Bestimmung und Optimierung verfahrenstechnischer und ... · the salinity (mainly influenced by the content of sodium chloride), the content of magnesium sulfate/ potassium chloride

Bestimmung und Optimierung verfahrenstechnischer und

metabolischer Kenngrößen bei photoautotrophen

Mikroorganismen unter Verwendung nichtlinearer

Optimierungsalgorithmen

Der Technischen Fakultät

der Friedrich-Alexander Universität

Erlangen-Nürnberg

Zur Erlangung des Grades

Dr.-Ing.

vorgelegt von

Matthias Schirmer

aus Bamberg

Als Dissertation genehmigt von

der Technischen Fakultät der Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 25.09.2015

Vorsitzende des Promotionsorgans: Prof. Dr.-Ing. habil. M. Merklein

1. Gutachter: Prof. Dr. R. Buchholz

2. Gutachter: Prof. Dr.-Ing. C. Posten

Inhalt I

Inhalt

I Zusammenfassung ............................................................................................................ V

II Abstract ........................................................................................................................... VII

1 Einleitung ............................................................................................................................ 1

2 Stand des Wissens .............................................................................................................. 3

2.1 Phototrophe Mikroorganismen .................................................................................. 3

2.2 Kultivierungssysteme ................................................................................................... 4

2.2.1 Offene Kulturführungssysteme ............................................................................ 4

2.2.2 Geschlossene Kulturführungssysteme ................................................................. 5

2.3 Stoffwechsel .................................................................................................................. 7

2.3.1 Photosynthese ......................................................................................................... 7

2.3.2 Lichtreaktion............................................................................................................ 7

2.3.3 Dunkelreaktion ........................................................................................................ 8

2.3.4 Photorespiration – oxidativer C2-Zyklus ............................................................. 9

2.3.5 Atmung ................................................................................................................... 10

2.4 Extrazelluläre Polysaccharide ................................................................................... 10

2.4.1 Struktureller Aufbau ............................................................................................. 10

2.4.2 Syntheseweg ........................................................................................................... 12

2.4.3 Merkmale und potentielle Anwendung ............................................................. 12

2.5 Mathematische Suchalgorithmen ............................................................................. 14

2.5.1 Überblick ................................................................................................................ 14

2.5.2 Beschränkte Algorithmen .................................................................................... 15

2.5.3 Unbeschränkte Algorithmen ............................................................................... 16

2.5.4 Globale Algorithmen ............................................................................................ 17

2.5.4.1 Genetische Algorithmen ................................................................................ 17

2.5.4.2 Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahren ................................................ 18

2.5.5 Auswahl eines mathematischen Algorithmus ................................................... 23

2.5.6 Auswahl der Randparameter und der Kultivierungsbedingungen ................. 24

Inhalt II

2.5.6.1 Photonenflussdichte – Licht .......................................................................... 24

2.5.6.2 CO2-Gehalt und pH-Wert .............................................................................. 26

2.5.6.3 Medienbestandteile .......................................................................................... 28

2.5.6.4 Temperatur ....................................................................................................... 30

2.5.6.5 Gasvolumenstrom ........................................................................................... 30

3 Aufgabenstellung ............................................................................................................. 32

4 Material und Methoden .................................................................................................. 33

4.1 Verwendete Mikroorganismen ................................................................................. 33

4.2 Artifizielles-Meerwasser-Medium für Porphyridium purpureum .............................. 33

4.3 Kultivierungssysteme ................................................................................................. 33

4.3.1 Stammhaltung und Vorkulturführung ............................................................... 33

4.3.2 Photobioreaktor-Screening-Module ...................................................................... 33

4.3.2.1 Photobioreaktor-Screening-Modul Aufbau .................................................... 34

4.3.2.2 Durchmischungscharakteristik ...................................................................... 36

4.3.2.3 Verweilzeitverhalten ........................................................................................ 36

4.3.3 Airlift-Schlaufenreaktor – Medusa ..................................................................... 37

4.4 Prozessmonitoring ..................................................................................................... 38

4.4.1 Zellzahl ................................................................................................................... 38

4.4.2 Optische Dichte .................................................................................................... 39

4.4.3 Biotrockenmasse ................................................................................................... 39

4.4.4 pH-Wert und Temperaturmessung .................................................................... 40

4.4.5 Sauerstoffpartialdruck .......................................................................................... 40

4.4.6 Prozessgaszusammensetzung .............................................................................. 40

4.4.7 Prozessabgaszusammensetzung .......................................................................... 40

4.4.8 Wachstumsrate ...................................................................................................... 40

4.4.9 Photonenflussdichte ............................................................................................. 41

4.5 Downstream-Prozess .................................................................................................... 41

4.5.1 Zentrifugation ....................................................................................................... 41

Inhalt III

4.5.2 Dialyse .................................................................................................................... 41

4.5.3 Zentrifugenfiltration ............................................................................................. 41

4.5.4 Bestimmung der Exopolysaccharidkonzentration ........................................... 42

4.5.5 Bestimmung des Exopolysaccharidsulfatgehaltes ............................................ 42

4.6 Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahren ........................................................... 43

4.6.1 Startparameter ....................................................................................................... 43

4.6.2 Fortführung ........................................................................................................... 44

4.7 Mathematische Beschreibung ................................................................................... 45

4.7.1 Raum-Zeit-Ausbeute ............................................................................................ 45

4.7.2 Lichtversuche ........................................................................................................ 45

4.7.3 Statistische Analyse ............................................................................................... 47

5 Ergebnisse......................................................................................................................... 49

5.1 Untersuchungen zum strömungstechnischen Verhalten ...................................... 49

5.1.1 Durchmischungsverhalten ................................................................................... 49

5.1.2 Verweilzeitverhalten ............................................................................................. 50


5.2.1 Startparameter ....................................................................................................... 52

5.2.2 Fortführung des Algorithmus ............................................................................. 57

5.2.3 Maßstabsvergrößerung ......................................................................................... 62

5.3 Untersuchungen zu metabolisch reaktionstechnischen Kenngrößen ................ 63

5.3.1 Bestimmung des Massentransferkoeffizienten ................................................. 65

5.3.2 Sauerstofftransferrate und Sauerstoffaufnahmerate ........................................ 66

5.3.3 Bruttosauerstoffproduktionsrate ........................................................................ 67

6 Fehlerdiskussion .............................................................................................................. 68

7 Diskussion ........................................................................................................................ 72

7.1 Untersuchungen zum Durchmischungs- und Verweilzeitverhalten ................... 72


7.2.1 Startparameter ....................................................................................................... 73

Inhalt IV

7.2.1.1 Standardkultivierung ....................................................................................... 73

7.2.1.2 Photonenflussdichtevariation ........................................................................ 75

7.2.1.3 Gasvolumenstromvariation ............................................................................ 76

7.2.1.4 Natriumchloridvariation ................................................................................. 76

7.2.1.5 Kaliumnitratvariation ...................................................................................... 77

7.2.1.6 Magnesiumsulfatvariation .............................................................................. 77

7.2.1.7 Untersuchungen zum Sulfatierungsgrad ...................................................... 78

7.2.2 Fortführung ........................................................................................................... 78

7.2.3 Zusammenfassung ................................................................................................ 80

7.2.4 Maßstabsvergrößerung ......................................................................................... 82

7.3 Untersuchungen zu metabolisch reaktionstechnischen Kenngrößen ................ 85

7.3.1 kl,a(O2)-Untersuchungen ....................................................................................... 85

7.3.2 Sauerstoffproduktionsrate ................................................................................... 86

8 Ausblick und Optimierungsperspektiven .................................................................... 89

9 Literatur ............................................................................................................................. 91

10 Anhang ............................................................................................................................ 100

Zusammenfassung V

I Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf zwei Schwerpunkte zur Kultivierung des photoauto-

trophen Mikroorganismus Porphyridium purpureum. Der erste Schwerpunkt liegt in der Produk-

tionsoptimierung eines ausgewählten Metaboliten. Der Zweite beschäftigt sich mit einer Metho-

denentwicklung zur in-situ Bestimmung verfahrenstechnischer und dem Metabolismus beeinflus-

sender Kenngrößen.

Bei dem ausgewählten Metaboliten handelt es sich um Exopolysaccharide, für die antivirale Wirk-

samkeiten in Abhängigkeit ihres Sulfatierungsgrades bekannt sind. Zur Quantifizierung der Exo-

polysaccharide und deren Sulfatierungsgrad sind photometrische Methoden und ein geeignetes

Aufreinigungsverfahren entwickelt worden.

Die Beurteilung der spezifischen Produktionsleistung von Porphyridium purpureum erfolgt anhand

der Raum-Zeit-Ausbeute an Exopolysacchariden. Zur Beeinflussung der spezifischen Produk-

tionsleistung wird ein nichtlineares Optimierungsverfahren, das Nelder-Mead-Downhill Simplex-

Verfahren, angewendet. Dafür werden fünf Randparameter – die Photonenflussdichte, die Salini-

tät (maßgeblich durch den Gehalt an Natriumchlorid bestimmt), der Gehalt an Magnesium-

sulfat/Kaliumnitrat und der Gasvolumenstrom – ausgewählt. In mehreren durchgeführten Para-

metervariationen wird im Vergleich zu Standardbedingungen ein Anstieg der Raum-Zeit-

Ausbeute von 0,0658 bis zu 0,1353 g��-1�d-1 erreicht. Zeitgleich ist eine Erhöhung des Sulfatie-

rungsgrades von 5,14 auf bis zu 8,76 Gew.-% und der des zellzahlspezifischen Exopolysaccharid-

gehaltes von 9,70 auf bis zu 26,62 gEPS�(1012 Zellen)-1 festgestellt worden.

Im zweiten Schwerpunkt der Arbeit werden grundsätzliche Methoden zur in-situ Bestimmung

reaktionstechnischer und dem Metabolismus beeinflussender Kenngrößen in nicht-gerührten

Blasensäulen für photoautotrophe Mikroorganismen etabliert. Die Kenngrößen sind basierend

auf folgender Beobachtung ausgewählt worden: während des Kultivierungsprozesses ist ein An-

stieg der Viskosität aufgrund vermehrter Exopolysaccharidproduktion festzustellen. Die Ände-

rung der Viskosität beeinflusst den Massentransferkoeffizienten (z.B. von Sauerstoff) des Reak-

torsystems. Bei zu hohen Sauerstoffkonzentrationen ist von einer Inhibierung des Wachstums

von Porphyridium purpureum, die sich durch eine Änderung der Bruttosauerstoffproduktionsrate

äußert, auszugehen. Demzufolge wird der Massentransferkoeffizient als reaktions-/transport-

technische Kenngröße und die Bruttosauerstoffproduktionsrate als metabolische Kenngröße

gewählt. Basierend auf der dynamischen Methode mit Quelle/Senke wird ein Verfahren zur

gleichzeitigen Bestimmung des Massentransferkoeffizienten und der Bruttosauerstoffproduk-

tionsrate (inklusive der Sauerstoffaufnahmerate und der Nettosauerstoffproduktionsrate) entwi-

Zusammenfassung VI

ckelt. In einer ersten praktischen Anwendung ist während einer durchgeführten Kultivierung ein

Absinken des Massentransferkoeffizienten von 35 auf bis zu 5 h-1 zu beobachten. Das Absinken

scheint umgekehrt und nichtlinear von der Erhöhung des Exopolysaccharidgehaltes abzuhängen.

