Aus dem Physiologischen Laboratorium der I. G. Farbenindustrie A.-G., Werk Wupper~al Elberfeld.

Beziehungen zwischen chemischer Form und Wirksamkeit yon Vitamin A in den Konzentraten aus

Fischleberiilen. Ein B e i t r a g zur A u s w e r t u n g von V i t a m i n A - P r ~ p a r a t e n .

Von Dr. W. Grab.

Mit 2 Textabbildungen.

(E4ngegangen am. 15. Juni 1939.)

Einleitung und Fragestellung.

Die chemische Natur des Vitamin A ist dutch die Untersuchungen von K a r r e r sowie H e i l b r o n schon in den Jghren 1931/32 anfgekl~rt, worden, und die aufgestellte Konstitutionsformel wurde gesichert dutch die Dar- stellung und Identifizierung des natiirlichen und synthetischen Perhydro- Vitamin A, sowie durch die erst kiirzlich gelungene Synthese des Vitamin A selbst (1). Auch seine physiologisehe Bedeutung im Organismus ist heute in grol~en Ziigen bekannt und seine biologischen Wirkungen im einzelnen vielfach untersucht (2). Man k(innte glauben, dal~ damit auch alle Fragen der mengenm~13igen Bestimmung yon Vitamin A mit chemischen und biologischen Verfahren .v611ig geklgrt w~ren, zumal durch die ,,Internationale Konferenz zur Standardisierung yon Vitaminen" schon 1931 und 1934 besondere Richtlinien herausgegeben worden sind, die die Auswertung yon Vitamin A-PrS,paraten auf eine einheitliche Grundlage stellen sollten (3).

In diesen yon den erfahrenen Vitaminfachleuten ausgearbeiteten Riehtlinien wird festgelegt, dal~ die Wirksamkeit yon Vitamin A-Pr~paraten dutch Vergleich mit einer internationalen Standardsubstanz ermittelt werden soll, und die i n t e r n a t i o n a l e E i n h e i t wird definlert als ,,die Vitamin A-Wirksamke i t yon 0,67 des internationalen Standard- prgparates; eine solche Einheit ist enthalten in 0,6~ (0,6 Mikrogramm) yon reinem fl-Carotin".

Die Grundlage fiir die Auswertung von Vitamin A bildet also die Fest- stellung seiner Wirksamkeit, die natiirlich einzig durch einen biologischen Versuch erfal]t werden kann.

Die pharmakologische Bestimmung der VitaminA-Wirkung im b io log ischen Versuch besteht gew6hnlieh darin, dal~ man das Vitamin A

Beziehungen zwischen chemischer Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 171

zum ,,limitierenden Faktor" im Stoffwechsel werden l~l]t und nun die Wir- kungen bekannter Zulagen yon Vitamin A quantitativ ausmil]t. Die Durch- ftihrung solcher Versuche ist miihevoll, langwierig und kostspielig. Selbst- versti~ndlich erfaltt der Tierversuch abet auch alle Stoffe, die im Organismus eine Vitamin A-Wirksamkeit entfalten kSnnen, ohne Riicksicht auf ihre chemische Natur, also z.B. auch die Carotine (4--7).

Da das Vitamin A neben seiner biologischen Wirksamkeit auch noch einzelne besonders charakteristische physikalische und chemische Eigen- schaften besitzt, hat man auch diese sdhon friihzeitig zu seinem Nach- weis herangezogen und zwei weitere gerfahren ausgearbeitet, die -- mit gewissen Einschrgnkungen- auch Riickschliisse anf die Menge des vorhandenen Vitamin A in einem UntersnchUngsma}erial zulassen.

Die p h y s i k a l i s c h e Messung des Gehalts an Vitamin A benutzt die ,,Farbe" des reinen Vitamin A, die sich aus seiner geringen Durchlgssigkeit fiir nltraviolettes Licht ergibt. Man mi•t spektrophotometrisch die Licht- absorption der zu priifenden L6sungen bei dem far Vitamin A charak- teristischen Maximum yon 328 m# und driickt dieses Megergebnis zweck- m~tgig im spezifischen Extinktionskoeffizienten E aus. Der Extinktions- koeffizient gibt ja bekanntlich einen Anhaltspunkt fiber die Konzentration

eines lichtabsorbierenden Stoffes in einer LSsung (8--11). Die chemische Messung des Gehalts an Vitamin A benutzt die be-

kannte Carr-Price-Reaktion, bei der in Gegenwart yon Vita.min A durch den Zusatz yon Antimontrichlorid eine tiefblaue Fgrbung entsteht. Durch konventionelle Festlegung einiger Einzelheiten dieses Verfahrens ist es mSglich geworden, auch mit dieser dritten Versuchsanordnung quanti- tative Unterschiede im Vitamin A-Gehalt zu erfassen (12, 13).

Man kSnnte nun meinen, dal~ dutch die beiden verhaltnismg:l~ig ein- fachen ehemischen und physikalischen Verfahren der Nachweis yon Vitamin A besonders leicht und genau mSglich wgre; dabei darf man aber nicht vergessen, dal~ das Vitamin A ja praktisch hie rein vorliegt, sondern stets neben e~ner mehr oder weniger grol]en Menge yon Begleitsubstanzen nachgewiesen werden mull; und gerade dabei macht sich nun der wesent- lichste Nac~hteil der physikalischen trod chemischen Verfahren entsche~dend bemerkbar, dal3 sie namlich fiir den Nachweis yon Vitamin A leider ziemlich nnspezifisch sind: ~ sie erfassen:einerseits ja auch Stoffe, die keinerlei Vitamin A-Wirksamkeit besitzen und geben andererseits keine oder nut ungeniigende Reaktion, selbst wenn Vitamin A oder g, quivalent wirkende Stoffe sicher vorhanden sind; der biologische Versuch ist also zur Nach- priifung der physiko-chemischen Mel]ergebnisse nicht zu entbehren.

Vergleicht man nnn die Resultate der physikalischen und chemischen Bestimmung yon Vitamin A einerseits mit den biologischen Messungen der Vitamin A-Wirksamkeit andererseits, so muff noch ein weiterer Umstand besonders beriicksichtigt werden: dag n~mlich die beiden Arten cter Aus- wertung in ihrem Wesen grundlegend voneinander verschieden sind.

172 W. G~AB:

Die physikalisch-chemischen Messungen des Vitamin A sagen besten- falls nut etwas aus fiber den Geha l t eines Pr~parates an Vitamin A in Gramm, ohne Rfieksicht auf die davon tats~chlieh resorbierten, also bio- logiseh wirksam werdenden Anteile.

Die biologisehe Auswertung ermittelt dagegen ausschlieBlich die W i r k s a m k e i t in internationa]en E i n h e i t e n , und erfaBt damit auch alle ~quivalent wirkenden Stoffe, sowie Art der Darreichung und die bio- logisehen Vorgange der Resorption und Verteilung im Organismus.

Bei diesem Sachverhalt ist es nieht verwunderIich, daB U n s t i m m i g - k e i t e n zwisehen den E r g e b n i s s e n der b io log i schen und p h y s i k o - chemischen B e s t i m m u n g e n yon V i t a m i n A auftreten, die in den letzten Jahren sehon mehrfach Gegenstand yon besonderen experin]entellen Untersuehungen gewesen sind (50, 47, 48).

DaB man erst in der letzten Zeit auf diese f eh l ende U b e r e i n - s t i m m u n g aufmerksan] wurde, hat seinen Grund darin, daB erst n]it der zunehm~enden Verfeinerung der Untersuehungsverfahren die bestehenden Unstimmigkeiten deutlieh genug in Erseheinung traten.

In eigenen Versuehen anlaffiieh der pharmakologischen Auswertung des Vitamin A-Praparates ,,V o g an" haben aueh wir diese fehlende Uberein- stimmung zwisehen den verschiedenen fiblichen Verfahren zur Auswertung yon Vitamin A beobachtet, und dabei ge]ang es uns, eine besondere B e- z i ehung zwischen der chemischen F o r m des V i t a m i n A und se iner biologisehen Wirksamkeit aufzuzeigen (vgl. 14).

Vitamin A ist ein einwertiger Alkoliol der naehstehenden chemischen Konstitution :

C C H s C H 3 I i / O H

H~ C / ~C--C H~C H--C=C H--C I~=C I-I'C =C H--C H2 ,

H 2 C \ / \ , C H a CH 2

den K a r r e r (1) als ,,Axerophtol" bezeichnete. An seiner alkoholisehen Hydroxylgruppe kann er mit organisehen S~nren verestert sein. Vitamin A kann somit also als freier Alkohol oder als Ester vorliegen; und unsere naehstehend besehriebenen U n t e r s u e h u n g e n ga l t en den] Naehwe i s , dab zwischen d iesen be iden F o r m e n yon V i t a m i n A wesentliehe U n t e r s e h i e d e in der b i o l o g i s c h e n W i r k s a m k e i t bes t ehen . Die Kl~rung dieser Frage hat aueh erhebliehe praktische Bedeutung, da Vi- tamin A in den therapeu~iseh angewandten Pr~.paraten (Lebertran und hochwertigen Konzentraten) sowohl in der Esterform wie auch als freies Axerophtol vorliegen kann.

Da~Vitamin A, wie seine Konstitutionsformel zeigt, fiinf konjugiert zueinander stehende Doppelbindungen enthSlt, sind mehrere Stereoisomere davon m6glieh, die sich dureh cis-trans-Stellung der einzelnen Glieder unterscheiden. Ob sieh das

Beziehungen zwisehen chemischer Form und Wirksamkeit von Vitamin A usw. 173

Vitamin A unter Berficksichtigung der Stereoisomerie in verschiedene chemische For men t~ufteilen ]~13t, mul~ vorl~ufig d~hingestellt bleiben, und damit auch die Frage, ob die verschiedene sterische Anordnung der Doppelbindungen einen EinfluI~ auf die biologische Wirksamkeit hat.

Ahnliche Wirkungsunterschiede wie wit, fanden zwischen Axerophtol und Vitamin A-Ester, unabh~ngig yon uns auch Mol~I und Reid (15) in ibren gleichzeitig durchgeffihrten Untersuchungen.

Um den Unterschied in der Wirksamkeit der beiden Formen von Vitamin A fiberzeugend zu beweisen ist es notwendig, die fiblichen Vet- fahren ,zu seiner Auswertung and ihre verschiedenen Unzul~nglichkeiten kritisct~ zu besprechen. Dies ist um so mehr angezeigt, als bei der routine- m~l~igen Nachpriifung von Vitamin A-Pr~paraten manchmal yon den ein- zelnen Methoden mehr erwartet oder verlangt wird, als sie bestenfalls leisten k5nnen. Wie iiberall in der experimentellen Forschung muir man die Leistungsf~higkeit jeder Methode kennen, um den Wert der Ergebnisse richtig beurteilen zu kSnnen, ,,denn nut die Methoden sind es ja, die die Resultate liefern".

II.

Die Verfahren zur Bestimmung des Vitamin A und die Beziehung der dabei gemessenen Werte zueinander.

Fiir die exakte Dosierung aller therapeutisch verwendeten Stoffe ist es erforderlich, daI~ ihre Wirksamkeit eindeutig angegeben werden kann.

