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vor l iegenden Spurenkonzen t ra t ionen meis t niche ausre icht und da der exper imente l le Aufwand rech t hoch ist. MSglicherweise ergeben sich Anwendungen fiir die Mikrosonde, mi t der ex t r em kleine 0 b j e k t e unter - sucht werden kSnnen, doch sind bei diesem Verfahren bisher noch Pr/~parat ionsschwierigkei ten zu i iberwinden.

Literatur 1. BooK, R.: RSntgenanalyse. In: Ullmann's Encyklop~die der technischen Che-

mic, Bd. 2/1, S. 363, 3. Aufl. Miinchen: Urban & Schwarzenberg 1961. 2. MUELL]~, 1~. O. : Spektrochemische Analysen mit RSntgenfluoreszenz. Theorie

und industrielle Anwendung, 1. Aufl. Miinchen: Oldenbourg 1967.

Prof. Dr. R. Bocx Institut ffir Anorganische Chemie und Kernchemie der Universiti~t 6500 Mainz, Joh. Joachim Becher-Weg

Bestimmung toxikologisch wichtiger Elemente in biologischem Material mittels RSntgenfluorescenz- Analyse

G. HAUCK

Institut ffir gerichtliche und Versicherungsmedizin der Universit/~t Freiburg i. Br. Direktor: Prof. Dr. W. SPAN~

Eingegangen am 3. April 1968

Determination o/ Elements o/ Toxicological Importance in Biological Material by Means o /X-Ray Fluorescence Analysis. The application of X-ray fluorescence analysis till to day is restricted to the determination of elements of clinicalimportance in very small samples. By systematical investigations and improving industrial equipment it could be achieved to adapt X-ray fluorescence analysis to forensic toxicology. The limits of detection are 1 ~g of bromine in 5 g of urine, 1,8 ~g of lead in 10 g of blood, and 0,025 ~g of arsenic in 10 to 30 mg of hair. The standard deviation is i to 5 ~ Because of its high specifity X-ray fluorescence analysis satis- fies the high standards claimed for forensic toxicology.

Die RSntgenf luorescenz-Analyse wurde bisher nur wenig ffir die Unter - suchung biologischen Mater ia ls angewandt . I m wesent l ichen sind es drei Arbei tskreise , die sich mi t diesem Anwendungsgeb ie t der RSntgen- f luorescenz-Analyse besch/iftigen. Der Arbe i t skre i s yon NAT]~LSO~ [12 bis

Bestimmung toxikologisch wichtiger Elemente 99

27] hat die Bestimmung yon klinisch wichtigen Elementen wie Natrium, Kalium, Calcium, Eisen, Chlor, Schwefel und Phosphor ausgearbeitet. Entspreehend der Problemstellung wurden nut kleine Serum- bzw. Blut- mengen eingesetzt und das Verfahren weitgehend automatisiert. Zur Bestimmung yon Strontium, Brom, Eisen, Kupfer und Zink wurde das Material (Serum oder Knochen) verascht. Versuche zur Bestimmung yon schweren Elementen wie Blei, Wismut oder Thallium fiihrten nicht zu befriedigenden Ergebnissen. Ebenfalls ffir klinische Untersuchungen mit fast gleieher Aufarbeitung der Proben haben MATg~S u. LV~D [9--11] die R6ntgenfluorescenz-Analyse zur Bestimmung yon Eisen, Calcium und Brom angewandt. Besonders bei der Bestimmung yon Eisen in Blur und Plasma scheint die R6ntgenfluoreseenz-Analyse anderen Methoden tiber- legen zu sein. Fiir die Bestimmung yon Harnstoff haben MAT~IES u. LeND ein interessantes Verfahren ausgearbeitet, das darauf beruht, dag das freigemaehte Ammoniak mit Neglers Reagens auf einem Fflterpapier reagiert. In dem entstandenen Niedersehlag wird das Quecksilber mittels R6ntgenfluorescenz-Analyse bestimmt. In Deutschland haben sich, abgesehen yon eigenen Arbeiten [5--7], bisher nur BEYEI~MANN U. CI~E- TIUS [1--3] mit der Anwendung der R6ntgenfluoreseenz-Analyse zur Untersuehung biologisehenMaterials besch/~ftigt. Auch sic setzten nut sehr kleine Probenmengen ein. Im Gegensatz zu der Untersuehung yon biologischem Material f/it klinisehe Zweeke stehen bei der toxikologisehen Untersuehung meist mehr als nur einige Milligramm der Probe zur Verfiigung. Besonders bei gerieht- lichen Fragestellungen sind jedoch die Anforderungen an die Genauigkeit und Sieherheit der Methode grSBer als bei klinischen F/~llen. Wit haben deshalb gepr/ift, ob die R6ntgenfluorescenz-Analyse auch fiir forensisch- toxikologisehe Analysen eingesetzt werden kann. Diese Arbciten fiihrten wit mit einem Kristalloflex IV der Fa. Siemens in verst/trkter Ausfiihrung (60 kV, 50 mA) dutch. Wit benutzten den Zusatz fiir RSntgenfluores- eenz-Analysen in Luft. Wit untersuchten die M6glichkeiten der Brom- bestimmung in Urin, der Bleibestimmung in Blur und der Arsenbestim- mung in Haaren. Damit wurde sowohl die Art des zu bestimmenden Elementes -- Nichtmetall, Metall und l'Jbergangselement -- als aueh die Art der Probe varfiert. Es sollte eine ehemisehe Aufarbeitung des Unter- suchungsmaterials vermieden werden, da dabei immer die Gefahr der Einsehleppung oder des Verlustes der zu bestimmenden Elemente besteht. Ein Vergleich zwischen Wolfram- und MolybdgnrShre zeigte, dab in allen F~llen die Molybd/~nr6hre giinstiger ist. Dies ist darauf zuriickzufiihren, dab neben dem Bremsspektrum die spezifische Strahlung wesentlieh mit zur Anregung beitr/~gt. Mit Spannungen bis zu 60 kV wird bei Molybd~n das K- und L-Spektrum, bei Wolfram abet nut das L-Spektrum angeregt.

