1963 4. Analyse yon biologischem Material 453

besserung des Trenneffekts ergibt. Zur quantitativen Bestimmung der getrennten Substanzen wurde diQ direkte Photometrie der auf der Platte gebildeten, zum Naohweis dienenden Farbkomplexe olme und mit Elution (dureh Abzentrifugieren des Absorptionsmittels) aus der abgekratzten Sohicht erprobt.

1 Klin. Wsehr. 40, 1098--1101 (1962). Med. Poliklinik, Univ. Miinehen. P. T~E~I~,

Isolierung and quantitative Bestimmung yon 8-0-Methyladrenalin (MA) und 8-0-Methylnoradrenalin ()IN) im Harm Zur Abseh~tzung des Catechol- aminstoffwechsels in vivo aus ttarnbefunden ist es wichtig, neben den freien Aminen nnd den Phenols&uren auch die obenerw~hnten Abb~uprodukte quantitativ zu bestimmen. So entwickeln O. K~AuPe, I-I. BE~N~En~XER und D. PA21STAS ~ folgende Vorschri]t: 50 ml Ham werden mit konz. Salzs&ure elektrometriseh auf PH 0,9--1,0 eingestellt und 45 rain lang unter Einleiten yon Stickstoff zum Sieden erhitzt. ~'aeh dem Erk~lten wird der tIaupttefl der Farbstoffe dureh einmaliges Aus- schiitteLa mit der gleichen Menge Essigsi~ure~thylester entfernt. Die wi~l~rige Sehicht wird nach Zugabe yon 15 g Kaliumehlorid mit festem Kaliumphosphat (KaPOt) muter Riihren genau auf pH 10,0 eingestellt. Dieser pH-Wert liegt zwischen den beiden isoelektrisehen Punkten, so dal~ das nachtr~gliche Ausschiitteln mit ~thylacetat-Athanol (4 + 1) nach 5 Malen hinreichend beendet ist. Ein Trennen der Phasen in Zentrifugierg]~sern bei 2000 U/rain karm nStig sein. Um den mit- extrahierten ttarnstoff und die stSrenden anorganischen Sa]ze auszuf~llen, werden die vereinigten organischen Phasen auf dem Wasserbad zur Trockne eingeengt, anschlieBend in 2--4 ml Methanol aufgenommen und mit 50 ml Chloroform ver- setzt. Naeh dem Filtrieren wird die LSsung erneut zur Trockne eingeengt, l~it 0,5 ml Methanol li~l~t sich der Rfickstand aufnehmen. 5, 10 und 20 tel dieser L5sung (entsprechen4 0,5, 1,0 und 2,0 ml des Originalharns) werden auf Whatman-Papier Nr. 1 aufgetragen, das zur zweidimensionalen Chromatographie (aufsteigend) vorbereitet ist. Isopropanol -- 25~ AmmoniaklSsung -- Wasser (40 + 1 + 9) client als Laufmittel in der ersten Richtung, das Fliei3mittelgemisch n-Butanol- Eisessig-Wasser (4 + 1 + 1) in der 2. Riehtung. Die Sichtbarmachung der Zonen erfolgt durch Bespriihen der trockenen Chromatogramme mit frisch bereiteter diazotierter p-NitranilinlSsung. Eine iNachbehandlung mit 20% iger SodalSsung ist angezeigt. Zur quantitativen Bestimmung werden die entspreehenden Flecke nach dem Bespriihen aus dem Chromatogramm herausgeschnitten, mit emer Mischung aus tert. Butanol-Wasser-100/oiger SodalSsmlg (5 + 5 -[- 1) eluiert und anschlie- 13end bei 550 nm photometrisch gemessen. An Hand einer Eichkurve lassen sieh die entspreehenden Azofarbstoffe bestimmen. MA wLrd zu 100~ ~ N zu 650/0 wieder- gewonnen. Als untere Nachweisgrenze gilt f'fir beide Verbindungen 0,5--1 #g/ml Harm Abschliel3end zeigen Verff. die Brauchbarkeit ihrer Methode an 18 verschie- denen ttarnen. In 6 Tabellen, einer Kurve, einer schematischen Darstellung und einer Photographie sind die systematisch erarbeiteten Ergebnisse zusammen- gefa~t.

x Clin. chim. Acta (Amsterdam) 6, 851--860 (1961). Pharmakol. Inst., Univ. ~Vien (0sterreich). H. J o ~

Bei der Adsorptions-fluorimetrisehen Bestimmung yon freiem und gebun- denem Adrenalin und Noradrenalin im Ham naeh P. A. K _ ~ I . ~ 1 entfernt man zun~ehst die Ca- und Mg-Salze mit Ammoniumoxalat bei p~ 6,0--6,5, dann ad- sorbiert man die Catecholamine bei PH 8,2--8,3 an Aluminiumoxid. ~[an eluiert mit Essigs~m'e und oxydiert im Eluat Adrenalin bei pH 4,4, Noradrenalin bei p~ 6,5. Die Oxydutionsprodttkte werden in alkalisehem ~[edium in apfelgrfin fluorescierende Verbindungen fibergeffihrt und dureh Aseorbins~ure stabilisiert,