Bei chemisch einheit]ichen Stoffen eines bekannten Wirkungstypus genfigt es, den gewichtsmg~igen Gehalt einer Arzneizubereitung an diesem Wirkstoff anzugeben; denn jeder Arzt hat ja aus seiner Erfahrung von der Wirksamkeit einer so eingestellten Arzneiform ohnehin eine zutreffende Vorstellung. Die Bestimmung des Wirkstoffgehalts erfolgt in diesen F~llen mit einfachen c h e m i s c h e n Methoden.

Bei chemisch nicht einheitlichen Wirkstoffen yon komplexer bio]ogi- scher Wirksamkeit mu~, da andere Methoden versagen, die p h a r m a - k o 1 o gi s c h e Auswertung ihrer Wirkungssti~rke fiir die Dosierung zugrunde gelegt werden. Zu diesen letzteren Stoffen gehSrt das Vitamin A, das ja in den iiblichen Handelspr~paraten nicht rein vorliegt, S0ndern in Form eines aus Fischleber5len gewonnenen besonders Vitamin ~;reichen Konzentrates. Wie eingangs schon erwahnt, wird fiir die Answertung eines vitamin A-Pr~parates aussch]iel]lich die Bestimmung seiner :Wirk- samkeit zugrunde ge]egt, die man im biologischen Versuch dutch Vergleich mit der Wirksamkeit des internationalen Standardpr~parates erh~]t.

Da die Verl~l~lichkeit des biologischen Versuchs gelegentlich immer wieder in Zweifel gezogen wird, sei hier kurz auf die wichtigsten Einw~nde gegen den Tierversuch eingegangerr.

1. Die biologiSche A u s w e r t u n g yon V i t a m i n A. Eine ver- la~liche biologische Auswertung setzt voraus, dal~ es eine spez i f i sche ,

174 W. GRAB:

e m p f i n d l i c h e u n d g e n a u e Versuchsanordnung gibt , die es e r laubt , die W i r k s a m k e i t eines P r~pa ra t e s mi t der des en t sprechenden ~ t anda rd - p r~para te s zu vergleichen.

Diese Grundforde rungen fiir e inen biologischen Versuch s ind nun bei der q u a n t i t a t i v e n Bes t immung der W i r k s a m k e i t von V i t a min A- P r a p a r a t e n durchaus n ich t in idealer Weise erfi i l lbar. I m einzelnen verh~l t es sich folgendel~ma~en:

a) S p e z i f i t ~ t . Die ,,Spezifit~t" einer Wirkung ist selbstverst~ndlich ja nur ein relgtiver Begriff; sie wird umgrenzt durch die Beantwortung der beiden Fragen: Wieviel verschiedene Substanzen haben qualitativ dieselben oder ~hnliche Wirkun- fen ? und: Bei welehen Dosen dieser Substanzen tri t t diese Wirkung ein ?

Die SI0ezifitgt des Vitamin A-Wachstumsversnehs 5eruh{: auf dem alleinigen Fehleri von Vitamin A in der GrundkSSt, das einzig nut ersetzt werd~n kann dutch Stoffe mit der biologischen Wirkung von Vitamin A. D a die bekannten anderen Vitamine sowie aueh andere Wuehsstoffe mit der spezifischen Wachstumswirkung des Vitamin A b e i gleichzeitiger A-Mangelkost in keiner Weise interferieren, ist die Spezifit~t des Wachstumsversuchs fiir Vitamin A Ms ausreichend anzusehen.

b) E m p f i n d l i e h k e i t . Der Vitamin A-Wachstumsversuch erlaubt, die Wir- kung von 0,5--1 y Vitamin A als tagliche Dosis ftir ein Tier sicher zu erkennen, ist also sehr empfindlich.

e) G e n a u i g k e i t . Der biologisehe Versush soll genau sein, d. h. kleine Unter- schiede in der St~rke yon zwei Pr~paraten mit Sieherheit noch erkennen lessen.

Die Genauigkeit des Vitamin A-Versuehs ist wegen der groften biologischen Streuung in der Empfindlichkeit der einzelnen Versuchstiere leider nur feting. Zahlenm~ig l~gt sieh die relative Genauigkeit des Vitamin A-Versuehs erfassen dureh die Angabe der ,,Wahrscheinlichkeit P", dal~ ein beobachtetes Versuchs- ergebnis in 99 yon 100 P~llen innerhalb gewisser @renzen liegt. Ffir den 5 Wochen dauernden Vitamin A-Wachstumsversuch wird in der britisehen Pharmaeopoe (16) angegeben ffir P = 0,99, daf~ bei Verwendung yon 10 Ratten far 100 in gleichartiger Weise durehgeffihrte Versuehe des Ergebnis in 99 F~llen gr5fter ist als 37 % und kleiner ist als 272 % des ,,wahren" Ergebnisses M (M • 2,576 s). Diese Genauigkeit ist verglichen mit der anderer biologiseher Auswertungsverfahren far Vitamine wesentlich geringer, denn bei Vitamin B~, Coder D i s t die Genauigkeit mindestens doppelt so groik

Die Genauigkeit des Vitamin A-Versuchs ist yon der sorgfaltigen Einhaltung der Versuehsbedingungen abh~ngig. Eine ErhShung der Genanigkeit ist nut durch eine Vermehrung der gleiehzeitig eingesetzten Versuehstiere einheitlicher Ab- stammung mSglieh.

d) S t a n d a r d p i ~ p a r a t . Da die St~rke eines Praparats in irgendeinem Mat~ zuverl~ssig und reproduzierbar gngegeben werden muir, ist eine Vergleiehung seiner Wirksamkeit mit der eines Standardpr~parats unbedingt erf0rderlich. Des yon der 8tandardisierungskommission daftir vorgesehene internationale Standardpr~parat ist eine 0,03 %ige LSsung yon/~-Carotin in CocosS1 (3).

Die Wahl des chemiseh gut definierten und gut haltbaren /~-Carotins als Standardpraparat fiir Vitamin A stellt nur einen Notbehelf dar, der dutch die biologiseh gleichartige Wirkung des Carotins gerechtfertigt wird. Dabei mug man abet bedenken, dal~/~-Carotin mit dem zw~prtifenden Vitamin A-Prgparat stofflich inkongruent ist. Der Wirkungsgrad des /~-Carotins hangt yon seiner Spaltung in der Leber tier Versuchstiere ab; fiber des Ausmal~ dieser Spaltung ist man nosh nisht ~ibereinstimmender Meinung (21).

Beziehungen zwischen chemischer Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 175

Trotz der ibm anhaftenden Sehwierigkeiten kann also der Ratten: Wachstums-Versueh doeh als verlal~liehes biologisches Verfahren zur Messung der Wirksamkeit yon Vitamin A gelten, wenn er nur in richtiger Weise durchgefiihrt wird*.

Wegen des grol3en Aufwands an Zeit, Platz, Miihe und Kosten beim Tierversuch hat man sich sehon seit langem bemiiht, die bekannten physikalischen und chemisehen Reaktionen auf Vitamin A zu quantitativen Bestimmungsmethoden auszubauen. Aber auch hierbei ergaben sich eine Reihe yon Schwierigkeiten, auf die kurz eingegangen werden soil.

2. Die p h y s i k a l i s e h e Messung yon V i t a m i n A. Wenn man yon reinem Vitamin A spektralphotometriseh die Lichtabsorption bei dem charakteristisehen Maximum yon 328 m# migt, so erhalt man als spezifi-

i00 corn sehen Extinktionskoeffizienten E - Werte um 1800. D a der

g. cm E-Wert proportional der Konzentration eines Stoffes ist, so kann man den Gehalt an lichtabsorbierender Substanz in einem Priiparat erreehnen. Zu bedenken ist nur, dal3 die Liehtabsorption einer LSsung nieht nur auf Vitamin A bezogen werden daft, da es ja sogar im Lebertran (47) Sub- stanzen mit dem gleichen Absorptionsspektrum gibt. H i e k m a n (22) getang es, eine solcbe Fraktion zu isolieren, die a.ber keinerlei Vitamin A- Wirksamkeit besal~ (spurious Vitamin A). Andererseits kann dutch die Anwesenheit yon Begleitsubstanzen neben Vitamin A das charakteristische Absorptionsmaximum des Vitamin A so verschoben sein, daft man nur dutch den Tierversuch entscheiden kann, ob es sieh hierbei noeh um YitaminA handelt oder nicht (27, 30, 39). Dureh Abtrennung der ver- seifbaren Anteile kann man zwar erreiehen, dag die Messung der Lieht- absorption in der unverseifbaren Fraktion weniger gestSrt ist; abet auch dann hat man noch damit zu rechnen, dab das Absorptionsmaximum des Vitamin A durch andere breite Absorptionsbanden ttberlagert wird; dazu kommt noch, dal? der Absorptionskoeffizient bei Priifung der isolierten unverseifbaren Fraktionen stgrker yon der Art des verwendeten L6sungs- mittels abhgngt, als bei den direkt gepriiften LeberSlen (56).

3. Die ehemisehe B e s t i m m u n g yon V i t a m i n A . Dig nach Zusatz yon Antimontrichlorid-Reagens zu Vitamin A-haltigen LSsungen auftretende Blaufiirbung (Carr-Priee-Reaktion) ist zwar fiir Vitamin A eharakteristiseh, sie-wird abet aueh von einer Reihe anderer Substanzen gegeben, die keine Vitamin A-Wirksamkeit besitzen (63). Dazu kommt noeh, dal~ die Blaureaktion dureh Begleitstoffe gehemmt (31--33) werden kann, wie man das aus den bekannten Abweiehungen zwisehen dem Blau-

* Mit der kfirzlich von Wagner (60) beschriebenen Versuehsanordnung, die Wirksamkeit yon Vitamin A-Priipar~ten dnrch die tteilung der Keratoma]acie aus~uwerten, haben wir keine eigene Erfahrung, und daher auch kein Urteil tiber ihre Genauigkeit und praktische Brauchbarkeit.

176 W. G~AB:

wert yon Dorschlebertran und desaen unverseifbarer Fraktion schon kennt (10, 13, 34, 35). Aus neueren Untersuehungen (36) entnimmt man weiter, dab bei der Oxydation diese Hemmungsstoffe kaum ver~ndert werden, w~hrend das Vitamin A raseh der ZerstSrung anheimfgllt.

4. Bez iehung zwischen den b io log i sch und phys iko - chemisch gemessenen W e t t en fiir V i t amin A. Da die physikahschen und chemi- sehen Verfahren zur Bestimmung yon Vitamin A also in verschiedenster Weise gestSrt sein kSnnen und dadureh unzuverl~ssig werden, mul~ man dutch hgufige Naehkontrollen im Tierversuch die erhaltenen Befunde sichern. Bei Abweichungen zwischen physiko-chemischer Messung und biologischem Befund ist natiirlieh stets dem letzteren, also der Bestimmung der Wirksamkeit, der Vorrang zuzuerkennen, wie dies auch eine Vorschrift des britischen Arzneibuehes (16) ausdriieklich angibt.

Um nun nicht in jedem Falle die umstgndliche und kostspielige biologisehe Auswertung durchfiihren zu m.tissen, ist man so vorgegangen, da~ man bei einzelnen Prgparaten zungehst ihre biologisehe Wirksamkeit feststellte, und andererseits auch physikalisch und Ghemisch den Gehalt an Vitamin A beStimmte. Die drei zu einem Prgparat gehSrigen Werte setzte man nun zueinander in Beziehung, und dutch Bildung der Quo- tienten aus Wirksamkeit und E-Weft, bzw. Wirksamkeit und Blauwert wurde der Zusammenhang zwischen den einzelnen Messungen zahlenmgBig erfa~t; man erhielt auf diese Weise Faktoren, die es ermSglichen sollten, dab aus des physikalischen Messung unmittelbar die biologische ,,Wirk- samkeit" errechnet werden konnte.

