktatkonzentration........................................................................................................................41

Abb.8:TNF-αKonzentration.......................................................................................................................43

Abb.9:IL-1βKonzentration.........................................................................................................................44

Abb.10:Interleukin-6Konzentration.....................................................................................................45

Abb.11:Interleukin-10Konzentration...................................................................................................46

Abb.12:MittlererarteriellerBlutdruck.................................................................................................47

Abb.13:Herzfrequenz....................................................................................................................................48

Abb.14:Atemfrequenz...................................................................................................................................50

Abb.15:Temperatur.......................................................................................................................................51

Abkürzungsverzeichnis

ACCP American College of Chest Physicians

ADDRESS Administration of Drotrecogin Alfa (Activated) in Early Stage Severe

Sepsis

ALI Acute Lung Injury

AP Activating Protein

AT Antithrombin

ARDS Acute Respiratory Distress Syndrome

BPM Beats Per Minute

CAM Cellular Adhesion Molecule

CASP Colon Ascendens Stent Peritonitis

CARS Compensatory Antiinflammatory Response Syndrome

CD Cluster of Differentiation

CDC Center for Disease Control

CLP Cecal Ligation and Puncture

DAMP Danger- Associated Molecular Patterns

DIC Disseminated Intravascular Coagulation

DNA Deoxyribonucleic Acid

ENHANCE Extended Evaluation of Recombinant Human Activated Protein C

eNOS endothelial Nitric Oxide Synthease

EPCR Endothelial Protein C Receptor

EPIC Extended Prevalence of Infection in the ICU

FITC Flouroescinisothiocyanat

HIV Humanes Immundefizienz Virus

ICAM Intercellular Adhesion Molecule

IFN Interferon

IL Interleukin

IL-1ra Interleukin-1 Receptor Antagonist

iNOS inducible Nitric Oxide Synthease

IRF Interferon- Regulating Factor

IVM Intravitalmikroskopie

KG Körpergewicht

LBP LPS- Binding Protein

6

LPS Lipopolysaccharid

MAP Mean Arterial Pressure

MODS Multiple Organ Dysfunction Syndrome

MOV Multiorganversagen

mmHG Millimeter Quecksilbersäule

NaCl Natriumchlorid

NO Stickstoffmonoxid

NOD Nucleotide- binding Oligomerization Domain

NF-κB Nuclear Factor Kappa- light- chain- enhancer of activated B-cells

PAF Platelet- Activating Factor

PAI-1 Plasminogen Activator Inhibitor-1

PAMP Pathogen- Associated Molecular Patterns

PAR Protease Activated Receptors

PC Protein C

PIRO Predisposition, Infection, Response, Organ failure

PROWESS Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis

PRR Pattern Recognition Receptor

PSGL-1 P-Selektin Glykoprotein Ligand

RIG-1 Retinoic acid Inducible Gene 1

RNS Reactive Nitrogen Species

ROS Reactive Oxygen Species

S1P Sphingosin-1-Phosphat

S1P1 Sphingosin-1-Phosphat Receptor 1

SCCM Society of Critical Care Medicine

SIRS Systemic Inflammatory Response Syndrome

T-PA Tissue Plasminogen Activator

TAFI Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor

TF Tissue Factor

TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor

TLR Toll- Like Receptors

TM Thrombomodulin

TNF Tumor Necrosis Factor

U-PA Urokinase- type Plasminogen Activator

VCAM vascular adhesion molecule

7

1 Einleitung

1.1 Geschichte der Sepsis

Obwohl die Sepsis, von der Millionen von Patienten betroffen sind, eine der größten

Herausforderungen der modernen Medizin darstellt, ist sie kein Phänomen der Neuzeit. Eine

altägyptische Fallsammlung von 3.000 vor Christus ist die älteste bekannte Abhandlung in der

Symptome der Sepsis wie Fieber und Eiterbildung als sekundäre Komplikationen nach

Verletzungen und Frakturen beschrieben werden. Das Wort Sepsis ist griechischen Ursprungs

und bedeutet „Dekomposition von tierischem oder pflanzlichem organischem Material“. Im

Mittelalter verschwand das Wort aus dem medizinischen Sprachgebrauch Europas und wurde

erst in der Renaissance „wiederentdeckt“. Mit dem Aufkommen von Pasteurs Theorie, dass

mikrobiologische Organismen für die Entstehung von Krankheiten verantwortlich sind, wurde

der Begriff Sepsis gleichbedeutend mit Septikämie, Pyämie oder Saprämie verwendet (1). Da

keine einheitliche Definition der Sepsisbegriffe bestand, führte das American College of

Chest Physicians (ACCP) und die Society of Critical Care Medicine (SCCM) 1991 eine

einheitliche Nomenklatur ein. Dabei wurden die Begriffe Systemic Inflammatory Response

Syndrome (SIRS), Sepsis, schwere Sepsis, septischer Schock und Multi Organ Dysfunction

Syndrome (MODS) geprägt (2).

1.2 Begriffsdefinitionen

Unter dem Begriff SIRS versteht man eine systemische Reaktion des Körpers auf einen

entzündlichen Stimulus, der infektiöser (z. B. Bakteriämie, Fungämie, Virämie) und nicht

infektiöser (z.B. Trauma, Verbrennung, Pankreatitis) Natur sein kann. Diese systemische

Reaktion ist definiert als das Vorliegen von mindestens zwei der folgenden vier Parameter:

1. Körpertemperatur über 38°C oder unter 36°C

2. Herzfrequenz über 90 Schläge pro Minute

3. Tachypnoe (Atemfrequenz über 20 Atemzüge pro Minute) oder Hyperventilation (PaCO2

unter 32 mmHg)

4. Leukozytose (über 12.000 Zellen/µL Blut) oder Leukopenie (unter 4000 Zellen/µL Blut)

oder über 10% unreife neutrophile Granulozyten im Differenzialblutbild

8

Kann bei einem SIRS eine infektiöse Ursache z.B. durch Blutkulturen nachgewiesen werden,

liegt eine Sepsis vor. Wenn zusätzlich Zeichen einer Einschränkung der Organfunktion wie

z.B. Laktatazidose, Oligurie oder eine akute Verschlechterung des Geisteszustandes eintreten,

spricht man von einer schweren Sepsis. Entwickelt sich außerdem eine Hypotension, die

nicht auf Flüssigkeitsgaben reagiert, ist ein septischer Schock eingetreten.

Tritt neben dem septischen Schock noch eine Organdysfunktion oder ein Organversagen in

mehr als einem Organsystem ein spricht man von Multiorgandysfunktionssyndrom (MODS)

oder Multiorganversagen (MOV).

Diese 1991 definierten Stadien beschreiben das Kontinuum einer Krankheit deren Übergänge

fließend sind und dienen vor allem dazu, die Behandlung und Erforschung der Sepsis zu

verbessern. 2001 erfolgte eine Revision und Erweiterung dieser Kriterien, die eine bessere

und schnellere Diagnose der Sepsis ermöglichen sollte, jedoch die eigentlichen Definitionen

nicht veränderte. Weiterhin wurde das PIRO-System zum Staging der Sepsis analog zu

Krebserkrankungen eingeführt (2).

1.3 Epidemiologie der Sepsis

Aufgrund nationaler Unterschiede in der Dokumentation der Sepsis sind epidemiologische

Daten schwer zu vergleichen. Viele Studien untersuchen oft nur die Inzidenz auf

Intensivstationen oder in bestimmten Patientenpopulationen. In den Industrieländern wie der

USA stellten Martin et al. im Jahr 2000 eine Inzidenz von 240 Fällen pro 100.000 Einwohner

fest, in Europa bewegt sich die Inzidenz der Sepsis je nach Land zwischen 40 und 110 Fälle

pro 100.000 Einwohner und in Australien kommt es zu 77 Fällen pro 100.000 Einwohner (3-

7). Bisher gibt es kaum belastbare Studien die Rückschlüsse auf die Inzidenz in

Entwicklungs- und Schwellenländer zulassen. In Deutschland liegt die Inzidenz der Sepsis bei

116 Fällen pro 100.000 Einwohner und die der schweren Sepsis bei 110 Fällen pro 100.000

Einwohner (5). Die Inzidenz der Sepsis ist von einer Reihe von Faktoren wie Alter und

Komorbiditäten (Onkologische Erkrankungen, HIV, Diabetes) abhängig. Martin et al.

konnten nachweisen, dass in den USA Patienten über 65 fast ein Drittel aller Sepsispatienten

ausmachen (8). Während die allgemeine Inzidenz bei pädiatrischen Patienten mit 56 Fällen

pro 100.000 Einwohner niedrig ist, ist sie bei Neugeborenen und Kleinkindern bis einem Jahr

mit 516 Fälle pro 100.000 Einwohner besonders hoch (9).

9

Einige Untersuchungen legen nahe, dass die allgemeine Inzidenz der Sepsis in den letzten

Jahrzehnten angestiegen ist. Während das Center for Disease Control (CDC) in den USA

1979 noch von 73,6 Fällen pro 100.000 Einwohner ausging, waren es 1989 bereits 175,9 Fälle

auf 100.000 Einwohner (10). Hartman et al. haben ebenfalls einen Anstieg der Sepsisinzidenz

bei pädiatrischen Patienten festgestellt (11).

Die hohe gesellschaftliche Relevanz erschließt sich aus der Mortalität, die international auf

Intensivstationen auf 5- 80% (je nach Sepsisgrad) geschätzt wird (12). Die Mortalität ist von

mehreren Faktoren abhängig wie Alter, Geschlecht, Schwere der Sepsis und Komorbiditäten.

Sowohl sehr junge als auch sehr alte Patienten weisen eine überproportional höhere Mortalität

auf (9,13). Frauen haben eine höhere Wahrscheinlichkeit an einer schweren Sepsis oder einem

septischem Schock zu versterben, trotz einer höheren Inzidenz bei männlichen Patienten (14).

Eine Erklärung für diese höhere Mortalität konnte noch nicht gefunden werden. Mit

zunehmender Schwere der Sepsis, steigt auch das Risiko zu versterben. In der Literatur wird

die Mortalität der Sepsis mit bis zu 30%, der schweren Sepsis mit bis zu 50% und des

septischen Schocks mit bis zu 80% angegeben (15).

Auf deutschen Intensivstationen beträgt die Mortalität der schweren Sepsis 55%. Sie ist damit

höher als in anderen europäischen Ländern und wird darauf zurückgeführt, dass das

Patientenkollektiv in Deutschland älter ist (5).

Der häufigsten Infektionsherde sind die Lunge, der Urogenitaltrakt und das Abdomen, häufig

können Erreger im Blut isoliert werden ohne das ein infektiöser Fokus nachgewiesen werden

kann (15).

Die Erreger, die eine bakterielle Sepsis hervorrufen können, sind starken regionalen

Unterschieden unterworfen. Studienergebnisse von Martin et al. aus dem Jahr 2003 belegen,

dass in den USA Erreger aus dem gram-positiven Spektrum dominieren. Die 2009 in Europa

durchgeführte EPIC II Studie zeigt hingegen eine höhere Prävalenz von gram-negativen

Erregern. Daten aus Entwicklungsländer legen nahe, dass auch dort die gram-negativen

Organismen dominieren, während eine große Erhebung im Schwellenland China kein

Überwiegen einer besonderen Spezies aufweisen (3,16-20). Gram-negative septische

Erkrankungen scheinen mit einer höheren Mortalität vergesellschaftet zu sein (21). Fungi

nehmen weiter an Bedeutung zu und können in 20% als ursächliche Erreger isoliert werden

(3,22). Es ist aber anzumerken das nur in 10-20% aller Fälle Erreger nachgewiesen werden

können (23).

Überlebt ein Patient eine Sepsis, ist seine Lebensqualität danach deutlich eingeschränkt (24).

Die Wahrscheinlichkeit zu versterben ist noch 5 Jahre nach durchgemachter Sepsis erhöht,

10

besonders bei älteren Patienten besteht die Gefahr dauerhafte kognitive, psychische und

funktionelle Defizite zu entwickeln (25,26).

Die Festlegung von einheitlichen Definitionen durch die ACCP/SCCM soll eine bessere

epidemiologische Einschätzung der Inzidenz, Mortalität und Morbidität ermöglichen. Gaieski

et al. geben in ihrer Studie jedoch zu bedenken, dass die Auswahl der statistischen Methoden

großen Einfluss auf die festgestellte Inzidenz und Mortalität haben können (27).

Angus et al. bezifferten 2001 die Kosten für das US-amerikanische Gesundheitssystem auf

jährlich 16,7 Mrd. Dollar (13). Zwischen 1997 und 2008 stiegen die Behandlungskosten der

Sepsis dreimal stärker an als die Gesamtbehandlungskosten aller anderen Krankheiten. Laut

Elixhauser et al. stellte die Septikämie in US-amerikanischen Krankenhäusern im Jahre 2009

den sechsthäufigsten Aufnahmegrund dar und verursachte Kosten von 15,4 Mrd. US-Dollar,

was 4,3% des nationalen Krankenhausbudgets entsprach (28). In Deutschland verursacht die

schwere Sepsis jährlich Kosten zwischen 3,6 und 7,9 Millionen Euro. Beim größten Teil

dieser Kosten handelt es sich um indirekte Kosten, die durch Minderung der Erwerbsfähigkeit

aufgrund von frühem Tod oder dem Verlust der Produktivität entstehen (29).

11

1.4 Pathophysiologie der Sepsis

Überblick 1.4.1

Unser Verständnis der Pathophysiologie der Sepsis erweitert sich ständig und ist trotzdem

immer noch unvollständig. Nach dem heutigen Wissensstand handelt es sich bei der Sepsis

per Definition um eine systemische Reaktion des Organismus auf eine Infektion (12).

Die derzeit vorherrschende Theorie besagt, dass nicht die Pathogenität der eindringenden

Organismen die Hauptursache für die Morbidität und Mortalität dieses Krankheitsbildes

darstellt, sondern eine Dysregulation der Immunantwort und deren Einfluss auf viele weitere

Stoffwechselprozesse im Körper. Eindringende Mikroorganismen lösen eine

inflammatorische Reaktion des Immunsystems aus um sie zu bekämpfen. Um eine

Generalisierung der Immunantwort zu verhindern und auf den Ort der Infektion zu

beschränken, kommt es zu einer kompensatorischen anti-inflammatorischen Reaktion (30).

Die Dysregulation von pro- und anti-inflammatorischen Reaktionen ist für die Entstehung der

Sepsis verantwortlich. Der Anfang einer septischen Erkrankung ist durch einer

überschießenden Entzündungsreaktion, die nicht auf den Ort der Infektion beschränkt bleibt,

gekennzeichnet. Wenn dieses Initialstadium überwunden ist, kommt es oft zu einer

prolongierten Immunsuppression, wobei vermutet wird, dass diese Immunsuppression für die

hohe Sterblichkeit der Sepsis verantwortlich ist (31).

Wenn Pathogene in den Körper eindringen wird das Immunsystem aktiviert. Das

Immunsystem wird in zwei große Komplexe unterteilt: das angeborene (unspezifische) und

das adaptive (spezifische) Immunsystem. Die angeborene Immunabwehr ist darauf ausgelegt,

eindringende Organismen lokal und schnell zu bekämpfen. Die spezifische Abwehr wird erst

später aktiviert, sie koordiniert die angeborene Immunabwehr und ermöglicht eine

spezifischere und schnellere Bekämpfung bei wiederholten Infektionen (32).

Das Endothel der Gefäße koordiniert während einer Infektion die lokalen

Abwehrmechanismen des Immunsystems, indem es die Einwanderung weiterer Abwehrzellen

ermöglicht und die Pathogene über die Aktivierung der Gerinnung und durch die Regulation

des Gefäßtonus vom Rest des Körpers abschottet.

12

Die erste Verteidigungslinie des Körpers gegen eindringende Organismen ist die angeborene

Abwehr. Die Zellen der angeborenen Abwehr erkennen sogenannte danger-associated

molecular patterns (DAMPs), Gefahrensignale die Gewebsschäden oder –stress anzeigen, um

eine schnelle Reaktion auf eine Gefahr für den Organismus zu ermöglichen. Zu diesen

DAMPs gehören unspezifische Bestandteile pathogener Organismen (pathogen-associated

molecular patterns, PAMPs) und Moleküle die bei Verbrennung, Trauma, Ischämie oder

anderen Gewebsschädigungen entstehen (Alarmine) (32). Zu den PAMPs gehören unter

anderem Peptidoglykane, Endotoxin, Lipoteichonsäuren, Lipopeptide und DNA-Fragmente

(33). Die Erkennung dieser Gefahrensignale wird über eine Reihe von Rezeptoren vermittelt

(Pattern-recognition receptors, PRRs), die sich der Oberfläche der Zellen der angeborenen

Abwehr befinden (34). Zu den zellulären Bestandteilen des angeborenen Immunsystems

zählen die neutrophilen Granulozyten, Monozyten und die Natürliche Killerzellen (35). Die

neutrophilen Granulozyten sind vor allem für die Zerstörung von eindringenden Organismen

zuständig. Sie nehmen diese mittels Phagozytose in sich auf und generieren sogenannte

reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS), um diese zu zersetzen. Monozyten

differenzieren sich abhängig von dem Gewebe in das sie einwandern entweder in

gewebsständige Makrophagen oder dendritische Zellen. (32). Bei den Makrophagen handelt

es sich um Auslöser und Regulatoren der angeborenen Immunantwort, da sie neben der

Phagozytose von pathogenen Erregern, eine Vielzahl von entzündlichen Mediatoren

produzieren können. Dendritische Zellen sind antigen-präsentierende Zellen, welche

Bestandteile zerstörter Mikroorganismen auf ihrer Oberflächeexprimieren und so T- und B-

Zellen des adaptiven Immunsystems aktivieren somit stellen sie das Bindeglied zwischen

angeborenem und adaptivem Immunsystem dar (36). Natürliche Killerzellen produzieren

Entzündungsmediatoren und können infizierte Zellen zerstören. Zu den PRRs gehören die

Familien der toll-like receptors (TLRs), C-type lectin receptors (CLRs), nucleotide-binding

oligomerization domain (NOD) und retinoic acid inducible gene I (RIG-I)- like receptors

(34). Binden diese Rezeptoren an ihre entsprechenden Liganden wird eine Reihe von Stoffen

freigesetzt, die die Entzündungsreaktion im Körper vermitteln. Dazu gehören Zytokine,

Chemokine, Akute-Phase Proteine, Lipid Mediatoren, reaktive Sauerstoffspezies (reactive

oxygen species, ROS), reaktive Stickstoffspezies (reactive nitrogen species, RNS) und die

Enzyme der Koagulation, Fibrinolyse, Komplementkaskade und des Kinin-Kallikreinsystems,

sie werden auch als Entzündungsmediatoren bezeichnet (32). Bei den TLR handelt es sich um

Oberflächenrezeptoren von denen beim Menschen bis heute 10 verschiedene Subtypen

13

identifiziert worden sind. Besonders hervorzuheben sind hier TLR2, der Lipoteichonsäuren

und Peptidoglykane erkennt, und TLR4, der das Endotoxin bindet (37).

