Aus der Medizinischen Klinik I - zhb.uni-luebeck.de · Die Hemmung der Proteindegradierung uber das Proteasom stellt eine neue Therapieop- tion f ur die Behandlung von malignen Erkrankungen

Aus der Medizinischen Klinik Ider Universitat zu Lubeck

Direktor: Prof. Dr. med. H. Lehnert

In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen einerKombinationstherapie mit Bortezomib,

Mafosfamid und 4-OH-Trofosfamid an humanenTumorzelllinien LX1, MX1 und S117

Inauguraldissertation

zur Erlangung der Doktorwurdean der Universitat zu Lubeck

– Aus der Sektion Medizin –

vorgelegt vonJan Mikael Gerl

aus Hillerød

Lubeck 2013

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. T. Wagner

2. Berichterstatter/-in: Priv.-Doz. Dr. rer. physiol. M. Tegtmeier

Tag der mundlichen Prufung: 21.11.2014

Zum Druck genehmigt. Lubeck, den 21.11.2014

Promotionskommission der Sektion Medizin

i

ii

Meinen Eltern

iii

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

1.1 Geschichte der Chemotherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Alkylanzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.3 Neue Generation der Krebstherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.4 Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.5 Kombinationstherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.6 Stand der Forschung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

1.7 Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2 Material und Methoden 11

2.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.1.1 Labormaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.1.2 Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.2.1 Medien und Zusatze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.2.2 Puffer und Stammlosungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.3 Zytostatika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.3.1 Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.3.2 Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.3.3 Cyclophosphamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.3.4 Mafosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.4 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.5 Zellbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.5.1 Herstellung der Losungen und Medien fur die Zellkultur . . . . . 15

2.6 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.6.1 Steriles Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.6.2 Kultivieren und Passagieren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.6.3 Kryokonservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.7 Proteinchemische Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.7.1 Kristallviolett-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

2.7.2 Zytostatikaaufbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.7.3 Behandlungsschemata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

Inhaltsverzeichnis iv

2.8 Tierexperimentelle Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.8.1 Tierhaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.8.2 Narkose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.8.3 Tumoranzuchtung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.8.4 Tumortransplantation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.8.5 Behandlungsschemata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.9 Biometrie und Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3 Ergebnisse 25

3.1 In-vitro-Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.1.1 Ermittlung der IC-Werte von Bortezomib . . . . . . . . . . . . . 25

3.1.2 Ermittlung der Konzentrationsreihen von Mafosfamid und 4OH-

Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.1.3 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.1.3.1 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid

und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3.1.3.2 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid

und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.1.4 Zeitversetzte Kombinationsversuche . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.1.4.1 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am

MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.1.4.2 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am

MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37


LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39


LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41


S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44


S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.2 Versuchsablauf in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.2.1 Bortezomib als Einzelbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

3.2.2 In-vivo-Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib 50

3.2.3 In-vivo-Kombinationsversuche mit Cyclophosphamid und Borte-

zomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4 Diskussion 54

4.1 Hintergrund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.2 Das kleinzellige Lungenkarzinom LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

Inhaltsverzeichnis v

4.2.1 In-vivo-Versuche am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.3 Das Mammakarzinom MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.4 Das Weichteilsarkom S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.5 Zeitversetzte Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.6 Schlussfolgerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

5 Zusammenfassung 64

Literaturverzeichnis 66

Abbildungsverzeichnis 77

Tabellenverzeichnis 79

A Abkurzungsverzeichnis 82

B Grafische Darstellungen 84

C Daten 90

D Danksagung 99

E Lebenslauf 100

F Erklarung 101

1

1 Einleitung

1.1 Geschichte der Chemotherapie

Die Behandlung maligner Tumore hat sich im 20. Jahrhundert entwickelt. Lange Zeit

stand als Therapie lediglich die Moglichkeit der lokalen Tumortherapie durch Chirurgie

oder Bestrahlung zur Verfugung. 1942 wurde als erstes Chemotherapeutikum Stickstoff-

Lost eingesetzt und markierte damit den Beginn der systemischen Therapieansatze.

Zu Beginn der 90er Jahre wurden die ersten Antikorper entwickelt, und 10 Jahre

spater standen die ersten zielgerichteten Therapien (englisch”Targeted Therapies“) zur

Verfugung [10].

Die Entwicklung der systemischen Chemotherapie brachte den entscheidenden Vor-

teil, Tumore auch in fortgeschrittenen Stadien behandeln zu konnen und damit die

Lebenszeit der Patienten zu verlangern und die Lebensqualitat zu verbessern. Da die

zytotoxische Wirkung von Chemotherapien allerdings nicht ausschließlich auf Tumorzel-

len beschrankt ist, verursachen sie zahlreiche und zum Teil erhebliche Nebenwirkungen,

die sich limitierend auf die Therapie auswirken konnen. Viele schnell proliferierende

Gewebe, wie das Knochenmark, die Schleimhaut des Magen-Darm-Traktes und die Ge-

schlechtszellen, leiden unter der zytotoxischen Wirkung der Medikamente. So entstehen

Leukozytopenien, Mukositiden und Sterilitat. Nach wie vor ist es Inhalt zahlreicher

Forschungsvorhaben, die Behandlungsmoglichkeiten gezielter einzusetzen und damit

Nebenwirkungen zu reduzieren [81].

Dank neuer Erkenntnisse der Biomedizin und Molekularbiologie konnen bestimm-

te Eigenschaften maligner Zellen fur die Entwicklung neuer, spezifischer Arzneistof-

fe genutzt werden. Diese Medikamente umfassen u.a. monoklonale Antikorper ge-

gen Oberflachenproteine von Krebszellen oder Inhibitoren der Blutgefaßneubildung

[65].

1 Einleitung 2

1.2 Alkylanzien

Zu den altesten Chemotherapeutika gehoren die Alkylanzien. Sie sind eine Stoffgrup-

pe, die zyklusunspezifisch DNA-Schaden induziert [42]. Die Alkylanzien lassen sich

in die Untergruppen der platinhaltigen Chemotherapeutika, wie Cisplatin, und in die

Senfgasderivate, wie beispielsweise Cyclophosphamid, Trofosfamid und Mafosfamid,

aufteilen. Die Stoffe der zuletzt genannten Gruppe werden auch als Oxazaphosphorin-

derivate bezeichnet. Cyclophosphamid wurde als eines der ersten Zytostatika Anfang

der funfziger Jahre entdeckt und ist zur Behandlung vieler verschiedener Tumore zuge-

lassen, wie beispielsweise dem Mammakarzinom, Lungenkarzinom und Weichteilsarkom

[14, 56].

Das heutzutage am haufigsten angewandte Oxazaphosphorin ist das Cyclophosphamid.

Es ist eine inaktive Vorstufe (Prodrug) und wird erst in der Leber mittels Cytochrom

P450-abhangigen Oxidasen zu dem aktiven Metaboliten 4-Hydroxycyclophosphamid

hydroxyliert. Im Falle des Cyclophosphamids handelt es sich um das Cytochrom 2B6

(Cyp2B6). In der aktivierten Form gelangt das Cyclophosphamid leicht durch die

Zellmembran ins Zellinnere, wo es dann spontan zu Acrolein und dem alkylierenden

Phosphoramid-Mustard zerfallt (Abb. 1.1). Letztgenanntes bewirkt in der Zelle eine

Vernetzung der einzelnen DNA-Strange, was zu Einzel- oder Doppelstrangbruchen fuhrt

und letztendlich den Zelltod induziert. Fur die toxischen Nebenwirkungen macht man

unter anderem Acrolein und in geringerem Ausmaß Chloracetaldehyd verantwortlich. Um

Nebenwirkungen vorzubeugen wird Cyclophosphamid mit Mesna kombiniert, welches an

Acrolein bindet und es dadurch neutralisiert [14, 31, 52, 56, 74]. Da Cyclophosphamid

erst durch Enzyme aktiviert werden muss, wird es in Zellversuchen durch Mafosfamid

ersetzt. Dieses zerfallt in wassriger Losung spontan aquimolar zu 4-OH-Cyclophosphamid

und Mesna [15].

Trofosfamid schadigt die DNA von metabolisch aktiven Zellen auf gleiche Weise wie

Cyclophosphamid und Mafosfamid. Aufgrund der stark lipophilen Eigenschaften wird

Trofosfamid ausschließlich per os verabreicht. Im Organismus wird es teilweise zu Ifos-

famid und zu einem geringen Teil zu Cyclophosphamid metabolisiert. Trofosfamid

wird wie Cyclophosphamid uber Enzyme der Cytochrom P450-Familie in der Leber

aktiviert, in diesem Fall jedoch durch das Cytochrom 3A4 (Cyp3A4). Das so entstandene

4-OH-Trofosfamid zerfallt spontan zu Trofosfamid-Lost (Abb. 1.1). Im Gegensatz zu

Cyclophosphamid ist die aktivierte Form von Trofosfamid in seiner kristallinen Form

stabil und kann deshalb in Zellkulturversuchen verwendet werden. Die Nebenwirkungen

von Trofosfamid werden zu einem großeren Teil vom Chloracetaldehyd verursacht,

anders als bei Cyclophosphamid, was die starker ausgepragteren neurotoxischen Ne-

benwirkungen erklart. Vergleichsweise hat Trofosfamid jedoch ein niedrigeres Neben-

1 Einleitung 3

wirkungsprofil und scheint eine vielversprechende palliative Behandlungsmoglichkeit

fur eine Reihe von Tumoren zu sein. Es wird, ebenfalls wie Cyclophosphamid, un-

ter anderem beim Mammakarzinom, Weichteilsarkom und Lungenkarzinom eingesetzt

[14, 31, 52, 56, 74].

Oxazaphosphorine

Trofosfamid Ifosfamid

Mafosfamid

Mesna

Cyclophosphamid

Strukturisomere

Cyp 3A4 Cyp 3A4 Cyp 2B6

4-OH-Trofosfamid

Acrolein

4-OH-Ifosfamid 4-OH-Cyclophospamid

Acrolein

Chloracetaldehyd

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Spontaner

Zerfall

Chloracetaldehyd

Abbildung 1.1: Dargestellt ist der Stoffwechsel der Oxazaphosphorin-Derivate Trofosfa-mid, Mafosfamid und Cyclophosphamid. Sie liegen als inaktive Vorstufe(Prodrug) vor. Die Pfeile in dieser Ebene indizieren spontanen Zerfall.Damit die Stoffe aktiviert werden konnen, mussen sie erst durch dieUntertypen des Cytochrom P450 (Cyp 450) verstoffwechselt werden,welche auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER) der Leberzellenzu finden sind. Mafosfamid bedarf als einziges keiner enzymatischenMetabolisierung, da es spontan in seine aktive Form zerfallen kann. [56]

1.3 Neue Generation der Krebstherapie

Die neue Generation der systemischen Chemotherapien umfasst, wie oben erwahnt, die

sogenannten”Targeted Therapies“. Man kann sie unter anderem in die Wirkklassen der

”niedermolekularen Arzneimittel“ (englisch

”small molecule drugs“),

”Monoklonalen An-

tikorper“ und”Apoptose induzierenden Arzneimittel“ unterteilen.

Die”small molecule drugs“ blockieren spezifische Enzyme und Rezeptoren fur Wachs-

tumsfaktoren, welche am Prozess des Tumorwachstums beteiligt sind. Ein Beispiel

dafur ist Imatinib, das fehlgefaltete Enzyme oder Proteine in einer Zelle erkennt und

weitere Zellteilungen dieser Zelle durch die kompetitive Hemmung der Tyrosinkinase

verhindert.

Monoklonale Antikorper blockieren Molekule, wie Oberflachenrezeptoren oder Wachs-

tumsfaktoren. Als Beispiel ist hier Bevacizumab zu nennen, welches die Angioneo-

1 Einleitung 4

genese hemmt. Das wichtigste angiogenetische Molekul ist der”Vascular Endotheli-

al Growth Factor“ (VEGF), welcher mitogen auf das Gefaßendothel wirkt und die

Permeabilitat der Gefaße beeinflusst. Bevacizumab bindet den VEGF, verhindert so-

mit die Gefaßneubildung in Tumoren und verbessert die Membranpermeabilitat der

Gefaße. Letzteres kann die Wirkung zeitgleich gegebener Zytostatika begunstigen

[72].

Apoptose induzierende Therapeutika losen, wie der Name schon sagt, den programmier-

ten Zelltod aus. Zu den Apoptose induzierenden Medikamenten gehort u.a. Bortezomib.

Entdeckt wurde es, als man gezielt proteasomhemmende Proteine entwickelte, da man

sich aufgrund theoretischer Kenntnisse eine proapoptotische Wirkung erhoffte. Bei

den In-vitro-Screeningsversuchsreihen des”National Cancer Institute“ (NCI) erwies

sich PS-341, welches spater in Bortezomib umbenannt wurde, als potentes zytotoxi-

sches Agens gegenuber einer Reihe von humanen Krebszelllinien. Aufgrund der hohen

Ansprechrate und der geringen Nebenwirkungen bei der Behandlung des Multiplen

Myeloms wurde Bortezomib 2003 im Eilverfahren von der amerikanischen”Food and

Drug Administration“ (FDA) und ein Jahr spater von der europaischen”European

Medicines Agency“ (EMA) fur die Behandlung des Multiplen Myeloms zugelassen

[61].

1.4 Bortezomib

Die Hemmung der Proteindegradierung uber das Proteasom stellt eine neue Therapieop-

tion fur die Behandlung von malignen Erkrankungen dar, da insbesondere gezeigt werden

konnte, dass maligne Zellen sensibler als normale Zellen auf die Proteasomhemmung

reagieren. Dies wurde in vitro und in vivo am Beispiel von transformierten Fibroblasten,

CLL-Zellen (chronisch lymphatische Leukamie) oder CD34-positiven hamatopoetischen

Vorlauferzellen von Patienten mit CML gezeigt [39, 43, 66]. Die Wirkungsweise des Bor-

tezomib steht in engem Zusammenhang mit dem Wirkmechanismus der Proteasomen.

Es gibt mehrere zellulare Systeme, die Proteine abbauen, wobei man lysosomale und

nicht lysosomale Systeme unterscheidet. Proteasome spalten Proteine nicht lysosomal

und sind maßgeblich an der zellularen Homoostase beteiligt. Durch das Degradieren

von Proteinen bilden sie einen Gegenspieler der Proteinbiosynthese. Das Proteasom

ist ein Enzymkomplex, bestehend aus einer 20S-Kerneinheit und zwei regulativen 19S-

Untereinheiten. Die zur Degradation bestimmten Proteine werden vom Proteasom unter

Energieverbrauch entfaltet und anschließend in der Kerneinheit proteolytisch gespalten.

Zuvor mussen diese Proteine jedoch mit Ubiquitin markiert werden, welches ein hoch

konservatives Protein ist. Die Bindung des Ubiquitins an ein Protein wird durch drei

1 Einleitung 5

Enzyme (E1, E2 und E3) katalysiert (Abb. 1.2). Der weitere Werdegang des markierten

Proteins hangt dann von der Art sowie von der Anzahl angehangter Ubiquitin-Molekule

ab. Das Anbinden von einem oder mehreren einzelnen Ubiquitin-Molekulen beeinflusst

die intrazellulare Verteilung eines Proteins und ermoglicht die Interaktion mit anderen

Proteinen. Eine Polyubiquitinierung, die Markierung eines Proteins mit mehr als funf

aneinander geketteten Ubiquitin-Molekulen, bewirkt den Abbau uber das Proteasom

[37, 71].

Es wird eine Vielzahl von Proteinen durch das Proteasom gespalten. Die Spaltung

bewirkt je nach Protein eine Aktivierung, Stabilisierung oder Inaktivierung. Durch

diese Vorgange beeinflusst das Proteasom die intrazellulare Konzentration von Regu-

latoren des Zellzyklus (p21, p27 [83]), der DNA-Reparatur [22, 26, 30], der Apoptose

(Glykoprotein 130 [38, 64, 68]), der Tumorsuppression (p53 [84]), des Immunsystems

(Iκ Bα Inhibitor des Transkriptionsfaktor NF-κ B [85]) und der zellularen Stressantwort

(c-Jun N-terminale Kinase [89][92]). Außerdem beseitigt es auch fehlgefaltete sowie

uberflussige Proteine. Die Wirkungsweise des Bortezomib entsteht durch die Hem-

mung der Proteasomen und den dadurch entstehenden Einfluss auf die oben genannten

Systeme.

Abbildung 1.2: Dargestellt ist der Proteasomstoffwechsel. Ein zu verstoffwechselndesProtein wird durch die Enzyme E1-E3 ubiquitiniert und unter Ener-gieverbrauch durch das Proteasom gespalten. - ADP = Adenosin Di-phosphat, ATP = Adenosin Triphosphat, E1 = Ubiquitin aktivierendesEnzym, E2 = Ubiquitin konjugierendes Enzym, E3 = Ubiquitin ProteinLigase. Abbildung von Rieken et al. 2010 [75].

Bortezomib besetzt reversibel, mit hoher Affinitat und Selektivitat die katalytische

Untereinheit des Proteasoms und hemmt somit dessen Funktion. Eine Verhinderung der

regelrechten Verstoffwechselung der oben genannten Proteine verursacht eine Storung

des Gleichgewichts derselben in der Zelle. Das somit entstehende Uberangebot oder der

Mangel dieser Proteine fuhrt zur Hemmung der Zelldifferenzierung, zur Initiierung von

Entzundungsreaktionen und letztendlich zum Zellzyklusarrest und dem programmierten

Zelltod (Apoptose).

Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass Bortezomib eine zytostatische Wirkung auf

1 Einleitung 6

eine Vielzahl von Tumoren hat. Zu diesen Tumoren gehoren unter anderem das Multiple

Myelom [53], die T-Zell-Leukamie [78, 86, 87], das Prostata-Karzinom [1, 93], das Kolon-

Karzinom [19], das Melanom [3] sowie das Lungenkarzinom [1], das Mammakarzinom

[1] und das Sarkom [82].

Eine Reihe von Studien wurden zum nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC)

durchgefuhrt, im Gegensatz dazu finden sich nur wenige Studien zum kleinzelligen

Lungenkarzinom (SCLC). Mortenson et al. konnten 2005 in einem Zellversuch zeigen,

dass das SCLC empfindlich auf Bortezomib reagiert. Außerdem liegen Studien vor, die

vermuten lassen, dass Bortezomib die Chemoresistenz von SCLC unterbinden kann

(Siehe Kap. 1.6). Bis heute liegen fur Bortezomib keine In-vivo-Daten vor, weder fur

das SCLC noch fur die Kombinationsgabe. Eine 2006 veroffentlichte Phase-II-Studie

von Lara et al. zur Behandlung von refraktaren SCLC-Patienten mit Bortezomib als

Einzelbehandlung konnte keine signifikante Uberlebensverlangerung zeigen [49]. Im

Gegensatz zu der Phase-II-Studie zum SCLC liegen Daten zu einem In-vivo-Versuch

fur Kombinationsversuche am NSCLC vor. Teicher et al. haben fur das NSCLC im

Tiermodell der Maus eine signifikante antineoplastische Wirkung von Bortezomib

als Einzeltherapie und auch als Kombinationstherapie mit Cisplatin, Flourourazil,

Taxol oder Adriamyzin zeigen konnen [87]. Beim Mammakarzinom konnten Teicher et

al. einen zytotoxischen Effekt von Bortezomib sowohl bei In-vitro- als auch In-vivo-

Versuchen nachweisen [87]. In den In-vivo-Versuchen mit Mausen wurde Bortezomib

alleine und in Kombination mit Cyclophosphamid oder Cisplatin untersucht. Bei

der Einzeltherapie mit Bortezomib konnte man im Vergleich zur peroralen bei der

intraperitonealen Verabreichung eine signifikant niedrigere Zelluberlebensrate sehen. Die

Kombination von Bortezomib und Cyclophosphamid in den Tierversuchen verstarkte

die zytotoxische Wirkungen sowohl auf die Tumorzellen (bis zum 40-fachen) als auch

auf die Knochenmarkszellen, dies jedoch zu einem geringeren Grad (bis zum 18-fachen).

Dies bedeutet eine effektivere Krebsbehandlung, aber auch ein erhohtes Risiko fur

Knochenmarksdepression in Form von Anamie, Trombozytopenie oder Leukopenie und

ein damit verbundenes erhohtes Risiko fur schwere Infektionen.

Bis heute befassen sich nur wenige Studien mit der Wirkung von Bortezomib auf

das Sarkom. Eine 2010 veroffentlichte In-vitro-Studie von Bauer et al. zu den Ga-

strointestinalen Stromatumoren (GIST) zeigte, dass diese empfindlich auf Bortezomib

reagieren [7]. In der Studie wurde die Zelllinie GIST882 mit verschiedenen Bortezomib-

Konzentrationen im nM-Bereich behandelt und uber 3 Tage inkubiert. Anschließend

wurde die Zelluberlebensrate mit einem Apoptose-Assay gemessen. Die Konzentration,

bei der 50% des Wachstums gehemmt wurde, lag ungefahr bei 20 nM. Im gleichen Jahr

wurde eine Studie von Shapovalov et al. publiziert, in der gezeigt wurde, dass Mause

mit einem Rhabdomyosarkom ebenfalls gut auf die Einzeltherapie mit Bortezomib

1 Einleitung 7

ansprechen. Maki et al. hatten bereits 2005 eine Phase-II-Studie zur Einzelbehandlung

von Patienten mit metastasierendem Sarkom mit Bortezomib durchgefuhrt. Man stellte

fest, dass die Einzelbehandlung mit Bortezomib keinen signifikanten antineoplastischen

Effekt hatte und man in zukunftigen Studien nur praklinisch getestete Kombinationsbe-

handlungen anwenden sollte. Bis heute gibt es allerdings keine Studien uber die Kombi-

nationsbehandlungen von Bortezomib und Oxazaphosphorinen.