Basierend auf den Untersuchungen zum Massentransferkoeffizienten wird eine maximale Brutto-

und Nettosauerstoffproduktionsrate zum Ende der linearen Phase am vierten Kultivierungstag zu

71,70/61,89 mmol�l-1�h-1 gemessen. Die Differenz stellt den Sauerstoffbedarf von Porphyridium

purpureum dar. Bezogen auf die Biotrockenmasse wird im Bereich zwischen der Übergangs-und

der stationären Phase ein Bedarf von 0,45 mmol��-1�h-1 festgestellt. Dieser Wert stimmt mit den

Untersuchung von Kliphuis et al. (0,3 mmol��-1�h-1) vor dem Hintergrund eines biologischen Sys-

tems nahezu überein und könnte dem Sauerstoffbedarf des Erhaltungsstoffwechsel zugeordnet

werden [Kliphuis et al. 2011].

Abstract VII

II Abstract

In the present work two main topics for the cultivation of the photoautotrophic microorganism

Porphyridium purpureum are investigated. The first one deals with the optimization of the produc-

tion level of one selected metabolite. The second topic focuses on developing an in-situ method

for the determination of process and metabolic characteristic values.

The selected metabolite is a sulfated anionic extracellular polysaccharide, which is effective

against certain viruses in dependency of the degree of sulfation. For the quantification of the

exopolysaccharide and its sulfation level photometric methods and a specified downstream pro-

cess were developed.

The production level of Porphyridium purpureum is evaluated by the so-called space-time yield of

the exopolysaccharide. To optimize the production level, a global heuristic optimization method

– the Nelder-Mead-Downhill Simplex-Method – was used. Five parameters which should have a

strong influence on the production of exopolysaccharide were selected – the photon flux density,

the salinity (mainly influenced by the content of sodium chloride), the content of magnesium

sulfate/ potassium chloride and the gas volume flow rate. By applying the method in several runs,

an increase of the space-time yield from 0.0658 up to 0.1355 g��-1�d-1 in comparison to standard

culturing conditions were determined. At the same time, an increase of the sulfation level (from

5.14 up to 8.76 weight percent) and of the cell specific exopolysaccharide content (from 9.70 up

to 26.62 gEPS�(1012 Cells)-1) were detected.

In the second topic of this thesis, basic methods for the in-situ determination of process and me-

tabolic characteristic values for photoautotrophic microorganisms in non-stirred bubble columns

were established. The characteristic values were chosen due to the following observations. Due to

the production of exopolysaccharide during the cultivation process an increase of the viscosity of

the culture suspension is noticed. The change of the viscosity affects the mass transfer coefficient

(e.g. of oxygen) in the reactor system. In consequence, oxygen accumulation could happen, which

depresses the growth rate and indirectly the gross oxygen production rate of the microorganisms.

For this reason, the mass transfer coefficient and the gross oxygen production rate were chosen

as characteristic process and metabolic values. On the basis of the dynamic method with

source/sink a procedure for a simultaneous determination of the mass transfer coefficient and

the gross oxygen production rate (inclusively of the oxygen uptake rate (OUR) and the gross ox-

ygen production rate (OPRGross)) is established. In an initial implementation, decreases of the

mass transfer coefficient from 35 down to 5 h-1 were detected during the cultivation process of

Abstract VIII

Porphyridium purpureum. The reduction might be inversely and non-linearly dependent on the in-

crease of the exopolysaccharide content.

Based on the results of the mass transfer coefficient a maximum gross and net oxygen produc-

tion rate (OPRNet) is measured to the end of the linear growth phase (on day four;

OPRGross: 71.70 mmol��-1�h-1 , OPRNet: 61.89 mmol��-1�h-1). The difference is related to the oxygen

uptake rate/oxygen demand of the cells. With regard to the specific (bio dry weight) oxygen de-

mand an almost stable value (0.45 mmol��-1�h-1) is detectable between the decline- and stationary

phase. This value is in good agreement with the studies of Kliphuis et al. (0.3 mmol��-1�h-1) and

might satisfy the oxygen demands of the cells for the maintenance metabolism [Kliphuis et al.

2011].

Einleitung 1

1 Einleitung

Algen sind eukaryotische Organismen, die Photosynthese betreiben. Eine grobe Einteilung der

von bis zu 106 geschätzten Spezies [Norton et al. 1996] erfolgt in Makro- (vielzellige Algen, wie

zum Beispiel der Seetang) und in Mikroalgen (einzellige Algen, wie zum Beispiel das Phytoplank-

ton). Algen werden im Allgemeinen mit umkippenden Gewässern, Geruchsbelästigungen und für

den Menschen gesundheitsschädlichen Folgen assoziiert. Allerdings ist dieses übermäßige Algen-

wachstum meist nur in stark vom Menschen beeinflussten Habitaten zu beobachten. Algen spie-

len ökologisch eine bedeutende Rolle. In der erdgeschichtlichen Entwicklung waren vor allem

Cyanobakterien und auch Mikroalgen an der Bildung einer sauerstoffreichen Atmosphäre vor ca.

2,5 Milliarden Jahren beteiligt und bildeten somit die Basis für nahezu jede Lebensform auf der

Erde. Eine weitere bemerkenswerte Eigenschaft ist die Fähigkeit pro Kilogramm gebildeter Bio-

masse bis zu 1,8 Kilogramm Kohlenstoffdioxid zu fixieren [Posten & Rosello-Sastre 2011]. Wäh-

rend der Photosynthese produzieren Mikroalgen nicht nur Sauerstoff, sondern bilden auch koh-

lenhydrat- und lipidreiche Verbindungen (bis zu 70 % Lipidgehalt bezogen auf die Biotrocken-

masse). Neben dem Hintergrund einer CO2-neutralen Biodieselgewinnung wächst auch bei der

Herstellung weiterer Produkte das Interesse Algenbiomasse zu verwerten. Besonders deutlich

zeigt sich das steigende Interesse in der Publikationsstatistik der letzten Jahre (siehe Abbildung

10.1 im Anhang; Suchdatenbank Scopus). Im Zeitraum von 2006 bis 2013 ist ein nahezu expo-

nentieller Anstieg (μ = 0,12 Jahr-1) der publizierten Artikel mit dem Begriff microalgae zu verzeich-

nen. In diesem Kontext beschränkt sich das Interesse nicht nur auf die Verwertung der Biomasse

als Rohstoff zur Biodieselherstellung. Mikroalgen synthetisieren als sogenannte Primärproduzen-

ten weitere wirtschaftlich sehr interessante Produkte. Die Produktpalette reicht von Nahrungs-

und Futtermitteln, ungesättigten Fettsäuren, Vitaminen, Pigmenten, Antioxidantien, Kosmetika

bis hin zu bioaktiven Substanzen mit potentiell pharmazeutischer Anwendung. Obwohl Mikroal-

gen ein breites Produktspektrum bieten, ist bis dato die großindustrielle Nutzung mit einer An-

zahl von ca. 16 Spezies als gering anzusehen [Geier & Buchholz 2013].

Von besonderem Interesse ist hier zum Beispiel ein Wertstoff der Mikroalge Porphyridium purpu-

reum. Diese produziert sogenannte Exopolysaccharide, die antivirale Aktivitäten gegen den Her-

pes Simplex 1-, den Varicella Zoster, den Humanen Herpes 6A und den Humanen Cytomegalie-

Virus aufzeigen [Huleihel et al. 2001; König et al. 2006; Witvrouw & Clercq 1997; Talyshinsky et

al. 2002].

Einleitung 2

Für eine wirtschaftlich sinnvolle Nutzung werden hohe Biomasseerträge/Wertstoffprodukte,

reproduzierbare Ergebnisse und Screening-Plattformen benötigt. Besonders die beabsichtigte Bil-

dung von pharmakologischen Wirkstoffen erfordert GMP (good manufacturing practice) – konforme

Reaktionsbedingungen. Diese Anforderungen können nur in geschlossenen Photobioreaktoren

erfüllt werden. Zu diesem Zweck entwickelte Walter monoseptisch kultivierbare Photobioreakto-

ren, die sowohl zum Screening als auch zur Produktion unter monoseptischen Bedingungen ge-

nutzt werden können [Walter 1999]. Geschlossene Photobioreaktoren bieten die Möglichkeit

einer nahezu vollständigen Prozesskontrolle. Zum aktuellen Zeitpunkt finden Photobioreaktoren

ihre Anwendung hauptsächlich in der Produktion von Hochwertprodukten der Pharma-, Kosme-

tik- und Lebensmittelindustrie [Buchholz 2009]. Um weitere ökonomische Anwendungen zu

realisieren bedarf es daher zusätzlicher Optimierung. Ein Ansatzpunkt muss die Erhöhung der

Biomasse beziehungsweise der Wertstoffprodukte (durch gezielt einzustellende Reaktionsbedin-

gungen) bei gleichzeitiger Senkung der Kosten (z.B. der Reaktionszeit) sein. In diesem Kontext

bieten sich vor allem mathematische Optimierungsverfahren an. Diese werden in der Finanzma-

thematik zur Senkung von Kostenfunktionen beziehungsweise auch zur Maximierung von Ziel-

größen in biologischen Systemen verwendet.

Stand des Wissens 3

2 Stand des Wissens

2.1 Phototrophe Mikroorganismen

Als phototrophe Mikroorganismen werden alle pro- und eukaryotischen Mikroorgansimen defi-

niert, die Licht als Energiequelle nutzen. Zur Nutzung von Licht als Energiequelle sind sie auf

bestimmte Pigmente angewiesen, die das eintreffende Licht in Form von Quanten absorbieren.

Im Wesentlichen kann es sich bei den Pigmenten (auch akzessorische) von eukaryotischen Mik-

roorganismen um die Gruppe der Chlorophylle, Carotinoide und Phycobiline handeln. Porphyri-

dium purpureum stellt als sogenannter Primärproduzent die Basis der Nahrungskette dar. Er stellt

aus anorganischen Substraten unter Nutzung der Photosynthese organische und energiereiche

Produkte her. Unter den photoautotrophen Mikroorganismen, zumeist Algen, sind sie mit einer

geschätzten Anzahl von bis 106 Spezies mit der wichtigste Vertreter der Primärproduzenten

[Norton et al. 1996]. Die Einteilung in Reich, Abteilung, Unterstamm, Klasse, etc. erfolgt in der

Algenkunde nach dem Standardwerk von Christiaan van den Hoek [Hoek et al. 1993] und Gab-

rielson und Garbay [Gabrielson et al. 1985]. Diese wird zur Einordnung der in der hier vorliegen-

den Arbeit untersuchten Mikroalge Porphyridium purpureum verwendet.

Die einzellige Rotalge Porphyridium purpureum, früher auch Porphyridium cruentum genannt, wird von

Nägeli das erste Mal 1849 beschrieben [Nägeli 1849].

Porphyridium purpureum

Porphyridium purpureum ist in die Abteilung der Rhodophyta, in die Klasse der Bangiophycea, in die

Ordnung der Porphyridiales und in die Familie der Porphyridiaceae einzuordnen [Gabrielson et

al. 1985]. Aufgrund der vorkommenden Pigmente wird Porphyridium in vier Spezies unterteilt:

griseum (helles grau), sordidum (olivgrün), aerugineum (blaugrün) und purpureum (rot) (siehe Abbil-

dung 2.1, links) [Ott 1987].