Das Endotoxin (synonym: Lipopolysacharid (LPS)) ist ein prototypischer PAMP. Es ist ein

Bestandteil der Zellwand vor allem von gram-negativen aber auch von einigen gram-positiven

Bakterien und ist bei jedem Bakterienstamm unterschiedlich. Es besteht aus einem

Polysaccharid das kovalent an das sogenannte Lipid A gebunden ist. Die

Polysaccharidstruktur wird in ein Kern-Antigen und das O-Antigen eingeteilt, woraus sich die

Benennung der verschieden LPS-Formen ergibt (38). Mit Hilfe des LPS-binding protein

(LBP) bindet LPS an den Oberflächenrezeptor CD14, der die Dimerisierung von TLR4

bewirkt (39). Die Dimerisierung des TLR löst eine intrazelluläre Signalkaskade aus, die über

verschiede Adapterproteine und Kinasen eine Translokation von Transkriptionsfaktoren wie

nuclear factor-kappa B (NF-κB), interferon-regulating factors (IRF) und activating protein-1

(AP-1) aus dem Zytosol in den Zellkern bewirkt. Der Transkriptionsfaktor NF-κB nimmt

dabei eine Schlüsselrolle in der Regulation der angeborenen Abwehr und in der Pathogenese

der Sepsis ein, denn er aktiviert die Transkription von über 200 Genen, dazu gehören vor

allem die Mediatoren der Entzündungsreaktion wie Zytokine, Chemokine,

Adhäsionsmoleküle, Enzyme und Akute-Phase Proteine (32).

Zytokine sind niedermolekulare Proteine, die die Entzündungsreaktion regulieren und von

besonderer Bedeutung in der Entstehung der Sepsis sind. Entsprechend ihrer Wirkung werden

sie in pro- und anti-inflammatorische Zytokine eingeteilt (40). Pro-inflammatorische Zytokine

wie Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), tumor necrosis factor- beta (TNF-β), Interleukin-

1beta (IL-1β), Interleukin-2,-3,-5,-12 und-18 aktivieren und verstärken die

Entzündungsreaktion. Anti-inflammatorischen Zytokine wie Interleukin-4,-6 und -10

wiederum vermindern die Entzündungsreaktion, um nach stattgehabter Bekämpfung wieder

die Homöostase herzustellen (41). Diese Unterteilung ist allerdings umstritten, da einige

Zytokine sowohl pro- als auch anti-inflammatorisch wirken, abhängig von Stimulus und

produzierender Zelle (39). Ein weiterer Bestandteil der die Zytokinwirkung reguliert sind die

löslichen Zytokinrezeptoren im Plasma, die die zirkulierenden Zytokine binden und

neutralisieren (39).

Die ersten Zytokine die bei einer Entzündungsreaktion im Blut nachgewiesen werden können

sind TNF-α und IL-1β, sie werden weshalb sie als „proximale“ Zytokine bezeichnet werden.

Sie wirken vor allem auf die Zellen des Immunsystems, Endothelzellen und Zellen in Lunge,

Darm und Leber und induzieren die Produktion weiterer Entzündungsmediatoren (32).

14

TNF-α wird überwiegend aus den aktivierten Makrophagen und Natürlichen Killerzellen

freigesetzt. Während die normale Serumkonzentration von TNF-α unbekannt ist und auch in

gesunden Probanden erhöht sein kann, konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass die

TNF-α-Konzentration nach Endotoxinapplikation stark ansteigt (42). Die generelle Wirkung

von TNF-α ist eine lokale Entzündungsreaktion, Fieber, die Aktivierung des Endothels und

der neutrophilen Granulozyten (39). Im Experiment konnte bei Gabe von rekombinantem

TNF-α die Entwicklung von SIRS-Symptomen, Leukopenie, Koagulopathie und

Organschäden (Gastrointestinale Nekrosen, Nebenniereneinblutung, ARDS) beobachtet

werden, während bei niedriger Zytokinkonzentration Kachexie und Toleranzentwicklungen

auftraten (41,43). TNF-α führt zu einer verstärkten Produktion, Aktivierung und

Differenzierung von Makrophagen und erhöht so die Konzentration an pro-inflammatorischen

Mediatoren. Weiterhin bewirkt TNF-α, dass Endothelzellen und neutrophile Granulozyten

vermehrt Adhäsionsmoleküle exprimieren, was zu einer vermehrten Einwanderung von

Abwehrzellen ins Gewebe führt. (40).

IL-1 ist die Bezeichnung für die beiden Proteine IL-1α und IL-1β, die an dieselben

Rezeptoren binden, wobei IL-1β in weit höherer Konzentration im Körper vorkommt als IL-

1α (41). IL-1 wird ebenfalls hauptsächlich von den Zellen der Abwehr sezerniert. IL-1β

aktiviert Makrophagen, B- und T-Zellen, sowie die Synthese von Akute-Phase Proteinen in

den Leberzellen (39). Im Experiment führt IL-1β ebenfalls zur Entwicklung von

Schocksymptomen, erhöhter Produktion von Kortisol und vermehrter Freisetzung von

Leukozyten und Thrombozyten (44).

IL-6 ist eines der später synthetisierten „distalen“ Zytokine, welches nach Stimulation durch

LPS, IL-1 und TNF-α aus Makrophagen, Fibroblasten und Lymphozyten sezerniert wird. IL-6

aktiviert neben den B- und T-Lymphozyten auch das Gerinnungssystem und induziert, wie

auch IL-1, die Bildung von Akute-Phase Proteinen (41,45). IL-6 kann bei einer Vielzahl

akuter Störungen des Organismus (Trauma, Verbrennungen, große Operationen) im Blut

nachgewiesen werden und gilt zudem als prognostischer Marker um die Mortalität der Sepsis

abzuschätzen (46). Die Rolle von IL-6 in der Pathogenese der Sepsis ist umstritten, da es auch

anti-inflammatorische Eigenschaften besitzt. IL-6 führt sowohl zu einer Verminderung von

pro-inflammatorischen Mediatoren wie TNF-α, IFN-γ und Stickstoffmonoxid, als auch zum

Anstieg von anti-inflammatorischen Mediatoren wie IL-10, welches eines der wichtigsten

anti-inflammatorischen Mediatoren ist (45,47). IL-10 wird von Makrophagen, Lymphozyten

und Natürlichen Killerzellen produziert und inhibiert hauptsächlich die Produktion von pro-

inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-1,-6 und -8 in den Makrophagen (48,41).

15

Weiterhin induziert es die Produktion von löslichen TNF-α und IL-1- Rezeptoren, die die

Wirkung dieser pro-inflammatorischen Zytokine neutralisieren (40).

Das adaptive Immunsystem besteht aus B- und T-Lymphozyten. Die B-Lymphozyten

produzieren spezifische Antikörper gegen eindringende Organismen. Diese Antikörper setzen

sich auf die entsprechenden Oberflächenantigene der eindringenden Organismen und

ermöglichen somit eine schnelle Phagozytose und deren Zerstörung. Die T- Lymphozyten

erkennen mittels des T-Zell Rezeptors die Antigene die auf der Oberfläche von Makrophagen

und dendritischen Zellen präsentiert werden. Die T-Lymphozyten werden in CD8+

zytolytische T- Zellen, CD4+T-Helferzellen und CD4+ CD25+ T-Regulatorzellen eingeteilt.

CD8+ zytolytische T-Zellen erkennen mit Antikörpern besetzte Zellen und zerstören diese

mittels lytischer Granula oder Induktion des programmierten Zelltods (Apoptose). Die CD4+

T-Helferzellen (TH) können sich, abhängig vom vorherrschenden Milieu der

Entzündungsmediatoren, in zwei unterschiedliche Formen differenzieren. TH1 Zellen

amplifizieren die unspezifische Immunantwort während TH2-Zellen über eine Induktion der

B-Zellen zu einer Verstärkung der adaptiven Immunantwort führen. Die CD4+ CD25+ T-

Regulatorzellen bewirken vor allem eine Begrenzung der Immunantwort (39).

Unter septischen Bedingungen wird die Funktion der Leukozyten beeinflusst. Granulozyten

werden durch die Zytokine und Chemokine, die während der Sepsis verstärkt von

Abwehrzellen und Endothelzellen produziert werden, in erhöhtem Maße rekrutiert und

aktiviert (49,50). Dies führt paradoxerweise zu einer verminderten Anzahl an neutrophilen

Granulozyten am Ort der Infektion und einer erhöhten Konzentration in nicht betroffenen

Organen (51).

Nach dem die neutrophilen Granulozyten Mikroorganismen bekämpft haben wird, um die

entzündliche Reaktion einzudämmen, ihr programmierter Zelltod (Apoptose) eingeleitet.

Während einer Sepsis hingegen werden verstärkt anti-apoptotische Signale ausgelöst, sodass

die neutrophilen Granulozyten länger überleben (52). Ihre verstärkte Aktivierung und längere

Überlebensdauer führen zu einer Gewebsschädigung, da vermehrt ROS und RNS produziert

werden, die die umliegenden Zellen und Gewebe schädigen (53). In der späten Phase der

Sepsis ist die Fähigkeit der neutrophilen Granulozyten auf chemotaktische Signale zu

reagieren vermindert, weswegen weniger proteolytische Enzyme und ROS freigesetzt werden

(54). Lymphozyten werden verstärkt apoptotisch und schränken damit die Fähigkeit des

Organismus ein, die bestehende Infektion weiter zu bekämpfen oder opportunistische Erreger

abzuwehren (32).

16

Während die Entwicklung der Immunantwort sehr gut erforscht ist, gibt es zurzeit noch

wenige Ansätze, die erklären, wie die Dysregulation von pro- und anti-inflammatorischer

Immunantwort zum Multiorganversagen führt. Während der Sepsis ist die

Sauerstoffversorgung der Organe kompromittiert, Ursache dafür ist ein Missverhältnis

zwischen Sauerstoffangebot und Sauerstoffbedarf. Die Versorgung der Organe mit Sauerstoff

kann auf der Ebene der Makrozirkulation, Mikrozirkulation und auf zelluläre Ebene gestört

sein. Pneumonien sind die häufigsten primären Infektionsherde, aber auch sekundär

entwickelt sich bei einer Sepsis oft eine akute Lungenschädigung (acute lung injury, ALI)

und/oder ein Lungenversagen, die den Gasaustausch behindern (acute respiratory distress

syndrome, ARDS) (55,56). Weiterhin ist bei 50% aller Patienten mit schwerer Sepsis und

septischem Schock eine Einschränkung des Herzzeitvolumens aufgrund myokardialer

Dysfunktion festzustellen, was zusätzlich zu einer Verschlechterung des Sauerstoffangebots

für die Organe führt (57). Diese Verschlechterung des Sauerstoffangebots hat eine Reihe von

Kompensationsmechanismen zur Folge, die die Versorgung kritischer Organe wie Herz und

Gehirn erhalten sollen, jedoch die Störung der Mikrozirkulation der Organe zur Folge haben

(58). Zudem entsteht in den Organen eine verminderte Sauerstoffausschöpfung, da die

Mitochondrien in den Zellen den angebotenen Sauerstoff schlechter umsetzen können, was

von Fink et al. als zytopathische Hypoxie bezeichnet wird (59).

Die Mikrozirkulation während der Sepsis 1.4.2

Die Mikrozirkulation bezeichnet die Durchblutung und den Stoffaustausch in Blutgefäßen die

kleiner als 100µm sind. Tyagi et al. teilen die Bestandteile der Mikrozirkulation nach ihrer

Funktion ein; es gibt Widerstandsgefäße, Austauschgefäße und Kapazitätsgefäße (60). Die

Funktion der Mikrozirkulation ist es die Sauer- und Nährstoffversorgung der Organe und die

Abwehrfunktion des Körpers zu gewährleisten. Um die Organe adäquat versorgen zu können

messen die Endothelzellen den Blutfluss und metabolische Signale, um den Vasotonus

anzupassen oder mehr Gefäße des Kapillarbettes zu rekrutieren (61).

Diese Regulationsmechanismen der Mikrozirkulation der Organe sind während einer Sepsis

gestört und die Sauerstoffversorgung der Organe ist kompromittiert, was laut Ince et al. eine

der Hauptursachen für die Entwicklung des Multiorganversagens darstellt (61). Ursächlich für

das Versagen der Mikrozirkulation ist unter anderem die geringere Verformbarkeit der

Erythrozyten, vermehrte Einwanderung von Leukoyzten, Ablagerung von Fibrin und

Mikrothromben, Störung der Barrierenfunktion, Dysregulation des Vasotonus und

17

Ausbildung arteriovenöser Shunts (58). Diese Veränderungen führen zu einer verminderten

Flussgeschwindigkeit in den Kapillaren bis hin zum kompletten Stopp des Blutflusses.

Das Endothel ist der zentrale Bestandteil der Mikrozirkulation, es besteht aus einer

Zellschicht die die Innenseite sämtlicher Blutgefäße auskleidet und ist das größte Organ des

Körpers. Die Schädigung es Endothels während der Sepsis der Hauptgrund für das Versagen

der Mikrozirkulation (62). Die Hauptaufgaben des Endothels sind die Regulation des

Nährstofftransports, des Gefäßtonus, der Zellmigration, des Gerinnungssystems und des

Immunsystems (63). Das Endothel ist ein integraler Bestandteil der angeborenen Abwehr von

Pathogenen, da Endothelzellen, genauso wie Monozyten und Makrophagen, mikrobielle

Strukturen erkennen, Entzündungsmediatoren freisetzen, die Einwanderung von

Abwehrzellen koordinieren und die Ausbreitung der Entzündung durch Vasokonstriktion und

lokale Aktivierung der Gerinnung eindämmen (63,64).

Durch bakterielle Bestandteile und einer Vielzahl von körpereigenen Mediatoren wird

während der Sepsis das Endothel unkontrolliert aktiviert. Das dysfunktionale Endothel

verändert sich in seiner Struktur (Schwellung, Fragmentierung und Ablösung von Zellen) und

Funktion (65), was zu einer verstärkten Einwanderung von Leukozyten, Störung des

Gefäßtonus, vermehrten Blutgerinnung, erhöhten Permeabilität der Gefäßwände und

Apoptose von Endothelzellen führt (63).

Die verminderte Verformbarkeit von Erythrozyten hat mehrere Ursachen: die erhöhte

intrazelluläre Konzentration von 2,3- Diphosphoglycerat (2,3-DPG) und Calcium, die

erniedrigte intrazelluläre Konzentration von ATP und die erhöhte extrazelluläre

Konzentration von Stickstoffmonoxid und reaktiver Sauerstoffspezies (66).

Die ausführenden Zellen des Immunsystems, wie neutrophile Granulozyten und

Lymphozyten, sind nur in geringer Zahl in den Organgeweben vorhanden, sie finden sich

hauptsächlich im Knochenmark und als ständig zirkulierende Masse im Blut. Damit die

Leukozyten in die betroffenen Gewebe einwandern können, ist die Aktivierung des Endothels

und der Leukozyten notwendig. Im aktivierten Zustand können beide eine Verbindung

eingehen, die den Übertritt von Leukozyten vom Blut ins Gewebe ermöglicht. Der Übertritt

von Leukozyten erfolgt hauptsächlich in den postkapillären Venolen, da die

Strömungsverhältnisse zu einer Verlagerung der Leukozyten von der Mitte des Blutstromes

nach Außen führen. Zudem werden deutlich mehr Adhäsionsmoleküle auf der Oberfläche von

Endothelzellen in postkapillären Venolen exprimiert als an jeder anderen Stelle des

18

Gefäßsystems (49). Die Wanderung der Leukozyten ins Gewebe erfolgt in 4

aufeinanderfolgenden Schritten.

Abb.1: Leukozyten-Endothel- Interaktionen (modifiziert nach (67))

Der erste Schritt ist das Tethering: die Leukozyten und das Endothel exprimieren lange

Molekülketten, die Selektine, die an glykosylierten Liganden auf der jeweils anderen

Oberfläche binden, um die Geschwindigkeit der Leukozyten zu reduzieren. Auf der

Oberfläche der Leukozyten wird L-Selektin exprimiert, das aktivierte Endothel ist exprimiert

es P- und E-Selektin. Die Bindung ist nur von kurzer Dauer, was zur Folge hat, dass die

Leukozyten an der Gefäßwand entlang rollen. Der wichtigste Ligand für die Selektine ist der

P-Selektin Glykoprotein Ligand 1 (PSGL1) (67).