Von diesen , , U m r e c h n u n g s f a k t o r e n " erlangte insbesondere jener zwischen Extinktionskoeffizienten und Wirksamkeit eine gewisse Be- deutung, da gerade die Messung des E-Wertes bei Vitamin A wegen seines hohen, molekularen Extinktionskoeffizienten einfach und genau ist. An verschiedenen Lebertranen und Vitamin A-Konzentraten stellte man nun

I00 eem den E-Wert und die Wirksamkeit (in internationalen Einheiten

g �9 c m

pro Gramm) lest, und als Quotient aus diesen Werten ergaben sich dabei Ziffern zwischen 1300 und 2380. A]s Mittelwert wurde die Zahl 1600 angesehen, die also nun als Umrechnungsfaktor aus dem E-Weft eines Pr~parats in seine Vitamin A-Wirksamkeit gelten sollte (37).

Aueh die internationale Standardisierungs-Kommission hat bei Vitamin A-Pr~paraten die Messung des E-Wertes unter bestimmten Be- dingungen als behelfsmgBiges Verfahren zu ihrer Wertbestimmung zu- gelassen. Als Umrechnungsfaktor aus dem E-Wart eines Prgparats in seine biologische Wirksamkeit wurde der oben erw~hnte Faktor 1600 vorgesehen (3b). ,

In der Folgezei t wurde nun dieser Faktor 1600 zur Erreehnung der a]lein maBgebenden biologisehen Wirksamkeit a]lgemein verwendet.

Beziehungen zwischen chemiseher Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 177

Gerade aber dies hat zu einer Reihe yon MiBverst~ndnissen tiber die wirk- liche Wirksamkeit yon Vitamin A-Praparaten geftihrt. Es z e i g t e s i ch n ~ m l i c h , d a b d i e s e r U m r e e h n u n g s f a k t o r 1600 n u t b e d i n g t e G t i l t i g k e i t b e s i t z t , u n d dal~ s e i n e a l l g e m e i n e V e r w e n d u n g zu v S l l i g e n t s t e l l t e n E r g e b n i s s e n f i i h r e n mui~te.

Als Ursaehe ffir dieses Versagen des Umreehnungsfaktors k6nnen nun mehrere Umst~nde in Betraeht gezogen werden; z.B.:

Bei der Oxydation yon Vitamin A dureh Luftsauerstoff bleiben der Carr- Price-Wert und der Spektrophotometerwert ]~nger erhalten als die biologische Wirksamkeit, so dab also in einem gegebenen Zeitpunkt keinerlei Paralle]its zwischen physiko-ehemischer Messung und Wirksamkeit mehr besteht (38). Zu einer ganz ~hnlichen schiefen Beziehung zwisehen E-Wert und Wirksamkeit kommt es auch bei der Einwirkung von ranzigem Fett oder von Licht auf Vitamin A. ttierbei kommt es sogar info]ge der Oxydation des Vitamin A zu einer Erh6hung des E-Wertes fiber den wirkliehen Vitamin A-Gehalt hinaus (39).

Neben dieser Ver~nderung der biologisehen Wirksamkeit dureh langsame ZerstSrung des Vitamin A spielt aber auch die LSsungsform, in der das Vitamin A zur Resorption geboten wird, ffir den bio]ogischen Auswertungsversuch eine wichtige Ro]le. Schon 1934 hat Coward (40) beschrieben, dab Vitamin A in versehiedenen Olen gel6st fast unwirksam is t, und Andersen (41) hat bei Mensehen dieselbe Beobachtung gemacht.

Auch wit hat ten Gelegenheit, diese U n v e r l ~ B l i c h k e i t des U m - r e e h n u n g s f a k t o r s 1600 festzuste]len. Die Abweichung zwischen der im Tierversuch best immten Wirksamkeit, und der aus dem E-We~t er- rechneten ,,Wirksamkeit" sind bei manehen Pr~paraten so groin, dal] sie auch bei Beriicksiehtigung aller etwaigen Defekte der einzelnen Ver- fahren deutlieh genug in Erscheinung treten. G e r a d e f t i r d i e s e be i m a n e h e n 1 ) r ~ p a r a t e n s e h r w e s e n t l i c h e n U n s t i m m i g k e i t e n z w i s c h e n b i o l o g i s c h e m B e f u n d u n d p h y s i k o - e h e m i s e h e n W e r t e n f e h l t e b i s h e r e ine b e f r i e d i g e n d e E r k l ~ r u n g . Die vorliegenden Untersuchungen sollen dazu beitragen die Grtinde aufzukl~ren, warum zwisehen den verschiedenen Verfahren zur Bestimmung von Vitamin A h~ufig keine Ubereinstimmung besteht.

I I I .

~Tersuchsanordmmgen.

1. M e s s u n g des C a r r - P r i c e - W e r t e s .

Vitamin A g~bt schon in verdiinnter LSsung mit Antimontrich]orid eine tiefblaue Farbreaktion.

Im allgemeinen benutzt man den C a r r -P r i ce -Wer t als Ausdruck ffir die durch diese Blaureaktion gemessene Vitamin A-Konzentration in einem bestimmten Substrat. (Der Carr-Price-Wert ist eine Konzentrationsangabe, und nicht eine Mengenangabe; er entspricht also in seiner physikalischen Dimension z.B. den Baum@-Graden ffir die ~onzentration einer Schwefels~ure.) Der Carr-Price-Wert wird gemessen dadurch, dab man eine Reihe yon Verdfinnungen des Vitamin A-

178 W. G~AB:

Pr~iparats herstellt und die Konzentration c in g/100 corn derjenigen LSsung er- mittelt, die in 1 cm dicker Kiivette 5--10 Sekunden naeh dem Mischen mit dem zehnfachen Volumen ReagenslSsung in der Farbmessung mit dem Lovibond- Tintometer die Ablesung 10 Blau ergibt. Hieraus wird der

2O0 Carr-Priee-Wert - -

c berechnet.

Da veto Lovibond-Tintometer verschiedene Konstruktionen (z. B. ohne und mit Graufilter) bestehen, so sind Messungen mit verschiedenen Exemplaren dieses Instruments nieht direkt miteinander vergleichbar. Deshalb ist es vorzuziehen, die St~rke der Farbreaktion mittels des Z ei s s schen Pulfrich- (Stufen-) Photometers mit dem Spektralfilter S 61 zu messen. Wir nehmen die Reaktion in einer 1 em dieken Kiivette vor, wghrend sich in der Vergleiehskiivette Reagensl5sung oder Wasser befindet, und lesen die 5--10 Sekunden naeh dem Misehen gemessene Lichtdureh- l~ssigkeit am Photometer ab. Um den Ansehlul~ an ~ltere Blaumessungen zu er- halten, haben wir die Beziehung zwisehen beiden MeBmethoden mit einem ~lteren Lovibond-Tintometer ohne Graufilter ermittelt. Demgem~B betrachten wir die Lovibondmessung 10Bl~u als gleichbedeutend mit einer Liehtdurchlgssigkeit yon 16%.

Beispieh Wenn unsere Konzentrate in einer bestimmten Verdiinnung die Lovibondablesung 10 Blau (an dem Mteren Tintometer) ergeben, so ist ihre mit dem Pulfrichphotometer gemessene Liehtdurchl~ssigkdt 10%. Wenn c = 0,1% ist,

200 dann betragt ihr Carr-Price-Wert 0~1 = 2000.

Die Fehlerbreite der Blaumessung ist nicht gering, wegen der rasch ver- schwindenden Blauf~irbung nach Zusatz des Antimontrichloridreagens; wir schatzen sie auf • 10 ~/~.

2. M e s s u n g d e r . L i c h t a b s o r p t i o n .

Die Auswer tung von Vi tamin A-Prapara ten mi t diesem Verfahren beruht auf dem bei der Wellenl~nge 328 m # gelegenen Maximum des

Absorpt ionsspektrums yon r e inem.Vi t amin A.

Nach den tiblichen Vorschriften (51) miissen die Vitamin A-Pr~parate verseift werden, und die Beaktion allein mit dem Unverseifbaren ausgeffihrt werden. Man verdfinnt das Vitamin A-haltige Substrat mit einem optiseh leeren L6sungsmittel, z. B. Heptan (destilliert), zu einer LSsung mit der Anzahl g in 100 ccm, und miBt nun die Liehtschw~chung einer 1 cm dieken Sehieht dieser L6sung bei der Wellen- l~nge 328 m/~. Am zweckm~l~igsten drfickt man diese gemessene Lichtschw~ehung,

100 ccm im ,spezifischen Extinktionskoeffizienten E - - (E ~ der dekadisehe Loga-

g �9 c m

rithmus der yon einer Verd(innung des Pr~parats 100 eem/g bewirkten Licht- schwaehung, dividiert dureh die in em gemessene Schiehtdieke). Gebr~uehlich ist zur Feststellung des E-Wertes das H ilgersche Vitameter, oder jedes Photometer mit der MSglichkeit einer Messung der Absorption im Ultravioletten. Die Messung ist bequem und daher sehr be]iebt, da E rech~ genau bestimmt werden kann und infolgedessen eine ebenso genaue ,,Vitamin A"-Best~mmung vorget~uscht wird.

3. M e s s u n g d e r W i r k s a m k e i t y o n V i t a m i n A i m T i e r v e r s u e h .

Unser biologiseher Versuch zur Bes t immung der Wirksamkei t yon Vi t amin A bes tand darin, dag wir bei jugendl iehen R a t t e n durch eine

B eziehungen zwischen chemischer Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 179

Vitamin A-freie Kost einen S~illstand im Waehstum erzeugten und nun den Grad der Gewichtszunahme bei Zulage yon versehiedenen Dosen Vitamin A ausmal~en.

Da wir in den Jahren, wghrend denen wir den Vitamin A-Rattenversueh laufend durchftihren, die Erfahrung gemacht haben, dab gerade die Beobaehtung vieler kleiner Einzelheiten ftir einen erfolgreichen Versuch erforderlich ist, geben wir im Anhang eine genaue Beschreibung der Versuehsanordnung und die dazu gehSrige mathematisehe Auswertung der Ergebnisse.

Ergebnisse. 1. Die u n t e r s u c h t e n V i t a m i n A - P r ~ p a r a t e und die E r g e b n i s s e

i h r e r W e r t b e s t i m m u n g .

Die Ergebnisse unserer Tierversuche haben wir in Form yon Tabellen im Anhang zusammengestellt und die Einzelbefunde auch mathematisch ausgewertetiund dadurch gesichert.

Aus unseren Versuchen hatte sich ergeben, dab zwei versehiedene Typen yon Konzentraten (A und E) yon Vitamin A ganz verschiedene biologische Wirksamkeit besa/3en, obwohl ihre Carr-Price-Werte und ihre spektrophotometrisch gemessenen E-Werte ungef/ihr gleich waren.

