Zeitschrift fur allgemeine Mikrobiologie 24 (1984) 1 , 61 -64

Kurze Originalrnitteilung

(Akademie der Wissenschaften der DDR, Institut fur technische Chemie, Leipzig, Direktor: Prof. Dr. sc. nat. M. RINGPBEIL)

Bestimmung von freiem und gebundenem Ergosterol in Mikroorganismen

H. MULLER und B. VOIGT

(Eingegangen am 13. 6.1983) A method for the quantitative determination of free and esterified ergosterol in lipid fractions from biomasses grown on hydrocarbons as sole carbon source is described. Column chromatography was uscd for the fractionation of lipids. Esterified ergosterol was determined in the benzene frac- tion and free ergosterol in the methanol fraction by known methods.

Ergosterol und dessen Ester kommen in einer Vielzahl von Mikroorganisnien vor

MERCER 1974). Zur Bestinimung von freiern und gebundenem Ergosterol sind zahlreiche Arbeiten

in der Literatur beschrieben. Ihnen gemeinsani ist die Extraktion der Lipide aus Biomassen, die Auftrennung der gewonnenen Lipidfraktionen an Kieselgelplatten bzw. -saulen, die Isolierung des unverseifbaren Anteils und die Bestimmung des Ergo- sterolgehaltes im unverseifbaren Anteil mittels Dunnsehichtchromatographie, Gas- chromatographie bzw. Gaschromatographie-Massenspektronietrie. Fur die Bestini- rnung von freiem und gebundenem Ergosterol in Lipidfraktionen mit einem Kohlen- wasserstoffanteil von 20-50 Gew.-% (VOIGT et al. 1979, VOIGT u. MULLER 1981, 1982) sind die bekannten Methoden nur bedingt geeignet. Eine dunnschichtchroniato- graphische Auswertung (ALENTYEVA et al. 1974) wird durch Kohlenwasserstoffe rind Wachse gestort. Fur eine UV-spektrometrische Bestinimung des Ergosterolgehaltes ist nach HILDEBRANDT et al. (1983) eine vollstandige Entfernung der Kohlenwasser- stoffe Voraussetzung.

In der vorliegenden Arbeit wird eine Analysenmethode zur Bestimmung von freiein und gebundenem Ergosterol in Mikroorganismenbiomasse und daraus isolierten Lipidfraktionen vorgelegt, die eine UV-spektrometrische Bestiinniung des freien und gebundenen Ergosterols in Anlehnung an die Methode von HTJMMEL (1955) bei Anwesenheit von substratspezifischen Kohlenwasserstoffen gestattet . Die Bestimmung erfolgte aus den vorher isolierten Lipidfraktionen der Biomassen. Dabei muBte eine Extraktionsmethode gewahlt werden, die einerseits eine vollstandige Extraktion der Lipide gewahrleistet und andcrerseits die Sterolester nicht spaltet. Von den uberpriiftcn Methoden ent- sprach’die Extraktion mit Chloroform/MethanoI nach VORBECK u. MARINETTI (1965) diesen Forde- rungen. Die von uns beschriebene Ergosterolbestimmungsmethode ist ebenfalls fur die analytische Charakterisierung von Lipidfraktionen geeignet, die bei der Reinigung von auf Kohlenwasser- stoffen gezuchteten Futterhefen anfallen.

Alle eingesetzten Chemikalien hatten p. a. QualitLt. Ergosterol wurde von der Firma FERAK Berlin bezogen und durch Kristallisation aus Aceton gereinigt. Ergosterolacetat und -palmitat wurden durch Umsetzung mit Acetanhydrid (ORGANIKUM 1962) bzw. Palmitinsaurechlorid (SUMI 1929) hergestellt. Das Digitonin wurde als 0,5 proz. athanolische Losung eingesetzt. Die Saulenchromatographie erfolgte an Kieselgel SC rein, 100-200 p der Firma SERVA Heidelberg.

Trennung des gebundenen vom freien Ergosterol: 1 g Lipidextrakt wird in 5-10 ml n-Hexan gelost und auf eine ChromatographiesLule (d = 10 mm), in die etwa 20 g aktiviertes Kieselge

(GAL’TSOVA et al. 1981, TAK~TANI et al. 1978, BAILEY U. I’ARKS 1975, UARTLBTT u.