Der zweite Schritt ist das Triggering: Um eine feste Bindung einzugehen, müssen die

Leukozyten aktiviert werden. Chemokine und Zytokine (z.b. TNF-α, IL-1, IL-8), die vom

aktivierten Endothel selbst oder von den Abwehrzellen im Gewebe gebildet werden, binden

an G-Protein gekoppelte Rezeptoren auf der Oberfläche der Leukozyten und bewirken so die

Aktivierung. Der Arrest oder „Sticking“ ist der dritte Schritt, Leukozyten und Endothel gehen

dabei eine feste Bindung ein. Auf der Oberfläche der Leukozyten wird die Bindung an die

19

Endothelzelle von den Integrinen vermittelt, die in α- und β-Intergine unterteilt sind. Sie

binden an zellulären Adhäsionsmoleküle (cellular adhesion molecules, CAM) auf der

Oberfläche der Endothelzellen (49). Die CAM sind vom Aufbau den Immunglobulinen

ähnlich, die wichtigsten CAM sind intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) und

vaskular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), auch sie werden erst nach Aktivierung auf der

Endothelzelloberfläche exprimiert. Die Integrine liegen in zusammengerollter, niedrig affiner

Form vor. Die Aktivierung der Leukozyten führt zu einer Konformationsänderung der

Integrine, zu einer geraden hoch-affinen Form. Da nun ihre Bindungsstellen freigelegt sind,

rollen die Leukozyten nicht mehr, sondern werden fest an ihrem Platz gehalten (67). Die

Bindung der Adhäsionsmoleküle führt nicht nur zur einer Verbindung zwischen Leukozyten

und Endothelzellen, sondern löst auch intrazelluläre Signalkaskaden aus, die Zellverformung,

Proliferation und Apoptose regulieren (68). Der letzte Schritt ist die Diapedese, die

Leukozyten können auf para- oder intrazellulären Weg durch die Barriere aus Endothelzellen

und Basalmembran treten. Sowohl Leukozyten als auch Endothelzellen verformen sich dabei

und gehen Bindungen mit verschiedenen Oberflächenmolekülen ein (67).

Unter septischen Bedingungen werden auf der Oberfläche von Endothelzellen NF-κB-

abhängig, vermehrt Adhäsionsmoleküle wie ICAM-1 und E-Selektin exprimiert (69). Dies

führt zu einer vermehrten Einwanderung und Akkumulation von aktivierten Leukozyten in

die Gewebe und auf der Oberfläche der Endothelzellen (70). Die Beeinträchtigung der

Mikrozirkulation führt lokal zu einer erniedrigten Flussgeschwindigkeit des Blutes und

reduzierten Scherkräften, die eine weitere Akkumulation von Leukozyten unterstützen (71).

Aktivierte adhärente neutrophile Granulozyten setzen verstärkt reaktive Sauerstoffspezies,

proteolytische Enzyme und andere Stoffe frei, die die Endothelzellen und die Basalmembran

zerstören (72). Das geschädigte Endothel exprimiert verstärkt Adhäsionsmoleküle und

Zytokine, sodass in einer sich selbst verstärkenden Feedbackschleife immer mehr Leukozyten

einwandern und aktiviert werden (49). Die hohe Anzahl an Leukozyten kann die kleine

Gefäße der Mikrozirkulation verstopfen und zu lokalen Gewebsischämien führen (32).

Das bezeichnende Merkmal der schweren Sepsis und des septischen Schocks ist die

zunehmende hämodynamische Instabilität, die aus der Dysregulation des Vasotonus und der

Verschiebung von intravasalen Volumen in den Extravasalraum resultiert (64,73). Der

Vasotonus wird über mehrere Wege reguliert, wie zum Beispiel das vegetative Nervensystem

oder Mediatoren, die von verschiedenen Zellen (Mastzellen, Fibrozyten) produziert werden

(49). Das Endothel reguliert auf lokaler Ebene den Vasotonus mittels der Produktion von

20

vasodilatierenden Substanzen wie Stickstoffmonoxid (NO) und Prostacyclin sowie von

vasokonstriktorischen Substanzen wie Endothelin, Thromboxan A2 und dem Plättchen-

aktivierenden Faktor (PAF) (64). Der wichtigste Vasodilatator ist NO welcher enzymatisch

mittels NO-Syntheasen (NOS) aus der Aminosäure L-Arginin gebildet wird (74). In der

Frühphase der Sepsis überwiegt die Suppression der endothelialen NOS (eNOS) durch

Mediatoren wie TNF-α oder Endotoxin und die Bindung von NO durch ROS, sodass die

Vasokonstriktion dominiert. Im weiteren Verlauf wird die induzierbare NO-Synthetase

(iNOS) vermehrt aktiviert, was zu einer Überproduktion von NO führt und damit zur

charakteristischen Hypotension (64).

Eine wichtige Funktion des Endothels ist die Regulation des Austausches von Wasser,

gelösten Stoffen, Makromolekülen und Zellen zwischen dem Intra- und Extravasalraum.

Diese Barriere besteht aus zellulären (Zonula occludens und Zonula adherens) und nicht-

zellulären Bestandteilen (Glykokalyx) (75). Die erhöhte Konzentration von Thrombin,

Komplement, Bradykinin, PAF und Zytokinen führt zu einer vermehrten Internalisierung,

Phosphorylation und vermehrten Abbau der Verbindungen zwischen den Endothelzellen.

Nicht nur die Verbindungen zwischen den Endothelzellen ist für die Barrierefunktion des

Endothels wichtig, sondern auch ihre Form, die durch das Zytoskelett aufrecht erhalten wird.

Bei entzündlichen Prozessen werden innerhalb der Endothelzellen Aktinfilamente abgebaut

oder verkürzt, was eine Formveränderung der Zellen zur Folge hat (76). Der Abbau und die

Kontraktion von Zell-Zellverbindungen führt zur Vergrößerung der Lücken zwischen den

einzelnen Endothelzellen, was die Permeabilität der Gefäße erhöht. Diese Permeabilität

ermöglicht es Plasmaproteine wie Albumin und Blutzellen aus dem Blut ins Gewebe

übertreten zu können. Die Vasodilatation während der Sepsis vergrößert diesen Effekt noch

weiter. Der in der Adventia reichlich vorhandene Tissue Factor (TF) und Collagenfasern

erhalten so Kontakt zum Intravasalraum was die weitere Aktivierung der Gerinnung und

Anlagerung von Plättchen ermöglicht (77).

Davon betroffen sind inbesondere die postkapillären Venolen, da sie sowohl eine hohe

Anzahl an interzellulären Verbindungen und Fenestrae als auch eine hohe Dichte an

Rezeptoren für Entzündungsmediatoren, wie z.B. TNF-α, IL-1b und Histamin, besitzen

(49,76). Der Übertritt von Plasmaproteinen in den Extravasalraum steigert den onkotischen

Druck des Interstitiums, was den überhöhten Übertritt von Flüssigkeit weiter verstärkt (49).

Dieser Verlust von intravasaler Flüssigkeit trägt zur Hypotonie und Dysfunktion der

Mikrozirkulation bei (61).

21

Während eines Entzündungsprozesses wird die das Gerinnungssystem aktiviert, um die

Pathogene und die Immunantwort des Körpers räumlich zu begrenzen (78). In einem Großteil

septischer Patienten können Störungen des Gerinnungssystems nachgewiesen werden. Diese

Störungen reichen von Thrombozytopenie bis hin zur disseminierten intravasalen Koagulation

(DIC), einem Syndrom bei dem gleichzeitig Thrombosen und Blutungsereignisse auftreten

(79).

Der Tissue Factor (TF) ist das Enzym, das hauptsächlich für die Initiierung der Blutgerinnung

bei Entzündung verantwortlich ist. TF ist normalerweise gewebsständig und beginnt seine

Wirkung erst, wenn es mit dem im Blut zirkulierenden aktivierten Faktor VII (FVIIa) in

Kontakt kommt und den TF-FVIIa Komplex bildet. Dieser Komplex aktiviert wiederum den

Faktor Xa (FXa), der zusammen mit dem Faktor Va (FVa) Prothrombin (FII) in Thrombin

(FIIa) spaltet. Thrombin spaltet seinerseits das zirkulierende Fibrinogen zu Fibrin, welches

das Grundgerüst eines Thrombus bildet (63). Die Thrombinproduktion verstärkt sich selbst

mittels der Aktivierung weiterer Faktoren wie Faktor IX, XI und den Kofaktoren V und VIII

(80).

22

Abb.2: Gerinnungskaskade TF= Tissue Factor, FII= Faktor II (Prothrombin), FIIa= aktivierter Faktor II (Thrombin), FV= Faktor V (Proakzelerin), FVa= aktivierter

Faktor V (Akzelerin), FVII= Faktor VII (Proconvertin), FVIIa= aktivierter Faktor VII (Convertin), FVIII(a)= (aktivierter) Faktor VIII

(antihämophiles Globulin A), FIX(a)= (aktivierter) Faktor IX (Christmas- Faktor), FX(a)= (aktivierter) Faktor X (Stuart- Prower- Faktor),

FXI(a)= (aktivierter) Faktor XI (Rosenthal- Faktor), FXII(a)= aktivierter Faktor XII (Hageman- Faktor)

Die Regulation der Thrombusbildung erfolgt über drei Enzyme: Antithrombin (AT), Tissue

Factor Pathway Inhibitor (TFPI) und Protein C (PC). Antithrombin bindet und inaktiviert die

Faktoren Thrombin, IXa, Xa und den TF-FVIIa Komplex. TFPI inaktiviert ebenfalls den TF-

FVIIa- Komplex, kann diesen jedoch erst binden, nachdem es Faktor Xa gebunden hat (81).

Thrombin inaktiviert sich in einer negativen Feedbackschleife, in dem es an das

endothelständige Thrombomodulin (TM) bindet. Dieser Thrombomodulin- Thrombin-

Komplex überführt Protein C in seine aktivierte Form. Diese Reaktion wird um den Faktor 20

verstärkt, wenn sich PC an den endothelialen Protein C Rezeptor (EPCR) bindet (82). Das

aktivierte Protein C (aPC) bindet und inaktiviert mit seinem Kofaktor Protein S die Faktoren

Va und VIIIa. Ohne diese Faktoren kann die Gerinnungskaskade nicht ablaufen und kein

neues Thrombin gebildet werden (83).

Der Abbau des Fibrinthrombus, auch Fibrinolyse genannt, erfolgt durch das Enzym Plasmin,

das durch Spaltung des Vorläuferproteins Plasminogen gebildet wird. Die wichtigsten

23

Spaltenzyme sind der tissue-type plasminogen activator (t-PA) und der urokinase-type

plasminogen activator (u-PA), die aus den Endothelzellen freigesetzt werden (79).

Während einer Sepsis entstehen vermehrt Thromben, da gerinnungshemmende Enzyme und

Fibrinolyse eingeschränkt sind.

Inflammatorische Mediatoren aktivieren vor allem die Blutgerinnung, deren Bestandteile

aktivieren wiederum Entzündungskaskaden was zu einer exzessiven Bildung von Thromben

und zu einem Verbrauch von zellulären und enzymatischen Bestandteilen der Gerinnung

führt.

Der wichtigste Aktivator der Gerinnung während eines entzündlichen Prozesses ist der TF.

Aufgrund der Schädigung des Endothels wird vermehrt subendotheliales TF freigelegt. LPS,

TNF-α, IL-1 und IL-6 stimulieren die erhöhte Expression von TF auf der Oberfläche von

Monozyten, Makrophagen, Endothelzellen und im Blut zirkulierender Mikropartikel (81,84).

Bei diesen Mikropartikeln handelt es sich um Zellfragmente, die von aktivierten oder

apoptotischen Zellen, wie z.B. Thrombozyten, Monozyten und Endothelzellen, abgesondert

wurden. Diese Mikropartikel wirken selbst prothrombotisch, da sie mit den Membranen

anderer Zellen verschmelzen und so die Konzentration von TF auf der Oberfläche dieser

Zellen erhöhen (84). Das gebildete Thrombin und Entzündungsmediatoren wie Zytokine,

platelet- activating factor (PAF) und Endotoxin aktivieren die Thrombozyten (85). Das

aktivierte Endothel führt zu einer vermehrten Anlagerung von Thrombozyten, indem es große

von- Willebrand- Faktor- Moleküle auf seiner Oberfläche exprimiert. Durch die

Formveränderungen der Endothelzellen werden auch subendotheliale Kollagene freigelegt,

die ebenfalls zu einer vermehrten Aggregation von Thrombozyten führen (84). Die aktivierten

Thrombozyten unterstützen die Koagulation indem sie weitere Gerinnungsfaktoren freisetzen

und die Bildung des Fibrinthrombus verstärken (80). Auf der Oberfläche der aktivierten

Thrombozyten wird auch verstärkt P-Selektin exprimiert, dadurch binden und aktivieren sie

Leukozyten und Endothelzellen (85). Entzündliche Mediatoren wie IL-6 erhöhen die

Produktion der Thrombozyten aus dem Knochenmark, die durch geringere Mengen Thrombin

aktiviert werden können (86).

Die Aktivität sämtlicher gerinnungshemmender Kaskaden ist während einer Sepsis

vermindert. Aufgrund von gesteigertem Verbrauch, reduzierter Synthese und

proteasebedingtem Abbau ist die Konzentration von Antithrombin vermindert. Zudem werden

sich auf der Oberfläche von Endothelzellen befindliche Heparin-ähnliche Moleküle, die die

Funktion von Antithrombin unterstützen, bei einer Inflammation in geringerer Anzahl

synthetisiert (82). Die Konzentration von Protein C ist während eines entzündlichen Prozesses

24

stark vermindert (87). Durch die verstärkte Bildung von Thrombin wird mehr Protein C

aktiviert und verbraucht, weiterhin wird weniger Protein C durch die Leber synthetisiert (84).

Die Aktivierung von Protein C ist stark gestört da die wichtigen Kofaktoren für die

Aktivierung TM und ECPR in ihrer Funktion gestört sind(89). Yan et al haben nachweisen

können, das eine niedrige Konzentration von Protein C mit einer höheren Mortalität und

Morbidität einhergehen (88). Die Funktion der Kofaktoren TM und ECPR ist während einer

Sepsis aus mehreren Gründen eingeschränkt. Zum einen führen Entzündungsmediatoren wie

TNF-α zu einer verminderten Expression von TM auf der Oberfläche von Endothelzellen.

Zum anderen kann TM durch die Enzyme von aktivierten neutrophilen Granulozyten von der

Oberfläche des Endothels abgespalten oder oxidiert werden, was seine Aktivität senkt. Der

EPCR wird ebenfalls von der Oberfläche der Endothelzellen abgespalten und ist in seiner

gelösten Form weniger aktiv (90). Die Konzentration des TFPI verändert sich unter

entzündlichen Bedingungen kaum oder ist allenfalls leicht erhöht, jedoch kann es die hohe

prothrombotische Konzentration von TF nicht neutralisieren (91).

Die Bildung von Fibrin aus Fibrinogen ist durch die generelle Aktivierung der Gerinnung

erhöht. Fibrinogen ist zudem ein Akute Phase Protein, das als Reaktion der Körpers auf eine

Entzündung vermehrt in der Leber synthetisiert wird, damit mehr Substrat für die

Fibrinthrombusbildung zur Verfügung steht (81).

Die Auflösung der gebildeten Fibrinthromben ist während einer Sepsis gestört. Plasminogen

wird in verringertem Maße zu Plasmin gespalten, da die Enzyme t-PA und u-PA durch

Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) inaktiviert werden. TNF-α und IL-1β führen zu

einer länger anhaltenden Freisetzung von PAI-1 aus den Endothelzellen (92). Die Ablagerung

von Mikrothromben in der Mikrozirkulation können zur Entwicklung, Hypoxie und

Organschäden führen, die im weiteren Verlauf zum multiplen Organversagen beitragen

können (61).

Die Gerinnung und die Inflammation beeinflussen sich gegenseitig. Dabei haben

prothrombotische Faktoren der Gerinnungskaskade eine pro-inflammatorische Wirkung und

anti-koagulatorischen Faktoren auch eine anti-inflammatorische Wirkung.

Thrombin wirkt an vielen Stellen der Entzündungsreaktion, indem es Endothelzellen,

Makrophagen, Thrombozyten und Mastzellen aktiviert. Dies führt zu einer erhöhten

Produktion von Zytokinen, Adhäsionsmolekülen und Aktivatoren der Gerinnung (80). Eines

der wichtigsten Bindeglieder zwischen Koagulation und Inflammation sind die Protease-

aktivierten Rezeptoren (PAR), die auf der Oberfläche von Endothelzellen, Thrombozyten,

25

Lymphozyten, Monozyten und Fibroblasten exprimiert werden (89). Die Aktivierung der

PARs durch Enzyme der Gerinnung, wie Thrombin oder dem TF-FVIIa-Komplex führen zu

einer verstärkten Aktivierung der Plättchen, einer verstärkten Produktion von pro-

inflammatorischen Mediatoren und einer verstärkten Apoptose von Endothelzellen und

Lymphozyten (84). Die vermehrt aktivierten Thrombozyten setzen Mediatoren wie CD40

Ligand frei, das die Bildung von TF und pro-inflammatorischen Zytokinen induziert und

somit die Entzündungsreaktion weiter verstärkt (81).