7*

100 G. HAuoK:

Die L-Spektren yon Molybd~n und Wolfram sind zu energiearm, um zur Fluorescenzanregung yon Arsen, Brom oder Blei beizutragen. Es kann deshalb nur das K-Spektrum yon Molybd~n zur Fluorescenz- anregung beitragen. Ani~erdem liegt das L-Spektrum yon Wolfram in der N~he der Analysenlinien yon Arsen, Brom und Blei und stSrt. Obwohl bereits bei einer Spannung yon 20 kV die spezifische Strahlnng des K-Spektrums yon Molybd/~n angereg~ wird, zeigte sich, dal3 bis zur maximal mSglichen Spannung yon 60 kV die Ausbeute an Fluorescenz- strahlnng zunimmt. Dabei verbesserte sich aueh das Verh~ltnis yon Linie zu Untergrund und damit wurde die Ausbeute an Nettoimpulsen wesentlich erhSht. Diese Verbessernng t ra t ein, obwohl bei 60 kV die RShre nur mit 32 mA betrieben werden konnte. (Die yon uns verwendeten HochleistungsrShren der Fa. Siemens sind nur bis 2 kW belastbar.) F/Jr die spektrale Zerlegung der RSntgenfluorescenzstrahlung benutzten wir einen Lithinmfluorid-KristaU. Der Sollerspalt hat te eine 0ffnung yon 0,15 ~ Zur Unterdrfickung der stSrenden Bleistrahlung, besondcrs der Streustrahlung yon den Blenden, haben wir die Ein- und Austrittsblcnde mit 0,1 m m starkem Sflberbleeh kaschiert. Als Detektor benutzten wir ein Geiger-Mfiller-Zahlrohr mit Argonffillung im Plateaubereieh bei 1000 V Z~hlrohrspannung. Der Geiger-Mfiller-Z/~hler isf in seiner Emp- findlichkeit fiber lange Zeit konstant. I m Gegensatz dazu hat der Szinfil- lationsz~hler zwar eine hShere Empfindlichkeif, das l~ausehverhaltnis ist jedoch nur bei Diskriminierung besser. Versuehe zeigten, da]3 die Kanal- einstellung ffir die Diskriminierung nur sehwer fiber einige Stunden konstant gehalten werden kann. Deshalb haben wit den Geiger-Miiller- Zahler trotz seiner geringeren Impulsausbeute vorgezogen.

