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Aus der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe
der Universität zu Lübeck
Direktor: Prof. Dr. K. Diedrich
Effekte der Gonadotropin-releasing Hormon Antagonisten Cetrorelix und
Ganirelix auf IGF-II, IGFBP-2 und PAPP-A in
humanen Granulosaluteinzellen
Inauguraldissertation
zur
Erlangung der Doktorwürde
der Universität zu Lübeck
- aus der Medizinischen Fakultät –
Vorgelegt von
Britta Krautmacher
aus Olpe
Lübeck 2004
2
1. Berichterstatter/Berichterstatterin: Priv. Doz. Dr. med. J.M. Weiss
2. Berichterstatter/Berichterstatterin: Prof. Dr. med. Achim Peters
Tag der mündlichen Prüfung: 01.12.2004
Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 01.12.2004
gez. Prof. Dr. med. Peter Dominiak
3
- Dekan der Medizinischen Fakultät -
4
1. Einleitung 9
1.1. Die endokrine Kontrolle der Reproduktion 9
1.1.1. Die Hypothalamus-Hypohysen-Ovar-Achse 9
1.1.2. Die Regulation des ovariellen Zyklus 11
1.1.3. Die Wirkung des Gonadotropin-Releasing Hormons 15
0.2. GnRH-Rezeptor 17
0.2.1. Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors 18
1.3. GnRH-Analoga 20
1.3.1. GnRH-Agonisten 21
1.3.2. GnRH-Antagonisten 22
1.4. Extrahypophysäre Wirkungen von GnRH 24
1.5. Intraovarielles IGF-System 26
1.5.1. Insulin like Growth Factor I und II 26
1.5.1.1. Insulin like Growth Factor I 26
1.5.1.2. Insulin like Growth Factor II 28
1.5.2. Typ I und Typ II IGF Rezeptoren 30
1.5.3. Insulin like Growth Factor Binding Proteins 31
1.5.3.1. IGFBP-1 31
1.5.3.2. IGFBP-2 32
1.5.3.3. IGFBP-3 33
1.5.3.4. IGFBP-4 34
1.5.3.5. PAPP-A 35
1.5.3.6. IGFBP-5 37
1.5.3.7. IGFBP-6 37
5
1.5.4. Regulation der IGFs und IGFBPs 38
2. Problemstellung 40
3. Material und Methoden 41
3.1. Material 41
3.1.1. Chemikalien 41
3.1.2. Hormone, Hormonanaloga und Wachstumsfaktoren 42
3.1.3. Versuchskits 43
3.2. Methoden 44
3.2.1. Kontrollierte ovarielle Hyperstimulation (COH) 44
3.2.1.1. Das lange Protokoll 44
3.2.1.2. Das „Lübecker Protokoll“ 45
3.2.2. Granulosaluteinzellpräparation 47
3.2.3. Stimulation mit GnRH Antagonisten und Agonisten 48
3.2.4. Stimulation mit HCG, IGF-II und Insulin 49
3.2.5. Radioimmunoassay für IGF-II 50
3.2.6. Radioimmunoassay für IGFBP-2 51
3.2.7. Enzymimmunoassay für PAPP-A 52
3.2.8. Radioimmunoassay für IGFBP-4 52
3.2.9. Konzentrierung der Proben 54
3.2.10. Proteinbestimmung 54
2.1.11. Laemmli Gel 55
2.1.12. Western Blot für IGFBP-4 56
3.3. Datenpräsentation und Statistik 57
4. Ergebnisse 58
6
4.1. Patientinnencharakeristik 58
4.2. Effekte der in-vivo Behandlung von Patientinnen mit Cetrotide plus Gonadotropin
und Triptorelin plus Gonadotropin auf die basale Sekretion von IGF-II und
IGFBP-2. 59
4.3. Effekte der in-vitro Behandlung von kultivierten Granulosaluteinzellen mit
Triptorelin, Cetrorelix und Ganirelix auf die Produktion von IGF-II 61
4.4. Effekte der in-vitro Behandlung von kultivierten Granulosaluteinzellen mit
Triptorelin, Cetrorelix und Ganirelix auf die Produktion von IGFBP-2 63
4.5. Effekte der in-vitro Behandlung von kultivierten Granulosaluteinzellen mit
Triptorelin, Cetrorelix und Ganirelix auf die Produktion von PAPP-A 65
4.6. Ergebnisse des RIA und Western Blot zur Ermittlung der IGFBP-4 Konzentration
66
5. Diskussion 67
6. Zusammenfassung 80
7. Literaturverzeichnis 82
8. Danksagungen 110
9. Lebenslauf 111
7
Abkürzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
APS Ammoniumpersulfat
Arg Arginin
AS Aminosäure
Asp Asparagin
BSA Bovine Serume Albumine
BP Bindungsprotein
bzw. beziehungsweise
Ca2+
Calciumionen
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
COH kontrollierte ovarielle Hyperstimulation
DAG Diacylglycerol
DMEM Dulbecco´s modified Eagle Medium
DNS Desoxyribonucleinsäure
E2 Östrogen
ECM extrazelluläre Matrix
EIA Enzymimmunoassay
ET Embryotransfer
et al. et alterae
FF Follikelflüssigkeit
FSH Follikelstimulierendes Hormon
GH Growth Hormon (Wachstumshormon)
Gly Glycin
8
GLZ Granulosaluteinzellen
GnRH Gonadotropin-releasing Hormon
GnRHag Gonadotropin-Releasing Hormon Agonisten
GnRHant Gonadotropin-Releasing Hormon Antagonisten
GZ Granulosazellen
h Stunde
HCG humanes Choriongonadotropin
HMG humanes postmenopausales Gonadotropin
H2O Wasser
HVL Hypophysenvorderlappen
ICSI Intracytoplasmatische Spermatozoen Injektion
IGF Insulin-like Growth Faktor
IGFBP Insulin-like Growth Faktor Binding Protein
IP3 Inositol-1,4,5-trisphosphat
IVF In-vitro Fertilisation
J125
Jod125
-markiert
kDa kiloDalton
LH Luteinisierendes Hormon
LHRH Luteinierendes Hormon-Releasing Hormon
mRNA messenger Ribonucleinsäure
M6P Mannose-6-Phosphat
MW Molekulargewicht
NSB Nicht spezifische Bindung
OHSS ovarielles Hyperstimulationssyndrom
9
P4 Progesteron
PAPP-A Pregnancy associated Plasma Protein-A
PBS Phosphate Buffered Saline
PEG Polyethylenglycol
PKC Proteinkinase C
PLC Phospholipase C
ProMBP pro major basic protein
rec FSH rekombinantes Follikelstimulierendes Hormon
RIA Radioimmunoassay
s. siehe
SDS Sodium Dodecyl Sulfat
TA Totalaktivität
TEMED N, N, N’,N’-Tertramethylenethylendiamin
TMB Tetramethylbenzidin
TriCl Tri-(hydroxymethyl)-amminomethanchlorid
u.a. unter anderem
v.a. vor allem
z.B. zum Beispiel
ZNS Zentrales Nervensystem
10
1. Einleitung
1.1. Die endokrine Kontrolle der Reproduktion
1.1.1. Hypothalamus-Adenohypophyse-Ovar-Achse
Der Hypothalamus, die Adenohypophyse und das Ovar sind im ovariellen Regelkreis
miteinander verbunden. Die funktionsentscheidende Steuerung der zyklischen Stimulierung
der Genitalorgane geht von den Steroidhormonen des Ovars aus, welches das Endglied einer
Steuerungskette darstellt. Die ovariellen Hormone können rückwirkend die vorgeschalteten
Zentren mitregulieren (Conn 1987).
Der Hypothalamus spielt eine wichtige Rolle in der physiologischen Regulation der
weiblichen Reproduktionsfunktion. Das Verständnis der hormonellen Regulation ist von der
Identifikation der Steroidhormone und der hypophysären Gonadotropine über die Entdeckung
der hypothalamischen Releasingfaktoren und der ovariellen Hormone und
Wachstumsfaktoren, welche die Gonadotropinsekretion und die intraovarielle Regulation
modulieren, fortgeschritten. Heute geht man davon aus, dass der Follikel, der für die
Ovulation bestimmt ist, eine gewisse Reihenfolge von Ereignissen initiert, die den
Menstruationszyklus über die hypothalamische-hypophysäre Achse kontrollieren (Ying et al.
1988).
Im Hypothalamus der Frau befinden sich Kerngebiete, die als übergeordnete
Steuerungszentren die gonadotropen Zellen der Adenohypophyse und folglich die Funktion
des Ovars beeinflussen. Der Hypothalamus selbst bezieht Informationen aus dem Kortex, dem
Limbischen System, dem Thalamus und von externen Stimuli, die mittels biogener Amine,
Opioide und Prostaglandinen überbracht werden (Marshall 1989). Im Nucleus arcuatus und
Nucleus paraventricularis des Hypothalamus wird ein Neuropeptid, das Gonadotropin-
Releasing Hormon (GnRH) gebildet, welches die hypophysäre Synthese und Sekretion von
11
Gonadotropinen steuert. Die pulsatile Sekretion des GnRH aus dem Hypothalamus ist eine
Grundvoraussetzung für die physiologische Ausschüttung der Gonadotropine der
Adenohypophyse (Knobil 1980). GnRH erreicht die Adenohypophyse über das
hypothalamisch-hypophysäre Pfortadersystem und stimuliert in Synergie mit Östradiol die
Bildung und Freisetzung von Glykoproteinen, die man wegen ihrer vornehmlichen Wirkung
auf die Gonaden als Gonadotropine bezeichnet (McCann et al. 1984). Es handelt sich um das
Follikelstimulierende Hormon (FSH) und das Luteinisierende Hormon (LH), welche in einer
zeitlich und quantitativ fein abgestimmten Relation klar definierbare, anatomische
Veränderungen am Ovar vornehmen. Zu diesen gehören die Follikelreifung, die Ovulation,
die Corpus luteum Bildung und die Produktion der Steroidhormone.
Das in den basophilen Zellen des HVL produzierte FSH (MW 34 000) bewirkt im Ovar die
Reifung des Graaf-Follikel, stimuliert die Bildung von Östradiolrezeptoren und fördert die
Synthese von Östradiol aus Testosteron durch Stimulation der aromatisierenden Enzyme in
den Granulosazellen. Die Ausschüttung erfolgt pulsatil und ist durch Inhibin hemmbar (Ying
et al. 1988).
Das gleichermaßen periodisch sezernierte LH stimuliert die Steroidbiosynthese, genauer die
Androgensynthese, in den Zellen der Theka interna des Ovars. Es bewirkt die zur Ende der
Follikelphase und zur Zyklusmitte stattfindenden Veränderungen, die die Ovulation auslösen.
Während der Lutealphase regt es die Östrogen- und Progesteronbildung an.
Die Östrogene und Progesterone des Ovars können über eine positive und negative
Rückkopplung die Hypophyse und den Hypothalamus regulieren (Fink 1988). Dadurch
bedingt kommt es während des Menstruationszyklus ebenfalls zu einer Änderung des
Rhythmus der GnRH-Sekretion. Der erhöhte Östrogenspiegel in der Follikelphase bedingt
eine GnRH-Sekretion alle 1-2 Stunden, während in der Lutealphase, die unter dem Einfluss
12
von Progesteron steht, dies nur alle 2-5 Stunden geschieht. Außerdem bewirkt auch das
Tageslicht eine erhöhte Frequenz (Rossmanith und Lauritzen 1991).
Hypothalamus
G
N
R
H
Hypophyse
F
S
H
L
H
OvarE2, P4
E2
P4
E2
P4
E2, P4
E2, P4
Abb. 1.1: Rückkopplungsmechanismus der Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Achse
(Einzelheiten s. Text) GnRH: Gonadotropin releasing Hormon, FSH: Follikelstimulierendes
Hormon, LH: Luteinisierendes Hormon, P4: Progesteron, E2: Östrogen
1.1.2.. Die Regulation des ovariellen Zyklus
Der Menstruationszyklus mit einer Länge von 28 Tagen stellt das sich wiederholende Korrelat
der Tätigkeit des Hypothalamus-Hypophysen-Ovar-Systems dar, die mit strukurellen und
funktionellen Veränderungen in den Zielgeweben des Reproduktionstraktes, des
Endometriums, Uterus, Eileiter und Vagina, einhergeht.
13
Der Menstruationszyklus lässt sich in drei Phasen unterteilen: die Follikelphase, die Ovulation
und die sich daran anschließende Lutealphase. Änderungen der Plasmaspiegel von
Östrogenen, Progesteronen, Androgenen und Gonadotropinen sind in den einzelnen Phasen
des Zyklus charakteristisch (Treloar et al. 1967).
FSH und LH sind unabdingbar für die Entwicklungen während der Follikelphase. Dies wird
durch die Wechselwirkung von Granulosa- und Thekazellen bestimmt, an deren Regulation
endokrine, parakrine und autokrine Mechanismen beteiligt sind. LH stimuliert die
Thekazellteilung und die Produktion von Androgenen, welche von Granulosazellen (GZ) zu
Östrogenen aromatisiert werden können. FSH bewirkt die Zellteilung von GZ und stimuliert
die aromatisierenden Enzyme, die notwendig sind, die Androgene der Thekazellen zu
Östrogene zu verwandeln (Ryan und Petro 1966). Der Anstieg des FSH bewirkt eine
Zunahme von FSH-Rezeptoren, die ausschließlich in Granulosazellen zu finden sind (Suzuki
et al. 1994). Dies führt zu einer Steigerung der Östrogensekretion (Dorrington und Armstrong
1979). Die gesteigerte Sekretion von Östrogen bewirkt eine weitere Proliferation von
Granulosazellen, den Follikelwachstum und einen Anstieg von Östrogenrezeptoren u.a. in den
GZ (Hsueh et al. 1984). Während der Proliferationsphase steigen die Östrogenspiegel parallel
mit der Follikelgröße und der Anzahl der GZ. Die im Laufe der ersten zwei Wochen
zunehmende Östrogenproduktion bewirkt einen Abfall von FSH (negatives Feedback) und die
Atresie in den meisten Follikeln. Der Abfall des FSH verhindert die Entwicklung von
benachbarten Follikeln des dominanten Follikels. Der zur Ovulationsreife wachsende
dominate Follikel bildet u.a. in seinen Granulosazellen das Inhibin, dessen Wirkung in einer
selektive Hemmung der FSH-Freisetzung besteht und somit über das Rückkopplungssystem
zur Regulierung der übergeordneten Zentren beiträgt (Tsonis und Sharpe 1986). Dieser zur
Ovulation bestimmte Follikel weist folgende Charakteristika auf: FSH in der antralen
14
Follikelflüssigkeit, optimale Anzahl von GZ für die Follikelgröße und primäre Produktion
von Östrogenen im Gegensatz zu Androgenen (McNatty et al. 1979). Der stark ansteigende
Östrogenspiegel löst über einen positiven Feedback den LH-Gipfel aus, welcher die Ovulation
initiert. Zwei Bedingungen müssen für die Ovulationsauslösung getroffen werden, zum einen
muss die Östrogenkonzentration mehr als 150-200 pg/mL betragen und zum anderen muss
dieser Spiegel für 48-50 Stunden gewährleistet sein (Filicori et al. 1984).
Während des präovulatorischen Anstiegs von LH kommt es unter Vermittlung von
Prostaglandinen zur Freisetzung hydrolytischer Enzyme an bestimmten Abschnitten der
Follikelwand und Kontraktion derer, woraufhin es zur Ausstoßung der reifen Oozyte kommt.
Nach der Ovulation wird der gesprungene Follikel zu einem funktionell neuen Organ, zum
Corpus luteum. Das Corpus luteum ist ein vorübergehendes endokrines Organ für etwa 14
Tage, welches hauptsächlich Progesteron produziert (Tureck et al. 1982). Unter dem Einfluss
von FSH synthetisieren die großen Luteinzellen Östrogen und die kleinen Luteinzellen unter
der Einwirkung von LH Testosteron und Progesteron. LH ist in den ersten 7-8 Tagen nach der
Ovulation für die Aufrechterhaltung des Corpus luteum verantwortlich, danach übernimmt
das im Blastozysten produzierte Choriongonadotropin diese Aufgabe. Bleibt eine Konzeption
aus, kommt es zur Rückbildung des Corpus luteum zum Corpus albicans (Filicori et al. 1984).
15
LH
0 5 10 15 20 25 30
0
50
100
IU
/l
Progestron
0 5 10 15 20 25 30
0
5
10
ng
/m
lÖstradiol
0 5 10 15 20 25 30
0
100
200
300
400
pg
/m
l
16
Tag des Reproduktionszyklus
Abb. 1.2: Hormonsekretionsmuster während des 28 Tage dauernden Menstruationszyklus. In
der ersten Hälfte der Follikelphase steigen die Plasmaspiegel der Gonadotropine FSH und LH
an, in der zweiten Hälfte kommt es zum Anstieg von Östradiol, dessen Gipfel 1 Tag vor dem
steilen Anstieg des LH-Plasmaspiegels (Ovulationsphase) erreicht. In der späten Lutealphase
fallen die Spiegel der Gonadotropine und Steroidhormone des Ovars vor dem Einsetzen der
Menstruationsblutung wieder ab.
1.1.3. Wirkung des Gonadotropin-Releasing Hormon
Das Dekapeptid Gonadotropin-Releasing Hormon (GnRH), auch Luteinisierendes Hormon-
Releasing Hormon (LHRH) genannt, wurde erstmals von den Arbeitsgruppen von Schally
und Guillemin isoliert und seine Struktur vollständig aufgeklärt (Schally et al. 1971,
Guillemin 1977). Für diesen Beitrag wurde ihnen 1977 der Nobelpreis verliehen. GnRH
entsteht aus einem größeren Prohormon im Hypothalamus v.a. im Nucleus arcuatus und der
Area praeoptica und wird über neurosekretorische Axone der Eminentia mediana pulsatil
sezerniert. Epinephrin und Norepinephrin erhöhen die GnRH Ausschüttung, wogegen
Dopamin, Serotonin und endogene Opioide die Sekretion hemmen (Marshall 1989). GnRH
FSH
0 5 10 15 20 25 30
0
10
20
30
IU
/l
17
gelangt über ein Pfortadersystem zur Adenohypophyse, wo es an spezifische Rezeptoren der
gonadotropen Zellen bindet und somit eine Kette an intrazellulären Reaktionen auslöst
(Stojilkovic et al. 1994). Daraufhin erfolgt die Synthese und Ausschüttung von LH und FSH
in den peripheren Kreislauf, die die Steroidbiosynthese und die Gametogenese im Ovar, ihrem
Zielorgan regulieren (Knobil 1980).
