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Bestimmung der Molekularen Masse
von Makromolekülen
GrößenausschlußchromatographieGelfiltration,
SEC=size exclusion chromatography
GrößenausschlußchromatographieGelfiltration,
SEC=size exclusion chromatography
10log
MW
[kD
a]Elutionsvolumen [ml]
Carboanhydrase
BSA
Lysozym
Aprotinin
Größenausschlußchromatographie
Vorteile:Sehr oft ist Gelfiltration ein Schritt bei der Isolation des Proteins. Somit istdie Information über die native Größe schon vorhanden. Genauigkeit: +/- 10% im optimalen Fall bis zu +/-50% Abweichung
Nachteile:Das Elutionsvolumen kann durch die Form des Proteins oder auch durchInteraktionen des Proteins mit der Säulenmatrix stark beeinflusst werden.Schwache Komplexe zerfallen auf Gelfiltration.
Protein
Hydrodynamischer Radius
Massenspektrometrie
Massenspektrometrie
• Hauptmethoden:
ESI = Electrospray Ionisation
MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
•Prinzip: Moleküle werden ionisiert und im elektrischen Feld beschleunigt
Massenspektrometrie• Detektion der ionisierten Moleküle z.B. mittels TOF = Time Of Flight
• PrinzipAlle Moleküle haben nach der Beschleunigung im el. Feld diegleiche kinetische Energie = E = ½ mv2. Es gilt
Ekin (Molekül 1) = Ekin (Molekül 2) ½ m1v1
2 = ½ m2v22
Ist nun die Masse m1 größer als die Masse m2
ist also die Geschwindigkeit v1 entsprechend kleiner als v2
d.h. das “leichtere” Molekül 2 kommen zuerst an.
Massenspektrometrie• Latest: Detektion der ionisierten Moleküle
Orbitrap
MassenspektrometrieVorteile:Sehr wenig Probe wird benötigt. Sehr präzise Messungen.Genauigkeit bis +/- 0.1 Da
Nachteile:Da die Proteien ionisiert werden müssen, kommt es oft zurDeanturierung der Proteine; d.h. Multimere oder Komplexe zerfallen sehroft bei der Ionisation und können nicht detektiert werden.
Dynamische Lichtstreuung• DLS, Dynmaic Light Scattering auch “quasi-
elastische” Streuung genannt.
• Grundprinzip:Ist das Molekül sehr viel größer als die Wellenlänge des eintreffende Lichts, werdendie Photonen elastisch - d.h. ohne ÄnderungWellenlänge - gestreut (Rayleigh Scattering).
(Analogie zum elastischen Stoß, bei dem ein Partikel, dersehr viel kleiner als der Stoßpartner ist, zwar eine andereRichtung erhält aber die Geschwindigkeit vollständigerhalten bleibt)
Dynamische Lichtstreuung
Moleküle in Bewegung
Einfallendes Licht
Gestreutes Licht
Moleküle in Lösung
Dynamische Lichtstreuung
Einfallendes Laserlicht Auslöschung
Verstärkung
Detektion
Dynamische Lichtstreuung
Einfallendes Laserlicht Auslöschung
Verstärkung
Änderung der Inensität
in Abhängigkeit von
der Bewegung
Dynamische Lichtstreuung
Brown’sche Molekülbewegung abhängig von Diffusionskoeffizient
Diffussionskoeffizient
kB = Boltzmann KonstanteT= Temperaturη = ViskositätR0= Hydrodynamischer Radius des diffundierenden Teilchens
Änderung der Lichtintensität gibt Rückssschlüsseauf Bewegung der Moleküleund über den Diffusionskoeffizienten auf die Größe der Moleküe.
Dynamische LichtstreuungVorteile:Wenig Probenvolumen, in der Regel geringe ProteinkonzentrationBenötigte Proteinkonzentration von der Größe des Proteins abhängig.
Nachteile:Methode extrem anfällig auf Partikel, wie z.B. aggregiertes Protein,Staub, etc, geringe Präzision.
Achtung bei Glycerin oder andere Substanzen im puffer, die Viskosität stark ändern.
Analytische Ultrazentrifugation
• Grundprinzip:
Bewegung der Moleküle während Sedimentation oder
Sedimentationsgleichgewicht wird gemessen =>
Rückschlüsse auf Größe.
Analytische Ultrazentrifugation
Analytische Ultrazentrifugation
Analytische Ultrazentrifugation
Analytische Ultrazentrifugation
t=0
t=x
Analytische UltrazentrifugationSedimentation
Analytische Ultrazentrifugation
Lamm Gleichung
Analytische Ultrazentrifugation
Analytische Ultrazentrifugation