Z. Lebensm. Unters. Forsch. 167, 87--92 (1978)

Zeitschrift flJr

Lebensmittel- Untersuchung.

und-Forschung @ J. F. Bergmann Verlag 1978

Bestimmung von reduziertem und oxydiertem Glutathion in Weizenmehlen und -teigen * **

Franziska Weber und Werner Grosch Kurt-Hess-Institut fiir MehI- und Eiweil3forschung, Deutsche Forschungsanstalt fiir Lebensmittelchemie, D-8046 Garching, Bundesrepublik Deutschland

Determination of Reduced and Oxidised Glutathione in Wheat Flours and Doughs

Summary. A quantitative method for the analysis of reduced (GSH) and oxidised (GSSG) glutathione in cereals has been developed. The steps are: Extraction of the flour or dough and carboxymethylation of GSH, gel filtration on Sephadex G-50, chromatogra- phy on Dowex 50 WX8 and after basic cleavage deter- mination of the separated GSSG with 5,5'-dithio- bis(2-nitrobenzoic acid), separation of carboxymethy- lated GSH on Dowex 1X8 and determination with 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid. When analysing for the amount of GSH and GSSG in flours of three varie- ties of wheat the former ranged from 0.27 to 0.46 gmol/g and the latter from 0.26 to 0.38 lamol/g. After kneading for 5 min to a dough the GSH disap- peared with a corresponding increase in GSSG.

Zusammenfassnng. Fiir die quantitative Analyse yon reduziertem (GSH) und oxydiertem (GSSG) Gluta- thion in Cerealien wurde das folgende Verfahren ent- wickelt: Extraktion eines Mehles oder Teigs und Carb- oxymethylierung des GSH, Gelfiltration an Sephadex G-50, Chromatographie an Dowex 50 WX8 und nach alkalischer Spaltung Bestimmung des abgetrennten GSSG mit 5,5'-Dithio-bis(2-nitrobenzoes~iure), Ab- trennung des carboxymethylierten GSH an Dowex 1X8 und Bestimmung mit 2,4,6-Trinitrobenzoesulfon- s~iure. In drei Sorten von Weizenmehlen wurden 0 ,274,46 ~tmol/g GSH und 0,264,38 gmol/g GSSG gefunden. Beim Kneten (5 min) verschwand das GSH und das GSSG nahm entsprechend zu.

* Herrn Prof. Dr. L.Acker zu seinem 65. Geburtstag gewidmet ** Wir danken der AIF und dem Forschungskreis der Ern~ih- rungsindustrie fdr die f'manzielle Untersttitzung der Arbeit. Frl. Ch. Hopfer danken wir fiir die geschickte experimentelle Mitar - beit

Reduziertes (GSH) und oxydiertes Glutathion (GSSG) k6nnen die rheologischen Eigenschaften eines Teigs sehr wesentlich beeinflus- sen [1--3, 13]. Steigende Zus~itze erniedrigen die Stabilit~it und fiihren zu einer Abnahme der Knettolerenz, wobei das GSH wirksa- mer ist als das GSSG [2, 3]. Zur Erkl~irung der Effekte wird ange- nommen, dab die hochmolekularen Proteinmolekiile des Klebers durch Reduktion bzw. Disulfid-Austausch vom Glutathion gespal- ten werden [17].

In den ersten Versuchen zum Nachweis und zur quantitativen Analyse wurden an GSH 2--30 nmol/g und GSH + GSSG, 0,26-- 0,32 ~tmol/g (berechnet als GSH) gefunden [4]. An dem bier ange- wandten Bestimmungsverfahren (gelchromatographische Tren- hung, Alloxan-Test) wurde die ungeniigende Spezifitgt der Alloxan- Reaktion kritisiert. Dieser Mangel wurde durch eine getrennte enzy- matische Erfassung yon GSH und GSSG beseitigt [5, 6]. Eine Ana- lyse yon Mehlen aus zehn australischen Weizensorten ergab bei Anwendung des neuen Verfahrens 34~132 nmol/g GSH und 14-- 47 nmol/g GSSG [7].