Die antikoagulatorischen Enzyme Antithrombin, Thrombomodulin und aktviertes Protein C

besitzen eine anti-inflammatorische Wirkung. Antithrombin vermindert Leukozytenadhäsion

und Faktor X Aktivierung indem es die Expression von CD11b/CD18 auf der Oberfläche von

Leukozyten inhibiert. Des Weiteren führt Antithrombin zu einer erhöhten Produktion von

Prostazyklin, was den Transkriptionsfaktor NF-κB in den Endothelzellen supprimiert und die

Produktion von IL-6 und TF in den Monozyten vermindert (93,94). Auf der Oberfläche der

Leukozyten führt Antithrombin zu einer verminderten Expression von Integrinen und

Aktivierung durch Chemokine, wodurch weniger Leukozyten an den Ort der Inflammation

rekrutiert werden (95). Thrombomodulin wirkt anti-inflammatorisch, da es ein wichtiger

Aktivator von Protein C ist. Zudem bildet Thrombomodulin mit Thrombin den Thrombin-

Thrombomodulin Komplex, wodurch die pro-inflammatorische Wirkung von Thrombin

unterbunden wird. Der Thrombin-Thrombomodulin-Komplex aktiviert thrombin activatable

fibrinolysis inhibtor (TAFI). TAFI stabilisiert Fibrinthromben und inhibiert die Bildung von

Bradykinin und die Aktivierung des Komplementsystems, was zur hämodynamischen

Stabilisierung der Mikrozirkulation beiträgt (96). Im Mäusemodell inhibiert TM aPC-

unabhängig die Rekrutierung von Neutrophilen in der Lunge (97). Aktiviertes Protein C

beeinflusst die Expression von Genen und inflammatorischen Mediatoren, die Apoptose von

Immunzellen und stabilisiert zudem die endotheliale Barriere. Diese Eigenschaften des

aktivierten Protein C beschränken die Inflammation und sind unabhängig von der

antikoagulatorischen Funktion (98). Das in der Mikrozirkulation vermehrt abgelagerte Fibrin

hat pro-inflammatorische Eigenschaften indem es über die Freisetzung von pro-

inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen die Adhäsion von Makrophagen stimuliert

(99). Sowohl der Aktivator der Fibrinolyse u-PA, als auch der Inhibitor der Fibrinolyse PAI-1

inhibieren die Freisetzung von TNF-α (80).

26

Aktiviertes Protein C 1.4.3

Protein C wurde erstmals 1976 von Stenflo et al. charakterisiert (100). Ein hereditärer Mangel

an Protein C führt zu einem gehäuften Auftreten von venösen Thrombembolien (101). 1987

haben Taylor et al. nachgewiesen, dass die Gabe von aktiviertem Protein C die Häufigkeit

thrombotischer Ereignisse und die Mortalität nach Escherichia coli Infusion deutlich

minderte, dies geschah allerdings noch unter der Annahme, dass aPC die Hämostase in der

Mikrozirkulation stabilisiert (83). In den folgenden Jahren konnte in mehreren Arbeiten

nachgewiesen werden, dass die anti-inflammatorischen Effekte von aPC unabhängig von

seiner antikoagulatorischen Funktion sind (102-105). 2001 haben Bernard et al. in der

PROWESS (Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis)–Studie bewiesen, dass die

Behandlung mit rekombinanten aktivierten Protein C die Mortalität der schweren Sepsis bei

Patienten mit einer hohen Sterbewahrscheinlichkeit absolut um 6,1% reduziert (106). Die

Ergebnisse der PROWESS-Studie führten zu der Zulassung von aPC, unter dem

Wirkstoffnamen Drotrecogin-alfa (aktiviert) (Handelsname: Xigris™) unter der Auflage,

weitere Studien durchzuführen, die die Wirksamkeit von aPC bestätigen sollten. Die

ADDRESS (Drotrecogin Alfa (Activated) for Adults with Severe Sepsis and a Low Risk of

Death)- Studie sollte die Wirksamkeit von aPC bei schwerer Sepsis und niedriger

Wahrscheinlichkeit des Patienten zu versterben untersuchen, fand aber keine signifikante

Reduktion der Mortalität und eine signifikante Zunahme an Blutungskomplikationen (107).

Auch bei pädiatrischen Patienten mit schwerer Sepsis konnte keine Verbesserung der

Überlebenswahrscheinlichkeit nachgewiesen werden, bei Kindern die weniger als 60 Tage alt

waren zeigte sich eine erhöhte Rate intrakranieller Blutungen (108). Andere Studien wie die

ENHANCE- Studie konnten die Ergebnisse von PROWESS reproduzieren, sodass auf

Anweisung der European Medicines Agency (EMA) die PROWESS- SHOCK Studie

durchgeführt wurde, um die Wirksamkeit von aPC zu bestätigen (109,110). Auch hier konnte

keine Verbesserung der Mortalität nachgewiesen werden, so dass die Herstellerfirma Eli Lilly

Xigris™ wieder vom Markt nahm. 2012 publizierte die Cochrane Library eine Metaanalyse,

die die Wirkung von aPC anhand der Daten aus sämtlichen prospektiven randomisierten

Studien untersuchen sollte. Es konnte ebenfalls keine Verbesserung der Mortalität

nachgewiesen werden (111). Kalil et al. untersuchten dafür in ihrer Metaanalyse die

Beobachtungstudien, die von den Autoren der Cochrane Library nicht einbezogen wurden und

fanden eine Reduktion der Mortalität die vergleichbar mit den Ergebnissen von PROWESS

war (112). Die Erklärungen für diese unterschiedlichen Ergebnisse sind vielschichtig.

27

Prospektive randomisierte Studien sind Beobachtungsstudien überlegen, da sie den Einfluss

von Störfaktoren durch Randomisierung minimiert. Dies kann bedeuten, dass in den

Beobachtungstudien Patienten aPC appliziert bekamen, die eine höhere Chance hatten zu

überleben, oder das durch die Randomisierung Patientenkollektive ausgeschlossen wurden,

die von aPC profitiert hätten. Durch die Implementierung der Surviving Sepsis Campaign

Guidelines wurden weltweit Diagnostik- und Behandlungsstandards geschaffen, die die

Mortalität der Sepsis verminderten. Diese Richtlinien, die eine frühzeitige Diagnose und

Behandlung vereinfachen, haben dazu beigetragen, dass die Patientengruppe der besonders

schwer erkrankten und erst verspätet behandelten Patienten kleiner geworden ist. Bei dieser

Patientengruppe jedoch handelt es sich um diejenigen Patienten, die von der Gabe von aPC

am meisten profitiert haben, weswegen anzunehmen ist, dass die Verkleinerung dieser

Patientengruppe auch die Bedeutung von aPC für die Behandlung der Sepsis minimiert hat

(113).

28

2 Aufgabenstellung

An der Entstehung des Organversagens während der Sepsis ist die Mikrozirkulation

maßgeblich beteiligt. Die Störungen in der Mikrozirkulation sind in der Regel mit einer

pathologisch aktivierten Gerinnung verbunden. Es lässt sich also vermuten, dass der Einsatz

von antikoagulatorischen Substanzen von Vorteil sein könnte.

Das aktivierte Protein C ist ein gerinnungshemmendes Protein, das während der Sepsis in

verminderter Konzentration vorhanden ist. Dies bedingt eine vermehrte Thrombusbildung, die

wiederum zur Minderperfusion von Organen führt.

Folgende Fragen sollten in dieser tierexperimentellen Studie beantwortet werden:

1. Hat die Gabe von aktiviertem Protein C einen Einfluss auf die mesenteriale

Plasmaextravasation und die Leukozytenadhärenz bei experimenteller

Endotoxinämie?

2. Wie wird die Freisetzung der Entzündungsmediatoren TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-10

bei Endotoxinämie durch die Gabe von aktiviertem Protein C beeinflusst?

3. Lässt sich bei Endotoxinämie durch die Gabe von aktiviertem Protein C eine

Veränderung klinischer Parameter, wie Blutdruck, Herzfrequenz, Atemfrequenz und

Temperatur messen?

29

3 Material und Methoden

3.1 Versuchstiere

Es wurden für die Untersuchungen 40 männliche Lewis-Ratten im Alter von 6-7 Wochen mit

einem Gewicht von 200-270g verwendet (Charles River, Deutschland). Die Experimente

entsprachen den Richtlinien für die Durchführung von Tierversuchen nach Art.2, Abs.8 des

Tierschutzgesetzes und wurden vom Gesundheitsamt Mecklenburg-Vorpommern genehmigt.

Sie wurden von April bis September 2007 durchgeführt. Die Einteilung der Versuchstiere

erfolgte randomisiert in 4 Gruppen zu je 10 Tieren:

1. Kontrollgruppe (Kontrolle) keine Intervention

2. Kontrollgruppe mit aktiviertem Protein C (aPC) aPC 2mg/kg KG

3. Endotoxingruppe (LPS) LPS 15mg/kg KG

4. LPS-Gruppe mit aktiviertem Protein C (aPC+LPS) LPS 15mg/kg KG, aPC 2mg/kg KG

3.2 Versuchsablauf

Wir führten die Versuche bei jedem Versuchstier nach einem einheitlichen Protokoll durch.

Nach der Anästhesie präparierten wir das Versuchstier für das Experiment mittels Einlage von

Kathetern in die Halsgefäße, Tracheotomie und medianer Laparotomie. Nach einer

Erholungspause von 15 Minuten führten wir die erste Intravitalmikroskopie mit

Videoaufzeichnung durch. Dann erfolgte zum Zeitpunkt 0 die Einleitung der Endotoxinämie

mittels Applikation von LPS und unmittelbar danach die Gabe von aktiviertem Protein C

(Drotrecogin alfa (aktiviert) – Xigris®, Lilly, Germany). In den Kontrollgruppen wurden die

jeweiligen Medikamente durch die gleiche Menge Kochsalzlösung ersetzt. Sowohl 60 als

auch 120 Minuten nach der initialen Gabe der Medikamente wurden weitere

intravitalmikroskopische Aufnahmen durchgeführt. Blutabnahmen erfolgten bei allen

Gruppen unmittelbar vor der ersten und nach der dritten Intravitalmikroskopie (IVM). Nach

der letzten Blutabnahme wurde das Tier mittels einer intravenösen Pentobarbitalüberdosis

euthanasiert.

30

Abb.3: Versuchsablauf

Operative Techniken 3.2.1

Um die Vergleichbarkeit zwischen den Gruppen gewährleisten zu können, wurden sämtliche

Operationsmaßnahmen bei jedem Tier einer jeden Gruppe gleich durchgeführt. Die Operation

dauerte, von Halsschnitt bis Ende der Katheterisierungen, zwischen 30 bis 40 Minuten.

Die Einleitung der Anästhesie erfolgte durch gewichtsadaptierte Injektion von 60 mg/kg KG

Pentobarbital (Synopharm GmbH, Barsbüttel, Deutschland). Die Narkosetiefe war

ausreichend, wenn der Cornealreflex erloschen war und das Setzen eines Schmerzreizes am

Schwanz keinen Beugereflex auslöste. Danach wurde das Tier auf einer Platte, die auf 37°

vorgeheizt war, fixiert. Zum Überwachen der Körpertemperatur wurde eine Temperatursonde

rektal eingeführt (Thermosonde, W223, RFT, Strassfurt, Deutschland).

Nach Positionierung des Versuchstieres wurde zuerst ein kleiner submentaler Querschnitt

gefolgt von einem medianen Längsschnitt durchgeführt, wobei die Hautlappen mittels

Klemmen fixiert wurden. Zuerst erfolgte das Aufsuchen und Darstellen der Vena jugularis

externa, danach wurde die Vene mittels Metallclip nach proximal und distal abgeklemmt. Der

distale Abschnitt wurde mittels Faden legiert, in den proximalen Teil wurde der PVC Katheter

31

(PE 50, Innendurchmesser 0,58 mm, Portex, Hythe, Kent UK) mittels Venae-Sectio- Technik

eingeführt und per Faden fixiert. Über den zentralvenösen Zugang applizierten wir zur

Aufrechterhaltung der Narkose Pentobarbital im Bolus und eine Vollelektrolytlösung

(Sterofundin, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) in gewichtsadaptierter

Dauerinfusion. Danach wurde die Arteria carotis communis analog zur Vene katheterisiert.

Das Versuchstier atmete weiter Raumluft, zur Tracheotomie wurde ein kleiner Querschnitt

zwischen zwei Knorpelspangen auf Höhe des 6.-8. Ringknorpels durchgeführt und ein

Plastikröhrchen (18 G Flexüle, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) als Tubus

eingeführt, welches per Faden fixiert wurde. Die Halswunde wurde anschließend mit einem in

NaCl-getränkten Tupfer abgedeckt, um eine Austrocknung zu verhindern. Zur Vorbereitung

der Intravitalmikroskopie wurde ein Längsschnitt entlang der Linea Alba durchgeführt, auch

diese Wunde wurde mit einem in Elektrolytlösung getauchten Tupfer abgedeckt.

Anschließend folgte für das Versuchstier eine fünfzehnminütige Ruhephase, um eine

Erholung vom Operationsstress zu ermöglichen.

Damit die Intravitalmikroskopie durchgeführt werden konnte musste der Darm ausgelagert

werden. Hierfür wurde das Versuchstier auf ein Mikroskop überführt und ein 4 cm langes

Stück des präterminalen Ileums mittels no-touch Technik in ein Wasserbad ausgelagert. Das

Wasserbad besaß eine Temperatur von 37°C und wurde durch eine kontinuierliche Infusion

von 0,9 prozentigem NaCl gespeist, um nicht untersuchte, ausgelagerte Darmabschnitte vor

der Austrocknung zu bewahren. Der zu untersuchende Darmabschnitt wurde auf eine speziell

erhöhte Haltungsvorrichtig, die Stage, gelegt und mit einem Objektträger abgedeckt, um die

Mikroskopie zu ermöglichen, ohne den zu untersuchenden Abschnitt unnötig zu

traumatisieren.

3.3 Untersuchungsmethoden

Endotoxinmodell 3.3.1

Die LPS-Dosis, die benötigt wird, um den Einfluss der Endotoxinämie auf die

Mikrozirkulation zu untersuchen, wurde in Vorversuchen ermittelt. Zur Induktion der

Endotoxinämie entschieden wir uns für die Bolusapplikation von 15 mg/kg KG LPS (E. coli,

Serotyp O111:B4 , Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen) über den zentralvenösen

32

Zugang, beginnend nach der ersten IVM-Untersuchung. Um die Vergleichbarkeit zu

gewährleisten wurde bei den Kontrollgruppen diese Dosis als Elektrolytinfusion appliziert.

Intravitalmikroskopie 3.3.2

Wir benutzten zur Durchführung der Intravitalmikroskopie folgende Gerätekonfiguration:

Technik:

− Mikroskop: Epifloureszenzmikroskope, Axiotech Vario, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena,

Deutschland

− Lichtquelle: HBO 50, Osram, Berlin, Deutschland

− Okulare: 10x, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland

− Objektive: 20x/0,5 Achroplan, Carl Zeiss Jena GmbH, Jena, Deutschland

− Filter: Zeiss Filtersatz Nr. 20 (Anregung: BP 546/12; Strahlteiler: FT560 ; Emission:

BP 575-640) für Beobachtung im Rhodamin-6G-Kontrast

Zeiss Filtersatz Nr.10 (Anregung: BP 450-490; Strahlteiler: FT 510; Emission:

BP 515-565

− Videokamera: Pieper FK 6990 IQ, Pieper GmbH, Berlin, Deutschland

− Videorecorder: Panasonic NV-SV120EG-S, Matsushita Electric Ind. Co. Ltd., Japan

− Monitor: Hewlett Packard Modell 66s, Hewlett Packard, Saronno, Italien

− Video Timer: VTG-22, For-A-Company, Tokyo, Japan, finale Monitorvergrößerung

500fach

Zu Anfang wurde lichtmikroskopisch eine geeignete Venole im Mesenterium mit einem

Durchmesser zwischen 25-40 µm aufgesucht und Flourescein- isothiocyanat- Albumin

(FITC-Albumin) sowie Rhodamin-6G appliziert. FITC-Albumin dient der Darstellung des

Blutplasmas, während Rhodamin 6G benutzt wurde, um Leukozyten anzufärben. Mit Hilfe

respektiver Filter für FITC-Albumin und Rhodamin wurden je eine 30-sekündige

Videoaufzeichnung durchgeführt. Die Auswertung wurde verblindet und in zeitlicher

Versetzung vom Versuch durchgeführt.

33

Extravasation 3.3.3

Um den Austritt von Plasma aus den Gefäßen in das Gewebe darzustellen, injizierten wir 10

Minuten vor Messung FITC-Albumin, welches das Plasma unter Blauanregung darstellt und

bei einer Wellenlänge von 528 nm seine maximale Fluoreszenz hat. Dadurch kann bei

Benutzung entsprechender Filter der Intravasalraum (hell) vom Extravasalraum (dunkel)

unterschieden werden. Durch Feststellung des Helligkeitsunterschiedes zwischen Intra- und

Extravasalraum mittels computertechnischer Auswertung der digitalisierten Aufnahmen kann

die im Laufe des Experimentes auftretende Änderung der Plasmaextravasation objektiviert

werden. Der Helligkeit im Intra- und Extravasalraum wurden Werte von 0 (schwarz, keine

Fluoreszenz) bis 255 (weiß, maximale Fluoreszenz) zugewiesen. Wir führten pro IVM zu den

Messzeitpunkten 0, 60 und 120 Minuten fünf Messungen der Lichtintensität in der Venole

und dem sie umgebenden Gewebe durch. Danach bildeten wir den Mittelwert für jeden

Messzeitpunkt und errechneten den Quotienten aus den Mittelwerten des Intravasalraums und

des Extravasalraumes Ip/Ie.