Die Konzentrate A wurden durch Verseifen yon Fischlebern gewonnen und das erhaltene Unverseifbare baldigst mit Erdnul~Sl verdiinnt, so dal] die fertigen Pr~parate das Vitamin A in der chemischen Form des Alkohols ,,AxerophtoI" enthielten. Die Ausgangskonzentrate hatten einen Carr- Price-Wert von etwa 50000, sie enthielten also etwa 1,2--],5 Millionen internationale Einheiten Vitamin A pro Gramm. Sie stellten eine dunke]- braune, Mare, in diinner Sehicht rote Masse dar, yon honigartiger Kon- sistenz. Dureh Verdiinnen mit ErdnnBS1 wurden aus diesen Konzentraten LSsungen hergestellt mit einem Carr-Price-Wert yon etwa 2000. Diese LSsungen wurden nun spektrophotometrisch auf ihren E-Wert, ehemiseh auf ihren Blauwert und biologisch auf ihre Vitamin A-Wirksamkeit gepriift.

Unsere Messungen ergaben im Durehschnitt ans 11 verschiedenen Proben dieser Konzentrate A:

Carr-Priee-Wert = etwa 2000. 100 cem

Extinktionskoeffizienten bei 328 m#: E = 38,6 g �9 em.

Biologisehe Wirksamkeit ~ 70000 i. E. pro Gramm (vgl. Tabelle 6a).

Die Konzentrate E warden aus den Fisehlebern ohne jede Verseifung hergestellg, also 'nur dutch Anreieherung des Vitamin A mit Hilfe von LSsungsmitteln. In diesen Konzentraten ist das Vitamin A in der Form von Estern vorhanden.

Nach den Untersuehungen yon H i c k m a n , T i s c h e r u. a. (22--26) (zit. nach H i e k m a n ) kommt n~mlieh das Vitamin A in der tierisehen

180 W. O~*B:

Leber im Nativzustand nieht nur in Form des freien Alkohols, sondern in der weitaus iiberwiegenden Menge an organisehe S~uren als Ester ge- bunden vor. Uber die Natur der S~uren, an die das Vitamin A als Ester gebunden ist, ist noeh wenig bekannt; sicherlich kommen mehrere S~uren in Betraeht, vorzugsweise wohl Fetts~uren, 3 % des Viatmin A sind an Palmitins~ure gebunden.

Unsere Ester-Ausgangskonzentrate batten einen Carr-Priee-Wert yon 20000--30000. Sie stellten im Gegensatz zu den Konzentraten A ein goldgelbes klares 01 dar. Dutch Verdiinnen mit Erdnu~51 wurden aus den Konzentraten E wiederum LSsungen hergestellt mit einem Cart-Price- Weft yon etwa 2000. Diese L5sungen wurden mm spektrop.hotometriseh auf ihren E-Wert, chemisch auf ihren Blauwert und auf ihre biologische Wirksamkeit untersueht. Es ergaben unsere Messungen im Durchschnitt aus 8 verschiedenen Proben dieser Konzentrate E:

Cart-Price-Weft = etwa 2000. 100 ccm

Extinktionskoeffizienten bei 328 m# : E = 39,4 g �9 cm

Biologische Wirksamkeit = 130000 i. E. pro Gramm (vgl. Tabelle 6b).

Aus diesen Ziffern ersieht man, dal~ die E r g e b ni s s e d e s b i o 1 o gi s e h e n Versuchs und der p h y s i k a l i s c h e n und chemischen V i t a m i n A- M e s s u n g e n nicht, wie man bisher annahm, in allen F~llen iibereinstimmen, sondern im Gegenteil wel t v o n e i n a n d e r abweichen kSnnen. Die Konzentrate E erwiesen sieh als beipahe doppelt so wirksam, als nach ihrem Blauwert und ihrem J~-Wert zu erwarten gewesen wi~re. Diese bessere Wirksamkeit der Vitamin A-Esterkonzentrate i st eine rein biologisehe Erscheinung; denn, wie die Quotienten aus den Blauwerten und den E-Werten bei beiden Konzentraten zeigen, enthalten beide Typen der Konzentrate gleich viel Vitamin A, j edoeh in chemisch verschiedener Form, niLmlich einmal als Vitamin A-Alkohol (KonzentratA), und einmal als Vitamin A-Ester (Konzentrat E). Die bessere Wirksamkeit des Ester- Konzentrats beruht wahrscheinlich auf der grSl~eren S t a b i l i t ~ t des Vitamin A in der Esterform, die wit in I-Ialtbarkeitsversuchen unter ver- sehieden gew~hlten Laboratoriumsbedingungen sahen (s. unten).

Tr~gt man die in der Tabelle (3--5) im Anhang gegebenen Werte in halblogarithmisches Koordinatenpapier ein, und zwar die Werte M als Ordinate y und die Logarithmen der Dosen z als Abszisse x, so erh~lt man das nachstehende Diagramm.

Diagramm l.

In Abb. 1 sind auSer den bei fi-Oarotin beobachteten Punkten auch die den Regressionsgleiehungen entspreehenden Geraden eingezeichnet, wie sie sich bei den Bereehnungen aus den einzelnen Werten ergaben.

B eziehungen zwischen chemiseher Form und Wirks~mkeit yon Vitamin A usw. 181

Die von uns errechneten Regressionsgleichungen sind:

1. Fi i r ~-Carot in: y = 18,0s + 15,08; Dosis = S; l o g s = s.

2. Fi i r Kor~zentrate E mi t Vi t amin A-Es te rn : y = 16,89 x - 2,37.

3. Fi i r Konzen t r a t e A mi t freiem Vi tamin A: y ~ 1 7 , 4 x - 9,72; x = log z; z -= Dosis.

Die gepr~iften Dosen fiberdecken einen Bereieh yore sechs- bis achtfachen der kleinsten Dosis. Veto internationalen StandardprKparat konnten hShere Dosen als 1,8 y nicht gepriift werden, da wir mit den Proben dieses Pr~iparats sehr sparsam umgehen multten.

Die Dosen in den Tabellen bzw. in den Abbildunge n bedeuten die Tagesdosis ffir eine Batte. Bei den Konzentraten A und E bezeiehnet die Angabe in y jene Gewichtsmenge, die: yon den Konzentraten mit dem Carr-Priee-Wert = 2000 igglich gegeben wurde.

~ g

~ 6

I'

i~/BZlT~ti'onzle 48 7 2 d r 5"nkeilen r

s=tog , . ,< '~ Tages#osen

0

i I i I I i I I 8Zz . z 2s r 8o~

~=1o 9 z [Dgemdosis yon ~nze,7/m/en}:--,-

Abb. 1. Ergebnis der biologischen Auswertung der Esterkonzentrate E und Alkoholkonzentrate A yon VitaminA, gepr(ift im Vergleich mit dem internationMen Standardpr~iparat fl-Carotin. Die lineare Ordinate zeigt die dllrchsehnittliehe Gewichtszllnahme. Auf der logarithmisch geteilten Abszisse sind die t~gliehen Dosen anfgetragen. Die untere Teilung der Abszisse tr~gt die Dosen ffir die Konzentrate A und E. ]~ier bezieht sieh die Angabe in Gamma auf jene GewiehtsmengelL die yon den Konzentraten mit dem Garr-Frice-Wert = 2000 ~g l ieh gegeben wurden. Die obere Teilung tier AbszJsse ~r~gt die t~glichen Dosen des internationalen Standardpr~iparats fl-Carotin gleichzeitig mit der Teilung in internationalen Einheiten; 0,6 7 yon fl-Carotin = 1 internationale Einheit. Die obere und die untere Teilung der Abszisse sind so zueinander ia Beziehung gesetzt, dal~ die Werte far 25 7 Konzentrat und 1,8 u yon fl-Carotin = 3 internationale Einheiten zusammenfallen. Daraus folgt, da~ 1 ~illion 7 = 1 g Konzentrat der Wirksamkeit yon 120000 internationalen Einheiten entspreehen mfissen. Wenn also auf dem Diagramm die Wirkungsknrve eines Konzentrats mit der Wirkungskurve des B-Carotins zusammenfiele, so h~itte

dieses Konzentrat die Wirksamkeit yon 120000 i. E. Vit~minA pro Gramm.

Aus Abb. 1 ersieht man, dab bei gleichem Blauwert die Ester- konzen t ra te E immer wirksamer sind, als die das freie Vi tamin A ent- hMtenden Konzen t r a t e A.

Die genaue Analyse der Tsbelle und Abb. 1 vermittelt aber noch eine Reiho weiterer Ergebnisse:

Archly f. oxperiment, Path. u. Pharmakol, Bd. 193. 13

182 W. GRAB :

1. Die Streuung der einzelnen Werte ist bei allen Dosen und bei allen Pr~- paraten diesetbe. Berechnet man unter Beriieksichtigung des Gewichts der Beob- achtung den Mittelwert om aus den Streuungen a, . . . %\T bei den einzelnen Dosen, so erh~.lt man der Reihe nach folgende Werte:

o~n = 7,25 fiir fl-Carotin; o m = 7,60 fiir Konzentrat A und o~]' ~ 8,86 fiir Konzentrat E.

Man erkennt also keine Abh~ngigkeit der Streuung yon der Zuwachswirkung y; da nun die Zuwaehswirkung y mit dem 10g z = x ansteigt, die Streuung aber immer dieselbe bleibt, so wird die Streuung, in Prozenten yon y ausgedrtiekt, mit steigendem y immer kleiner, also bei steigenden Dosen relativ immer geringer. Der Vergleich yon Prs ist also bei den h6chsten Dosen am giinstigsten, da hier die Werte die relativ kleinste Streuung besitzen. (Berechnung yon am im Anhang.)

2. Der Vergleich der Wirksamkeit der beiden Vitamin A-Konzentrate A und E mit dem internationalen Standardpr~parat ist bei den Dosen yon 25 y dureh- gefiiba-t worden. Dieses geschah einerseits deswegen, weft gerade diese beiden Dosen bei beiden Pr~paraten besonders hi~ufig geprtift wurd'en, so dab also die Befunde ein gewisses Gewicht besitzen; andererseits entsprieht diese Dosis in ihrer Wirksamkeit in der GrSSenordnung etwa 1,8 ?/~-Carotin, das ist die hSchste iiberhaupt geprtifte Dosis des internationalen Standardpr~parats; aus den oben im Punkt 1 gegebenen Ausfiihrungen entnimmt man, dal~ die Streuung bei den h6chsten Dosen relativ am geringsten ist. Aus dem Verhs jener Desert der Konzentrate A und E, die gleiche Wirkungen wie 1,8 },/~-Carotin hervorbringen, erh~lt man die im vor- stehenden gegebenen Wirksamkeitswerte der Konzentrate in internationalen Ein- heiten pro g.

Dal] man aus dem Diagramm zahlenm~l]ig etwas andere Werte entnimmt als die Mittelwerte der Tabellen 6 liegt daran, da~ bei der Berechmung der Regressions- gleiehungen fiir das Diagramm 1 die Zusamme~assung der Werte eine andere ist, als bei der Bildung der Mittelwerte in den Tabellen.

3. Bei der obenerw~hnten relativ groi~en Streuung der einzelnen Vitamin A- Versuehe erhebt sieh die Frage, in welchem Grade der beobaehtete Unterschied in der Wirksamkeit zwisehen dem Vitamin A-Esterkonzentrat und dem Konzentrat A mit freiem Vitamin A aueh wirklieh signifikant im Sinne der Wahrscheinlichkeits~ rechnung ist. Wir haben aueh diese Frage geprtift, und gefunden, dal3 k = 2,55 ist; das bedeutet, dal~ bei 30 Wiederholungen des Versuchs 29real der gefundene Wirksamkeitsunterschied auf einer wirk]iehen Wirkungsdifferenz der Konzentrate A und E beruhL unter der Voraussetzung, dai] man sowohl die Konzentrate A wie E an je fiinf Gruppen yon etwa je 10 Versuehstieren priift, d. h. also mit insgesamt 100 Tieren. (Einzelheiten der Berechnung yon k im hnhang.)