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(Akt. : 6 Std. bei 453 K) mit. n-Hexan eingeschlammt wurde, gegeben. Bei einer Tropfgeschwindig- keit, von etwa 2 Tropfen/sec wird in der Reihenfolge 100 ml n-HexanlBenzen (80/20), 100 ml Rcnzen und 100 rnl 3Icthanol cluiert.

Die vor allem die Kohlenwasserstoffe enthaltende n-HexanlBenzen-Fraktion wird verworfen. Die Benzen- und die Jfethanolfraktion wcrden getrennt am R.otat.ionsverdampfer eingeengt.. Sie enthalten die Ergosterolester bzw. das frcie Ergosterol.

Best,immung des gebundenen Ergosterols : Der Destillationsriickstand der Benzenfraktion wird in heiRem Athanol gelost und bei 293 K quantitat.iv in einen 25 ml-RIaBkolben uberfiihrt. 5 ml der Athanollosung nerden abpipettiert und in ein Zentrifugenglas gegeben. AnschlieRend a-erden 3 ml einer 0,5 proz. athanolischen Digitoninlosung und 3 ml Wasser zugesetzt. Nach kurzzeitigem Erwarmen auf - 343 K wird die Losung 2 Stunden bei e t x a 278 K aufbewahrt. Der Pu'iederschlag wird zent,rifugiert, in heiRem Athanol gelost und bei 293 K quantitativ in einen 25 ml-Mal3kolben iiberfuhrt. Die Extinktion der athanolischen Digitonidlosung wird im UV-Bereich zwischen 280 und 310 nm gegen den reinen Alkohol gemessen.

Bestimmung des freien Ergosterols : Der Dest,illationsruckstand der Methanolfraktion wird mit 25 ml einer 10 proz. athanolischen Kalilauge eine Stunde a'm RuckfluS erhitzt. Die noch warme Losung wird mit 25 ml Wasser rersetzt und anschliefiend in einem Scheidetrichter 4mal mit je 30 ml a-Hexan extrahiert. Die vereinigten n-Hexanlosungen werden rnit Wasser gewaschen. iiber Nat.riumsulfat' getrocknet und das Losungsmittel am Rotationsverdampfer ent'fernt. Der Riick- stand wird in Athanol gelost, in einen 25 ml-MaBkolben iiberfiihrt und analog der Ergosterol- esterbestimmung weiter behandelt.

Die Ext,inktion der Losung bei 293,5 nm wird nach Abzug des Blindwert,es bei 310 nm zur Berechnung des Ergosterolgehalt'es herangezogen. Reines Ergosterol (10004 Trockensnbstanz) weisteine Extinktion von E i X , (293,5 nni) = 171.5 auf.

Zur Ermittlung der Adsorption von freiem und gebundenem Ergosterol an,,Kieselgel 15-urden Modellgemische aus Ergosterol und Ergosterolacetat. bzw. -palmitat, gelost in Athanol bzw. Erd- oldestillat der Siedegrenze von 513-633 K, eingesetzt.

Eine Trennung von freieni und gebrindeneni Ergosterol ist durch Elution der Ester niit Benzen und nachfolgende Ablosung des freien Ergosterols niit Methanol nioglich (Tab. 1 ) . Bei kohlrnwasserstoffhaltigen Lipidfraktionen niiissen die Kohlenwasser- stoffe vorher durch Elution mit n-HexanlBenzen (8O:ZO) abgetrennt werden (HILDE- BRANDT e t al. 1983). Bei Verwendung von Ergosterolpalinitat konnten die niit Ergoste- rolacetat erzielten Ergebnisse (Tab. 1 ) bestatigt werden.