Leukozyten-Endothel-Interaktion 3.3.4

Die Darstellung der Leukozyten erfolgte mit Rhodamin 6G, einem Fluoreszenzfarbstoff,

welcher bei einer Wellenlänge von 610 nm sein Fluoreszenzmaximum erreicht. 15 Minuten

vor der Untersuchung injizierten wir 0,2 ml 0,05g% Rhodamin 6G intravenös.

3.3.4.1 Temporär adhärente Leukozyten

Temporär adhärente Leukozyten weisen ein einfach zu erkennendes Verhalten in der

Fluoreszenzmikroskopie auf, da sie nur kurz andauernde Bindungen mit der

Endotheloberfläche eingehen, “rollen” sie an der Gefäßwand entlang. Es wurden alle

rollenden Leukozyten, die innerhalb der 30-sekündigen Aufnahme mit einer

durchschnittlichen Geschwindigkeit von 50 µm/s das untersuchte Areal passierten, gezählt

und als Anzahl pro Minute erfasst: Roller Flow= n/min.

34

3.3.4.2 Endothel-adhärente Leukozyten

In unserem Versuch wurden alle Leukozyten, die innerhalb der 30-sekündigen Aufnahme in

einer definierten Fläche an der Gefäßwand verweilten, erfasst. Um die Gefäßinnenfläche zu

berechnen, bezogen wir uns auf ein Zylindermodell:

Zylinderfläche: A=I*U (I= Länge des Gefäßes)

Zylinderumfang: U= π*d (d= Durchmesser des Gefäßes)

Adhärente Leukozyten pro Fläche: n/mm²

Laborparameter 3.3.5

Blutentnahmen erfolgten vor der Applikation der Medikamente und Kontrastmittel am

Zeitpunkt T= 0 min und am Ende des Versuchs zum Zeitpunkt T= 120 min.

3.3.5.1 Laktat

Zur Laktatbestimmung füllten wir 55 µl des gewonnenen Blutes in eine heparinisierte Pipette

(PICO 50, Radiometer Medical ApS, Åkandevej 21, DK-2700 Brønshøj, Denmark) und

werteten es maschinell aus (Radiometer ABL 330, Radiometer, Hamburg, Deutschland). Die

Eichung des Gerätes erfolgte entsprechend der Vorschrift der Herstellerfirma. Die Messung

fand innerhalb von 15 Minuten nach Gewinnung der Probe statt.

3.3.5.2 Zytokine

Zur Bestimmung der TNF-α, IL-1β, IL-6 und IL-10- Konzentration füllten wir eine

Microvette (500, Ca-EDTA, Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) mit 500 µl Blut und

zentrifugierten die Probe für 10 Minuten bei 6.000 Umdrehungen pro Minute. Der

Plasmaüberstand wurde abpippetiert, auf 4 Eppendorfgefäße verteilt und anschließend

tiefgefroren. Nach Abschluss aller Versuche ermittelten wir die Konzentration der Zytokine

mit Hilfe eines standardisierten Ratten-spezifischen Test-Kits (TNA-α, IL-1β, IL-6 und IL-10

Rat-Quantikine ELISA Kits, R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland).

35

Statistische Methoden 3.3.6

Da in unserem Versuch mit 40 Tieren eine kleine Fallzahl vorlag und die Ergebnisse im

Kolmogoroff-Smirnow-Test nicht normal verteilt waren, benutzten wir nicht-parametrische

Maßzahlen und Methoden zur Darstellung und Auswertung. Alle Ergebnisse wurden mittels

Kruskal-Wallis- bzw. Friedmantest auf Signifikanz überprüft und post hoc mit dem Student-

Newman-Keuls-Test analysiert. Mittlerer arterieller Blutdruck, Temperatur, Herz- und

Atemfrequenz wurden mittels zweifaktorieller Varianzanalyse überprüft, da hier mehrere

Messwerte über die Zeit vorlagen. Bei Signifikanz wurden diese Ergebnisse mittels Student-

Newman- Keuls-Test weiter analysiert.

Das Signifikanzniveau wurde bei p < 0,05 angesetzt.

Für die statistische Analyse nutzen wir das Statistikpaket SPSS 15.0 (SPSS GmbH Software,

München). Bei den Ergebnissen wurde Median, 25. und 75. Perzentile, Minimum und

Maximum dargestellt.

36

4 Ergebnisse

4.1 Intravitalmikroskopie

Extravasation 4.1.1

Abb.4: Plasmaextravasation (Quotient intra-/extravasal) zu den Messzeitpunkten 0, 60 und

120 Minuten.

Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur mit aktiviertem Protein C behandelte

Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit

aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; #P<0,05 versus LPS

Zeitpunkt der Intravitalmikroskopie [min]120600

Plas

mae

xtra

vasa

tion

[Quo

tient

intr

a-/ e

xtra

vasa

l]

1,0000000

,9000000

,8000000

,7000000

,6000000

,5000000

,4000000

115

38

58

4778

82

87

88

#

aPC+ LPSLPSaPCKontrolle

Gruppen

Page 3

37

In keiner Gruppe kam es im Verlauf zu einer signifikanten Zu- oder Abnahme der

Plasmaextravasation gegenüber ihrem Ausgangswert. Bei der ersten Intravitalmikroskopie

unterschieden sich die Gruppen nicht signifikant voneinander. Bei der zweiten

Intravitalmikroskopie, eine Stunde nach Medikamentengabe, unterschied sich keine Gruppe

nicht signifikant von der unbehandelten Kontrollgruppe, allerdings war die

Plasmaextravasation in der LPS-Gruppe signifikant höher als in der nur mit aPC behandelten

Kontrollgruppe. Während der dritten Intravitalmikroskopie, 120 Minuten nach Beginn des

Experiments, konnten wir feststellen, dass die Plasmaextravasation in der aPC-

Kontrollgruppe signifikant niedriger ausfiel als in den restlichen Gruppen. In der mit LPS

behandelten aPC-Gruppe verzeichneten wir eine signifikant niedrigere Plasmaextravasation

als in der LPS-Gruppe, einen Unterschied zur Kontrollgruppe konnten wir jedoch nicht

nachweisen.

38



Abb.5: Temporär adhärenten Leukozyten (n/min) zu den Zeitpunkten 0, 60 und 120 Minuten.



aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus

Kontrolle, #P<0,05 versus LPS

Im Vergleich zu den Ausgangswerten konnte in der mit LPS behandelten Gruppe ein

wesentlicher Anstieg der Anzahl von temporär adhärenten Leukozyten nach 60 und 120

Minuten verzeichnet werden. In den anderen Gruppen gab es gegenüber den Ausgangswerten

hingegen keine Veränderungen hinsichtlich der Anzahl der temporär adhärenten Leukozyten.

Nach 120 Minuten, zum Zeitpunkt der 3. Intravitalmikroskopie, wies die LPS-Gruppe eine


tem

porä

r adh

ären

te L

euko

zyte

n [n

/min

]

50,00

40,00

30,00

20,00

10,00

,00

11939 42

10aPC+ LPSLPSaPCKontrolle

Gruppen

#

*

Page 2

39

signifikant höhere Anzahl temporär adhärenter Leukozyten auf als die Kontrollgruppe. Des

Weiteren zeigte sich, dass in der mit aPC behandelten LPS-Gruppe die Anzahl der temporär

adhärenten Leukozyten signifikant niedriger ausfiel, als in der LPS-Gruppe.

4.1.2.2 Fest adhärente Leukozyten

Abb.6: Fest adhärente Leukozyten (n/mm2) zu den Zeitpunkten 0, 60 und 120 Minuten.




Kontrolle, #P<0,05 versus LPS

Die Anzahl der fest adhärenten Leukozyten in der Kontrollgruppe veränderte sich während

des Experiments nicht signifikant, jedoch war ein leicht ansteigender Trend zu beobachten. In

der mit aPC behandelten Gruppe war ebenfalls keine signifikante Veränderung in der Anzahl


fest

adh

ären

te L

euko

zyte

n [n

/mm

2]

1200,00

1000,00

800,00

600,00

400,00

200,00

,00

111

79102

30 62

42

#

#


Gruppen

**

Page 1

40

der fest adhärenten Leukozyten gegenüber den Ausgangswerten festzustellen, jedoch zeigte

sich eine abfallende Tendenz.

Sowohl nach 60 als auch nach 120 Minuten war die Anzahl der fest adhärenten Leukozyten in

der aPC-Gruppe signifikant niedriger als in allen anderen Gruppen. In der mit LPS

behandelten Gruppe stieg die Anzahl der fest adhärenten Leukozyten nach 60 Minuten

signifikant gegenüber dem Ausgangswert an. Zum letzten Messzeitpunkt, 120 Minuten nach

Versuchsbeginn, hatte sich der Wert gegenüber dem Ausgangswert vervierfacht. In der mit

LPS und aPC behandelten Gruppe nahm nach 60 Minuten die Stickeranzahl gegenüber den

Ausgangswerten zu, fiel aber nach 120 wieder auf den jeweiligen Ausgangswert ab. Sowohl

nach 60, als auch nach 120 Minuten konnte bei der aPC+LPS-Gruppe im Vergleich zur LPS-

Gruppe eine signifikant niedrigere Anzahl an fest adhärenten Leukozyten festgestellt werden.

41

4.2 Laborparameter

Laktat 4.2.1

Abb.7: Laktatkonzentration (mmol/l) zu den Messzeitpunkten 0 und 120 Minuten.




Kontrolle; #P<0,05 versus LPS

In den mit LPS behandelten Gruppen war ein Anstieg der Laktatkonzentration zu

verzeichnen, der sich signifikant von den Ausgangswerten unterschied. Die

Laktatkonzentration wich, sowohl in der Kontroll-, als auch in der aPC-Gruppe nicht

signifikant von ihrem jeweiligen Ausgangswert ab.

Zeitpunkt der Blutentnahme [min]1200

Lakt

atko

nzen

trat

ion

[mm

ol/l]

6,00

5,00

4,00

3,00

2,00

1,00

,00

32

37

2370

#

aPC+LPSLPSaPCKontrolle

Gruppen

*

Page 1

42

Nach 120 Minuten konnten wir feststellen, dass die Laktatkonzentration sowohl in der LPS-,

als auch in der aPC+LPS-Gruppe signifikant höher war, als in der Kontroll- und aPC-Gruppe.

Im Vergleich zu der Gruppe der ausschließlich LPS verabreicht wurde, wies die aPC+LPS-

Gruppe eine signifikant geringere Laktatkonzentration auf.

43

Zytokine 4.2.2

4.2.2.1 TNF-α

Abb.8: TNF-α Konzentration (pg/ml) zu den Zeitpunkten 0 und 120 Minuten.

TNF-α = Tumor necrosis Faktor-Alpha; Kontrolle = unbehandelte Kontrollgruppe; aPC = nur

mit aktiviertem Protein C behandelte Kontrollgruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid

behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte

Gruppe; n=10; *P<0,05 versus Kontrolle; #P<0,05 versus LPS

Zum Zeitpunkt der 1. Blutentnahme wiesen die Tiere der unbehandelten Kontrollgruppe eine

signifikant höhere TNF-α Konzentration auf als die Tiere der anderen Gruppen.

120 Minuten nach Medikamentenapplikation war die Konzentration von TNF-α in der

Kontroll- und aPC-Gruppe gleichbleibend niedrig. Bei den Tieren der beiden LPS-Gruppen

war ein signifikanter Anstieg der TNFα-Freisetzung zu beobachten. Die TNFα-Konzentration

Zeit der Blutentnahme[min]1200

TNF-

alph

a K

onze

ntra

tion

[pg/

ml]

1250,00

1000,00

750,00

500,00

250,00

,00

3354

63

61

50

46*

*


Gruppen#

Page 1

44

in der mit aPC behandelten LPS-Gruppe war dabei signifikant höher als in der nur mit LPS

behandelten Gruppe.

4.2.2.2 Interleukin-1β

Abb.9: IL-1β Konzentration (pg/ml) zu den Zeitpunkten 0 und 120 Minuten.

IL-1β= Interleukin-1Beta; Kontrolle= unbehandelte Kontrollgruppe; aPC= nur mit

aktiviertem Protein C behandelte Kontrollgruppe; LPS= nur mit Lipopolysaccharid

behandelte Gruppe, aPC+LPS= mit aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte

Gruppe n=10; *P<0,05 versus Kontrolle; #P<0,05 versus LPS.

In den beiden mit LPS behandelten Gruppen konnte gegen über den Ausgangswerten nach

120 Minuten eine signifikante Erhöhung der IL-1β-Konzentration festgestellt werden.) Die

IL-1β-Konzentration in den mit LPS behandelten Gruppen war nach 120 Minuten signifikant


IL-1

bet

a K

onze

ntra

tion

[pg/

ml]

5000,00

4000,00

3000,00

2000,00

1000,00

,00

3620

22

4

50

8

#

*aPC+ LPSLPSaPCKontrolle

Gruppen

Page 2

45

höher als in der Kontroll- und der aPC-Gruppe, allerdings war sie in der mit aPC behandelten

LPS-Gruppe signifikant niedriger als in der nur mit LPS behandelten Gruppe.

4.2.2.3 Interleukin-6

Abb.10: Interleukin-6 Konzentration (pg/ml) zu den Zeitpunkten 0 und 120 Minuten.

IL-6= Interleukin-6; Kontrolle= unbehandelte Kontrollgruppe; aPC= nur mit aktiviertem

Protein C behandelte Kontrollgruppe; LPS= nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe;

aPC+LPS= mit aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10;

*P<0,05 versus Kontrolle.

In den mit LPS behandelten Gruppen konnte 120 Minuten nach Endotoxingabe eine 25-fach

höhere IL-6 Konzentration als in der Kontrollgruppe gemessen werden, zwischen den beiden

LPS-Gruppen bestand jedoch zum gleichen Messzeitpunkt kein Unterschied in den IL-6

Konzentrationen.


IL-6

Kon

zent

ratio

n [p

g/m

l]

12000,00

10000,00

8000,00

6000,00

4000,00

2000,00

,00

76

79

33

5460

1218

63

4341


Gruppen*

Page 3

46

Im Gegensatz zu den beiden mit LPS behandelten Gruppen unterschied sich die IL-6

Konzentration in der Kontroll- und aPC-Gruppe nicht signifikant vom jeweiligen

Ausgangswert.


Abb.11: Interleukin-10 Konzentration (pg/ml) zum Zeitpunkt 0 und 120 Minuten.

IL-10= Interleukin-10; Kontrolle= unbehandelte Kontrollgruppe; aPC= nur mit aktiviertem

Protein C behandelte Kontrollgruppe; LPS= nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe;

aPC+LPS= mit aktiviertem Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe, n=10,

*P<0,05 versus Kontrolle, #P>0,05 versus LPS.

In allen Gruppen konnten wir einen signifikanten Anstieg der IL-10 Konzentrationen

gegenüber den Ausgangswerten beobachten.

Die IL-10 Konzentration zum Zeitpunkt 0 war in der aPC+LPS-Gruppe im Vergleich zu den

anderen Gruppen signifikant erhöht.

Zeitpunkt der Blutentnahme[min]1200

IL-1

0 K

onze

ntra

tion

[pg/

ml]

2000,00

1500,00

1000,00

500,00

,00

38152429

#


Gruppen

Page 4

47

Nach 120 Minuten konnten wir feststellen, dass die IL-10 Konzentration in beiden mit LPS

behandelten Gruppen signifikant höher war als in der Kontroll- und aPC-Gruppe. Die IL-10

Konzentrationen in beiden LPS-Gruppen unterschieden sich jedoch nicht signifikant

voneinander.

4.3 Hämodynamik

Mittlerer arterieller Blutdruck 4.3.1

Abb.12: Mittlerer arterieller Blutdruck (mmHg).




Kontrolle

Zeit [min]1209060300-30

mitt

lere

r art

erie

ller B

lutd

ruck

[mm

Hg]

175,00

150,00

125,00

100,00

75,00

112

100

93

265268

183

3

*


Gruppen

*

**

Seite 1

48

In unserer Untersuchung lagen die Ausgangswerte des mittleren arteriellen Blutdrucks in

allen Gruppen bei durchschnittlich 125 mmHg. In der Kontrollgruppe blieb der Blutdruck

während des ganzen Versuches stabil bei durchschnittlich 130 mmHG. In den beiden

Endotoxingruppen und der nur mit aPC behandelten Gruppe kam es im Vergleich zur

Kontrollgruppe 30 Minuten nach Applikation der Medikamente zu einem signifikanten Abfall

des mittleren Blutdrucks. Während in der LPS- und aPC+LPS-Gruppe der Blutdruckabfall

anhielt, stabilisierte sich der Blutdruck in der aPC-Gruppe nach 90 Minuten wieder. Zwischen

den Werten der LPS- und der mit aPC behandelten LPS-Gruppe bestand während des

gesamten Messzeitraumes kein signifikanter Unterschied.

Herzfrequenz 4.3.2

Abb.13: Herzfrequenz (n/min).



Messzeitpunkt [min]120 min.90 min.60 min.30 min.0 min.-30 min.

Her

zfre

quen

z [n

/min

]

600,00

550,00

500,00

450,00

400,00

350,00

300,00

193

191

197

177

179

97

186

187

185

405

162

10

*


Gruppen

*

#

Seite 2

49


Kontrolle, #P<0,05 versus LPS.

In der Kontrollgruppe und der aPC-Gruppe blieb die Herzfrequenz bei durchschnittlich

400/min und zeigte während des gesamten Experimentes keine signifikanten Veränderungen.

In den beiden mit LPS behandelten Gruppen stieg die Herzfrequenz nach 90 Minuten im

Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant an.