Porphyridium purpureum enthält neben Chlorophyll a zusätzlich akzessorische Pigmente, wie zum

Beispiel Phycoerythrin. Diese können zum Teil den grünen Farbanteil von Chlorophyll a (äußerer

Zellbereich in Abbildung 2.1, links) überdecken und sind im Gegensatz zu Chlorophyll a wasser-

löslich.

Porphyridium purpureum wird als unbegeißelte und kugelförmige Zelle mit Durchmessern im Be-

reich von bis zu 10 μm beschrieben und vermehrt sich asexuell durch Mitose. Im natürlichen

Lebensraum kommt die Alge zumeist in größerer Anzahl, eingebettet in einer gelartigen Struktur

aus Exopolysacchariden, vor (siehe Abbildung 2.1, rechts).

Stand des Wissens 4

Abbildung 2.1: Exemplarische Darstellung von Porphyridium purpureum Zellen Links: 1000-fache Vergrößerung; Rechts: Alcian-Blue Färbung; Wiedergegeben nach [Kusche 2011] Die natürlichen Lebensräume von Porphyridium purpureum sind vor allem saline aquatische (Mee-

reswasser, Brackwasser und Süßwasser) und terrestrische Habitate. Dies ist ein Grund für die

große Diversität an Metaboliten [Jones et al. 1963]. Das Produktspektrum reicht von mehrfach

ungesättigten Fettsäuren (Eicosapentaen- und Arachidonsäure), Hochwertprodukten wie zum

Beispiel dem Pigment Phycoerythrin bis hin zu bioaktiven Metaboliten. Sowohl sulfatierte Meta-

bolite als auch das Co-Enzym Q10 von Porphyridium purpureum weisen antiinflammatorische, antivi-

rale oder antioxidative Eigenschaften [König 2006; Naumann et al. 2007; Klein et al. 2012] auf

und sind somit potentielle Metabolite für pharmakologische Anwendungen.

2.2 Kultivierungssysteme

Kultivierungssysteme für Mikroalgen werden nach ihrer technischen Verfahrensweise, ihrer

fluiddynamischen Eigenschaften und auch nach der Interaktion zwischen Kultivierungssys-

tem/Atmosphäre eingeteilt. Unabhängig von der Einteilung der Reaktorsysteme müssen diese die

Versorgung mit Licht, einer geeigneten Kohlenstoffquelle und Nährmedien sicherstellen.

Im Folgenden wird ein kurzer Überblick der vorhandenen Reaktorsysteme nach der Kategorie

offen und geschlossen wiedergegeben.

2.2.1 Offene Kulturführungssysteme

Offene Kultivierungssysteme zeichnen sich durch die maßgebliche Eigenschaft aus, dass ein di-

rekter Kontakt zwischen dem Kultivierungssystem und der Umwelt besteht. Diese werden gene-

rell in open-ponds und raceway-ponds eingeteilt.

Open-ponds (offene Teichanlagen) stellen hierbei die simpelsten Reaktorsysteme dar und gehen auf

die Entwicklung von Reaktorsystemen aus der Abwasseraufbereitung zurück. Der Gasaustausch

12,42 μm

12,8

8 μm

Stand des Wissens 5

zwischen der fluiden und der gasförmigen Phase ist als gering anzusehen. Eine Durchmischung

der Reaktorsysteme erfolgt einerseits durch äußere Einflüsse, wie z.B. Wind und Wellen, oder

durch systeminterne Temperaturgradienten der fluiden Phase. Es erfolgt selten eine Regelung der

Temperatur oder des pH-Wertes. Die genannten Eigenschaften schließen die Möglichkeit einer

monoseptischen Kultivierung aus [Borowitzka 1999]. Das Kultivierungssystem wird unzurei-

chend mit Kohlenstoffdioxid (CO2) versorgt und Gradienten bezüglich der Temperatur, des pH-

Wertes und der Nährmedien induzieren stark unterschiedliche Wachstumsbedingungen. Auf-

grund der fehlend aktiven Durchmischung sind zudem Sedimentationsproblematiken wahr-

scheinlich. Einen weiteren limitierenden Effekt stellt die notwendige Versorgung mit Licht dar

(siehe Kapitel 2.5.6.1). Die exponentielle Abnahme des Lichtes beschränkt die Tiefe der Reaktor-

systeme und führt zu Grundflächen von 2,5 bis zu 10 km² [Borowitzka 1999; Benemann et al.

1987].

Eine ingenieurstechnische Weiterentwicklung der open-ponds stellen die sogenannten raceway-ponds

dar. In einem raceway-pond wird die Vermischung und somit ein besserer Gasaustausch durch zu-

sätzlich installierte Schaufelräder, Pumpen und Strömungsbrecher erzeugt. Desweiteren kann

durch die Benutzung verschiedener Begasungsorgane eine CO2-Limitierung minimiert werden.

Eine zusätzliche Temperierung beziehungsweise eine definierte pH-Wertregelung ist nicht direkt

gegeben. Trotz der aktiven Durchmischung sind raceway-ponds auf Tiefen von ca. 30 cm be-

schränkt und produzieren im günstigsten Fall Biomassen von bis zu 1,6 g��-1 [Brennan & Owende

2010]. Auch bei diesen Systemen ist die Möglichkeit einer monoseptischen Kultivierung nicht

gegeben und es werden daher zumeist extremophile Mikroalgen bei hohen pH-Werten und Sali-

nitäten (Spirulina und Dunaliella) kultiviert.

2.2.2 Geschlossene Kulturführungssysteme

Per Definition sind geschlossene Photobioreaktoren Kultivierungssysteme, bei denen der zu kul-

tivierende Mikroorganismus keinen direkten Kontakt mit der umgebenden Atmosphäre hat. Je

nach Art der Anwendung – Gewinnung von Hochwertprodukten, hohe Ausbeuten an Biomassen

oder zu Forschungszwecken – sind verschiedene Reaktorausführungen konstruiert worden. Pho-

tobioreaktoren weisen die Möglichkeit einer nahezu vollständigen Mess- und Regelungstechnik

bezüglich der Temperatur, des pH-Wertes, des Gasein- und -austrages, der Durchmischung, der

Nährmedienversorgung und eingeschränkt des Lichteintrages auf. Ein wesentlicher Vorteil ist

hierbei die Möglichkeit einer monoseptischen Kultivierung. Im Gegensatz dazu steigen mit den

vorhandenen Möglichkeiten die Konstruktions- und Betriebskosten.

Stand des Wissens 6

Photobioreaktoren sind im Wesentlichen eingeteilt nach: Rohr-, Platten-, Säulen- und Rührkes-

selreaktoren. Im Folgenden werden erstere drei dieser Reaktortypen, die für die Kultivierung von

photoautotrophen Mikroorganismen maßgeblich relevant sind, vorgestellt.

In Rohrreaktoren wird die Kultur durch durchsichtige Rohre gepumpt. Diese können horizontal,

vertikal, schräg geneigt oder auch helikal angeordnet sein [Molina et al. 2001; Perner-Nochta et al.

2007; Vunjak-Novakovic et al. 2005; Acién Fernández et al. 2003]. Die Durchmischung kann ei-

nerseits durch Pumpen oder durch ein Airlift-Prinzip, das zusätzlich den Austausch von Kohlen-

stoffdioxid und Sauerstoff zwischen der liquiden und gasförmigen Phase gewährleistet, erzeugt

werden [Acién Fernández et al. 2003; Molina et al. 2001]. Obwohl Rohrreaktoren für den kom-

merziellen Einsatz oft als die sinnvollsten erachtet werden [Chisti 2006] (25 m³ von Mera

Pharmaceuticals in Hawaii oder auch 700 m³ Anlage in Klötze, Deutschland [Pulz 2001]), sind sie

für großtechnische Massenkultivierungen nur eingeschränkt nutzbar. Die Länge der Rohre limi-

tiert deren Maßstabsvergrößerung. Innerhalb der einzelnen Rohrsegmente ist von einer verstärk-

ten O2-Akkumulation (siehe 2.3.4 Photorespiration – oxidativer C2-Zyklus), einer CO2-Limi-

tierung und einem pH-Wertgradienten auszugehen.

Plattenreaktoren bestehen aus zwei parallel angeordneten und seitlich abgedichteten, durchsichti-

gen Platten. Die Beleuchtung kann sowohl von einer als auch von zwei Seiten erfolgen. Die Ver-

sorgung mit Kohlenstoffdioxid wird durch eine aktive Begasung im Bodenbereich, nach dem

Airlift-Prinzip (Flat-Panel-Airlift Reaktor, FPA), erreicht. Die Blasen steigen innerhalb des Reaktors

auf und durch statisch installierte Umlenkbleche wird eine zirkulierende Strömung der Kultur

induziert. In Abhängigkeit der geführten Strömung und der damit verbundenen Umlaufzeit pas-

siert die Kultur Bereiche von hellen und dunklen Zonen. Dies ermöglicht eine bewusste Ausnut-

zung des in der Literatur diskutierten Flashing-Light-Effects [Posten & Rosello-Sastre 2011], siehe

Kapitel 2.5.6.5.

Säulenreaktoren sind zylindrische Reaktoren, die sowohl nach dem Prinzip des Rührkessels, je-

doch häufiger nach dem Blasensäulen- bzw. Airliftprinzip konstruiert sind [Eriksen et al. 2007;

Lee et al. 2006; Krichnavaruk et al. 2007]. Die Säulen sind vertikal angeordnet, wobei die Bega-

sung z.B. durch im Boden installierte Injektionsdüsen erfolgt. Für die Lichtversorgung kann so-

wohl eine externe als auch interne Beleuchtungsstrategie verfolgt werden [Krichnavaruk et al.

2007]. Blasensäulen zeichnen sich besonders durch ihre effektive Mischungscharakteristik, hohe

Gastransferraten und sehr gut kontrollierbare Wachstumsbedingungen aus. Die am Lehrstuhl für

Bioverfahrenstechnik der Universität Erlangen-Nürnberg entwickelten Blasensäulenreaktoren

vom Typ Photobioreaktor-Screening-Modul (PSM) werden bis dato erfolgreich zum Screening von

Hochwertprodukten aus phototrophen Mikroorganismen verwendet [Walter et al. 2003; Walter et

al. 2007; König et al. 2006; Klein et al. 2012; Sperber, von 2013]. Sowohl die Möglichkeit einer

Stand des Wissens 7

definierten monoseptischen Kulturführung, als auch der Scale-up der PSM bis hin zum Techni-

kumsmaßstab von ca. 120 Litern, bietet die Möglichkeit Prozess- und Wachstumsparameter de-

tailliert zu untersuchen.

2.3 Stoffwechsel

2.3.1 Photosynthese

Die Photosynthese in photoautotrophen Mikroorganismen kann als eine grundsätzlich notwendi-

ge Redoxreaktion zur Erhaltung sämtlicher Stoffwechselwege gesehen werden. Hierbei werden

während der Absorption von Lichtquanten und der anorganischen CO2-Fixierung unter Wasser-

verbrauch energiereiche organische Produkte und O2 gebildet. Die Nettoredoxreaktion wird mit

Gleichung (2.1) beschrieben.