Nach der erfolgreichen Strukturaufklärung des GnRH durch Schally 1971 wurden die
biologischen Funktionen der einzelnen Aminosäuren (AS) untersucht. Es stellte sich heraus,
dass die AS in Position 1, 2 und 3 die hormonelle Aktivität bewirken, die Bindung am GnRH-
Rezeptor durch Position 6 und 10 vermittelt wird. Die Endopeptidasen haben ihren
Hauptangriffspunkt an den Bindungsstellen zwischen Position 5 und 6 und Position 9 und 10.
An diesen Stellen wird GnRH gespalten und verliert seine biologische Wirksamkeit (Sealfon
et al. 1997). Durch gezielte chemische Veränderung in der Aminosäuresequenz des Peptids
konnten GnRH-Analoga synthetisiert werden. GnRH-Agonisten zeigen hauptsächlich eine
verlängerte und stärkere Wirkung, während GnRH-Antagonisten selbst biologisch inaktiv
sind und das physiologische Hormon kompetitiv vom Rezeptor verdrängen. Die Herstellung
von GnRH-Agonisten gelang durch Veränderung an den Positionen 6 und/oder 10, wodurch
eine erhöhte Bindungsaffinität und eine verminderter Abbau durch Endopeptidasen erreicht
wird. Das in dieser Arbeit verwendete Triptorelin, ein GnRH-Agonist, weist in Position 6 eine
D-Aminosäure auf. Die GnRH-Antagonisten Cetrorelix und Ganirelix zeigen einen Austausch
der AS in Position 2 und 3 bzw. zusätzlich der Positionen 6 und 8.
Der Fakt, dass FSH und LH pulsatil ausgeschüttet werden, führt zu der Vermutung, dass auch
GnRH in dieser Weise sezerniert wird. Diese Schlussfolgerung wurde bestätigt durch
Messungen im hypothalamischen-hypophysären Pfordadergebiet von Affen und Schafen,
welche eine pulsatile Frequenz von 70-90 Minuten zeigten (Carmel et al. 1976, Knobil 1980,
18
Clarke et Cummius 1982, Evans et al. 1996). Die Ausschüttung von FSH und LH erfordert
eine etwa stündliche Stimulation durch GnRH. Eine höhere oder niedrigere Impulsfrequenz
mit GnRH hat bei Nucleus arcuatus-abladierten Affen keine adäquate Ausschüttung der
Gonadotropine gezeigt (Knobil et al. 1980). Der pulsatile Charakter des GnRH ist auch für
den mitzyklischen Gonadotropingipfel essentiell. Dies zeigt die erfolgreiche Behandlung von
sterilen Frauen mit isoliertem GnRH-Mangel durch pumpengesteuertes pulsatiles GnRH,
welches Ovulationen auslösen kann.
GnRH kann die Anzahl seiner eigenen Rezeptoren selbst steuern: ein kontinuierliche hoher
GnRH-Spiegel erwirkt über Desensibilisierung eine Verminderung der Rezeptordichte (down-
Regulation), ein pulsatiler Charakter der Freisetzung durch Sensibilisierung ein vermehrtes
Rezeptorangebot. Die Impulsfrequenz der GnRH-Sekretion wird unter anderem über einen
negativen oder positiven Feedback-Mechanismus durch den Spiegel der Steroidhormone
Östrogen und Progesteron gesteuert. Östrogen übt seinen hemmenden Effekt auf
Hypothalamus und Hypopyshe aus. Dieser negative Feedback wird offensichtlich nach der
Menopause oder nach Kastration mit dem Anstieg von FSH und LH beantwortet. Hohe
Spiegel von Progesteron hemmt FSH und LH hauptsächlich auf der Ebene des Hypothalamus.
1.2. GnRH-Rezeptor
GnRH bindet an einen spezifischen Rezeptor der Adenohypophyse. Der humane GnRH-
Rezeptor gehört zu der Familie der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Dieser GnRH-
Rezeptor besteht aus sieben transmembranen Domainen und im Gegensatz zu anderen G-
Protein gekoppelten Rezeptoren fehlt das intrazelluläre c-terminale Ende und die dritte
intrazelluläre Schleife ist relativ kurz (Sealfon et al. 1997, Stojikovic et al. 1994). Diese
Abweichungen könnten die Resistenz des Rezeptors gegen die schnelle Desensitisierung
19
erklären (Willars et al. 1999). Während der Bindung von GnRH an seinen spezifischen
Rezeptor sind sowohl das aminoterminale als auch das carboxyterminale Ende involviert. Das
aminoterminale Ende aktiviert den Rezeptor. GnRH und seine Analoga binden an Position
121, während der GnRH-Antagonist an dieser Stelle keine Bindung eingeht (Zhou et al.
1995). Nach erfolgreicher Bindung wird der GnRH-GnRH-Rezeptor-Komplex mittels
Endozytose internalisiert, obwohl dieser Prozess für die Gonadotropinsekretion nicht
Voraussetzung ist (Kaiser et al. 1997). Die Anzahl der GnRH-Rezeptoren können durch
GnRH selbst oder durch andere Faktoren beeinflusst werden. Eine kontinuierliche Stimulation
mit hohen Spiegel von GnRH oder seinen Agonisten führt zu down-regulation des GnRH-
Rezeptors (Clayton 1989).
1.2.1. Signaltransduktion des GnRH-Rezeptors
Bei Aktivierung des Rezeptors kommt es zum Anstieg der Phopholipase C (PLC) Aktiviät,
welche eine Spaltung von Phosphoinosid zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol 1,4,5,
Trisphosphat (IP3) führt. IP3 entleert intrazelluläre Ca2+
Speicher und DAG stimuliert die
Proteinkinase C (PKC) (Naor 1990). Die PKC kann den Ca2+
-Einstrom via der
spannungsabhängigen Ca2+
-Kanäle beeinflussen. Die IP3 abhängige Ca2+
Mobilisierung ist
Hauptursache für die Vorgänge, die die Synthese und Ausschüttung von Gonadotropinen
bewirken (Tse et al. 1997), während der Ca2+
-Einstrom die intrazellulären Speicher auffüllt
(Stojilkovic and Catt 1995).
20
G-Protein
PLA2PLD
PLC
PA
PKC
S
K
C
ER
GnRH
Zytolsolischer Ca2+
Speicher
Ca 2+
DAG
AA
PIP2
IP3
Gonadotropinsynthese/-sekretion
Ca2+/Kalmodulin
EZR
IZR
ZM
Rezeptor
Ca2+
Abb. 1.3: Schema der Signaltransduktion nach Aktivierung des GnRH-Rezeptors
(Einzelheiten s. Text) EZR: Extrazellulärraum, IZR: Intrazellulärraum, ZM: Zellmembran,
SCK: Spannungsabhängiger Ca2+
Kanal, PLA2: Phospholipase A2, PLD: Phospholipase D,
PLC: Phospholipase C, PIP2: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat, DAG: Diacylglycerol,
IP3: Inositol-1,4,5-trisphoshat, PKC: Proteinkinase C, AA: Arachidonsäure, ER:
Endoplasmatisches Retikulum
21
1.3. GnRH Analoga
Nach der Entdeckung von GnRH und dessen Isolierung und Charakerisierung (Schally 1971)
wurden agonistische und antagonistische Analoga zu dieser Substanz entwickelt, um die
Ausschüttung von LH und FSH zu kontrollieren und um in dem komplizierten endokrinen
Regelkreis eingreifen zu können. GnRH Analoga sind in der Lage die
Gonadotropinfreisetzung zu unterdrücken und konsekutiv die Funktion der Gonaden. Diese
Eigenschaften bieten ein weites Anwendungsspektrum in der Therapie von vielen
Erkrankungen und ist Hauptgrund für ihren Einsatz im Klinikalltag. Erkrankungen die mit
erhöhten, unphysiologischen Spiegeln von Steroiden einhergehen, wie z.B. Pubertas praecox,
Endometriose oder prämenopausaler Uterus myomatosus können mit GnRH-Analoga
behandelt werden. In der Onkologie konnten GnRH-Agonisten bisher erfolgreich bei
hormonabhängig-wachsenden Tumoren wie Mamma-, Ovarial-, Endometrium- und
Prostatakarzinomen eingesetzt werden, aber auch bei benignen Erkrankungen wie der
Endometriose, dem Uterus myomatosus und letztendlich im Rahmen der Ovulationshemmung
und der kontrollierten ovariellen Hyperstimulation (Fekete et al. 1989, Emons et al. 1989,
Pahwa et al. 1991, Limonta et al. 1992).
22
Aminosäuresequenzen von GnRH und seinen Analoga
GnRH
pGlu His Trp Ser Tyr Gly Leu Arg Pro Gly-
NH2
Triptorelin (GnRH Agonist)
pGlu His Trp Ser Tyr D-Trp Leu Arg Pro Gly-
NH2
Cetrorelix (GnRH Antagonist)
NAcD
NAL(2)
D4Cl
PHE
D3PAL Ser Tyr DCit Leu Arg Pro DALA
Ganirelix (GnRH Antagonist)
NAcD
NAL(2)
D4Cl
PHE
D3PAL Ser Tyr DHarg
(Et2)
Leu Harg
(Et2)
Pro DALA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Abb.1.4: Gegenüberstellung der chemischen Strukturen von GnRH, Triptorelin, Cetrorelix
und Ganirelix (Diedrich: Gynäkologie und Geburtshilfe, Springer Verlag)
1.3.1. GnRH-Agonisten
Die synthetisch hergestellten Analoga, auch Deka- oder Nonapeptide, unterscheiden sich vom
nativen GnRH durch eine 100-200 fach erhöhte Rezeptoraffinität und einer verlängerten
Halbwertzeit. Diese resultierende verbesserte Bioverfügbarkeit wird durch Veränderungen in
der Aminosäuresequenz an Position 6 und 10 erreicht. Nach einem unvermeidbaren,
anfänglichen Anstieg der Gonadotropine (Flare-up-Effekt) durch Entleerung der
hypophysären Speicher und einem transienten Anstieg der Rezeptorzahl bewirken die
Agonisten eine Suppression durch Desensitisierung der gonadotropen
23
Adenohypophysenzellen. Dies geschieht zum einen durch Hemmung der zellulären
Signaltransduktionswege, woraufhin die Hypophysenzellen gegenüber nativen GnRH und
GnRH-Agonisten refraktär werden, zum anderen nimmt die GnRH-Rezeptordichte ab (Conn
und Crowly 1991). Der Abnahme der Rezeptordicht (down-Regulation) liegt eine
Internalisierung der Rezeptoren zu grunde. Diesem Defizit kann durch Neusynthese parallel
nicht schnell genug entgegen gewirkt werden, daher ist die absolute Rezeptoranzahl
vermindert. Es sind etwa 10 bis 14 Tage von Nöten um den anfänglichen Flare-up zu
überwinden und eine komplette Suppression zu erreichen. Auf die verminderte
Gonadotropinproduktion und –sekretion folgt eine Suppression der ovariellen
Steroidbiosynthese. Die Follikelreifung bleibt aus und der Östrogenspiegel sinkt auf
postmenopausale Werte. Diese Entkopplung der Hypothalamus-Hypophysen-Achse ist
jederzeit reversibel, dennoch dauert es etwa sechs Wochen bis sich der physiologische Zyklus
wieder eingestellt hat (Gordon et al. 1993).
Bereits seit zwei Jahrzehnten werden GnRH-Agonisten in Kombination mit Gonadotropinen
in den Protokollen der kontrollierten ovariellen Hyperstimulation (COH) in der assistierten
Reproduktion verwendet. Ihre Vorteile bestehen in der Senkung der vorzeitigen
Luteinisierung bei COH, die sonst zu Therapieabbrüchen zwingen, weiterhin in der Fähigkeit
die Follikelreifung zu synchronisieren, also das Wachsen von mehreren Oozyten zur gleichen
Zeit und den negativen Einfluss von hohen LH-Spiegeln auf die Follikelreifung und die
Embryoqualität zu unterdrücken (Stanger und Yovich 1985).
Die Unterdrückung der Gonadotropine und konsekutiv der gonadalen Steroidhormone ist ein
u.a. gewünschter Effekt bei vielen Erkrankungen. Zu diesen zählen die Endometriose, die
Uterusmyome, Steroidhormon- abhängige Tumoren wie z.B. das Prostatakarzinom und das
Mammakarzinom (Felberbaum et al. 2000, Huirne und Lambalk 2001).
24
1.3.2. GnRH-Antagonisten
Die ersten GnRH-Antagonisten (GnRHant) wurden vor mehr als 20 Jahren entwickelt, doch
ihr klinischer Einsatz wurde durch erhebliche Histaminausschüttung aus GnRH-
Rezeptortragenden Mastzellen überschattet (Karten und River 1986). Die kürzlich
sythetisierten GnRH-Antagonisten Ganirelix und Cetrorelix sind frei von diesen
Nebenwirkungen (Schally et al. 1989, Reissmann et al. 1995).
Cetrorelix und Ganirelix wurden bereits in die Protokolle der COH aufgenommen und
zugelassen. Die GnRH-Antagonisten sind in der Lage den frühzeitigen LH-Anstieg zu
verhindern, indem sie den GnRH-Rezeptor im Hypophysenvorderlappen kompetitiv
blockieren und folglich die LH-Freisetzung unmittelbar unterdrücken. Sie selbst besitzen
keine intrinsische Aktivität am GnRH-Rezeptor (Diedrich et al. 1994). Das Risiko der
Ovarialzystenbildung ist minimal, da es zu keinem flare-up Effekt kommt und
Hormonentzugserscheinungen sind durch die gleichzeitige Verabreichung von
Gonadotropinen während der Suppression der Adenohypophyse als unwahrscheinlich
anzusehen. Weitere Vorteile der GnRH-Antagonisten sind die relativ kurze
Stimulationsdauer, die sich dem normalen Menstruationszyklus anpasst und somit in diesen
integriert werden kann. Diese Vorgehensweise ist physiologischer und für die Patientinnen
subjektiv angenehmer (Huirne und Lambalk 2001).
25
1.4. Extrahypophysäre Wirkungen von GnRH
In einer Vielzahl von Geweben, wie z.B. der Brust, der Plazenta, dem Ovar, dem Uterus, der
Prostata und dem Hoden gelang der Nachweis der Anwesenheit des GnRH-Rezeptors oder
der Expression des GnRH-Rezeptorgens (Kakar et al. 1992, Ortmann und Diedrich 1999).
GnRH hat die Fähigkeit die mitogen-aktivierte Proteinkinase in humanen Granulosazellen zu
stimulieren und somit möglicherweise als autokriner Faktor zu wirken (Kang et al. 2000,
Kang et al. 2001). Mittels reverser transkriptase-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) konnte
die mRNA des GnRH-Rezeptors im humanen Ovar nachgewiesen werden (Peng et al. 1994,
Minaretzis et al. 1995, Weiss et al. 2001).
Die Sicherheit der GnRH-Analoga im Hinblick auf das Ovar, die Oozyten, die
Granulosazellen und den Embryo ist seit der Entdeckung von extrahypophysären GnRH-
Rezeptoren zum Gegenstand der Diskussion geworden. Besonders die hohen Konzentrationen
der therapeutisch eingesetzten GnRH-Analoga in der Zirkulation haben die Sorge geweckt,
GnRH-Antagonisten könnten schädlich für die ovarielle Funktion sein.
Soweit konnten noch keine intrinsichen Effekte von GnRH-Antagonisten auf die humane
Steroidbiosynthese in vitro demonstriert werden (Mannaerts und Gordon 2000, Demirel et al.
2000, Weiss et al. 2001). Hernandez hat die Hypothese aufgestellt, dass GnRH-Antagonisten
mit der mitotischen Programmierung der Zellen interagieren und in die Follikulogenese, die
Formation der Blastozyste und der Entwicklung des Endometriums eingreifen (Hernandez
2000). Obwohl die Hemmung der Spermienbindung an die Zona pellucida durch GnRH-
Antagonisten in vitro gehemmt wurde, konnten keine niedrigeren Fertilisationsraten in Phase
III Studien mit Antagonisten gefunden werden (Albano et al. 2000, Borm und Mannaerts
2000, Olivennes et al. 2000). In diesen vergleichenden klinischen Studien konnte kein
erheblicher Unterschied hinsichtlich der Fertilisationsrate, der Qualität der Embryos und der
26
Anzahl der Oozyten zwischen GnRHag und GnRHant festgestellt werden. Die GnRHant
scheinen sich bezüglich des ovariellen Hyperstimulationssyndrom (OHSS) als vorteilhaft zu
erweisen, da sie die Inzidenz signifikant senken (Diedrich et al. 1994, Weiss et al. 1999,
Albano et al. 2000, Ludwig et al. 2000, Olivennes et al. 2000). OHSS ist eine ernste
Komplikation der COH und äußert sich in Aszitis, Hydrothorax, Hämokonzentration und
thrombembolischen Ereignissen und kann möglicherweise zu lebensbedrohlichen Zuständen
führen (Ludwig et al. 1999). Die erniedrigte Rate an OHSS könnte auch auf einen ovariellen
Einfluss der GnRHant zurückzuführen sein.
In einer großen europäischen Studie konnten jedoch Nachteile von GnRHant gezeigt werden.
Die Implanationsrate (15,7% vs. 21,8%) und die Schwangerschaftsrate (20,3% vs. 25,7%)
waren gegenüber einem GnRHag-Stimulationsprotokoll erniedrigt (Borm und Mannaerts
2000). In zwei Meta-Analysen wurden die GnRH-Antagonisten und GnRH-Agonisten
bezüglich ihres Einsatzes in der Infertilitätsbehandlung miteinander verglichen (Al Inany und
Aboulghar 2002, Ludwig et al. 2001a). Eine Schlussfolgerung beinhaltete den klaren Vorteil
des GnRH-Antagonisten Cetrorelix gegenüber dem langen Protokoll mit GnRH-Agonisten im
Hinblick auf die Sicherheit und Verträglichkeit für die Patientinnen. Im Bezug auf die
Schwangerschaftsrate konnte zwischen den zwei Substanzen kein Unterschied aufgezeigt
werden. Die Auswertung der Stimulationsportokolle mit Ganirelix weisen auf eine
verminderte Schwangerschaftsrate und keinen Vorteil hinsichtlich der Sicherheit hin (Ludwig
et al. 2001a).