Be~ der Ausfiihrung der enzymatischen Analysen werden das GSH und das GSSG mit den wasserl6slichen Verbindungen des Mehls extrahiert [5]. Diese Arbeitsweise begtinstigt mSglicherweise die oben erwghnten Reaktionen zwischen den Kleberproteinen und den Formen des Glutathions. Ver/inderungen im GSH- und GSSG- Gehalt wg.ren die Folge. Damit die Analysenwerte dutch solche Reaktionen nicht verf~ilscht werden kSnnen, ist somit eine sofortige Derivatisierung des GSH w~ihrend der Extraktion erforderlich. Da- von ausgehend haben wir ein Verfahren entwickelt, das die ge- trennte Erfassung von GSH und yon GSSG gestattet.

Experimenteller Teil

Material und Reagentien

Weizenmehle 1 der Ernte 1976 (Typen und Sorten in Tab. 4); oxy- diertes (GSSG) und reduziertes Glutathion (GSH), 2,4,6-Trinitro- benzolsulfons~iure (TNBS), Dowex 50 WX8 (200--400 mesh), Do- wex 1X8 ( 2 0 0 4 0 0 mesh), Coomassie Brillant Blue G-250, 5,5'-Di- thio-bis(2-nitrobenzoes~ure) (DTNB) yon Serva. NADPH-Na4 (Reinheitsgrad II) und Glutathion-Reduktase (Suspension: 1 mg/ ml) yon Boehringer, Mannheim. Sephadex G 50 (medium) und G 10 von Pharmacia. Alle weiteren Reagentien waren Substanzen pro. anal. der Fa. Merck. Wasser: bidest. Qualit~it.

1 Wir danken Herrn Dr. Jodlbauer (Fa. Kampffmeyer Mtihlen- vereinigung KG) far die Bereitstellung der Mehle

0044-3026/78/0167/0087/$01.20

0,3

0,1

i , , ,

10 20 30 ~0

F. Weber und W. Grosch: Bestimmung von reduziertem und oxydiertem Glutathion in Weizenmehlen und -teigen 88

Ea~2

0.5

nmo[ GSSG/ml Neftl6sung

Abb. 1. Eichgerade zur Ermittlung der GSSG-Konzentration mit dem DTNB-Test

E 340

0,5

0,3

0.1

i = i i

20 40 60 80 nmo[ GSCH2COOH/ml Mefl[~sung -~

Abb. 2. Eichgerade zur Ermittlung der GSCH2COOH-Konzen- tration mit dem TNBS-Test

E3ao

0,5

03

0,1 ~ °

io io 3'0 so nmo[ OSO3H/m[ Mel~16sung =

Abb. 3. Eichgerade zur Ermittlung der Glutathions~iure-Konzen- tration mit dem TNBS-Test

E340

0.30 -

0,20

0.10 10 20

(rain)

Abb. 4. Versuch zur enzymatischen Bestimmung yon GSSG in Mehlen. Im Ansatz: 0,5 ml Mehlextrakt, 2,6 ml 0,05 m-Na-Phosphat- Puffer pH 7,0, 25 pmol EDTA-Na2, 1 mg NADPH. Extrakte aus A - - A Benno, 0 - - 0 KoIibri, © - - © CWRS, & - - A Jubilar

Methoden

Chemisehe Bestimmungsverfahren

Proteinbestimmung mit Coomassie Brilliant Blue G-250 nach Brad- ford [8]; Peptide und Petidderivate mit TNBS nach Mokrash [9], wobei die Boraxl6sung durch 0,2 m-Na-Boratpuffer pH 8,5 ersetzt wurde (vgl. Abb. 9). GSSG-Bestimmung mit DTNB nach Anderson u. Wetlaufer [10]. Aminos~iure-Analyse: Die Proben in 6n-HC1 bei l l 0 °C (Wasserstrahlpumpenvakuum) 22 Std hydrolysieren; Ana- lyse mit dem automatischen Analysator ,,Multichrom" der Fa. Beckman Instruments.