Tabelle 1 Adsorption von Ergosterol und -acetat an Kieselgelsaulen Saulendurchmesser 10 cm: 10-15 e akt. Kieseleel in wHexan I I1

50 mg Ergosterol in 25 ml A7hanol 50 mg Ergosterolacetat in 25 ml Athanol) j e ml eingesetzt

I11

Nodell- n-HexunlBenzen Benzen Met h a n d gemisch 80/20 50150 1 0 0 ml 100 ml

100 mg Ergosterolacetat in 5 g Erdoldestillat, 250 mg eingesetzt - __ ~- ~

100 ml 100 ml . ~- _ ~ _ _ _ _ ~ _ _

-t - - - I 11 - - I + I1 - - 111 -

t - - ') t 2 )

- t

Wiederfin- dungsrate (%)

98 92

96 93'), 972)

f ergosterolhaltige Fraktion

S a c h H ~ M A I R I . (1965) ist fiir die vollstandige Erfassung des Ergosterols vor der Fiillung des Digitonids eine alkalische Verseifung erforderlich. Unsere Untersrichungen zeigten, daCl bei der Bestinimung des Ergosterols i n der Benzenfraktion auf die Vcr- seifung verzichtet werden kann (Tab. 2) .

n i e Anwendbarkeit der Methode wnrde an Lipidfraktionen uberpriift, deren Haupt- komponenten Phosphatide, Glyceride, Fettsaaren und tlw. Kohlenwasserstoffe

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Tabelle 2 Ergosterolgehalte in Benzenfraktionen

Lipidfra ktionen

Lipidfraktion von Lodderomyces elongisporus (C-Quelle: Erdoldestillat 513-633 K) Lodderomyces elongisporus + Ergo- sterolacetat Lipidfraktion von Candida sp. (C-Quelle: n-Alkan- Gemisch)

Gehalt an gebundenem Ergosterol (yo) ohne alkal. mit alkal. Hydrolyse Hydrolyse - ..

0,05 0,05

0,73 0,75

0,07 0,os

Tabelle 3 Verteilung von freiem und gebundenem Ergosterol in ausgewiihlten Lipidfraktionen I I1 I11 Lipidfraktion I + 0,81 Gew.-% Ergosterolacetat (= 0,73 Gew.-yo Ergosterol) I V Lipidfraktion aus Saccharomycopsis ZipoZytica (C-Quelle : n-Alkan-Gemisch) V

Lipid- Gesamt- Ergosterolverteilung

fraktion ergosterol freies gebundenes

Lipidfraktionen itus Lodderomyces elongisporus (C-Quelle: Erdoldestillat 513-633 K) Lipidfraktion aus Candida sp. (C-Quelle : n-Alkan-Gemisch)

Lipidfraktion aus Saccharomycopsis Zipolytica (C-Quelle : Glucose) - .____

____. ~~

_____ (YO) (70) (YO)

- ~~

I 0,6- 1,0 90-95 5-10 11 293 97 3 I11 1,6 55 45 I v 2,9 55 45 V 230 25 75

(Erdiildestillat der Siedegrenze 513-633 K bzw. n-Alkane der Kettenlange C,-C,,) waren. Der Gesamtergosterolgehalt in den untersuchten Gemischen lag dabei in1 Be- reich von 0,6 bis 2,9 Gew.-% (Tab. 3).

Der relative Fehler der Methode betragt 5 5 %. Bei Ergosterolwerten von <1 Gew-% in den Lipidfraktionen betragt die mittlere absolute Abweichung 5 0 , l Gew. - yo.

Die Untersuchringen der an Kieselgelsaulen getrennten Lipidfraktionen zeigten, daB - freies bzw. gebundenes Ergosterol >90% in der Benzen- bzw. Methanolfraktion

- Kohlenwasserstoffe, die die analytische Bestimmiing des Ergosterols storen, nicht

- eine Verseifung der Benzenfraktion vor der Pallung des Digitonidkoniplexes nicht notwendig ist.

Nach dcr beschriebenen l’rennung ist es ebenfalls nioglich, nach der LIEBERMANN- BuRcHARDT-Reaktion den Anteil an freiein und gebundenern Sterol qiiantitativ zu bestimmen.

wiedergefunden werden,

mehr in den polaren Fraktionen enthalten sind,

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Literatur

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Anschrift : Dr. €3. VOIGT, Institnt fiir technische Chemie der AdW, DDK-7050 Leipzig, Permoser- str. 15