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w~hrend blauviolett fluorescierende Substanzen hierbei ausfallen und abzentri- fugiert werden. Gebundenes Adrenalin und •oradrenalin werden nach Siiure- hydrolyse bestimmt. -- Arbeitsweise. Zwei Chromatographierkolonnen werden wie folgt vorbereitet: Man legt etwas Gaze in das verengte Unterende einer Kolonne, setzt sie auf einen Saugkolben, giel~t eine Aufschl~mmung yon 2 g Aluminiumoxid in 10 ml 0,2 n Natriumacetatl6sung in die Kolonne, saugt nach kurzem Stehen- lassen ab und wischt mit 25 ml alkalisiertem Wasser. - - Man erhitzt 25 ml H a m in einem K6lbchen mit 5 ml konz. Salzs~ure 20 min auf einem koehenden Wasser- bad mid lil~t erkalten. Man brings nun den t t an l mit 20~ ~atronlauge auf p~ 6,0--6,5, versetzt mit 3 ml ges~t~. AmmoninmoxalatlOsung, filtrier~ naeh 3- -5 rain und ws mit 5 ml Wasser nach. NIan versetzt die Filtrate mit je 1--2 Tr. Phenolphthaleia und mit 4~ Natronlauge bis zur schwachen ~osa- f i rbung, saugt sie im Tempo yon 3--5 ml/min durch die Kolonne und w~seht zu- erst mit 50 ml 0,2 n ~atriumacetat16sung, dann mit 100 ml alkalisiertem Wasser nach. Je 2 ml des Eluats werden in drei Probiergliser mit 10 ml-NIarken gebracht. In Glas ,1 ̀ ~ werden Adrenalir~ u~d NoradrenMin oxydiert, m , 2 " nur Adrenalin; , 3 " dient als Kontrolle. Man bringt ,,1" mi~ 1 ml 0,7 m ~a2I-IPO~-LOsung auf p~ 6,5, , 2 " mit 0,8 ml 0,2 n Natriumacetatl5sung auf p~ 4,4. Dazu versetz~ man ,1 und , 2 " mit je 0,3 ml 0,01 n godi6sung und schiittelt 30 see, worauf man 2 Tr. 0,1 n NatriumthiosuffatlSsung zusetzt. , 3 " wird mit 0,3 nil l~ Aseorbin- s~urelSsung, 1 ml 0,7 m Dinatriumphosphatl6sung, 0,8 ml 0,2 n Natriumacetat- 15sung und 1 ml 20~ iNatronlauge versetzt. Naeh 5--6 min versetzt man , 1 " und , 2 " mit je 0,3 ml l~ Ascorbinsiurel6sung und je 1 ml 20~ Natron- lauge. PAle Gl~ser werden mit bidest. Wasser zur Ylarke aufgeffillt. Der nun aus- fallende Niederschlag wird 2 mia bei 200--300U/rain abzentrffugiert. - - Die Fluorescenz wird entweder mit einem Fluorimeter oder mit einem Pulfrich-Bhoto- meter mit Fluorescenzaufsatz 2 gemessen un4 mit eiaer Standardl6sung yon 10 ml Eosin (0,25 #g/ml) verglichen. In ,,1" wird die Gesamtituorescenz der Oxydations- produkte yon Adrenalin, Noradrenalin und Reagentien bes~immt, in , 2 " die yon Adrenalin und l~eagentien, in , 3 " nur die der l~eagentien, I)emnach ist die Fluo- rescenz yon Adrenalin = , , i" -- ,,2", die yon Noradrenalin , 2 " - - ,3 ~176 I)ie Kon-

a . b . 2 0 .A zentration yon Adrenalin (Nora4renalin) ergibt sieh aus 2 �9 25 - - ttg/Tag"

[a = Fluoreseenz yon Adrenalin oder Noradrenalin in Skalenteilen; b = ~quivalent eines Skalenteils auf der Eichkurve; 20 = Volumen des Eluats; A = Tagesharn- menge (fiir #g/O/0 wird A = 100 ml) ; 2 = Volumen des zur Analyse gelangenden Eluats; 25 = Volumen der tIarnprobe.] - - Zur Konstrulction der Eich~urve bereitet man Adrenalin- und Noradrenalinstamml6sungen yon 100/~g/ml, die im Kiihl- schrank einige Tage haltbar sind. Vor der Bestimmung stellt man daraus L6sungen in 0,2 n Essigsiure her, so dag die Endkonzentration 0,5 #g/ml betr~gt. Von 6 Probierglisern mit 10 ml-Marken bringt man in die 3 ersten je 0,5 ml Adrenalin- 16sung, in die iibrigen je 0,5 ml NoradrenalinlSsung, fiigt je 1,5 ml 0,2 n Essigs~ure hinzu, verarbeitet sie wie das Eluat und bestimmt die Fluorescenz jeder Probe, was mit anderen Konzentrationen wiederholt wird.

i Vop. med. Chim. 8, 407--411 (1962) [l~ussisch]. (Mit engl. Zus.fass.) Lehrst. f. Biochemie des Med. Inst., Charkov (UdSSI~). - - ~ Der Verf. benutzte ein solches im Laboratorium yon A. M. Utevskij gebautes Ger~t (siehe OsI~rS~Zi, V. 0 . : Biochimija 22, Nr. 3, 537, 1957). P. H ~ s

Eine Modifikation der Methode yon Shaw zur Best immung des Gehaltes yon adrenaliniihnliehen Substanzen in kleinen Blulmengen gibt E. ~. MiTL~.~ i an. Das Verfahren yon F. H. S~AW 2 wird einer /~lutmenge yon 0,1 ml angepal3t.