Wi t sehen die gefundene .Differenz in der Wirksamkei t der Konzen- t ra te A und E als s ignif ikant an.

4. Aus den Tabellen 3 his 5 entnimmt man auch noch die bei der einzelnen Dosis jeden Praparats dureh den Ted vorzeitig ausgesehiedenen Tiere. Bei einem Vergleieh der einander entsprechenden Dosen erkennt man wiederum sofort, dal3 beim Ester- konzentrat E weniger Tiere sterben, Ms bei dem auf den gleichen Blauwert ein- gestellten l<onzentrat A mit freiem Vitamin A und man erhi~lt somlt ein i~lmllches u der Wirksamkeit der Konzentrate A und E, wie beim Vergleich der Zuwaehswirkungen.

Die Messung der Todesrate liefert also auf eine unabh~ngige Weise eine vol lkommene Bes ta t igung der Ergebnisse des Waehstumsversuchs .

Beziehungen zwischen chemischer Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 183

2. U n t e r s c h i e d e in der LSs l i chke i t zwischen V i t a m i n A-Alkoho l nnd V i t a m i n A-Es te r .

Die Konzentrate mit Vitamin A-Estern und freiem Vitamin A-Alkohol unterscheiden sich nicht nut in ihrer biologisehen Wirksamkeit, sondern auch in ihren physikalisch-chemischen Eigenschaftcn voneinander.

H ickman(22) land, dab in seiner Hochvakuum-Destillations- apparatur (zur sogenannten ,,Molekulardestillation") das freie Vitamin A bei 125 o C, die Vitamin A-Ester bei 2150 mit einer bei seiner Versuchs- fiihrung optima]en Geschwindigkeit destillieren.

Man kann auch auf chemischem Wege eine Unterscheidung zwischen freiem Vitamin A und Vitamin A-Ester durchfiihren, und zwar wie R i t s e r t (13) land, auf Grund der Versehiedenen LSslichkeit der beiden Vitamin A-Formen in organischen hydrotropen LSsungsmitteln, z.B. Methanol.

Sehiittelt man eine 51ige LSsung eines Konzentrats mit Vitamin A- Alkohol mit der gleichen Menge wasserfreien Methanols durch, so verteilt sich das Vitamin A ziemlieh gleichm~i3ig zwischen 01phase und Methanol- phase. Schiittelt man dagegen eine 5lige LSsung eines Konzentrats mit VitamknA-Ester in gleieher Weise mit demselben Volumen Methanol dutch, so nimmt das Methanol nut 3--5 % des Vitamin A auf. Mit Hilfe dieses Verfahrens der elektiven Heraus]Ssung des freien Vitamin A aus einem Konzentrat kann man nun beispielsweise auch das Mengen- verh/iltnis zwischen freiem Vitamin A und Vitamin A-Ester in einem Konzentrat n~herungsweise bestimmen. Der Grad der Anni~herung an den wahren Weft hiingt wie bei allen Ausschiittelungsverfahren yon der Zahl der einzelnen Ausschiittelungen ab. Fiir unsere Ester-Konzentrate haben wit auf diese Weise festgestellt, da$ immer mehr als 93 %, meist mehr als 95 % des Vitamin A in der Esterform vorliegt; in unseren K0nzen- traten A mit freiem Vitamin A sind infolge der vollst~ndigen Verseifung keine Vitamin A-Ester mehr nachweisbar.

3. Einflul~ der V e r s e i f u n g au f B l a u w e r t , E - W a r t und Wirk- s a m k e i t bei d o p p e i t gepr i i f t en K o n z e n t r a t e n .

Um zu zeigen, dal] die im Durchschnitt der gep14iften Konzentrate A und E beobachteten Wirkungsunterschiede tats~ehlich auf der ver- schiedenen chemisehen Form des Vitamin A beruhen, haben wit zwei an 112 Tieren ausgewertete Esterkonzentrate nachtr~glich noch total verseift und das erhaltene Unverseifbare nochmals chemisch, physikalisch und biologisch an 67 Tieren geprtift.

Durch diese Priifung treten die beobachteten Unterschiede in der Wirksamkeit der verschiedenen chemischen Formen des Vitamin A be- sonders deutlich in Erscheinung. Anf diese Weise kann auch der Einwand

13"

1 8 4 W . GRAB :

wider legt werden, dal~ in den E s t e r k o n z e n t r a t e n die Messung des E - W e r t e s oder des Blauwer tes du t ch die Anwesenhei t yon anderen Stoffen ges tSr t

w~re. 0 b in den E s t e r k o n z e n t r a t e n viel le icht Stoffe vo rhanden sind, die

die Reso rp t ion oder die Ausnu tzung des V i t a min A beeinflussen, und die be im n a c h t r i g l i c h e n Verseifen der K o n z e n t r a t e viet leicht abge t r enn t werden, haben wir im einze]nen noch n ich t un tersucht . Aber schon bei der Ana lyse der Wirkungsun te r sch iede von Vi t amin D2 und V i t a min Da f ahnde t e m a n nach solchen resorp t ionsfSrdernden Stoffen in den LeberSlen, h a t sie j edoch n ieht nachweisen kSnnen. D a das V i t a min A auch i m m e r aus LeberSlen s t ammt , g lauben wi t daher , dab m a n du tch t t e r a nz i e hung soleher hypo the t i sche r Stoffe die Wirkungsun te r sch iede zwischen Vi ta - min A - E s t e r n und Axe roph to l n i c h t befr iedigend erkl~ren kann.

Tabelle 1. E i n f l u g der V e r s e i f u n g auf den B l a u w e r t u n d E - W e f t be i K o n z e n t r a t e n .

An hochwertigen Konzentraten mit den nativen A-Estern wurde zun~chst Blau- und E-Wert geraessen; dann wurde eine bestimmte Gewiehtsmenge der Pr i - parate verseift und das ertlaltene Unverseifbare wiederum auf das Ausgangsgewieht mit 01 aufgefiillt und nun nochmals Blau- und E-Wert gemessen.

Vitamin verester t I P r Ipara t and Nummer ~ Carr-Price-Wert E-Wert

Vor Verseifen Nr. 14 . . . . . . . . . . . Nach Verseifen Nr. 9a . . . . . . . . Vor Verseifen ~r. 28 . . . . . . . . . Nach Verseifen Nr. 29 . . . . . . . .

95 0

95 0

1800 1800 1990 2040

31,5 28,0 34,0 32,0

A r b e i t s b e i s p i e l ftir die letzten beiden Prgparate der Tabelle: 10 g Ester- konzentrat mit Carr-]?rice (C. P.) = 21600 wurden auf 108,0 g mit Erdnug61 auf- gefiillt. C.P. (berechnet = her.) = 2000; C.P. (gefunden = gef.) = 1990. Nach dreimaligem Aussehiitteln yon je 3 g dieses 01es mit je 7,5 ecru Methanol waren noeh 95% des Vitamin A (aus dem C. P.-Wert bet.) in der 01phase vorhanden.

Aus 10 g dieses I~onzentrats wurden dutch Verseifen erhalten 3,37 g Unverseif- bares mit C. P.-Wert yon 60 000; nach Auffiillen mit ErdnuI~51 atff 96,5 g ist C. P. (ber.) = 2000; C.P. (gel.) = 2040.

D i a g r a m m g (in Abb i ldung 2),

Die Abb. 2 zeigt die beiden Wirksamkeitsgeraden f~r zwei der doppelt gepr~ften Alkohol- und Esterkonzentrate der vorstehenden Tabelte. Die Geraden wurden gezeielme~ naeh den aufgestellten ~egressionsgteichungen, die aus den Einzel- werten der durehschnittlichen Gewichtszunahmen wiederum bereehnet worden waren (vgl. Anhang). Auf eine gleiehzeitige Priifung des internationalen Standard- pri~parats mul3te wegen Materialmangel verziehtet werden; die erhaltenen Befunde sind daher nicht absolut, sondern nut relativ zu werten. Die Geraden sind, da die Versuehe zu anderen Zeiten durehgefflhrt wurden, etwas gegen die Geraden der Abb. 1 verschoben; das Vertl~iltnis der Wh-ksamkeit der beiden Konzentrate ist abet ii~ Abb. 2 genau das gleiche wie in Abb. 1, und gerade die Feststellung dieses Verhiltnisses ist ja das Wesentliche.

Beziehungen zwischen ehemiseher Form und Wirksamkeit von Vitamin A usw. 185

Die besondere Beweiskraft dieses Versuchs liegt darin, dab jeweils zwei ver- schiedene Konzentrate vor und nach der Verseifung vSllig gleichzeitig im Tier- versuch geprfift wurden.

Die Tabe]]e 1 zeigt, dal] bei der nachtrggliehen Verseifung der beiden Esterkonzentrate sieh Blauwert und E-Wert nieht wesentlich geiindert haben. Die biologisehe Wirksamkeit ist dagegen, wie das Diagramm 2 zeigt, ~

bei dem verseiften Kon- I zo zentrat erheblich geringer als bei dem zugeh5rigen ,. le unverseift gebliebenen*. ,~ lz

Wie gerade das obige ~ 8 Arbeitsbeispie] zeigt, konnte die Verseifung fast mit theo- ,~.~ retischen Ausbeuten durch- gefiihrt werden; die geringen ~ 5 Verluste an Vitamin A sind bei der schwierigen Ab- trennung des Unverseifbaren unvermeidlich. In keinem Falle ist aber der E-Wert und der Blauwert in dem verseiften Konzentrat hSher Ms in dem Ms Ausgangsmaterial dienen-

3 ~ 15 2~" r �9 ~=Io 9 z ['~gesdos/s con ~zzentpe/en)---~

Abb. 2. Die Abb. 2 zeigt die versehiedene biologische Wi rk - s a m k e i t yon je zwei Konzen t ra ten , die zuers t als Es te r - pr~tparate und nach der naeht r~gl ich v o r g e n o m m e n e n Ver- se i fung nochmals als V i t a m i n - A- Alkohol- Konzen t r a t e biologiseh ausgewer te t wurden . Abszisse und Ordina te der Abb. 2 s ind genau en tspreehend der Abb. 1 gezeichnet .

den Esterkonzentrat, wie das der Fall hiitte sein mfissen, wenn stSrende Stoffe vorhanden gewesen wi~ren. Bei den Esterkonzentraten haben wir natfirlieh E-Weft and Blauwert in unverseifbarem Zustande gemessen, da die Konzentrate ja bereits sehr rein waren und das Absorptionsspektrum unverzerrt war.

4. E i n f l u l ] d e r V e r s e i f u n g a u f d ie t t a l t b a r k e i t de r V i t a m i n A- K o n z e n t r a t e .

Das Vitamin A ist eine augerordentlich labile Substanz, die gegeniiber Luftsauerstoff, insbesondere bei erhShter Temperatur, iiberaus empfindlich ist, und sich chemisch und in ihrer Wirksamkeit rasch veriindert. Uber die Ver~nderungen des Vitamin A berichten C o r b e t und H o l m e s (45), sowie R o b i n s o n (38) und S m i t h (39).