Während 60 und 90 Minuten nach Substanzgabe zwischen beiden LPS-Gruppen kein

signifikanter Unterschied in der Herzfrequenz bestand, konnten wir nach 120 Minuten

feststellen, dass in der aPC+LPS-Gruppe die Herzfrequenz mit durchschnittlich 451 Schlägen

pro Minuten signifikant niedriger war als in der nur mit LPS behandelten Gruppe mit 513

Schlägen pro Minute.

50

Atemfrequenz 4.3.3

Abb.14: Atemfrequenz (n/min).


Gruppe; LPS = nur mit Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; aPC+LPS = mit aktiviertem

Protein C und Lipopolysaccharid behandelte Gruppe; n=10; *P<0,05 versus Kontrolle;

#P<0,05 versus LPS.

Bei unserem Experiment konnten wir 60 Minuten nach Beginn des Experiments bei der LPS-

und aPC+LPS-Gruppe einen signifikanten Anstieg der Atemfrequenz feststellen, während

sich die Atemfrequenz in der Kontroll- und aPC-Gruppe nicht signifikant veränderte. Nach 90

Minuten war die Atemfrequenz der LPS-Gruppe höher als die der mit aPC behandelten LPS-

Gruppe. Die Atemfrequenz in der aPC+LPS-Gruppe unterschied sich nach 120 Minuten nicht

signifikant von den beiden Kontrollgruppen.

Messzeitpunkt [min]1209060300-30

Ate

mfr

eque

nz [n

/min

]

150,00

125,00

100,00

75,00

50,00

355

196

195

97

98

264

24

**


Gruppen

*

#

#

Seite 3

51

Temperatur 4.3.4

Abb.15: Temperatur (°C).




Kontrolle; #P<0,05 versus LPS.

Es konnte über den gesamten Zeitverlauf des Versuches ein signifikanter Temperaturanstieg

in der LPS-, aPC- und aPC+LPS-Gruppe festgestellt werden. Bei der Kontrollgruppe kam es

30 Minuten nach Beginn des Versuches zu einem signifikanten Temperaturanstieg, der sich

jedoch stabilisierte und nach 90 Minuten wieder abfiel und sich am Ende des Experiments

nicht mehr wesentlich vom Ausgangswert unterschied. Nach 60 Minuten war die Temperatur

in beiden mit LPS behandelten Gruppen signifikant höher als in der Kontrollgruppe. Während

die Temperatur in der LPS-Gruppe weiter anstieg, fiel sie in der mit aPC behandelten LPS-

Gruppe wieder ab und war 90 Minuten nach Medikamentengabe signifikant niedriger als in

Messzeitpunkt [min]1209060300-30

Tem

pera

tur [

°C]

42,00

41,00

40,00

39,00

38,00

37,00

36,00

419

338

97

430270

*


Gruppen

* # #

Seite 4

52

der LPS-Gruppe. Nach 120 Minuten konnte ein signifikanter Temperaturunterschied

zwischen den einzelnen Gruppen festgestellt werden. Die Tiere der Kontrollgruppe hatten mit

durchschnittlich 37,9°C die niedrigste Temperatur, gefolgt von den Tieren der aPC-Gruppe

mit 38,6°C, der aPC+LPS-Gruppe mit 39,7°C und der LPS-Gruppe mit 40,5°C.

53

5 Diskussion

5.1 Intravitalmikroskopie

Plasmaextravasation 5.1.1

Die Plasmaextravasation ist ein wichtiger Faktor in der Pathogenese der Sepsis, da sie zum

Organversagen durch Störung der Mikrozirkulation beiträgt. Durch die inflammatorische

Reaktion des Körpers verliert das Endothel seine Barrierefunktion, was einen unkontrollierten

Austritt von proteinreicher intravasaler Flüssigkeit in den Extravasalraum zur Folge hat.

Dieser Verlust des Plasmas führt zu einem relativen Volumenmangel, zur Hypotension und

zur Ödembildung in den Geweben.

Bei den Tieren der Kontrollgruppe blieb der Grad der Plasmaextravasation über den gesamten

Versuchszeitraum hinweg konstant. Aufgrund unserer Versuchsanordnung konnten wir die

Plasmaextravasation erst nach Präparation und Auslagerung des Darmes untersuchen,

weswegen es uns nicht möglich war, den Grad der Plasmaextravasation am nicht

traumatisierten Darmgewebe zu ermitteln. Auslagerung, Präparation und UV-Lichtexposition

während der Mikroskopie verursachen eine Entzündungsreaktion am Gewebe, die zu einer

Störung der endothelialen Barriere und somit zur Zunahme der Plasmaextravasation führen

kann. Bei den Tieren der aPC-Kontrollgruppe war interessanterweise eine signifikante

Reduktion der Plasmaextravasation zu beobachten. Es ist zu vermuten, dass die Gabe von

aPC die durch das experimentelle Setup ausgelöste Störung der Barrierefunktion reduziert.

Des Weiteren konnten wir feststellen, dass die Gabe von LPS zu einer starken Zunahme der

Plasmaextravasation führte, was mit den Angaben der Literatur übereinstimmt. Van

Lambalgen et al. haben gezeigt, dass im Intestinum die Extravasation unter Endotoxinämie

um bis zu 380% zunimmt (114).

In unserem Versuch haben wir zum ersten Mal in vivo nachweisen können, dass aPC die

Plasmaextravasation im Mesenterium während der Endotoxinämie signifikant verringert.

Zeng et al. haben mittels in vitro Untersuchungen an menschlichen Endothelzellen ebenfalls

eine konzentrationsabhängige Reduktion der endothelialen Permeabilität durch aPC

festgestellt (115). Aktiviertes Protein C führt über indirekte und direkte Mechanismen zu

einer Stabilisierung der endothelialen Barriere. Die direkte barrierestabilisierende Wirkung

von aPC wird durch die Aktivierung des Sphingosin-1-phosphat Rezeptor 1 (S1P1) vermittelt.

Der sich auf der Oberfläche der Endothelzellen befindende Protease-aktivierte Rezeptor 1

54

(PAR-1) wird ECPR-vermittelt von aPC aktiviert und induziert die Bildung von Sphingosin-

1-phosphat (S1P), das an S1P1 bindet (116). Die Aktivierung von S1P1 führt zu einer

Stabilisierung des Zytoskeletts und der Zell-Zellverbindungen und kann die durch Thrombin

verursachten Schäden an der endothelialen Barriere teilweise wieder rückgängig machen

(117,118). Bei entzündlichen Prozessen verliert die Glykokalyx ihre Struktur und ihre negativ

geladenen Bestandteile. Dies trägt zur erhöhten Plasmaextravasation bei, da die Gefäßwände

nun durchlässiger für Proteine wie Albumin sind (119). Marechal et al. haben am

Rattenmodell nachweisen können, dass aPC die LPS-bedingte Reduktion der

Glykokalyxstruktur vermindert (120). Ein weiterer Faktor der ebenfalls zur

Barrierendysfunktion beiträgt, ist die durch inflammatorische Mediatoren ausgelöste

Apoptose von Endothelzellen. Die Gabe von aPC wirkt dieser Apoptose entgegen, da es eine

vermehrte Expression anti-apoptotischer Proteine hervorruft (121,122). Wie weiter unten

näher ausgeführt, reduziert aPC die Anzahl an temporär und fest adhärenten Leukozyten an

der Gefäßwand im Mesenterium und könnte somit indirekt zur Reduktion der Extravasation in

unserem Versuch beigetragen haben. In der Literatur finden sich allerdings unterschiedliche

Aussagen zur Rolle der endothel-adhärenten Leukozyten in der Genese der erhöhten

Plasmaextravasation während der Sepsis. Yi und Kurose et al. haben in ihren Versuchen

festgestellt, dass ohne adhärente Leukozyten kein vaskuläres Leck entsteht (123,124). Im

Gegensatz dazu haben Walther et al.in ihrem Versuchen die Adhärenz der Leukozyten

unterbunden und konnten keine signifikante Minderung der Plasmaextravasation feststellen

(125). Ein wichtiger Faktor in der Entstehung der endothelialen Barrierestörung sind die

Thrombozyten, da ihre Inhibition sowohl in vivo als auch in vitro die Plasmaextravasation

verringert (126,127). Thrombin führt zu einer erhöhten Freisetzung und Aktivierung von

Thrombozyten, welche vermehrt Leukozyten auf der Oberfläche der Endothelzellen binden

und Aggregate bilden (128). Die Thrombozyten setzen Serotonin frei, was die Permeabilität

der Gefäße erhöht (129). Die Einschränkung der Thrombinproduktion durch aPC könnte

damit auch zu einer verminderten Aktivierung von Thrombozyten führen. Weiterhin wird

durch aPC auch vermehrt Cyclooxygenase in den Endothelzellen produziert, wodurch mehr

Prostacycline freigesetzt werden, die die Thrombozytenfunktion hemmen (130,131). Während

der Endotoxinämie werden im erhöhten Maße Mastzellen gebildet und aktiviert, dadurch wird

Histamin freigesetzt, das die Permeabilität der Gefäße erhöht (132). Marakova et al. konnte

am Rattenmodell nachweisen, dass aktiviertes Protein C die Freisetzung der histaminhaltigen

Mastzellgranula senkt (133).

55

Erhöhte Scherkräfte an den Gefäßwänden erhöhen die Permeabilität der Gefäße (134,135). In

unserem Versuchsaufbau haben wir die Scherkräfte nicht bestimmt, sodass sie nicht als

Erklärung für die Unterschiede in der Plasmaextravasation ausgeschlossen werden können.

Wie weiter unten dargestellt, konnten wir bei der aPC+LPS-Gruppe im Vergleich zur LPS-

Gruppe einen signifikant höheren mittleren arteriellen Blutdruck (MAP) messen. Da der MAP

jedoch nicht strikt mit der Durchblutung in der Mikrozirkulation korreliert, ist eine MAP-

bedingte Beeinflussung unserer Untersuchungsergebnisse unwahrscheinlich (136,137).


Um eine adäquate Immunantwort zu ermöglichen, müssen Immunzellen an den Ort der

Infektion gelangen. Sie wandern über den Blutstrom in das betroffenen Gewebe ein, indem

sie erst temporär und dann fest adhärieren bis sie ihren Bestimmungsort erreicht haben (138).

Während der Sepsis schädigen die einwandernden Leukozyten die Zellmembranen der

Endothelzellen durch Freisetzung von lytischen Enzymen und Sauerstoffradikalen, wodurch

die Funktion des Endothels gestört wird. Die Folgen sind eine erhöhte Gefäßpermeabilität und

die Aktivierung entzündlicher Kaskadensysteme (124).


Bereits während der ersten Intravitalmikroskopie vor Applikation der Medikamente konnten

wir „rollende“ Leukozyten an den Gefäßwänden im Mesenterium feststellen. Dies lässt sich

dadurch erklären, dass auch unter physiologischen Bedingungen immer eine geringen Anzahl

an Leukozyten am Endothel entlangrollen (139,140). Des Weiteren führt die Präparation des

Mesenteriums trotz gewebsschonender Maßnahmen wie Lagerung des Darms in erwärmter

Lösung, möglichst kurzer Belichtung des Untersuchungsgebiets und wenig Manipulation am

Darm zu einer Traumatisierung des Gewebes, die ihrerseits eine entzündliche Reaktion

auslösen und damit zu einer Ausschüttung von DAMPs und einer vermehrte Expression von

Adhäsionsmolekülen führen kann. Die Gabe von LPS führte zu einer starken Erhöhung der

Anzahl rollender Leukozyten, was von vielen Studien bestätigt wird (141).

Mittels unseres Versuches konnten wir zeigen, dass die Gabe von aPC die Anzahl temporär

adhärenter Leukozyten während der Endotoxinämie verringert, wodurch wir die Ergebnisse

von Iba und Hoffmann et al. bestätigen (139,142). Abraham et al. haben bei menschlicher

56

Endotoxinämie ebenfalls eine Reduktion der Akkumulation von neutrophilen Granulozyten in

der Lunge bei Behandlung mit aPC festgestellt (143).

APC beeinflusst die Anzahl temporär und fest adhärenter Leukozyten während der

Endotoxinämie auf direktem und indirektem Weg mittels Reduktion chemotaktischer Signale,

inflammatorischer Zytokine und von Adhäsionsmolekülen (144).

Aktiviertes Protein C wirkt indirekt auf die Adhärenz der Leukozyten indem es die pro-

inflammatorische Wirkung von Thrombin neutralisiert (87). Eine weitere indirekte Wirkung

ist die Veränderung der Genexpression des Transkriptionsfaktors NF-κB. Zudem werden

geringere Mengen an inflammatorischen Mediatoren wie TNF-α und IL-1β produziert, die die

Expression von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Leukozyten und Endothelzellen

stimulieren (102). Joyce et al. haben nachgewiesen, dass aPC eine Reduktion der Translation

von Genen, welche für E-Selektin, ICAM und VCAM codieren, bewirkt (145). Der EPCR

wird nicht nur auf der Oberfläche der Endothelzellen, sondern auch auf der Oberfläche von

neutrophilen Granulozyten exprimiert. Bindet aPC an den EPCR führt dies zu einer

verminderten Aktivierung und Expression von Adhäsionsmolekülen (146). Aktivierte

Thrombozyten auf der Oberfläche des Endothels verstärken die Bindung von Leukozyten,

indem sie Thrombozyten-Leukozyten Aggregate bilden (128). Es ist zu vermuten, dass durch

die aPC-vermittelte verminderte Thrombinproduktion auch weniger Thrombozyten aktiviert

werden, die zur weiteren Bindung von Leukozyten beitragen. In sehr hohen, nicht-

physiologischen Konzentrationen fungiert aPC auch als alternativer Ligand für das

Adhäsionsmolekül E-Selektin (147).

Die Zahl der rollenden Leukozyten wird durch die Scherkräfte an der Gefäßwand, dem

Durchmesser der Gefäße und die Leukozytenzahl im Blut beeinflusst. Eine Erhöhung der

Scherkräfte führt zu einer reduzierten Anzahl an rollenden Leukozyten, da diese ihre

Pseudopoden zurückziehen und weniger Adhäsionsmoleküle exprimieren (148). In unserem

Versuch haben wir keine Messung der Scherkräfte an den Gefäßwänden durchgeführt und

konnten somit auch nicht deren Einfluss auf unsere Messergebnissen bestimmen. Weiterhin

ist in kleineren Gefäßen eine höhere Anzahl an Leukozyten an den Gefäßwänden temporär

adhärent. Fiebig et al. haben festgestellt, dass eine Reduktion von 5µm zu einer Verdopplung

der Anzahl der rollenden Leukozyten führt (149). In unserem Versuch untersuchten wir

Gefäße mit einem Durchmesser zwischen 25-40 µm, allerdings nicht die Verteilung der

Durchmesser auf die verschiedenen Versuchsgruppen, sodass wir auch hier eine mögliche

Beeinflussung unserer Ergebnisse nicht erfassen konnten.

57

Abraham et al. konnten mittels ihrer Untersuchungen nachweisen, dass es während der Sepsis

zu einer vermehrte Einwanderung von Leukozyten in die Organe kommt (150,151). Die

erhöhte Anzahl an Leukozyten trägt zum Versagen der Mikrozirkulation bei, was einer der

Hauptursachen für die Entwicklung einer Organdysfunktion ist (61). Donati et al. haben

nachgewiesen, dass die Gabe von aPC die Mikrozirkulation während der schweren Sepsis

verbessert, ein Grund dafür könnte die APC-induzierte reduzierte Leukozytenadhärenz sein

(104,136,152). Wenn weniger Leukozyten am Endothel anhaften ist dies auch ein indirekter

Nachweis für eine verminderte Aktivierung von Endothelzellen und Leukozyten.

5.1.2.2 Fest-adhärente Leukozyten

Neben den temporär adhärenten Leukozyten konnten wir zum Messzeitpunkt 0 auch fest

adhärente Leukozyten an den Gefäßwänden feststellen. Auch hierfür könnte die Ursache die

weiter oben beschriebene versuchsbedingte Traumatisierung des Gewebes sein. Wir konnten

nachweisen, dass aPC während der Endotoxinämie die Anzahl der fest adhärenten

Leukozyten an der Gefäßwand vermindert. Damit bestätigen wir die Ergebnisse anderer

Autoren und unserer Arbeitsgruppe (139,140).

Um eine feste Bindung mit dem Endothel eingehen zu können, müssen die Leukozyten

aktiviert werden (153). In mehreren Versuchen konnte gezeigt werden, dass aPC die

Aktivierung von Leukozyten verringert (104,152). Die Adhäsionsmoleküle, die die feste

Adhärenz der Leukozyten an die Gefäßwand vermitteln, sind die Integrine und deren

Liganden, die CAMs. Wie im vorherigen Kapitel dargestellt, führt aPC über eine Reihe von

direkten und indirekten Mechanismen zu einer verminderten Aktivierung von Leukozyten und

Endothelzellen und damit zu einer geringeren Expression von ICAM und VCAM (122).

Elphick et al. konnten in vitro und in vivo nachweisen, dass aPC direkt an die β1- und β3-

Integrine auf der Oberfläche von neutrophilen Granulozyten bindet und somit ihre feste

Bindung und Migration vermindert (154). Weiterhin wurde nachgewiesen, dass aPC die

Reaktion von Lymphozyten, neutrophilen und eosinophilen Granulozyten auf chemotaktische

Signale, die die Migration von Leukozyten in die Gewebe steuern, vermindert (155,156). Die

Leukozyten an den Gefäßwänden produzieren Enzyme und reaktive Sauerstoff- und

Stickstoffspezies, die das Endothel weiter schädigen können und damit zum Versagen der

Mikrozirkulation beitragen können. Aus diesen Gründen ist davon auszugehen, dass eine

Reduktion der Anzahl fest adhärenter Leukozyten zu einem günstigeren Verlauf der Sepsis

beiträgt.