6 CO2+ 12 H2O Lichtenergie�� C6H12O6 +6H2O+6O2 (2.1) Die Gesamtreaktion wird in zwei Einzelreaktionen, die Licht- und Dunkelreaktion, unterteilt. In

der Lichtreaktion werden Lichtquanten absorbiert und energiereiche chemische Verbindungen,

wie Adenosintriphosphat (ATP) und Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH+H+) und

O2, unter Wasserverbrauch gebildet. Während der sogenannten lichtunabhängigen Dunkelreakti-

on wird anorganischer Kohlenstoff fixiert und zum Aufbau energiereicher Kohlenhydratverbin-

dungen verwendet. Die dazu notwendige Energie wird aus dem in der Lichtreaktion gebildeten

ATP und NADPH+H+ zur Verfügung gestellt.

2.3.2 Lichtreaktion

Wie beschrieben, dient die Lichtreaktion zur Synthese von ATP, NADPH+H+ und O2. Die Brut-

toreaktion wird wie folgt dargestellt:

12 H2O+18 ADP+18 Pi+12NAP+ Lichtenergie�� 6O2+12 NADPH+H++18 ATP (2.2) In eukaryotischen Zellen werden zur Absorption von Lichtquanten zwei Photosysteme (PS), das

PSI und das PSII, genutzt. Das PSII, das dem PSI vorgeschaltet ist, wird durch Absorption von

Lichtquanten bei einer Wellenlänge von 680 nm angeregt. Im angeregten Zustand, P680*, werden

energiereiche Elektronen auf einen Elektronenakzeptor übertragen und in die Elektronentrans-

portkette bis hin zum PSI weitergeleitet. Relaxiert das PS680* zu PS680, ist aufgrund der Elektro-

nenweitergabe ein Ladungsdefizit vorhanden. Dieses wird durch die Hydrolyse von einem Was-

sermolekül in zwei Elektronen und ein halbes Sauerstoffmolekül ausgeglichen. Die zeitgleich

Stand des Wissens 8

entstehenden vier Protonen führen u. a. zum Aufbau eines Ladungsgradienten zwischen dem

Thylakoidlumen und dem Stroma der Membran.

Wird im Anschluss das PSI bei einer Wellenlänge von 700 nm angeregt, gibt das PS700* ein

energiereiches Elektron an einen Akzeptor ab und wird in die Elektronentransportkette einge-

führt. Am Ende der Elektronentransportkette wird das Elektron zur NADPH+H+-Synthese ge-

nutzt. Relaxiert das PS700* in den Grundzustand zu PS700 zurück, ist es positiv geladen. Der

notwendige Ladungsausgleich kann aus der Elektronenübertragung vom PSII erfolgen.

Neben der Synthese von NADPH+H+ wird während der Lichtreaktion energiereiches ATP ge-

bildet und wird im Wesentlichen als nicht-zyklische Photophosphorylierung bezeichnet. ATP

wird aus Adenosindiphosphat (ADP) und einem Phosphatmolekül durch die ATP-Synthase ge-

bildet. Der unter anderem durch die Hydrolyse von Wasser entstandene Protonengradient zwi-

schen dem Lumen und dem Stroma wird zur ATP-Synthese genutzt. Die Protonen passieren

beim Transport vom Lumen in das Stroma die Thylakoidmembran durch die ATP-Synthase.

Während des Transportprozesses wird die ATP-Synthase mit ausreichend Energie zur ATP-

Synthese versorgt.

Im Gegensatz zur nichtzyklischen Photophosphorylierung wird in der zyklischen kein

NADPH+H+ gebildet. Das Elektron, das vom PS700* in die Elektronentransportkette einge-

führt wird, findet keine Verwendung zur NADPH+H+-Synthese. Das Elektron gelangt über ver-

schiedene Transportmechanismen zurück zum positiv-geladenen relaxierten PS700 und dient

dort zum Ladungsausgleich.

2.3.3 Dunkelreaktion

In der lichtunabhängigen Dunkelreaktion, dem Calvin-Zyklus, werden Kohlenhydrate durch

Kohlenstoffdioxidfixierung synthetisiert. Die dazu notwendige Energie wird aus den in der Licht-

reaktion energiereichen gebildeten Verbindungen wie ATP und NADPH+H+ zur Verfügung

gestellt und kann wie folgt bilanziert werden:

6CO2+12NADPH+12 H++18ATP+12H2�� C6H12O6+12NADP++18ADP+18 Pi (2.3) Der Calvin-Zyklus untergliedert sich in drei Phasen. In der zuerst stattfinden Carboxy-

lierungsphase wird CO2 durch das Enzym Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase

(RuBisCo, [Portis, Jr. & Parry 2007] an Ribulose-1,5-bisphosphat (RuBP; C5-Körper) fixiert. Der

entstandene C6-Körper ist sehr instabil und wird unter Wasserverbrauch in zwei

3-Phosphoglycerat-Einheiten (PGS) gespalten. Daraufhin erfolgt die reduzierende Phase, die

nach mehreren katalytischen Reaktionen in die Umwandlung von 3-Phosphoglycerat zu Glycerin-

Stand des Wissens 9

aldehyd-3-Phosphat (GAP) mündet. Die katalytischen Umwandlungsschritte sind endotherm und

beziehen die notwendige Energie aus der Oxidation von ATP und NADPH+H+. Zum Abschluss

des Calvin-Zyklus findet die regenerierende Phase statt. In dieser wird Glycerinaldehyd-

3-Phosphat in mehreren katalytischen Reaktionen alleinig unter ATP-Oxidation zu RuBP regene-

riert. Im Anschluss kann der Zyklus erneut starten. Die Oxidationsprodukte von ATP und

NADPH+H+ (ADP und NADP+) werden der Lichtreaktion zur Verfügung gestellt. Das in der

reduzierenden Phase produzierte Glycerinaldehyd-3-Phosphat wird pro Zyklus zu 1/6 aus dem

Calvin-Zyklus ausgeschleust und zur Synthese von Glucose verwendet.

2.3.4 Photorespiration – oxidativer C2-Zyklus

Die Photorespiration ist ein lichtabhängiger Stoffwechselweg zu Beginn des Calvin-Zyklus. In

diesem ist das Enzym RuBisCo beteiligt und arbeitet nicht nur als Carboxylase, sondern auch

vermehrt als Oxygenase. Anstatt zwei Moleküle 3-Phosphoglycerat zu katalysieren, reagiert Ru-

BisCo zusätzlich mit O2. Es entstehen ein Molekül 3-Phosphoglycerat und ein für den Mikroor-

ganismus toxischer C2-Körper (2-Phosphoglycolat) [Portis, Jr. & Parry 2007; Andrews et al. 1973].

Dieses wird über eine Reihe katalytischer Reaktionen zu 3-Phosphoglycerat unter CO2-Bildung

und O2-, ATP- und NADPH+H+-Verbrauch umgewandelt und kann somit dem Calvin-Zyklus

wieder zugeführt werden. Der Reaktionsmechanismus wird infolgedessen auch als Lichtatmung

bezeichnet [Bresinsky & Strasburger 2008]. Wie bereits beschrieben, kann das Enzym RuBisCo

sowohl als Carboxylase, als auch als Oxygenase fungieren und soll vom CO2 zu O2-Verhältnis

abhängig sein [Masojídek et al. 2007]. Laut Literatur ist die Michaelis-Menten-Konstante für CO2

bis zu 38-mal geringer im Vergleich zu O2. Dennoch erfolgt in Abhängigkeit des CO2 zu O2-

Verhältnisses eine Konkurrenzreaktion [Nelson et al. 2009; Reumann & Weber 2006]. Es kann

davon ausgegangen werden, dass ca. 25-50 % der umgesetzten Moleküle im Calvin-Zyklus dem

oxidativen C2-Zyklus folgen. Die Photorespiration ist energetisch gesehen ein sehr aufwendiger

Prozess und senkt wahrscheinlich die CO2-Fixierungsrate, bezogen auf einen Maximalwert von

100 %, auf bis zu 70 % [Wingler et al. 2000; Lüttge et al. 2005; Osmond & Grace 1995].

Der Sinn und Nutzen der Photorespiration wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Eine inte-

ressante These ist der einer Schutzfunktion vor Temperaturextrema und vor zu hohen Strah-

lungsintensitäten [Wingler et al. 2000; Bowsher et al. 2008].

Stand des Wissens 10

2.3.5 Atmung

Die Atmung dient – wie die Photosynthese – als ein wesentlicher Stoffwechselweg zur Energie-

versorgung der Zelle. Der hier beschriebene Stoffwechselweg wird ausschließlich während Dun-

kelperioden in Anwesenheit von Sauerstoff eingeleitet und kann mit folgender Reaktionsglei-

chung dargestellt werden.

C6H12O6+6O2 +32 ADP+32 Pi+ 6 H2O � 6 CO2 +32ATP+12H2O (2.4) Die wesentlichen Reaktionsschritte der Atmung werden nur im Allgemeinen wiedergegeben, da

in der vorliegenden Arbeit die Nettoreaktionsgleichung von Bedeutung ist.

Im ersten Schritt der Atmung, der Glykolyse, findet die Oxidation von Glucose zu zwei C3-

Molekülen (Pyruvat) statt. Die freiwerdende Energie wird zur Synthese von ATP und

NADPH+H+ genutzt. Im Anschluss erfolgt die vollständige Umsetzung des entstandenen Pyru-

vats zu CO2 im Citratzyklus bei gleichzeitiger NADPH+H+-Bildung. Der abschließende Schritt

stellt die sogenannte Elektronentransportkette dar. In diesem werden die Elektronen vom gebil-

deten NADPH+H+ auf Sauerstoff übertragen. Infolgedessen entsteht ein Protonengradient den

die Atmung zur ATP-Synthese nutzt. Der in der Atmungskette restliche verbleibende Sauerstoff

wird währenddessen zu Wasser oxidiert.

2.4 Extrazelluläre Polysaccharide

Die Zellwand von Porphyridium purpureum ist aus einem Xylosepolymer als Grundbaustein aufge-

baut. Das Biopolymer verleiht der Zelle Stabilität und ist mit einer Schicht von sulfatiert hetero-

genen Polysacchariden umgeben. Während der exponentiellen Phase ist die Schichtdicke gering

und vergrößert sich in der stationären Phase [Ramus 1972]. Die an der Zellwand gebundenen

Polysaccharide können während des Wachstums ins Medium sekretiert werden und erhöhen da-

durch die Viskosität. Alle drei Formen der produzierten Polysaccharide, intrazelluläre (IPS), zell-

wandgebundene und extrazelluläre (ca. 30 % der zellwandgebundenen) sind chemisch vollkom-

men identisch [Arad & Levy-Ontman 2010; Ramus 1972; Arad et al. 1985].

2.4.1 Struktureller Aufbau

Polysaccharide werden je nach Monomerzusammensetzung in homogene und heterogene unter-

teilt. Chemisch gesehen handelt es sich um anionische Polysaccharide, die rheologisch in die

Gruppe der nicht-newtonschen, pseudoplastischen und strukturviskosen Fluide zuzuordnen sind.

Ein zum Beispiel durch Ionenaustauschchromatographie aufgereinigtes Polysaccharid zeigt fol-

gende Monosaccharidzusammensetzung (Tabelle 2.1).