Enzymatische Analyse des GSSG

5 g Mehl entsprechend den Angaben von Hird et al. [6] mit 10 ml 0,05 m-Na-Phosphat-Puffer pH 7,0 bzw. 6,0, der 10 mmol EDTA- Na 2 enth~lt, 15min extrahieren. Nach Zentrifugation (10000g; 15 rain) Uberstand druckfiltrieren (Sartorius Membranfilter: 0,6 gin) - - Enzymtest nach Bernt u. Bergmeyer [11] ausffihren. Im Ansatz: 2,5 ml 0,05 m-Na-Phosphat-Puffer, pH 7,0 bzw. 6,0, der 10 mmol EDTA-Na2 enthglt; 0,5 ml Mehlextrakt; 0,1 ml NADPH (10 mg/ml) und 0,01 ml Glutathion-Reduktase (Suspension: 1:10 verdfinnt).

Darstellung yon Carboxymethylglutathion (GSCH2COOH)

Zu 0,75 g (4,0 mmol) Jodessigs~iure gel6st in 180 ml Wasser bei pH 9 (0,1 n-NaOH) eine L6sung von 1 g (3,3 retool) GSH in 20 ml Wasser (pH 9) unter pH-stat-Bedingungen (pH 9) tropfen. Nach 30 rain bei Zimmertemperatur die Mischung mit verd. HC1 neutralisieren und das Wasser im Vakuum bei 30 ° C abziehen. Rfickstand in 2--3 ml Wasser 16sen und in drei Portionen fiber Sephadex G10 (26 x 2,5 cm) mit Wasser als Eluenten chromatographieren. Durch Reaktion mit TNBS im Eluat das GSCHzCOOH lokalisieren, Was- set im Vakuum bei 30°C abziehen, Riickstand in wenig Wasser 16sen und das Derivat dutch Zugabe yon )kthanol ausf~illen. Nach Hydrolyse mit 6 n-HC1 den GSCH2COOH-Gehalt des Priiparates durch Aminosiiure-Analyse ermitteln.

Diinnschichtchromatographie yon GSSG und GSCH 2 COOH

Sie erfolgte nach Anderson u. Wetlaufer [10] auf Kiesetgel (0,5 ram) mit n-Butanol/Eisessig/Wasser (70 + 50 + 20;v/v/v) als Laufmittel.

Getrennte Bestimmun9 yon GSH und GSSG (Verfahren I)

Extraktions-Puffer: In 200 ml Wasser 2,4g Tris (0,1 tool/l), 0,15 g KC1 (0,01 tool/l), 96,8 g Harnstoff (Stool/I), 0,2rag EDTA-Na; (2,7 p.mol/1) und 60 mg Jodessigs~iure (1,6 retool/l) 16sen, den pH- Wert mit verd. HC1 auf 8,5 einstellen und 15 rain mit N2 spfilen.

Extraktion und Derivatisierung der SH-Verb.: In einen Zentri- fugenbecher aus Polyiithylen 5 g Mehl einwiegen, 50 ml Extrak- tionspuffer hinzupipettieren, eine Glaskugel (~Z : 2,5 cm) hinzugeben und das verschlossene Gerbil3 1 Std intensiv schfitteln (Schfittelma- schine ,,Turbula" der Fa. W.A. Bachhofen, Basel). Nach Zentrifuga- tion (10000g; 20min) ()berstand abdekantieren und Rtickstand noch zweimal mitje 50 ml Extraktionspuffer extrahieren.

Gelfiltration

Sephadex G 50 (medium) in 0,4% Essigsiiure, die 0,02% Na-Azid enthiilt, quellen und S~iule (3 x 84 cm) ftillen. Mehlextrakt (ca. 120 ml) aufgeben und mit genannter Essigsiiure-Lsg. eluieren (1 ml/ rain). Fraktionen (A 10 ml) sammeln, im Eluat Proteingipfel mit Coomassie Brillant Blue und Glutathion-Gipfel durch Reaktion mit TNBS lokalisieren.