27
1.5. Intraovarielle IGF-System
Die Familie der Insulin-like Growth Factors besteht aus zwei Liganden, IGF-I und IGF-II,
sechs Bindungsproteinen IGFBP 1-6, zwei Rezeptoren und spezifischen Proteasen.
1.5.1. Insulin-like Growth Faktoren-I und -II
Insulin-like Growth Faktor-I (IGF-I) und IGF-II sind niedermolekulare Einfachketten-
Polypeptide, die zusammen zu Proinsulin eine strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit
besitzen (Daughaday und Rotwein 1989). IGF-I und -II, die 1978 erstmals gereinigt und
sequenziert wurden (Rinderknecht et al. 1978), zeigen eine Homologie von etwa 50%. Sie
bestehen aus einer „A“ und einer „B“-Kette, die locker über Disulfidbrücken verbunden sind.
IGF -I und -II weisen noch ein aus 12 und 8 Aminosäuren (AS) aufgebautes C-Peptid,
welches die beiden Ketten (A und B) verbindet und ein D-Segment, welches die A-Kette um
8 und 6 AS verlängert (Blundell und Humbel 1980).
Das Gen für IGF-I befindet sich auf dem langen Arm von Chromosom 12 (Rotwein et al.
1986), die Codierung von IGF-II auf dem kurzen Arm von Chromosom 11, wo auch das Gen
für Insulin lokalisiert ist (Bell et al. 1985).
1.5.1.1. Insulin like Growth Faktor-I
IGF-I, früher auch bekannt als Somatomedin C, wird von Growth Hormon (GH) reguliert und
soll als Mediator von GH wachstumsfördernd, besonders auf den Skelettknorpel wirken. In
der Leber liegt der Hauptort der IGF-I Synthese, welche ebenso von GH abhängig ist. IGF-I
wird aber auch in anderen Geweben (z.B. Ovar) gebildet, wo die Produktion von anderen
Wachstumsfaktoren und kaum bzw. nicht von GH bestimmt wird.
28
IGF-I mRNA ist im humanen Ovar kaum detektierbar und in GZ zu keinem Zeitpunkt des
Follikelwachstums nachweisbar (El Roeiy et al. 1993, El Roeiy et al. 1994). Im Gegensatz zu
den Bedingungen bei Ratten weisen die Untersuchungen bei Menschen daraufhin, dass die
Follikulogenese von IGF-I unabhängig ist. Der Serumspiegel von IGF-I ist bei Patientinnen,
die sich COH und IVF unterziehen, wesentlich höher als der in der FF. Dort ist die IGF-I
Konzentration in androgendominaten und östrogendominaten Follikeln etwa gleich hoch und
ist von der Follikelgröße unabhängig (van Dessel et al. 1996). Diese Beobachtungen lassen
die Vermutung zu, IGF-I in der FF stammt aus der peripheren Zirkulation durch
Transsudation und macht eine Herkunft aus GZ unwahrscheinlich (Chang et al. 1994,
Pellegrini et al.1995).
In der präovulatorischen FF von diesen Patientinnen ist die Konzentration von IGF-II etwa
achtmal höher als die von IGF-I (Kubota et al. 1993). Die Hypothese, dass IGF-I nicht
essentiell für ein normales Follikelwachstum ist, wird durch Beobachtungen bei Patientinnen
mit Laron-Zwergwuchs mit GH-Rezeptormangel unterstützt (Laron 1984). Diese Patientinnen
haben eine normale Ovulation und Fertilität und reagieren auf Gonadotropine. Trotz des
erhöhten GH Spiegel, ist IGF-I weder im Serum noch in der FF in ausreichenden Mengen
nachweisbar und IGF-II ist im Serum zu 25% des normalen Levels enthalten (Lunenfeld et al.
1991, Menashe et al. 1991, Dor et al. 1992). Diese Ergebnisse weisen auf eine
Unabhängigkeit der physiologischen Follikelentwicklung von IGF-I und auf eine
überwiegende Bedeutung von IGF-II im Ovar hin.
29
1.5.1.2. Insulin like Growth Faktor-II
IGF-II wird auch in verschieden Geweben u.a. Ovar synthetisiert, ist aber in sehr geringem
Maße von GH abhängig. Man vermutet, dass IGF-II eine Rolle für den fetalen Wachstum und
die Entwicklung spielt und, da man hohe Konzentrationen im Liquor zerebrospinalis
nachweisen kann, für die Entwicklung des ZNS. Eine Deletion des IGF-II Gens bewirkt ein
Zurückbleiben des intrauterinen und perinatalen Wachstums (Schoenle et al. 1985, DeChiara
et al. 1990).
Im menschlichen Ovar wird IGF-II in Granulosazellen (GZ) und Thekazellen exprimiert (El
Roeiy et al. 1993, El Roeiy et al. 1994). IGF-II wird von GZ präovulatorischer Follikel und
von Granulosaluteinzellen (GLZ) nach COH intensiv synthetisiert und sezerniert
(Ramasharma 1987, Voutilainen 1987, Geisthovel 1989, Hernandez 1992, El Roeiy 1993,
Voutilainen 1996). IGF-II Spiegel sind in östrogendominater Follikelflüssigkeit (FF) höher
als in androgendominanter FF, außerdem korreliert er gleichsinnig mit der Follikelgröße, dem
Östrogenspiegel und dem Zyklustag. Zum Zeitpunkt der Follikelselektion erfolgt ein
dramatischer Anstieg der IGF-II Produktion in den Granulosazellen (Giudice 2001). Die
Serumspiegel von IGF-I und –II sind bei Frauen mit physiologischem Menstruationszyklus
von diesem unabhängig, was die Bedeutung des intraovariellen IGF-Systems unterstreicht
(van Dessel et al. 1996). GH, Prolaktin, LH, FSH und hCG können die Sekretion von IGF-II
aus GZ sehr effektiv induzieren. Dies geschieht dosisabhängig, wobei von GH und Prolaktin
auffallend höhere Mengen (100 ng/mL), als von LH, FSH und hCG (10 ng/mL) benötigt
werden. 2 ng/mL hCG, LH oder FSH reichen, um die IGF-II Sekretion auf ein 8-10fache im
Vergleich zur Kontrolle zu steigern (Ramasharma und Li 1987). Die IGF-II Konzentration ist
im venösen Abfluss des Ovars höher als in der peripheren Zirkulation, was zusätzlich auf
einen ovariellen Ursprung hindeutet.
30
Die Effekte der IGFs im Ovar beinhalten zum einem die Mitogenese und Reifung der Oozyte,
zum anderen die Steigerung der Steroidbiosynthese, entweder allein oder gemeinsam mit
Gonadotropinen (Giudice et al. 1995). Im Thekazellkompartiment erhöht IGF-I in
Kombination mit LH die Anzahl der LH-Rezeptoren, fördert die Androgenbiosynthese und
die DNS-Synthese (Adashi et al. 1985, Davoren et al. 1986). IGF-I kann die de novo Synthese
der Steroidhormone nicht allein stimulieren, da es nicht den Cholesteroltransport in das
Mitochondrium beeinflussen kann (Magoffin und Weitsman 1996). Dies lässt folgern, dass
IGF-I die LH Wirkung bezüglich der Androgenbiosynthese erleichtert.
Im Gegensatz dazu wirken die IGFs im Granulosazellkompartiment synergistisch mit FSH
auf die Östrogensynthese und Sekretion (Adashi et al. 1985, Christman et al. 1991). Nach der
Luteinisierung wird die Progesteronsynthese durch LH und IGFs stimuliert (Adashi et al.
1985, Davoren et al. 1985). Auch die P450 Aromataseaktivität und die DNS-Synthese werden
positiv beeinflusst (Giudice et al. 1995).
Zelltyp Ratte Mensch
Granulosazellen IGF-I IGF-II
Thekazellen IGF-II IGF-II, ?IGF-I
Tabelle 1.5.1: Unterschied zwischen IGF-I und IGF-II im Ovar von Ratten und Menschen
31
1.5.2. Typ I und Typ II IGF Rezeptoren
Der biologische Effekt von IGFs wird durch zwei verschiedene Typen von spezifischen
Zellmembranrezeptoren vermittelt (Rosenfeld et al. 1989, Nissely und Lopaczynski 1991).
Der Typ I-Rezeptor bindet vorzugsweise IGF-I im Vergleich zu IGF-II, mit moderater
Affinität zu Insulin. Der Typ I-Rezeptor ist, genau wie der Insulinrezeptor, ein Glykoprotein
mit der Struktur eines Tetramers. Zwei α- und zwei β- Untereinheiten, locker verbunden über
Disulfidbrücken, haben eine relative Molekularmasse von 130 000 und 90 000. Die
extrazellulär gelegenen α-Untereinheiten präsentieren die Bindungsdomaine für die Liganden
(IGF-I und -II, Insulin), während die intrazellulär gelegenen, hydrophoben β-Untereinheiten
eine ATP-Bindungsstelle, eine durch die Liganden aktivierbare Tyrosinkinase und eine
Möglichkeit zur Autophosphorylierung zeigen.
Der Typ II-Rezeptor unterscheidet sich vom IGF-I und Insulinrezeptor. Er besitzt eine hohe
Affinität für IGF-II und eine geringere für IGF-I, bindet Insulin aber nicht. Der Rezeptor ist
strukturell homolog mit dem kationen-unabhängigen Mannose-6-Phosphat (M6P) Rezeptor
(Nisselet und Lopaczynski 1991). Er ist ein Einzelstrang-Glykoprotein, wobei 90% seiner
Struktur extrazellulär liegt. Der zytoplasmatische Anteil weist mehrere potentielle Stellen mit
der Möglichkeit zur Phosphorylierung von Threonin, Serin und Tyrosin auf.
In den meisten Fällen scheinen die metabolischen und wachstumsfördernden Aktionen von
IGF-II jedoch nicht über den IGF-II Rezeptor, sondern über den IGF-I oder sogar über den
Insulinrezeptor vermittelt zu werden (Morrione et al. 1997). Der physiologische Effekt von
IGF-I wird primär via IGF-I Rezeptor überbracht (Nisselet und Lopaczynski 1991).
32
1.5.3. Insulin-like Growth Factor Binding Proteins
Die IGFs zirkulieren mit hoher Affinität gebunden an spezifische Bindungsproteine (IGFBP),
welche wie die IGFs selbst mit wichtigen biologischen Funktionen versehen sind. Die
IGFBPs sind eine Familie von mindestens sechs Plasma- und Gewebeproteinen mit
gemeinsamen strukturellen und funktionellen Charaktereigenschaften (Rosenfeld et al. 1990,
Cohen et al. 1991, Lamson et al. 1991). Sie wurden nummeriert von IGFBP-1 bis -6 analog
der Reihenfolge ihrer molekularen Charakterisierung (Report of nomenclature of IGF binding
proteins 1992). Die IGFBPs binden speziell IGF-I und -II, nicht aber Insulin oder Proinsulin.
IGFBP-2,-5,-6 haben eine höhere Affinität zu IGF-II, während IGFBP-1,-3 und -4 IGF-I und -
II mit etwa gleicher Affinität binden. Sie sind in allen biologischen Flüssigkeiten präsent. Die
Analyse der AS-Sequenz hat ergeben, dass etwa eine 50%ige Homologie zwischen den
einzelnen IGFBPs einer Spezies und eine etwa 80%ige Homologie zwischen den gleichen
IGFBPs unterschiedlicher Spezies besteht.
IGFBP-1,-2,-4,-5,-6 , als sogenannte „kleine Komplexe“, sind sowohl im Serum als auch in
anderen Flüssigkeiten enthalten. Ihre Molekularmassen variieren zwischen 24 und 35 kDa.
IGFBP-3 liegt meist als „großer Komplex“ von 150 kDa vor, der aus zwei Untereinheiten,
einer 85 kDa säurelabilen und einer aus IGF-I oder -II bestehenden Einheit, aufgebaut ist.
1.5.3.1. IGFBP-1
IGFBP-1 ist ein nicht-glykolisiertes Protein mit einer Molekularmasse von 25 000, dessen
Gen man auf Chromosom 7 detektiert hat. Von der Dezidua, dem sekretorischen
Endometrium, der Leber und im Ovar von GLZ und dem Corpus Luteum gebildet, wird
IGFBP-1 primär von Insulin reguliert. In vitro suppremiert Insulin sehr wirksam die IGFBP-1
mRNA Transkription. Diese Unterdrückung von Seiten des Insulin scheint gegenüber den
33
stimulierenden Effekten von Glukokortikoiden, cAMP, Progesteron überlegen zu sein
(Conover et al. 1992, Suwanichkul et al. 1993, Suwanichkul et al. 1994).
Im Ovar ist die Konzentration von IGFBP-1 besonders während der präovulatorischen Phase
(Wang et al. 1995), aber auch unter COH im Serum (Martikainen et al. 1991) und in der
Follikelflüssigkeit (van Dessel et al. 1996) erhöht. In situ Hybridisierung zeigte, dass nach
dem LH-Anstieg IGFBP-1 mRNA besonders in Granulosazellen von dominaten Follikeln
exprimiert wird (El Roiey et al. 1994). Der Spiegel liegt in der FF um einiges höher als im
Serum (Chang et al. 1994). Im menschlichen Ovar vermutet, dass IGFBP-1 während der
Follikelphase die IGF-I stimulierte Androgenproduktion der Thekazellen hemmt und somit
durch eine Steigerung der Östrogensynthese in Granulosazellen die Follikelatresie und
Anovulation verhindert (Nobel und Dewailly 1992). Die Beobachtung deutet, dass die
IGFBP-1 Produktion in Granulosazellen des dominaten Follikels eventuelle eine wichtige
Rolle im Follikelwachstum und dessen Reifung durch Modelierung der IGF-I Aktion
bezüglich der Androgenproduktion in Thekazellen, aber nicht in Granulosazellen spielt.
1.5.3.2. IGFBP-2
IGFBP-2, ein aus 289 AS bestehendes glykolisiertes Peptid von 31 kDa, wurde dem zweiten
Chromosom zugeordnet (Binkert et al. 1989, Ehrenborg et al. 1991). Es ist in einer Vielzahl
von Flüssigkeiten nachweisbar, wie z.B. in Cerebrospinalflüssigkeit, Amnion- und
Coelonflüssigkeit, Urin und Seminalplasma (Gargosky et al. 1993, Rosenfeld et al. 1990). Es
findet aber auch eine de novo Synthese in GLZ statt, welche durch Faktoren, die
intrazelluläres cAMP erhöhen, gehemmt wird. Es gelang der Nachweis in humanen GLZ-
Kulturen, dass 100 ng/mL hCG die IGFBP-2 Produktion und Sekretion auf 32% der Kontrolle
senkt (Cataldo et al. 1993). IGF-II, im Gegensatz zu IGF-I, führt auch zu dieser Inhibierung
34
(Cataldo und Guidice 1992). GLZ-Kulturen von Rindern zeigten eine erhöhte Ausschüttung
von IGFBP-2 nach Stimulation mit IGF-I und Insulin, aber nicht durch IGF-II (Grimes und
Hammond 1992).
Die Bindungsaffinität von IGFBP-2 ist wesentlich höher zu IGF-II als zu IGF-I, was für einen
regulierenden Einfluss in Form einer Hemmung auf die IGF-II Wirkung spricht.
IGFBP-2 wird in Granulosazellen und Thekazellen von atretischen Follikeln lokalisiert, ist in
primordialen, preantralen und antralen Follikeln geringfügig nachweisbar (Peng et al. 1994).
Die Follikelflüssigkeit von atretischen und androgen-dominanten Follikeln enthält hohe
Konzentrationen von IGFBP-2, folglich niedrige Spiegel und verminderte Aktivität von IGF-
II (Cataldo und Giudice 1992, San Roman und Magoffin 1993, Giudice et al. 1995).
IGFBP-1 und –2 besitzen eine Tripeptidsequenz, Arg-Gly-Asp (RGD), nahe des carboxy-
terminalen Endes (Rosenfeld et al. 1990, Lamson et al. 1991). Diese Tripeptid ist die
Erkennungsstelle für Adhäsivprozesse an die Zellmembranrezeptoren, die sogenannten
Integrine (Ruoslahti et Pierschbacher 1987). Aufgrund der Blockierung der IGFBP-1 Bindung
durch synthetische RDG-Sequenzen, kann man davon ausgehen, dass IGFBP-1 und –2 durch
ihre RDG-Sequenz an die Zellmembran binden (Brewer et al. 1988).
1.5.3.3. IGFBP-3
IGFBP-3 ist das vorherrschende Bindungsprotein im Serum. Es findet eine de novo Synthese
von IGFBP-3 in GLZ (Hamori et al. 1991) und eine Sekretion in Anwesenheit von IGF-I und
IGF-II statt (Cataldo und Guidice 1992). Expression von mRNA wird in Thekazellen von
allen und in Granulosazellen von hauptsächlich dominaten Follikeln (El Roeiy et al. 1994 )
gefunden. GH und IGF-I regulieren die Konzentration im positiven Sinn.
35
1.5.3.4. IGFBP-4
IGFBP-4 ist ein 24 kDa Protein, in seiner glykolisierten Form von 28 kDa. IGFBP-4 wurde in
allen biologischen Flüssigkeiten und einer Vielzahl von Zellen, wie z.B. Fibroblasten,
Neuroblastom, Prostata und Osteozyten nachgewiesen (Cohen et Rosenfeld 1994, Collett-
Solberg et Cohen 1996). Der IGFBP-4 Spiegel scheint mit dem Alter anzusteigen.
Im menschlichen Ovar konnte immunozytologisch IGFBP-4 in Oozyten zum Zeitpunkt der
follikulären Wachstumsphase detektiert werden, während in GZ und Thekazellen von
primordialen, preantralen und antralen Follikeln die Immunofärbung nicht nachweisbar war.