1.5 Kombinationstherapie

Wie im vorhergehenden Kapitel dargestellt, stoßt die Einzeltherapie an ihre Grenzen,

und der Einsatz von Kombinationstherapien in der Krebsbehandlung gewinnt immer

mehr an Bedeutung. Ist ein Medikament zur Einzeltherapie zugelassen, ist es gesetzlich

nicht zwingend notwendig, eventuelle Kombinationen praklinisch zu testen [24]. Das

hat zur Folge, dass man Kombinationsbehandlungen an Patienten einsetzen kann, ohne

die Wirkung in praklinischen Studien gezeigt zu haben. Dies birgt die Gefahr, dass

man Wechselwirkungen wie z.B. Resistenzmechanismen erst zu einem spateren Zeit-

punkt beim Patienten entdeckt. Fanucchi et al. haben 2006 in einer Phase-II-Studie

die Kombination von Bortezomib und Docetaxel, einem antimikrotubularen Zytosta-

tikum, an Lungenkarzinom-Patienten untersucht [27]. Man hat nur eine geringfugig

verstarkte antineoplastische Wirkung fur die Kombinationsbehandlung im Vergleich

zur Einzelbehandlung mit Bortezomib festgestellt. In der Arbeit wird auf den positiven

Effekt der Kombinationstherapie von Bortezomib und Doxetacel, einem Taxan, verwie-

sen. Es fehlt jedoch ein Verweis auf Studien, welche dies in praklinischen Versuchen

belegen. In den 1999 durchgefuhrten Studien von Teicher et al. wurde gezeigt, dass

Paclitaxel, welches ebenfalls ein Taxan ist, in Kombination mit Bortezomib einen guten

antineoplastischen Effekt auf eine Lungenkrebszelllinie hat [87]. Auch wenn Docetaxel

und Paclitaxel zur Gruppe der Taxane gehoren und eine gleiches Grundgerust haben,

konnen alleine aufgrund unterschiedlicher Seitenketten unerwartete Wechselwirkungen

in der Kombination mit Bortezomib auftreten. Dies veranlasste 2007 Jung et al., eine

In-vitro-Studie zur Kombination von Docetaxel und Bortezomib am NSCLC durch-

zufuhren, in der sie sowohl antagonistische als auch synergistische Effekte beobachten

konnten [41]. Der synergistische Effekt war dann zu beobachten, wenn die Zellen erst

mit Docetaxel und zeitverzogert mit Bortezomib behandelt wurden. Auch wenn man

nicht direkt vom praklinischen Effekt auf den klinischen Effekt einer Behandlung schlie-

ßen kann, zeigen diese Daten, wie wichtig es ist, eine Kombinationstherapie erst in

praklinischen Studien zu untersuchen, um im Patienten eine optimale Wirkung erzielen

zu konnen.

1 Einleitung 8

1.6 Stand der Forschung

Das Lungenkarzinom ist die haufigste maligne Erkrankung des Mannes. Veroffentlichungen

der deutsche Krebsgesellschaft [4] kann man entnehmen, dass das kleinzellige Lungen-

karzinom, ein Subtyp des Lungenkarzinoms, charakteristischerweise zentral mit hoher

Proliferationsrate wachst und fruh hamatogen oder lymphogen metastasiert, vorzugs-

weise in das Gehirn, die Knochen, Leber oder Nebenniere. Klinisch wird das kleinzellige

Lungenkarzinom in eine begrenzte (limited disease, LD) und eine ausgedehnte Krank-

heitsausdehnung (extensive disease, ED) eingeteilt. Da es meist erst im fortgeschrittenen

Stadium symptomatisch wird, liegt die mediane Uberlebensrate bei drei bis funf Mona-

ten und die 1 Jahresuberlebensrate bei ca. vier Prozent. Die deutsche Krebsgesellschaft

erklart, dass die Therapie der Wahl bei begrenzter wie bei dissiminierender Erkrankung

die Polychemotherapie ist. Beim SCLC LD kann die Therapie mit Bestrahlung und in

seltenen Fallen auch mit Chirurgie erganzt werden. Außerdem fuhren sie aus, dass eine

Polychemotherapie einen bedeutend besseren Effekt hat als eine Einzelstoffbehandlung.

”Die Gabe einer zytostatischen Monotherapie entspricht nicht dem evidenzbasiertem

medizinischen Standard.“ [4]. Die Standardchemotherapien stellen sich aus einem Al-

kylanzium wie Cisplatin oder Cyclphosphamid, und einem zweiten und eventuell dritten

Medikament zusammen.

Klinische Studien zur Kombinationsbehandlung des SCLC mit Bortezomib sind bis jetzt

noch nicht veroffentlicht worden. In praklinischen Studien haben Mortenson et al. zeigen

konnen, dass es die Synthese der regulatorischen Proteine des”B-cell lymphoma 2“

(Bcl-2) hemmt [63]. Außerdem wurde in praklinischen Studien von Zangemeister-Wittke

et al. gezeigt, dass diese Bcl-2-Proteine Grund fur die Chemoresistenz des SCLC sein

konnen [96]. Durch die Blockade der Synthese von funktionsfahigen Bcl-2-Proteinen

zeigten sie, dass diese Proteine, die von Proteasomen verstoffwechselt werden, antia-

poptotisch wirken und einer der Hauptfaktoren der Chemoresistenz im SCLC sind.

Diese Beobachtungen fuhren zu der Hypothese, dass Bortezomib einer Cheomoresistenz

im SCLC entgegenwirken kann. Dowlati et al. konstatierten in ihrer Studie von 2007,

dass im SCLC eine hohe angiogenetische Aktivitat zu beobachten sei und dies sich

als therapeutischer Angriffspunkt eigne [23]. Im Jahr zuvor haben Roccaro et al. mit

verschiedenen Untersuchungen festgestellt, dass Bortezomib antiangiogenetisch wirkt

[77]. Sie zeigten, dass die Proliferation von Endothelzellen von Myelom-Patienten durch

Bortezomib gehemmt wird. Außerdem haben sie eine dosisabhangige Inhibition der

Angiogenese anhand von verschiedenen Assays nachgewiesen.

Die haufigste maligne Erkrankung der Frau ist das Mammakarzinom, wobei das invasive

duktale Mammakarzinom der am haufigsten vorkommende Untertyp des Mamma-

karzinoms ist. Die Wahl der Therapie des Mammakarzinoms soll den individuellen

1 Einleitung 9

Gegebenheiten gerecht werden und hangt unter anderem von Tumortyp, Aus-breitung,

Lokalisation und diversen Risikofaktoren ab. Die ausfuhrlichen Leitlinien sind auf der

Homepage der Deutschen Krebsgesellschaft einzusehen [46]. Vereinfacht wird primar ope-

riert und speziell bei brusterhaltender Operation nachbestrahlt. Erst in den fortgeschrit-

tenen Stadien kommt die neoadjuvante und adjuvante Polychemotherapie hinzu, die

sich aus einer Kombination von u.a. Cyclophosphamid, Methotrexat und 5-Flourouracil

zusammensetzt. Im fortgeschrittenen Stadium wird diese aggressive Kombinations-

therapie gegebenenfalls von einer milderen palliativen Monotherapie abgelost. Seit

einigen Jahren wird der Effekt von Bortezomib auf das Mammakarzinom untersucht.

Es gibt einige Forschungsgruppen, die in In-vitro-Versuchen zeigten, dass verschiedene

Mammakarzinomzellen auf eine Therapie mit Bortezomib ansprechen [16, 18, 87]. Im

Vergleich dazu konnten Ames et al. 2009 keine signifikante Steigerung der Apoptoserate

bei der Monotherapie mit Bortezomib feststellen, hingegen jedoch erhohte Aktivitat der

Apoptose induzierenden Pfade, weswegen man empfiehlt, eine Kombinationsbehandlung

zu untersuchen [2]. Einzig die 2008 veroffentlichten Ergebnisse der Forschungsgruppe

um Xu et al. [95] zeigten eine Resistenz des Mammakarzinoms gegenuber Bortezomib.

Klinische Versuche zur Kombination mit einem zweiten Zytostatikum haben verschiedene

Ergebnisse erbracht. Eine 2008 veroffentlichte Studie von Schmid et al. zur Kombination

von Capecitabin mit Bortezomib an therapierefraktaren Mammakarzinom-Patientinnen

zeigte eine moderate Verlangerung des progressionsfreien Uberlebens [80]. Die Kombi-

nation war fur die Patientinnen gut vertraglich und hatte wenige Nebenwirkungen. Die

Kombination von Bortezomib und Doxorubicin in einer 2010 veroffentlichten Studie von

Irvin et al. wurde gut toleriert, hatte aber keine signifikante Wirkungsverstarkung [40].

Zur Kombination von Cyclophosphamid und Bortezomib gibt es bis heute eine einzige

Arbeit aus dem Jahr 1999 von Teicher et al. [87]. In ihren Vorversuchen mit Mausen

konnte gezeigt werden, dass die intraperitoneale Verabreichung von Bortezomib der

oralen Verabreichung vorzuziehen ist, da Bortezomib eine um ein Vielfach verstarkte

zytotoxische Wirkung bei einer nur gering erhohten Knochenmarkstoxizitat zeigte.

Bei den In-vivo-Kombinationsversuchen mit Cyclophosphamid und Bortezomib zum

Mammakarzinom konnte eine bis zu 40-fache Verstarkung der Zytotoxizitat beobachtet

werden. Die Knochenmarkstoxizitat verstarkte sich im Vergleich dazu nur um das

17-fache.

Anders als bei den Erwachsenen kommt Lungen- und Brustkrebs bei Kindern seltener

vor. Das Weichteilsarkom stellt nach den Malignomen des zentralen Nervensystems

(ZNS) die zweitgroßte Gruppe der soliden Tumoren in der Padiatrie dar. Es ist mesen-

chymalen Ursprungs und kommt zu 60% an den Extremitaten vor. Die WHO hat 61

maligne Sarkomentitaten registriert. Die Vielzahl an Sarkomen erklart die Uneinigkeit

und die widerspruchlichen Ergebnisse bei Studien zum Ansprechen auf Chemothera-

1 Einleitung 10

pieprotokolle. Die niedrig malignen Sarkome und Chondrosarkome sprechen nicht bis

kaum auf Chemotherapien an, weswegen sie chirurgisch angegangen werden sollten.

Bei inoperablen Fallen wird u.a. mit Ifosfamid, Doxorubicin, Cyclophosphamid und

Methotrexat in verschiedenen Kombinationen behandelt [67, 79, 94]. Bei Begleiterkran-

kungen oder reduziertem Allgemeinzustand sollte weniger aggressiv therapiert werden.

In solchen Fallen wird u.a. Trofosfamid als Monotherapie empfohlen. Die Ansprech-

wahrscheinlichkeit bei der Trofosfamid-Monotherapie ist gering und kann alternativ

mit einer neueren Substanz kombiniert werden [79]. Die bis jetzt vorliegenden Studien

zeigen jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Mortalitat beim Vergleich von

Mono- und Polychemotherapie [60, 73]. In der 2009 durchgefuhrten klinischen Studie

von Maurel et al. verglich man den Effekt von Doxorubicin mit dem der Kombination

von Doxorubicin und Ifosfamid [60]. Bei der Kombinationstherapie wurden mehr Ne-

benwirkungen beobachtet, aber keine Verlangerung des progressionsfreien Uberleben.

Es gibt wenige Studien zu Sarkomen und der Behandlung mit Bortezomib. Diese

zeigen, dass Ewingsarkome [57], Rhabdomyosarkome [9] und Osteosarkome [82] sen-

sibel gegenuber Bortezomib sind. In einer Phase-II-Studie von Maki et al. aus dem

Jahr 2005 zur Einzelbehandlung von Sarkomrezidiven mit Bortezomib wurde eine

nur geringfugige antineoplastische Aktivitat beobachtet, weswegen man auch hier eine

Kombinationsbehandlung vorschlagt [58].

1.7 Fragestellung

Die meisten Neoplasien werden mit einer Kombination von Chemotherapeutika be-

handelt, da diese sich als effektiver als die jeweilige Einzelbehandlung erwiesen haben.

In Kapitel 1.4 und 1.6 werden Studien erwahnt, die gezeigt haben, dass Bortezomib

Eigenschaften hat, die eine Kombination mit einem zweiten Zytostatikum als vielver-

sprechend erscheinen lassen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob es

bei der Kombination von den Oxazaphosphorinen Trofosfamid und Mafosfamid mit Bor-

tezomib in Zellversuchen zu einer Wirkungsverstarkung kommt und ob eine eventuelle

Wirkungsverstarkung durch die zeitversetzte Gabe der Substanzen beeinflusst wird. Die

Kombinationsbehandlungen wurden in Zellversuchen an den haufigsten Malignomen

der Frau, des Mannes und des Kindes untersucht. In vorliegender Studie wurden das

Mammakarzinom MX1, das Lungenkarzinom LX1 und das Weichteilssarkom S117 ver-

wendet. Im Anschluss an die In-vitro-Untersuchungen wurde der Frage nachgegangen,

ob sich die Ergebnisse der Zellversuche am Tiermodell der Maus zum LX1 reproduzieren

lassen.

11

2 Material und Methoden

2.1 Material

2.1.1 Labormaterial

Tabelle 2.1: Labormaterial

Labormaterial Bezugsquelle96 Well - Mikrotiterplatten Nunc, WiesbadenFalcon Rohrchen (15 ml, 50 ml) Nunc, Wiesbadensterile Pipetten Eppendorf AG, HamburgPipettenspitzen (200 µl, 1000 µl) Greiner, GriesheimBiocidal ZF Desinfektionsspray WAK Chemie Medical GmbH, SteinbachZellkulturflaschen 75cm2 Nunc, WiesbadenEinfrierrohrchen, Cryo Tube Nunc, WiesbadenTuberkulinspritze 1ml BD Plastipak, HeidelbergKanule 26G, 0,45mm BD Pastipak, HeidelbergSteriles Abdecktuch 45cm x 75cm Hartmann AG, HeidenheimSkalpell 11er Klinge C. Bruno Bayha GmbH, TuttlingenKnopfsonde Aesculap AG, TuttlingenCutasept Bode Chemie, HamburgSteri-Strip Noba Verbandmittel, Wetter

2.1.2 Gerate

Tabelle 2.2: Gerate

Gerate Bezugsquelle

Brutschrank Typ BB 6220 CU Heraeus Instruments, Hanau

Werkbank Gelaire, Sydney, Australien

Spektralphotometer fur Mikrotiterplatten Dynex Technologies, Berlin

Mikroskop ID 03 Carl Zeiss, Gottingen

Neubauer Zahlkammer Karl Hecht KG, Sondenheim/Rhon

Megafuge Heraeus Sepatech, Osterode


Tabelle 2.2: Fortsetzung

Gerate Bezugsquelle

Elektronische Waage Sartorius, Gottingen

Wasserbad GFL, Burgwedel

Ultraschallbad, Dandelin Sonorex, TK 52 Bandelin Electronic, Berlin

ELISA-Waschstation Behring, Marburg

Ruttler, MS2 Minishaker IKA-Werk GmbH, Staufen

Pipetus-Akku Hirschmann, Eberstadt

Stickstoffbehalter Cryson GmbH, Schollkrippen

Wasserstrahlpumpe KNF-Lab, Balterswil, Schweiz

Glaspasteurpipetten Hecht- Assistent, Sondeheim

Kafig Makrolon Typ III E. Becker und Co., Castrop-Rauxel

2.2 Reagenzien

2.2.1 Medien und Zusatze

Tabelle 2.3: Medien und Zusatze

Medien und Zusatze BezugsquelleRPMI 1640 Zellmedium Cambrex Bio Science, Verviers, BelgienEinfriermedium Cryo-Safe I c.c.pro GmbH, OberdorlaFetal Bovine Serum Biochrom AG, BerlinPenicillin-Streptomycin Gibco/ Invitrogen, Karlsruhe(Penicillin 50.000 IU/mlStreptomycin 50 mg/ml)Trypsin-EDTA-Losung Gibco/ Invitrogen, KarlsruheAmpicillin Ratiopharm, UlmRompun 2% BayerVital, LeverkusenPentobarbital-Na. 1,8 ml Amp. Apotheke UK-SH, Lubeck

2.2.2 Puffer und Stammlosungen

Tabelle 2.4: Puffer und Stammlosungen

Puffer und Stammlosungen Bezugsquelle

MES-Puffer, Morpholenoethansulfonic acid Gerbu, Gaiberg

Essigsaure 10% J.T. Backer, Griesheim

Kristallviolett 0,1% Sigma, Deisenhofen



Puffer und Stammlosungen Bezugsquelle

Glutaraldehyd Grade II 25% Losung Sigma, Deisenhofen

Natriumchloridlosung 0,9% Apotheke UK-SH, Lubeck

Ethanol 70% hergestellt aus Ethanol 96% Apotheke UK-SH, Lubeck

Natriumhydroxid 1N (NaOH) Apotheke UK-SH, Lubeck

Aqua destillata Apotheke UK-SH, Lubeck

2.3 Zytostatika

2.3.1 Bortezomib

Bezugsquelle: Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, USA

Summenformel: C19H25BN4O4

Bortezomib ist eine Dipeptidyl-Borsaure. Das bei den Versuchen verwendete Bortezomib

war eine fertig hergestellte Injektionslosung, die aus den Bestanden der stationaren

Therapie zur Verfugung gestellt wurde. Die Losung wurde aliquotiert und bei -20°Cgelagert. Bortezomib hat eine Molekulargewicht von 384,24. Die verschiedenen Konzen-

trationen fur die einzelnen Versuche wurden durch Verdunnung mit Medium hergestellt

(Kap. 2.7.2).

2.3.2 Trofosfamid

Bezugsquelle: Baxter Oncology, Frankfurt

Summenformel: C9H18Cl3N2O2P

Trofosfamid wurde in zwei Formen angewandt. Das aktivierte Trofosfamid, auch 4OH-

oder 4OOH-Trofosfamid genannt, wurde in den Zellversuchen angewandt. Die inaktive

Grundsubstanz Trofosfamid wurde in den Tierversuchen verwendet. Das kristalline 4OH-

Trofosfamid hat ein Molekulargewicht von 355,6. Fur die Versuche wurden Rohrchen

mit 2 µg Zytostatikum eingewogen und bei -80°C gelagert, um sie bei Bedarf fur die

Behandlung der Zellen als Stocklosung nutzen zu konnen. Die gewunschten Konzentra-

tionen wurden mittels einer Verdunnungsreihe hergestellt (Kap. 2.7.2).

Das inaktive Trofosfamid mit einem Molekulargewicht von 323,59 wurde ebenfalls als

kristalline Substanz geliefert. Es wurde bei -80°C gelagert, wobei fur die Versuche

Rohrchen mit jeweils 80 mg Trofosfamid abgewogen wurden. Vor Behandlung der

Tiere wurde das Trofosfamid in 16 ml 0,9% Kochsalzlosung mittels des Ultraschallba-

des aufgelost, wonach die gewunschte Menge intraperitoneal (i.p.) verabreicht wurde


[13, 54, 48, 44, 91]. Bei der peroralen (p.o.) Therapie wurde in Abhangigkeit von Anzahl

und Gewicht der Tiere die gewunschte Menge Trofosfamid in dem jeweils notigen

Volumen Leitungswasser gelost [8, 59].

2.3.3 Cyclophosphamid

Bezugsquelle: Pfizer, Karlsruhe

Summenformel:C7H15Cl2N2O2P

Das kristalline Cyclophosphamid von der Firma Pfizer wurde aus den Bestanden der

stationaren Therapie zur Verfugung gestellt. Das Pulver wurde bei Raumtemperatur

trocken gelagert. Am Tag der Therapie wurde mit physiologischer Kochsalzlosung die

gewunschte Dosis hergestellt, welche vom Korpergewicht des Versuchstier abhangt (Kap.

2.8.5). Das Molekulargewicht betragt 279,1.

2.3.4 Mafosfamid

Bezugsquelle: NIOMECH, Bielefeld

Summenformel: C9H18C12N2O5PS2xC6H14N

Mafosfamid wurde in seiner kristallinen Form als Mafosfamid L-Lysine mit einem

Molekulargewicht von 500,5 g/mol von Niomech bezogen und bei -20°C trocken gelagert.