F.Weber und W. Grosch: Bestimmung yon reduziertem und oxydiertem Glutathion in Weizemnehlen und -teigen 89

Kationenaustausch-Chromatographie

S~ittIe (0,9 x 6 cm) mit Dowes.50 WX8 (H+-Form), suspendiert in Wasser, fiillen. Glutathiongipfel yon der Gelfiltration (9/1 o jeder Fraktion; insgesamt etwa 220 ml) nach Einstellung yon pH 1,5 mit 2,5 n-HCI aufgeben. Nacheinander eluieren (1,5 ml/min) mit 100 ml 0,2 n-HC1, 50 ml 0,5 n-HC1, 100 ml n-HC1, 100 ml 2,5 n-HC1, 300 ml 6 n-HC1 und Wasser bis zur neutraleu Reaktion. Fraktionen (3,1 ml) sammeln und TNBS-Test zur Lokalisierung des GSSG- und GSCHz-COOH-Gipfels ausfiihren.

GSSG-Bestimmun 9

64,5% des GSSG-Gipfels (2 ml jeder Fraktion) mit verd. NaOH neutralisieren und im Vakuum auf 20 ml einengen. DTNB-Test aus- fiihren. Auswertung mit Hilfe der in Abb. 1 dargestellten Eiehgera- den.

Anionenaustausch-Chromatographie

Mit einem fltichtigen Athylmorpholin/Picolin/Pyridin/Essigsgure- Puffer pH 6,4, der nach Angaben yon Schroeder [12] hergestellt worden war, Dowex 1X8 ~iquilibrieren und damit S~iule (1 x 85 cm) fallen. Von 64,5% des GSCH2COOH-Gipfels (2 ml jeder Fraktion) nach der Kationenaustausch-Chromatographie die Salzs~iure im Va- kuum abziehen, Riickstand in 11 ml Puffer pH 6,4 16sen und 10 ml auf die S~iule pipettieren. Elution (1 ml/min) bei 40 ° C mit 100 ml Puffer pH 6,4 und 300 ml 0,5 n-Essigs~iure. Fraktionen (4,5 ml) sam- meln und GSCH2COOH-Gipfel mit TNBS-Test lokalisieren,

GSCH 2 COO H-Bestimmun9

67% des gesammelten GSCH2COOH-Gipfels (3 ml jeder Fraktion) im Vakuum zur Trockene einengen und in 10 ml Wasser 15sen. TNBS-Test ausfiihren. Auswertung mit Hilfe der in Abb. 2 darge- stellten Eichgeraden.

Bestimmung yon GSH und GSSG als Glumthionsi~ure (Verfahren II)

Extraktion und Oxydation: 5 g Mehl 3 mal mit dem Tris/HCl/Harn- stoff-Puffer 8,5 (ohne JCH2COOH ) extrahieren und Extrakt an Se- phadex G 50 und Dowex 50X8 chromatographieren, wie im Analy- sengang I beschrieben. Je 64% GSSG- trod GSH-Gipfels vereinigen, im Vakuum bei 30 ° C zur Trockene einengen und nach Zugabe yon 1,4ml Ameisens~ure + 0,1 ml 30% H202 oxydieren [14]. Nach 30 min bei Zimmertemperatur das iiberschiissige Reagens unter mehrmaligem Verdiinnen mit Wasser im Vakuum bei 30 ° C abde- stillieren. Riickstand in 2,5ml 0,2m-Monochloressigsiiure-Puffer pH 3,416sen. Chromatographie nach Coventry et al. [15]: 2 ml (80%) der Probe auf Sgule (0,9 x 25 cm) mit Dowex 1X8 (200400 mesh) in 0,2 m- Monochloressigsiiure-Puffer pH 3,4 pipettiereu. Bei Zimmertempe- ratur mit demselben Puffer eluieren und Fraktionen ~ 6,2 ml sam- meln. Gipfel der Glutathionsg.ure mit dem TNBS-Test lokalisieren. 64% des Gipfels (4 ml jeder Fraktion) vereinigen, mit verd. NaOH neutralisieren und mit dem TNBS-Test die Konzentration bestim- men (Eichgerade in Abb. 3).