Tabelle 2.1: Monosaccharidzusammensetzung der Exopolysaccharide aus Porphyridium purpureum, bezogen auf den Gesamtkohlenhydratgehalt

Wiedergegeben und abgeändert nach [König 2006; Kusche 2011]

Monosaccharid Kohlenhydratgehalt [Gew.-%] Min.- und maximaler Wert [Gew.-%] Galaktose 37,3 29,8-41,6 Xylose 33,9 28,9-33,9 Glukose 18,3 14,6-28,2 Glukuronsäure 10,1 7,0-12,1 Mannose 0,4 0-2,4 Nach König, besteht die Leitstruktur zu 55,6 % aus Hexosen und 33,9 % aus Pentosen [König

2006]. Der anionische Charakter ist durch kovalent gebundene Carboxylgruppen der Glukuron-

säure (-COO-) und durch Sulfatgruppen (-OSO3-) an die Leitstruktur der Polysaccharide zu erklä-

ren [Geresh et al. 2002; Heaney-Kieras & Chapman 1976]. Laut Literatur wird ein ähnliches Ver-

halten für den Sulfatierungsgrad, mit einer Schwankungsbreite von 1-10 %, beschrieben [Geresh

et al. 1992; Geresh et al. 2002; Geresh & Arad 1991; Percival & Foyle 1979]. Dieser wird von Kö-

nig unter Anwendung von Elementaranalysetechniken zu 8,6 % bestätigt [König 2006]. Zusätz-

lich ist ein nicht kovalent gebundenes 66 kDa großes Protein identifiziert worden, das in engem

Zusammenhang mit den Exopolysacchariden vorkommt [Shrestha et al. 2004; Heaney-Kieras et

al. 1977]. Untersuchungen zeigen einerseits, dass dieses Protein ein Erkennungsmerkmal für den

Dinoflageaten Crypthedecodinium cohnii ist [Ucko et al. 1989; Ucko et al. 1999] und andererseits

scheint es in Verbindung zur Polysaccharidsynthese zu stehen. Eine interessante Eigenschaft

zeigt Crypthedecodinium cohnii auf: Der Dinoflageat scheint in der Lage zu sein die Polysaccha-

ride von Porphyridium purpureum zu degradieren.

Werden die Kultivierungsbedingungen geändert, verändert sich respektive die prozentuale Zu-

sammensetzung der Monosaccharide. Li et al. zeigen, dass bei Kultivierungen alleinig mit Luft im

Vergleich zu einem Gemisch Luft/CO2 (3-5 %), der Galaktoseanteil ab- und der Xyloseanteil

zunimmt [Li et al. 2000]. Weiterhin wird ein derartig dynamisches Verhalten bei Kultivierungen

mit Nitrat- und Sulfatlimitierungen festgestellt. In diesem Fall wird ein geringerer Glukose- und

Xyloseanteil, zugunsten von Galaktose und Methylhexosen, bestimmt [Arad et al. 1988; Ucko et

al. 1993]. Obwohl sich die Monomerzusammensetzung ändert, scheint der Gesamtgehalt an

Polysacchariden konstant zu sein.

Aufgrund der unterschiedlichen Zusammensetzung ist eine molekulare Masse nicht eindeutig

bestimmbar und wird in der Literatur in einem Bereich von 2-7��6 Da angegeben [Geresh et al.

2009; Murray & Riley 1969]. Die Bestimmung der dreidimensionalen Struktur unter Anwendung

von Röntgenbeugungsstrukturanalysen zeigt eine helikal sich wiederholend gerichtete Struktur


und weist eine Biegesteifigkeit ähnlich der von Xanthan bzw. DNA auf [Dário et al. 2011; Etes-

hola et al. 1996; Eteshola et al. 1998].

2.4.2 Syntheseweg

Der Aufbau und die Struktur von sulfatierten Exopolysacchariden ist in Kapitel 2.4.1 beschrieben

worden und soll nun im Hinblick auf die Biosynthese diskutiert werden. Die Polysaccharide wer-

den nach der C-Fixierung im Calvin-Zyklus, ausgehend von Glycerinaldehyd-3-Phosphat, gebil-

det. Das erste Hauptprodukt des Calvin-Zyklus in Porphyridium purpureum ist ein niedermolekulares

Kohlenhydrat, das Floridosid (2-O-Glycerin--D-Galaktopyranosid) [Viola et al. 2001]. 14C Isoto-

penmarkierungsexperimente, mit H14CO3- als C-Quelle, zeigen dass die C-Fixierung nicht auf

Licht angewiesen ist. Nach einer 30-minütigen Inkubationszeit ist der markierte 14C zuerst in Flo-

ridosid und im Anschluss in Floridosidenstärke, in Polysacchariden und in Proteinen nachweis-

bar. Floridosid ist somit als Ausgangskohlenhydrat für den Aufbau von Polysacchariden und Flo-

ridenstärke anzusehen und soll in Abhängigkeit der Kultivierungsbedingungen entweder ver-

mehrt den Aufbau von Polysacchariden oder Floridenstärke begünstigen [REED et al. 1980;

Adda et al. 1986; Li et al. 2001; Thepenier & Gudin 1985].

Die Polysaccharide werden im Golgiapparat produziert und sulfatiert. Die intrazellulär produzier-

ten Polysaccharide werden während der exponentiellen Phase zum Teil im Dictyosom gespei-

chert und in der Übergangs- bzw. stationären Phase verstärkt mit Hilfe von Vesikeln an die Zell-

wand transportiert, gebunden und ins Medium sekretiert [Ramus & Robins, D. M. 1975]. Der

exakte Mechanismus des Sulfatierungsprozesses ist noch nicht vollständig entschlüsselt. Untersu-

chungen zeigen, dass die Sulfatierung ebenso im Golgiapparat stattfindet. Anorganisches Sulfat

wird aus dem Medium zum Dictyosom transportiert und wahrscheinlich mit Sulfotransferasen an

die Polysaccharide gebunden. Fortführende Untersuchungen postulieren, dass auch die Amino-

säure Cystein als Sulfatquelle dienen könnte [Keidan et al. 2006].

Die Biosynthese der Polysaccharide und deren Zusammensetzung kann sich in Abhängigkeit der

Wachstumsbedingungen ändern (siehe Kapitel 2.4.1). Tritt z.B. eine Nitrat-, Sulfat- oder CO2-

Limitierung ein, wird ein erhöhter Anteil an (zellzahlspezifischen) Exopolysacchariden bestimmt.

Im Gegensatz dazu stellt man während der exponentiellen Wachstumsphase einen erhöhten An-

teil an zellwandgebundenen Polysacchariden und intrazellulär vorliegender Floridenstärke fest

[Arad et al. 1988; Ucko et al. 1993].

2.4.3 Merkmale und potentielle Anwendung

Das Molekulargewicht der Exopolysaccharide wird laut Literatur zu 2-7��6 Da angegeben [Ge-

resh et al. 2009; König 2006]. Während des Kultivierungsprozesses, vor allem in der stationären


Phase, werden zellwandgebundene Polysaccharide sekretiert und die Viskosität des Nährmediums

nimmt zu. Bereits bei geringen Konzentrationen von bis zu 0,25 g��-1 werden Viskositäten bis zu

30 mPa�� [König 2006]. Exopolysaccharide besitzen ähnliche Eigenschaften wie Xan-

than, das bereits industriell genutzt wird. Es weist bei Konzentrationen von 0,2 g��-1 Viskositäten

von 37-38 mPa�s auf [Dário et al. 2011]. Desweiteren zeichnen sich Exopolysaccharide durch

einen großen Stabilitätsbereich hinsichtlich der Temperatur (30-120 °C) und des pH-Wertes (2-9)

aus. Zudem besitzen sie die Möglichkeit Wasser einzulagern und sollen ionenaustauschende und

osmoregulatorische Eigenschaften besitzen [Ucko et al. 1999; da Costa et al. 1998; Geresh et al.

1997].

Auf Grundlage der beschriebenen Eigenschaften werden folgende Funktionen der Exopolysac-

charide für Porphyridium purpureum postuliert: Schutz vor mechanischer Beanspruchung, vor Aus-

trocknung, vor zu hoher Strahlenbelastung, vor Temperatur-, pH-Wert- und Salinitätsänderung

[Ramus & Groves 1972; Camacho et al. 2000; Eteshola et al. 1996]. Physiologisch sollen sie als

Lebensraum für vitamin- und hormonproduzierende Mikroben, der Abwehr gegen Aufsit-

zerpflanzen, zur phototaktischen Gleitbewegung und der Biorecognition dienen [Rebolloso Fuentes

et al. 1999; Arad & Richmond 2007; Ramus & Groves 1972; Ucko et al. 1999; Hoek et al. 1993].

Da Exopolysaccharide von Porphyridium purpureum ähnliche rheologische Eigenschaften zu den

von Xanthanen und Carragenen zeigen, könnten sie als Stabilisatoren, Hydrokolloide oder auch

als Verdickungsmittel eingesetzt werden. Sowohl der Einsatz als natürliches Gleitmittel und als

Gelierflüssigkeitsersatz ist denkbar [Arad & Levy-Ontman 2010; Arad et al. 2006]. Der Einsatz als

Nahrungsmittelzusatz wird ebenso diskutiert. Untersuchungen zeigen, dass ein geringer Anteil an

Exopolysacchariden in Futter für Mäuse den Cholesterin- und Triglyceringehalt ohne toxische

Nebenwirkungen senken [Li et al. 2001; Dvir et al. 2000].

Pharmakologisch wird vor allem der Einsatz als Entzündungshemmer [Matsui et al. 2003; Tannin-

Spitz et al. 2005] und als Virustatika diskutiert. So zeigen sulfatierte Exopolysaccharide von Por-

phyridium purpureum antivirale Aktivitäten gegenüber der Herpesviridae-Familie. Ein spezifisches

Merkmal derer ist das Vorhandensein einer dsDNA. Aufgrund derer zeigen Exopolysaccharide

simultan antivirale Aktivitäten gegenüber das Humane Cytomegalievirus, gegen das Varizella-

Zoster-Virus und gegen das Herpes-Simplex-Virus (Typ 1 und 2) [Witvrouw & Clercq 1997; Hu-

leihel et al. 2001; Huleihel et al. 2002; Talyshinsky et al. 2002; Arad & Levy-Ontman 2010; Minko-

va et al. 1996]. Zusätzlich wird von Witvrouw beschrieben, dass bereits geringe Konzentrationen

von Exopolysacchariden das HIV-Virus inhibieren [Witvrouw & Clercq 1997]. Die exakten Wir-

kungsmechanismen sind derzeit nicht bekannt und werden daher nur kurz beschrieben. Einer-

seits wird diskutiert, dass sie das Eindringen des Virus in die Wirtszelle verhindern und anderer-

seits die Virusreplikation selbst vermindert wird [Huleihel et al. 2001; Huleihel et al. 2002; Damon-


te et al. 2004]. Diese Thesen werden unter anderem durch Untersuchungen von Gonzales et al.

und Baba et al. unterstützt. So weisen Carragene und Dextransulfate ähnliche Effekte auf. Zudem

zeigt sich, dass mit einem erhöhten Sulfatierungsgrad der Exopolysaccharide die antivirale Aktivi-

tät zunimmt [Witvrouw & Clercq 1997; Huleihel et al. 2001; Huleihel et al. 2002; Talyshinsky et al.