58

5.2 Laborparameter

Laktat 5.2.1

Die Laktatkonzentration im Blut ist ein wichtiger prognostischer Faktor für die Behandlung

einer Sepsis und korreliert mit der Schwere der Erkrankung und der Mortalität (157). Laktat

entsteht, wenn die Organe nicht genügend Sauerstoff erhalten und die Zellen auf den

anaeroben Stoffwechsel zur Energiegewinnung umstellen. Während einer Sepsis kommt es

oftmals zu einer erhöhten Laktatkonzentration im Blut, diese entsteht durch eine verstärkte

Laktatproduktion aufgrund einer gestörten Sauerstoffversorgung auf makro- und

mikrohämodynamischer Ebene sowie einer gestörten Sauerstoffverwertung auf zellulärer

Ebene. Zusätzlich kann der Abbau des Laktats durch die Leber, Niere und Skelettmuskulatur

vermindert sein (157,158).

In unserer Versuchsreihe konnten wir in der Kontroll- und aPC- Gruppe keine Veränderung

der Laktatkonzentration feststellen. In der LPS-Gruppe hingegen hatte sich die

Laktatkonzentration nach 2 Stunden verdreifacht. Auch bei der aPC+LPS-Gruppe konnten

wir nach 120 Minuten eine Erhöhung der Laktatkonzentration feststellen, diese fiel jedoch

signifikant niedriger aus als in LPS-Gruppe.

De Backer et al. konnten in ihrer Studie am Menschen ebenfalls feststellen, dass die Gabe von

aPC bei Endotoxinämie eine Reduktion der Laktatkonzentration bewirkt (137). Ob aPC eine

direkte Auswirkung auf die Produktion oder die Clearance von Laktat hat ist nicht bekannt.

Severin et al. haben im Rattenmodell festgestellt, dass vor allem die Clearance von Laktat bei

Endotoxinämie eingeschränkt ist, da bedingt durch die eingeschränkte Durchblutung weniger

Laktat von den Organen aufgenommen werden kann (159). Da wir, wie oben ausgeführt, eine

aPC bedingte Stabilisierung der Makro- und Mikrozirkulation festgestellt haben, lässt sich

vermuten, dass diese Stabilisierung die Laktatclearance verbessert hat. Durch die

Stabilisierung der Mikrozirkulation wird zusätzlich eine bessere Sauerstoffversorgung der

Organe erreicht, was dazu führt, dass weniger Laktat produziert wird. Eine weitere, von der

Sauerstoffversorgung der Organe unabhängige Laktatquelle sind die Leukozyten, Haji-

Michael et al. haben nachweisen können, dass bei Endotoxinämie die Leukozyten eine

signifikante Menge Laktat produzieren (160). Die von uns bereits diskutierte verminderte

Aktivierung und Rekrutierung von Leukozyten durch aPC könnte somit ebenfalls zur

Verminderung der Laktatkonzentration beitragen.

59

Eine erhöhte Laktatkonzentration alleine ist jedoch kein verlässlicher Indikator für eine

Gewebshypoxie und kann den Zustand der Mikrozirkulation nicht verlässlich abbilden (161).

Zytokine 5.2.2

5.2.2.1 TNF-α

In unserem Versuch stieg nach LPS-Gabe die TNF-α Konzentration nach 120 Minuten stark

an. In vielen Versuchen an Menschen und Tieren konnte nach Gabe von Endotoxin ein

Anstieg der Plasmaspiegel von TNF-α verzeichnet werden, der nach 90 Minuten sein

Maximum erreichte (42,162-164). In der mit aPC behandelten LPS- Gruppe war die TNF-α

Konzentration nach 120 Minuten sogar etwas höher als in der LPS-Gruppe, was konträr zur

derzeitigen Studienlage ist.

Aktiviertes Protein C inhibiert die Produktion von TNF-α indem es die Translokation von NF-

κB in den Zellkern verhindert. NF-κB wird bei Aktivierung aus dem Zytosol in den Zellkern

überführt, wo er zu einer vermehrten Transkription von inflammatorischen Mediatoren wie

TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 und ICAM führt (165). In mehreren in vitro- und in vivo-Studien

wurde nachgewiesen, dass aPC die LPS-induzierte Aktivierung von NF-κB in Monozyten

reduziert (102,166,167). Die Inhibition von NF-κB scheint in vivo zu einer höheren

Überlebenswahrscheinlichkeit, nicht nur bei Endotoxinsepsis, sondern auch bei

polymikrobieller Sepsis, zu führen (168). Fibrin und Fibrinogen verstärken die Expression

von TNF-α, die fibrinolytische Wirkung von aPC könnte demnach ebenfalls eine

Verringerung der TNF-α Konzentration bewirken (81).

Die verminderte Ausschüttung von pro-inflammatorischen Mediatoren durch aPC bedeutet

eine direkte Wirkung auf die Entstehung der Entzündungsreaktion. Neben den direkten

Wirkungen von TNF-α, wie zum Beispiel die Aktivierung der Abwehrzellen und der

Koagulation, hat dieses Zytokin eine besondere Bedeutung für den Verlauf einer Sepsis (169).

Indem es Makrophagen zur Ausschüttung weiterer Zytokine, Lipid-Mediatoren und reaktiver

Sauerstoffspezies stimuliert, fungiert es als Hauptaktivator der weiteren Zytokinkaskade und

der pro-inflammatorischen Ausrichtung der Immunantwort (40). Die TNF-α Konzentration

korreliert beim Menschen mit der Schwere und dem Ausgang einer Sepsis, was die

Vermutung nahe legt, dass eine Reduktion dieses Zytokins einen günstigeren

Krankheitsverlauf bedingen könnte (41). Es muss aber beachtet werden, dass Zytokine sehr

wichtig sind für die Abwehr von Mikroorganismen und dass die Behandlung mit spezifischen

60

TNF-α-Antikörpern im Rahmen einer Sepsistherapie keine Reduktion der Mortalität erzielen

konnte (30,170). Bei der menschlichen Endotoxinämie konnte kein Wirkung von aPC auf die

Konzentration von TNF-α nachgewiesen werden (112,171). In unserer Versuchsreihe haben

wir lediglich die globale Konzentration von TNF-α im Blut bestimmt, weswegen wir keine

Aussage über Veränderungen in der lokalen TNF-α-Konzentration machen können. Da es

sich bei der Sepsis um ein sehr komplexes Krankheitsbild handelt, dessen Pathophysiologie

noch nicht vollständig erforscht ist, lässt sich kein abschließendes Urteil fällen, ob eine

Änderung der TNF-α Konzentration positive oder negative Effekte hat.

5.2.2.2 IL-1β

IL-1β ist ein weiterer Mediator, welcher von aktivierten Makrophagen und Endothelzellen am

Anfang der Zytokinkaskade freigesetzt wird. In den Gruppen, die kein LPS verabreicht

bekommen hatten, veränderte sich die Konzentration von IL-1β nicht. Die Gabe von LPS

hingegen verursachte einen Anstieg der IL-1β Konzentration um den Faktor 10. In unserem

Versuch konnten wir zeigen, dass aPC die Konzentration von IL-1β während der

Endotoxinämie deutlich reduziert. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit der gegenwärtigen

Studienlage am Rattenmodell, Keller et al. konnten zum Beispiel nach der Gabe von aPC

während einer Endotoxinämie ebenfalls eine deutliche Reduktion von IL-1β feststellen (172).

Auch beim Menschen konnte eine Verminderung der IL-1β-Konzentration durch die Gabe

von aPC nachgewiesen werden (173).

Die Reduktion der IL-1β-Konzentration kann auf die aPC bedingte Hemmung des

Transkriptionsfaktors NF-κB zurückgeführt werden (167). Auch die fibrinolytische Funktion

von aPC führt zu Verminderung der Fibrin und Fibrinogen bedingten Produktion von IL-1β

(174). Während der Sepsis hat IL-1β einen inhibitorischen Effekt auf die Aktivierung von

Protein C. IL-1β vermindert die Produktion von EPCR und Thrombomodulin, zwei

membranständige Enzyme die potente Aktivatoren der Konversion von Protein C in seine

aktivierte Form sind. EPCR vermittelt zudem viele zelluläre Wirkungen von aktiviertem

Protein C (87). IL-1β vermindert die Konzentration von Thrombomodulin und des EPCR auf

zellulärer Ebene, indem es die Transkription herabsetzt. Weiterhin wird der auf den

Endothelzellen membranständige EPCR freigesetzt, in dieser Form ist seine Wirkung

vermindert (82). Somit lässt sich vermuten, dass die aPC bedingte Verminderung der IL-1β

Produktion auch die Freisetzung und Wirkung des körpereigenen aPC verstärkt.

61

IL-1β ist ein proximales Zytokin, das die Immunantwort des Körpers aktiviert und reguliert.

Deshalb hat IL-1β, wie TNF-α, eine Schlüsselrolle in der Pathophysiologie der Sepsis inne

(40). Es ist davon auszugehen, dass die verminderte Ausschüttung von IL-1β den Verlauf der

Sepsis positiv beeinflusst, da im Mausmodell bei Applikation eines Rezeptorantagonisten von

IL-1 (IL-1ra) eine höhere Überlebenswahrscheinlichkeit festgestellt werden konnte (175), Es

war allerdings nicht möglich diese Ergebnisse beim Menschen zu reproduzieren (176). Bei

der rheumatischen Arthritis, einer chronisch inflammatorischen Krankheit, hat sich die Gabe

von IL-1ra jedoch als Therapie etabliert (177).

5.2.2.3 Interleukin- 6

Ein wichtiger distaler Mediator der Sepsis ist das Interleukin-6, dessen Produktion von TNF-α

und IL-1β stimuliert wird (178).

In unserem Versuch konnten wir keinen Effekt von aPC auf die Produktion von IL-6 während

der Endotoxinämie zeigen. Die Wirkung von aPC auf die IL-6 Konzentration ist in der

Literatur noch umstritten. Iba et al. haben bei einer Versuchsanordnung, die unserer ähnlich

ist, eine und drei Stunden nach aPC-Gabe eine deutliche Reduktion der IL-6 Konzentration

gemessen, jedoch wurde eine deutlich geringere LPS-Dosis verwendet (139). Derhaschnig

und Kalil et al. haben bei der menschlichen Endotoxinämie keinen Einfluss von aPC auf die

IL-6-Konzentration nachgewiesen (171,179). Im Gegensatz dazu wurde in der PROWESS-

Studie bei septischen Patienten eine signifikante Reduktion der IL-6-Konzentration durch aPC

festgestellt (180).

Mehrere in vivo-Studien haben gezeigt, dass aPC die Produktion von IL-6 in den

Endothelzellen großer Gefäße und Keratinozyten erhöht, während es die Produktion in den

Makrophagen, neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen der Mikrozirkulation

vermindert (173,181-183). Die Ausschalten des IL-6-Gens im Mausmodell machte die

Versuchstiere resistenter gegenüber pulmonaler und abdomineller Inflammation (184,185). In

anderen in vivo-Studien konnte ebenfalls ein protektiver Effekt von IL-6 während der

Endotoxinämie nachgewiesen werden (186). Während einer Meningokokkensepsis ist IL-6 an

der Entstehung der myokardialen Depression beteiligt, die zu einem zirkulatorischen Schock

und kritischer Organperfusion führen kann (187). Die derzeitige Studienlage lässt keine

eindeutigen Schlüsse zu, ob eine Reduktion der IL-6-Konzentration einen positiven Einfluss

auf den Verlauf einer Sepsis hat. Allerdings haben mehrere Studien die Validität von IL-6 als

62

diagnostischen und prognostischen Marker der Sepsis beim menschlichen Erwachsenen und

Neonaten belegt (46,188,189).


Produktion und Wirkung pro-inflammatorischer Zytokine hemmt und damit zu

hämodynamischer Stabilität und der verminderten Aktivierung der Leukozyten und des

Endothels beiträgt (190-192).

In allen untersuchten Gruppen konnte ein Anstieg der IL-10-Konzentration gemessen werden.

Der Anstieg von IL-10 in der Kontrollgruppe nach 120 Minuten kann auf das

Operationstrauma und die dadurch entstandene inflammatorische Reaktion zurückgeführt

werden (193). In der nur mit aPC behandelten Gruppe stieg die IL-10-Konzentration nach 120

Minuten signifikant an. Weiterhin stellten wir fest, dass sich die IL-10-Konzentration bei der

mit aPC und LPS behandelten Gruppe nicht signifikant von der LPS- Gruppe unterschied.

Lehmann et al. haben bei einem ähnlichen Versuch eine signifikante Erhöhung der IL-10

Konzentration durch die Gabe von aPC bei Endotoxinämie feststellen können (140). Lehmann

und Fijen et al. haben die maximale Konzentration von IL-10 drei Stunden nach LPS-Gabe

gemessen, da wir unser Experiment schon früher beendet haben, ist zu vermuten, dass wir

diesen möglichen Effekt nicht messen konnten (140,194).

Die Applikation von aPC erhöht die Konzentration von IL-10 im Blut, indem es die

Produktion von IL-10 durch LPS-stimulierte Makrophagen induziert (195). Makrophagen

produzieren mehr pro-inflammatorische Mediatoren, wenn sie durch LPS oder den Mediator

Interferon-gamma (IFN-γ) stimuliert werden, aPC und IL-10 hingegen vermindern diese

Reaktion der Makrophagen (196). Eine Erhöhung der IL-10 Konzentration führt im

Mausmodell bei Endotoxinämie zu einer deutlich erhöhten Überlebenswahrscheinlichkeit. In

Modellen der polymikrobiellen Sepsis scheint IL-10 jedoch eher negative Effekte zu haben

(197,198). Einige Autoren gehen davon aus, dass IL-10 in der Anfangsphase der Sepsis durch

seine anti-inflammatorische Wirkung protektiv wirkt, in der Spätphase allerdings zur

Immunsuppression beiträgt, die wesentlich für die Mortalität verantwortlich ist, sodass der

Zeitpunkt der IL-10-Wirkung von Bedeutung ist (198,199).

63

5.3 Hämodynamische Parameter

Mittlerer arterieller Blutdruck 5.3.1

Der mittlere arterielle Blutdruck (MAP) ist eines der diagnostischen Kriterien der Sepsis. Ein

mittlerer arterieller Blutdruck von unter 70 mmHg oder ein Abfall vom Ausgangswert um 40

mmHg wird als pathologisch angesehen (200). Der Blutdruckabfall während einer Sepsis wird

auf eine verminderte Wirksamkeit vasokonstriktorischer Mediatoren zurückgeführt, welche

durch eine vermehrte Produktion von Stickstoffmonoxid (NO), dem potentesten Vasodilatator

des Organismus, verursacht wird (201-203).

Während unseres Versuchs konnten wir in allen Gruppen außer der Kontrollgruppe einen

Abfall des MAP feststellen. In der Kontrollgruppe lag der MAP über den kompletten

Zeitraum des Experiments konstant bei durchschnittlich 125 mmHg, während in den anderen

Gruppen 30 Minuten nach Medikamentenapplikation ein Abfall auf durchschnittlich 100

mmHg zu beobachten war, der bis zum Ende des Experiments anhielt. Lehmann et al.

konnten bei einem vergleichbaren Versuch mit Gabe der gleichen LPS-Dosis einen ähnlich

starken MAP-Abfall in den beiden mit LPS behandelten Gruppen feststellen, allerdings

normalisierten sich diese Werte und entsprachen nach drei Stunden wieder den

Ausgangswerten (140). Wir konnten eine mögliche Rückkehr zu den Ausgangswerten nicht

beobachten, da wir unsere letzte Messung zwei Stunden nach Endotoxingabe durchgeführt

haben. Allerdings befanden sich die MAP-Werte in einem akzeptablen, unteren

Referenzbereich, sodass kein septischer Schock mehr vorlag. De Backer et al. konnten beim

Menschen 4 Stunden nach aPC-Gabe eine Erhöhung des Blutdrucks feststellen, was ebenfalls

über unseren Beobachtungszeitraum hinausgeht (137).

In der nur mit aPC behandelten Gruppe verzeichneten wir ebenfalls einen Abfall des

Blutdruckes nach Medikamentenapplikation, der jedoch von anderen Untersuchungen nicht

bestätigt wird.

Die Stabilisierung des Blutdrucks durch aPC ist umstritten. Während Derhaschnig et al.

keinen Einfluss feststellen konnten, haben Kalil et al. bei gesunden Probanden eine Inhibition

des Endotoxin-vermittelten Blutdruckabfalls nachgewiesen (171,179). Bei Patienten im

septischen Schock hatte aPC einen stabilisierenden Einfluss auf den MAP, was die

Notwendigkeit von Vasopressorengaben reduzierte (204).