In atretischen Follikeln wurde die Färbung jedoch sichtbar, so dass in diesen Follikeln
IGFBP-4 lokalisiert werden konnte (Peng et al. 1994). Die FF von atretischen Follikeln
enthält hohe Spiegel von IGFBP-2 und –4, welchen man eine hemmende Wirkung auf IGF-II
zuspricht (Cataldo und Giudice 1992, San Roman und Magoffin 1993, Giudice et al. 1995)
und somit von einer erniedrigten Bioverfügbarkeit dessen ausgehen kann. Im Gegensatz dazu
findet man einen Anstieg von IGFBP-2,-3,-4 Fragmenten mit niedrigerer Molekularmasse in
dominaten Follikeln, was auf eine erhöhte Aktivität der Proteasen hindeuten könnte (Cwyfan-
Hughes et al. 1997). Diese Hypothese unterstützend fand man IGFBP-4 Proteaseaktivität in
wachsenden, aber nicht in atretischen Follikeln (Chandrasekher et al. 1995, Iwashita et al.
1996). Diese Protease kann spezifisch IGFBPs in kleinere Stücke spalten, welche dann eine
erheblich verminderte Affinität zu IGFs aufweisen und so die Aktion der IGFs potenzieren
(Conover et al. 1992, Mason et al. 1996).
36
1.5.3.5. Pregnancy-associated Plasma Protein-A
Pregnancy-associated Plasma Protein (PAPP-A) ist ein großes Glykoprotein (720 kDa),
welches in der Plazenta seine herkömmliche Herkunft hat. Während der Schwangerschaft
wird es in hohen Konzentrationen im Trophoblasten produziert und in den mütterlichen
Kreislauf ausgeschüttet. Das zirkulierende PAPP-A ist ein Komplex, der aus zwei PAPP-A
Untereinheiten und zwei Untereinheiten einer glykolisierten Proform (50-90 kDa), eines
eosinophilen major basic protein (proMBP), besteht, welche über Disulfidbrücken verbunden
sind. Der PAPP-A Spiegel steigt während der Schwangerschaft mit dem Gestationsalter an
(Qin et al. 1997). PAPP-A ist jedoch nicht für die Schwangerschaft spezifisch, da man
messbare Konzentrationen bei nicht schwangeren Frauen und bei Männern nachweisen
konnte. Bei den nicht Schwangeren wird das Endometrium als Syntheseort vermutet (Bischof
et al. 1986). Die biologische Funktion ist bisher nicht vollständig geklärt. Erst kürzlich wurde
gezeigt, dass es sich bei den IGFBP-4 Proteasen um das pregnancy-associated plasma protein-
A (PAPP-A) handelt (Conover et al. 1999).
Im menschlichen Ovar sind Granulosazellen eine Quelle von PAPP-A, welche durch einen
Nachweis im ELISA (Immunohemmung und Immunodepletion) in kultivierten humanen
Granulosazellen belegt werden konnte. PAPP-A ließ sich in androgen-dominaten, mit einem
Durchmesser des Follikels von weniger als 9 mm kaum detektieren, dagegen erfolgte die
Sekretion von PAPP-A in das Medium der kultivierten humanen Granulosazellen von
östrogen-dominaten Follikeln mit einem Follikeldurchmesser von mehr als 9 mm und von
Granulosaluteinzellen. Die Spiegel von PAPP-A zeigten keine Veränderung hinsichtlich der
Stimulation mit IGF-II und hCG. Conovers Daten demonstrieren die Herkunft von PAPP-A
aus ovariellen Granulosazellen, welches dadurch einen Hinweis auf die Follikelselektion und
die Formierung des Corpus luteum geben könnte (Conover et al. 2001). Diese Aussage
37
unterstützend demonstrierte eine andere Arbeitsgruppe anhand von in-situ Hybridisierung,
dass PAPP-A mRNA nur in antralen gesunden Follikeln, vom 5 mm Stadium bis zur
präovulatorischen Zustand, folglich in östrogen-dominaten Follikeln nachweisbar ist.
Außerdem konnte auch die Expremierung im Corpus luteum dargestellt werden. Dagegen war
die mRNA des PAPP-A in prenatralen, gesunden kleinen (∅ 1-2 mm), atretischen antralen,
größeren atretischen antralen Follikeln, Oberflächenepithel, Tunica albuginea und Zellen des
Bindegewebes sehr niedrig oder nicht detektierbar (Hurwitz et al. 2000). Dies ist der erste
Hinweis, dass die Gene, die PAPP-A kodieren in den Ovarien expremiert werden, welches
aber hauptsächlich auf die gesunden Granulosazellen und Corpora lutea beschränkt ist. Dieses
eingeschränkte Verteilung des PAPP-A im ovariellen Zyklus könnte die Vermutung
unterstützen, dass PAPP-A zunächst als funktioneller Marker von dominaten Follikeln und
dessen Folgeprodukt, des Corpus luteum bezeichnet werden kann und unterstreicht die
Hypothese über die physiologische Rolle des PAPP-A, welche sich auf die Kontrolle des
Überlebens, des Wachstums, die Differenzierung von dominaten Follikeln und Corpora lutea
erstreckt. Diese Interaktion wird über die Inaktivierung des IGFBP-4 vermittelt. Weiterhin
wurde gezeigt, dass die IGFBP-4 Proteaseaktivität in vitro ansteigt, wenn man GZ mit IGFs,
Östradiol oder FSH inkubiert. FSH kann in hohen Konzentrationen (>10 ng/ml) IGFBP-4
Produktion inhibieren und die Proteasen stimulieren (Liu et al. 1993). So wurde gezeigt, dass
FSH die Aktivität von IGFBP-4 auf zwei Wegen modifizieren kann, prätranslational und
posttranslational. Auf diese Weise könnte man vermuten, dass die hohen Spiegel von FSH in
dominaten Follikeln diese vor der Atresie beschützen, indem sie die IGFBP-4 Genexpression
hemmen und die Proteasen anregen. Ebenso steigern niedrige FSH Konzentrationen die
IGFBP-4 Wirkung und stimulieren nicht die Proteasen, was folglich zur Atresie führt
(Erikson et al. 1994).
38
Zusammenfassend kann man die Vermutung äußern, das PAPP-A im menschlichen Ovar zu
einem bestimmten Zeitpunkt der Follikelentwicklung expremiert wird, um IGFBP-4 zu
spalten und somit die lokale Bioverfügbarkeit von IGF-II zu steigern, welche wiederrum die
Steroidbiosynthese und die Entwicklung des dominanten Follikel und des Corpus luteum
fördert. Diese Hypothese wird unterstützt durch eine Studie, in der IGFBP-4 die IGF
induzierte Östradiolausschüttung aus GZ hemmt, wozu die gespaltenen IGFBP-4 nicht fähig
sind (Iwashita et al. 1996, Iwashita et al. 1998).
1.5.3.6. IGFBP-5
IGFBP-5 ist eine 29 kDa Protein, welches im Gegensatz zu den anderen IGFBPs den IGF-
induzierten Zellwachstum in einer Reihen von Zellen stimuliert (Rajaram et al. 1997).
IGFBP-5 wird hauptsächlich in der Cerebrospinalflüssigkeit, in geringeren Mengen im Serum
gefunden. In vitro liegt IGFBP-5 im freien Medium nur als gespaltenen Fragmente vor, die
keinen Effekt auf IGF-I zeigen (Jones et al. 1993).
1.5.3.7. IFGBP-6
IGFBP-6 bestehend aus 216 AS wird in Körperflüssigkeiten, wie Serum und Liquor
zerebrospinalis nachgewiesen und von vielen Geweben (Leber, Lunge und Gehirn) expremiert
(Rechler 1993). IGFBP-6 hat eine größere Affinität zu IGF-II als zu IGF-I und scheint die
IGF Aktion in vitro zu modifizieren (Andress et al. 1991, Bach et al. 1994). Im menschlichen
Ovar konnte dieses Bindungsprotein bislang noch nicht nachgewiesen werden.
39
1.5.4. Regulation der IGFs und IGFBPs
Im menschlichen Ovar herrscht ein empfindliches Gleichgewicht zwischen den einzelnen
Komponenten der IGF-Familie. Jeder Zyklusabschnitt, jedes intraovarielle Kompartiment und
jeder hormonelle Zustand eines Follikels bedingt eine unterschiedliche Zusammensetzung der
Wachstumsfaktoren. Doch nur eine bestimmte Kombination von Konzentrationen der
einzelnen Peptide gewährleistet den unbehinderten Ablauf der gesunden und erfolgreichen
Follikelreifung und der folgenden Prozesse der Reproduktion. Dieser physiologisch relevante
Zustand konnte durch viele Beobachtungen u.a. an humanen Granulosaluteinzellen analysiert
werden.
Die Messung der Wachstumsfaktoren wurden zum Teil in der Follikelflüssigkeit von im
Verlauf der IVF-Behandlung punktierten Follikeln vorgenommen. Es können Follikel in ihrer
Hormonausstattung und ihrer Größe unterschieden werden. In kleinen, androgendominaten
Follikeln findet man hohe Spiegel von IGFBPs, besonders IGFBP-2 und -4, dagegen aber
niedrige Spiegel von IGF-II und kein Nachweis von spezifischen IGFBP-Proteasen. Somit ist
die minimale Menge an bioverfügbaren IGF-II und dessen verminderte synergistische
Wirkung mit den Gonadotropinen in diesen kleinen, androgendominanten und zumeist
infertilen Follikeln erklärbar.
Im Gegensatz dazu werden Androgene, die aus Thekazellen stammen, als Substrat für die
Gonadotropin und IGF stimulierte Aromatase in wachsenden, dominaten Follikeln für die
Östrogenproduktion herangezogen. Hohe Level an IGF-II entstehen zum einen aus der
verminderten IGFBP-Produktion, zum anderen aus vermehrter Degradierung der
Bindungsproteine durch spezifische Proteasen (Giudice et al. 1995). Im Leitfollikel oder
östrogendominanten Follikeln im Allgemeinen beobachtet man erhöhte Konzentrationen von
IGF-II und der spezifischen IGFBP-4 Protease PAPP-A und nur geringe bis nicht
40
nachweisbare Level von IGFBP-2 und -4. Spezifische Proteasen vermindern die Affinität der
IGFBPs für IGFs (Conover et al. 2001), wodurch sie entscheidend in die intraovarielle
Regulation des IGF-Systems eingreifen und PAPP-A somit eine tragende Rolle neben IGF-II
und IGFBP-2 und -4 bei der Sicherstellung des physiologischen Ablaufs der Reproduktion
zukommt.
Generell kann man die Behauptung aufstellen, dass erhöhte IGFBP-Spiegel meist mit
erniedrigten IGF-Konzentrationen, niedrige IGFBP-Spiegel mit hohen IGF-Konzentrationen
assoziiert sind. Zu den Effekten von GnRH Analoga auf das humane ovarielle IGF-System
existieren derzeit keine Daten.
IGF-I IGF-II IGFBP-2 IGFBP-4 PAPP-A
Dominanter
Follikel
- ++++ - - ++++
Atretischer
Follikel
- +/- +++ ++++ -
Abb. 1.5: Expression von IGF-I, IGF-II, IGFBP-2 und –4 und PAPP-A im menschlichen
Ovar. Die Zeichen weisen von einem starken (++++) bis zu einem schwachen Vorhandensein
(+) und keiner Detektion (-) hin.
41
1. Problemstellung
In der vorliegenden Arbeit wird der mögliche Einfluss von GnRH-Analoga auf die
endokrinen Vorgänge auf ovarieller Ebene untersucht. Die klinische Relevanz dieser
Erforschung ergibt sich aus dem vermehrten Einsatz von GnRH-Antagonisten zusätzlich zu
den bisher gängigen GnRH-Agonisten in der assistierten Reproduktion. Da bei dieser
Indikation unphysiologisch hohe Konzentrationen im systemischen Kreislauf vorliegen,
können diese Substanzen durch Bindung an ovarielle Rezeptoren den lokalen Steroidhormon-
und Wachstumsfaktorhaushalt aus dem Gleichgewicht bringen. Solche Veränderungen
könnten in Störungen der Follikelreifung, der Eizellqualität und der Implantationsrate
resultieren.
Die GnRH-Antagonisten sind eine recht junge Substanzgruppe, über die bisher wenig
Erkenntnisse bezüglich ihrer Wirkung auf das humane Ovar vorliegen. Während ihres
klinischen Einsatz auf dem Gebiet der Reproduktionsmedizin zeigten GnRHant gegenüber
GnRHag deutliche Vorteile, aber auch einige Nachteile. Ob diese letzteren nun durch
Veränderungen auf der Ebene der Wachstumsfaktoren bedingt sind, bedarf einer Klärung.
In dieser Arbeit werden aus diesem Grund die Effekte von GnRHant und GnRHag auf das
ovarielle IGF-System überprüft.
42
3. Material und Methoden
3.1. Material
3.1.1. Chemikalien
Chemikalien Verwendung Herkunft
Acrylamid Stock Trenn- und Sammelgel Bio-Rad Laboratories GmbH,
München, Deutschland
10% APS Trenn- und Sammelgel Merck, Darmstadt, Deutschland
Aqua Spüllösung Verdünnung Delta-Pharma GmbH, Pfullingen,
Deutschland
D-MEM/F-12 Medium Gibco BRL, Life Technologies,
Karlsruhe, Deutschland
Fetales Kälberserum Mediumzusatz Biochrom KG, Berlin, Deutschland
Ficoll-pâque GLZ-Präparation Amersham Pharmacia Biotech AB,
Uppsala, Schweden
Sodiumcarbonat
anhydrous, S 7795
Extraktion der
intrazellulären Faktoren
Sigma, St. Louis, USA
PBS-Dulbecco GLZ-Präparation,
Western Blot
Biochrom KG, Berlin, Deutschland
Penicillin/Streptomy
cin Solution, P 0781
Mediumzusatz Sigma, Steinheim, Deutschland
10% SDS Trenn- und Sammelgel BioRad, Hercules, USA
Serum Replacement
2 S 9388
Mediumzusatz Sigma, Steinheim, Deutschland
Skim Milk Western Blot Becton Dickinson Microbiology
Systems, Sparks, USA
TEMED Trenn- und Sammelgel BioRad, Hercules, USA
1,5 M TrisCl, pH 8.8 Trenngel BioRad, Hercules, USA
0,5 M TrisCl, pH 6.8 Sammelgel BioRad, Hercules, USA
Trypanblau Zellzählung und -
vitalität
Sigma, St. Louis, USA
43
3.1.2. Hormone, Hormonanaloga, Antikörper und Wachstumsfaktoren
Name Analoga Herkunft
β-Actin primärer Antikörper BioRad, Hercules,
USA
Cetrorelix, D 20761 GnRH-Antagonist ASTA Medica,
Frankfurt,
Deutschland
Donkey anti-goat IgG-HRP sekundär Antikörper Santa Cruz
Biotechnology
Donkey anti-sheep/ goat antibody sekundär Antikörper Immunodiagnostic
Systems, Boldon, UK
Ganirelix, Org 37462 batch G GnRH-Antagonist N.V. Organon, Oss,
Niederlande
IGF-I, human recombinant I 3769 Insulin-like Growth
Factor I
Sigma, St. Louis,
USA
IGF-II, human recombinant I
2526
Insulin-like Growth
Factor II
Sigma, St. Louis,
USA
IGFBP-4, human recombinant
804-GB
Insulin-like-Growth-
Factor-Bindingprotein 4
R&D Systems,
Wiesbaden,
Deutschland
IGFBP-4 Antibody, anti-human
AF804
Insulin-like-Growth-
Factor-Bindingprotein 4
Antikörper
R&D Systems,
Wiesbaden,
Deutschland
Insulin, human recombinant I
0259
Insulin Sigma, St. Louis,
USA
Pregnesin Humanes
Choriogonadotropin
(HCG)
Serono Pharma
GmbH,
Unterschleißheim,
Deutschland
Triptorelin D-6-Tryptophane-GnRH Ferring, Kiel,
Deutschland
44
3.1.3 Versuchskits
Versuchskit Herkunft
Bio-Rad Protein Assay incl. Standard
II
Bio-Rad Laboratories GmbH, München,
Deutschland
Radioimmunoassay für IGFBP-2 DSL Deutschland GmbH, Sinsheim,
Deutschland
Radioimmunoassay für IGF-II Mediagnost, Reutlingen, Deutschland
ECLTM
Western Blot Detektion
Reagents
Amersham Pharmacia Biotech, Little
Chalfont, UK
EIA für PAPP-A BioCat GmbH, Heidelberg, Deutschland
45
3.2. Methoden
3.2.1. Kontrollierte ovarielle Hyperstimulation (COH)
Granulosaluteinzellen wurden von Frauen gewonnen, die sich einer IVF-ET oder ISCI
Behandlung unterzogen. Es werden zwei verschiedene Stimulationsprotokolle für die COH
unterschieden, das lange Protokoll und das „Lübecker Protokoll“.
3.2.1.1. Das lange Protokoll
Das lange Protokoll ist am weitesten verbreitet und am längsten etabliert. Es unterliegt dem
Prinzip der Synchronisation der Follikelreifung. Dies geschieht durch Gabe von GnRH-
Agonisten und die dadurch bedingte Desensitivierung der Adenohypophyse in der
Kombination der Verabreichung von Gonadotropinen. Der Ablauf gestaltet sich wie folgt:
Am 22. Zyklustag erhält die Patientin ein subcutanes Depot eines GnRH-Agonisten z.B.
Triptorelin (Decapeptyl Gyn, Ferring, Kiel, Deutschland). Nach 14 Tagen erfolgt eine
Blutentnahme und eine Sonographie zum Ausschluss von Ovarialzysten, die durch den
anfänglichen Anstieg der Gonadotropine bedingt sein können. Die Serumspiegel der
Gonadotropine und des Östrogens sollten auf Grund der Entkopplung der Hypothalamus-
Hypophysen-Ovar-Achse supprimiert sein. Ist dies der Fall kann die Stimulation mit
Gonadotropinen initiert werden. Zunächst erfolgt die Gabe von zwei Ampullen à 75 I.E.