Ergebnisse und Diskussion

Versuche zur enzymat i sehen Bes t immung des G S S G , die bei p H 7,0 und p H 6,0 ausgefi ihrt wurden, ergaben, d a b schon vor d e m Zusa tz der G l u t a t h i o n - R e d u k t a s e eine O x y d a t i o n des N A D P H durch den M e h l e x t r a k t s ta t t f indet (Abb. 4). Auff~illig ist dabe i die hohe

Tabelle 1. Verfahren zur quantitativen Analyse von GSH (als GSCH2COOH) und GSSG im Mehl

1. Extraktion: 5 g Mehl + Puffer pH 8,5 + Harnstoff+ Jodessigsiiure 2. Gelfiltration (Sephadex G 50): Abtrenuung der Proteine 3. Kationen-A. (Dowex 50 WXS): Abtrennung des GSSG 4. Quantitative Bestimmung des GSSG: Reaktion mit 5,5'-Dithio-

bis(2-nitr obenzoes~iur e) (DTNB-Test) 5. Anionen-A. (Dowex 1X8): Abtrennung des GSCH2COOH 6. Quantitative Bestimmung des GSCHzCOOH: Reaktion mit

2,4,6-Trinitr obenzolsulfons~iure (TNBS-Test)

Tabelle 2. Erfassung yon GSH und GSSG bei den einzelnen Extraktionsschritten (Mehl der Sorte ,,Benno")

Schritte GSH GSSG gmol/g btmol/g

1. Extraktion 0,46 0,24 1. + 2. Extraktion 0,46 0,35 3. Extraktion <0,05 <0,05

Aktivit~it der Sor te , ,Jubilar". Insgesamt verst~irkt dieses Ergebnis die in der Ein le i tung ge~iugerten Bedenken gegen eine enzymat i sche Ana lyse des Glu ta th ions .

Zu r schnellen Der iva t i s i e rung des G S H fiir eine chemische Ana lyse b ie te t sich u.a. d ie Jodessigs~iure an. Vorversuche ha t t en ergeben, d a b sie zur Best im- mung der n i ede rmoleku la r en SH -Pe p t i de im Meh l besser geeignet ist (kiirzere Reakt ionsze i t , h t ihere Aus- beute) als das 4-Vinylpyr id in , obwoh l die C a r b o x y m e - thy l -Der iva te eine gewisse Instabilit~it aufweisen [16]. Z u den wei teren Schr i t ten des Analysenverfahrens , das in Tab. 1 zusammenges te l l t ist, einige Bemerkungen .

Ext rak t ion

Z u r Uberpr t i fung, ob drei E x t r a k t i one n zur Erfassung der be iden G l u t a t h i o n - F o r m e n ausreichen, wurde ein Meh l (Sorte , ,Benno") gestuft extrahier t . Tabe l le 2 zeigt Unte r sch iede im Verha l ten des G S H und G S S G : W~ihrend die S H - V e r b i n d u n g schon be im ersten M a l wei tgehend ext rahier t wird, m u g fiir die Bes t immung des Disulf ids dieser Arbe i t s schr i t t zumindes t wieder- hol t werden. D a m i t bei j ede r M e h l s o r t e eine vollst~in- dige Erfassung der Ve rb indungen gew~ihrleistet ist, ha l ten wir eine dre imal ige E x t r a k t i on ftir erforderl ich.

Gelfiltration

Vor der Aufgabe auf die Sephadex G-50-S~iule ist eine K o n z e n t r i e r u n g der vere in ig ten Ex t r ak te nicht zu empfehlen: Ver lus te an G l u t a t h i o n wurden beob- achtet . D u r c h die Gel f i l t r a t ion werden die wasser- 16slichen Pro te ine von den G l u t a t h i o n e n und an- deren n i ede rmoleku la r en Verb indungen abget rennt . G S C H 2 C O O H und G S S H werden gemeinsam eluiert.