2002; Gonzalez et al. 1987; Baba et al. 1988].

Aufgrund der verschiedenen Wirkungsweisen wird für sulfatierte Exopolysaccharide ein hohes

Potential als Virustatika mit einer unwahrscheinlich stattfindenden multiplen Resistenzbildung

postuliert [Huleihel et al. 2001; Huleihel et al. 2002; Gonzalez et al. 1987].

Trotz der Vielzahl an Anwendungsmöglichkeiten ist bisher kein aktiv therapeutischer Ansatz

industriell beschrieben. Mögliche Ursachen beschreiben Wagner und Kraus wie folgend [Wagner

& Kraus 2000]: Aufgrund von sich verändernder Kultivierungsbedingungen sind unterschiedlich

zusammengesetzte Exopolysaccharide zu erwarten. Infolgedessen ist eine exakte Replikation mit

genügend großen Mengen für biologische Testsysteme zur Bestimmung des exakten Wirkungs-

mechanismus schwierig. Weiterhin wird auf das Fehlen von spezifischen Verdauungsenzymen im

Menschen hingewiesen. Bereits bei geringer Toxizität könnte somit eine stetige Akkumulation im

menschlichen Körper stattfinden, die permanent pathogene Auswirkungen zur Folge hat [Hulei-

hel et al. 2001].

2.5 Mathematische Suchalgorithmen

In der angewandten Mathematik werden Suchalgorithmen überall dort eingesetzt, in welchen es

darum geht in komplexen Systemen optimale Parameter zumeist mit unbekannter Relation be-

züglich einer oder mehrerer Zielgrößen (Minimum oder Maximum) zu eruieren. In den folgenden

Unterkapiteln werden die gängigsten Algorithmen zur Auffindung optimaler Parameter u. a. für

biologische Systeme beschrieben.

2.5.1 Überblick

Mathematische Optimierungsverfahren sind als Methodiken zu definieren, die mannigfaltige Be-

ziehungen eines vorgegebenen Systems umschreiben, um diese zu analysieren und zu lösen. Sie

können als allgemeingültige Vorgehensweisen betrachtet werden, die jedoch keine endgültig spe-

zifische Lösung der Beziehungen innerhalb des Systems wiedergeben [Luenberger & Ye 2008].

Die Beziehungen können entscheidungssystematischer oder auch optimierungsbedingter Natur

sein. Optimierungsbedingte Lösungsstrategien sind im Wesentlichen im Bereich der Ökonomie

und dem naturwissenschaftlichen/technischen Gebiet anzusiedeln und können wie folgt systema-

tisch bearbeitet werden: Es wird eine Zielgröße/Funktion (f(x)) definiert, die die Güte und Quali-

tät der Entscheidung beschreibt. Zeitgleich werden Einflussgrößen (xi, sogenannte kontinuierli-


che Komponenten) und Nebenbedingungen (gj(x) und hj(x)) ausgewählt, die das System beein-

flussen und eingrenzen. Das Verfahren kann beendet werden, sobald die Zielgröße in Abhängig-

keit der Einflussgrößen und Nebenbedingungen ausreichend optimiert (maximiert/minimiert)

wurde. Mathematisch werden Optimierungsverfahren wie folgt beschrieben (siehe (2.5)),

Optimiere f(x), x= �x1x2.

xn

� �Rn gj(x)=0, j=1,2,…, m hj(x)=0, j=1, 2, …, r (2.5)

und werden generell in zwei Klassen unterteilt (siehe (2.6)) [Snyman 2005]:

Beschränkte/endliche Verfahren: Unbeschränkte/nicht-endliche Verfahren:

hj(x)�1 x �Rn (2.6)

Simultan können diese zwei Klassen ebenso in lineare und nichtlineare Verfahren eingeteilt wer-

den. Lineare Optimierungsverfahren werden generell mathematisch durch eine Standardform

(siehe (2.7), beschränktes Optimierungsproblem) ausgedrückt:

Minimiere F(x)= �c1c2.

cn

� x Ax � b x � 0 (2.7)

Hierbei wird das Optimierungsproblem durch die Funktion F(x), mit einer m-n großen Matrix A

(m � n) und dem Rang m beschrieben. Die Zielfunktion wird durch den Vektor c mit einer mög-lichen Beschränkung (Vektor b) ausgedrückt.

Im Gegensatz zu linearen Optimierungsverfahren, beschreiben nichtlineare Optimierungsverfah-

ren Beziehungen nichtlinearer Funktionszusammenhänge.

2.5.2 Beschränkte Algorithmen

Beschränkte lineare Optimierungsverfahren sind in die Kategorie numerischer Algorithmen, wie

z.B. das Simplex-Verfahren, einzuordnen. Die grundsätzliche Herangehensweise beschränkte

lineare Gleichungssysteme zu lösen wird erstmals von Dantzig [Dantzig 1966] vorgestellt. Dieses

Verfahren findet vor allem in der Finanzwirtschaft zur Planung von Produktionsprozessen

[Luenberger & Ye 2008; Chong & Zak 2013] und zur Evaluierung von Prozess- und Reaktions-

parametern seine Anwendung [Walters 1999; Walters et al. 1991; Morgan & Deming 1974; De-

ming et al. 1978; Luersen & Le Riche 2004].

Grundsätzlich basiert das Verfahren auf der Zurückführung linearer Optimierungsprobleme in

eine Standardform (siehe Tabelle 10.1 Anhang: praktische Vorgehensweise zur Durchführung des

Simplex-Verfahrens) nach Gleichung (2.7) [Luenberger & Ye 2008; Lagarias et al. 1999]. Die


maßgebliche Aufgabe des Simplex-Algorithmus besteht im Pivotieren um ein ausgewähltes Ele-

ment in der Matrix A. Hierbei versucht der Algorithmus einen Punkt x zu identifizieren, der das

lineare Gleichungssystem A�� b mit einer gleichzeitigen optimalen Zielfunktion F(x) löst. In Abhängigkeit des Optimierungsproblems können für das Gleichungssystem drei Fälle auftreten:

nicht lösbar, Lösungen mit beliebig maximal hohen Zielfunktionswerten F(xN) (unbeschränkter

Fall) und eine/unendliche viele Lösungen.

Ausgehend von der Lösbarkeit des Systems kann die Quantität der zu iterierenden Punkte x gra-

fisch anhand eines konvexen Polyeders (siehe Abbildung 2.2) beschrieben werden [Luersen & Le

Riche 2004].

Abbildung 2.2: Grafische Darstellung einer Lösungsmöglichkeit des Simplexalgorithmus Wiedergegeben und abgeändert nach [Pottmann & Bentley 2007] Der Algorithmus wandert beginnend von einer Startlösung x0, entlang der Kanten des Polyeders,

zu einem optimalen Funktionswert F(x).

Ein bemerkenswerter Vorteil des Simplex-Algorithmus liegt in der Möglichkeit sogenannter

Warmstarte und trägt somit zu einer Verringerung der exponentiellen Laufzeit bei [Luenberger &

Ye 2008; Chong & Zak 2013]. Während der Durchführung des Algorithmus können Nebenbe-

dingungen hinzu- oder weggenommen werden, wobei der Warmstart an der letzten Lösungsmög-

lichkeit (Ecke im Polyeder) des Optimierungsproblems ausgeführt wird.

2.5.3 Unbeschränkte Algorithmen

Unbeschränkte Optimierungsalgorithmen, wie z.B. die Newton-Methode, sind in die Kategorie

der Gradienten-Verfahren einzuordnen. Im Speziellen wird das Newton-Verfahren, so wie der

Simplex-Algorithmus, zur Lösung von ingenieurswissenschaftlichen Problemstellungen, z.B. in

der Auslegung von Rektifikationskolonnen, angewendet. Desweiteren werden mit diesem auch

ökonomische Kostenfunktionen minimiert. Die Bestimmung des Optimums (Nullstelle bzw.


eines lokalen Miniums) der Funktion f(x) erfolgt durch eine quadratische Funktion q(x) am Start-

punkt xk, wobei q(x) durch eine Taylor-Reihenentwicklung iterativ bestimmt wird. Ausgehend

von q(x) wird das Minimum bestimmt und als nächster Iterationsstartpunkt xk+1 verwendet. Die

Iteration wird solange wiederholt bis der Abstand zwischen xk und xk+1 hinreichend klein wird

[Luenberger & Ye 2008; Snyman 2005; Chong & Zak 2013; Kusche 2011]. Zur iterativen Annä-

herung der quadratischen Funktion q(x) muss vorausgesetzt werden, dass f(x) zweimal stetig dif-

ferenzierbar ist. Aus diesem Grund konvergiert das Simplex-Verfahren zumeist schneller als an-

dere Gradienten-Verfahren. Dieser Vorteil kann jedoch auch in Abhängigkeit der Wahl des Start-

punktes xk von Nachteil sein. Ist der Startpunkt xk zu weit von dem unbekannten Optimum

entfernt, konvergiert das Verfahren nicht und wird abgebrochen.

2.5.4 Globale Algorithmen

Im Gegensatz zu unbeschränkten Algorithmen, deren Voraussetzung zumindest das Vorhanden-

sein der ersten Ableitung ist [Chong & Zak 2013], funktionieren globale Algorithmen anders.

Globale Algorithmen durchsuchen den gesamten Raum Rn bezüglich der Einflussgrößen xi. Es ist

weder die Funktion, noch deren Ableitung notwendig. Sie arbeiten mit den Absolutwerten der

Zielfunktion die experimentell bestimmt werden. Infolgedessen können sie somit bei einer größe-

ren Anzahl an Optimierungsproblemen eingesetzt werden. Zwei Hauptvertreter sind z.B. evolu-

tionäre Algorithmen und das Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahren, die in den folgenden

Unterkapiteln diskutiert werden.

2.5.4.1 Genetische Algorithmen

Genetische Algorithmen sind als eine Unterklasse der evolutionären Algorithmen anzusehen. Sie

durchsuchen stochastisch, basierend auf den Auswahlregeln der Evolution, den kompletten

Raum Rn, der als binäre Strings oder als Array definiert wird.

Bereits im Jahr 1957 ist mittels computerbasierter Simulationen versucht worden tiefere und ver-

ständlichere Einblicke in genetische Prozesse und der natürlichen Auslese zu bekommen [Barri-

celli 1957; Fraser 1957]. Ende der 1960er Jahre wird der Begriff des genetischen Algorithmus,

insbesondere von Bagley [Bagley 1967], eingeführt. Seine Arbeiten gehen auf die Grundlagenar-

beit von Holland – University of Michigan – zurück [Holland 1962, 1992]. Sie finden heute vor

allem im Chemieingenieurwesen [Judson et al. 1992; Meza & Martinez 1994], der Medizin [Smig-

rodzki et al. 2005] und im Bereich der neuronalen Netzwerke ihre Anwendung [Koza 1992]. Ge-

netische Algorithmen arbeiten nach folgendem Prinzip (siehe Abbildung 2.3):


Abbildung 2.3: Prinzip des genetischen Algorithmus Der in Abbildung 2.3 beschriebene Algorithmus wird abgebrochen, sobald ein selbstdefiniertes

Optimum gefunden bzw. ein Abbruchkriterium erreicht wird.