HMG (Menogon, Ferring, Kiel) bzw. rekombinatem FSH (Gonal F), die nach vier Tagen
auf drei Ampullen erhöht wird. Anhand der täglich erhobenen Östradiolwerte kann die Dosis
der Gonadotropine individuell angepasst werden und bei Erreichen der sogenannten aktiven
Phase, d.h. der Östrogenspiegel steigt kontinuierlich an, die aktuelle Menge beibehalten
werden. Ab dem 8. Tag der Gonadotropinstimulation erfolgt neben der Bestimmung des
Hormonstatus die Messung der Follikelgröße mittels der Sonographie. Sobald der Leitfollikel
46
einen Durchmesser von mindestens 18-20 mm aufweist, wird die Ovulation mit 10 000 I.E.
HCG i.m. (Choragon, Ferring, Kiel) ausgelöst.
Die Oozytengewinnung erfolgte 36 Stunden später durch ultraschallgesteuerte transvaginale
Follikelpunktion, woraufhin die Trennung der Oozyten von der Follikelflüssigkeit folgt.
Nach Befruchtung der Oozyten mittels in-vitro-Fertilisation (IVF) oder
intrazytoplasmatischer-Spermatozoeninjektion (ICSI) geht der Embryotransfer (ET) 48
Stunden später vonstatten. Die Verabreichung von je 5 000 I.E. HCG am 2. und am 5. Tag
nach Follikelpunktion unterstützt die Lutealphase.
3.2.1.2. Das „Lübecker Protokoll“
Das „Lübecker Protokoll“, auch Antagonisten-Mehrfachgabe-Protokoll genannt, wurde 1994
von Diedrich et al. entworfen. Es beruht auf der Fähigkeit der GnRH-Antagonisten die
GnRH-Rezeptorbindungsstelle kompetitiv zu hemmen und somit den Regelkreis der
endokrinen Achse sofort zu unterbrechen. Die Supprimierung der Gonadotropine und der
ovariellen Steroidhormone geschieht innerhalb weniger Stunden nach Gabe der Antagonisten.
Ergo brauchen GnRH-Antagonisten erst relativ spät im Stimulationsprozess und zwar wenn
ein LH-Anstieg droht gegeben zu werden. Die Behandlung beginnt am 2. Zyklustag mit der
Verabreichung von zwei Ampullen HMG oder rec FSH, ab dem 6. oder 7. Tag erfolgt die
tägliche Gabe von 0.25 mg Cetrorelix, einem GnRH-Antagonisten und eine entsprechende
Dosisanpassung der Gonadotropine. Mittels Follikulometrie und Hormonstatus wird analog
der Zeitpunkt der Ovulationsauslösung bestimmt und ebenfalls mit 10 000 I.E. HCG
begründet. Das weitere Prozedere gleicht, bis auf die zusätzliche Gabe von 5 000 I.E. HCG
am 8. Tag zur Lutealphasenunterstützung, dem des langen Protokolls.
47
22 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 16
14 Tage Zyklustage 36h 48h
GnRH-Agonist
Depot
Kontroll-Sono
LH< 10 ml.E./ml
E2< 50 pg/ml
2 Amp. HMG od. FSH
3 Amp. HMG od. FSH
10 000 I.E
. H
CG
Follikelpunktion
Em
bryotransfer
Abb. 3.1: Schema eines Agonistenstimulatiosprotokoll (Einzelheiten s.Text)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 14 16
Zyklustage 36h 48h
2 Amp. HMG od. FSH
10
0
00
I.E
. H
CG
Follikelp
un
ktion
Em
bryo
tran
sfer
0,25 mg Cetrorelix/d
48
Abb. 3.2: Schema eines Antagonistenstimulationsprotokoll (Einzelheiten s.Text)
3.2.2. Granulosaluteinzellpräpraration
Die bei der Punktion gewonnene Follikelflüssigkeit wurde mit einer sterilen Spritze
gesammelt und bei 175g für 10 Minuten zentrifugiert, daraufhin der Überstand mit einer
Absaugpipette entfernt. Es folgte ein Zusammenmischen der Granulosaluteinzellen auf zwei
Röhrchen und eine Aufsuspension mit 5 mL Phosphate buffered Saline (PBS-Dulbecco,
Biochrom KG, Berlin, Deutschland). Nach erneuter Zentrifugation bei 175g, Beseitigung des
Überstandes und Aufmischung mit 5 mL PBS schließ sich die vorsichtige Auftragung der
Zellsuspension auf 5 mL Ficoll (Ficoll-Paque, Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala,
Schweden) an und deren Zentrifugation bei 312g für 20 Minuten. Nach der Auftrennung
befanden sich die Granulosaluteinzellen in einer Zwischenphase der Ficollröhrchen, aus
welcher die Zellen mit einer sterilen Pasteurpipette entnommen und in 10 mL PBS in einem
50 mL Röhrchen (Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland) gesammelt wurden.
Zur Entfernung von Erythrozytenkoagel ließ sich eine Filtration der Zellsuspension durch ein
Zellsieb (100 µm, Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) in ein neues 50 mL Röhrchen anwenden.
Es folgte eine Zentrifugation bei 175g für 10 Minuten und die Absaugung des Überstandes.
Das verbliebene Pellet am Boden des Röhrchen wurde mit 5 mL Inkubationsmedium:
Dulbecco´s modified Eagle Medium F-12 (D-MEM/F-12, Gibco BRL, Life Technologies,
Karlsruhe, Deutschland) aufsuspensiert und vom Boden durch mehrmalige Durchmischung
gelöst.
Zur Ermittlung der Zellvitalität und -zahl diente die Neubauerzählkammer, für welche 50 µL
Zellsuspension und 50 µL Trypanblau (Sigma, St. Louis, USA) gemischt und auf die
Zählkammer aufgetragen wurde. Die Vitalität der Zellen lag stets > 90%. Die Zellzahl beruhte
auf Auszählung aller 64 Felder, einer Division durch 4 (Anzahl der Quadranten) und einer
49
Multiplikation mit 2 (Verdünnung Zellsuspension : Trypanblau 1:1) und 10 000 (Faktor der
Zählkammer). Das Ergebniss ergab die wahrscheinliche Zellzahl pro mL.
Circa 200 000 Zellen wurden in einem Well einer 24 Wellplatte (Cellstar, Greiner
Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland) mit jeweils 1 mL Inkubationsmedium kultiviert.
500 mL Inkubationsmedium war mit 100 IU/mL Penicillin, 100 ng/mL Streptomycin (Sigma,
Steinheim, Deutschland) und 50 mL fetalem Kälberserum (Biochrom KG, Berlin,
Deutschland) versetzt. Die Kultivierung fand in einem Inkubationsschrank bei 37°C, 5%
CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit für 48 Stunden statt.
Abb. 3.3.: Aufnahme einer Graulosaluteinzellpräparation
3.2.3. Stimulation mit GnRH Antagonisten und GnRH Agonist
Nach zwei Tagen erfolgt ein Mediumswechsel, das bisherige Nährmedium wurde abgezogen
und die Wells wieder mit 1 mL Inkubationsmedium inklusive Penicillin, Streptomycin und
Serum Replacement 2 (Sigma, Steinheim, Deutschland) gefüllt. Serum Replacement wurde
aufgrund der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren gewählt, damit jegliche Beeinflussung
50
von dieser Seite ausgeschlossen werden konnte. Es folgte die Stimulation mit je 1 nM
Cetrorelix, Ganirelix und Tripotrelin je mL, ein Viertel der Zellen blieb unstimuliert, um als
Kontrollgruppe zu dienen. Die Kultivierung der Wellplatte für weitere 48 Stunden im
Brutschrank schloss sich an.
Nach zwei Tagen erfolgte das Abziehen der Suspension aus den Wells, die Einpipettierung in
1,5 mL Reaktionsgefäße (Eppendorf, Köln, Deutschland) und das Einfrieren bei -18°C.
3.2.4. Stimulation mit hCG, IGF-I, IGF-II und Insulin
Als Positivkontrollen diente für den Vergleich der IGF-II Messung hCG, dass nachweislich die
IGF-II Produktion und Sekretion stimuliert. 2 ng/mL reichen um die Konzentration von IGF-II
auf ein 8-10 faches zu erhöhen (Ramasharma und Li 1987). Die Granulosazellen wurden wie
beschrieben präpariert und nach 48 Stunden Anwachszeit mit ~ 70 ng/mL hCG (Pregnesin
5000 IE, 0,417-1mg hCG, Serono, Unterschleißheim, Deutschland) für weitere 48 Stunden
stimuliert. Nach Abziehen des Überstandes erfolgte wieder das Einfrieren bei -80°C mit 1 mL
Natriumkarbonat.
IGF-II (15 ng/mL = 2 nM/mL) und hCG (142 ng/mL) wurden als negative Kontrollen, IGF-I
(100 nM/mL) und Insulin (1µM/mL) als positive Kontrollen für die IGFBP-2 Bestimmung
benutzt. Es gelang der Nachweis in humanen GLZ-Kulturen, dass 100ng/mL hCG die IGFBP-2
Produktion und Sekretion auf 32 % der Kontrolle senkt und dass IGF-II dies dosisabhängig
erreicht. IGF-I zeigte keine Effekte (Cataldo et al. 1993). GLZ-Kulturen von Rindern zeigten
eine erhöhte Ausschüttung von IGFBP-2 nach Stimulation mit IGF-I und Insulin, aber nicht
durch IGF-II (Grimes und Hammond 1992). Die Stimulation erfolgte nach dem bekannten
Verfahren.
51
3.2.5. Radioimmunoassay für IGF-II
Ein Radioimmunoasssay-Kit von Mediagnost (Mediagnost, Reutlingen, Deutschland) diente
zur Konzentrationsbestimmung von IGF-II. Die Standardreihe bestand aus acht verschiedenen
Spiegeln mit 0.0, 0.4, 0.9, 2.0, 4.5, 10.0, 22.5 und 50.0 ng/mL. Die Kontrollen hatten eine
Konzentration nach einer 1:100 Verdünnung von 8 +
/- 0.8 ng/mL und 2.65 +
/- 0.35 ng/mL. Die
Messung der Standards, Kontrollen und unverdünnten Proben erfolgte als Doppelbestimmung.
Es wurde je 100 µL Standard, Kontrolle und Proben in entsprechende Röhrchen pipettiert. Auf
die Proben wurden ausserdem noch 10 µL Ansäurepuffer gegeben. Das Röhrchen der
nichtspezifschen Bindung (NSB) erhielt 100 µL Dilutionpuffer und 100 µL Kanninchen-
Immunglobulin. Daraufhin erfolgte die Pipettierung von 100 µL des Antiserums mit dem ersten
Antikörper (anti-humanes IGF-II), bestehend aus Kaninchen-IgG und rekombinantem humanen
IGF-I, auf alle Röhrchen, ausser die der Totalaktivität (TA) und NSB. Nach kuzer Mischung
schloss sich die Gabe von je 100 µL 125
I-IGF-II (< 50 kBq) an und die Inkubation von
mindestens 48 Stunden bei 2-8°C. Das Präzipitatiosreagenz (500 µL) mit dem zweiten
Antikörper (anti-Kaninchen-Immunglobulin) wurde in alle, ausser TA, Röhrchen pipettiert,
woraufhin diese mittels des Vortex gemischt und bei 2- 8°C eine Stunde lang inkubiert wurden.
Es folgte die Zugabe von 1 mL eiskalten Wassers und die Zentrifugation bei 2-8°C und 3000g
für 30 Minuten. Der Überstand wurde dekantiert und die Aktivität aller Röhrchen im
Gammacounter für eine Minute lang gemessen.
Die Eichkurve wurde anhand der Ergebnisse der Standardreihe berechnet und die
Konzentration der Proben an dieser erhoben.
52
3.2.6. Radioimmunoassay für IGFBP 2
Zur quantitativen Bestimmung von IGFBP 2 wurde ein Radioimmunoassay-Kit von
Diagnostic System Laboratories (DSL, Sinsheim, Deutschland) benutzt. Die Werte der
Standards, Kontrollen und Proben wurden anhand von Doppelbestimmung erhoben. Es
wurden sechs Standards mit 0, 2.0, 5.0, 20.0, 50.0 und 100.0 ng/mL und zwei Kontrollen
(10+/-3 ng/mL, 30+/-9 ng/mL) verwendet.
200 µL Standard, Kontrolle oder unverdünnte Probe wurde auf den Boden des
entsprechenden Röhrchen gegeben, neben der Pipettierung von 300 µL Nullstandard in die
NSB-Röhrchen (nichtspezifische Bindung). Es folgte die sofortige Gabe von 100 µL IGFBP-2
Antiserum (polyklonales Kaninchen-IGFBP-2 Antiserum) in alle Röhrchen, außer NSB und
TA (Totalaktivität). Nach Mischung der Röhrchen mittels eines Vortex schloss sich die
Inkubation bei Raumtemperatur für 4 Stunden an.
Als nächster Schritt wurde 100 µL 125
I-markiertes IGFBP-2 (< 185 kBq) in alle Röhrchen
gegeben und wiederum votiert und für 16-20 Stunden bei 2-8°C inkubiert.
1 mL Präzipitationsreagenz bestehend aus Ziege-Anti-Kaninchen-Gammaglobulin wurde in
alle Röhrchen, außer TA, pipettiert und bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubiert.
Daraufhin folgte eine Zentrifugation bei 1500g für 30 Minuten, die Dekantierung des
radioaktiven Überstandes aller, außer TA, in entsprechende Behälter und das Ausklopfen der
Röhrchen auf Fließpapier.
Zum Abschluss wurden alle Röhrchen 1 Minute lang im Gammacounter gemessen.
Aus den Messergebnissen der Standards wurde eine Eichkurve erstellt.
Die Sensitivität des Tests betrug 0,5 ng/mL für IGFBP 2. Inter- und Intra-Assay Variationen
lagen unter 8,5%.
53
3.2.7. Enzymimmunoassay für Placenta-assoziertes Plasma Protein (PAPP-A)
Die Messung der PAPP-A Konzentration wurde anhand eines kommerziell erhältlichen EIA-
Kits der Firma BioCat (Biocat GmbH, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt. In eine mit
anti PAPP-A Antikörpern beschichtete 96 Microwellplatte wurden zunächst je 100µL PBS als
Probenverdünnung pipettiert, worauf sich die Applikation der Proben und der Standards mit
je 10 µL anschloss. Für diese Messung wurden gepoolte Proben einer Patientin, die anhand
eines Centricon Zentrifugenfilterhilfsmittels (Millipore, USA) hochkonzentriert wurden,
verwendet. Die Referenzstandards standen in Konzentrationen von 0, 0.1, 0.3, 1, 3 und 8
mIU/mL zur Verfügung. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur von 60 Minuten wurde
der Überstand verworfen. Ein mehrmaliger Waschprozess mit Tris-Buffer Saline als
Waschpuffer folgte. Jeder Wellinhalt wurde mit Enzymkonjugat, Anti PAPP-A Antikörper
mit Meerrettichperoxidase vermischt und für weitere 15 Minuten inkubiert. Erneute
Abschüttung des Überstandes und Waschung. Beim nächsten Schritt erfolgte die
Aufmischung mit Tetramethylbenzidin Lösung (TMB) und nach einer zehnminütigen
Inkubation wurden die Reaktionen mit 100 µL Stopplösung (HCL Lösung) beendet. Die
optische Densität wurde mittels eines Microplattenleser bei 450 nm ermittelt. Die Ergebnisse,
der als Duplikate gemessenen Proben wurde anhand der Standardkurve errechnet. Als
Negativkontrollen wurde bei dieser Messung Wasser benutzt.
3.2.8. Radioimmunoassay für IGFBP-4
Da es für den Nachweis von IGFBP-4 kein komerziell erhältliches Kit zu Verfügung steht,
wurde der Versuch unternommen aus einzelnen Komponenten ein Radioimmunoassay
herzustellen.
54
Rekominantes humanes IGFBP-4 der Firma RD Systems (Wiesbaden, Deutschland) stand
nach Rekonstitution mit sterilem PBS incl. 1% BSA als Standard in einer
Ausgangskonzentration von 5µg/ 20µl zur Verfügung. Die Standardreihe des ersten Versuchs
bestand nach entsprechender Verdünnungsreihe aus 15 unterschiedlichen Konzentrationen,
die von 6 pg/ml bis 100 ng/ml reichten.
Für das erste Antiserum wurde Anti-human IGFBP-4 Antikörper (RD Systems, Wiesbaden,
Deutschland), der in 1 ml PBS aufgenommen eine Ausgangskonzentration von 100 µg/ml hat,
genutzt. Beim Einsatz im Assaypuffer des RIA wurden versuchsweise drei verschiedene
Endverdünnungen getestet: 1:750 000, 1:375 000 und unverdünnt. Als Tracer diente
wiederrum rekombinantes IGFBP-4, welches zur Markierung mit 125
J zur Firma Hartmann
Analytic (Braunschweig, Deutschland) verschickt wurde. Im Assaypuffer lag eine Aktivität
von 100 000 cpm/ 500 µl vor. Das zweite Antiserum bestand aus donkey anti-sheep/ goat
antibody (IDS, Boldon, UK), welches nach einer 1:6 Verdünnung mit Assaypuffer seinen
Einsatz fand.
Für den ersten Durchgang des IGFBP-4 RIA wurden 200µl Assaypuffer in die Röhrchen der
Nichtspezifischen Bindung (NSB), die Standards (n=15) mit Nullwert und die Proben, in
Doppelbestimmung in einer Menge von 50 µl gegeben. Daraufhin erfolgte die Zugabe von
200 µl Antiserum I, anti-human Antikörper IGFBP-4 in PBS, gestaffelt in den erwähnten drei
verschiedenen Konzentrationen in alle Röhrchen ausser der NSB und der Totalaktivität. Der
Tracer, J 125 markiertes IGFBP-4, wurde in einer Menge von 500 µl in alle Reagenzgefäße
pipettiert und anschließend folgte die Inkubation des RIA-Ansatzes für 16-20 Stunden.