Als Analysenlinie w~hlten wir die Brom-K~-Linie, die Blei-Lfil,2-Linie und die Arsen-K~-Linie. Der Untergrund, der bei jeder Messung berfick- sichtigt werden muG, wurde 0,5 ~ neben der Analysenlinie auf der kfirzer- welligen Seite bestimmt. Die Spezifitat ist bei Messung yon Linie und Untergrnnd bereits sehr hoch, lediglieh bei der Arsen-K~-Linie k5nnte Blei stSren. Diese St5rung, wie auch Koinzidentien yon seltenen Elemen- ten wie Francium, Osmium, Hafnium und Neptunium kSnnen durch Auf- nahme eines Spektrums ausgeschlossen oder reehnerisch berficksiehtigt werden. Damit isb es mSglieh, mat der R5ntgenfluorescenz-Analyse streng spczifiseh die einzelnen Elemente in biologischem Material zu bestim- m e n .

Die Probenvorbereitung ist auBerordentlich einfach. Fltissige Proben, wie z.B. Urin, kSnnen direk~ in die Fliissigkei~sbecher -- die verbessert wurden -- eingefiillt und untersuch~ werden. Fiir die Untersuehung sind etw~ 5 ml notwendig. Bei Bht und Gewebe h~t sieh bew~hrt, diese zun~chst im V~kuumtrockenschrank bei 60 ~ C und 100 Torr zu trocknen, dann fein zu pulverisieren und eine 10 g Ausgangsmaterial entspreehende Menge zu Tableften zu pressen. Beim Trocknen back~ d~s organische

Bestimmung toxikologisch wichtiger Elemente 101

Material leicht am Glas lest. Dies kann durch leichtes Einfetten der Petri-Scha]e mit Silicon verhindert werden. Die Tabletten haben bei einem Pregdruck yon etwa 100 at eine ausreichende Festigkeit, ohne da] irgendwelehe Zus~tze erforderlieh w~ren. Bei der Untersuchung yon Haaren haben wir 3--5 mm lange Haarabschnitte uuf eine Tablette aus Hoeehst-Waehs C aufgepreBt. Bei einer Haarmenge zwischen 10 und 30 mg war damit eine ausreichende Fixierung gegeben. Mit Arsenverlusten ist auch w~hrend der Analyse nieht zu reehnen, da Arsen in den Haaren an das cystinreiche Keratin gebunden vorliegt.

Das biologisehe Material hat einige Besonderheiten, die sieh zum Teil gfinstig, zum Tell ungiinstig auswirken. Einmal besteht die Matrix aus leichten Elementen und ist wegcn der biologischen Steuerungsmechanis- men in allen Proben gleicher Art wie z.B. mensehlichen Blutproben aus- reichend konstant. Es genfigt also in der Regel, fiir das verschiedene Probenmaterial einmal eine Eichkurve aufzustellen. Alle Proben gleicher Art kSnnen dann in gleicher Weise analysiert werden. Gerade bei der Auf- stellung der Eichkurven wirkt sich nachteilig aus, dag es kein biologisches Material gibt, welches frei yon den zu analysierenden Elemen~en ist. Auch l~gt sieh die Matrix des biologischen Materials nicht ausreichend genau simulieren. Man mug deshalb den Gehalt in dem Probenmaterial ffir die Eichkurve mit anderen Methoden bestimmen oder nach Zusatz bekannter Mengen rechnerisch ermitteln. Die zweite Methode ist meist wesentlich genauer. Ni t der gesehilderten Anordnung war es mSglich, nieht nur erh6hte Gehalte bei Vergiftungen, sondern aueh die physiologischen Konzentra- tionen der genannten Elemente zu bestimmen. Um zufgllige Sehwankun- gen besonders der anregenden gSntgenstrahlung auszuschlieBen, wurden jeweils etwa 1 Million Impulse gez~hlt. Die daftir notwendige Zeit liegt f~r Blei und Arsen bei 100 rain, fiir Brom bei 40 rain. Die Genauigkeit ist jedoch nicht nur yon der Zahl der Impulse abh/~ngig. Die Standard- ahweiehungen warden aus Mehrfachuntersuchungen berechnet [4, 8]. Die Standardabweiehung der Bleibestimraung im Blur liegt bei 2 ~ die der Brombest immung bei 5 ~ und die der Arsenbestimmung in Haaren bei 1 ~ Die Nachweisgrenzen wurden f/ir Blei zu 18 ~g/100 g Vollblut, fiir Brom zu 20 ~g/100 g I t a rn und ftir Arsen zu 0,025/~g in der eingesetzten Menge bestimmt. Bei schonender Verasehung, z.B. mit dem Ger/~t zur Kaltverasehung der Fa. Tracer-Lab., soll nach ARNOT,D (Diskussions- bemerkung) die Naehweisgrenze noch welter gesenkt werden k6nnen. Bei hSheren Konzentrationen, speziell yon Brom, wie sie besonders nach der Einnahme bromhaltiger Medikamente auftreten, kann die Unter- suehung wesentlich bcsehleunigt werden. Die toxikologisch interessieren- den Gehalte fiber 0,5 mg/100 ml Urin lassen sieh n/~mlich sehon dureh die Auswertung der Peakh6he der Brom-Kc~-Linie hestimmen, wenn das Fluoreseenzspektrum z.B. mit einem Kompensographen registriert wird. Die gesamte Untcrsuchungszeit liegt dann bei etwa 10 rain.

