Bioanalytik ~ o N t e r

DB 7 Bestimmung von iistrogenwirksamen Stilbenderivaten in Fleisch

H. W. Diirbeck und I. Bilker

Institut filr Angewandte Physikalische Chemie, Kernforschungsanlage Jiilich GmbH, Postfach 1913, D-5170 Jillich, Bundesrepublik Deutschland

Determination of Estrogen-Effective Stilbene Derivatives in Meat

Problemstellung. Die synthetischen 6strogenwirksamen Stilben- derivate Diethylstilbrstrol (DES), Dienrstrol (DIES) und Hex- 6strol (HEX) stimulieren die Protein-Biosynthese und spielen daher als effiziente Wirkstoffe zur Erhrhung des Krrperge- wichts von Schlachttieren (K/ilber, Puten, H/ihnchen) bzw. zur Verktirzung der Mastzeit eine wesentliche Rolle. Nach deut- schem Lebensmittelrecht ist die Anwendung bei Tieren jedoch grunds/itzlich verboten, da beim Verzehr von stilbrstrolhaltigen Nahrungsmitteln gesundheitliche Sch~idigungen auftreten krn- hen [1]. Auf Grund des derzeitigen Kenntnisstandes liegen die zu erwartenden Rilckstandskonzentrationen im nanomolaren Bereich, so dab fiir die notwendigen Kontrollen der gesetzlichen Regelungen sehr empfindliche und selektive Nachweisverfahren erforderlich sind. Die in Tabelle 1 zusammengefal3ten Daten verdeutlichen, dal3 gerade filr Rilckstandsbestimmungen in Fleisch (Muskelgewebe) sehr niedrige Bestimmungsgrenzen er- reicht werden milssen [2].

Tabelle 1. Erforderliche Nachweisgrenzen zur Bestimmung von Stilbrstrolen in Geweben und Krrperflilssigkeiten (Werte in gg/kg)

Muskel 0,02 Fett 0,05 Ham 2 Kot 5

Neben den histologischen und immunologischen (RIA, EIA) Methoden haben in jiingster Zeit chromatographische Verfah- ten - mit und ohne Massenspektrometerkopplung - zuneh- mend an Bedeutung gewonnen [3 - 5]. Diese Techniken ermrgli- chen die simultane und selektive Identifizierung der individuel- len Stilbrstrole und errffnen damit neue Mrglichkeiten zur Verbesserung der analytischen Sicherheit. Das nachfolgend skiz- zierte Verfahren basiert auf grundlegenden Untersuchungen zur Capillar-GC/MS-Bestimmung von DES [6] und ist durch eine besonders einfache Probenvorbereitung gekennzeichnet, so dab Kontaminationseffekte oder Substratverluste weitgehend elimi- niert werden.

Methodik. Die Stilbenderivate werden mit Diethylether im U1- traschallbad aus der homogenisierten biologischen Matrix (Fleisch, Fett) extrahiert und anschliel3end mit NaOH von den neutralen und basischen Co-Extrakten getrennt. Nach Neutrali- sation der w/il3rigen Phase und Rfickextraktion mit einem semi- polaren Lrsungsmittel (CH2Clz, Diethylether) wird der zur

Trockne gebrachte Rilckstand mit MSTFA/Hexan silyliert und nach einer Reaktionszeit von 30 min chromatographiert.

Chromatographische Bedingungen: 30-m-Quarz-Capillare (i. D. 0,32 ram) belegt mit DB-5. Temperaturprogramm: 2 min isotherm bei 80~ dann programmiert mit 30~ auf 185~ weiter mit 1,5~ auf 210~ und schliel31ich mit 10 ~ C/min auf 300 ~ C.

Massenspektrometrische Bedingungen: Quadrupolmassen- spektrometer mit ElektronenstoBionisation bei 70 eV und cycli- schem Massenscan.

Ergebnisse. Unter den angegebenen experimentellen Bedingun- gen werden cis-DES, trans-DES und Hexrstrol vollst/indig von- einander getrennt, wfihrend das kritische Substanzpaar trans- DES/Dienrstrol lediglich zu 75% aufgelrst ist. Dennoch erge- ben sich keine Probleme bei der massenspektrometrischen Iden- tifizierung der Einzelkomponenten. Die generelle Zuordnung und Bestimmung der Stilbrstrole erfolgt nach verschiedenen Modifikationen, die durch die jeweiligen Wirkstoffkonzentra- tionen bestimmt werden. Bei Konzentrationen oberhalb 2 ~tg/ kg geniigt die Fragmentographie charakteristischer Ionenmas- sen (m/z 412, 413,397, 383 fiir DES; m/z 410, 411,395, 381 fiir DIES und m/z 207 filr HEX) sowie die Peakfl/ichenintegration spezifischer Ionen-Chromatogramme. Demgegeniiber erfordern Bestimmungen im Konzentrationsbereich zwischen 0,05 und 0,5 gg/kg den ausschlieglichen Einsatz der Mehrfach- oder Ein- zelionendetektion (SIM, MIS, MID), wobei durch Halbmas- senscan bei konstanter Mel3zeit sowohl Nachweisgrenzen als auch Variationskoeffizienten nachhaltig verbessert werden krn- hen [7]. Zur Absicherung der Ergebnisse ist die zus/itzliche Er- mittlung spezifischer chromatographischer KenngrrBen sowie die Bestimmung der Intensit/itsverh/iltnisse selektiver Frag- mentmassen (z. B. m/z 412/413 fiir DES) unerl/il31ich. Fiir DES und Dienrstrol betrfigt die Nachweisgrenze etwa 0,05 gg/kg bei einer Standardabweichung yon + 35%. Hexrstrolbestimmun- gen im Bereich zwischen 0,05 und 0,5 gg/kg krnnen durch un- spezifische Interferenzen der Fragmentmasse 207 mit gravieren- den Fehlern behaftet sein und miissen daher grunds/itzlich durch Variation des Derivates (Heptafluorbutyrat) sowie durch Ande- rung der chromatographischen Bedingungen (S/iule: DB-1701) und des charakteristischen Fragmentions (m/z 331) abgesichert werden.

Literatur

1. McMartin KE, Kennedy KA, Greenspan P, Alam SN, Greiner P, Yam J (1978) J Environ Pathol Toxicol 1:279

2. Hoffmann B (1982) Fresenius Z Anal Chem 311:332 3. Verbeke R (1979) J Chromatogr 177:69 4. Bergner-Lang B, K/ichele M (1981) Dtsch Lebensmittel-

Rundschau 77: 305 5. Derks HJGM, Freudenthal J, Litjens JLM, Klaassen R,

Gramberg LG, Borrias-van Tongeren V (1983) Biomed Mass Spectrom 10: 209

6. Dfirbeck HW, Bilker I (1983) Fresenius Z Anal Chem 315:479

7. Dfirbeck HW, Bilker I (1984) Proc 2. Symposium on the Analysis of Steroids, Szeged 12.- 14. June

Fresenius Z Anal Chem (1985) 320:723 �9 Springer-Verlag 1985

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