Die Trennung begann mit der Gabe von 50 µl Humanserum in alle Röhrchen außer NSB und
von 100 µl Antiserum II (donkey anti-sheep/goat) in der genannten 1:6 Verdünnung in alle
Reagenzien bis auf die der Totalaktivität. Polyethylenglycol (PEG) wurde in einer
55
Konzentration von 7% und einer Quantität von 1 ml in die Gesamtheit der Röhrchen
abzüglich Totalaktivität pipettiert. Nach einer Inkubation bei Raumtemperatur für 20 Minuten
schloss sich die Zentrifugation bei 3000 g für 20 Minuten an. Vor der einminütigen Messung
im Gammazählgerät erfolgte die Absaugung des Überstandes.
Bei der zweiten Version des IGFBP-4 RIA erfolgte der Versuchsaufbau nach dem gleichen
Prinzip, lediglich einige Konzentrationen wurden alteriert. Die Standardreihe erstreckte sich
über eine Bandbreite von 1000 ng/ml bis 3,9 ng/ml. Das Antiserum I wurde in zwei neuen
Verdünnungen getestet, 1:3750 und 1:375. Die restlichen Mengen, Konzentrationen und
Ablauf waren mit dem ersten Versuch identisch.
3.2.9. Konzentrierung der Proben
Für den Fall, dass in den Proben die Konzentration von IGFBP-4 unterhalb der
Nachweisgrenzes des RIA liegt und um diese Möglichkeit von der vollkommenden
Abwesenheit des Wachstumsfaktors abgegrenzen zu können, wurden spezielle
Zentrifugenröhrchen (Millipore Cooperation, Bedford, Ma, USA) zur Hilfe genommen. Diese
Centriconröhrchen (YM-10) sind mit einem Filter ausgestattet, der einen cut-off bei 10 000
MW hat. Die Proben einer Patientin wurden gepoolt in jeweils ein Filterröhrchen gegeben und
bei 4000 g für 45 Minuten zentrifugiert. Danach erfolgte die Ausspülung des Filters mit H2O
und die nochmalige Zentrifugation für 5 Minuten. Der hochkonzentrierte Probenrückstand
wurde analog den ursprünglichen Proben in den Versuchen eingesetzt.
3.2.10. Proteinbestimmung
Um die Anwesenheit von Protein in den Proben zu überprüfen wurde der Bio-Rad Protein
Assay (Bio-Rad Laboratories GmbH, München) herangezogen. Eine Standardreihe, wofür der
56
Bio-Rad Protein Assay Standard-II (lyophilized bovine serum albumin) zur Verfügung stand,
wurde nach entsprechender Verdünnung mit H2O in folgenden Konzentrationen eingesetzt:
14, 7, 3.5, 1.75 ng/ml. Die Proben wurden mit H2O auf eine Verdünnung von 1:100 gebracht.
Die folgende Bestimmung begann mit der Einpipettierung von jeweils 800 µl Standard, Probe
und H2O als Leerwert in die Photometerröhrchen, woraufhin sich die Gabe von 200 µl Bio-
Rad Protein Assay Reagenz anschloss. Nach kurzem Schütteln und Inkubation bei
Raumtemperatur für 5 Minuten erfolgte die Extinktionsmessung im Photometer nach
Kalibrierung gegen H2O bei einer Wellenlänge von 585 nm. Für die Errechnung der
Probenkonzentrationen war die Multiplikation mit dem Faktor 100 aufgrund der vorherigen
Verdünnung Voraussetzung.
3.2.11. Laemmli Gel
Das Laemmli Gel setzt sich aus 30 ml Trennungsgel und 5 ml Sammelgel zusammen.
Für das Trenngel wurde eine 12,5% T range gewählt und die Lösung setzte sich aus folgenden
Substanzen zusammen: 12,5 ml Acrylamide Stock (Bio Rad), 7,5 ml 1,5 M Tri-
(hydroxymethyl)-amminomethanchlorid (TrisCl) (pH 8.8), 0,3 ml 10% Sodium Dodecyl
Sulfat (SDS), 9,6 ml deionisiertes Wasser, 150 µl 10% Ammoniumpersulfat (APS) und 20 µl
N, N, N’, N’-Tetramethylenethylendiamin (TEMED).
Das 4% Sammelgel enthielt 0,67 ml Acrylamid Stock, 1,25 ml 0,5 M TrisCl (pH 6.8), 0,05 ml
10% SDS und 3 ml deioisierendes Wasser. Kurz bevor dem Gießen des Sammelgels erfolgte
die Zugabe von 25 µl 10% APS und 2,5 µl TEMED.
Zuerst wurde das Trenngel in die entsprechenden Kammern gegossen und nach Zugabe von
Buthanol für 30 Minuten ausgehärten. Danach erfolgte der Abguß des Buthanols und die
57
Befestigung des Kamms. Das auf Eis gekühlte Sammelgel wurde vorsichtig auf das Trenngel
aufgetragen und für eine weitere halbe Stunde ausgehärtet.
3.2.12. Western Blot für IGFBP-4
Die Proben wurden nach vorheriger Proteinkonztrationsbestimung in 5 µg Portionen
eingesetzt. Diese Menge befand sich in einer 12 µl Lösung, die sich aus 9 µl Probenlösung,
welche mit 3 µl Probenpuffer verdünnt wurden, zusammensetzt. Nach siebenminütigem
Kochen wurden die 12 µl Probe in die Taschen des Gels aufgetragen. Als Kontrolle diente
eine Standardreihe, die sich 100 ng bis 1000 ng erstreckte und für welche das IGFBP-4
Protein herangezogen wurde. Nachdem die Kammern mit Elektrophoresepuffer gefüllt wurde
die Apparatur bei 80 V und 70 mA für 90 Minuten lang laufen gelassen. Daraufhin erfolgte
das Blotten, das Gel wurde auf eine Membran gelegt und das Transferieren fand bei 10 V und
80 mA für 2 Stunden statt. Das 1-2 stündige Blocken schloss sich mit 5% Milchlösung an.
Der erste Antikörper, anti-IGFBP-4 (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) in einer 1:1000
zu 1:5000 Verdünnung und als Kontrolle β-Actin in einer 1:7500 Verdünnung wurden über
Nacht bei Raumtemperatur eingesetzt. Der nächsten Versuchsschritt begann mit der
mehrmaligen Waschung mit 1xPBS und setzte sich mit der Inkubation des zweiten
Antikörpers, donkey anti-goat IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology) in einer 1:2000
Verdünnung und donkey anti-mouse für β-Actin in 15 ml Milchlösung für eine Stunde fort.
Erneute Waschung mit 1xPBS über 60 Minuten. Nach Detektion mittels ECL Western Blot
Detektion Reagent erfolgte die Belichtung nach 1, 5, 15, 30 und 60 Minuten.
58
3.3. Datenpräsentation und Statistik
Die erhobenen Daten wurden mittels des Statistikprogramms Prism 2.01 (GraphPad Prism
,
San Diego, USA) erfasst und analysiert. Jedes Experiment wurde mit Granulosaluteinzellen
von einer Patientin und in dreifacher Ausführung durchgeführt. Die Daten der einzelnen
Versuche wurden kombiniert und die Ergebnisse der Versuche zur quantitativen Bestimmung
der IGF-II, IGFBP-2 und PAPP-A Konzentrationen wurden in % des Basalwertes angegeben.
Der Basalwert wurde als 100% definiert. Die Abbildungen zeigen Mittelwerte und
Standardabweichungen vom 9-20 Experimenten. Die verschiedenen Behandlungsgruppen
wurden für statistische Unterschiede mit dem Mann Whitney U-Test oder bei mehr als zwei
Gruppen mit einer Varianzanalyse und anschließendem Newman-Keuls Test untersucht. Ein
p < 0,05 wurde als signifikant angenommen. Für die Abbildungen wurden repräsentative
Daten ausgewählt.
59
4. Ergebnisse
4.1. Patientinnencharakteristik
Für die Experimente konnten zwei verschiedene Patientinnenkollektive aufgrund der
unterschiedlichen Stimulationsprotokolle aufgestellt werden. Die erste Gruppe von 25
Patientinnen, die der Stimulation mit GnRHag und FSH untergingen, waren im Durchschnitt
33,88 Jahre alt und zeigten einen mittleren Serumöstradiolwert zum Zeitpunkt der
Follikelpunktion von 2561,35 pg/mL. Bei der Punktion wurden zwischen 2 und 30 Oozyten
gewonnen, was einen Durchschnittswert von 15 Eizellen ergibt. In der anschließenden
Granulosazellpräparation konnten 512 400/mL durchschnittlich isoliert werden mit einer
Bandbreite von 200 000 – 2 250 000 Zellen pro mL.
Die zweite Gruppe an Patientinnen erhielt eine COH mit GnRHant und FSH und zählte
wiederrum 25 Frauen, die ein mittleres Alter von 31,9 Jahren aufwiesen. Der
durchschnittliche Serumöstradiolwert am Tag der Gewinnung der Oozyten betrug 2232,5
pg/mL und während der Präparation konnten 150 00 bis 1 290 000/mL Zellen mit einem
Mittelwert von 469 500/mL gewonnen werden. Die Anzahl der Oozyten betrug
durchschnittlich 12,5 und die Ausbeute rangierte zwischen 5 und 32 Eizellen.
Agonisten-Protokoll Antagonisten-Protokoll
Patientinnen (n) 25 25
Alter in Jahren 33,88 31,9
E2-Konzentration (pg/ml) 2561,35 2232,5
Oozyten (n) 15 (2-30) 12,5 (5-32)
GLZ (n/ml) 512 400 (200 000-2 250 000) 469 500 (150 000-1 290 000)
Abb. 4.1: Gegenüberstellung der Charakteristika der zwei Gruppen, die mit dem Agonisten-
oder Antagonisten- Protokoll stimuliert worden sind.
60
4.2. Effekte der in-vivo Behandlung von Patientinnen mit Cetrotide plus Gonadotropin und
Triptorelin plus Gonadotropin auf die basale Sekretion von IGF-II und IGFBP-2.
Zum Ausschluss von einer Beeinflussung der verschiedenen Stimulationsprotokolle auf die
Ergebnisse der kultivierten Granulosazellen wurde die in-vivo Effekte von Cetrorelix mit
denen von Tritporelin verglichen. Dafür wurden die Konzentrationen von IGF-II und
IGFBP-2 in der unstimulierten Kulturflüssigkeit gemessen. Vergleichend konnten keine
signifikanten Unterschiede zwischen dem langen und kurzen COH Protokoll weder in der
IGF-II noch in der IGFBP-2 Synthese aufgezeigt werden. Interindividuelle Schwankungen in
den Absolutwerten waren zu erwarten und wurden besätigt, aber intraindividuelle Differenzen
konnten anhand Mehrfachbestimmung ausgeschlossen werden. Der nachgewiesene Bereich
von IGF-II reichte bei GnRH-antagoistisch behandelten Frauen 0,472-0,942 ng/ml und bei
GnRH-agonistisch stimulierten Patientinnen 0,693-1,107 ng/ml. Für IGFBP-2 ergibt sich
folgende Bandbreite der Absolutwerte: die Cetrorelixbehandlung zeigte Ergebnisse zwischen
18,78 und 24,79 ng/ml und die Verabreichung von Triptorelin Werte von 10,19 und 38,89
ng/ml.
IGF-II
Cetrorelix Triptorelin
0.0
0.5
1.0
1.5
ng
/m
l
61
Abb. 4.1: Effekte der in-vivo Behandlung mit Cetrorelix und Triptorelin auf die IGF-II
Produktion
Abb. 4.2: Effekte der in-vivo Behandlung mit Cetrorelix und Triptorelin auf die IGFBP-2
Produktion
4.3. Effekte der in-vitro Behandlung von kultivierten Granulosaluteinzellen mit Triptorelin,
Cetrorelix und Ganirelix auf die Produktion von IGF-II
Bei der Durchführung der Experimente über die Syntheseleistung der kultivierten humanen
GLZ bezüglich des IGF-II wurden alle Tests in drei- oder mehrfacher Ausführung absolviert,
um die Validität des Assays zu bestätigen. Die Auswertung der Ergebnisse zeigte einen
Meßbereich von 0,42 - 0,89 ng/ml, welches daraufhin deutet, dass genug IGFBPs durch
Ansäuerung extrahiert wurde und somit nicht mit dem Assay inferieren konnte. Die
Sensitivität des Test wurde durch die Stimulation der GLZ mit hCG und dessen Einfluss auf
die Synthese des IGF-II überprüft. HCG diente als Positivkontrolle und 70 ng/ml hCG
erzeugte in unseren Versuchen eine signifikante Steigerung der IGF-II Sekretion um 459,5
%. In der Literatur wurde die Erhöhung der Syntheseleistung von IGF-II durch hCG von
IGFBP-2
Cetrorelix Triptorelin
0
10
20
30
ng
/m
l
62
Ramasharma und Li (1987) beschrieben. Dadurch wird gezeigt, dass der von uns
angewendete Assay empfindlich genug ist, um stimulatorische oder hemmende Effekte der
GnRH-Agonisten und GnRH-Antagonisten auf die IGF-II Produktion in kultivierten
Granulosaluteinzellen darzustellen. Weder Triptorelin, noch Cetrorelix oder Ganirelix waren
nach einer Stimulationsdauer von 48 Stunden in der Lage die IGF-II Sekretion der GLZ
signifikant zu alterieren. Ausserdem konnte kein Unterschied zwischen den beiden
Untersuchungsgruppen, Stimulation der Patientinnen mit GnRH-Agonisten gegenüber GnRH-
Antagonisten, differenziert werden.
Abb. 4.3: Kultivierten humanen Granulosaluteinzellen wurden für 48 h mit Ganirelix,
Cetrorelix und Triptorelin, je 1 nM behandelt. IGF-II wurde im RIA gemessen. Unbehandelte
Kontrollen wurden als 100% gesetzt.
IGF-II
Basal Ganirelix Cetrorelix Triptorelin
0
50
100
150
% b
asal
63
Abb. 4.4: Kultivierten humanen Granulosaluteinzellen wurden für 48 h mit 70 ng/ml hCG
behandelt. IGF-II wurde im RIA gemessen. P < 0,05.
4.4. Effekte der in-vitro Behandlung von kultivierten Granulosaluteinzellen mit Triptorelin,
Cetrorelix und Ganirelix auf die Produktion von IGFBP-2
In dieser Versuchsreihe erfolgte ebenso die mehrfache Ausführung der Experimente und aus
der Literatur bekannte Kontrollen diente Insulin als positiver Vergleich (Grimes und
Hammond 1992) und IGF-II als negativer Maßstab (Cataldo et al. 1992). IGF-II veränderte
die IGFBP-2 Ausschüttung zu 90,3 % des unstimulierten Basalwertes. Insulin erreichte die
IGFBP-2 Stimualtionssteigerung auf 112,1 % im Vergleich zur basalen Sekretion, welches
mit einem p<0,05 eine statistische Signifikanz aufweist. Die
Wachstumsfaktorsyntheseleistung unter der Stimulation der GnRH-Analoga zeigte widerrum
keinen signifikanten Veränderung im Sinne einer Hemmung oder Stimulation.
IGF-II
Basal HCG
0
100
200
300
400
500
% b
asal
64
Abb. 4.5: Kultivierte humane Granulosaluteinzellen wurden für 48 h mit Ganirelix,
Cetrorelix und Triptorelin, je 1 nM behandelt. IGFBP-2 wurde im RIA gemessen.
Unbehandelte Kontrollen wurden als 100% gesetzt.
Abb. 4.6: Kultivierte humane Granulosaluteinzellen wurden für 48 h mit IGF-II und Insulin
IGFBP-2
Basal % Ganirelix % Cetrorelix % Triptorelin %
0
25
50
75
100
125
% b
asal
IGFBP-2 Kontrollen
Basal % IGF-II % Insulin %
0
25
50
75
100
125
% b
asal
65
behandelt. IGFBP-2 wurde im RIA gemessen. Unbehandelte Kontrollen wurden als 100%
gesetzt. Insulin: p<0,05, IGF-II: p>0,05.
66
4.5. Effekte der in-vitro Behandlung von kultivierten Granulosaluteinzellen mit Triptorelin,
Cetrorelix und Ganirelix auf die Produktion von PAPP-A
Die Auswertung der Ergebnisse der ELISA-Messung erbrachten als Resultate eine
unveränderte PAPP-A Konzentration in GnRH-Antagonisten und GnRH-Agonisten
behandelten Granulosaluteinzellen. Die PAPP-A Spiegel der Ganirelix-stimulierten Zellen lag
im Bereich von 102,5%, der Cetrorelix behandelten GLZ von 95,8% und von 115,4% bei den
mit Triptorelin bearbeiteten Zellen im Vergleich zu Proben die von unbehandelten GLZ
gewonnen wurden. Diese Veränderungen im Vergleich zu der Gruppe der unbehandelten
Zellen ist nicht signifikant, da p > 0,05. Die Negativkontrolle Wasser, sowie die
unkonzentrierten Proben blieben unterhalb der Nachweisgrenze.
Abb. 4.7: Kultivierte humane Granulosaluteinzellen wurden für 48 h mit Ganirelix,
Cetrorelix und Triptorelin, je 1 nM behandelt. PAPP-A wurde im EIA gemessen.
Unbehandelte Kontrollen wurden als 100% gesetzt.
PAPP-A
Ganirelix Cetrorelix Triptorelin
0
50
100
150
% b
asal
67
4.6. Effekte der in-vitro Behandlung von kultivierten Granulosaluteinzellen mit Triptorelin,
Cetrorelix und Ganirelix auf die Produktion von IGFBP-4
Nach erfolgloser Suche nach einer schon hinreichend getesteten Nachweismethode für
IGFBP-4, wurde der Versuch gestartet aus einzelnen Komponenten ein Radioimmunoassay
herzustellen. Der erste Durchlauf mit einer umfangreichen Standardreihe und drei
verschiedenen Konzentrationen des Antiserums blieb erfolglos. Eine Standardkurve konnte
trotz der drei verdünnnungen nicht reproduziert werden. Der zweite Ansatz des
Radioimmunoassays beinhaltete eine erweiterte Standardreihe und zwei weniger konzentrierte
Antiseren. Diesmal konnte eine Standardkurve mit leichten Abfall gemessen werden. Die
Proben blieben dennoch unterhalb der Nachweisgrenze. Der niedrigste gemessenen
Standardwert lag bei 3,9 ng/ml.