90 F. Weber und W. Grosch: Bestimmung yon reduziertem und oxydiertem Glutathion in Weizenmehlen und -teigen

0,5N HCL'-~I 1N HCL II 2,5N H C L - -

E 340 0,5 Cystin

GSSG / / ~ A / / GSCH2COOH o,/U

0,1

150 200 250 300 E t u a t (ml)

Abb. 5. Chromatographic yon GSH (3 ~mol), Cystin (2,5 ~unol), GSCH2COOH (3 gin•l) und GSSG (2 gmol) am Kationenaus- tauscher Dowcx 50 WX 8

E34o

Puffer -- pH 6,Z,--II

0 , 3 -

0,2-

0,I-

i

5O

0,5N C H 3 C O O H - -

(1) (2)

i - l ~ l - i

150 250 Etuat (m[)

(3)

A - - t - - t

350

Abb. 8. Chromatographie eines Mehlextraktes (,,Benno") am An- ionen-Austauscher Dowex 1X8. - - Extraktion des Mehles in Gegen- wart • - - 0 und in Abwesenheit A - - A yon Jodcssigs~ure

0,5N HCL-~t 1N HCL It 2,5N HCL

E3~o[ 2

0,2 1 1 o,+L/- , J

150 200 250 300 E l u a t ( m l )

Abb. 6. Chromatographic eines Mehlextraktes (Benno) am Kat- ionenaustauscher Dowex 50 WX8

E340 Puffer

- - p H 6./,~1 0,5

0,3

0,1

0,5N C H 3 C O O H . - -

GSCH2COOH

Cystin GSH

GSCH2COOH/ox.

j i i

100 200 30O Etuctt (mr) . =

Abb. 7. Chromatographic yon GSH (3 gmol), Cystin (2,5/am•l), GSCH2COOH (3 lUllol) und mit CH3COOH/H202 oxydiertem GSCHzCOOH am Anionenaustauscher Dowex 1X8

Eine Differenzierung von den Proteinen erfolgt durch die Anffirbung mit Coomassie Blue, da die Peptide, die fiber die TNBS-Reaktion nachgewiesen werden, hier nicht reagieren.

Chromatographic am Kationenaustauscher

Ein Teil des Eluates vonder Gels/iule, der die beiden Glutathione enth~ilt, wird ohne Konzentrierung chro-

E 340 0,5

o3 +__], 0.1

i

7 9 11 pH

Abb. 9. pH-Abhiingigkeit des TNBS-Testes. -- • • - - • GSSG (14 nmol/ml), ( 3 - - 0 ohnc GSSG

E3~o

CysSO3H +

GSCH2COOH/ox.

0.3 0.2 0,1

i

50 100 150 E l u a t ( m t ) ,.

Abb. 10. Chromatographic von CysSO3H (3 gin•l), GSCH2COOH (3 j.tmol) oxydiert mit H202/CH3COOH und GSO3H (3 gin•l) an Dowex 1X8 nach Coventry et al. (15)

matographiert. Abgetrennt wird das GSSG (Abb. 5). Mehlextrakte ergaben zwei Fraktionen (Abb. 6). Frak- tion 1 verhielt sich diinnschichtchromatographisch wie GSSG (Rf: 0,18). Die quantitative Bestimmung des GSSG erfolgte photometrisch durch Reaktion mit DTNB. Nach alkalischer Spaltung werden dabei auch Disulfide erfal3t und zwar mit unterschiedlicher Inten- sit,it [10].. So reagiert z.B. das GSSG wesentlich emp-

F. Weber und W. Grosch: Bestimmung yon reduziertem und oxydiertem Glutathion in Weizenmehlen und -teigen .91

findlicher als das Cystin. Das Eluat yon der Sephadex G-50-S~iule enth~ilt u.a. auch noch Harnstoff. Er wird am Kationenaustauscher im Anschlug an das GSCH2COOH eluiert.

