T R E F F P U N K T FO R SC H U N G |

Proteine besitzen in der Regel einebestimmte Anzahl an geladenenGruppen auf ihrer Oberfläche, diein Wechselwirkung mit Wassermo-lekülen treten. Hierdurch entstehteine geschlossene Hydrathülle umdie Proteine. Auch um hydro-phobe, also eigentlich wasserab-stoßende Bereiche auf der Protein-oberfläche bildet sich eine geord-nete Wasserstruktur aus. Dadurchwird die Annäherung und Anlage-rung zweier solcher hydrophoberOberflächen verhindert und dieProteine bleiben in Lösung. Mitstetiger Erhöhung der Salzkonzen-tration konkurrieren die Ionen desSalzes mit den Proteinen um dasHydratwasser und entziehen es ih-nen; vorzugsweise erst einmal anden hydrophoben Bereichen. Da-durch verringert sich die Hydrat-hülle um die Proteine. Je mehr hy-drophobe Bereiche der Proteinevorhanden und freigelegt sind,umso häufiger kommt es zu Wech-selwirkungen der Proteine unterei-nander. Sie lagern sich aneinanderan, bilden Aggregate und präzipi-tieren (fallen aus). Diesen Effektnennt man auch den „salting-out-effect“. Proteine mit einer höherenAnzahl an hydrophoben Oberflä-

chenbereichen aggregieren beisteigender Salzkonzentration ent-sprechend früher. Wie gut ein Salzzur Ausfällung von Proteinen ver-wendet werden kann, ist in der sogenannten Hofmeister-Serie (sieheKasten) beschrieben, die vonFranz Hofmeister 1888 postuliertwurde. Die in der Hofmeister-Serielinks stehenden Salze sind für dieAusfällung besonders gut geeignetund werden dort als „antichaot-rop“ bezeichnet, wie z.B. das Am-moniumsulfat [(NH4)2SO4].

Dieses Salz ist für die Fällungoptimal, da es nicht nur sehr preis-wert ist, sondern auch die biologi-sche Aktivität der Proteine schützt,gut wasserlöslich ist, keine signifi-kante Lösungswärme zeigt undsich durch Dialyse wieder sehrleicht aus der Lösung entfernenlässt.

Im Eisbad wird das Salz in feinpulverisierter Form unter Rührendes Fällungsansatzes in kleinenPortionen zugegeben, bis zum Beispiel eine Konzentration von80–85% Sättigung erreicht ist. AmBesten benutzt man hierfür einenSpatel und lässt das Ammoniumsul-fat immer gut lösen. Wenn das Am-moniumsulfat für die gewünschteKonzentration komplett aufgelöstist, sollte eine deutliche Trübungeintreten. Bitte hier beachten, dassdie Angabe der Sättigungskon -zentration nicht der Angabe gSalz/100mL Lösung entspricht!Laut Tabelle entsprechen 80% Sät-tigung einer Zugabe von 56,1gAmmoniumsulfat pro 100mL Lö-sung. Eine vollständige Fällungkann einige Stunden dauern. Die

gefällten Proteine lassen sich problemlos abzentrifugieren(10.000xg, 10–20 min) und kön-nen nach der Entfernung des Sal-zes weiteren Reinigungsschrittenausgesetzt werden.

Will man die Proteine in derLösung nicht nur aufkonzentrie-ren, sondern bestimmte Proteinein der Lösung anreichern, so kannman die Fällung auch fraktioniertdurchführen und die Tatsache nut-zen, dass verschiedene Proteinebei verschiedenen Ammoniumsul-fat-Konzentrationen ausfallen.

[1] G. Richter, Praktische Biochemie, GeorgThieme Verlag, 2003.

[2] A. Pingoud, C. Urbanke, Arbeitsmethodender Biochemie, Walter de Gruyter, 1997.

[3] M. Otto, Analytische Chemie, John Wiley& Sons, 2011.

80 | Biol. Unserer Zeit | 2/2013 (43) www.biuz.de © 2013 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

D I E L A B O R S E I T E

Ausfällung durch AmmoniumsulfatDas Ausfällen von Proteinen steht oft am Anfang der Reinigungsprozedur einer Proteinlö-sung und dient der Entfernung grober Verunreinigungen wie Lipiden, Kohlenhydraten,Nukleinsäuren und Proteinen mit anderem Lösungsverhalten. Die einsetzbaren Technikenvariieren und reichen von der Änderung des pH-Wertes über Fällung durch Hitze bis hinzum Einsatz organischer Lösungsmittel oder hoher Salzkonzentrationen, wobei das Aus-salzen hier die am häufigsten benutzte Methode darstellt. Als eine der bekanntesten Me-thoden gilt die Ammoniumsulfatfällung.

© Lorelyn Medina – FOTOLIA

G U T Z U W I S S E N

Bei geringem Probenvolumenempfiehlt sich die Zugabe desSalzes tropfenweise als gesät-tigte Lösung anstatt als Pulver.So vermeidet man lokal höhereAmmoniumsulfatkonzentratio-nen und somit auch das Ausfal-len unerwünschter Proteine. Je-doch ist zu beachten, dass sichdas Volumen der Probelösungentscheidend vergrößert. Bei einer 50%igen Sättigung wirddas Probenvolumen verdoppelt.

Viel Spaß beimExperimentie-

ren wünschtAndrea Hauk

(geb. Schrödel),Heidelberg

Menge an Ammoniumsulfat, die bei25°C der Proteinlösung zugegebenwerden muss, um eine bestimmteSättigung (in %) zu erhalten.Verändert nach: Harlow, Lane: Anti -bodies – A laboratory manual. ColdSpring Harbor Laboratory, 1988.

H O F M E I S T E R- S E R I E

KationenNH4

+ > K+ > Na+ > CS+ > Li+ > Mg2+ > Ca2

+ > Guanidin

AnionenPO4

3– > SO42– > CH3COOH– > CL– > Br– > NO2

– > ClO3– > I–

> SCN–

Je weiter links die aufgezählten Ionen stehen, desto bessereignen sie sich als Fällungsmittel.

% Sättigung Menge an Ammonium-sulfat in g/L

20 11430 17640 24350 31360 39070 47280 561

100 761