4. Auf Physiologie und Pathologie beztigliche. 461

Zur Lokalisation der Flecken wird mit Antimontriehlorid-Methanoll5sung (1 : 2) besprfiht und erhitzt. Bei Verwendung einer JodlSsung (0,3~o J2 in 5~o iger wal3riger KJ-LSsung) wird die Erkennung der Fleeken erleiehtert, wenn man das Filter- papier nach dem Bespriihen mit lauwarmen Wasser w~seht. Folgende Rf-Werte werden angegeben: Testosteron 0,72=t=0,02; Methyltestosteron 0,82 ~= 0,02; Methylandrostendiol 0,55 =L 0,02; Progesteron 0,94 =t= 0,01; Desoxycorticosteron- acetat 0,95 ~: 0,01; Cortisonacetat 0,01; ~a-Androstendion 1,0 =t= 0,97; Dehydro- isoandrosteron 0,82 =j: 0,02; AS-Androstendiol 0,42 =~= 0,02; Oestron 0,30 =~ 0,02; ~.-Oestradiol 0,16 ~= 0,02. K. I-IINsBERG.

Zur Erkennung und Bestimmung yon Steroidsapogeninen verwenden H. A. WALENS, A. TURNER jr. und M. E. WALL 1 die yon G. DIAz, A. Z~FARONI, G. ROS~N- KRA~Z und C. DSER~SSI 2 beobachtete Reaktion mit konz. Schwefels~ure, bei der LSsungen entstehen, die im Bereich yon 220---400 m# charakteristisehe Absorp- tionsspektren aufweisen. - - Arbeitsweise. Etwa 5 mg der Probe 15st man in Chloro- form, iiberfiihrt in einen 10 ml-MeBkolben, bringt zur Troekene, versetzt mit 94~oiger Sehwefelsiiure bis zur Marke, h~lt 16 Std im Wasserbad bei 40 ~ C, kfihlt ab und erg~nzt, falls notwendig, mit 94~oiger Schwefelsi~ure. Dann ffihrt man in 1 cm-Qu~rzzellen im Beckman-DU-Spektrophotometer oder im Cary recording- Spektrophotometer im Bereich yon 220--600 m# die Messungen durch. Dureh Vergleich der erhaltenen Werte mit den angegebenen Tabellen kSnnen die meisten Sapogenine leicht identifiziert werden. - - Die quantitative Bestimmung wird bei einer Komponente dureh Absorptionsmessung bei 250 m# und Auswertung mit Itilfe einer Tabelle vorgenommen. Bei zwei Komponenten werden 2r bei 250 und 350 m# durehgefiihrt und die Konzentrationen aus einfachen Gleichungen bereehnet. Liegt ein Gemiseh mehrerer Sapogenine vor, so ist die Zerlegung in Ein- oder Zweistoffsysteme mittels Adsorptionschromatographie erforderlich. Man ver- wendet dazu aktiviertes Aluminiumoxyd oder Florisil a. Als Elutionsmittel dienen versehiedene Misehungen yon Chloroform, Benzol und J~thanol. Die Genauigkeit der Methode wird mit =~: 2~o angegeben. - - Einige Sapogenine, besonders die ges/~ttigten, carbonyffreien Verbindungen zeigen sehr/~hnliche Spektra und lassen daher keine eindeutige Identifizierung zu. Wenn man jedoch auBer der Spektral- untersuchung noch die Schmelzpunktsbestimmung und das chromatographisehe Verhalten als weitere Kriterien hinzunimmt, so kann man wenigstens 13 der ge- wShnlieh vorkommenden Sapogenine vollsti~ndig identifizieren. Ein Schema hierzu ist im Original angegeben. Tm B~EY~X~.

Bei der Bestimmung yon Ergothionein im Blur treten naeh D. B. MELVILLE und i~. LuBsc~z a sehr oft StSrungen auf, weft bei der Diazoreaktion viele Substanzen mit reagieren, wie z. B. Tyrosin, die die orange Farbe des Ergothioneins verdecken. Glutathion unterdrtiekt die Farbbildung. Bei der Anwendung der HU~TERschen Originalreaktion 5 treten Verluste beim EnteiweiBen auf. Es wurde nun gefunden, dab eine Enteiweigung mit Trichloressigs~ure glatt gelingt, wenn reiehlieh redu- zierende Substanzen, Glutathion und Dithionit, zugesetzt werden. Beide k5nnen dureh Behandlung des eiweigfreien Filtrates mit Amberlite IRA 410 entfernt werden. Von Glutathion wird eine 3,5~oige LSsung verwendet, Natriumdithionit ist fein gepulvert und das Amberlite wird dureh 3sttindiges Schtitteln mit 5~oiger

1 Analyt. Chemistry 26, 325--329 (1954). East Region. l~es. Lab., Philadelphia, Pa. (USA).

J. org. Chemistry 17, 747 (1952). 3 Floridin Co., Warren, Pa. (USA).

J. biol. Chemistry 200, 275--285 (1953). Univ. Med. Coll., New York. 5 HUNTER, G. : Canad. J. I~es. (Sect. E) 27,230 (1949) ; vgl. diese Z. 133, 461 (1951).