Tabelle 3. Analyse von GSH/GSSG-Gemischen

Eingesetzt ~u-n ol Wiedergefunden gmol

GSH GSSG GSH GSSG

3,3 3,3 3,3 3,5 3,3 1,6 3,0 1,6 6,5 6,5 6,4 7,1

Tabelle4. Analyse von Weizenmehlen und-teigen

Material Weizensorte

Chromatographie am Anionenaustauscher

Der 2. Gipfel aus dem Mehlextrakt, der im Chromato- gramm (Abb. 6) die Position des GSCH2COOH bzw. Cystins einnimmt, enth~ilt noch Begleitstoffe. Eine Ab- trennung erfolgte an Dowex 1X8 (Abb. 8). Ein Ver- gleich mit einem Probelauf, der zur Bestimmung der Elutionsvolumina von hier interessierenden Verbin- dungen durchgeftihrt worden war (Abb. 7) zeigt, dab bei der Extraktion des Mehles in Gegenwart von Jod- essigs~iure ein Gipfel (Nr. 2 in Abb. 8) mit dem Reten- tionsvolumen des GSCH2COOH auftritt. Fehlt bei der Extraktion das SH-Reagens, dann fehlt Gipfel 2 und es erscheint mit ktirzerer Retention eine andere Substanz (Nr. 1 in Abb. 8).

Die quantitative Bestimmung des GSCHzCOOH erfolgte mit dem TNBS-Test. Er wurde bei pH 8,5 durchgefiihrt, da hier nach Abzug des stark pH-ab- h~ingigen Reagentienblindwertes (Abb. 9) die h6chste Farbausbeute erzielt wird.

Erprobun9 des Analysenverfahrens

Durch Analysen einer Reihe von GSH/GSSG-Gemi- schen wurde die Methode eingearbeitet. Wiedergefun- den wurden von jeder Verbindung 90--105% der ein- gesetzten Mengen, die im Bereich 1,5--7 ~tmol lagen (Tab. 3).

Eine Erprobung des Verfahrens an Mehlen dreier Weizensorten ergab sehr viel h6here Glutathion-Kon- zentrationen als bisher ftir Weizenmehle gefunden worden sind (Tab. 4). Die h6chste GSH-Konzentration wurde in der Sorte ,,Benno" nachgewiesen, gefolgt von ,,CWRS" trod ,,Kolibri". Die beiden zuletzt genannten Sorten enthalten GSG und GSSG im molaren Ver- h~ltnis von 1 : 1, w/ihrend im ,,Benno" die GSH- deut- lich tiber der GSSG-Konzentration liegt.

Zur Oberprtifung der Analysenergebnisse wurde zun/ichst in den drei Mehlsorten die Summe aus GSH + GSSG durch Perameisens~iure-Oxydation (Analysengang II) und chromatographische Abtren- nung des entstandenen GSO3H (Testchromatogramm in Abb. 10) bestimmt (Tab. 4). Ein Vergleich der gefun- denen mit den Mengen an GSO3H, die sich aus einer Umrechnung der in Tab. 4 angegebenen GSH- und GSSG-Konzentrationen ergeben, zeigt eine befriedi- gende Obereinstimmung der Werte.

Zur weiteren Kontrolle des Analysengangs I wur- den Proben der Sorten ,,Benno" und ,,CWRS" analy- siert, denen beide Formen des Glutathions zugesetzt worden waren (Tab. 5). Werden die gefundenen um die

,,Benno" ,,CWRS" ,,Kolibri" Type 405 Type 405 Type 405

I. Mehle GSH gmol/g 0,46 GSSG ~tmol/g 0,37 GSO3H gmol/g 1,45 (1,20) ~

II. Teig A b GSH n.n. GSSG gmol/g 0,66

III. Teig B b GSH gmol/g 0,29 GSSG gmol/g 0,48

0,38 0,27 0,38 0,26 1,14 (1,14) a 0,75 (0,78)"

n.n. n.n. 0,52 0,44

a Zum Vergleich sind die Ergebnisse aus der getrennten Analyse von GSH und GSSG auf GSO3H umgerechnet und in () ange- geben b Teig A: 5g Mehl nach Zugabe yon 2,5ml Wasser 5rain geknetet und dann sofort, wie im Analysengang I beschrieben, extrahiert. Teig B : Wie Teig A, doch Reduktion der Knetzeit auf 2 rain n. n. : nicht nachweisbar