Fur die Versuche wurden Rohrchen mit 2 mg Zytostatikum vorbereitet, um sie bei

Bedarf fur die Behandlung der Zellen als Stocklosung zu verwenden. Die gewunschten

Konzentrationen wurden anschließend anhand einer Verdunnungsreihe, wie in Kapitel

2.7.2 beschrieben, hergestellt [13, 54, 48, 44, 91]

2.4 Zelllinien

Tabelle 2.5: Auflistung der verwendeten Tumorzelllinien

Zelllinie Histologie Bezugsquelle Etablierung

S117 polymorphkerniges Cell Lines in vitro etabliert

Sarkom der Service von H. Lohrke, 1985

Schilddruse Heidelberg Deutsches Krebs-

forschungszentrum Heidelberg



Zelllinie Histologie Bezugsquelle Etablierung

MX1 invasives duktales Cell Lines in vitro etabliert

Mammakarzinom Service von H. Lohrke, 1985

ohne Heidelberg Deutsches Krebs-

Ostrogenrezeptoren forschungszentrum Heidelberg

LX1 kleinzelliges Cell Lines in vitro etabliert

Bronchialkarzinom Service von H. Lohrke, 1985

Heidelberg Deutsches Krebs-

forschungszentrum Heidelberg

2.5 Zellbiologische Methoden

2.5.1 Herstellung der Losungen und Medien fur die

Zellkultur

Tabelle 2.6: Zusammenstellung der verwendeten Losungen und Medien

Medium, Losung Komponenten Menge

Kulturmedium RMPI 1640 (25 mM Hepes, L-Glutamin) 450 ml

fetales Kalberserum, 50 ml

Penicillin-Streptomycin 1 ml

(50.000IU/ml und 50 mg/ml)

Gefriermedium Cryo-safe gebrauchsfertig

Glutaraldehyd 11% Glutaraldehyd 25% 44 %

NaCl 0,9% 56 %

Trypsin EDTA Trypsin EDTA gebrauchsfertig

MES Puffer MES 4,2652g

200mM pH 6,0 Aqua dest. 100 ml

NaOH 1N bis pH 6,0

Kristallviolett 0,1% Kristallviolett 100 mg

MES-Puffer pH 6,0 100 ml

Essigsaure 10% Essigsaure 100% 5 ml

Aqua dest. 45 ml

Pentobarbital-Na. Pentobarbital-Na. 1 ml

-Rompun-Lsg. NaCl-Lsg. 0,9% 9 ml

Rompun 2% 1 ml

NaCl-Lsg. 0,9% 9 ml


2.6 Zellkultur

2.6.1 Steriles Arbeiten

Um die Kontamination der Zellkulturen mit Mikroorganismen zu vermeiden, wurde

steril gearbeitet. Alle Arbeiten mit den Zellen wurden unter der sterilen Werkbank

durchgefuhrt. Die Arbeitsflache und die Arbeitsmaterialien wurden zu Beginn der Arbeit

mit 70% Ethanol desinfiziert. Außerdem wurden steril verpackte Einmalartikel benutzt

und zuvor autoklavierte Glasmaterialien.

2.6.2 Kultivieren und Passagieren

Es wurden die humanen Zelllinien MX1, LX1 und S117 verwendet (Tab. 2.5). Die

Tumorzellen wurden als Aliquots von 4x106 Zellen in flussigem Stickstoff gelagert. Um

ausreichend Zellen fur die Versuchsansatze zu erhalten, mussten sie nach dem Auftauen

in Kulturflaschen (75 cm2) subkultiviert werden. Zur Vermehrung wurden die Zellen,

die als adharente Monolayer wachsen, ab einer Konfluenz von ca. 95 % passagiert, indem

sie auf zwei oder mehr Flaschen verteilt wurden.

Die in flussigem Stickstoff kryokonservierten Tumorzellen wurden in einem 37°C war-

men Wasserbad aufgetaut und anschließend in Kulturmedium aufgenommen und in

ein Falconrohrchen uberfuhrt. Um die Tumorzellen vom restlichen Gefriermedium zu

befreien, wurden die Rohrchen mit der Zellsuspension drei Minuten bei 1000-1500

Umdrehungen per Minute (U/min) zentrifugiert, und das Medium wurde anschließend

abgesaugt. Das ubriggebliebene Zellpellet wurde in Kulturmedium resuspendiert und

auf Zellkulturflaschen verteilt. Diese wurden im Brutschrank bei 37°C in wasserdampf-

gesattigter Atmosphare mit 5% CO2 kultiviert. Vor den Versuchen fand immer eine

Subkultivierung statt, um eventuelle Schaden durch die Kryokonservierung auszuschlie-

ßen.

Wahrend die MX1- und LX1-Zellen alle drei Tage subkultiviert wurden, reichten fur

die Vermehrung der S117–Zellen vier Tage aus. Fur das Passagieren der Zellen wurde

zunachst das Nahrmedium abgesaugt, durch Zugabe von 10 ml 0,9% Kochsalzlosung

wurden die Zellen gespult und anschließend mit einer 10%igen Trypsin-Losung fur 5 Mi-

nuten bei 37°C inkubiert. Durch Beklopfen der Kulturflasche losten sich die Zellen vom

Flaschenboden. Um die Trypsinwirkung zu neutralisieren, wurden funf ml Kulturmedi-

um zugegeben. Diese Suspension wurde in einem 50 ml-Falconrohrchen bei 1500 U/min

fur 3 Minuten zentrifugiert. Die S117-Zellen wurden bei 1000 U/min uber die gleiche Zeit


zentrifugiert. Der Mediumuberstand wurde abgesaugt und das Pellet in Medium resus-

pendiert. Anschließend wurde die Zellzahl, mittels der Neubauerzahlkammer bestimmt,

und pro Kulturflasche wurden 4–6x106 Tumorzellen eingesat.

2.6.3 Kryokonservierung

Fur die Kryokonservierung von Zellen wurde das Pellet wie oben beschrieben ge-

wonnen und in Cryo-Safe-Medium resuspendiert. Durch Cryo-Safe-Medium wird das

Auskristallisieren von Wasser im Zellinneren verhindert. Dabei wurde die Zellzahl dies-

mal auf 4x106 Zellen/ml eingestellt. Die Zellsuspension wurde in Nunc-Kryorohrchen

mit einem Volumen von je 1,8 ml uberfuhrt und anschließend einen Tag bei -80°Cheruntergekuhlt. Die Kryorohrchen wurden am nachsten Tag in flussigen Stickstoff

umgelagert.

2.7 Proteinchemische Methode

2.7.1 Kristallviolett-Assay

Der Kristallviolett-Assay wurde erstmals von Joseph E. Grady 1960 beschrieben [33]

und fur die vorliegenden Versuche - wie von W. Kueng 1989 optimiert [47] - durchgefuhrt.

Mit dieser Methode erhalt man ein quantitatives Maß fur vitale Zellen. Die Versuche

wurden in 96-Well-Platten durchgefuhrt, die mit einer zuvor festgelegten Anzahl Zellen

beimpft wurden. Die zu messenden Zellen wurden 15 Minuten mit einer 11%-igen

Glutaraldehydlosung auf einem Plattenruttler bei 500 U/min inkubiert (Tab. 2.6). Nach

Entfernung des Uberstands und einem Waschschritt mit destilliertem Wasser wurden

die Versuchsplatten luftgetrocknet. Anschließend wurden die Zellen mit einer 1%-igen

Kristallviolett-Losung gefarbt und 20 Minuten auf einem Plattenruttler inkubiert (Tab.

2.6). Da abgestorbene Zellen ihre Adharenz verlieren, wurden diese samt dem freien

Farbstoff durch den folgenden Waschschritt entfernt. Anschließend wurden die Platten

luftgetrocknet und die verbleibenden angefarbten Zellen danach mit 1 ml 10% Essigsaure

lysiert (Tab. 2.6). Auf diese Weise wurde der Farbstoff freigesetzt, dessen optische Dichte

bei 590 nm im Photometer bestimmt wurde. Durch die Farbstoffkonzentration bzw. die

optische Dichte kann man auf die Zellkonzentration ruckschließen.


2.7.2 Zytostatikaaufbereitung

Fur die Herstellung von Verdunnungsreihen wurden Stocklosungen von Mafosfamid (1

mmol/l), 4OH-Trofosfamid (1 mmol/l) und Bortezomib (1 µmol/l) angesetzt (siehe hier-

zu auch Kapitel 2.3). Die Zytostatika wurden in Medium suspendiert. Anschließend wur-

den Mafosfamid und 4OH-Trofosfamid fur 3 Minuten im verschlossenen Reagenzglas in

ein Ultraschallbad gestellt, um die vollstandige Losung der Stoffe im Medium zu sichern.

Zur Bestimmung der geeigneten Mafosfamid- und 4OH-Trofosfamid-Konzentrationen

wurden die Arbeiten von Klink et al., Letsch et al. und Braasch et al. herangezogen

[54, 11, 44]. Die Arbeit von Teicher et al. diente als Orientierung bei der Bestimmung

der Bortezomibkonzentrationen [87]. Die Bortezomibkonzentrationen werden in der vor-

liegenden Arbeit als”Inhibiting Concentration“ IC25, IC50 oder IC75 angegeben, und

entsprechen bei der jeweiligen Zelllinie einer Wachstumshemmung von 25, 50 oder 75%

(durch Bortezomib). Die verschiedenen IC-Werte von Bortezomib sind im Ergebnisteil

in Tabelle 3.1 dargestellt. Die Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine sind im

Ergebnisteil in Tabelle 3.2 dargestellt.

2.7.3 Behandlungsschemata

Da, abgesehen von den verwendeten Zytostatikakonzentrationen, der Versuchsaufbau bei

allen Zelllinien identisch war, wird dieser im Folgenden exemplarisch an einer Zelllinie

dargestellt. Die 96-Well-Platten wurden am Tag 1 des Versuchs mit Zellen beimpft.

LX1- und S117-Platten wurden mit 3x103 Zellen pro Well beimpft, und MX1-Platten

wurden mit 5x103 Zellen pro Well beimpft.

Der zweite Schritt, die Behandlung, wurde am Tag 2 durchgefuhrt. Je nach Versuch

wurden unterschiedliche Behandlungsschemata angewandt. Es wurden Kombinations-

versuche durchgefuhrt, in denen die Zytostatika zeitgleich und zeitversetzt gegeben

wurden. Bei den zeitgleichen Versuchen gab es eine unbehandelte Kontrollplatte und

jeweils eine Kontrollplatte zur Einzelbehandlung mit Mafosfamid, 4OH-Trofosfamid und

Bortezomib mit den zuvor festgelegten Konzentrationsreihen, die in den Tabellen 3.1

und 3.2 im Ergebnisteil dargestellt sind. Die Versuchsplatten wurden mit Mafosfamid

und Bortezomib IC25 bzw. 4OH-Trofosfamid und Bortezomib IC25 behandelt. Die

gleichen Versuche wurden ebenfalls mit Bortezomib IC50 und IC75 durchgefuhrt (Tab.

2.7).

Bei den zeitversetzten Kombinationsversuchen wurden die Zellen mit einer Stunde

Zeitverzogerung behandelt. Dies ist ebenfalls in Tabelle 2.7 dargestellt. Es wurde zum

Zeitpunkt null Stunden (0h) mit Bortezomib (IC25 oder IC50) behandelt, und eine


Stunde spater (1h) mit Mafosfamid bzw. 4OH-Trofosfamid und umgekehrt, in den

gleichen Konzentrationen wie die zeitgleichen Kombinationen. Der Versuchsaufbau

ahnelt dem Aufbau der simultan behandelten Zellen. Es wurden wie zuvor eine unbe-

handelte Kontrollplatte, sowie eine Kontrollplatte fur Mafosfamid, 4OH-Trofosfamid

und Bortezomib verwendet. Diesmal wurde jedoch fur Bortezomib eine Kontrollplat-

te fur die Zeitpunkte 0h und 1h benotigt. In diesen Versuchen wurde Bortezomib

IC75 ausgeschlossen, da der zytotoxische Effekt der Kombinationen mit Bortezomib

IC75 in den zuvor durchgefuhrten simultanen Behandlungen zu hoch war. Mit dem

Verdunnungseffekt, der entsteht, wenn man ein Zytostatikum zum Zeitpunkt 1h da-

zugibt, wurde folgendermaßen umgegangen: Die Versuchsplatte wurde mit 200 µl des

ersten Zytostatikums in normaler Konzentration beimpft und nach einer Stunde mit 10

µl des zweiten Zytostatikums, welches eine 21-mal hohere Konzentration hatte. Dadurch

fallt die Konzentration des ersten Zytostatikums mit ca. 5%, welches als akzeptabel

angesehen wurde. Die genannten zeitversetzten Kombinationsversuche wurden ebenfalls

mit zwei Stunden Verzogerung durchgefuhrt (Tab. 2.7). In diesem Fall wurde jedoch

nur Bortezomib IC50 angewandt, da aufgrund der vorangegangenen Versuche dies am

erfolgversprechendsten erschien.

Im dritten Schritt wurde die Zelluberlebensrate gemessen. Dies geschah anhand des

Kristallviolett-Assays, wie unter Kapitel 2.7.1 beschrieben. Die Versuchsreihen mit

LX1 und S117 wurden 48 Stunden nach Behandlung gemessen. Die Versuchsreihen mit

MX1-Zellen wurden wegen der geringen Teilungsrate, erst 72 Stunden nach Behandlung

gemessen. Die Absorbtionswerte wurden mit den Computerprogrammen Microsoft Excel

und GrafPad Prism ausgewertet und dargestellt.

Tabelle 2.7: Behandlungsschemata der einzelnen Zelllinien

Einzeltherapie MX1 LX1 S117

Bortezomib (B) x x x

Mafosfamid (M) x x x

Trofosfamid (T) x x x

Zeitgleich Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75

B + M x x x

B + T x x x

Um 1h versetzte Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 und IC50

B 0h + M 1h x x x

M 0h + B 1h x x x

B 0h + T 1h x x x

T 0h + B 1h x x x



MX1 LX1 S117

Um 2h versetzte Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC50

B 0h + M 2h x x x

M 0h + B 2h x x x

B 0h + T 2h x x x

T 0h + B 2h x x x

2.8 Tierexperimentelle Versuche

2.8.1 Tierhaltung

Die in den Versuchen verwendeten Nu/Nu-Nacktmause wurden aus der Zuchtung von

Taconic erworben. Durch Deletion eines Gens sind die Nacktmause athymisch, was

eine fehlende T-Zellpragung zur Folge hat. Artfremde Zellen werden daher nur bedingt

vom Immunsystem der Maus erkannt und abgestoßen, was diese Mause zum idealen

Wirt von Xenografts macht. Die Tiere wurden in der spezifisiert pathogenfreien (SPF)

Abteilung der Universitatsklinik Schleswig-Holstein, Campus Lubeck gehalten. Futter

und Kafigstreu wurde bei der Firma Altromin erworben. Die Mause bekamen Leitungs-

wasser ad libitum und hatten einen konstanten Tag-/Nacht-Rhythmus. Gemaß dem

Tierschutzgesetz wurden alle Tierversuche dieser Dissertation unter der Tierversuchsan-

tragsnummer V742-72241 122-4 (22-3/05) vom Ministerium fur Umweltschutz, Natur

und Forsten des Landes Schleswig-Holstein genehmigt.

2.8.2 Narkose

Die Narkose wurde mittels einer Mischung aus Nembutal (Pentobarbital-Natrium) und

Rompun durchgefuhrt (Tab. 2.6). Hierfur wurde Nembutal, wie auch Rompun 2% mit

einer isotonischen Kochsalzlosung im Verhaltnis 1:10 verdunnt. Beide Losungen wurden

zu gleichen Teilen gemischt (1:1). Die zu verabreichende Dosis war vom Gewicht des

Versuchstier abhangig (8 ml/kg KG Nembutal sowie 8 ml/kg KG Rompun 2%). Zur

Betaubung eines Tiers wurde nach Desinfektion der Haut die Nembutal-/Rompun-

Losung i.p. injiziert.


2.8.3 Tumoranzuchtung

In den Tierversuchen wurde die Tumoranzuchtung im Nacken der Maus wie folgt

durchgefuhrt: Es wurde ausschließlich die Tumorzelllinie LX1 verwendet. In einem

ersten Schritt wurden die Zellen in vitro kultiviert, wie unter Kapitel 2.6 beschrieben.

Anschließend wurde das Zellpellet zweimal mit 20 ml Zellkulturmedium gewaschen. Das

gereinigte Zellpellet wurde in Ringerlosung resuspendiert, und die Zellen wurden auf eine

Konzentration von 2 - 4x106 Zellen pro 100 µl eingestellt. Diese wurden dann in einer 1

ml-Spritze aufgenommen und unverzuglich weiterverarbeitet, d.h. dem Anzuchtstier

nach Desinfektion der Haut in den Nacken injiziert. Dazu wurde fur jede Maus eine

neue 12er Kanule verwendet. Als Prophylaxe wurde fur die drei darauffolgenden Tage

Ampicillin (10 mg/kg KG) ins Trinkwasser gegeben. Um die Maus mit den Zellen

zu beimpfen, wurde sie, wie zuvor beschrieben, mit der Nembutal-/Rompun-Losung

narkotisiert (Kap. 2.8.2).

2.8.4 Tumortransplantation

Bei einem Tumorvolumen von mindestens 300 mm3 wurde der Tumor entweder auf ein

neues Anzuchttier oder ein Versuchstier transplantiert. Dazu wurden die Tiere, wie unter

Kapitel 2.8.2 narkotisiert. Unter aseptischen Bedingungen wurde der Tumor explantiert

und auf einer Petrischale in ca. 1 mm3 große Tumorstuckchen zerteilt. Zum Schutz vor

Austrocknung lagerten die Tumorstuckchen bis zur Implantation in einer Petrischale

mit 0,9% Kochsalzlosung. Nach der Entnahme des Tumors wurde das narkotisierte

Tier durch Genickbruch getotet. Bei den Anzuchttieren wurde der Tumor ins Genick

transplantiert und bei den Versuchstieren in die Flanke. Von der Implantationsstelle

abgesehen, war der Transplantationsvorgang identisch. In Narkose und unter sterilen

Bedingungen wurde an der gewunschten Stelle ein ca. 0,5 cm langer Hautschnitt

vorgenommen und mit Hilfe einer Kiefersonde eine subkutane Hauttasche prapariert.

Nach der Implantation eines Tumorstuckchens wurde der Schnitt mit einem Steri-Strip

verschlossen. Zur Infekionsprophylaxse verabreichte man den Tieren Ampicillin uber

das Trinkwasser, wie in Kapitel 2.8.3 beschrieben. Transplantationsdatum, Tumortyp

und Passage wurden entsprechend vermerkt. Jeden zweiten bis dritten Tag wurde das

Tumorwachstum kontrolliert (Kap. 2.9).

2.8.5 Behandlungsschemata

Die Therapie wurde bei einem Tumorvolumen von 100-150 mm3 begonnen. Die Berech-

nung des Tumorvolumens ist in Kapitel 2.9 beschrieben. Es wurde mit Trofosfamid,


Cyclophosphamid und Bortezomib behandelt. Die Wirkung einer Einzeltherapie mit je

einem der drei Medikamente wurde untersucht sowie die Kombination von Bortezomib

und Trofosfamid bzw. Cyclophosphamid. Bortezomib wurde zweimal wochentlich verab-

reicht. Trofosfamid und Cyclophosphamid wurden i.p. einmal alle 14 Tage verabreicht.

Bortezomib wurde i.p. injiziert in den Konzentrationen 0,3 mg/kg(KG), 0,6 mg/kg(KG)

und 1,0 mg/kg(KG). Trofosfamid wurde i.p. als Stoßtherapie von 176,4 mg/kg(KG)

verabreicht. Cyclophosphamid (als Aquvalent zu Mafosfamid der In-vitro-Versuche)

wurde i.p. als Stoßtherapie von 176,4 mg/kg(KG) verabreicht. Außerdem wurde die

metronomische Therapie mit der Stoßtherapie von Trofosfamid in Kombination mit

Bortezomib i.p. untersucht. Hierbei wurde Trofosfamid (19 mg/kg(KG)) kontinuier-

lich uber das Trinkwasser verabreicht und zwei-mal wochentlich mit Bortezomib (0,6

mg/kg (KG)) i.p. kombiniert. Wahrend der Versuche wurde dreimal wochentlich das

Tumorvolumen bestimmt und vermerkt, ob Nekrosen auf dem Tumor zu sehen wa-

ren.

2.9 Biometrie und Statistik

Bei den in den Graphiken angegebenen Werten handelt es sich um Mittelwerte (Mean)

und Standardfehler (SEM). Die Berechnung und Darstellung der Werte erfolgte mit dem

Computerprogramm ExcelTM. Die IC-Werte wurden an den Graphiken des Computer-

programms GraphPad Prism 4 berechnet. Die Zelluberlebensrate wurde anhand der

optischen Dichte (OD) errechnet. Dabei wurde eine unbehandelte Kontrolle als 100%

Zelluberleben gewertet. Folgende Formel wurde zur Berechnung der Zelluberlebensrate

verwendet:

Zelluberlebensrate% = 100 ODProbeODKontrolle

Zum Vergleich der Mittelwerte wurde der Mann-Withney-U-Test verwendet, da es

sich um ein parameterfreies Prufverfahren handelt, bei dem die Voraussetzung der

Normalverteilung nicht erfullt sein muß. Ein Signifikanzniveau (p) ≤ 0,05 wurde als sta-

tistisch signifikant gewertet. Es wurde untersucht, ob es einen signifikanten Unterschied

zwischen der Kontrolle und der Kombinationstherapie gibt. Dazu wurden die jeweiligen

Mittelwerte bei jeder verwendeten Konzentrationsstufe miteinander verglichen. Die

Werte sind tabellarisch u.a. im Anhang C dargestellt. Die p-Werte wurden mit dem Pro-

gramm”PAST“ (Paleontological Statistics Software) berechnet (Universitat Blindern

in Oslo, Norwegen [34]). Bei den zeitversetzten Kombinationsversuchen wurde mehr als

ein Vergleich pro Datensatz durchgefuhrt, was es notig machte, das Signifikanzniveau

anzupassen, um eine Kumulation des Alphafehlers zu vermeiden. Die Alphafehler-

Kumulierung besagt, dass mehr Vergleiche pro Datensatz das Risiko erhohen, ein


falsch positives Ergebnis zu bekommen. Nach der Bonferroni-Methode fur multiple

Paarvergleiche adjustiert man das Signifikanzniveau, indem man das initial festgelegte

Signifikanzniveau (in vorliegender Arbeit p≤0,05) durch die Anzahl der Vergleiche

teilt. Bei den zeitversetzten Versuchen wurden bis zu zwei Vergleiche pro Datensatz

durchgefuhrt, weswegen das Signifikanzniveau bei p≤0,025 lag.