Welchen Einflu~ auf die Hal tbarkei t des Vitamin A hat es nun, ob es Ms freier Alkohol oder als nativer Ester in einem Pr~parat vorliegt ?

In der Literatur (22, 26, 39) bestehen sehon einzelne Hinweise dafiir, dal~ das Vitamin A in der Form der nativen Ester weniger empfindlich ist gegeniiber Luftsauerstoff und tIitze, als in der Form des freien Alkohols.

* A n m e r k u n g bei der K o r r e k t u r : In letzter Zeit priiften wir auch ein drittes Konzentrat doppelt, das heil3t als Esterkonzentrat E und als Kon- zentrat A mit freiem Axerophtol; wiederum war, auf Dosen gleichen E- und t/lauwerts bezogen, das Esterkonzentrat E 1,60 mal wirksamer als das Konzentrat A.

186 W. G ~ B :

Bei Aufbewahrung der Konzentrate bei Zimmertemperatur in braunen, fast vSllig gefiillten Flaschchen mit paraffiniertem Stopfen zeigte sich w~hrend eines Jahres bei beiden Typen der Konzentrate keine wesentliche Abnahme im Blau- und E-Weft. Die etwa gefundenen Unterschiede liegen noch im Bereich der Fehlerbreite der Verfahren.

I-IElt man abet die Konzentrate in offenen Schalen im Dunkeln an der Luft, so gehen E- und Blauwert beim Konzentra~ I..~it Vitamin A-Alkohot schon innerhalb 5 Tagen auf die tt~lfte zuriick, beim Esterkonzentrat dagegen bleiben sie voll erhalten. Beim Aufbewahren im zerstreuten Tages- licht unter Luftzutritt ist Unter den gleichen Bedingungen beim Kon- zentrat A der Blauwert schon nach 90 Stunden auf die H~lfte gesunken, beim Esterkonzentrat dagegen in der gleichen Zeit noch unver~indert.

(Tbersicht fiber die beobachteten Werte gibt die T a b e l le 2.

Tabelle 2. V e r g l e i c h d e r H a l t b a r k e i t von Vitamin A in Form von Ester und in Form yon freiem Alkohol.

Es wurden je 10 g der Pr~parate Nr. 28 und 29 in offenen Petri-Schalen mit einer Oberflgche yon 28 qcm im diffusen Tages]icht und im Dunkeln an der Luft auf- bewahrt. Die Tabelle gibt die _~nderung des Carr-Price-(Blau-)Wertes und des E-Wertes in Abh~ngigkeit yon der Zeit an, und zwar in absoluten Ziffern und in Prozenten des entsprechenden Ausgangswertes. Die Konzentrate waren in Erdnu1351 gelSst, das keinerlei Zusatz enthielt.

S |d .

0 18 66 90

114 137 185 233 281

I m T a g e s l i c h t I m D u n k e l n

V e r s e i f t e s P r ~ p a r a t E s t e r p r h p a r a t Ver se l f t e s E s t e r p r ~ p a r a t , P r ~ p a r a t , B l a u w e r t B l a u w e r t

IO/o des

2040 100 1870 92 1460 72 990 49 407 20

C a r t - ~176 des A u s -

P r i ce - g a n g s - W e r t w e r t e s

1990 100 2030 102 2040 102 1990 100 1900 95 1780 90 1560 78 690 35

B l a u w e r t

Ca r t - P r i c e - W e f t

O/o des A u s -

g a n g s - w e r t e s

E - W e r t

E - W e f t

B1 a u w e r t E - W e r t

L o E - W e r t O[o des a a r r L ]0 des o[0 des Aus- 1~:: - i Aus- Aus- lee-

g a n g s - W e f t gwantge s- g a n g s - w e r t e s I s w e r t e s

100 100 94 84 69 54 22

34,0 1990 2060 2010 2020 2000 2020 1860 1760 1180

100 103 101 101 100 33,0 101 30,7 91 87 i< 1,7o! 59 i

32,0

31,6

2040 1910 1710 1410 1110 450

r

18,0 1,70

100

99

103 96

< 5

Nach 118 Stunden wurde ein Tell der im Dunkeln aufbewahrten Konzentrate mit hydroehinonhaltigem Erdnul~51 verdfinnt fiir die Pr/iffmg im Tierversueh.

Aus der Tabelle ersieht man, dal] der Riickgang im Blauwert (und E-Weft) bei den Konzentraten mit fl'eiem Vitamin A sofort nach Beginn des Einflusses yon Licht und Luft einsetzt, w~hrend bei den Konzentraten mit Vitamin A-Ester offenbar die ZerstSrung des Vitamin A erst dann beginnt, wenn das 01 ranzig geworden ist.

Beziehungen zwischen chemiseher Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 187

Wit nehmen an, dal~ gerade dieses Verhalten der verschiedenen Typen yon Vitamin A den Schlfissel liefert zur Erklgrung der besseren Wirk- samkeit der Vitamin A-Ester im Tierversueh: Die Vitamin A-Ester fallen bei der Aufnahme per os in 51iger L6sung in viel geringerem AusmaB der ZerstSrung anheim wie das freie Vitamin A als Alkohol.

5. E i n f l u f i d e r V e r s e i f u n g a u f d ie U m r e c h n u n g s f a k t o r e n , d ie f i i r d ie V i t a m i n A - K o n z e n t r a t e g e l t e n mi i s sen .

Unsere Untersuchungen haben gezeigt, dab die Vitamin A-Ester also wirksamer sind als freies Vitamin A; die Umreehnungsfaktoren aus dem E-Wef t auf die biologische Wirksamkeit sind demgemiil~ bei den Ester- konzentraten erheblich hSher als bei den Konzentraten mit freiem Vitamin A. In der Tabelle 6 im Anhang geben wir zungchst einen Uberbliek fiber alle yon uns untersuchten Pri~parate m i t den dabei im einzelnen gefundenen Umrechnungsfaktoren, und als Ergiinzung dazu eine Zusammenstellung der in der L}teratur angegebenen Umreehnungsfaktoren f t i r Lebertran, Konzentrate und kristallisiertes Vitamin A (Tabelle 8 und 9).

Bei der Angabe der biologisehen Wirksamkeit jedes einzelnen Pr~parats ver- fuhren wir so, dag wir die an jedem Priiparat beobaehteten Zuwachswirkungen bei mehreren Dosen mit der Wirkung des g le iehzei t ig gepr~ften/3-Carotinstandard- pri~parats verglichen haben.

Im einze]nen trugen wir die gefundenen Zuwachswerte jedes Pri~parats in das Koordinatennetz ein; dann bestimmten wir au~ graphischem Wege aus den drei bzw. vier Werten bei versehiedenen Dosen den Sehwerpunkt, und zwar unter Beriieksiehtigung der Zahl der Tiere bei jedem einzelnen Punkt. Dureh den so ermittelten Sehwerpunkt der zu suchenden Wirkungskurve des Pr~parats legen wir nun eine ParMlele zur Wirksamkeitsgeraden des//-Carotins, die ja dieselbe Neigung hat wie die der Vitamin A-Pri~parate (s. Abb. 1). Auf dieser Parallelen wird nun jener Abszissenwert gesueht, der die gleiche OrdinatenhShe hat wde 1,8 y = 3 i. E. //-Carotin. Dieser Abszissenwert gibt jene Dosis an, die in ihrer Wirksamkeit der yon 3 i. 13. /~-Carotin entspricht.

Die Umrechnungsfaktoren wurden dureh Bildung der entspreehenden Quo- tienten der Tabellenwerte bei jedem Pr~parat einzeln gewonnen. Sie wurden bei gleiehartig hergestellten Priiparaten zu Mittelwerten zusammengefagt, und zwar wiederum unter Bertieksiehtigung der Zahl der ffir jede einzelne Beobaehtung vel~,endeten Tiere.

Selbstverstiindlich geht die Streuung des biologisehen Versuehs auch in die Relation zwischen E-Weft und biologische Wirksamkeit mit ein, so dal~ also der Umrechnungsfaktor nur angegeben werden kann rhit der im biologischen Versueh ermittelten Streuung.

Bei der Bereetmung der Streuung des :Umrechnungsfaktors gingen wir so vor, dag wir die mittlere Abweichung aus den Einzelwerten des Umrechnungsfaktors errechneten. Die Streuung der Umreehnungsfaktoren stellt also ,,den m i t t l e r e n Fehler des Mi t t e lwer tes" dar.

Aus der grSl~eren Wirksamkeit der Vitamin A-Esterkonzentrate im Verhgltnis zu ihrem spektrophotometrisch gemessenen E -Wef t ergibt sich, dal3 auch d ie U m r e e h n u n g s f a k t o r e n b ei d e n K o n z e n t r a t e n E h S h e r s i n d a l s be i d e n K o n z e n t r a t e n A .

188 W. G~AB:

I m einzelnen ergaben sieh im Durehsehnitt unserer Versuehe als Quotient aus biologischer Wirksamkeit (in internationalen Einheiten pro Gramm) und E-Wert :

Bei Konzentraten mit Vitamin A-Alkohol: 1800 ~ 400. Bei Konzentraten mit nat ivem Vitamin A-Ester: 3400 ~ 600. Diese Werte sind als Umrechnungsfaktoren fiir die betreffenden

Konzentrate unserer Herstellung anzuwenden.

V ,

Besprechung der Ergebnisse.

Das wesentliche Ergebnis unserer Untersuchungen besteht darin, dag Vitamin A-Priloarate, die das V i t a m i n A i m n a t i v e n , v e r e s t e r t e n Z u s t a n d enthalten, w i r k s a m e r und h a l t b a r e r sind, a l s Pr~.parate re_it freiem V i t a m i n A - A l k o h o l . Dementsprechend sind auch die Um- rechnungsfaktoren aus den Extinktionskoeffizienten E und dem Carr- Price-Wert bei den Konzentraten mit Vitamin A-Ester hSher, als bei den Konzentraten mit Vitamin A-Alkohol.

Wir betrachten zunachst den Umreehnungsfalctor aus dem E-Wer t in die biologische Wirksamkeit (in internationalen Einheiten pro Gramm) bei P r ipa ra ten mit freiem Vitamin A.

Da selbst, hochwertige Konzentrate neben Vitamin A immer noch Begleitstoffe enthalten, wodurch die Messung der Lichtabsorption gestSrt sein kann oder keinen sicheren RiicksehluB auf den Gehalt an Vitamin A zuliigt (vgl. Abschnitt II) , so legt man wohl am besten f ib die Berechnung des Umrechnungsfaktors jene Werte zugrunde, die man an reinem kri- stallisiertem Vitamin A gemessen hat. In der Tabelle 8 im Anhang sind die beobaehteten Werte zusammengestellt.

Wie schwierig es aber ist, bei hochwertigen Vitamin A-Praparaten eine a 11 g e m ei n giiltige Beziehung zwischen dem Extinktionskoeffizienten

T und der biologisehen ~ irksamkeit anfzustellen, zeigen gerade die Messungen an dem mehrfaeh untersuchten kristallisierten P r i p a r a t yon Vitamin A yon H o l m e s und C o r b e t (45).

Der E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t dieses Priiparats zeigte eine Abhs yore Alter der hergestellten L6sung; w~hrend bei ganz frisch verd~innten LSsungen der E-Wert einer 1%igen LSsung bei 1 em Sehiehtdicke f[ir die Wellenls 328 my. = 2i00 betrug (entspreehend einem molekularen Extinktionskoeffizienten yon 60000), sank dieser hohe Wert im Verlauf yon 61nigen Stunden scharf ab auf einen endgiil~igen Wert yon E t % -- 1600, wobei sich eine neue Absorptionsbande bei

1 cm 360 my. entwiekelte.