Tabelle 5. Analyse yon Mehlen mit Zus~tzen yon GSH und GSSG

Sorte/Zusatz GSH GSSG gmol/g ~arnol/g

,,Benno" mit 0,44 grnol/g GSH u. 0,32 ~tmoi/g GSSG 0,88 (0,44) a 0,72 (0,40) ,CWRS" mit 0,32 gmol/g GSH u. 0,32 gmol/g GSSG 0,72 (0,40) 0,67 (0,35)

a Eine Verminderung der gefundenen Mengen um die Zusgtze ergibt die Werte in ( )

zugesetzten Mengen gemindert, so resultieren GSH- und GSSG-Werte, die in guter N~iherung mit denen tibereinstimmen, die in Tab. 4 fiir die beiden Mehlsor- ten angegeben sind. Auch dieses Ergebnis beweist die Brauchbarkeit des entwickelten Verfahrens.

Die Erfassungsgrenze der Methode liegt bei 0,25 gmol GSSG bzw. GSH; d.h. bei einer Einwaage yon 5 g Mehl k6nnen noch 0,05 ktmol/g GSSG bzw. GSH nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit kann noch gesteigert werden, u.a. durch Ausfiihrung des TNBS-Testes in einem UberschuB von Sulfit [18].

92 F. Weber und W, Grosch: Bestimmung von reduziertem und oxydiertem Glutathion in Weizenmehlen und -teigen

Vergmderungen im GSH- und GSSG-Gehah bei der Teig- bereitung

Teige, die ohne weitere Zus/itze aus den drei Mehlsor- ten hergestellt worden waren, wurden mit dem Verfah- ren I analysiert. Nach einer Reaktionsdauer von nur 5 rain konnte kein GSH mehr nachgewiesen werden, doch hatte die GSSG-Konzentration entsprechend zugenommen (Tab. 4). Bei einer Verkiirzung der Knet- dauer auf 2 min (Sorte ,,Benno" in Tab. 4) waren erst etwa 40% des vorhandenen GSH zttm GSSG oxy- diert. Gegenw~irtig tmtersuchen wir, inwieweit ein Di- sulfid-Austausch mit Klebeproteinen oder andere Oxydationsreaktionen an der raschen Umwandlung des GSH zum GSSG beteiligt sind.

Literatur

1. Ziegler, E.: Cereal Chem. 17, 551 (1940) 2. Frater, R., Hird, F.J.R.: Biochem. J. 88, 100 (1963) 3. Kuninori, T., Sullivan, B.: Cereal Chem. 45, 486 (1968) 4. Kuninori, T., Matsumoto, H. : Cereal Chem. 41, 252 (1964)

5. Davidson, B.E., Hord, F.J.R.: Biochem. J. 93, 232 (1964) 6. Hird, F.J.R., Croker, J.W.D., Jones, W.L.: J. Sci. Food Agric.

19, 602 (1968) 7. Archer, M. J.: J. Sci. Food Agric. 23, 485 (1972) 8. Bradford, C.M.: Anal. Biochem. 72, 248 (1976) 9. Mokrash, L.C.: Anal. Biochem. 18, 64 (1967)

10. Anderson, W.L., Wetlaufer, D.B.: Anal. Biochem. 67, 493 (1975) 11. Bernt, E., Bergmeyer, H. U.: Methoden der enzymatischen Ana-

lyse. 2. Aufl. S. 1605. Weilheim: Verlag Chemie 1970 12. Schroeder, W.A.: Separation of peptides by chromatography of

Dowex 1 with volatile developers. In: Methods of Enzymology, Bd. XI, p. 361, New York: Academic Press 1967

13. Bloksma, A.WH. : Cereal Chem. 49, 104 (1972) 14. Hirs, C.H.W.: Performic acid oxidation. In: Methods of En-

zymology, Bd. XI, p. 197. New York: Academic Press 1967 15. Coventry, D.R., Carnegie, P.R., Jones,J.K.: J. Sci. Food Agric.

23, 587 (1972) 16. Gurd, F.R.N.: Carboxymethylation. In: Methods of EnzymoI6-

gy, Bd. XI, p. 532. New York: Academic Press 1967 17. Ewart, J.A.D.: J. Sci. Food Agric. 28, 191 (1977) 18. Fields, R.: Biochem. J. 124, 581 (1971)

Eingegangen am 9. Januar 1978