Außerdem wurde als Mittel der Effektmessung der”Combination Index“ (CI) ange-

wandt. Dieser beruht auf einer von Chou und Talalay entwickelten Methode, welche der

quantitativen Beschreibung einer Kombinationstherapie dient [17]. Wenn die Gesamtwir-

kung zweier Medikamente die Summe der Einzelwirkungen ist, spricht man von einem

additiven Effekt (CI=1). Ein synergistischer Effekt liegt vor, wenn die Gesamtwirkung

zweier Medikamente die Summe der Einzelwirkungen ubertrifft (CI<1). Wenn die Ge-

samtwirkung zweier Medikamente niedriger ist als die jeweiligen Einzelwirkungen, wird

das als antagonistischer Effekt bezeichnet (CI>1). Der CI wurde mit der Software”Cal-

cuSyn“ von Firma Biosoft berechnet. Um den CI genauer zu beschreiben, empfiehlt der

Hersteller eine Unterteilung des CI, wie in Tabelle 2.8 dargestellt.

Tabelle 2.8: Unterteilung des CI

Beschreibung CI

stark synergistisch 0,10 - 0,30

synergistisch 0,30 - 0,70

moderat synergistisch 0,70 - 0,85

leicht synergistisch 0,85 - 0,90

additiv 0,90 - 1,10

leicht antagonistisch 1,10 - 1,20

moderat antagonistisch 1,20 - 1,45

antagonistisch 1,45 - 3,30

stark antagonistisch 3,30 - 10

Um die abschließende Diskussion zu erleichtern, soll der Begriff”subadditiver Effekt“

erganzend definiert werden, welcher infolge CalcuSyn schon in den antagonistischen

Bereich gehort. Als subadditiv wird der Effekt definiert, bei dem die Gesamtwirkung

zweier Medikamente geringer ist als die Summe der Einzelwirkungen, hingegen hoher

ist als die jeweiligen Einzelwirkungen. Diese Definitionen orientieren sich an dem

Buch”Anasthesiologische Pharmakotherapie“ von Holger Thiel und Norbert Roewer

[88].

In den Tierversuchen wurde das Tumorvolumen mit Hilfe eines Messschiebers berechnet.

Der Tumor wurde in Langs- und Querrichtung ausgemessen. Da die Tiefe eines Tumors


nicht mit einfachen Mitteln gemessen werden kann, wurde folgende viel verwendete

Formel zu Hilfe genommen:

Volumen (mm3) = Lange (mm) x Breite (mm2)/ 2 [21, 29]

Der Behandlungseffekt wurde anhand der Tumorwachstumsverzogerung gemessen. Dies

ist die Zeit, die benotigt wird, um ein gewisses Tumorvolumen zu erreichen im Ver-

gleich zur jeweiligen Kontrolle. In diesem Fall wurden 800 mm3 als Zielwert festge-

legt.

25

3 Ergebnisse

3.1 In-vitro-Versuche

3.1.1 Ermittlung der IC-Werte von Bortezomib

Um die IC25-, IC50- und IC75-Werte fur Bortezomib fur die Zelllinien MX1, LX1 und

S117 (Kap. 2.4) zu ermitteln, wurden die Zellen mit einer steigenden Konzentrationsreihe

von Bortezomib behandelt. Anschließend wurde die relative Zelluberlebensrate mit

dem Kristallviolett-Assay (Kap. 2.7.1) ermittelt. Die benotigte Dosis, um 25% (IC25),

50% (IC50) bzw. 75% (IC75) des Zellwachstums zu hemmen, wurde berechnet. In der

Tabelle 3.1 sind die ermittelten Werte fur alle drei Zelllinien zusammengefasst. Der

Abbildung 3.1 kann man entnehmen, dass die drei Zelllinien gegenuber einer Behandlung

mit Bortezomib sensibel reagieren. Am empfindlichsten reagierten die LX1-Zellen auf

eine Bortezomibbehandlung, wohingegen die MX1-Zellen am unempfindlichsten waren;

sie benotigten bei einer IC50 eine um das 4,5-fache hohere Dosis als die MX1-Zellen.

Die S117-Zellen lagen bei der IC25 und IC50 nur geringfugig hoher als die LX1-

Zellen.

Tabelle 3.1: Zusammenfassung der IC25, IC50 und IC75 von Bortezomib der Zelllinien

Zelllinie Bortezomib IC25 Bortezomib IC50 Bortezomib IC75MX1 6,98 nmol/l 18,36 nmol/l 53,12 nmol/lLX1 2,92 nmol/l 4,03 nmol/l 5,25 nmol/lS117 3,93 nmol/l 6,04 nmol/l 18,90 nmol/l

3 Ergebnisse 26

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1,25 2,5 5 7,5 10 15 20 30 40 50 60

Re

l.Z

ell

üb

erl

eb

en

sra

e im

Vg

l. z

ur

Ko

ntr

oll

e [

%]

Bortezomib [nmol/l]

LX1 MX1 S117

Abbildung 3.1: Dargestellt sind die Zelluberlebensraten fur Bortezomib bei den ZelllinienMX1 (n=10), LX1 (n=10) und S117 (n=10). Die y-Achse stellt dierelative Uberlebensrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, unddie x-Achse die untersuchte Bortezomibkonzentration in nmol/l dar.

3.1.2 Ermittlung der Konzentrationsreihen von Mafosfamid

und 4OH-Trofosfamid

Außerdem wurden in dieser Arbeit Mafosfamid und 4OH-Trofosfamid zur Behand-

lung der drei Zelllinien untersucht. Das in den In-vitro-Versuchen verwendete 4OH-

Trofosfamid wird im folgenden Text als Trofosfamid bezeichnet. In der Tabelle 3.2

ist die jeweilige IC50 der beiden Oxazaphosphorine dargestellt. Trofosfamid zeigte

fur alle drei Zelllinien eine geringfugig hohere IC50 als Mafosfamid. In der gleichen

Tabelle sind die in den Versuchen verwendeten Konzentrationsreihen fur die einzelnen

Zelllinien aufgefuhrt. Die in den Arbeiten von Klink et al. [44] und Letsch et al. [54]

verwendeten Oxazaphosphorin-Konzentrationen wurden mit der vorliegenden Arbeit

bestatigt.

Tabelle 3.2: Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine

Oxazaphosphorin MX1 LX1 S117

MafosfamidIC50 5,91 µmol/l 11,83 µmol/l 15,07 µmol/lKonz.-reihe

1,25; 2,5; 5; 7,5;10; 15 µmol/l

2,5; 5; 10; 20; 40µmol/l

5; 10; 15; 20; 30µmol/l

TrofosfamidIC50 12,85 µmol/l 16,75 µmol/l 16,08 µmol/lKonz.-reihe

2,5; 5; 10; 15; 20;30 µmol/l

2,5; 5; 10; 20; 40µmol/l

5; 10; 15; 20; 30µmol/l

3 Ergebnisse 27

3.1.3 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung

Die Zelllinien wurden mit den in Tabelle 3.2 aufgefuhrten Konzentrationsreihen fur

Mafosfamid oder Trofosfamid behandelt und mit Bortezomib IC25, IC50 bzw. IC75

(Tab. 3.1) kombiniert. Als Kontrolle diente eine Behandlung mit Mafosfamid und Tro-

fosfamid als Einzeltherapie. Um Unterschiede in den Kombinationsbehandlungen und

den Einzelbehandlungen zu ermitteln, wurden die Zelluberlebensraten der Kombinati-

onsbehandlungen mit denen der Einzelbehandlung verglichen. Im Folgenden wird uber

Signifikanzen geschrieben, die sich auf den Vergleich mit der jeweiligen Einzelbehandlung

beziehen. Die berechneten p-Werte sind im Anhang fur die Zelllinien MX1, LX1 und

S117 zu sehen (Anhang C). Außerdem wird der”Combination Index“ (CI) verwendet,

um zu beurteilen, ob eine Kombinationsbehandlung einen wirkungsverstarkenden oder

einen wirkungsabschwachenden Effekt hat. Dies wird in Kapitel 2.9 und Tabelle 2.8

beschrieben.

3.1.3.1 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und

Bortezomib

In den Abbildungen 3.2-3.4 wird an den Zelllinen MX1, LX1 und S117 die Einzeltherapie

mit der Mafosfamidkonzentrationsreihe im Vergleich zur Kombinationstherapie der

Konzentrationsreihe mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 gezeigt. Abbildung 3.2

stellt die zeitgleiche Kombinationsgabe an der Zelllinie MX1 dar. Es konnten fur alle

Mafosfamidkonzentrationen bei der Kombinationsgabe mit Bortezoimb IC75 signifikante

Unterschiede ermittelt werden (Tab. 3.3). Bei den Kombinationen mit Bortezomib IC50

waren alle Messpunkte signifikant bis auf den mit der hochsten Mafosfamidkonzentration.

Im Gegensatz dazu konnten Signifikanzen bei der Kombination mit Bortezomib IC25

nur fur die Mafosfamidkonzentrationen 1,25 µmol/l bis 5 µmol/l ermittelt werden. Die

Kombination von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte CI-Werte knapp uber und

unter eins, was einem moderat antagonistischen bis moderat synergistischen Effekt

entspricht (Tab. 3.4).

In Abbildung 3.3 sind die Kombinationsversuche fur das LX1 abgebildet. Die Kombina-

tion von Mafosfamid mit Bortezomib IC25 war dem Kurvenverlauf der Kontrolle sehr

ahnlich. Nur bei der Mafosfamidkonzentration von 5 µmol/l konnte eine Signifikanz

nachgewiesen werden (Tab. 3.3). Die Kombinationen mit Bortezomib IC50 bzw. IC75

ahnelten sich in ihrem Verlauf und unterschieden sich signifikant von der der Kontrolle

anhand der niedrigsten drei bzw. vier Mafosfamidkonzentrationen. Die Kombination

von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte CI-Werte uber eins entsprechend einem

moderat antagonistischen bis antagonistischen Effekt (Tab. 3.4).

3 Ergebnisse 28

Die Ergebnisse der Versuche mit der Zelllinie S117 sind in Abbildung 3.4 dargestellt.

Auch hier war der Kurvenverlauf der Kombination mit Bortezomib IC25 der Kontrolle

sehr ahnlich und wies keinen signifikanten Unterschied auf (Tab. 3.3). Die Kombina-

tion von Mafosfamid mit Bortezomib IC50 zeigte signifikante Unterschiede fur die

drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen. Ahnlich war es bei der Kombination mit

Bortezomib IC75, die mit Ausnahme der beiden hochsten Mafosfamidkonzentrationen

Signifikanzen zeigte (Tab. 3.3). Die Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC50

zeigte CI-Werte, die knapp unter eins lagen, und belegen somit einen additiven bis

moderat synergistischen Effekt (Tab. 3.4).

Tabelle 3.3: Signifikante (+) und nicht signifikante (-) Unterschiede der zeitgleichenKombinationsbehandlungen mit Mafosfamid und Bortezomib IC25, IC50bzw. IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Signifikanzniveau p≤0,05.

MX1

Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15M vs. M + B IC25 + + + - - -M vs. M + B IC50 + + + + + -M vs. M + B IC75 + + + + + +

LX1

Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40M vs. M + B IC25 - + - - -M vs. M + B IC50 + + + - -M vs. M + B IC75 + + + + -

S117

Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30M vs. M + B IC25 - - - - -M vs. M + B IC50 + + + - -M vs. M + B IC75 + + + + -

Tabelle 3.4: Der CI der zeitgleichen Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid (M) undBortezomib IC50 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Der CI ist in Kap.2.9 erlautert.

MX1M µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15CI 1.309 1.197 1.118 0.857 0.771 0.815

LX1M µmol/l 2,5 5 10 20 40CI 1.377 1.590 1.771 1.638 1.247

S117M µmol/l 5 10 15 20 30CI 1.028 1.085 0.803 0.759 0.796

3 Ergebnisse 29

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1,25 2,5 5 7,5 10 15

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]

Mafosfamid [µmol/l]

Mafosfamid Mafosfamid + Bortezomib IC25Mafosfamid + Bortezomib IC50 Mafosfamid + Bortezomib IC75

Abbildung 3.2: Dargestellt ist die relative Uberlebensrate des MX1 unter der Behand-lung mit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbe-handlung mit Bortezomib IC25 (n=14), IC50 (n=14) und IC75 (n=14).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2,5 5 10 20 40

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]



Abbildung 3.3: Abgebildet ist die relative Uberlebensrate des LX1 unter der Behandlungmit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlungmit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=11) und IC75 (n=12).

3 Ergebnisse 30

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 30

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]



Abbildung 3.4: Die Grafik zeigt die relative Uberlebensrate des S117 unter der Be-handlung mit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinati-onsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=10) und IC75(n=12).

3.1.3.2 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und

Bortezomib

In den Abbildungen 3.5-3.7 wird die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und

Bortezomib IC25, IC50 und IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117 dargestellt.

In diesen Versuchen wurde die Kombination von Trofosfamid und Bortezomib mit der

Einzelbehandlung mit Trofosfamid verglichen.

Die Ergebnisse mit MX1 sind in Abbildung 3.5(a) dargestellt. Bei der Kombination

von Trofosfamid und Bortezomib IC25 gab es einen signifikanten Unterschied fur die

Trofosfamidkonzentration 5 µmol/l (Tab. 3.5). Vergleichsweise gab es Signifikanzen fur

die Kombinationen mit Bortezomib IC50 und IC75 bei den Trofosfamidkonzentrationen

5 µmol/l bis 10 µmol/l. In Abbildung 3.5(b) ist der CI der Kombination von Trofosfamid

mit Bortezomib IC50 grafisch dargestellt. Die Ordinatenachse zeigt den CI an, wobei die

gestrichelte Linie CI=1 markiert, welches der Umschlagpunkt zwischen Synergismus und

Antagonismus ist. Alle gemessenen Werte hatten einen CI von uber 1 und lagen somit im

antagonistischen Bereich. Den Zahlenwerten des CI kann man entnehmen, dass der Effekt

der Kombinationsbehandlung rein antagonistisch war (Tab. 3.6).

An der Abbildung 3.6 zum LX1 wird deutlich, dass alle drei Kurven der Kombinations-

versuche sich der Trofosfamidkontrolle schon bei geringen Trofosfamidkonzentrationen

anpassen. Die Kurven deuten anfanglich eine Abnahme der Proliferationshemmung an,

3 Ergebnisse 31

im Sinne eines antagonistischen Effekts. Der CI zur Kombination von Trofosfamid und

Bortezomib IC50 bestatigt dies (Tab. 3.6). Der einzige signifikante Unterschied war

fur die Trofosfamidkonzentration von 2,5 µmol/l bei der Kombination mit Bortezomib

IC75 zu sehen (Tab. 3.5).

Die Versuche zum S117 wurden in Abbildung 3.7 dargestellt. Auch hier war die Kurve

der Kombination mit Bortezomib IC25 der Kontrolle sehr ahnlich und wies keinen

signifikanten Unterschied auf (Tab. 3.6). Die Kombination mit Bortezomib IC50 wies

lediglich eine Signifikanz fur die niedrigste Trofosfamidkonzentration auf, wohingegen

die Kombination mit Bortezomib IC75 fur die Konzentrationen 5 µmol/l bis 15 µmol/l

Signifikanzen aufwies. Der CI der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50

lag zwischen 1,3 und 1,9, entsprechend einer Wirkungsabschwachung im moderat

antagonistischen bis antagonistischen Bereich (Tab. 3.6).

Zusammenfassend fur die zeitgleichen Kombinationstherapien kann man sagen, dass

die Zelllinien allen Behandlungen gegenuber sensibel waren. Wie zu erwarten, zeigte

sich, dass mit steigender Dosis von Mafosfamid die Proliferationsrate der Zellen fiel

und ein vorhandener signifikanter Unterschied mit steigender Mafosfamidkonzentration

immer kleiner wurde. Ahnliches war auch fur die Kombination mit Trofosfamid zu

beobachten, wobei die Proliferation anfanglich jedoch stabil war bzw. tendenziell zunahm,

was den Eindruck erweckt, dass eine Kombination mit Mafosfamid und Bortezomib

einen besseren Effekt hat als die Kombination mit Trofosfamid. Ein additiver bis

synergistischer Effekt wurde nur fur die Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid

fur das MX1 und das S117 festgestellt, jedoch nicht fur das LX1. Die Kombination

mit Trofosfamid zeigte fur alle drei Zelllinien einen unterschiedlich stark ausgepragten

Antagonismus.

3 Ergebnisse 32

(a)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2,5 5 10 15 20 30

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]

Trofosfamid [µmol/l]

Trofosfamid Trofosfamid + Bortezomib IC25Trofosfamid + Bortezomib IC50 Trofosfamid + Bortezomib IC75

(b)

Abbildung 3.5: (a)Dargestellt ist die relative Uberlebensrate vom MX1 unter der Be-handlung mit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinati-onsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=12), IC50 (n=12) und IC75(n=12). In Abbildung (b) ist der CI im Vergleich zur rel. Uberlebensrateals Fraktion (eng. Fractional Effect) zu sehen. Der Effekt der Kom-binationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 wird mitder jeweiligen Einzelbehandlung der beiden Stoffe verglichen. Die Mess-punkte sind nach steigender Konzentration nummeriert, wobei 1 derniedrigsten und 6 der hochsten Trofosfamidkonzentration entspricht.

3 Ergebnisse 33

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2,5 5 10 20 40

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]



Abbildung 3.6: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate vom LX1 unter der Behandlungmit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlungmit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=11) und IC75 (n=12).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 30

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]



Abbildung 3.7: Die Grafik zeigt die rel. Uberlebensrate vom S117 unter der Behandlungmit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlungmit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=10) und IC75 (n=12).

3 Ergebnisse 34

Tabelle 3.5: Signifikante (+) und nicht signifikante (-) Unterschiede der zeitgleichenKombinationsbehandlungen mit Trofosfamid und Bortezomib IC25, IC50bzw. IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Signifikanzniveau p≤0,05.

MX1

Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30T vs. T + B IC25 - + - - - -T vs. T + B IC50 + + + - - -T vs. T + B IC75 + + + - - -

LX1

Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40T vs. T + B IC25 - - - - -T vs. T + B IC50 - - - - -T vs. T + B IC75 + - - - -

S117

Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30T vs. T + B IC25 - - - - -T vs. T + B IC50 + - - - -T vs. T + B IC75 + + + - -

Tabelle 3.6: CI der zeitgleichen Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid (T) undBortezomib IC50 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Siehe auch Kap.2.9

MX1T µmol/l 2,5 5 15 10 20 30CI 2.112 2.201 2.482 1.938 1.677 1.995

LX1T µmol/l 2,5 5 10 20 40CI 1.780 1.903 2.037 1.813 0.858

S117T µmol/l 5 10 15 20 30CI 1.616 1.753 1.828 1.336 1.406

3.1.4 Zeitversetzte Kombinationsversuche

Nach den unter Kapitel 3.1.3 beschriebenen zeitgleichen Kombinationsgaben wurde

der Frage nachgegangen, ob eine zeitversetzte Gabe der Medikamente Einfluss auf das

Uberleben der Tumorzellen hat. Diese Frage stellt sich, da eine zeitversetzte Gabe der

Stoffe theoretisch von Vorteil sein konnte, wenn man bedenkt, dass die Oxazaphos-

phorine am besten auf schnell proliferierende Gewebe wirkt, wohingegen Bortezomib

zyklusunspezifisch einen hemmenden Effekt auf den Zellzyklus ausubt. Das eine zeitver-

setzte Gabe von Medikamenten einer zeitgleichen Gabe uberlegen seien kann, haben

Gomi et al. bereits 1992 gezeigt. Mit ihren In-vitro-Versuchen an einer NSCLC-Zelllinie

zeigten sie, dass die zeitversetzte Gabe von Navelbine und Cisplatin einen agonis-

tischen Effekt hatte, wohingegen die zeitgleiche Gabe einen antagonistischen Effekt

hatte [32]. Die In-vivo-Versuche zu einem NSCLC von Kodama et al. zeigten, dass die

zeitversetzte Gabe von Cisplatin und Docetaxel der zeitgleichen Gabe uberlegen war

[45].

3 Ergebnisse 35

In den vorliegenden zeitversetzten Versuchen wurde, wie in Kapitel 2.7.2 beschrieben,

erst Mafosfamid bzw. Trofosfamid und dann zeitversetzt Bortezomib gegeben und umge-

kehrt. Aus Grunden der Lesbarkeit werden diese Kombinationen im folgenden Text an

einigen Stellen als Abkurzungen dargestellt, wobei”M“ fur Mafosfamid,

”T“ fur Trofosfa-

mid und”B IC25“ bzw.

”B IC50“ fur Bortezomib IC25 bzw. IC50 steht. Die zeitversetzte

Kombination, in der Bortezomib IC25 nach Mafosfamid gegeben wurde, ist als”M>B

IC25“ dargestellt. Die Kombination mit Bortezomib IC75 wurde nicht durchgefuhrt, da

die hohe Apoptoserate einen nur geringen Spielraum fur die Kombinationsbehandlung

ubrig ließ. Im Anschluss an die um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen

wurde untersucht, ob eine Verlangerung des Zeitintervalls auf zwei Stunden die gefunde-

nen Effekte verstarkt. In diesen Versuchen wurden nur Kombinationen mit Bortezomib

IC50 untersucht, da man an diesen Kombinationen sowohl antagonistische als auch

synergistische Effekte gut darstellen kann. Der genaue Versuchsaufbau wurde unter

Kapitel 2.7.3 beschrieben. Aus Grunden der Ubersichtlichkeit werden in den folgenden

Kapiteln einige Grafiken lediglich im Anhang B aufgefuhrt, insbesondere wenn sie keine

neuen Informationen bringen. Die Ergebnisse werden stattdessen tabellarisch zusam-

mengefasst. Das adjustierte Signifikanzniveau lag bei den zeitversetzten Versuchen, wie

in Kapitel 2.9 erklart, bei p≤ 0,025.