Die Idee einen Western Blot als Nachweismethode zu probieren schloss sich an. Zunächst
musste dennoch geklärt werden, ob überhaupt Protein in der Probe enthalten war.
Die Proteinbestimmung zeigte in Ganirelix-stimulierten Proben eine Konzentration von 7,22
mg/ml, in Cetrorelix-behandelten einen Spiegel von 7,35 mg/ml und in Triptorelin-
stimulierten einen von 7,33 mg/ml. Die unstimulierten Kontrollproben wiesen 6,8 mg/ml als
Proteinkonzentration auf.
Im Western Blot war eine Standardreihe von 100 ng bis 1000 ng nachweisbar. Die Bande der
eingesetzten Proben, ob direkt, konzentriert oder gepoolt und konzentriert, blieb leer.
Aufgrund fehlender repräsentativer Daten wurde auf Abbildungen verzichtet.
68
5. Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurden die Effekte von GnRH-Analoga auf IGF-II, IGFBP-2,
IGFBP-4 und PAPP-A, der spezifischen IGFBP-4 Protease, in humanen
Granulosaluteinzellkulturen untersucht. Es zeigte sich, dass weder Triptorelin noch die
GnRH-Antagonisten Cetrorelix und Ganirelix einen Einfluß auf die gemessenen
entscheideneden Faktoren des ovariellen IGF-Systems ausübten.
Die Granulosazellkulturen entstanden aus der Follikelflüssigkeit von Patientinnen nach COH,
die entweder den GnRH-Agonisten oder –Antagonisten erhalten hatten. Es wurden gezielt
Granulosaluteinzellen für die Herstellung der Kulturen angewedet, da nach Ergebnissen von
Brus et al. GnRH-Rezeptoren ausschließlich in luteinisierten Granulosazellen vorkommen
und in Granulosazellen nicht detektiert werden können (Brus et al. 1997). Da es in der
Fragestellung um die mögliche Wirkungen von GnRH-Analoga auf das ovarielle
Wachstumsfaktorsystem der IGF-Familie handelt und der GnRH-Rezeptor eine
Übermittlungsfunktion übernehmen könnte, ist die Verwendung von Granulosaluteinzellen
für die durchgeführten Versuche grundlegende Vorraussetzung.
Die Zellen wurden in vitro mit jeweils 1 nM Cetrorelix, Ganirelix und Triptorelin für 48
Stunden stimuliert. Die Stimulationsdosis von 1 nM der jeweiligen GnRH-Analoga wurde
gewählt, um den Substanzspiegel während COH in einem Follikel widerzuspiegel und so ein
möglichst physiologisches in vitro Modell den Experimenten als Grundlage zu bieten
(Ludwig et al. 2002a). Es wurden keine Konzentrationsänderungen während der Versuche
vorgenommen, da während der COH nur feste Standarddosierungen der GnRH Analoga
verwendet werden und nur die Konzentration der Gonadotropine variiert wird. Ein weiterer
wichtiger Punkt ist Wahrung der Kontinuität und die Vergleichbarkeit mit vorherigen Studien,
69
die von dieser Arbeitsgruppe durchgeführt worden sind (Ortmann et al. 1998, Demirel et al.
2000, Weiss et al. 2001).
Diese Behandlung der Zellen fand nach einer vorherigen Inkubationszeit von ebenfalls 48
Stunden statt, welche gewährleisten sollte, dass die in vivo Verabreichung der GnRH-
Analoga minimal mit der in vitro Stimulation interagiere. Die Anwesenheit des GnRH-
Rezeptors und der GnRH-Rezeptor mRNA in frisch dissoziierten und kultivierten
Granulosazellkulturen nach verschiedenen Inkubationszeiten wurde mittels PCR bestätigt
(Peng et al. 1994). In jeder Zellkultur blieb ein Viertel der Granulosaluteinzellen unbehandelt,
die nur mit Medium in Berührung kamen. Es befand sich zusätzlich in dieser Fraktion nur ein
Serum Replacement, welches ohne Zusatz von Wachstumsfaktoren ist und somit sollte eine
mögliche Beeinflussung dieser auf die unstimulierten Granulosaluteinzellen ausgeschlossen
werde. Diese Maßnahmen sicherten stets einen möglichen Vergleich mit einem Basalwert.
Die Ergebnisse des IGF-II Assays zeigten, dass weder Triptorelin noch die Vertreter der
GnRH-Antagonisten die Akkumulation von IGF-II signifikant im Bezug zum Basalwert
veränderten. Um jedoch die mangelnde Sensitivität des Assays ausschließen zu können,
wurden aus der einschlägigen Literatur bekannte Hormone oder Wachstumsfaktoren
hinzugenommen, die nachweislich die Produktion des IGF-II alterieren. Im Falle des IGF-II
fiel die Wahl auf hCG, welches den vorherigen Experimenten gerecht wurde (Ramasharma et
Lin 1987) und die IGF-II Syntheseleistung über das vierfache steigerte. So konnte die
Unsensitivität des Assays als Grund für die fehlende Beinträchtigung der IGF-II Synthese
ausgeschlossen werden.
Die Analyse der Ergebnisse bezüglich der PAPP-A zeigte eine unveränderte
Proteasenausschüttung nach Stimulation mit den GnRH-Antagonisten und dem GnRH-
Agonisten Triptorelin im Vergleich zum Basalwert. Für diese Versuche wurden
70
hochkonzentrierte Proben verwendet, da in den Ausgangsexemplaren die PAPP-A
Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze blieb und somit die Anwesenheit von PAPP-A
in der Kulturflüssigkeit bestätigte.
Die Untersuchungen spiegeln die bisher bekannten physiologischen Zustände der IGF-Familie
und der Verhältnisse untereinander wider. Die Tatsache, dass sowohl IGF-II und PAPP-A, die
als mitogene und antiapoptoische Faktoren agieren, in den Granulosaluteinzellkulturen
nachweisbar waren als auch durch die Behandlung mit GnRH-Analoga nicht in ihrer
ursprünglichen Relation verändert waren, lässt eine positive Schlussfolgerung zu (Giudice et
al. 1995, Conover et al. 2001). Diese beinhaltet die Unversehrheit des intraovariellen IGF-
Systems und dessen elemantaren physiologischen Gleichgewicht durch die in vitro
Applikation von Cetrorelix, Ganirelix und Triptorelin. Da besonders IGF-II und PAPP-A in
östrogen-dominanten, größeren Follikeln und in den Leitfollikeln in erhöhten Spiegeln
vorzufinden sind und sie somit als Marker für die erfolgreiche Follikulogenese betrachtet
werden können, sind die Ergebnisse dieser Arbeit in dieser Hinsicht zu interpretieren
(Hurwitz et al. 2000, Giudice 2001).
Auch der zweite Untersuchungspunkt, das IGFBP-2 konnte durch die Stimulation mit den
GnRH-Analoga nicht in seiner Syntheseleistung verändert werden. Die mit Ganirelix,
Cetrorelix und Triptorelin behandelten Zellen zeigten keine signifikanten
Konzentrationsunterschiede im Vergleich zu den unstimulierten Granulosaluteinzellen, die als
Basalwert dienten. Ebenfalls wurde die Sensitivität des Radioimmunoassays für IGFBP-2
anhand von Positiv- und Negativkontrollen überprüft. Diesmal reagierten die kultivierten
Zellen auf die hemmende Wirkung des IGF-II (Giudice 1992) und die Aktivierung von
Insulin (Cara 1994) mit entsprechender verminderter bzw. erhöhter IGFBP-2 Ausschüttung.
Der Assay kam wiederrum als Fehlerquelle nicht in Betracht.
71
Zwar gelang der Nachweis von IGFBP-4 weder anhand eines Radioimmunoassays noch
mittels Western Blot, aber dieser Mangel kann unter Beachtung der Literaturangaben erörtert
werden. In vielen Arbeiten in denen die natürliche Zusammensetzung des IGF-Systems
untersucht worden ist, hat sich folgender Sachverhalt herrauskristallisiert. IGFBP-4 und auch
IGFBP-2 gehören zu der auf die Follikulogenese hemmend wirkende Fraktion der
Wachstumsfaktorenfamilie. Daher ist auch der fehlende Nachweis des IGFBP-4, der trotz
Hochkonzentrierung und Anwendung verschiedener Experimentieransätze nicht erfolgte, im
Gesamtblick auf die Literatur nicht als unpassend zu betrachten. IGFBP-4 ist nur in
atretischen, nicht aber in sich gesund entwickelden Follikeln zu lokalisieren (Peng et al.
1996). Die erfolgreiche Detektion von IGFBP-2 in den Versuchen dieser Arbeit gibt ebenso
die bisherigen Erfahrungen mit dem IGF-System wieder. Im Gegensatz zu IGFBP-4 ist
IGFBP-2 in primordialen, preantralen und antralen Follikeln nachweisbar, was sich mit den
vorliegenden Ergebnissen deckt. Das Vorhandensein von IGFBP-2 neben IGFBP-4 in
atretischen Follikeln ist bekannt (Cataldo und Giudice 1992, San Roman und Magoffin 1993,
Giudice et al. 1995).
Mit diesen Resultaten konnten wir zum ersten Mal zeigen, dass GnRH-Antagonisten keinen
Einfluss auf das menschliche ovarielle IGF-System haben und aus diesem Grund ist kein
direkter Vergleich mit dem aktuellen Stand der Forschung möglich. Die Ergebnisse, die man
bezüglich der Steroidbiosynthese und der cAMP-Signaltransduktion erhoben hat, spiegeln
aber indirekt die dieser Arbeit wider.
Im humanen Ovar sind die Granulosazellen der primäre Ort der IGF-II Synthese im Vergleich
zur IGF-I Genexpression (Hernandez et al. 1992, El Roiey et al. 1993, Mason et al. 1994).
IGF-I mRNA ist kaum im menschlichen Ovar nachweisbar und in den Granulosazellen zu
keinem Zeitpunkt der Follikelreifung, während die Synthese von IGF-II in
72
Granulosaluteinzellen und präovulatorischen Granulosazellen lokalisiert ist (El Roiey et al.
1993, El Roiey et al. 1994). IGF-II stimuliert, als primäres IGF im Ovar, die
Steroidbiosynthese in Synergie mit FSH in den Granulosazellen. Zum Zeitpunkt der
Follikelselektion erfolgt ein dramatischer Anstieg der IGF-II Produktion in den
Granulosazellen (Giudice 2001).
Im humanen Ovar sind IGFBP-2 und –4 dafür bekannt, dass sie die Aktion von IGF-II
hemmen, welche sie vorzugsweise und hauptsächlich binden. IGFBP-2 und –4 werden in
Granulosazellen und Thekazellen von atretischen Follikeln lokalisiert, sind in primordialen,
preantralen und antralen Follikeln geringfügig nachweisbar (Peng et al. 1996). Die
Follikelflüssigkeit von atretischen und androgen-dominanten Follikeln enthält hohe
Konzentrationen von IGFBP-2 und –4, folglich niedrige Spiegel und verminderte Aktivität
von IGF-II (Cataldo und Giudice 1992, San Roman und Magoffin 1993, Giudice et al. 1995).
Im Gegensatz dazu findet man höhere Ansammlungen von niedermolekularen IGFBP-2 und
–4 Bruchstücken in dominaten Follikeln, welches für eine vermehrte Aktivität der IGFBP-
Proteasen spricht (Cwyfan Hughes et al. 1997). Dieser Zustand führt zu einer geringeren
Affinität der IGFBP-2 und –4 für IGF-II.
Weiterhin wurde eine Protesaeaktivität in der Follikelflüssigkeit von sich differenzierenden
und nicht von atretischen Follikeln beobachtet (Chandrasekher et al. 1995, Iwashita et al.
1996). Diese spezifischen Proteasen für IGFBP-4 wurden als das längst bekannte pregnancy-
associated plasma protein-A (PAPP-A) identifiziert (Conover et al. 1999). PAPP-A wird
hauptsächlich im kultivierten Medium von GZ aus östrogen-dominanten Follikeln und in
Granulosaluteinzellen gefunden, im Medium von androgen-dominanten Follikeln dagegen in
geringfügiger Menge (Conover et al. 2001). Molekularbiologisch wurde diese Beobachtung
bestätigt durch die Darstellung der PAPP-A mRNA mittels in situ Hybridisierung im
73
humanen Ovar. PAPP-A mRNA zeigte ein starkes Signal in GZ von gesunden, antralen
Follikeln und in Zellen des Corpus luteum (Hurwitz et al. 2000).
Dies ist ein wesentlicher Beweis für den Fakt, dass IGFs, IGFBPs und dessen Proteasen im
Allgemeinen in die Follikelgenese und Steroidbiosynthese im Ovar involviert sind, und dass
der Zustand einer Imbalance im intraovariellen IGF-System, welcher durch die Verabreichung
von GnRH-Antagonisten verursacht werden könnte, die physiologische Entwicklung des
Follikelwachstums und dessen Reifung stören könnte und folglich auch die Proliferation des
Endometriums und die Implantation des Embryo.
Diese Hypothesen wurden in mehreren großen klinischen Studien überprüft. Es konnten
bezüglich der Eckpfeiler Oozytenanzahl, Fertilisationsrate und Qualität der Embryos keine
Unterschiede feststellen. Vorteilhaft erwiesen sich die GnRH-Antagonisten neben der
Vermeidung des vorzeitigen LH-Anstiegs im Hinblick der COH Komplikation OHSS, dessen
Inzidenz signifikant niedriger auftrat (Diedrich et al. 1994, Weiss et al. 1999, Albano et al.
2000, Ludwig et al. 2000, Olivennes et al. 2000). Dennoch zeigte eine weitere
Multizenterstudie ein minimales, aber wichtiges Zurückbleiben der Schwangerschaftsrate und
der Implantationsrate der GnRH-Antagonisten hinter den im Vergleich stehenden Agonisten
(Borm und Mannaerts 2000). Zwei aktuelle meta-Analysen, in denen fünf randomisierte
prospektive Studien verglichen wurden, kamen zu dem Schluss, dass das Stimulationsschema
mit Cetrorelix hinsichtlich Sicherheit für die Patientin dem langen Protokoll überlegen war
und dass bezüglich der Schwangerschaftraten kein Unterschied gezeigt werden konnte (Al-
Inany und Aboulghar 2002, Ludwig et al. 2001a). Ganirelix hingegen wies erniedrigte
Schwangerschaftsraten auf. Die niedrigeren Implantationsraten, die in der IVF-Therapie mit
höheren Dosen Antagonisten vorkommen, sind wahrscheinlich auf die verminderte
endometriale Empfänglichkeit als auf einen direkten embryonalen Effekt zurüchzuführen.
74
Kryokonservierte Embryonen aus diesen Zyklen bringen normale Schwangerschaftsraten
hervor (Kol et al. 1999, Seelig et al. 2002). Zusätzlich war der follikuläre Wachstum nicht
durch die tägliche Applikation von GnRH-Antagonisten beinträchtigt (de Jong et al. 2001).
Soweit konnten auch noch kein erhöhtes Risiko für Geburtsdefekte in Schwangerschaften, die
einer täglichen Applikation von GnRH-Antagonisten exponiert waren, festgehalten werden
(Ludwig et al. 2001b).
Da diese Ereignisse allerdings eine Schlüsselrolle auf dem Weg der erfolgreichen Austragung
einer Schwangerschaft, damit der menschlichen Fortpflanzung sind, wäre dies weiter
zuprüfen. Wie Hernandez bereits disskutierte, muss nun demonstriert werden, dass die
benötigte Minimaldosis zur LH-Suppression keinerlei Einfluss auf die Empfänglichkeit des
Endometriums, somit auf die Implanation und die Embryoentwicklung hat (Hernandez 2000).
Diese Beobachtungen führten zu den Vermutungen, dass GnRH-Antagonisten ihren
nachteiligen Effekt mittels anderer Faktoren als der ovariellen Funktion ausüben (Al Inany
und Aboulghar 2002) oder, dass ein mehr individueller Einsatz von GnRH-Antagonisten
gewählt werden müsste (Ludwig et al. 2002b). Weiterhin wurde eine Lernphase für das neu in
die IVF-Behandlung eingeführte GnRH-Analogon als Grund für die niedrigen
Schwangerschaftsraten angeführt.
Erst wenn sich der GnRHant als gleichwertig in Bezug auf die Implantation mit GnRHag
erweist, kann sein Einsatz bedenkenlos empfohlen werden.
Da diese Umstände aber im Gesamtblick eher als nachteilig zu bewerten sind, ist nun zu
klären an welcher Stelle diese Alterierung stattfindet und ob sie durch Justierung der GnRH-
Antagonistendosis aufzuheben ist ohne die vorteilhafte Wirkung auf den LH-Anstieg zu
verlieren. Somit ist die Einflussnahme der GnRH-Antagonisten auf das menschliche Ovar, wo
die entscheidenen initialen Vorgänge der Reproduktion beginnen und wo ein sensilbes, fein
75
abgestimmtes Verhältnis von Hormonen und Wachstumsfaktoren herrscht, zu überprüfen
(Hernandez 2000).
Eine Vorraussetzung für Aktionen von GnRH-Analoga am menschlichen Ovar könnte durch
die Anwesenheit des GnRH-Rezeptors und dessen Funktionstüchtigkeit in diesem Organ
gewährleistet sein. Es herrscht Übereinstimmung über die Existenz des GnRH-Rezeptors im
Ovar von Nagetieren. Widersprüchliche Daten diskussieren die Expression des
entsprechenden Rezeptors im humanen Ovar und anderen extrahypophysären Geweben,
dennoch machen Beweise die Existenz eines auto- und parakrinen GnRH-Systems im
humanen Reproduktionstrakt immer wahrscheinlicher. Verschiedene Experimente in lutealen
Gewebe und Zellen kamen zu unterschiedlichen Ergebnissen. Der GnRH-Rezeptor wurde in
Oozyten entdeckt (Dekel et al. 1988). Es wurden keine, schwache oder starke
Bindungsaffinitäten für GnRH nachgewiesen (Huhtaneimi et Clayton 1982). Anhand von
quantitaiver Autoradiographie konnte in humanen Granulosaluteinzellen während einer späten
Phase der Follikelreifung Rezeptoren mit hoher Affinität detekiert werden (Latouche et al.