Die biologisehe W i r k s a m k e i t dieses kristallisierten Vitamin A-Pr~parats wurde in zwei versehiedenen Laboratorien geprffft, und zwar stets naeh dem Batten- waehstumsversueh; bei der einen Untersuehung wurde das Priparat in acht ver- sehiedenen Verd(tnnungen an insgesamt 47 Tieren geprtift, und die Wirkung dieser Dosen mit der einmal gepriiften Dosis yon 1 i. E. des Sta.ndardpr~i~rats (an 9 Tieren )

Beziehungen zwisehen ehemiseher Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 189

vergliehen. Das Pri~parat wurde danaeh bezeichnet als: ,,betri~ehtlich wirksanler als 2,2 Millionen i. E. pro g und etwas weniger als 3,4 Millionen i. E. pro g". Ein genauerer Wert li~ftt sich wohl kaum angeben, da ein Vergleieh des kristallisierten Vitamin A-Priiparats mit dem internationalen Standardpriiparat nur bei einer einzigen Dosis durehgefiihrt wurde. Bei der Prfifung des gleiehen Priiparats in einem zweiten Laboratorium ergab sich eine Wirksamkeit ,,yon mehr als 2,5 Mil!ionen i. E. pro g", wobei eine Angabe fiber das Gewicht dieser Beobachtung fehlt.

Die aus diesen Ziffern der biologischen Wirksamkeit und den beiden Extink- tionskoeffizienten sich ergebenden Umrechnungsfaktoren liegen zwisehen den Werten 1080 und 2125 (,zglo Tabelle 8 im Anhang). Eine Entseheidung zwischen diesen Werten ist sehwierig, solange dureh neue breit angelegte Versuchsreihen niaht einer yon den Werten best~tigt wird. Mead (21) gibt ffir sein kristMlisiertes Vitamin A-Pri~parat als E-Wert 1820 an (in ~thanol gemessen), der innerhalb 20 bis 30 Minuten nach Herstellung der L6sung beobachtet wurde.

Unter den beobaehteten Extinktionskoeffizienten ist fraglos der h6ehst ge- messene Wert yon E = 2100 der richtigste; da sich aber das empfindliche Vitamin A- Molekfil in verdfirmten L6sungen rasch veriindert, ist won in der Praxis meist nur ein etwas niedrigerer Wert des Extinktionskoeffizienten zu messen. Bei den hSchst wirksamen Konzentraten, die duroh Vakuumdestillation hergestellt worden sind, sind als Extinktionskoeffizienten E~ an dem Pr~parat von Car r (61) gemessen worden E = 1600, und nach Angaben yon Mead (21) an einem andelen Priiparat E - - 1 9 5 0 . Alle Werte zusammengefal3t w/irden einen Mit te lwer~t ffir einen

�9 1 0 / 0 E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t en des Vitamin A geben,-der bel e twaE 1 ~m = 1800 liegt. Bei den Angaben fiber die biologisehe Wirksamkeit des kristallisierten Vitamin A

(aus Vergleiehsversuehen mit dem internationMen Standardpr~parat) ist es sehr sehwierig, einen Mittelwert zu finden, da ausreiehende Angaben fiber den Umfang der Versuehe und fiber die Genauigkeit des erhaltenen Ergebnisses fehlen.

W e n n es sehon sehwierig ist, aus den bei k r i s ta l l i s ie r tem Vitamin A gemessenen W e r t e n einen a l l g e m e i n g i i l t i g e n U m r e e h n u n g s f a k t o r zu ermi t te ln , so erseheint dies fas t unm6glieh, wenn mai l die in der L i t e r a t u r vor l iegenden Angaben t iber U m r e c h n u n g s f a k t o r e n bei L e b e r t r a n und K o n z e n t r a t e n f iberbl iekt . H ie r sehwanken die Wer te , wie die Tabel le 9 (ira Anhang) zeigt, z~dsehen 680 und 2380. Ordne t m a n aber die e inzelnen W e r t e naeh der A r t de r P rgpa ra t e , so lgg t sieh bere i t s erkennen, dal3 die Lebe r t r ane immer hShere Umreehnungs fak to ren h a t t e n als die Konzen- t r a te . Dieser Befund is t so auff~llig, dal3 er ~n versehiedenen Aufs~tzen i iber die Auswer tung yon V i t a m i n A - P r g p a r a t e n bere i ts besproehen wurde.

So diskutierten M o r g a n und Mitarbeiter (47) bereits die M6gliehkeit, dal~ das Vitamin Abei der Verseifung einen Riiekgang in seiner Wirksamkeit erleiden kSnne, der sieh weder in seinem Extinktionskoeffizienten noeh in seinem Carr-Priee-Wert erkennen li~13t.

Andererseits stellte H u m e (58) f6st, dal3, auf gleiehen Extinktionskoeffizienten bezogen, ein natfirlieher Heilbuttran nur um ein weniges besser wirkte als ein ebenso geprfiftes Konzentrat mit freiem Vitamin A, und sie folgert daraus, dab also der Untersehied im Umreehnungsfaktor zwisehen freiem Axerophtol und ver- estertem Vigamin A nieht bedeutend sein k6nne.

Demgegenfiber muBte es immer wieder auffallen, dal~ aber gerade bei einem veresterten Pri~parat, wie beim U. S. P. Cod-Liver-tteferenee-Oil, das besonders hiiufig untersueht wurde, der Umreehnungsfaktor weir hSher lag als bei den meisten Konzentraten.

190 W. GaAB:

Aueh wir haben das amerikanische Vitamin A-Standardpr~iparat U. S. P. Cod- Liver-Reference-Oil (Kontroll-Nr. 1-39-A) untersucht und wir fanden, daf~ es ~u 95% aus verestertem Vitamin A besteht. Die genaue Messung der biologisehen Wirksamkeit dieses Standardpr~parats ist bei uns noch nieht abgesehlossen.

Dal~ man den so wesentlichen Unterschied in der Wirksamkeit zwischen verestertem und freiem Vitamin A bisher iibersehen konnte, ist verwunderlieh; wahrseheinlich liegt dies abet daran, dal] man die bei den Messungen der Vitamin A-Wirksamkeit und der zugehSrigen Extink- tionskoeffizienten beobachteten Unstimmigkeiten dutch immer wieder neue Beobachtungen wenigstens zum Teil erkNiren konnte. Im einzelnen ist man dabei zu folgenden interessanten Ergebnissen gekommen:

Naeh den systematischen Untersuchungen englischer Laboratorien (47, r 49) gibt es nieht nur einen, sondern mehrere Stoffe, die die spezifischen antixerophthalmisehen und waehstumsfSrdernden Wirkungen des Vi- tamin A besitzen. Von diesen Stoffen hat man den mit Vitamin A2 be- zeichneten 'bereits n~iher kennengelernt.

~Vitamin [A2 unterscheidet sieh yon Vitamin A nur dadureh, dag es eine um die Atomgruppierung - -CH=CH-- Ningere Seitenkette besitzt, seine ultraviolette Absorption (Maximum bei 350 mlx ) ist dagegen von der des Vitamin A versehieden. Aueh in der FarbtSnung der Blaureaktion mit Antimontriehlorid kann Vitamin A 2 yon Vitamin A unterschieden werden.

Aul~er dem Vitamin A 2 soil noch ein weiterer Stoff mit spezifiseher Vitamin A- Wirksamkeit im Lebertran vorkommen, der bei 285 m~ ein Maximum der Lieht- absorption zeigt und sieh ebenfalls in der Blaureaktion yon Vitamin A unterseheidet.

Endlich wurde aueh noeh das Vorkommen yon cyelisiertem Vitamin A in Fisehleber61en beschrieben (48), das naeh Embree (63) biologiseh unwirksam ist, and ein eharakteristisehes Ultraviolettabsorptionsspektrum zeigt, in der Cart-Price- Reaktion yon Vitamin A selbst abet nieht untersehieden werden kann.

/donzentrate, die Vitamin A und A 2 oder auch noeh die anderen eben auf- gez~ihlten Stoffe gleiehzeitig enthalten, ~eigen natiirlieh eine gr6ftere Wirksamkeit, als sich aus dem bei 328 m~ gemessenen Extinktionskoeffizienten entnehmen Nif]t. Vitamin A~ kommt in den Leber61en yon Sfil]wasser- und Seefischen vor; in einer Reihe yon ktir~lich ersehienenen Arbeiten (26) wird fiber die Verteilung yon Vita- min A und Vitamin A~ in der Natur berichtet, und es wird gezeigt, daft die anti- xerophthalmisehe Wirkung sieh in ganz derselben Weise auf mehrere natfirlich vorkommende Stoffe verteilt, wie die antiraehitisehe Wirksamkeit auf mehrere Formen yon Vitamin D.

Man kSnnte nun denken, dal3 die ganzen Diskrepanzen in der Wirk- samkeit zwisehen den in ihrem/~-Wert iiquivalenten Vitamin A-Prgparaten einfaeh darauf beruhen, dal~ sie versehiedenen Gehalt an Vitamin A2 oder an den anderen wirksamen Stoffen besitzen. Bestimmt man aber die Menge des Vitamin A2 in solehen LeberSlen genauer, so mug man erkennen, dal3 ihre Menge in keinem Falle ausreieht, um die bestehenden Unstimmig- keiten zwischen E-Wert und Wirksamkeit roll zu erklgren (48).

Die y o n uns g e p r i i f t e n K o n z e n t r a t e e n t h a l t e n s i c h e r k e i n V i t a m i n A2. Aueh fiir die Anwesenheit der bei 285 m# absorbierenden Stoffe oder fiir eyelisiertes Vitamin A haben wir keine Anhaltspunkte.

Beziehungen zwisehen chemiseher Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 191

Der yon uns gefundene Wirkungsuntersehied zwisehen den Konzen- t ra ten A und E kann also nicht auf die Anwesenheit yon Vitamin A2 oder ~quivalent wirkenden Stoffe bezogen werden.

Der oben erw~hnte Unterschied in der Wirksamkeit der Konzentrate und der unverseift gebliebenen Lebertrane wurde gelegentlich auch noeh mit anderen Beobaehtungen zu erkl~ren versucht. Man mu~te n~mlieh feststellen, da~ das Vitamin A in manehen Konzentraten so rasch zugrunde ging, da$ sehon wi~hrend der Dauer des Tierversuchs eine Abnahme in der Wirksamkeit einsetzte (58).

Dal3 das Vitamin A in I~onzentraten yon freiem Axerophtol raseher zugrunde geht als in Konzentraten yon Vitamin A-Estern, haben auch wir beobachtet (vgl. Tabelle 2).

In erster Linie ist dabei zu denken an eine ZerstSrung des Vitamin A durch Bildung yon Peroxyden beim Ranzigwerden des Oles, in welehem das Vitamin A gelSst ist, wie da~ Robinson (38) und Smith (39) gezeigt haben. Dazu kommt noch, dal] das freie Vitamin A an seiner alkoholischen OH-Gruppe de'r Oxydation zu Aldehyd unterliegt, was beim Ester nieht mSglieh ist. Besonders verhKngnisvoll Jst es rain, daft eine solche geringe Oxydation gar nicht leieht zu erkennen ist, denn nach Robinson (38) geht die biologische Wirksamkeit des freien Vitamin A bei allm~hlicher Oxydation rascber zurfiek als sein E- und Blauwert. Berechnet man also bei einem zum Teil verdorbenen Vitamin A-Konzentrat mit ffeiem hxerophtol aus dem E-Wert und der geringen Wirksamkeit den Umreehnungsfaktor, so wird man ihn besonders niedrig linden.