MX1

Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am

MX1

Die um eine Stunde versetzten Kombinationsversuche mit Mafosfamid und Bortezomib

IC50 am MX1 sind in Abbildung 3.8 dargestellt. Der Kurvenverlauf der zeitgleichen

Kombinationen, wie sie in Abbildung 3.2 zu sehen sind, und der hier dargestellten

zeitversetzten Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC50 ahneln einander.

Die zeitversetzten Kombinationen mit Bortezomib IC50 zeigten Signifikanzen fur die

Mafosfamidkonzentrationen 1,25-5µmol/l (Tab. 3.7). Es gab keinen signifikanten Un-

terschied im Vergleich zwischen den zeitversetzten Kombinationen, unabhangig davon,

ob Mafosfamid an erster oder zweiter Stelle gegeben wurde. Der Tabelle 3.7 kann

man entnehmen, dass der CI der zeitversetzten Kombination”M>B IC50“ großtenteils

im additiven Bereich lag, wohingegen die Kombination”B IC50>M“ einen leichten

Antagonismus aufwies. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Die zeitversetzten

Kombinationen von Mafosfamid und Bortezomib IC25 unterschieden sich nicht signifi-

kant von der Einzelbehandlung mit Mafosfamid. Grafik und p-Werte sind im Anhang

B.1 und C.7 zu finden.

3 Ergebnisse 36

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1,25 2,5 5 7,5 10 15

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]


Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hBortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h

Abbildung 3.8: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate der um eine Stunde versetztenKombinationsversuche von Mafosfamid und Bortezomib IC50 im Ver-gleich zur Mafosfamidkontrolle am MX1 (n=15).

Tabelle 3.7: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt derTabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9.

Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15

p-WerteM vs. M>B IC50 + + + - - -M vs. B IC50 >M + + + - - -

M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - - -

CIM >B IC50 1.149 1.125 0.922 0.916 0.844 1.099B IC50 >M 1.557 1.483 1.183 1.138 0.977 2.242

Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid am

MX1

Als Erweiterung der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen wurde

untersucht, ob eine Verlangerung des Intervalls zwischen der Medikamentengabe auf

zwei Stunden vorhandene Effekte verstarkt. Die um zwei Stunden versetzte Kombination

von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte einen ahnlichen Kurvenverlauf, wie die um

eine Stunde versetzte Kombination (Anhang B.3 und C.11). Signifikante Unterschiede

waren fur die drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen zu sehen, wie auch bei der

um eine Stunde versetzten Kombination (Tab. 3.8). Die Gabe von Mafosfamid zwei

Stunden vor oder nach Bortezomib IC50 zeigte keinen unterschiedlichen Effekt. Der CI

3 Ergebnisse 37

der um zwei Stunden versetzten Kombination streckte sich von moderat antagonistisch

bis synergistisch fur beide Kombinationsvarianten (Tab. 3.8).

Tabelle 3.8: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt derTabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kapitel2.9.


p-WerteM vs. M>B IC50 + + + - - -M vs. B IC50 >M + + + - - -

M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - - -

CIM >B IC50 1.412 1.263 1.055 0.811 0.708 0.584B IC50 >M 1.392 1.207 1.027 0.933 0.861 0.675


MX1

Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am

MX1

Die um eine Stunde versetzten Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib

IC50 am MX1 zeigten einen ahnlichen Kurvenverlauf wie die zuvor in Abbildung 3.5(a)

dargestellten zeitgleichen Kombinationsversuche. Die um eine Stunde versetzten Kom-

binationen von Trofosfamid und Bortezomib IC50 sind in Abbildung 3.9 dargestellt.

Fur beide Kombinationsvarianten waren Signifikanzen fur die zwei niedrigsten Trofos-

famidkonzentrationen zu sehen (Tab. 3.9). Im Vergleich der Kombinationsvarianten

untereinander zeigten sich signifikante Unterschiede fur die Konzentrationen 5 µmol/l

und 15 µmol/l. Die zeitversetzte Kombination”B IC50 >T“ lag hauptsachlich im

antagonistischen Bereich, ahnlich der zeitgleichen Kombination (Tab. 3.9). Die zeitver-

setzte Kombination”T >B IC50“, die an zwei Messpunkten einen signifikant hoheren

antineoplastischen Effekt aufwies als”B IC50 >T“, hatte lediglich einen geringfugig

niedrigeren CI im moderat antagonistischen bis antagonistischen Bereich. Die um eine

Stunde versetzten Kombinationen von Trofosfamid und Bortzeomib IC25 wiesen keine

signifikanten Unterschiede auf, weder im Vergleich zur Kontrolle noch im Vergleich

zueinander (Anhang B.2 und C.9).

3 Ergebnisse 38

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2,5 5 10 15 20 30Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]


Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h

Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h

Abbildung 3.9: Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate des MX1 bei der um eine Stundeversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=15).

Tabelle 3.9: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt derTabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9

Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30

p-WerteT vs. T >B IC50 + + - - - -T vs. B IC50 >T + + - - - -

T >B IC50 vs. B IC50 >T - + - + - -

CIT >B IC50 1.432 1.562 1.379 1.359 0.946 0.983B IC50 >T 1.987 2.438 2.088 2.088 1.158 1.212

Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am

MX1

Die Verlangerung des Zeitintervalls zwischen der Arzneimittelgabe bei der Kombination

von Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1 hatte keinen bedeutenden wirkungs-

verstarkenden Effekt. Abbildung und p-Werte sind im Anhang B.4 und C.12 abgebildet.

Der Vergleich der um eine und um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuche von

Trofosfamid und Bortezomib IC50 zeigte eine Veranderung in der Anzahl signifikan-

ter Messpunkte fur die Kombination”T>B IC50“. Wahrend bei der um eine Stunde

versetzten Kombinationsbehandlung signifikante Unterschiede fur die Trofosfamidkon-

zentrationen von 2,5 - 5 µmol/l gemessen wurden, zeigte die um zwei Stunden versetzte

Kombination Signifikanzen fur die Trofosfamidkonzentrationen von 2,5 - 15 µmol/l (Tab.

3 Ergebnisse 39

3.9 und 3.10). Die Verlangerung des Zeitintervalls fur die Kombinationsbehandlung”B

IC50>T“ bewirkte dahingegen keine Veranderung. Im Vergleich der beiden um zwei

Stunden versetzten Kombinationen untereinander zeigten sich signifikante Unterschiede

fur die Trofosfamidkonzentrationen 5 - 10 µmol/l. Der CI der Kombination”T>B

IC50“ lag im moderat antagonistischen bis additiven Bereich, wohingegen der CI der

Kombination”B IC50>T“ im antagonistischen Bereich lag. Wie auch bei den um eine

Stunde versetzten Kombinationen zu sehen war, hatte die Kombination”T>B IC50“

einen geringfugig starkeren antineoplastischen Effekt als die Kombination”B IC50>T“.

Die Kombination”T>B IC50“ zeigt jedoch lediglich zwei signifikante Messpunkte und

einen CI uber eins.

Tabelle 3.10: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationsthera-pie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnittder Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) odernicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Ab-schnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Sieheauch Kap. 2.9


p-WerteT vs. T>B IC50 + + + + - -T vs. B IC50 >T + + - - - -

T>B IC50 vs. B IC50>T - + + - - -

CIT >B IC50 1.167 1.252 1.184 1.009 0.826 0.764B IC50 >T 1.923 2.270 2.261 1.823 1.037 0.961


LX1


LX1

In Abbildung 3.10 ist die um eine Stunde versetzte Kombination von Mafosfamid

und Bortezomib IC50 am LX1 abgebildet. Die Kombination”B IC50>M“ zeigte si-

gnifikante Unterschiede fur die Mafosfamidkonzentrationen 2,5 und 5 µmol/l (Tab.

3.11). Vergleichsweise erbrachte die Kombination”M>B IC50“ Signifikanzen fur die

Mafosfamidkonzentrationen 2,5 - 10 µmol/l. Signifikanzen fur die drei niedrigsten Ma-

fosfamidkonzentrationen waren auch bei den zeitgleichen Kombinationen zu sehen (Tab.

3.3). Der CI der zeitversetzten Kombination”M>B IC50“ lag im moderat antagonistisch

Bereich, wohingegen die Kombination”B IC50>M“ hauptsachlich im antagonistischen

Bereich lag (Tab. 3.11). Fur die zeitgleiche Kombination wurden ahnliche CI-Werte

3 Ergebnisse 40

dokumentiert wie fur die zeitversetzten Kombinationen. Der Vergleich der zwei zeit-

versetzten Kombinationen untereinander zeigte einen signifikanten Unterschied fur die

Mafosfamidkonzentration 2,5 µmol/l. Die um eine Stunde versetzten Kombinationen

von Mafosfamid und Bortezomib IC25 wiesen keine signifikanten Unterschiede auf,

weder im Vergleich zur Mafosfamid-Kontrolle noch im Vergleich untereinander (Anhang

B.5 und C.13).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2,5 5 10 20 40Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]



Abbildung 3.10: Die Abbildung zeigt die rel. Uberlebensrate des LX1 bei den umeine Stunde versetzten Kombinationstherapien mit Mafosfamid undBortezomib IC50 im Vergleich zur Kontrolle mit Mafosfamid (n=11).

Tabelle 3.11: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9

Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40

p-WerteM vs. M>B IC50 + + + - -M vs. B IC50 >M + + - - -

M>B IC50 vs. B IC50>M + - - - -

ICM >B IC50 1.286 1.367 1.223 1.130 1.588B IC50 >M 1.548 1.520 1.395 1.214 1.592

3 Ergebnisse 41

Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am

LX1

Die um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib

IC50 am LX1 ahnelt vom Kurvenverlauf den zuvor durchgefuhrten zeitgleichen und

um ein Stunde versetzten Kombinationen (Anhang B.7). Ungleich der um eine Stunde

versetzten Kombinationsbehandlungen zeigten die um zwei Stunden versetzten Kombi-

nationen Signifikanzen fur die drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen fur beide

Kombinationsvarianten (Tab. 3.12). Dafur war beim Vergleich der beiden Kombinatio-

nen untereinander keine Signifikanz festzustellen. Der CI zeigte fur die Kombination

”M >B IC50“ einen moderat antagonistischen Effekt und fur die Kombination

”B IC50

>M“ einen antagonistischen Effekt, wobei es jedoch keinen signifikanten Unterschied

gab (Tab. 3.12).

Tabelle 3.12: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9


p-WerteM vs. M>B IC50 + + + - -M vs. B IC50 >M + + + - -

M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - -

ICM >B IC50 1.230 1.357 1.494 1.350 1.187B IC50 >M 1.331 1.464 1.690 1.548 1.404


LX1


LX1

Die zeitversetzten Kombinationen mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 unterschieden

sich deutlich von der zeitgleich Kombination (Abb. 3.11). Es zeigten sich Signifikanzen

fur die drei bzw. vier niedrigsten Trofosfamidkonzentrationen fur die Kombination

”T>B IC50“ bzw.

”B IC50>T“ (Tab. 3.13). Im Gegensatz dazu unterschied sich die

zeitgleiche Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50 nicht signifikant von der

Kontrolle (Tab. 3.5). Die Graphen der beiden zeitversetzten Kombinationen kreuzen

sich an einem Punkt. Es ergaben sich signifikante Unterschiede beim Vergleich der

3 Ergebnisse 42

Kombinationsvarianten untereinander fur die Konzentrationen 2,5 und 5 µmol/l sowie

20 µmol/l. Der CI beschreibt die Wirkung der beiden Kombinationsvarianten als ant-

agonistisch bis leicht antagonistisch, fur die Kombination”B IC50>T“ sogar bis additiv

(Tab. 3.13). Das Proliferationsverhalten der LX1 unter der Kombinationsbehandlung

mit Trofosfamid und Bortezomib IC25, ahnelte dem der zeitgleichen Kombinations-

behandlung. Sie zeigten weder Signifikanzen im Vergleich zur Trofosfamid-Kontrolle

noch im Vergleich der zeitversetzten Kombinationen untereinander. Die Grafik und die

p-Werte sind im Anhang B.6 und C.15 zu finden.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2,5 5 10 20 40

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]


Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hBortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h

Abbildung 3.11: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate des LX1 unter der um eine Stundeversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=13).

Tabelle 3.13: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9.

Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40

p-WerteT vs. T>B IC50 + + + - -T vs. B IC50 >T + + + + -

T>B IC50 vs. B IC50>T + + - + -

ICT >B IC50 1.208 1.386 1.675 1.739 1.114B IC50 >T 1.479 1.637 1.425 0.998 0.882

3 Ergebnisse 43


LX1

Die Ergebnisse der Versuche, in denen Trofosfamid und Bortezomib IC50 im Abstand von

zwei Stunden gegeben wurden, sind in Abbildung 3.12 zu sehen. Die um zwei Stunden

versetzte Kombination”T>B IC50“ zeigte einen gleichen Kurvenverlauf, wie dieselbe

Kombination mit einem Behandlungsintervall von einer Stunde. In beiden Fallen waren

signifikante Unterschiede zu sehen im Vergleich zu den drei niedrigsten Konzentrationen

der Kontrolle (Tab. 3.14). Die um zwei Stunden versetzte Kombination”B IC50>T“

unterschied sich von der Kontrolle lediglich bei der Mafosfamidkonzentration 2,5 µmol/l.

Ahnlich der zeitgleichen Kombinationstherapie waren CI-Werte im antagonistischen

Bereich zu sehen (Tab. 3.14). Die Kombination”T >B IC50“ befand sich im moderat

antagonistischen bis antagonistischen Bereich. Der Unterschied zwischen den beiden

Kombinationsvarianten war fur die beiden niedrigsten Trofosfamidkonzentrationen

signifikant.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 2,5 5 10 20 40

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]



Abbildung 3.12: Abgebildet ist rel. Uberlebensrate des LX1 bei der um zwei Stundenversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=13).

3 Ergebnisse 44

Tabelle 3.14: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationsthera-pie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnittder Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) odernicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Ab-schnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Sieheauch Kap. 2.9.


p-WerteT vs. T>B IC50 + + + - -T vs. B IC50 >T + - - - -

T>B IC50 vs. B IC50>T + + - - -

ICT >B IC50 1.235 1.322 1.537 1.489 1.591B IC50 >T 1.567 1.820 2.157 2.177 1.813


S117


S117

Die um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid und Borte-

zomib IC25 am S117 erbrachten Signifikanzen fur die zwei niedrigsten Mafosfamidkon-

zentrationen in beiden Kombinationsvarianten (Tab. 3.15). Im Vergleich dazu zeigte

die zeitgleiche Kombination keine Signifikanzen (Tab. 3.3). Im Vergleich untereinander

zeigten die beiden Varianten der zeitversetzten Kombinationen keinen signifikanten

Unterschied. Grafik und p-Werte sind im Anhang B.8 und C.19 abgebildet. Die zeit-

versetzten Kombinationsversuche mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigten fur

beide Kombinationen einen fast deckungsgleichen Kurvenverlauf (Abb. 3.13(a)). Die

Ergebnisse der Kombinationen”M>B IC50“ bzw.

”B IC50>M“ zeigten Signifikanzen

fur die vier bzw. drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen (Tab. 3.15). Der Ver-

gleich der Kombinationen untereinander erbrachte keinen signifikanten Unterschied.

Der CI beider Kombinationen lag zwischen 0,82 und 1,14 und befand sich somit im

uberwiegend additiven Bereich. Dies ist grafisch am Beispiel der Kombination”M>B

IC50“ dargestellt (Abb. 3.13(b)).

3 Ergebnisse 45

(a)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 30

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]



(b)

Abbildung 3.13: (a) Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate des S117 bei der um eineStunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid undBortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Mafosfamid(n=31). In Abbildung (b) ist der CI im Vergleich zur rel. Uberlebensrateals Fraktion (eng. Fractional Effect) zu sehen. Der Effekt der um eineStunde versetzten Kombinationsbehandlung

”M>B IC50“ wird mit

der jeweiligen Einzelbehandlung der beiden Stoffe verglichen. DieMesspunkte sind nach steigender Konzentration nummeriert, wobei 1der niedrigsten und 5 der hochsten Mafosfamidkonzentration entspricht.

3 Ergebnisse 46

Tabelle 3.15: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9.

Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30

p-WerteM vs. M>B IC50 + + + + -M vs. B IC50 >M + + + - -

M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - -

CIM >B IC50 1.081 1.158 1.004 0.875 0.823B IC50 >M 1.144 1.173 1.092 0.988 0.948

Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am

S117

Bei den um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuchen von Mafosfamid und Bor-

tezomib IC50 am S117 bewirkte die Verlangerung des Zeitintervalls auf zwei Stunden

keinen Unterschied. Abbildung und p-Werte sind im Anhang B.10 und C.24 dargestellt.

Signifikante Unterschiede zeigten die vier bzw. drei niedrigsten Mafosfamidkonzen-

trationen fur die Kombination”M>B IC50“ bzw.

”B IC50 >M“ (Tab. 3.16). Beide

Kombinationsvarianten der um zwei Stunden versetzten Behandlung zeigten CI-Werte

im additiven bis leicht synergistischen Bereich (Abb. 3.14). Gleiches war fur die um

eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen zu sehen (Tab. 3.15). Der Unter-

schied zwischen den um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlungen war nicht

signifikant (Tab. 3.16).

Tabelle 3.16: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9.


p-WerteM vs. M>B IC50 + + + + -M vs. B IC50 >M + + + - -

M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - -

CIM >B IC50 0.876 0.777 0.751 0.956 1.063B IC50 >M 0.942 0.865 0.879 1.093 1.528

3 Ergebnisse 47

Abbildung 3.14: Dargestellt ist der CI im Vergleich zur rel. Uberlebensrate als Fraktion(eng. Fractional Effect). Der Effekt der um zwei Stunden versetztenKombinationsbehandlung

”M>B IC50“ wird mit der jeweiligen Einzel-

behandlung der beiden Stoffe verglichen. Die Messpunkte sind nachsteigender Konzentration nummeriert, wobei 1 der niedrigsten und 5der hochsten Mafosfamidkonzentration entspricht.


S117


S117

Die um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib

IC25 zeigte, wie dieselbe zeitgleiche Kombination, keine signifikanten Unterschiede

im Vergleich zur Kontrolle. Im Vergleich untereinander unterschieden sich die beiden

zeitversetzten Kombinationsbehandlungen mit Bortezomib IC25 ebenfalls nicht (Anhang

B.9 und C.21). Die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 mit

einem Zeitintervall von einer Stunde ist in Abbildung 3.15 dargestellt. Die Kombination

”B IC50>T“ erbrachte Signifikanzen fur die Konzentrationen 5 µmol/l und 10 µmol/l,

wohingegen die zeitgleiche Kombination lediglich fur die niedrigste Konzentration einen

signifikanten Unterschied aufwies (Tab. 3.17). Im Vergleich dazu zeigte die Kombination

”T>B IC50“ Signifikanzen fur alle untersuchten Konzentrationen. Der Vergleich der

beiden Kombinationsvarianten untereinander erbrachte signifikante Unterschiede fur

alle bis auf die hochste Trofosfamidkonzentration. Die Kombination”T>B IC50“ lag

im additiven bis leicht antagonistischen Bereich im Vergleich zur Kombination”B

3 Ergebnisse 48

IC50>T“, welche im moderat antagonistischen bis antagonistischen Bereich lag (Tab.

3.17).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 30

Rel

. Zel

lübe

rlebe

nsra

te im

Vgl

. zur

Kon

trol

le [%

]



Abbildung 3.15: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate des S117 unter den um eineStunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Trofosfamid undBortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid(n=31).

Tabelle 3.17: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9.

Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30

p-WerteT vs. T>B IC50 + + + + +T vs. B IC50 >T + + - - -

T>B IC50 vs. B IC50>T + + + + -

CIT >B IC50 1.012 1.184 1.141 1.156 0.843B IC50 >T 1.438 1.943 1.984 1.784 1.120


S117

Die um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib

IC50 am S117 erreichten nicht den gleichen Effekt wie dieselbe Kombination mit einer

Stunde zwischen den Behandlungen (Anhang B.11). Die um zwei Stunden versetzten

Kombinationsbehandlungen erbrachten lediglich Signifikanzen fur die ersten drei bzw.

3 Ergebnisse 49

zwei Trofosfamidkonzentrationen fur die Kombinationen”T >B IC50“ bzw.

”B IC50 >T“

(Tab. 3.18). Der Vergleich zwischen den beiden Kombinationen zeigte einen signifikanten

Unterschied fur die niedrigste Trofosfamidkonzentration. Der CI zeigte einen leichten

antagonistischen Effekt fur die Kombination”T >B IC50“, wohingegen die Kombination

”B IC50 >T“ einen antagonistischen Effekt hatte.

Tabelle 3.18: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationsthera-pie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnittder Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) odernicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Ab-schnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Sieheauch Kap. 2.9.


p-WerteT vs. T>B IC50 + + + - -T vs. B IC50 >T + + - + -

T>B IC50 vs. B IC50>T + - - - -

CIT >B IC50 1.106 1.282 1.220 0.933 0.714B IC50 >T 1.755 1.338 1.390 0.794 0.831

3.2 Versuchsablauf in vivo

Aufgrund der umfangreichen In-vitro-Versuche und der hinsichtlich der Tieranzahl

restriktiven Tierversuchsgenehmigung wurde die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im

Tiermodell exemplarisch anhand der LX1-Zelllinie untersucht. Diese Zelllinie zeigte bei

den In-vitro-Experimenten die beste Ansprechrate auf die untersuchten Chemothera-

peutika. Die Ergebnisse werden aufgrund der marginalen Unterschiede zwischen den

Versuchen und der geringen Fallzahl nur deskriptiv dargestellt. Die Tiere wurden mit

Bortezomib, Trofosfamid und Cyclophosphamid wie unter Kapitel 2.8.5 behandelt. Die

Versuche wurden wie unter Kapitel 2.9 ausgewertet.