Die Funktionsweise genetischer Algorithmen kann wie folgt zusammengefasst werden: Es findet

ein heuristischer Suchprozess im kompletten Raum Rn statt. Es ist keine Kenntnis der Zielfunkti-

on und deren Ableitungen notwendig. Es wird mit populationären Ereignissen (nicht mit singulä-

ren) gearbeitet. Demzufolge bietet der genetische Algorithmus einen wesentlichen Vorteil gegen-

über anderen Optimierungsverfahren. Mit geringem Rechenaufwand wird bereits nach zehn oder

weniger Generationen ein Optimum erreicht [Weuster-Botz & Wandrey 1995; Weuster-Botz

2000; Chong & Zak 2013; Goldberg ©1989]. Nachteilig ist jedoch, dass kein definiertes Kriteri-

um zur Überprüfung des Optimums vorliegt. Weiterhin muss aufgrund des Bewertungssystems

und der Reproduktionsereignisse auf computerbasierte Systeme zurückgegriffen werden.

2.5.4.2 Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahren

Das Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahren (im Folgenden als Nelder-Mead-Verfahren be-

zeichnet) wird in die Klasse der unbeschränkten, direkten, multidimensionalen Suchverfahren

eingeordnet [Lagarias et al. 1999] und ist in keinem Fall mit dem von Dantzig [Dantzig 1966;

Dantzig 1998] vorgestellten Algorithmus zu verwechseln. Es wurde erstmals von Spendley, Hext

und Himsworth [Spendley et al. 1962] im Jahre 1962 publiziert und von Nelder und Mead 1965

überarbeitet [Nelder J.A. & Mead R. 1965]. Das Verfahren basiert auf der direkten Evaluierung

von Zielfunktionsgrößen und der Elimination des schlechtesten Punktes zur Berechnung des

nächsten Evaluationspunktes. Ein Simplex wird als ein geometrisches Objekt definiert, das sich

aus (n+1) linear unabhängigen Elementen (Vertexes = Eckpunkte) im Raum Rn zusammensetzt.

Jedes Vertex korrespondiert zu einem Satz an Versuchsbedingungen. Ein 0-dimensionales Simp-

lex wäre mit einem Vertex (Punkt) zu beschreiben. Dieses lässt sich jedoch aufgrund von null

Freiheitsgraden im Raum nicht verschieben und stellt somit eine triviale und nicht sehr praktische

Lösung des Algorithmus dar. Ein 1-dimensionales Simplex (2 Vertexes) ist somit als eine Gerade,

Ausgangspopulation Generiere Startpopulation bestehend aus zufälligen Individuen

Evaluation Berechne die Zielwerte der potentiellen Kandidaten

Leistungsfähigkeit Beurteile die Leistungsfähigkeit aufgrund der Zielwerte

Reproduktion Generiere neue Start- Population durch Kreuzung und Mutation

Auswahl Wähle die leistungs- fähigsten Individuen für Reproduktion aus


ein 2-dimensionales (3 Vertexes) als ein Dreieck, ein 3-dimensionales (4 Vertexes) als ein Tetra-

hedron anzusehen. Höher dimensionale Simplexes, mit mindesten vier Dimensionen und 5 Ver-

texes wären demnach sogenannte Hypertetrahedrons, die grafisch nicht mehr darstellbar sind –

sie funktionieren jedoch nach demselben Prinzip, wie 1-, 2- und 3-dimensionale Simplexes [Wal-

ters et al. 1991]. Zur anschaulicheren Darstellung wird die Durchführung des Nelder-Mead-

Verfahrens im 2-Dimensionalen beschrieben.

Die Generierung der Startpunkte xi, die Evaluierung der Zielfunktionswerte f(xi), die Berechnung

fortführender Startpunkte xi und die Abbruchkriterien sind in

Durchführung des Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahrens

Abbildung 2.4 dargestellt

Abbildung 2.4: Entscheidungsdiagramm des Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahrens Wiedergegeben und abgeändert nach [Walters et al. 1991; Lammert 2008] x1s schlechtester Punkt, xb bester Punkt, x2s zweitschlechtester Punkt, xsp Schwerpunkt, xr Reflexions-punkt, xe Expansionspunkt, xk Kontraktionspunkt, x´i Schrumpfungspunkte

Evaluiere x1s und xb: f(x1s)=Min f(xi) und f(xb)=Max f(xi) Berechne xsp und xr Evaluiere xr anhand f(xr)

Generiere n+1 Startpunkte Evaluiere Zielfunktionswerte f(xi), i=1,…, n+1

f(xr)>f(xb) f(xr)>f(x2s) f(xr)f(xb) f(xk)>f(x1s)

x1s=xe x1s=xr x1s=xk

Ersetze: xi=0,5��i+xb)

Abbruch

Ende


Zur Generierung eines 2-dimensionalen Simplex sind (n+1)-linear unabhängige Startpunkte not-

wendig. Die geometrische Figur stellt ein Dreieck (3 Vertexes) dar. Im Folgenden wird die Kon-

struktion eines rechtwinkeligen [Walters et al. 1991] bzw. eines gleichseitigen [Chong & Zak 2013]

Vertexes anhand der Formeln (2.8) und (2.9) veranschaulicht.

xi=x0+aiei

i= 1, …, n x0 Startvektor ai Schrittweite ei Einheitsvektor

(2.8)

xi=x0+pei+ � qekni=1

p=a

��2 �(n+1+n-1 q=

a��2 �(n+1-1

i= 1, …, n ei,k Einheitsvektoren x0 Startvektor a Schrittweite

(2.9)

Die Fortführung des Simplexverfahrens beruht auf den in Abbildung 2.4 dargestellten Auswahl-

regeln. Zur Berechnung des neuen Evaluierungspunktes xi (siehe Formel (2.11)) wird jeweils der

Schwerpunkt xsp des Systems nach Formel (2.10) berechnet.

xsp=� xnni=1

n i= 1, …, n (2.10)

xi=xsp+(xsp-x1s) = Multiplikationsfaktor (2.11) In Abhängigkeit der Auswahlregeln ergeben sich für � verschiedene Werte. Eine Reflexion

(� = 1, xr), eine Expansion (� = 2, xe), eine Kontraktion (� = 0,5, xk) und ein Sonderfall, die so-

genannte Schrumpfung (xí), sind in Abbildung 2.5 dargestellt.

Abbildung 2.5: Fortführung des Simplexverfahrens zur Berechnung neuer Startpunkte Wiedergegeben und abgeändert nach [Walters et al. 1991; Kusche 2011] x1s: schlechtester Punkt, xb: bester Punkt, x2s: zweitschlechtester Punkt, xsp: Schwerpunkt, xr: Reflexions-punkt, xe: Expansionspunkt, xk: Kontraktionspunkt, xí Schrumpfungspunkte

Xí Xí

Xsp

Xr

Xk

Xb

X1S X2S

Xe


Die Berechnung der neuen Startpunkte xi kann grundsätzlich in zwei Verfahren eingeteilt werden.

Einerseits die klassisch-statische Variante nach Spendley, bei der sich die Form des Vertexes

nicht verändert (Reflexionspunkt xr) und andererseits das dynamische Verfahren mit verschiede-

nen Werten für � (siehe Abbildung 2.6).

Sowohl das statische, als auch das dynamische Verfahren beruhen auf der gleichen Auswahl der

Startpunkte. Im statischen Verfahren ist die Form der Vertexes konstant und ein wesentliches

Merkmal für einen Optimumsbereich ist das Umkreisen der Vertexes um einen Vertex. Ist die

Schrittweite zu klein oder zu groß gewählt, erhöht sich die Anzahl der Vertexes oder es bricht

nach wenigen Iterationen ab. Im dynamischen Verfahren verändert sich die Form der Vertexes.

Es wird den optimalen Bereich unabhängig von der Schrittweite bzw. des Startpunktes finden.

Das Erreichen des optimalen Bereiches ist gekennzeichnet durch vermehrte Kontraktionsschritte

des Verfahrens [Lagarias et al. 1999; Walters et al. 1991; Morgan et al. 1990].

In beiden Varianten ist die Wahl der Startpunkte maßgeblich für die Anzahl der notwendigen

Iterationsschritte. Es liegen hierfür keine definierten Auswahlregeln vor; sie sind unter anderem

von der Erfahrung des Experimentators abhängig. Sowohl die Wahl der Startpunkte als auch die

Schrittweite sollten derart gewählt werden, dass sie einerseits physikalisch kontrollierbar und an-

dererseits metabolisch sinnvoll sind.

X2

X1100 80 60 40 20 0

0

20

40

60

100

80

0

20

40

60

100

X2

80

100 80 60 40 20 0X1

Abbildung 2.6: Darstellung des Simplexverfahrens im 2-dimensionalen Raum Links statisches Verfahren (16 Iterationen); Rechts dynamisches Verfahren (12 Iterationen); Wiedergegeben nach [Walters et al. 1991] Eine besondere Möglichkeit des Verfahrens stellt der sogenannte Warmstart, der bei physikalisch

oder chemischer Systemgrenzenüberschreitung auftreten kann, dar. In diesem Fall können meh-

rere Aktionen durchgeführt werden [Walters et al. 1991]. Im statischen Verfahren wird vorge-

schlagen die Systemgrenzen zu erweitern oder neu zu setzen. Es wird z.B. in einem chemischen

Experiment eine negative Konzentration an Salzsäure empfohlen. Eine Lösung des Problems

könnte durch den adäquaten Zusatz an Natronlauge erreicht werden. Dahingegen wird bei einer


Expansionsverletzung im dynamischen Verfahren die Reflexion bzw. die Kontraktion vorge-

schlagen. Sind diese Aktionen nicht ausführbar, wird der Verletzungsparameter auf seinen Start-

punkt xi zurückgesetzt und das Verfahren wird um eine Dimension erniedrigt [Walters et al. 1991].

Zur Beendigung des Verfahrens dienen folgende Kriterien:

� ein optimaler Bereich wird als valide angesehen, falls:

im statischen Verfahren eine Umkreisung der Vertexes um einen Vertex

im dynamischen Verfahren eine wiederholte Kontraktion der Vertexes

stattfindet [Walters et al. 1991; Morgan & Deming 1974]

� vorher definierte Zielfunktionswerte werden erreicht

� Setze f �= 1n+1

� f(xi)n+1i=1 und falls 1n+1 � �f(xi)-f ��2��n+1i=1 diese Bedingung dient zur Überprüfung, dass f(xi,max) auf dem Simplex nahezu konstant ist

[Walters et al. 1991; Morgan et al. 1990; Nelder & Mead 1965]

� �f(xi+1)-f(xi))< Mess- und Regelungsgenauigkeit der Experimente

� Notausstieg: eine vorher definierte Iterationszahl wird überschritten

Soll das Verfahren beendet werden, kann das gefundene Optimum folgendermaßen experimen-

tell überprüft werden: Ausgehend vom Optimum werden die Experimente in Richtung zum Mi-

nimum hin wiederholt. Der Algorithmus wird von mindestens zwei anderen Startpunkten aus

gestartet [Walters et al. 1991]. Eine weitere Möglichkeit ist die Wiederholung aller Iterationen

[Powell 1964]. Es wird im statischen Modus mit einer Seitenlänge des Betrages von xi-xi+1 gestar-

tet. Sind nach 2�n Iterationen keine Verbesserungen ersichtlich, kann das Verfahren beendet wer-

den. Zusätzlich kann die Existenz eines Optimums durch die Hesse-Matrix mit einer quadrati-

schen Funktionsannäherung überprüft werden (siehe 2.5.3 Unbeschränkte Algorithmen) [Nelder

& Mead 1965].