64

Die blutdruckstabilisierende Wirkung von aPC wird auf Verbesserung der Mikrozirkulation,

Myokardfunktion und Reaktivität der Widerstandsgefäße zurückgeführt. Die Applikation von

aPC bei Endotoxinämie führt zu einer verminderten Produktion von Stickstoffmonoxid, bei

dem es sich um einen potenten Vasodilatator der Widerstandsgefäße handelt (205). Zytokine,

wie TNF-α und IL-1β, induzieren über NF-κB die vermehrte Expression von iNOS, aPC

vermindert die Aktivität von NF-κB und könnte somit auch die Expression von iNOS

reduzieren (202). Weiterhin bildet Stickstoffmonoxid mit dem von Leukozyten produzierten

Superoxid das Peroxynitrit (206). Sowohl NO als auch Peroxynitrit tragen zur myokardialen

Dysfunktion bei Endotoxinämie bei indem sie die Sauerstoffverwertung in den Mitochondrien

der Herzmuskelzellen stören (207). Sennoun et al. konnten im Rattenmodell nachweisen, dass

die Gabe von aPC die Myokardfunktion erhält (208). Beim Menschen konnte ebenfalls ein

positiver Effekt von aPC auf die Myokardfunktion bei gleichzeitiger Gabe von Dexamethason

nachgewiesen werden (209). Die von uns gezeigte Verminderung der Plasmaextravasation

und der Leukozyten-Endothel-Interaktion könnte ebenfalls zu einer Verbesserung des MAP

aufgrund einer Verbesserung der Mikrozirkulation beitragen (136,137). Auch wenn es sich

beim MAP um einen Marker der Makrohämodynamik handelt, der nicht mit der Funktion der

Mikrozirkulation korreliert, hat sich doch gezeigt, dass eine Stabilisierung des Blutdrucks das

Outcome verbessert, was ein wichtiges Ziel in der Behandlung der Sepsis darstellt (210).

Herzfrequenz 5.3.2

Ein weiteres Kriterium der Sepsis beim Menschen ist der Anstieg der Herzfrequenz auf über

90 Schläge pro Minute (beats per minute, bpm). Die hämodynamischen Veränderungen, wie

Herzfrequenz und Blutdruck, dienen auch als Kontrolle der Effektivität des

Endotoxinmodells.

Wir konnten in beiden mit LPS behandelten Gruppen einen signifikanten Anstieg der

Herzfrequenz messen. Sowohl die Kontroll-, als auch die aPC-Gruppe hatten während des

gesamten Versuches eine durchschnittliche Herzfrequenz von 400 Schlägen pro Minuten. In

der LPS-Gruppe konnte nach zwei Stunden ein ausgeprägter Anstieg auf 500 bpm verzeichnet

werden. In der mit aPC behandelten LPS-Gruppe stieg die Herzfrequenz zuerst wie in der

LPS-Gruppe an, nach 120 Minuten jedoch waren die Werte mit durchschnittlich 450 bpm

signifikant niedriger als bei der Endotoxinämiegruppe.

Der Anstieg der Herzfrequenz nach LPS-Gabe wird von vielen Untersuchungen bestätigt.

Abhängig von der applizierten LPS-Menge stellt sich eine hyper- oder hypodyname

65

Kreislaufsituation ein. Die von uns verwendete Dosis führt zu dem Bild eines hypodynamen

Schocks (105,140,211). In der Literatur konnten wir kein Beispiel finden indem ein Einfluss

von aPC auf die Herzfrequenz beschrieben wurde. Die von uns beobachtete signifikante

Reduktion der Herzfrequenz kann z.B. auf den Einfluss der Zytokine auf das autonome

Nervensystem zurückgeführt werden.

Llaguno et al. haben festgestellt, dass bei Parasitämie die freigesetzten Zytokine das

autonome Nervensystem beeinträchtigen, was zu einer verminderten Aktivität des Nervus

vagus führt (212). Die Verminderung der Zytokinproduktion durch aPC könnte also zu einer

verminderten Herzfrequenz führen, allerdings wurde ein kausaler Zusammenhang zwischen

diesen beiden Faktoren noch nicht untersucht. Eine niedrigere Herzfrequenz kann auch

Ausdruck des besseren Blutdrucks sein, da eine bessere Füllung des Ventrikels nach dem

Frank-Starling-Mechanismus zu einer niedrigeren Herzfrequenz führt.

Eine Reduktion der Herzfrequenz ist von Vorteil, denn eine hohe Herzfrequenz bedeutet mehr

Arbeit für das Herz und damit einen höheren Sauerstoffverbrauch. Hält die erhöhte Arbeit des

Herzens an, kann es zu einer Erschöpfung des Myokards und zu einem Herzversagen

kommen.

Atemfrequenz 5.3.3

Unter septischen Bedingungen ist häufig eine Veränderung der Atemfrequenz zu beobachten,

sodass eine Tachypnoe mit mehr als 20 Atemzügen pro Minute oder ein Abfall des arteriellen

CO2 unter 32 mmHg als Zeichen der Hyperventilation beim Menschen als ein Sepsiskriterium

gesehen wird. Die erhöhte Atemfrequenz ist dabei ein Kompensationsmechanismus für die

latente metabolische Azidose (213).

In der Kontroll- und aPC-Gruppe konnten wir während des gesamten Versuchszeitraums

keine Veränderung der Atemfrequenz messen. Unter Endotoxinämie entstand im Vergleich

zur Kontroll- und aPC-Gruppe ein starker Anstieg der Atemfrequenz, jedoch konnten wir bei

der mit aPC behandelten LPS-Gruppe einen signifikant niedrigeren Anstieg messen als in der

LPS-Gruppe.

Unter entzündlichen Bedingungen wird die Atemfrequenz durch vagale Afferenzen der Lunge

und arterielle Chemorezeptoren gesteuert. Die Chemorezeptoren reagieren dabei auf

Veränderungen von CO2, O2 und des Säure- Base- Haushalt, während die vagalen Afferenzen

durch entzündliche Prozesse und pulmonalarteriellen Embolien ausgelöst werden können.

Tang et al. haben im Rattenmodell festgestellt, dass die vagalen Afferenzen

66

hauptverantwortlich für die Erhöhung der Atemfrequenz während der Sepsis sind und die

arteriellen Chemorezeptoren gegenregulieren. Es wird vermutet, dass entzündliche

Mediatoren wie TNF-α, Bradykinin und Thromboxan für die Stimulation der vagalen

Afferenzen verantwortlich sind (213). Die von aPC über NF-κB vermittelte verminderte

Produktion von entzündlichen Mediatoren könnte damit zur Reduktion der Atemfrequenz

während der Endotoxinämie beigetragen haben. Die oben besprochene Reduktion der

Laktatkonzentration und damit der metabolischen Azidose kann ebenfalls dazu beitragen,

dass die Atemfrequenz niedriger ist.

Temperatur 5.3.4

Ein Anstieg der Körpertemperatur über 38°C gilt als ein Sepsiskriterium (2). In allen Gruppen

konnte während des Experimentes eine Veränderung der Körpertemperatur festgestellt

werden. In der Kontrollgruppe stieg die Temperatur 30 Minuten nach Beginn an und sank

nach 90 Minuten wieder auf den Ausgangswert ab. Die Temperatur in den anderen Gruppen

stieg kontinuierlich. Die Gabe von Endotoxin führte zu einer Erhöhung der Temperatur, die

Applikation von aPC bei Endotoxinämie verminderte den Anstieg jedoch signifikant.

Der Temperaturanstieg in der Kontroll- und aPC-Gruppe lässt sich durch das

Operationstrauma erklären.

Bei Endotoxin handelt es sich um sogenanntes exogenes Pyrogen, also um eine

fieberauslösende Substanz. Dieses führt über die Aktivierung der Abwehrzellen zur

Produktion einer Reihe von endogenen Pyrogenen wie TNF-α, IL-1 und IL-6 (39,214).

Endogene Pyrogene verursachen die Bildung von Prostaglandin E2 im Gehirn, welches zu

einer direkten Erhöhung der Körpertemperatur führt (214). Es ist umstritten, ob sich eine

erhöhte Körpertemperatur positiv oder negativ auf den Verlauf einer Sepsis auswirkt (215).

Die antipyretische Wirkung von aPC kann dadurch erklärt werden, dass, wie oben bereits

ausgeführt, die Supprimierung von NF-κB zu einer verminderten Synthese von Zytokinen

führt, welche auch als endogene Pyrogene fungieren.

Die manuelle Regulation der Temperatur des Versuchsaufbaus stellt jedoch wahrscheinlich

die größte Einschränkung bei der Interpretation des Temperaturverlaufs dar.

67

5.4 Limitationen

Die Ergebnisse aus dem von uns verwendeten Tiermodell können nur bedingt auf den

Menschen übertragen werden, da das Endotoxinmodell die Komplexität der menschlichen

Sepsis nur beschränkt darstellen kann und es signifikante Unterschiede zwischen einem

tierischen und einem menschlichen Organismus gibt (216).

Die Bolusapplikation von Endotoxin führt zu einer ausgeprägten Entzündungsreaktion,

während bei septischen Prozessen ein stetiger entzündlicher Reiz vorherrscht (217). Anstatt

einer massiven Freisetzung von bakteriellen Bestandteilen und damit von entzündlichen

Mediatoren, wird bei einer Infektion eine deutlich niedrigere Konzentration an bakteriellen

Bestandteilen freigesetzt, was auch zu einer deutlich niedrigeren Konzentration von

Mediatoren wie TNF-α und IL-1 führt (217). Es werden verschiedene Serotypen von

Endotoxin in der Forschung verwendet, deren Eigenschaften sehr verschieden sein können.

Nedrebo et al. haben zum Beispiel für die Serotypen 0127:B8 und 0111:B4 zwar eine gleiche

hämodynamische Wirkung, jedoch deutliche Unterschiede in der Plasmaextravasation

festgestellt (218). Da es beim Endotoxinmodell keinen Fokus gibt, der durch die Abwehr

bekämpft werden kann, überwiegt die schädigende Wirkung der induzierten

inflammatorischen Reaktion auf die Organe (219). Der therapeutische Effekt von anti-

inflammatorische Substanzen wie aPC oder Zytokinantagonisten könnte deshalb übertrieben

dargestellt werden. Es ging in unserem Versuch darum, die Wirkungsweise von aPC genauer

zu untersuchen, die Effektivität von aPC bei der Behandlung der Sepsis war nicht Gegenstand

dieser Arbeit. Wir untersuchten die Wirkung von aPC auf die Mikrozirkulation um neue

therapeutische Ansätze zu finden und Patientengruppen zu identifizieren, die von aPC

profitieren könnten.

Seok et al. haben herausgefunden, dass die Genexpression von Mäusen und Menschen bei

Endotoxinämie nicht miteinander korreliert. Es sind noch keine Genanalysen durchgeführt

worden, die die Genexpression von Ratten und Menschen unter inflammatorischen

Bedingungen vergleichen, die Ergebnisse von Seok et al. lassen aber vermuten, dass es

signifikante Unterschiede gibt und die Übertragbarkeit unserer Ergebnisse beschränkt ist.

Andere Sepsismodelle, wie zum Beispiel die Punktion und Ligatur des Zökums (CLP) oder

die Colon-ascendens-Stent-Peritonitis (CASP), sind realitätsnäher, besitzen jedoch auch

Limitationen (216).

Bei den von uns verwendeten Versuchstieren unterschied sich der Verlauf der Sepsis im

Vergleich zum Menschen, da Ratten deutlich resistenter gegenüber Endotoxin sind. Im

68

Vergleich zum Menschen, bei dem die Sepsis vermehrt im höheren Alter auftritt, waren

unsere Versuchstiere außerdem relativ jung und wiesen keine signifikanten Komorbidäten auf

(216). Wir beobachteten die Versuchstiere lediglich 2 Stunden nach LPS-Gabe, um die

Wirkung von aPC auf die Mikrozirkulation im Endotoxinschock zu untersuchen. Oft stellt

sich im Verlauf der Sepsis eine Immunsuppression, mit einem Überwiegen von anti-

inflammatorischen Mediatoren und erhöhter Apoptose, ein. Ob aPC einen Effekt auf diese

späte Phase hat, konnten wir jedoch nicht untersuchen (31).

Bei dem von uns verwendeten aktivierten Protein C handelte es sich um humanes

rekombinantes aktiviertes Protein C, weswegen anzunehmen ist, dass unsere Ergebnisse durch

Speziesunterschiede beeinflusst worden sind. Malm et al. haben in ihren Versuchen

Unterschiede in der antikoagulatorischen Funktion von humanem aPC bei Ratten festgestellt

(220).

Wir applizierten aPC als Bolus von 2 mg pro Kilogramm Körpergewicht, bei der Behandlung

der Sepsis beim Menschen wird aPC als kontinuierliche Infusion von 24 µg pro Kilogramm

Körpergewicht pro Stunde über einen Zeitraum von 96 Stunden verabreicht, um einen

gleichbleibenden aPC-Spiegel im Blut zu gewährleisten (180). Die einmalige Bolusgabe hat

eine andere Pharmakokinetik als eine kontinuierliche Gabe und könnte so unsere Ergebnisse

und ihre Übertragbarkeit beeinflussen. In der Literatur konnten wir nur pharmakokinetische

Studien an Mäusen und Meerschweinen finden, hier zeigte sich nach einmaliger Bolusgabe

ein rapider Anstieg der Plasmakonzentration nach 15 Minuten und anschließend ein

exponentieller Abfall der Plasmakonzentration, sodass nach 24 Stunden kein aPC mehr

nachzuweisen war (221,222). Da wir lediglich einen Zeitraum von 2 Stunden beobachteten,

nehmen wir an, dass die Konzentration von aPC im Blut ausreichend war, um die

supraphysiologischen Konzentrationen zu erreichen, die auch bei der Behandlung des

Menschen angestrebt werden.

Die Applikation von aPC folgte direkt auf die Gabe von LPS, dies entspricht nicht dem

normalen Verlauf einer schweren Sepsis, da ein entzündlicher Prozess oft schon Stunden oder

Tage vorliegt, bevor die Indikation für eine Behandlung mit aPC gestellt wird.

Dank der Intravitalmikroskopie ist es möglich, komplexe Zellinteraktionen in vivo

darzustellen (223). Nachteile dieser Methode sind Atmungs- und Bewegungsartefakte des

lebenden Versuchstieres, die fehlende Visualisierung von Strukturen aufgrund geringer

Tiefenauflösung, Überdeckung, Bildrauschen und Zellschäden (224).

69

Die Auslagerung des Mesenteriums führt zu einer Entzündungsreaktion des ausgelagerten

Abschnitts, was die Anzahl an rollenden Leukozyten erhöhen kann, sodass die

Wahrscheinlichkeit besteht, dass unsere Ergebnisse bezüglich der Anzahl der temporär

adhärenten Leukozyten verfälscht sein könnte (49).

Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass die von uns verwendete Substanz zum Anfärben

des Plasmas und der Leukozyten ebenfalls das Ergebnis beeinflusst hat. Abbitt et al. haben

nachgewiesen, dass Rhodamin-6G die Geschwindigkeit und Migration von Leukozyten

beeinflusst (225).

70

6 Zusammenfassung

Obwohl große Fortschritte in der experimentellen und klinischen Intensivmedizin bezüglich

Pathophysiologie und Diagnose der Sepsis erzielt wurden, bleibt die Letalität weiter nahezu

unverändert hoch. Aufgrund einer immer länger lebenden, multimorbiden Bevölkerung, ist

damit zu rechnen, dass sich die Inzidenz immer weiter erhöht. Eine der Hauptursachen für die

Entwicklung einer Sepsis und eines Multiorganversagens ist das Versagen der

Mikrozirkulation, der Hauptort für den Gas- und Nährstoffaustausch.

Die Ursachen die zum Versagen der Mikrozirkulation führen sind vielfältig und umfassen das

dysfunktionale Endothel, die vermehrte Leukozyten-Endothel-Interaktion,

Gerinnungsstörungen und die Ausbildung von mikrovaskulären Shunts. Eine Verbesserung

der Mikrozirkulation scheint deshalb ein wichtiger therapeutischer Ansatz zu sein. Aktiviertes

Protein C hat neben seiner anti-koagulatorischen Funktion anti-inflammatorische, anti-

apoptotische und barrierestabilisierende Eigenschaften, die während einer Sepsis positiv auf

die Mikrozirkulation wirken.

Wir untersuchten welche Wirkung aPC auf die mesenteriale Mikrozirkulation hat, indem wir

die Plasmaextravasation und die Leukozyten-Endothel-Interaktionen beobachteten.

In unserem Versuch stellten wir fest, dass aPC die Anzahl temporärer und fest adhärenter

Leukozyten, sowie die Plasmaextravasation bei Endotoxinämie signifikant verringerte. Durch

die Gabe von aPC konnte die Freisetzung von IL-1β signifikant reduziert werden, während

wir eine Erhöhung der TNF-α Konzentration und keinen Einfluss auf die IL-6 und IL-10

Konzentration feststellen konnte.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass aktiviertes Protein C die Mikrozirkulation im Mesenterium

verbessert hat. Da die Mikrozirkulation in der Pathogenese der Sepsis eine wesentliche Rolle

spielt, lässt sich vermuten, dass aPC den Verlauf einer Sepsis positiv beeinflussen und somit

von Vorteil für die Patienten sein könnte.

71

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Eidesstattliche Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig verfasst und keine anderen

als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.

Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät, keiner anderen wissenschaftlichen

Einrichtung vorgelegt worden.

Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine

Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.

Datum Unterschrift

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Lebenslauf

Angaben zur Person

Name: Michael Schade

Geburtsdatum 13.03.1983

Geburtsort: Greiz

Schulbildung

1989- 1993 Lambert- Steinwich Schule, Stralsund

1993- 2002 Goethe- Gymnasium, Stralsund

Zivildienst

2002- 2003 OP- Lagerungspfleger, Klinikum Stralsund

Studium

2003- 2009 Studium der Humanmedizin

Ernst- Moritz- Arndt- Universität Greifswald

Ärztliche Tätigkeit

2010- heute Assistenzarzt

Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin

Universitätsmedizin Mainz

Datum Unterschrift

Documents

Aus der Klinik für Anästhesiologie, Intensivmedizin ... · infektiöser (z.B. Trauma, Verbrennung, Pankreatitis) Natur sein kann. Diese systemische Diese systemische Reaktion ist