3.2.1 Bortezomib als Einzelbehandlung

In den ersten Tierversuchen wurde untersucht, wie das Tumorwachstum auf die Ein-

zelbehandlung mit Bortezomib reagiert. In Abbildung 3.16 wurde die Behandlung

mit Bortezomib in verschieden Konzentrationen dargestellt. Die y-Achse stellt das

Tumorvolumen in mm3 und die x-Achse die Zeit in Tagen dar. Der Abbildung kann

man entnehmen, dass die unbehandelte Kontrolle das Zielvolumen von 800 mm3 nach

ca. 6,5 Tagen erreicht, wohingegen die Behandlung mit den drei verschiedenen Borte-

zomibkonzentrationen das Zielvolumen erst nach ca. 12 Tagen erreicht. Die einzelnen

3 Ergebnisse 50

Bortezomibkonzentrationen wiesen untereinander keine großen Unterschiede im Tumor-

wachstum auf. Die Wachstumsverlangsamung entsprach dementsprechend ca. 5,5 Tagen

(ca. 45%).

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 3 5 8 10 12 15

Tu

mo

rvo

lum

en

mm

³

Tage

Kontrolle Bortezomib i.p. 0,3 mg/kg KG 2x/Woche

Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG 2x/Woche Bortezomib i.p. 1,0 mg/kg KG 2x/Woche

Abbildung 3.16: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Einzelbehandlung mit Borte-zomib. Dargestellt ist die Entwicklung des Tumorvolumens in mm3

(y-Achse) uber Tage (x-Achse). Abgebildet ist eine unbehandelte Kon-trolle (n=3) im Vergleich zu i.p. verabreichtem Bortezomib zweimalWochentlich, einmal als 0,3 mg/kg (n=2), einmal als 0,6 mg/kg (n=2)und einmal als 1,0 mg/kg (n=8).

3.2.2 In-vivo-Kombinationsversuche mit Trofosfamid und

Bortezomib

In Abbildung 3.17 ist die Kombinationstherapie mit Trofosfamid (i.p.) und Bortezomib

0,6 mg/kg am Tiermodell dargestellt. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Versuchstie-

ren wurde auf die Kombination mit der niedrigsten Bortezomibkonzentration verzichtet.

Die Behandlung mit Bortezomib (0,6 mg/kg(KG)) alleine und in Kombination mit

Trofosfamid bewirkte eine Wachstumsverlangsamung von ca. 5,5 Tagen. Die Einzelbe-

handlung mit Trofosfamid bewirkte eine Wachstumsverlangsamung von 8,5 Tagen (ca.

57%), was drei Tage mehr waren als bei der Kombinationsbehandlung. In Abbildung

3.18 ist die gleiche Kombinationsbehandlung nur mit Bortezomib 1,0 mg/kg (KG)

dargestellt. In diesem Fall hatte die Kombinationsbehandlung den gleichen wachstums-

verlangsamenden Effekt wie Trofosfamid als Einzelbehandlung.

3 Ergebnisse 51

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 3 5 8 10 12 15 17 19

Tu

mo

rvo

lum

en

mm

³

TageKontrolle

Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG 2x/Woche

Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG Tag 1. und 15.

Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 0,6 mg/kg KG i.p.

Abbildung 3.17: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung vonBortezomib (0,6 mg/kg (KG)) und Trofosfamid (176,4 mg/kg (KG))im Vergleich zu den jeweiligen Einzelbehandlung als Kontrollen. x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen. Kontrolle n=3,Bortezomib n=2, Trofosfamid n=8, Trofosfamid in Kombination mitBortezomib n=8.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 3 5 8 10 12 15 17 19

Tu

mo

rvo

lum

en

mm

³

Tage

Kontrolle


Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG Tag 1. und 15.


Abbildung 3.18: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung vonBortezomib (1,0 mg/kg (KG)) und Trofosfamid (176,4 mg/kg (KG))im Vergleich zu den jeweiligen Einzelbehandlung als Kontrollen. x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen. Kontrolle n=3,Bortezomib n=8, Trofosfamid n=8, Trofosfamid in Kombination mitBortezomib n=8.

3 Ergebnisse 52

Außerdem wurde untersucht, ob die metronomische Gabe von Trofosfamid p.o. in

der Kombinationsbehandlung einen Unterschied bewirken konnte (Siehe auch Kap.

2.8.5). Aus den oben genannten Grunden wurde der Kombinationsversuch lediglich mit

Bortezomib 0,6 mg/kg (KG) i.p. und Trofosfamid p.o. bzw. i.p. durchgefuhrt. Wie in

Abbildung 3.19 zu sehen, verlangsamte die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid

(19 mg/kg (KG)) p.o. das Tumorwachstum um 10,5 Tage (ca. 62%) im Vergleich zur

unbehandelten Kontrolle. Dahingegen verlangsamte die Kombinationsbehandlung, in

der Trofosfamid i.p. alle 14 Tage verabreicht wurde, das Tumorwachstum nur mit

8,5 Tagen (ca. 57%) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die p.o.-Gabe von

Trofosfamid verlangsamte das Tumorwachstum um funf Tage im Vergleich zur i.p.-Gabe

von Trofosfamid.

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 3 5 8 10 12 15 17 19

Tu

mo

rvo

lum

en

mm

³

TageKontrolle



Trofosfamid p.o. 19 mg/kg KG + Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG i.p.

Abbildung 3.19: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zum Vergleich des Applikationswe-ges von Trofosfamid in der Kombinationsbehandlung von Trofosfamid(176,4 mg/kg (KG)) und Bortezomib (0,6 mg/kg (KG)). Kombinations-behandlung mit Trofosfamid i.p. (n=8) im Vergleich mit Trofosfamidp.o. (n=2). x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen.

3.2.3 In-vivo-Kombinationsversuche mit Cyclophosphamid

und Bortezomib

Parallel zu den Kombinationsbehandlungen mit Bortezomib und Trofosfamid wurde

die Kombination von Bortezomib (1,0 mg/kg (KG) i.p.) und Cyclophosphamid (176,4

mg/kg (KG) i.p.) untersucht (Abb. 3.20). Wie in Kapitel 2.8.5 beschrieben, wurde

Bortezomib zwei-mal pro Woche und Cyclophosphamid einmal jede zweite Woche

verabreicht. Die Einzelbehandlung mit Cyclophosphamid bzw. Bortezomib bewirkten

3 Ergebnisse 53

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1 3 5 8 10 12 15 17 19 22

Tu

mo

rvo

lum

en

mm

³

TageKontrolle


Cyclophosphamid i.p. 176,4 mg/kg KG

Cyclophosphamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 1,0 mg/kg KG i.p. 2x/Woche

Abbildung 3.20: Xenograftmodell am LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung vonCyclophosphamid (176,4 mg/kg (KG) i.p.) und Bortezomib (0,6 mg/kg(KG) i.p.) (n=2) im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Cyclophos-phamid (n=2). x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen.

jeweils eine Wachstumsverlangsamung von ca. 5,5 Tagen (ca. 45%), wohingegen die

Kombination der beiden Arzneien eine Wachstumsverlangsamung von ca. 8,5 Tagen (ca.

57%) bewirkte. Die Kombination hatte dementsprechend einen wirkungsverstarkenden

Effekt, wenn auch nur einen leichten.

54

4 Diskussion

4.1 Hintergrund

”Die Gabe einer zytostatischen Monotherapie entspricht nicht dem evidenzbasierten me-

dizinischen Standard“, lautet es von der deutschen Krebsgesellschaft zu der Behandlung

des kleinzelligen Lungenkarzinoms. In der Behandlung von vielen Krebsleiden konnte

man zeigen, dass eine Kombinationstherapie im Hinblick auf das Nebenwirkungsprofil

und die Uberlebensrate einer Monotherapie uberlegen ist. Aufgrund der komplexen

Wirkungsmechanismen und Interaktionen verschiedener Stoffe ist es schwierig voraus-

zusagen, welche Kombinationen eine positive Wirkungsverstarkung entwickeln und

welche dem Patienten letztendlich mehr Schaden zufugen. Deswegen ist es wichtig,

jede Kombinationsbehandlung in praklinischen Studien zu testen, auch wenn es nicht

in jedem Fall gesetzlich vorgeschrieben ist. Wie einleitend erwahnt, wurde die Wirk-

samkeit von Bortezomib als Monotherapeutikum diverser Tumoren in praklinischen

Studien gezeigt. In klinischen Studien jedoch wurde gezeigt, dass sich Bortezomib als

Einzelstoffbehandlung fur dieselben Tumoren nicht bewahrt, weshalb in diesen Fallen

Kombinationsbehandlungen mit verschiedenen Chemotherapeutika diskutiert wurden

[25, 55, 58]. Inzwischen liegt eine Reihe klinischer Studien vor, die Bortezomib mit einem

zweiten Chemotherapeutikum kombinieren. Eine der wenigen Kombinationsbehandlun-

gen, die einen verstarkenden Effekt zeigen, ist die Kombination von Bortezomib mit

Transtuzumab (In-vitro-Studie) oder mit Docetaxel (Phase-II-Studie), wobei letztere

Kombination mit einer Verstarkung der Nebenwirkungen einhergeht [6, 16]. Ziel dieser

Arbeit war es, die Wirkung und damit den eventuellen Nutzen einer Kombination

von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin zu prufen. Außerdem sollte die Repro-

duzierbarkeit von In-vitro-Versuchen in In-vivo-Versuchen exemplarisch untersucht

werden.

4 Diskussion 55

4.2 Das kleinzellige Lungenkarzinom

LX1

Mit den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass die SCLC-Zelllinie LX1 auf

die Behandlung mit Bortezomib anspricht (Abb. 3.1). Von den untersuchten Zelllinien

zeigte LX1 das beste Ansprechen mit einer IC50 von ca. 4 nM. Dies bestatigt die

2005 veroffentlichten Ergebnisse von Mortenson et al. [63]. In ihren Zellversuchen am

SCLC wurde eine Apoptoserate von 25-50% fur 20 nM Bortezomib nachgewiesen.

Weitere praklinische Versuche zur Einzelbehandlung von SCLC mit Bortezomib liegen

bis heute nicht vor. Lara et al. konnten in einer Phase-II-Studie zur Einzelbehandlung

mit Bortezomib keinen Effekt am Patienten nachweisen und schlugen deshalb eine

Kombinationsbehandlung vor [51].

In den vorliegenden In-vitro-Versuchen wurde die Kombination von Bortezomib mit

den Oxazaphosphorinen Mafosfamid und Trofosfamid untersucht. Cyclophosphamid

ist von einer enzymatischen Aktivierung abhangig und wurde deshalb in den Zell-

versuchen durch Mafosfamid ersetzt, da dieses spontan in den aktiven Metaboliten

von Cyclophosphamid zerfallt. Sowohl Trofosfamid als auch Cyclophosphamid sind

fur die Behandlung des SCLC zugelassen. Studien zur Kombinationsbehandlung mit

Bortezomib am SCLC wurden bisher nicht durchgefuhrt. Andere Lungenkarzinome

werden daher zum Vergleich herangezogen. Die zeitgleiche Kombination der beiden

Oxazaphosphorinen mit Bortezomib am LX1 zeigte einen unterschiedlich stark ausge-

pragten Antagonismus. Speziell fur die Kombination mit Trofosfamid ist eine negative

Interaktion zu vermuten, da es zu einer Wirkungsabschwachung kommt (Abb. 3.6). Die

Kombination von Bortzeomib mit Mafosfamid zeigte vergleichsweise einen zytotoxischen

Effekt, der nur geringfugig starker war als der der jeweiligen Einzelbehandlung. Die

Wirkung von Mafosfamid war relativ unbeeinflusst von der Kombination mit Bortezomib.

Das kann damit erklart werden, dass die beiden Medikamente einen unterschiedlichen

Ansatzpunkt haben. Dies wirft jedoch die Frage auf, warum es bei der Kombination von

Trofosfamid und Bortezomib zu einer Wirkungsabschwachung kommt. Die Studie von

Mortenson et al. legt nahe, dass der negative Effekt der Kombination von Trofosfamid

und Bortezomib nicht am Wirkungsmechanismus der Gruppe der Alkylanzien liegt

[62]. In ihrer Studie zeigten sie an einem NSCLC, dass die zeitgleiche Kombination von

Bortezomib, Gemcitabin und Carboplatin, welches ebenfalls ein Alkylantium ist, einen

wirkungsverstarkenden Effekt hatte. Abgesehen davon, dass im Versuch ein anderer

Lungenkarzinomtyp verwendet wurde, war der Versuchsaufbau dem der vorliegenden

Studie relativ ahnlich. Die Behandlungsdauer der Zellen betrug in beiden Fallen 24

Stunden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte anhand des MTT-Assays, das dem

in vorliegender Arbeit verwendeten Kristallviolett-Assay sehr ahnlich ist. Ein kleiner

4 Diskussion 56

Unterschied besteht darin, dass in der Kombinationsbehandlung von Mortenson et al.

eine Bortezomibkonzentration von 50 nM verwendet wurde, was uber der IC50 des

NSCLC liegt (IC50 = 30 nM). 2009 veroffentlichten Davies et al. eine Phase-II-Studie

zur Kombination von Bortezomib, Carboplatin und Gemcitabin, die eine Verlangerung

der medianen Uberlebenszeit auf 11 Monate erzielte [20]. Diese beiden Studien zeigen,

dass Bortezomib und ein Alkylanzium sich in einer Kombination nicht gegenseitig aus-

schließen. Eine andere mogliche Erklarung fur den negativen Effekt der Kombination der

Oxazaphosphorine und Bortezomib am LX1 in vorliegender Studie ist auch in der eben

genannten Studie von Mortenson et al. zu finden [62]. Sie haben die gleiche Kombination

von Bortezomib, Carboplatin und Gemcitabin auch zeitversetzt untersucht. Die Gabe

von Bortezomib zwolf Stunden vor Carboplatin und Gemcitabin bewirkte eine Apopto-

serate von 6,7%, wohingegen die Gabe von Bortezomib zwolf Stunden nach Carboplatin

und Gemcitabin eine Apoptoserate von 33,6% ergab. Die zeitgleiche Gabe zeigte eine

Apoptoserate von 21,5%. Die zeitversetzte Gabe der Oxazaphosphorine und Bortezomib

in der vorliegenden Studie konnte einen ahnlichen Effekt nur tendenziell bestatigen.

Generalisierend gesagt, zeigten die zeitgleichen Kombinationen und diejenigen, in denen

Bortezomib an erster Stelle gegeben wurden, einen ahnlichen antagonistischen Effekt.

Lediglich die Kombinationen, in denen die Oxazaphosphorine an erster Stelle gege-

ben wurden, zeigten einen tendenziell starkeren antineoplastischen Effekt, der jedoch

immer noch im antagonistischen Bereich lag. Zwischen den zeitversetzten Versuchen

von Mortenson et al. und denen der vorliegenden Studie gab es einige Unterschiede,

die die Ergebnisse beeinflusst haben konnen. Wie bei den zeitgleichen Versuchen von

Mortenson et al. handelt es sich auch bei den zeitversetzten Versuchen um ein NSCLC.

Außerdem fehlte in der vorliegenden Studie ein Gegenstuck zu Gemcitabin, das in der

Dreierkombination von Mortenson et al. mit aller Wahrscheinlichkeit seinen Teil zur

Wirkungsverstarkung beigetragen hat. Die Behandlung dauerte unverandert 24 Stunden.

In den ersten zwolf Stunden wurde mit dem ersten Medikament behandelt. Danach

wurde das Medium getauscht, und die Zellen wurden fur weitere zwolf Stunden dem

zweiten Medikament ausgesetzt. In der vorliegenden Arbeit betrug das Zeitintervall

zwischen den Behandlungen eine bzw. zwei Stunden, und die Medikamente wirkten

danach gemeinsam auf die Zellen ein. Einerseits eignet sich der Versuchsaufbau von

Mortenson et al. wahrscheinlich besser zur Darstellung des Effekts einer zeitversetzten

Therapie, da der Zeitintervall bedeutend langer ist. Andererseits hat Bortezomib eine

mittlere Eliminationshalbwertzeit von mindestens 40 Stunden laut EMA (European Me-

dicines Agency). Das bedeutet, dass ein Kombinationspartner, der zwolf Stunden spater

dazugegeben wird, auch unter dem Beisein von Bortezomib wirken wird. Umgekehrt gilt

Ahnliches fur Carboplatin, welches eine terminale Halbwertszeit von 24 Stunden hat.

Falls die Medikamente uber und auf gleiche Zellstrukturen, wie z.B. Enzyme, wirken

sollten, wird ein realistischeres Bild vermittelt, wenn, wie in vorliegender Studie, das

4 Diskussion 57

Medikament nach dem gewahlten Zeitintervall hinzugegeben wird. Ob und wie die

Reihenfolge der Medikamentengabe einen Einfluss auf die Zelluberlebensrate hat, wird

in Kapitel 4.5 ausfuhrlicher diskutiert.

4.2.1 In-vivo-Versuche am LX1

Da das LX1 am empfindlichsten gegenuber der Einzelbehandlung mit Bortezomib

war, wurde es in den weiterfuhrenden In-vivo-Versuchen naher untersucht. Aus zuvor

genannten Grunden werden die In-vivo-Versuche lediglich deskriptiv abgehandelt (Kap.

3.2). Die durchgefuhrten Versuche zeigten, dass Bortezomib als Einzelbehandlung im

Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle eine Verzogerung des Tumorwachstums um

41% - 45% bewirkt (Abb. 3.16). Der wachstumsverzogernde Effekt von Bortezomib wurde

nur geringfugig durch die verwendeten Dosen (0,3 - 1,0 mg/kg) beeinflusst. Dies stutzt

die In-vivo-Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Teicher et al., die am NSCLC zeigten, dass

eine Dosisanderung von Bortezomib (0,1 - 1,0 mg/kg) den wachstumshemmenden Effekt

der Einzelbehandlung nicht signifikant beeinflusste [87]. Dies kann an den Eigenschaften

von Bortezomib liegen. Wie in der Einleitung beschrieben, besetzt es reversibel mit

hoher Affinitat und Selektivitat die katalytische Untereinheit des Proteasoms (Kap.

1.4). Wenn ein Großteil der Proteasome bei einer gewissen Bortezomibkonzentration

gebunden ist, scheint eine Erhohung der Bortezomibkonzentration einen nur geringen

Mehreffekt zu bringen. Daruber hinaus nehmen die Bindungen an andere Proteine zu,

was eventuell Nebenwirkungen verursachen kann [5].

Auch wenn der Effekt der Einzelbehandlung mit Bortezomib begrenzt ist, erhofft man

sich einen positiven Effekt in einer Kombinationsbehandlung an Tieren. Einerseits

konnte gezeigt werden, dass Bortezomib die Bcl-2-Proteinfamilie hemmt, welche fur die

Chemoresistenz des SCLC verantwortlich gemacht wird [96]. Andererseits soll Borte-

zomib einen antiangiogenetischen Effekt haben, was speziell bei der Behandlung des

SCLC ein Vorteil ware [23, 77]. In den vorliegenden In-vivo-Versuchen wurde u.a. die

Kombination von Cyclophosphamid und Bortezomib am LX1 untersucht (Abb. 3.20).

Die Kombination bewirkte eine Wachstumsverzogerung von ca. 20% im Vergleich zur

jeweiligen Einzelbehandlung. Tendenziell hatte die Kombination einen subadditiven

Effekt, was etwas besser war als die gleiche Kombination in den In-vitro-Versuchen (Abb.

3.3). Dieser Unterschied kann damit erklart werden, dass bei Zellversuchen lediglich

die Zellen direkt untersucht werden und die Interaktion mit dem Tumorstroma nicht

reprasentiert wird. Die einzigen publizierten Ergebnisse zur Kombination von Cyclophos-

phamid und Bortezomib stammen von Teicher et al. [87]. In ihrer 1999 veroffentlichten

Studie untersuchten sie u.a. diese Kombination in einem Xenograftmodell zum Mam-

makarzinom MCF-7. Sie beschreiben den Kombinationseffekt als synergistisch, was

4 Diskussion 58

einer ausgepragteren Wirkungsverstarkung entspricht, als es die vorliegende Studie

zeigen konnte. Im Vergleich zu den vorliegenden Tierversuchen handelt es sich um zwei

verschiedene Tumortypen und einen unterschiedlichen Versuchsaufbau. Im Tiermodell

von Teicher et al. wurde nach einem abgeschlossenen Behandlungszyklus von neun

Tagen Tumorgewebe und Knochenmark von den Versuchstieren in Zellkultur uberfuhrt,

um auf diese Weise eine Proliferationshemmung zu messen. In den In-vivo-Versuchen der

vorliegenden Arbeit wurde mit der Tumorwachstumsverzogerung gearbeitet. Das lasst

einerseits nur eine grobere Beurteilung zu, andererseits wird der Behandlungsverlauf

etwas realistischer widergespiegelt, da das Versuchstier mehrere Behandlungszyklen

durchlauft. Auf diese Weise kann man genauer den lebensverlangernden Effekt der

Behandlung beurteilen. Ein weiterer Unterschied war, dass Teicher et al. eine relativ nied-

rige Bortezomibkonzentration von 0,1 mg/kg KG gewahlt hatten, die als Einzeltherapie

einen geringen klinischen Effekt hatte. An den Anfang dieser Diskussion zur Einzelbe-

handlung mit Bortezomib zuruckdenkend, konnte man die Vermutung aufstellen, dass

Bortezomib am besten unterstutzend zu einer zweiten Behandlung eingesetzt werden

sollte. Man wurde so auf die zytotoxische Eigenwirkung von Bortezomib verzichten und

nur die potenzierende Wirkung auf das zweite Zytostatikum nutzen. Davon ausgehend,

dass man Cyclophosphamid und Trofosfamid miteinander vergleichen kann, erscheint

dies eher unwahrscheinlich. Die Ergebnisse der In-vivo-Versuche zur Kombination von

Trofosfamid mit verschiedenen Dosen Bortezomib (0,6 mg/kg KG und 1,0 mg/kg KG),

wie sie in Kapitel 3.2.2 beschrieben sind, sprechen dagegen. Die Kombination mit der

niedrigeren Dosis Bortezomib hatte den gleichen wachstumsverzogernden Effekt, wie die

Einzelbehandlung mit derselben Dosis Bortezomib. Das war 13% weniger als die Einzel-

behandlung mit Trofosfamid. Dies zeigt, dass die Kombination antagonistisch wirkte.