Wie bereits erwähnt, arbeitet der Algorithmus ohne Kenntnis der Ableitung eines Optimierungs-

problems/Zielfunktion und begutachtet nur die Güte der Vertexes im Raum Rn. Aus diesem

Grund wird der Algorithmus im Vergleich zu nichtglobalen Algorithmen als robuster angesehen

[Lagarias et al. 1999; Walters et al. 1991]. Das Optimierungsproblem wird als Blackbox begutach-

tet und zeigt dementsprechend ähnliche Funktionsweisen wie genetische Algorithmen (siehe

Eigenschaften des Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahrens

2.5.4.1).Vor allem das dynamische Verfahren zeigt seine Effizienz in der Anpassung der Struktur

an die Gestalt des Optimierungsproblems (siehe Abbildung 2.6) und bestimmt somit genauer das


Optimum [Ucko et al. 1999; Morgan et al. 1990; Parker et al. 1985]. Ein weiterer Vorteil liegt in der

Anzahl der notwendigen Experimente. Verglichen mit klassischen Einflussgrößenanalysetechni-

ken steigt die Zahl der Iterationsschritte linear und nicht exponentiell. Es wird meist schon nach

30-50 Iterationsschritten ein Optimalbereich gefunden [Lagarias et al. 1999; Morgan & Deming

1974; Nelder & Mead 1965; Morgan et al. 1990; Parker et al. 1985; Gough et al. 1996]. Die Ein-

fachheit des Algorithmus zeigt sich in der Durchführung der zu berechnenden neuen Startpunk-

te. Mit simpler Vektorgeometrie kann das Verfahren angewendet werden und benötigt keine

computerbasierte Unterstützung [Walters et al. 1991].

Im Gegensatz dazu benötigt die Anwendung des Verfahrens die Expertise des Anwenders. Sind

die Startpunkte zu weit weg vom Optimum gewählt, beeinflusst das die Schnelligkeit der Kon-

vergenz. Zudem können aufgrund der Wahl der Startpunkte (Algorithmus kollabiert) mehrere

Neustarts notwendig sein. Der gefundene Optimalbereich kann nicht exakt bestimmt werden und

es existiert kein mathematischer Beweis seiner Konvergenz. Zusätzlich muss experimentell über-

prüft werden, ob nur ein lokales und kein globales Optimum vorliegt [Walters 1999; Morgan et al.

1990].

2.5.5 Auswahl eines mathematischen Algorithmus

In der vorliegenden Arbeit wird ein Optimierungsverfahren ausgewählt, das zur Maximierung der

Raum-Zeit-Ausbeute bezüglich der EPS-Bildung dient. Der Syntheseweg und die Sekretion von

Polysacchariden in Porphyridium purpureum sind nicht im Detail bekannt (siehe Kapitel 2.4.2).

Demzufolge existiert bis dato keine eineindeutige mathematische Beschreibung. Die Einflüsse

(Licht, CO2-Gehalt, Medienzusammensetzung, Temperatur, etc.), die zum einen das Wachstum

und zum anderen die Produktbildung beeinflussen, sind komplex und voneinander abhängig.

Aus diesem Grund können keine linearen Verfahren angewendet werden. Es empfehlen sich

globale heuristische Optimierungsverfahren, wie z.B. der Genetische Algorithmus oder das Nel-

der-Mead-Verfahren.

Liegen die zu beeinflussenden Größen im kompletten Raum Rn stochastisch verteilt vor, wäre ein

Genetischer Algorithmus aufgrund des geringeren experimentellen Aufwandes die sinnvollste

Wahl. Sind die Einflüsse weitestgehend bekannt und es kann davon ausgegangen werden, dass

der Optimalbereich eingegrenzt worden ist, kann das Nelder-Mead-Verfahren in der Findung des

zuvor eingegrenzten Optimums effizienter sein als ein Genetischer Algorithmus [Durand & Al-

liot 1999].

Aufgrund von Literaturrecherchen ist ein eingegrenzt optimaler Bereich für das Wachstum und

der EPS-Produktion von Porphyridium purpureum anzunehmen [Ramus 1972; König 2006; Jones et


al. 1963; Fleck-Schneider et al. 2007; Roselló Sastre 2010]. Unter den genannten Bedingungen ist

es unwahrscheinlich, dass das Nelder-Mead-Verfahren vorzeitig kollabiert oder an einem lokalen

Optimum konvergiert. Aus diesem Grund wird in der vorliegenden Arbeit das einfach zu imple-

mentierende, effiziente und robuste Nelder-Mead-Verfahren ausgewählt.

2.5.6 Auswahl der Randparameter und der Kultivierungsbedingungen

Photoautotrophe Mikroorganismen sind vor allem auf Licht, CO2 und Mineralnährstoffe ange-

wiesen. Weiterhin nehmen sowohl der pH-Wert, die Kultivierungstemperatur als auch die

Durchmischung einen Einfluss auf das Wachstum und somit auf die Biosynthese von Polysac-

chariden. Die hierfür maßgeblichsten Einflüsse sind in Tabelle 2.2 wiedergegeben und werden

diskutiert.

Tabelle 2.2: Einflussparameter zum Wachstum und der Biosynthese von Exopoly-sacchariden der Rotalge Porphyridium purpureum im Rahmen des Nelder-Mead-Downhill Simplex-Verfahrens

Wiedergegeben und abgeändert nach [Kusche 2011]

Parameter Einfluss auf das Wachstum/Biosynthese Photonenflussdichte (PFD – Licht)

Effizienz der Photonenabsorption durch Lichtsammelkomplexe ��

��!"��#��"�� Pigmentzusammensetzung ��$'"��?��$��"��'"@��\��^!$-Gehaltes

CO2-Gehalt Wachstum (einzige C-Quelle); Aufbau von Kohlenhydraten pH-Wert Wachstum, Enzymaktivität, gelöst CO2; EPS

��$'"��?��^�� Natriumchlorid Änderung der Salinität und damit direkte Änderung des osmotischen Druckes

��_��`��'"�?��"��^!$-Sekretion Sulfat S-Aufnahmerate ist lichtabhängig; Wachstum

��$-Quelle für Proteinsynthese und Beeinflussung des Sulfatgehaltes der EPS Nitrat Wachstum, Metabolismus

��{-Quelle zur Nukleotid-, ATP- und Proteinsynthese Phosphat Wachstum; P-Quelle für Nukleotide, ATP, Co-Enzyme, Phospholipide Temperatur Wachstum und EPS-Produktion durch Enzymaktivität; Viskositätsänderung

��|}��?�"��?��EPS im Medium Gasvolumenstrom Durchmischung im Photobioreaktor; Scherbeanspruchung

��~�'"��?��Flashing-Light-Effect ��$'"��'"�^!$�

2.5.6.1 Photonenflussdichte – Licht

In jedem chemischen und biotechnologischen Prozess ist das Ziel den Prozess nach maximaler

Effektivität auszulegen. Werden photoautotrophe Mikroorganismen in geschlossenen Photobio-

reaktoren kultiviert, stellt bei ausreichender CO2- und Mineralnährstoffversorgung Licht meist


den limitierenden Faktor dar. Ausgehend vom Gesetz von Lambert-Beer, siehe (2.12), kann die

Extinktion an Lichtquanten in verdünnten Lösungen in Abhängigkeit des dekadischen Extink-

tionskoeffizienten��, der Konzentration c und der Weglänge beschrieben werden.

�� = �0�1 = �� I0= Intensität der einfallenden Strahlung I1= Intensität der transmittierten Strahlung ��= dekadischer Extinktionskoeffizient c= Molkonzentration der Lösung d= Schichtdicke/Weglänge

(2.12)

Die Intensität der einfallenden Strahlung wird durch die Photonenflussdichte beschrieben. Wäh-

rend des Wachstums photoautotropher Mikroorganismen erhöht sich die Biomasse und konse-

quenterweise variiert die Zusammensetzung der Pigmente. Beide Faktoren beeinflussen den de-

kadischen Extinktionskoeffizienten und die Konzentration der Lösung [Walter 1999; Radmer et

al. 1987]. Da das Gesetz von Lambert-Beer nur für verdünnte Lösungen zutrifft, beschreibt es in

diesem Fall die Veränderung der Extinktion nicht explizit korrekt. Untersuchung zeigen jedoch,

dass in Abhängigkeit der Weglänge von einer exponentiellen Abnahme auszugehen ist [Posten &

Rosello-Sastre 2011]. Es werden orts- und zeitabhängig unterschiedliche Extinktionen detektiert

und beeinflussen die Photosyntheserate des Mikroorganismus (siehe Abbildung 2.7).

Phot

osyn

thes

rate

Saue

rsto

ffpro

dukt

ions

rate

Lichtintensität

3 4 5

2

1

Abbildung 2.7: Darstellung der Photosyntheserate in Abhängigkeit der Lichtintensität Wiedergegeben und abgeändert nach [Walter 1999; Sperber, von 2013]; 1: Dunkelatmung; 2: Lichtkompensationspunkt; 3: Lichtlimitierung (max. Quantenausbeute); 4: Lichtsättigung (max. Photosyntheserate); 5: Photoinhibierung Im Wesentlichen sind fünf Bereiche zu unterscheiden. Bereich 1 ist gekennzeichnet durch einen

größeren O2-Verbrauch als dieser in der Photosynthese produziert wird. Die Energiegewinnung

und die damit notwendige Bereitstellung von Reduktionsäquivalenten erfolgt maßgeblich über

den Katabolismus des Mikroorganismus (siehe 2.3.5 Atmung). Der Lichtkompensationspunkt

(Bereich 2) wird als derjenige Punkt definiert, an dem der Verbrauch an Sauerstoff in der Dun-


kelatmung gleich dem des produzierten Sauerstoffes durch die Photosynthese ist. Die Bereiche 3-

5 sind im Wesentlichen durch Lichtlimitierung, Lichtsättigung und der Photoinhibierung gekenn-

zeichnet. Im lichtlimitierten Bereich (Bereich 3) wird jedes eintreffende Quant vom Photosystem

maximal genutzt, jedoch ist dieses noch nicht ausgelastet. Wird die Photonenflussdichte im Be-

reich 4 weiterhin erhöht, ist kein weiterer Anstieg der Photosyntheserate zu verzeichnen und die

überschüssige Energie wird vor allem in Form von Wärmedissipation abgegeben. Eine Schädi-

gung des Photosystems kann bei stetiger Erhöhung der Bestrahlungsstärke in Form eines Ein-

bruches der Photosyntheserate (Bereich 5) beobachtet werden. Die überschüssige Energie kann

durch das Photosystem nicht mehr abgeführt werden und es kommt zur Bildung von

O--Radikalen, die das Photosystem nachhaltig schädigen [Richmond et al. 1993; Peng et al. 2013].

Zur Bestimmung der Quantität der Photosyntheserate (Bereich 1) und somit zu einer genaueren

Beschreibung der Nettosauerstoffproduktionsrate untersuchten Kliphuis et al. die

Documents

Bestimmung und Optimierung verfahrenstechnischer und ... · the salinity (mainly influenced by the content of sodium chloride), the content of magnesium sulfate/ potassium chloride