102 G. HAUCK: Bestimmung toxikologisch wichtiger Elemente

Als besondere Vorteile der RSntgenfluorescenz-Analyse bei der Bestim- mung toxikologisch wichtiger Elemente in biologischem Material sind zu nennen :

1. Die Empfindl ichkei t ist so groin, dab aueh noch physiologisch vor- kommende Spuren yon Brom in Urin, Blei in Blur und Arsen in Haaren sicher erfa~t werden. 2. Die Genauigkei t ist der anderer Methoden iiberlegen. 3. Die Methode ist streng spezifiseh. StSrungen dureh andere Elemente kSnnen ausgeschlossen werden. 4. Die Proben brauehen nieht ehemiseh aufgearbeitet zu werden.

Zusammenfassung Die bisherige Anwendung der RSntgenfluorescenz-Analyse auf bio- logisehes Material besehrankte sieh auf die Bes t immung klinisch wieh- tiger E lemente in sehr kleinen Probenmengen. Durch systematisehe Unte r suehungen u n d Verbesserungen der handelsi ibliehen Gerate war es m5glich, die RSntgenfluorescenz-Analyse auch in der forensisehen Toxi- kologie einzusetzen. Die Naehweisgrenzen bet ragen 1 ~g Brom in 5 g Urin, 1,8 ~g Blei in 10 g Vollblut und 0,025 ~g Arsen in 10--30 mg t taaren . Die S tandardabweiehungen liegen bei 1--5~ . Bei der hohen Spezifitat der RSntgenfluorescenz-Analyse wird diese Methode aueh den hohen Anforderungen der forensisehen Toxikologie gereeht.

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Dozent Dr. G. HAVeK Institut fiir Gerichtliche und Versicherungsmedizin der UniversitEt 7800 Freiburg i. Br., AlbertstraBe 9

Anwendung der Elektronen-Mikrosonde zur RSntgenemissionsanalyse in biologisehem Material

E. WEINRu

Applied 1%esearch Laboratories, LeMesnil St. Denis (Frankreich)

Eingegangen am 20. September 1968

Application o/the Electron Micro-Probe to the X-Ray Emission Analysis o/Biolo- gical Material. After discussion of some basic principles of the apparatus and tech- nique used the following examples of application are mentioned: determination of fluorine in teeth, determination of foreign particles in lung tissue, and analysis of dried solutions.

Die Anwendung der g 6 n t g e n s p e k t r o m e t r i e in der chemisehen Ana lyse is t schon lange bekann t . Bere i ts 1913 ver6ffent l ichte Mos~Lw~ die phy- s ikal ischen Grund lagen dieser Technik. I h r e Verwendung in der ana ly- t i schen Al l t agsprax i s is t jedoeh ers t in neues ter Zei t i iblich geworden. Das Pr inz ip is t sehr e infach: eine Subs tanzprobe , die yon einem Elek- t ronenb i inde l getroffen wird, s t r ah l t ein kompl iz ier tes R 6 n t g e n s p e k t r u m aus, das die charak te r i s t i schen Lin ien der versehiedenen Elemente , die sich im b o m b a r d i e r t e n P u n k t befinden, aufweist . Die Auswer tung dieses Spek t rums ermSgl ieht die Bes t immung der Zusammense tzung und Kon- zen t r a t ion dieser E lemente .

Aufbau des Mikroanalysators Der E lek t ronens t r ah l -Mikroana lysa to r , dessen erstes Modell yon GUI~IER u. CASTAING [1] (1951) beschr ieben wurde, ste]lt eine Anwendung dJeser Teehnik ffir sehr kleine zu ana lys ie rende Bereiche dar . Das Elekt ronenbf indel , das m a n aueh , ,Sonde" nennt , is t in einer k]as- sisehen E lek t ronenkanone en tha l ten , die einen Wolf ram-Glf ih faden ent-