Die gleiche Kombination mit der hoheren Bortezomibdosis hatte den gleichen Effekt wie

Trofosfamid als Einzelbehandlung. Somit kam es nicht zu einer Wirkungsverstarkung,

jedoch auch nicht zu einem Effektverlust. Diese Ergebnisse fur die Kombination mit

Trofosfamid waren in Anbetracht der durchgefuhrten In-vitro-Versuche nicht unerwartet

(Abb. 3.6). Ruckblickend muss die Frage gestellt werden, ob man bei so unterschied-

lichen Ergebnissen die beiden Alkylanzien Trofosfamid und Cyclophosphamid fur die

Kombination mit Bortezomib miteinander vergleichen kann. Unterschiede zwischen der

Kombination mit Cyclophosphamid und der mit Trofosfamid konnen an der Verstoff-

wechselung liegen. Trofosfamid und Bortezomib werden beide durch das Leberenzym

Cyp3A4 metabolisiert, wohingegen Cyclophosphamid von Cyp2B6 metabolisiert wird.

Durch das Enzym Cyp3A4 wird Trofosfamid aktiviert und Bortezomib inaktiviert (Abb.

1.1). Außerdem hat Bortezomib eine leicht hemmende Wirkung auf einige Proteine

der Cytochrom P450-Familie. Cyp2B6, welches Cyclophosphamid metabolisiert, gehort

jedoch nicht zu den von Bortezomib gehemmten Cytochrom P450-Proteinen [36, 70].

In welchem Ausmaß dieses Einfluss auf den Behandlungseffekt hat, ist unklar. Der

4 Diskussion 59

Unterschied zwischen den beiden Alkylanzien war in den In-vitro-Versuchen zu LX1

nur leicht ausgepragt. Dies kann jedoch nicht mit dem Metabolismus der Stoffe erklart

werden, da einerseits die Cytochrome in nicht-hepatischen Geweben wie der Lunge in

nur geringen Konzentrationen vorkommen, und andererseits, weil in den Zellversuchen

aktiviertes 4OH-Trofosfamid verwendet wurde [69].

Im klinischen Alltag wird Trofosfamid oral verabreicht. In unseren In-vivo-Versuchen

hatten wir uns fur eine intraperitoneale Verabreichung entschieden. Es ware mit einigen

Herausforderungen und Unsicherheiten verbunden, Tieren eine gewunschte Menge Tro-

fosfamid p.o. zu verabreichen. Da die orale Bioverfugbarkeit von Trofosfamid gut ist,

sollte es keinen großen Unterschied machen, ob die gewunschte Stoffmenge i.p. oder p.o.

gegeben wird. Mit dem letzten In-vivo-Versuch sollte diese Annahme bestatigt werden.

Dies wurde anhand einer Kombination von Bortezomib und Trofosfamid getestet, wobei

Trofosfamid einmal wie bisher als Injektion verabreicht wurde und einmal uber das

Trinkwasser. Die Trofosfamiddosierung basierte auf vorher durchgefuhrten Untersuchun-

gen zum Trinkwasserverbrauch der Versuchstiere. Die Kombination, in der Trofosfamid

p.o. verabreicht wurde, verlangsamte das Tumorwachstum um weitere funf Tage im

Vergleich zur Kombination, in der das Trofosfamid i.p. verabreicht wurde. Diese beiden

Applikationswege von Trofosfamid wurden auch in der Arbeit von Bela et al. untersucht

[8]. Die Tumorwachstumskurven fur die beiden Applikationswege zeigten in dieser Stu-

die den gleichen Effekt. Im Vergleich zur vorliegenden Arbeit fallen zwei Unterschiede

auf. Erstens wurde in vorliegender Arbeit eine Kombinationsbehandlung untersucht.

Zweitens wurde die per-orale-Behandlung bei Bela et al. mit acht Tieren untersucht,

im Vergleich zu zwei Tieren in der vorliegenden Studie, was bei den sich ergebenden

Unsicherheiten einer metronomischen Therapie zu wenig war.

Die Resultate der Tierversuche bestatigten mit geringfugigen Abweichungen die vorange-

gangenen Versuche zu den LX1-Zellen und die Aussagekraft von In-vitro-Experimenten

zur Wirkung von Chemotherapeutika. Allerdings war dies aufgrund der geringen

Fallzahl und hoher biologischer Varianz im Tumorwachstum nicht statistisch zu si-

chern.

4.3 Das Mammakarzinom MX1

Bei den Mammakarzinomen wurden anfanglich nur Ostrogen-Rezeptor-positive Zelllinien

mit Bortezomib untersucht. Erst Ende 2009 wurde die Empfindlichkeit von Ostrogen-

Rezeptor-negativen Mammakarzinom-Zelllinien auf Bortezomib getestet [35]. In den Ver-

suchen war kein wesentlicher Unterschied in der Empfindlichkeit gegenuber Bortezomib

zwischen Ostrogen-Rezeptor-positiven oder Ostrogen-Rezeptor-negativen Zelllinien zu

4 Diskussion 60

erkennen. Aufgrund dieser Ergebnisse wird in der vorliegenden Diskussion auf den Rezep-

torstatus der Mammakarzinomzellen keine Rucksicht genommen.

In der vorliegend Studie konnte gezeigt werden, dass das Mammakarzinom MX1 auf

die Behandlung mit Bortezomib anspricht (Kap. 3.1.1). Dies bestatigten die 1999

veroffentlichten In-vitro-Versuche zum Mammakarzinom MCF-7 von Teicher et al.

[87]. Eine 2008 publizierte Studie von Xu et al. zeigte hingegen, dass verschiedene

Mammakarzinom-Zelllinien, u.a. MCF-7-Zellen, resistent gegen Bortezomib waren [95].

Es ist schwierig, diese Diskrepanz aus dem Stand zu erklaren, da ein ahnlicher Ver-

suchsaufbau benutzt wurde wie von Teicher et al.. Der gleiche Versuchsaufbau wurde

auch in der vorliegenden Arbeit angewandt. Die MX1-Zellen wurden 72 Stunden mit

Bortezomib behandelt, wohingegen die MCF-7-Zellen einer Behandlungsdauer von

lediglich 48 Stunden ausgesetzt waren. Bei 50 nM Bortezomib war bei den Versuchen

von Xu et al. eine relative Zelluberlebensrate von uber 90% zu sehen. Jedoch zeigten

Teicher et al. bei der gleichen Konzentration eine Uberlebensrate von ca. 1%, und

die vorliegenden Ergebnisse zeigten fur die MX1-Zellen eine Uberlebensrate von ca.

25% (Abb. 3.1). Der Verweis von Xu et al. auf eine klinische Studie, die zeigte, dass

Bortezomib als Einzelbehandlung keinen signifikanten Effekt hatte, spricht zwar fur die

Ergebnisse von Xu et al., erklart jedoch nicht den Unterschied zwischen den Studien.

Eine mogliche Erklarung ist, dass die Empfindlichkeit der Zellen sich verandert hat. Es

wurde beispielsweise wahrend eines der Versuche der vorliegenden Arbeit bemerkt, dass

sich die Empfindlichkeit bei einer Zellreihe mit einer hohen Passagenummer (”altere“

Zellen), schlagartig markant und bleibend verringerte.

Abgesehen von den zuvor diskutierten Versuchen von Teicher et al. liegen bis heute

keine Studien zur Kombination von Bortezomib mit Oxazaphosphorinen vor. Bei der

zeitgleichen Kombination von Bortezomib und Mafosfamid zeigte das MX1 einen

Effekt im additiven Bereich, wie er auch fur das S117 zu sehen war. Im Vergleich

dazu zeigte der CI fur das LX1 einen moderat antagonistischen Effekt fur dieselbe

Kombination. Dabei war das LX1 die empfindlichste Zelllinie bei der Einzelbehandlung

mit Bortezomib. Da die gleiche Kombinationsbehandlung auf die eine Zelllinie einen

moderat antagonistischen und auf die beiden anderen einen addiditiven Effekt hatte,

ist es schwierig, die Ursache hierfur in der Interaktionen der beiden Stoffe zu suchen.

Bei der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib ist dies eher moglich. Da

diese Kombination in allen drei Zelllinien einen mehr oder weniger stark ausgepragten

Antagonismus ausubt, stellt sich die Frage, warum nicht ein ahnlicher Effekt gesehen

wird wie bei der Kombination von Mafosfamid und Bortezomib, jedenfalls fur das MX1

und das S117. Wie in Kapitel 4.2.1 diskutiert wird, konnte dies mit einem Unterschied

zwischen den beiden Alkylanzien Mafosfamid und Trofosfamid erklart werden, wie

z.B. der Membrangangigkeit. Dabei hat Trofosfamid jedoch aufgrund seiner lipophilen

4 Diskussion 61

Eigenschaft eine bessere Membrangangigkeit als Mafosfamid [12]. Mafosfamid hingegen

zerfallt zu 4OH-Cyclophosphamid mit ebenfalls guter Membrangangigkeit, da es im

chemischen Gleichgewicht mit seinem Tautomer Aldolphosphamid steht. Bortezomib

konnte einerseits die Membrangangigkeit von Trofosfamid beeinflussen durch Konkurrenz

um einen Transportmechanismus, andererseits ware eine chemische Interaktion der Stoffe

auch denkbar. Trofosfamid hat z.B. eine schlechtere Wasserloslichkeit als Mafosfamid.

Eine Kombination von Midazolam und Ketamin als Infusion fuhrt beispielsweise zur

Herabsetzung der Loslichkeit und damit zur Ausfallung der Stoffe [76]. Die zeitversetzten

Kombinationen zu MX1 werden in Kapitel 4.5 diskutiert.

4.4 Das Weichteilsarkom S117

In den vorliegenden Ergebnissen wird gezeigt, dass die Sarkomzellen S117 auf die Be-

handlung mit Bortezomib ansprechen (Abb. 3.1). Dies stutzt die 2008 veroffentlichten

Ergebnisse von Lu et al. und Bersani et al., die in Zellkulturversuchen zeigten, dass

verschiedene Weichteilsarkome empfindlich auf Bortezomib als Einzeltherapie reagieren

[9, 57]. Eine Studie zu der Kombination von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin

am Sarkom wurde bis heute nicht veroffentlicht. Es liegen jedoch Studien vor, die einen

synergistischen Effekt bei der Kombination von Bortezomib mit Cisplatin, Doxorubicin

oder 5-Flourouracil beschrieben haben [28, 90]. Wie Oxazaphosphorine entfalten diese

Zytostatika ihre Wirkung auch uber DNA-Schadigung. Speziell Cisplatin gehort wie

die Oxazaphosphorine zur Familie der Alkylanzien. Es sollte dementsprechend nicht an

der alkylierenden Wirkung von Trofosfamid liegen, dass die Kombination mit Bortezo-

mib einen antagonistischen Effekt hatte. Einen neuen Betrachtungswinkel bringen die

zeitversetzten Kombinationstherapien im folgendem Kapitel 4.5.

4.5 Zeitversetzte Versuche

Beim Betrachten der zeitversetzten Ergebnisse fiel auf, dass die Kombinationen, in

denen Bortezomib an erster Stelle gegeben wurde, einen tendenziell schlechteren Effekt

hatten. Dies galt sowohl fur die Kombination mit Mafosfamid als auch fur die mit Tro-

fosfamid. Der einzige Versuch, der signifikante Unterschiede zwischen den zeitversetzen

Kombinationen zeigte, war der um eine Stunde versetzte Kombinationsversuch mit

Trofosfamid und Bortezomib IC50 (Abb. 3.15). Im Vergleich dazu haben die erwahnten

Versuche von Mortenson et al. zum NSCLC signifikante Unterschiede bei den zeit-

versetzten Kombinationen von Carboplatin, Gemcitabin und Bortezomib gezeigt [62].

Wie in Kapitel 4.2.1 beschrieben wurde, zeigte die Behandlung mit Gemcitabin und

4 Diskussion 62

Carboplatin, gefolgt von Bortezomib, die starkste Wirkungsverstarkung. Die zeitgleiche

Kombination zeigte einen etwas geringeren Effekt. Die Kombination, in der Bortezomib

als erstes gegeben wurde, zeigte lediglich eine minimale Wirkungsverstarkung. Diese

Ergebnisse konnten Mortenson et al. anhand von Tierversuchen zum gleichen NSCLC

reproduzieren. Versuchsgruppen von je vier Tieren wurden entweder zeitgleich oder

zeitversetzt mit Gemcitabin, Carboplatin und Bortezomib beimpft. Das Zeitintervall

der zeitversetzten Versuche betrug acht Stunden, wobei wie in den Zellversuchen Borte-

zomib entweder vor oder nach den beiden anderen Zytostatika gegeben wurde. Diese

Kombinationsbehandlungen wurden zweimal wochentlich durchgefuhrt. In ihren Er-

gebnissen berichten Mortenson et al., dass Bortezomib, als es an erster Stelle gegeben

wurde, den antineoplastischen Effekt der Behandlung fast ganzlich aufhob. Im Gegensatz

dazu zeigten die zeitgleiche Kombination und die Kombination, in der Bortezomib um

acht Stunden spater gegeben wurde, eine signifikante Wachstumsverlangsamung. Die

Zellversuche von Mortenson et al. zeigten einen geringen Effekt von Bortezomib auf

die beiden anderen Zytostatika, jedoch nicht einen so ausgepragten antagonistischen

Effekt wie bei den Tierversuchen. Idealerweise kann man mit praklinischen Versuchen

den Effekt einer Behandlung in klinischen Versuchen voraussagen, wie es Jung et al.

2007 zeigten [41]. Aufgrund ihrer praklinischen Versuche rieten sie von einer zeitglei-

chen Kombination von Bortezomib und Docetaxel ab und empfahlen stattdessen eine

zeitversetzte Behandlung, in der Bortezomib an zweiter Stelle dazugegeben werden

sollte. Im Januar 2011 veroffentlichten Lara et al. eine Phase-II-Studie, in der Patienten

mit NSCLC zu erst mit Docetaxel und dann zeitversetzt mit Bortezomib behandelt

wurden, und verglichen dies mit einer Gruppe, die beide Stoffe gleichzeitig erhielt. Die

zeitversetzte Behandlung zeigte eine mediane Uberlebenszeit von 13,3 Monaten im

Vergleich zu 10,5 Monaten bei der zeitgleichen Behandlung, was die Ergebnisse von

Jung et al. bestatigte.

Bezuglich der Wirkung von Bortezomib in zeitversetzten Kombinationsbehandlungen

konnte man diese wie folgt erklaren: In vielen Studien wurde beschrieben, wie Bortezomib

den Zellzyklus unter anderem durch seine Wirkung auf Protein 21, Protein 27 und

Protein 53 (auch als”Wachter des Genoms“ bekannt) zum Stillstand bringt und durch

Herunterregulation der katalytischen Untereinheit der DNA-abhanigen Protein-Kinase

(DNA-PKcs) die DNA-Reparatur hemmt [22, 26, 30, 83, 84]. Im Vergleich dazu bewirken

Oxazaphosphorine bzw. Carboplatin DNA-Schaden, wobei sie bei schnell proliferierenden

Zellen mit hohem Stoffwechsel den besten Effekt entwickeln. Der antagonistische Effekt

von Bortezomib, wenn es an erster Stelle in einer Kombination gegeben wird, konnte

also durch die Hemmung des Zellzyklus erklart werden. Der Umkehrschluss, dass

die Reparatur von Alkylanzien induzierter DNA-Schaden durch spatere Zugabe von

Bortezomib verhindert werde, konnte durch diese Arbeit nicht unterstutzt werden, sehr

4 Diskussion 63

wohl hingegen durch die Studie von Mortenson et. al..

4.6 Schlussfolgerung

Wie man in den zahlreichen praklinischen Untersuchungen zur Einzelbehandlung mit

Bortezomib sieht, sind erfolgreiche Zell- und Tierversuchen keine Garantie fur erfolg-

reiche klinische Studien. Sie dienen jedoch als Wegweiser, weswegen es auch wichtig

ist, Versuche zu veroffentlichen, die kein positives Resultat aufweisen. Die molekularen

Mechanismen und moglichen Interaktionen einer Kombinationstherapie mit Bortezomib

sind noch nicht ausreichend geklart und bedurfen weiterer Untersuchungen. Uberdies

sollten keine klinischen Kombinationsversuche durchgefuhrt werden, ohne dass diese

vorher mit aquivalenten praklinischen Versuchen untermauert wurden. Aufgrund der

vorliegenden Ergebnisse sollte vorlaufig von klinischen Studien zur Kombination von

Bortezomib und Oxazaphosphorinen bei soliden Tumoren abgeraten werden, da die

Ergebnisse bestenfalls eine subadditive Wirkungsverstarkung erwarten lassen. Außerdem

muss man vermuten, dass die Behandlungsabfolge einen Einfluss auf den Behandlungs-

effekt hat. In kunftigen Studien sollte deshalb auch hierauf ein Augenmark gelegt

werden.

64

5 Zusammenfassung

Bortezomib ist ein neuartiges”Targeted Drug“ aus der Klasse der Proteasomen-

Inhibitoren, welches zur Behandlung des multiplen Myeloms eingesetzt wird. Die

vorliegende Arbeit untersuchte die Wirksamkeit von Bortezomib in Kombination mit Ma-

fosfamid bzw. 4OH-Trofosfamid in Zellversuchen, und die Kombination von Bortezomib

mit Cyclophosphamid bzw. Trofosfamid in Tierversuchen. Mafosfamid ersetzte Cyclo-

phosphamid in den Zellversuchen, da Mafosfamid spontan in den aktiven Metaboliten

4OH-Cyclophosphamid zerfallt, wohingegen Cyclophosphamid von einer enzymatischen

Aktivierung abhangig ist. Ziel der Arbeit war es, die Wirkung und damit den even-

tuellen Nutzen der Kombinationstherapien zu prufen, da es hierzu bis heute nur eine

praklinische Studie gibt.

Um die Wirkung der Kombinationstherapien bewerten zu konnen, wurde die Zell-

uberlebensrate photometrisch mit dem Kristallviolett-Assay bestimmt. Zu den in vitro

untersuchten Zelllinien gehorten das Mammakarzinom MX1, das kleinzellige Lungenkar-

zinom LX1 und das Weichteilssarkom S117. Der Behandlungseffekt in den Tierversuchen

wurde anhand des Tumorvolumens gemessen. In den Tierversuchen wurden die Kom-

binationstherapien wegen der begrenzten Anzahl der Versuchstiere und des hohen

Zeitaufwands lediglich an der LX1-Zellline untersucht.

Die vorliegenden Versuche bestatigen die Empfindlichkeit der drei Zelllinien gegenuber

Bortezomib. Die zeitgleiche Therapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 erbrachte

einen wirkungsverstarkenden Effekt im additiven Bereich fur die Zelllinien MX1 und S117.

Bei LX1 hatte diese Kombination einen moderat antagonistischen Effekt. Im zweiten

Versuchsabschnitt wurde untersucht, ob eine zeitversetzte Gabe der Medikamente

Einfluss auf die Wirkung der Kombinationen hat. Dabei wurden die Medikamente einmal

mit einem Zeitintervall von einer Stunde gegeben und einmal mit einem Zeitintervall

von zwei Stunden. Fur die zeitversetzte Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib

IC50 wurde keine großere Veranderung des Behandlungseffekts fur die drei Zelllinien

beobachtet, unabhangig davon, ob die Medikamente um eine oder zwei Stunden versetzt

gegeben wurden. Fur die zeitversetzten Kombinationen, in denen Mafosfamid (M) vor

Bortezomib IC50 (B IC50) gegeben wurde (M >B IC50), zeigte sich eine tendenziell

niedrigere Zelluberlebensrate als fur die Kombinationen, in denen Bortezomib an erster

Stelle gegeben wurde. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Die zeitgleiche

5 Zusammenfassung 65

Kombinationsbehandlung mit 4OH-Trofosfamid und Bortezomib IC50 erzielte fur

alle drei Zelllinien einen hauptsachlich antagonistischen Effekt. Fur die zeitversetzten

Kombinationen, in denen Bortezomib IC50 vor 4OH-Trofosfamid (T) gegeben wurde

(B IC50>T), war ein ahnlicher antagonistischer Effekt festzustellen. Die zeitversetzten

Kombinationen”T>B IC50“ zeigten eine tendenzielle Wirkungsverstarkung, da nur

einzelne Messpunkte der Kombinationen signifikante Unterschiede aufwiesen. Nur das

S117 zeigte einen klaren signifikanten Unterschied fur die um eine Stunde versetzte

Kombinationsbehandlung (Abb. 3.15). Die Kombination”T>B IC50“ lag im additiven

bis leicht antagonistischen Bereich, was sich signifikant von der Kombination”B IC50>T“

unterschied. Die letztgenannte Kombination lag ebenso wie die zeitgleiche Kombination

im antagonistischen Bereich. Dass eine zeitversetzte Behandlung einer zeitgleichen

Behandlung uberlegen sein kann, haben Jung et al. 2007 (In-vitro-Studie) und Lara et

al. 2011 (Phase-II-Studie) fur die Kombination von Bortezomib mit Docetaxel an einem

NSCLC gezeigt [41, 50]. Einige der Kombinationsversuche der vorliegenden Studie

wurden auch mit Bortezomib IC25 und IC75 durchgefuhrt, sollen hier aber nur erwahnt

werden, weil sie keine neuen Informationen erbrachten.