462 Bericht: Spezielle analytische Methoden.

Na2CO3-LSsung yon Chloriden befreit, mit Wasser ausgewaschen und feueht auf- bewahrt. Der alkalische Puffer besteht am besten aus 200 g wasserfreiem Na2CO 3 nnd 57 g l~atriumeitrat 2H20 in 1 1 Wasser, und mu] in einem Poly/~thylenbehilter aufbewahrt werden; vor Gebraueh sind Trfibungen dureh Filtrieren zu entfernen. - - Zur Bestimmung nimmt man 1 ml heparinisiertes Blut und 10 ml 0,9%ige lqaC1- LSsung, zentrifugiert den l~iedersehlag ab, saugt das ~berstehende soweit wie mSglich ab und fiillt mit Wasser auf 1,0 ml auf. Dann setzt man 0,5 ml Glutathion, ungefihr 25 mg Natriumdithionit und 5 ml Wasser zu und f/~llt das EiweiB durch 0 ,5ml 35%ige Trichloressigsiure. Das klare Zentrffugat wird mit 15ml ge- waschenem Chloroform gesehfittelt, die Chloroforml0hase und einige feste Bestand- ~eile werden abgetrennt, die w/~Brige Schicht mit ungefihr 4 ml (etwa 2,4 g) des feuchten I-I~rzbreies vermiseht und 10 rain gesehiittelt. Man filtriert ab, entnimmt 3 ml Filtrat, gibt 0,5 ml alkalisehen Puffer und 0,5 ml diazotierte Sulfanils/~ure zu, setzt 45 see in ein Eisbad, fiigt dann 1 ml 19 n lqatronlauge schnell zu und miBt bei 540 m# gegen einen entsprechend angesetzten Leerwert. Die Eichkurve wird mit reinen ErgothioneinlSsungen angelegt. D~ nur 8/7 des ursprfingliehen Blut- volumens verwendet werden, werden die Ergebnisse mit 7/3 multipliziert. Zusatz- versuehe bei Mensehen- und Tierblut in Mengen yon 1 ,7 -96 #g Ergothionein ergaben sehr gute Ausbeuten. Die beschriebenen Werte deeken sich fast mit denen yon HU~TER. Bei normalen l~Iensehen werden Werte zwisehen 1,7--4,2 #g gefunden. Ein Vorteil der 1Kethode soll die grSl]ere Empfindlichkeit sein. K. HI~S~EI~G.

N-Methyl-2-Pyridon-5-earbonamid (MPC) und n-Methylnieotinamid (M~A) sind die wesentlichsten Stoffweohselprodukte der Nieotins/~ure. Nieotinamid kommt nur in Spuren vor und andero Abb~uprodukte normalerweise gar nicht. Von W. I. M. H o L ~ i ~ 1 wird ein Verfahren entwickelt, um MPC und MI~A zu bestimmen, welches auf dem HoF~iie~sehen Abbau yon Siureamiden durch Hypobromit beruht. Zur quantitativen Auswertung ist es notwendig, einen lJ-bersehuB yon Bromlauge zu "r durch Zusatz yon Phenol. Die Broml6sung besteht aus 12,5 g I~atrium- bromid und 4 ml Brom in 100 ml W~sser. Das Pyridonreagens besteht aus 4 ml 2,5 n l~atronlauge, etwa 45 ml Wasser und 2 ml BromlSsung ~ufgeffillt mit Wasser auf 50 ml. Zum M_NA-Reagens verwendet man 6 ml 2,5 n Natronlauge. Die Phenol- 15sung ist 0,45% ig. Zur Bestimmung verwendet man LSsungen yon PH 7--9 mit 0--50 #g n-Nicotin~mid, iKNA odor MPC, verdiinnt auf 4 ml, gibt unter Lichtaus- schlul~ 1 ml HypobromitlSsung und 4 rain spi ter 1 ml PhenollSsung zu, versehlieBt mit einem Stopfen, der durch einen SchraubverschluB festgehalten wird und er- hitzt 10 rain in einem koehenden Wasserbad. Nach dem Abkfihlen setzt man 0,5 nil 2,4 n S~lzs/~ure und 0,5 in] 0,1%ige NaNO~-LSsung zu, nach weiteren 4 rain 0 ,5ml 0,5%ige Ammoniumsulf~minatl6sung und naeh weiteren 4ra in 0 ,5ml 0,1%ige N-(1-Naphthyl)-/~thylendiamindihydroehloridl6sung. Die Proben wer- den mit aufgesetztem Stopfen gesehfittelt und die Extinktion gegen eine Blind- probe bei 500 und 590 m/~ gemessen. Der Azofarbstoff ffir Nicotinamid und MNA absorbiert bei 500 m#, f/it MPC bei 590 re,u, ohne da~] eine gegenseitige St6rung stattfindet. - - Fiir die Untersuehung yon Urin muB man das iKNA abtrennen. Dies gelingt mit Deealso bei pg 7, welches MNA quanti tat iv zurfickhilt, wihrend lqico- tinamid und MPC durehliuft. MI~A wird mit 25% iger KC1-LSsung eluiert und wie oben besehrieben bestimmt. Die Ausbeuten betragen 88--96%. Besser ist dieVerwen- dung yon LLOYDS Reagens oder die Fallung mit Bleihydroxydbei PH 9,2. Mank~nn aueh eine unspezifisehe Farbe dadurch eolorimetrisch ausschalten, dab man den I{arn zuerst mit Phenol und dann mit dem auf d~s doppelte verd/innten I-Iypobromit- reagens versetzt. Zur schnellen Bestimmung yon MPC wird empfohlen, aus einer 24st~ndigen t{arnmenge den Tell, der der Urinsekretion entspricht, mit 2 ml 1 m

i Bioohemic. J. 56, 513--520 (1954). Univ. Cambridge (England).