1989). In einer sorgfältig durchgeführten Studie von Brus et al. (1997) wurde gezeigt, dass
Rezeptoren in der Follikelflüssigkeit, die GLZ enthielt, in hohem Umfang enthalten waren,
nicht aber in Follikeln zum präovulatorischen Zeitpunkt. Die Kultivierung des GnRH-
Rezeptors gelang nicht, aber er konnte mit Rezeptor-Assays analysiert werden. Der GnRH-
Antagonist D-Tyr-antide konnte den Rezeptor binden (Brus et al. 1997).
Diese Beobachtung lässt die Hypothese zu, der GnRH-Rezeptor wird primär nach dem
physiologischen LH-Anstieg expremiert. Die Präsens des GnRH-Rezeptors wird durch die
Ergebnisse von zahlreichen Untersuchungsgruppen unterstützt, denen es gelang das GnRH-
Rezeptor mRNA im menschlichen Ovar nachzuweisen (Kakar et al. 1992). Die GnRH-
Rezeptor mRNA wurde mittels RT-PCR in Granulosaluteinzellen identifiziert (Peng et al.
76
1994, Minaretzis et al. 1995). Im Corpus luteum konnten geringe Mengen an GnRH-
Rezeptor mRNA gefunden werden (Fraser et al. 1996). Genexpressionregulation ist durch
Stimulation mit GnRH steigernd möglich, eine Downregulation durch Stimulation mit hCG
(Peng et al. 1994). Weiterhin findet eine Downregulation der GnRH-Rezeptoren mRNA unter
dem Einfluss von Östradiol statt. Dieser biphasische Effekt des Östradiol beginnt mit einer
Stimulation und erst sekundär mit einer Downregulation der mRNA Expression (Nathwani et
al. 2000). Diese Beobachtung und der Nachweis, dass der GnRH-Rezeptor hauptsächlich nach
dem LH-Anstieg detektierbar ist (Brus et al. 1997) deutet auf ein dynamisches Muster mit
erhöhten Konzentrationen wähend der Lutealphase hin, welches für die para- und autokrine
Rolle des GnRH im Ovar und für die ovarielle Steroidhormone als potentielle Regulatoren des
lokalen GnRH/GnRH-Rezeptor Systems spricht (Nathwani et al. 2000).
Die kompetitive Blockade am GnRH-Rezeptor war lange die einzige Erklärung für die Aktion
von GnRH-Antagonisten. Eine Desentisierung des GnRH-Rezeptors, der Mechanismus der
der GnRH-Aktion zu grunde liegt, wurde bei Antagonisten nicht beobachtet (Clayton 1989).
Nach einer in vivo Behandlung mit sowohl GnRH-Agonisten als auch Antagonisten von
männlichen Ratten konnte eine vergleichende Abnahme von GnRH-Rezeptorspiegeln
gefunden werden (Pinski et al. 1996, Halmos et al. 1996). Kürzlich konnte gezeigt werden,
dass eine verlängerte Exposition mit Cetrorelix in vivo, nicht in vitro, und der Abwesenheit
von GnRH, die GnRH-Rezeptor mRNA Expression runterreguliert wird. Dies führt zu der
Schlussfolgerung, dass GnRH-Antagonisten dem stimulierenden Effekt von natürlichem
GnRH auf die GnRH Genexpression entgegenwirken und somit keinen direkter Effekt des
Antagonisten ist (Kovacs et al. 2001, Kovacs und Schally 2001).
Die Anwesenheit des GnRH-Rezeptors im humanen Ovar unterstützt die Vermutung, dass
Effekte auf GLZ durch GnRH mittles des Rezeptors geschehen. Andererseits ist die
77
Konzentration des physiologischen, hypothalamischen GnRH in der peripheren Zirkulation zu
gering, um den ovariellen Rezeptor zu stimulieren. Dennoch könnte die Verabreichung von
GnRH-Analoga im Rahmen der COH, die unphysiologische hohe Spiegel im System erreicht,
eine ausreichend hohe Konzentration für die Aktivierung dessen erlangen (Rivier et al. 1996,
Ortmann und Diedrich 1999). Er herrscht aber immernoch Unklarheit darüber, ob der
ovarielle Rezeptor überhaupt funktionstüchtig ist und somit der intraovariellen
Wachstumsfaktor- und Hormonhaushalt, inbesondere der der IGF-Familie beeinflusst werden
kann.
Der therapeutische Einsatz der GnRH-Analoga nimmt stetig zu, besonders in der
Reproduktionsmedizin, und die systemische Gabe dieser Peptidanaloga führt zu
Plasmakonzentrationen, die in der Lage sein könnten, den ovariellen GnRH-Rezeptor zu
aktivieren. Daher ist die Frage, ob GnRH-Agonisten und –Antagonisten nachteilige oder
nützliche Auswirkungen auf die ovarielle Funktion haben, von großem Interesse. Begrenzte
Information sind bezüglich der Aktivität der GnRH-Antagonisten am menschlichen Ovar
bekannt (Ortmann et al. 2001).
Bisher haben GnRH-Agonisten unstimmige Effekte auf die Steroidbiosynthese von GLZ in
vitro ausgeübt. Einige Arbeitsgruppen zeigten, dass die Progesteronsynthese gehemmt wird
bzw. verändert wird (Tureck et al. 1982, Miro et al. 1992) und die Östrogenproduktion
gesteigert wird (Bussenot et al. 1993, Pellicier und Miro 1990). Dazu widersprüchlich ist die
Beobachtung, dass die Produktion von Progesteron gesteigert und die von Östrogenen
vermindert wird, welches mit der erniedrigten Anzahl von LH-Rezeptoren und verminderter
Aktivität der Aromatase zusammenhängen soll (Guerrero et al. 1993). Die vergleichende
Studie von GnRH-Agonisten behandelten und HMG behandelten Patientinnen zeigte eine
verminderte Ösradiolproduktion beim GnRH-Agonisten Protokoll. Dieser Effekt trat auf nur
78
bei FSH stimulierten Zellen und nicht bei unstimulierten (Dor et al. 2000). Weiterhin wurde
zum einen eine direkte Wirkung von GnRH-Agonisten im Ovar vermutet (Uemura et al.
1994, Parinaud et al. 1988), zum anderen wurde diese direkte Interaktion verneint (Lanzone et
al. 1989, Casper et al. 1982).
Es wurde von keinen Effektunterschieden bei dem Vergleich des GnRH-Antagonisten Nal-
Glu mit dem GnRH-Agonisten Leuprolide Acetat, welche als Stimulanzien in der COH bei
Patientinnen eingesetzt wurden, auf die Progesteronsynthese von dessen gewonnenen GLZ
berichtet. In dieser Studie zeigte sich die potentielle Einflussnahme von Cetrorelix, den
GnRH-Antagonisten auf die Steroidbiosynthese mittels einer Aromataseaktivitätsminderung
während der ersten 6 Stunden (Minaretzis et al. 1995). In einer weiteren Studie wiesen die
GnRH-Antagonisten auf die basale oder hCG-stimulierte Östrogen- oder
Progesteronproduktion der GLZ keinen Einfluss auf, unabhängig davon, ob die Proben in vivo
oder in vitro mit dem Analoga in Verbindung traten (Lin et al. 1995). Ortmann et al.
unterstützen diese Aussage durch die Demonstration, dass kultivierte Granulosaluteinzellen,
die während der COH mit den GnRH-Antagonisten Cetrorelix und Ganirelix stimuliert
worden waren im Vergleich zu agonistisch Stimulierten keinen Unterschied in der
unalterierten Sekretion von basalen und hCG-stimulierten Östradiol und Progesteron
aufwiesen. Diese Beobachtung wird bestätigt durch in vitro Experimente bei welchen GLZ 1
nM Cetrorelix ausgesetzt wurden und keine signifikanten Effekte auf die Steroidbiosynthese
beobachtet wurden (Ortmann et al. 1998, Weiss et al. 2001). Dies führte zu der Überlegung,
dass die luteale Funktion von GnRH-Antagonisten weniger als von GnRH-Agonisten
beeinträchtigt ist. Eine aktuelle Studie der Arbeitsgruppe Lin et al. unterstützt diese Aussage.
Es wurden der GnRH-Antagonist Cetrorelix mit dem GnRH-Agonisten Buserelin verglichen
im Hinblick der Zellfunktion während der in vitro Stimulation. Es konnte kein Unterschied
79
bezüglich der Steroidbiosynthese detektiert werden, sondern nur, dass die GLZ mit einer
früheren Progesteron- und einer besseren Östrogensynthese auf die in vitro Stimulierung mit
hCG und cAMP von GnRH-Antagonisten im Gegensatz zu GnRH-Agonisten therapierten
Patientinnen reagieren (Lin et al. 1999). Gesetz des Falles der Anwesenheit eines hemmenden
autokrinen/parakrinen Systems bezüglich des GnRH, könnte man von der Annahme
ausgehen, dass die Steroidhormonproduktion der GLZ bei GnRH-Antagonisten behandelten
Frauen gesteigert wäre.
Für die Steuerung der ovariellen Steroidbiosynthese ist auf der Ebene der Signaltransduktion
der second-messenger cyclisches Adenosinmonophoshat (cAMP) von zentraler Beduetung.
Eine Untersuchung der Einwirkung der GnRH-Antagonisten, besonders die des Ganirelix auf
das cAMP wurde von der Forschergruppe um Ortmann durchgeführt. Es konnte jedoch keine
Beeinflussung von Seiten des Ganirelix auf die cAMP Ansammlung in humanen
Granulosaluteinzellen und Cumuluszellen nachgewiesen werden (Demirel et al. 2000).
Zusammenfassend kann man sagen, dass zu wenig Nachweis für einen direkten und
relevanten Effekt der GnRH-Antagonisten auf die ovarielle Steroidbiosynthese und die darin
eingeschlossene Signaltransduktion besteht. Diese Annahmen begründet sich hauptsächlich
aus Experimenten die in vitro durchgefürht worden sind und die zeigen konnten, dass die
Aktion der Gonadotropine nicht im Wesentlich verändert sind.
Der mangelnde Einfluss der GnRH-Antagonisten auf die Steroidbiosynthese schliesst die
Möglichkeit der ovariellen Aktion im Allgemeinen dennoch nicht aus. Daher wurde in der
vorliegenden Arbeit die möglichen Veränderungen auf der Ebenen der Wachstumsfaktoren
untersucht. Die IGF-Familie ist wie bereits disskutiert essentiell in die Follikulogenese und
auch die Steroidbiosynthese involviert (Guidice 1992, Guidice 2001). Sekundär ist dadurch
natürlich auch die Implantation betroffen und da in den schon genannten Studien besonders
80
die Schwangerschaftsrate und die Implantationsrate negativ beeinträchtig war (Hernandez
2000), haben wir die Effekte der GnRH-Antagonisten Cetrorelix und Ganirelix und des
GnRH-Agonisten Triptorelin auf das intraovarielle IGF-System untersucht.
Zusammenfassend zeigt diese Arbeit zum ersten Mal, dass die GnRH-Antagonisten Ganirelix
und Cetrorelix keinen Effekt auf das intraovarielle IGF-System haben. Die Tatsache, dass
humane Granulosaluteinzellen den GnRH-Rezeptor expremieren, bedeutet nicht, dass dieser
die Effekte von GnRH-Analoga oder GnRH selbst vermitteln. Diese Daten und diejenigen
von vorherigen Studien demonstrieren den nicht vorhandenen, nachteiligen Effekt dieser
Komponenten auf die ovarielle Funktion der Patientinnen, die sich einer kontrollierten
ovariellen Hyperstimulation mit den genannten Agentien unterziehen. Diese Ergebnisse
unterstützen die Hypothese, dass GnRH-Antagonisten ihre nachteiligen Effekte mittels
anderer Faktoren als der ovariellen Funktion ausüben (Al Inany und Aboulghar 2002).
Weiterhin wurde ein mehr individueller Einsatz der GnRH-Antagonisten gefordert und
folglich eine Lernphase für die anfänglich schlechteren Raten als Ursache angeführt (Ludwig
et al. 2002b).
81
6. Zusammenfassung
GnRH Antagonisten gelten bereits als etabliert, um einen vorzeitigen LH-Anstieg im Rahmen
der kontrollierten ovariellen Hyperstimulation zu vermeiden. Große Phase III Studien konnten
Vor- und Nachteile dieser neuen Substanzgruppe zeigen. GnRH Antagonisten sind in Bezug
auf Oozytenanzahl, Fertilisierungsrate und Embryoqualität gleichwertig zu den ubiquitär
verbreiteten und immernoch am häufigsten eingesetzen GnRH Agonisten sind. Dennoch sind
bei Frauen, mit GnRH Antagonisten behandelten wurden, die Schwangerschaftsraten und
Implantationsraten marginal geringer. Da es inzwischen sicher belegt ist, dass GnRH-
Rezeptoren im humanen Ovar expremiert werden, könnte dies auf unerwünschte ovarielle
Effekte der GnRH Antagonisten zurückführt werden. Die Arbeitsgruppe um Ortmann konnte
in früheren Studien zeigen, dass GnRH Antagonisten weder die Steroidbiosynthese noch die
cAMP-Produktion in humanen Granulosaluteinzellen beeinflussen. Da das ovarielle IGF-
System wesentliche Bedeutung für die Follikulogenese und sekundär für die Implantation hat,
wurde in dieser Arbeit der Effekt der GnRH Antagonisten Ganirelix und Cetrorelix und des
GnRH Agonisten Triptorelin auf den in humanen Ovar vorallem bedeutsamen
Wachstumsfaktor IGF-II, seinen Bindungsproteinen IGFBP-2 und –4 und dessen spezifische
Protease PAPP-A untersucht.
Die Granulosaluteinzellen wurden aus Follikelflüssigkeit von Patientinnen nach
Follikelpunktion im Rahmen der COH gewonnen. Die zwei Gruppen an Frauen wurden mit
Cetrorelix bzw. Triptorelin behandelt. Jede Patientin erhielt rekombinates FSH als
Gonadotropin. Die Zellen wurden in vitro mit je 1 nM Cetrorelix, Ganirelix und Triptorelin
für 48 h behandelt. IGF-II und IGFBP-2 wurden per Radioimmunoassay gemessen. Die
Messung von PAPP-A erfolgte mittels Enzymimmunoassay. Zur Überprüfung der Existenz
von IGFBP-4 wurden eigene Radioimmmunoassays und Western Blots konstruiert.
82
Weder die GnRH Antagonisten Cetrorelix und Ganirelix noch der GnRH Agonist Triptorelin
beeinflussen die intraovarielle Synthese und Sekretion von IGF-II, IGFBP-2 und PAPP-A.
IGFBP-4 konnte in humanen Granulosaluteinzellen nicht detektiert werden.
Schlussfolgernd kann man zu der Aussage kommen, dass GnRH Antagonisten keinen
signifikanten Effekt auf das humane ovarielle IGF-System in vitro. Sieht man diese
Ergebnisse im Zusamenhang mit den Daten der vorherigen Arbeiten, die den Einfluss der
Antagonisten auf die intraovarielle Steroidbiosynthese und den cAMP-Spiegel untersucht
haben, wird diese These unterstützt. Daher ist es unwahrscheinlich, dass GnRH Antagonisten
im Rahmen von Protokollen der COH die ovarielle Funktion negativ beeinträchtigen.
83
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9. Danksagung
Für die Möglichkeit zur Bearbeitung dieses Themas danke ich meinem Betreuer und
Doktorvater PD Dr. med. J.M. Weiss, Oberarzt der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfe
der Medizinischen Universität zu Lübeck. Er vermittelte mir die Faszination der
experimentellen-klinischen Wissenschaft und die Logik in der Forschung.
Weiterhin danke ich auch Prof. Dr. med. K. Diedrich, Direktor der Klinik für Gynäkologie
und Geburtshilfe der Medizinischen Universität zu Lübeck, für den überlassenen Freiraum
und Bereitstellung der Mittel und Räumlichkeiten für Forschung und Wissenschaft.
Herrn Stefan Pollack, MTA und Frau Sabine Northemann, MTA, möchte ich für die
unterstützende Hilfe und die guten Ratschläge und unbeugsame Geduld zu jeder Zeit herzlich
danken.
Desweiteren gilt mein Dank Prof. Dr. med. vet. Al-Hasani, Frau Dr. rer. nat. B. Schöpper und
Frau Sturm für die kooperative Zusammenarbeit während der Follikelpunktionen und allen
Ungenannten, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.
Nicht vergessen möchte ich den Einfluss meiner Eltern, die mich immer unterstützen und
Mark Scharfenberg und meinen Bruder Carsten Krautmacher, die mich stets motivierten.
113
10. Lebenslauf
Persönliche Daten
Name Britta Anietta Krautmacher
Geburtstag 20. Januar 1976
Geburtsort Olpe
Eltern Friedrich Albert Krautmacher
Gisela Maria Gertrud Krautmacher, geb. Klauke
Wohnort Schwartzkopffstraße 19, 10115 Berlin
Familienstand ledig
Schulbildung
1982 – 1986 Katholische Grundschule Olpe/Rhode
1986 – 1995 Städtisches Gymnasium Olpe
1992 – 1993 San Dieguito High School, Encinitas, CA, USA
Juni 1995 Abitur
Hochschulstudium
1995 – 1996 Studium der Zahnmedizin an der Ernst-Moritz Arndt Universität
Greifswald
1996 – 2000 Studium der Humanmedizin an der Ernst-Moritz Arndt
Universität Greifswald
2000 – 2002 Studium der Humanmedizin an der Medizinischen Universität
Lübeck
114
Oktober 2002 Staatsexamen der Humanmedizin
Promotion
2000 – 2002 Durchführung der experimentellen Arbeiten
Juni 2002 Postervorstellung auf der Norddeutschen Gesellschaft für
Gynäkologie und Geburtshilfe
Juli 2003 Veröffentlichung der Ergebnisse
Berufstätigkeit
Mai 2003 Ärztin im Praktikum und anschließend als Assistenzärztin
am Evangelischen Waldkrankenhaus Spandau, Lehrkrankenhaus
der Humbold Universität Berlin im Fachbereich Gynäkologie
und Geburtshilfe