Die gleichen Behandlungen wurden auch am Xenograftmodell zum LX1-Tumor unter-

sucht. Das LX1 wurde fur die In-vivo-Versuche ausgewahlt, weil es in den In-vitro-

Versuchen am empfindlichsten auf Bortezomib reagierte. Die Tierversuche bestatigten

die Wirksamkeit von Bortezomib als Einzelbehandlung. Der Effekt war unabhangig von

der verabreichten Dosis. Die Kombination von Bortezomib mit Trofosfamid zeigte einen

antagonistischen Effekt, ahnlich dem der Zellversuche. Im Vergleich dazu zeigte die

Kombination von Cyclophosphamid mit Bortezomib eine leichte Wirkungsverstarkung

im Sinne einer subadditiven Wirkungsverstarkung, im Vergleich zur jeweiligen Einzelbe-

handlung.

Abgesehen von der Studie von Teicher et al. zur Kombinationsversuchen von Cyclo-

phosphamid und Bortezomib am Xenograftmodell zum Mammakarzinom liegen bis

heute keine ahnlichen Arbeiten uber die untersuchten Kombinationsbehandlungen

vor. Die molekularen Mechanismen und moglichen Interaktionen einer Kombinations-

therapie mit Bortezomib sind noch nicht ausreichend geklart und bedurfen weiterer

Untersuchungen. In Anbetracht der vorliegenden Ergebnisse sollte von einer klinischen

Untersuchung der Kombination von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin an soliden

Tumoren abgeraten werden, solange keine Arbeiten vorliegen, die Gegenteiliges belegen.

Außerdem muss man vermuten, dass die Behandlungsabfolge einen Einfluss auf den

Behandlungseffekt hat. In kunftigen Studien sollte deshalb auch hierauf ein Augenmerk

gelegt werden.

66

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77

Abbildungsverzeichnis

1.1 Stoffwechsel der Oxazaphosphorin-Derivate . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.2 Proteasomstoffwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

3.1 Bortezomib als Einzelbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.2 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Bortezomib und Mafosfamid

am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29


am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29


am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

3.5 (a) Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezo-

mib am MX1 (b) CI der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib

IC50 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.6 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib

am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.7 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib

am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3.8 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und

Bortezomib am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.9 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und

Bortezomib IC50 am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.10 Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Mafosfamid und

Bortezomib IC50 am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.11 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und

Bortezomib IC50 am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

3.12 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Trofosfamid und

Bortezomib am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

3.13 (a) Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid

und Bortezomib IC50 am S117; (b) CI der um eine Stunde versetzten

Kombination”M>B IC50“ am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

3.14 CI der um zwei Stunden versetzten Kombination”M>B IC50“ . . . . . 47

Abbildungsverzeichnis 78

3.15 Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Trofosfamid und

Bortezomib IC25 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

3.16 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Einzelbehandlung mit Bortezomib 50

3.17 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Bor-

tezomib (0,6 mg/kg (KG)) und Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.18 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Bor-

tezomib (1,0 mg/kg (KG)) und Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . 51

3.19 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zum Vergleich des Applikationsweges

von Trofosfamid in der Kombinationsbehandlung von Trofosfamid und

Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

3.20 Xenograftmodell am LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Cy-

clophosphamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

B.1 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und

Bortezomib IC25 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

B.2 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und

Bortezomib IC25 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

B.3 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid

und Bortezomib MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

B.4 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid

und Bortezomib IC50 am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86

B.5 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid und


B.6 Die um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid

und Bortezomib IC25 am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

B.7 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Mafosfamid und


B.8 Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Mafosfamid und

Bortezomib IC25 am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

B.9 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlungen mit Trofosfamid

und Bortezomib IC25 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

B.10 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Mafosfamid und

Bortezomib am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

B.11 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid

und Bortezomib IC50 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

79

Tabellenverzeichnis

2.1 Labormaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2 Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.3 Medien und Zusatze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.4 Puffer und Stammlosungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.5 Auflistung der verwendeten Tumorzelllinien . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.6 Zusammenstellung der verwendeten Losungen und Medien . . . . . . . 15

2.7 Behandlungsschemata der einzelnen Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . 19

2.7 Fortsetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.8 Unterteilung des CI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.1 Zusammenfassung der IC25, IC50 und IC75 von Bortezomib der Zelllinien 25

3.2 Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine . . . . . . . . . . . . . . . 26

3.3 Signifikanzen der zeitgleichen Kombinationen von Mafosfamid und Bor-

tezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.4 CI der zeitgleichen Kombination mit Mafosfamid und Bortezomib . . . 28

3.5 Signifikanzen der zeitgleichen Kombinationen von Trofosfamid und Bor-

tezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.6 CI der zeitgleichen Kombination mit Trofosfamid und Bortezomib . . . 34

3.7 MX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-

onstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 36

3.8 MX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-


3.9 MX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-

onstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 38

3.10 MX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-


3.11 LX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-


3.12 LX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-


3.13 LX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-



3.14 LX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-


3.15 S117 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-


3.16 S117 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-


3.17 S117 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-


3.18 S117 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-


C.1 MX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid

mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

C.2 LX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid

mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

C.3 S117 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid

mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

C.4 MX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid

mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

C.5 LX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid

mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

C.6 S117 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid

mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

C.7 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie

mit Mafosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92




mit Trofosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93



C.11 MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie


C.12 MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie


C.13 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit

Mafosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94





Trofosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95



C.17 LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie


C.18 LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie


C.19 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit








C.23 S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie


C.24 S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie


82

Anhang A

Abkurzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

ADP Adenosindiphosphat

Amp. Ampulle

Aqua dest. Aqua destillata

ATP Adenosintriphosphat

B Bortezomib

Bcl-2 B-cell lymphoma 2

bzw. beziehungsweise

CI Combination Index

CLL chronisch lymphatische Leukamie

CML chronisch myeloische Leukamie

Cyp Cytochrom P450

DNA Desoxyribonukleinsaure

ED extensive disease

EMA European Medicines Agency

ER Endoplasmatisches Retikulum

evtl. eventuell

FKS fetales Kalberserum

GIST gastrointestinale Stromatumoren

IC25 Inhibiting Concentration 25%



i.p. intraperitoneal

Kap. Kapitel

KG Korpergewicht

Konz. Konzentration

LD limited disease

M Mafosfamid

MES-Puffer 2-(N-Morpholino)ethansulfonsaure

Anhang A Abkurzungsverzeichnis 83

NaCl-Lsg. Natrium Chlorid Losung

NCI National Cancer Institute

NSCLC nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom

OD optische Dichte

PAST Paleontological Statistiscs

p.o. peroral

rel. Uberlebensrate relative Uberlebensrate

rpm rounds per minute - siehe auch U/min.

SCLC kleinzelliges Lungenkarzinom

SEM Standard Error of Mean

T Trofosfamid

Tab. Tabelle

u.a. unter anderem

U/min Umdrehungen pro Minute

VEGF vascular endothelial growth factor

Vgl. Vergleich

vs. versus

ZNS Zentrales Nervensystem

84

Anhang B

Grafische Darstellungen

0

10

20

30

40

50

60

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100

0 1,25 2,5 5 7,5 10 15

Rel

. Pro

lifer

atio

nshe

mm

ung

im V

gl. z

ur K

ontr

olle

[%]


Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h

Abbildung B.1: Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate der MX1 Zellen unter der umeine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamidund Bortezomib IC25 im Vergleich zur Mafosfamidkontrolle (n=11).

Anhang B Grafische Darstellungen 85

0

10

20

30

40

50

60

70

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90

100

0 2,5 5 10 15 20 30

Rel

. Pro

lifer

atio

nshe

mm

ung

im V

gl. z

ur K

ontr

olle

[%

]


Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h

Abbildung B.2: Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate des MX1 bei den um eine Stundeversetzten Kombinationsversuchen mit Trofosfamid und BortezomibIC25 im Vergleich zu Trofosfamid als Einzelbehandlung (n=11).

0

10

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90

100

0 2,5 5 7,5 10 15 20

Rel

. Pro

lifer

atio

nshe

mm

ung

im V

gl. z

ur K

ontr

olle

[%

]



Abbildung B.3: Dargestellt ist die um zwei Stunden versetzt Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC50 am Mammakazinom MX1 (n=11).


0

10

20

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40

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100

0 2,5 5 10 15 20 30

Rel

. Pro

lifer

atio

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ung

im V

gl. z

ur K

ontr

olle

[%

]


Trofosfamid 4OH-Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + 4OH-Trofosfamid 2h

Abbildung B.4: Dargestellt ist die Zelluberlebensrate des MX1 unter der um zweiStunden versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid undBortezomib IC50 (n=11).

0

10

20

30

40

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100

0 2,5 5 10 20 40

Rel

. Pro

lifer

atio

nshe

mm

ung

im V

gl. z

ur K

ontr

olle

[%]



Abbildung B.5: Die Grafik zeigt am LX1 die um eine Stunde versetzte Kombinations-therapie von Mafosfamid und Bortezomib IC25, sowie die Kontrollemit Mafosfamid (n=10).


0

10

20

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50

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100

0 2,5 5 10 20 40Rel

. Pro

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atio

nshe

mm

ung

im V

gl. z

ur K

ontr

olle

[%

]



Abbildung B.6: Die Abbildung zeigt die relative Uberlebensrate der LX1 unter der umeine Stunde versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid undBortezomib IC25 (n=10).

0

10

20

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0 2,5 5 10 20 40

Rel

. Pro

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im V

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ur K

ontr

olle

[%]



Abbildung B.7: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate des LX1 bei der um zwei Stundenversetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und BortezomibIC50 (n=13).


0

10

20

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0 5 10 15 20 30

Rel

. Pro

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im V

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ur K

ontr

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[%]



Abbildung B.8: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate des S117 bei der um eine Stundeversetzten Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und BortezomibIC25, sowie die Kontrolle mit Mafosfamid (n=11).

0

10

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0 5 10 15 20 30Rel

. Pro

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im V

gl. z

ur K

ontr

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[%

]



Abbildung B.9: Abgebildet ist rel. Uberlebensrate des S117 unter der um eine Stundeversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC25 im Vergleich zur Trofosfamidkontrolle (n=11).


0

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0 5 10 15 20 30

Rel

. Pro

lifer

atio

nshe

mm

ung

im V

gl. z

ur K

ontr

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[%]



Abbildung B.10: Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate des S117 unter der um zweiStunden versetzten Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid undBortezomib IC50 (n=16).

0

10

20

30

40

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60

70

80

90

100

0 5 10 15 20 30Rel

. Pro

lifer

atio

nshe

mm

ung

im V

gl. z

ur K

ontr

olle

[%

]



Abbildung B.11: Dargestellt ist rel. Uberlebensrate des S117 bei der um zwei Stundenversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC50 im Vergleich zu Trofosfamid als Einzelbehandlung (n=12).

90

Anhang C

Daten

Zeitgleiche Kombinationsbehandlung

Dargestellt sind die p-Werte der zeitgleichen Kombinationsversuche der Zelllinien

MX1, LX1 und S117. Ein Signifikanzniveau von p≤ 0,05 wurde fur diese Versuche

festgelegt.

Tabelle C.1: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am MX1


p-WertBort. IC25 >0,01 >0,01 >0,01 0,11 0,33 0,71Bort. IC50 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,05 0,49Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,043

Tabelle C.2: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am LX1


p-WertBort. IC25 0,31 0,04 0,25 0,68 0,70Bort. IC50 >0,01 >0,01 >0,01 0,17 0,55Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,45

Tabelle C.3: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am S117


p-WertBort. IC25 0,35 0,17 0,36 0,51 0,97Bort. IC50 >0,01 >0,01 0,023 0,12 0,44Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 0,02 0,46

Anhang C Daten 91

Tabelle C.4: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 amMX1


p-WertBort. IC25 0,37 0,04 0,40 0,24 0,30 0,11Bort. IC50 >0,01 >0,01 0,02 0,76 0,32 0,29Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 0,16 0,72 0,37

Tabelle C.5: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am LX1


p-WertBort. IC25 0,48 0,90 0,67 0,16 0,78Bort. IC50 0,10 0,61 0,33 0,95 0,99Bort. IC75 0,02 0,13 0,74 0,11 0,43

Tabelle C.6: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am S117


p-WertBort. IC25 0,97 0,68 0,74 0,80 0,80Bort. IC50 >0,01 0,25 0,36 0,74 0,74Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 0,75 0,74

Anhang C Daten 92

Zeitversetzte Kombinationsbehandlungen

Dargestellt sind die p-Werte der zeitverzogerten Kombinationsversuche der Zelllinien

MX1, LX1 und S117. Ein Signifikanzniveau von p>0,025 wurde fur diese Versuche

festgelegt.

Tabelle C.7: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC25.

Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15

p-Wert 0,30 0,09 0,27 0,33 0,67 0,80

Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15

p-Wert 0,09 0,27 0,52 0,80 0,70 0,95

Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15

p-Wert 0,70 0,56 0,75 0,70 0,47 1,00

Tabelle C.8: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,04 0,46 0,60


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,20 0,78 0,45


p-Wert 0,15 0,09 0,23 0,25 0,68 0,78

Anhang C Daten 93

Tabelle C.9: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC25.

Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30

p-Wert 0,70 0,24 0,36 0,80 0,33 0,22

Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30

p-Wert 0,90 0,13 0,51 0,56 0,85 0,33

Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30

p-Wert 0,95 0,95 0,85 0,56 0,57 0,80

Tabelle C.10: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 0,07 0,13 0,33 0,37


p-Wert >0,01 >0,01 0,90 0,54 1 0,67


p-Wert 0,07 0,02 0,06 0,02 0,44 0,50

Tabelle C.11: MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,01 0,09


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,12


p-Wert 0,75 0,80 0,80 0,75 0,70 0,57

Anhang C Daten 94

Tabelle C.12: MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,02 0,07 0,24


p-Wert 0,02 0,12 0,06 0,65 0,19 0,52


p-Wert 0,07 0,01 0,02 0,08 0,48 0,85

Tabelle C.13: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC25.

Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40

p-Wert 0,40 0,60 0,60 0,90 0,78

Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40

p-Wert 0,39 0,91 0,91 0,53 0,32

Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40

p-Wert 0,97 0,81 0,53 0,40 0,39

Tabelle C.14: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 0,02 0,73 0,19


p-Wert >0,01 >0,01 0,17 0,81 0,42


p-Wert >0,01 0,13 0,27 0,53 0,44

Anhang C Daten 95

Tabelle C.15: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC25.

Trofosfamid vs. Trofosfamidamid 0h + Bortezomib IC25 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40

p-Wert 0,34 0,64 0,59 0,93 0,54

Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40

p-Wert 0,54 0,44 0,91 0,19 0,85

Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40

p-Wert 0,66 0,21 0,66 0,18 0,72

Tabelle C.16: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 0,01 0,13 0,53


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,10


p-Wert >0,01 0,02 0,27 >0,01 0,24

Tabelle C.17: LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,30 0,69


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,88 0,72


p-Wert 0,54 0,76 0,41 0,24 0,41

Anhang C Daten 96

Tabelle C.18: LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,32 0,76


p-Wert >0,01 0,03 0,42 0,52 0,76


p-Wert 0,05 >0,01 >0,01 0,12 0,27

Tabelle C.19: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC25.

Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30

p-Wert 0,01 0,01 0,05 0,21 0,24

Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30

p-Wert 0,03 >0,01 0,12 0,19 0,44

Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30

p-Wert 0,13 0,40 0,16 0,23 0,33

Tabelle C.20: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,04


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,21


p-Wert 0,12 0,41 0,16 0,23 0,32

Anhang C Daten 97

Tabelle C.21: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC25.

Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30

p-Wert 0,52 0,85 0,66 0,65 0,95

Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30

p-Wert 0,85 1 0,70 0,19 0,61

Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30

p-Wert 0,65 0,85 0,85 0,3 0,61

Tabelle C.22: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01


p-Wert >0,01 >0,01 0,06 0,07 0,21


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,45

Tabelle C.23: S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,07


p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,16


p-Wert 0,27 0,27 0,09 0,15 0,03

Anhang C Daten 98

Tabelle C.24: S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50.


p-Wert >0,01 >0,01 0,02 0,07 0,09


p-Wert >0,01 >0,01 0,16 >0,01 0,27


p-Wert >0,01 0,98 0,44 0,10 0,81

99

Anhang D

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. Thomas Wag-

ner fur die Uberlassung des Themas dieser Dissertation und der Nutzungsmoglichkeit

des Labors. Außerdem mochte ich mich bei ihm fur die intensive und geduldigen

Betreuung bedanken.

Außerdem mochte ich mich bei Frau Dr. Stephanie Stolting bedanken fur die moti-

vierende Unterstutzung, die wiederholte Korrektur der Arbeit, sowie die Hilfestellung

bei der Statistik.

Danken mochte ich auch Frau Monica Vollmert fur die Einweisung in die Arbeitsme-

thoden, die Betreuung wahrend der Versuche sowie fur die Korrektur von Teilen der

Arbeit.

Fur die großartige Hilfe bei den Tierversuchen mochte ich mich bei meiner Mitdokto-

randin Friederike Auerswald bedanken.

Bei Mark Schenk mochte ich mich fur die Einfuhrung in das Arbeitsprogramm

LaTex bedanken sowie dafur, dass er jederzeit mit Rat und Tat bei der Losung von

Programmproblemen geholfen hat.

Außerdem mochte ich mich bei Dr. Mathias Hoizcyk von der Onkologischen Klinik

in Essen und Dr. Tobias Wohrle von der Anastesiologischen Klinik der Ludwig-

Maximilians-Universitat Munchen fur die Korrekturlesung meiner Arbeit bedanken.

Fur die Rettung meiner Daten von meinem ausgebrannten Computer bin ich meinem

Freund Kasper Worsøe Andersen sehr zu Dank verpflichtet.

Auch dem Laborteam und den Mitdoktoranden mochte ich fur die aufmunternde

Zusammenarbeit danken.

Zuletzt gilt mein besonderer Dank meinen Eltern und meinem Bruder dafur, das sie mir

mein Studium ermoglicht und mir wahrend dieser Arbeit Vertrauen und Unterstutzung

geschenkt haben.

100

Anhang E

Lebenslauf

Personliche Daten

Name: Jan Mikael GerlGeburtstag/-ort: 26. Marz 1981,

Hillerød, Danemark

Hochschulausbildung

2000-2007 Studium der Humanmedizin04/03 - 12/07 Klinischer Abschnitt, Universitat zu Lubeck, Deutschland09/00 - 08/02 Vorklinischer Abschnitt, Semmelweis Universitat, Budapest, Ungarn02/06 - 10/06 PJ, Chirurgie und HNO, Universitat zu Lubeck, Deutschland11/06 - 02/07 PJ, Innere Medizin, Haukeland Sykehus, Bergen, Norwegen

Beruflicher Werdegang

09/12 - Ass.-Arzt HNO, Ahus Sykehus, Lørenskog, Norwegen06/12 - 08/12 Ass.-Arzt Innere Medizin, Dronning Ingrids Hospital, Nuuk, Gronland06/11 - 05/12 Ass.-Arzt HNO, Slagelse Hospital, Danemark04/11 - 05/12 Ass.-Arzt Audiologie, Slagelse Hospital, Slagelse, Danemark04/10 - 03/11 Ass.-Arzt Onkologie, Rigshospitalet, Kopenhagen, Danemark09/08 - 03/10 Ass.-Arzt Innere Medizin, Herlev Hospital, Kopenhagen, Danemark04/08 - 08/09 Ass.-Arzt Gastromedizin, Herlev Hospital, Kopenhagen, Danemark

Extracurriculare Aktivitaten

09/11 - 05/12 Assistentensprecher des Krankenhauses in Slagelse04/09 - 04/10 Assistentensprecher der internistischen Abteilung in Herlev05/05 - 05/06 1. Vorsitzender des ”deutschen Famulantenaustausches”(dfa)06/04 - 12/07 Experimenteller Teil der Dissertation

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Anhang F

Erklarung

Ich versichere, die vorliegende Arbeit selbststandig und nur unter Benutzung der

angegebenen Hilfsmittel angefertigt zu haben.

Die Tierversuche wurden vom Ministerium fur Umweltschutz, Natur und Forsten des

Landes Schleswig-Holstein unter der Tierversuchsantragsnummer V742-72241 122-4

(22-3/05) genehmigt (siehe auch Kap. 2.8.1).

Lubeck, den 30.01.2013

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Aus der Medizinischen Klinik I - zhb.uni-luebeck.de · Die Hemmung der Proteindegradierung uber das Proteasom stellt eine neue Therapieop- tion f ur die Behandlung von malignen Erkrankungen