Robinson hKlt das Vorkommen yon teilweise oxyd ie r t em Vita- min A in K o n z e n t r a t e n fiir die Ursache, dal] viele Untersueher so auffallend niedrige Werte ffir die Umrechnungs fak to ren aus dem E-Wer t in die biologisehe Wirksamkei t l inden. Wit mSehten auf Grund eigener Versuche uns der Meinung yon Robinson anschlief~en.

In unseren Praparaten mit freiem Vitamin A kann die schlechtere Wirksamkeit wohl ]~aum auf eine solche durch noch unveranderte E- und Blauwerte verschleierte 0xydat ion des Vitamin A bezogen werden; denn wit haben bei allen Konzentraten Lieht und Luftsauerstoff mit grol]er Sorgfalt ausgeschlossen und die Axerophtolkonzentrate immer schon baldigst mit hydrochinonhaltigem 01 verdiinnt, das ja die 0xydat ion hemmt. Auch bei einer Naehuntersuchung erwies sich in unseren Axerophtol- Konzentraten der E-Weft noch ebenso hoch wie zu Beginn des Versuchs, w~hrend ja bei d e r m i t der Zeit weiter mn sich greifenden Oxydation der E-Weft bedeutend hatte znriickgehen miissen.

W i t s i nd a l so d e r A u f f a s s u n g , dal~ d ie y o n uns g e f u n d e n e b e s s e r e b i o I o g i s c h e W i r k s a m k e i t de r o h n e j e d e V e r s e i f u n g h e r g e s t e l l t e n K o n z e n t r a t e y o n V i t a m i n A a u s s c h l i e $ 1 i e h d a r a u f b e r u h t , dal~ in d i e s e n P r / ~ p a r a t e n das V i t a m i n A in F o r m de r n a t i v e n E a t e r v o r l i e g t , d ie h a l t b a r e r u n d b e s s e r w i r k s a m s ind als f r e i e s A x e r o p h t o l .

Oben wurde erw/ihnt, dal] man die MSglichkeit einer besseren Wirksamkeit der Vitamin A-Ester bereits erwogen hatte (47, 58). Versuche

I92 W. G~A~:

zum direkten Beweis fiir einen etwaigen Wirkungsunterschied wurden abet zum ersten Male yon B i r d und E m m e t (42) unternommen. Ihre bisher vorliegenden Angaben sind zwar noeh nieht sehr aufsehlugreieh, lassen aber doeh sehon jetzt erkennen, dag die Vitamin A-Ester, auf gleiehen E-Weft bezogen, etwa doppelt so wirksam sind wie die Vitamin A-Konzentrate mit freiem Axerophtol. Besonders beweiskrgftig ist ihre weitere Angabe, dal3 freies Vitamin A naeh der Wiederveresterung wieder eine hShere Wirksamkeit erlangt, wenn gueh der Ausgangswert vet der Verseifung nieht mehr ganz erreicht wurde.

Wir fanden als Umreehnungsfaktor aus dem Extinktionskoeffizienten in die Wirksamkeit bei Konzentraten mit verestertem Vitamin A einen Wart yon etwa 3400 -4_ 600. Eine Ziffer ghnlicher Gr6genordnung wurde aueh sehon bei W o l f f (51) erwghnt.

Dal3 rein zahlenmgl3ig die Umreehnungsfaktoren in unseren Versuehen wesent- lieh hSher liegen Ms bei Bird und Emmet , kann versehiedene Ursaehen haben, unter denen das Ausgangsmaterial und die Art tier Herstellung des Vitamin A- Xonzengrats die wiehtig~sten sind. Wir haben das Esterkonzentrat aus Lebern in ganz besonders vorsiehtiger Weise gewonnen, naehdem uns die ~ugerordentlieh grebe Empfindliehkeit des Vitamin A geliiufig geworden ist. Wit gingen ja, im Gegensatz zu den meisten Ungersuehern, nieht yon fertigen Leber61en aus, sondern vonder unverarbeiteten Leber, so dab also dos Vitamin A in unserem Esterkonzen- trot gewissermal~en noeh in der ,,notiven Form", wie in der Leber des lebenden Tieres, enthalten ist. Ob diese ,,native Form" des Vitamin A vielleieht besonders leieht resorbiert wird, ist dureh unsere Versuehe Mlein noeh nieht zu entseheiden.

Aus letzter geit stammen nun Untersuchungen yon M e a d, C o w a r d und U n d e r h i l l (21), die die Wirksamkeit yon zwei kristallisierten Estern yon Vitamin A untersueht haben. Dis fiir den Vitamin A-Anteil des Esters bereehneten Extinktionskoeffizienten bei 328 m# ergaben Werte yon 1790 und 1830, die mit den fiir kristallisiertes Vitamin A praktisch zu findenden Werten gut iibereinstimmen. Die biologisehe Wirksamkeit des Vitamin A in diesen Estern wurde nngewShnlieh hoch gefunden, n~mlieh zu 3,2 bis 3,4 Millionen internationale Einheiten pro Gramm. Leider fehlt eine Vergleiehspriifung mit kristallisiertem Vitamin A-Alkohol. Vergleieht man abet die yon C o w a r d nnd U n d e r h i l l gefundene Wirksamkeit des veresterten Vitamin A mit der bisher bekannten yon freiem Vitamin A (2 bis 2,8 Millionen internationale Einheiten p ro Gramm), so fiillt wieder auf, dag die Esterpr~i.parate etwa 1,5 m~l so wirksam sind wie die im E-Weft gquivalenten Prgparate mit freiem Axerophtol.

Ein unmittelbarer Vergleieh der Wirksamkeit dieser k i i n s t l i e h e n Vitamin A-Ester mit den n a t i v e n in de r L e b e r v o r k o m m e n d e n Estern ist aber immer noeh nieht mSglieh, da die Resorption soleher un - n a t i i r l i e h e n Ester nieht mit der yon n a t t i r l i e h vorkommenden Vi- tamin A-Estern ohne weiteres gleiehgesetzt werden kann. Da aber weder die Verseifung der kiinstliehen Ester in vivo, noeh ihre Resorption ver- lgl~lieh festzustellen sind, k6nnen die Absolutwerte der Umrechnungs- faktoren fiir Vitamin A/Ester nut an solehen Prgparaten ermittelt werden,

Beziehungen zwisehen ehemiseher Form und Wirksamkei~ yon Vitamin A usw. 193

die die natiirliehen vorkommenden Ester des Vitamins A enthalten, die ja wahrseheinlieh ebenso vollst~indig wie die anderen Fet te im KSrper resorbiert und ausgenutzt werden. Selbstverstandlieh ist dabei, dal3 ein wirklich sieheres Ergebnis nut erwartet werden kann bei der Prfifung yon Pr~paraten, deren Herstellung yon Anfang an ausschliel31ich im Labora- torium iiberwacht worden ist. Wegen der grol~en Streuung der Vitamin A- Wachstumsversuche halten wir eine Priifung unter Verwendung mSglichst vieler Tiere ffir unbedingt erforderlieh.

Wenn man end]ich die E- und Blauwerte miteinander in Beziehung setzt, so finder man bei Konzentraten mit Vitamin A-Ester ungefiihr die gleiehen Verhg]tnis- ziffern wie bei jenen mit freiem Axerophtol, da ja die Versgifung auf diese Werte keinen EinfluB hat. Die an unseren IKonzentraten gefftndenen Werte stimmen mit denen der Literatur iiberein.

DaB Vitamin A in der Esterform besser wirksam ist als in der Form des freien Alkohols, ist, aber eigentlich niohts Uberraschendes. Etwas ganz Entspreehendes hat man auch bei Oestronpriiparaten in ihrer Wirkung a u f dss Uteruswachstum kennengeternt. Bier wurde der Untersehied im Wirkungstypus zwisehen Oestron und Oestronestern als so wesentlich empfunden, dab sich die internationale Standardisierungskommission zur Aufstellung eines neuen Standardprgparats ffir Oestronester entsehlieBen muBte. Bei Vitamin A dfirfte aber wahrscheinlich ein neues Prgparat fiir die Esterform nicht erforderlieh sein.

Da das fl-Carotin als Standardpriiparat fiir Vitamin A gut definiert und in gentigendem Grade haltbar ist, ist es als Bezugspr~iparat vorli~ufig kaum zu ersetzen. Da Carotin aber nieht vollst~indig resorbiert und gespalten wird (6, 7), entspreehen 0,6 ;~ des fl-Carotins im Durehsehnitt der Wirkung yon 0,3 y reinem Vitamin A.

Dem Untersehied in der Wirksamkeit yon freiem Axerophtol und Vitamin A-Ester mug aber dadureh Rechnung getragen werden, dal] ftir die beiden ehemisehen Formen des Vitamin A v e r s e hi e d e n e Umreehnungs- faktoren angewandt werden. Bei der vergleiehenden Auswertung yon Vitamin A-Praparaten bekannter Herstellung kSnnen die E- und die Blauwerte allein sehon Anhattspunkte fiir die biologisehe Wirksamkeit geben. Hier kann also der fiir das betreffende Prgparat ermittelte Um- reehnungsfaktor verwendet werden. Bei t ' raparaten unbekannter Her- stellung ist aber ein sieheres Urteil fiber die Wirksamkeit der Tier- versuehe unentbehrlieh.

VI. Anhang.

Versuehsanordnung zur Messung der Wirksamkeit yon Vitamin A im Tierversueh.

1. Tiere.

Junge, aussehlieglieh m~nnliehe Batten aus einer grol3en Tierzueht werden in Gewieht yon etwa 35 bis &5 g, d.h. an ihrem 20.--25. Lebenstag, einzeln in luftige Emaillekessel gesetzt und erhalten Vitamin A-armes Futter; sie werden wOehentlich zweimal gewogen.

194 W. GRAB:

Im Laufe der ns 3 Woehen nehmen die Tiere noeh an Gewieht zu, dann kommt es zum Gewichtsstillstand, der als Zeichen ffir die ErschOpfung der VitaminA- Vorri~te des Tieres anzusehen ist. tIaben die Tiere bet drei aufeinanderfolgenden W~gungen, also wghrend 10 Tagen, Gewiehtskonstanz oder Gewiehtsabnahme gezeigt (= Vorperiode), so werden sie in Versueh genommen, d. h. die Zugabe einer Dosis Vitamin A mit der Pipette beginnt (= Versuehsperiode). Nur solehe Tiere werden in den Versuch genommen, deren KSrpergewieht naeh Ablauf der Vor- periode zwisehen 40 und 70 g liegt. Tiere aus dem gleiehen Wurf werden gleieJami~13ig auf die verschiedenen Dosengruppen verteilt. Der Versuch dauert yon dem ersten Tag der Zuffitterung des Pr~parats an 35 Tage lang. Ftir jede einzelne Dosis setzen wir durehsehnittlich 12 Tiere.

2. F u t t e r .

Reiss~irke 65%, extrahiertes Casein (Vitamin A-frei) 21%, Salzraischung naeh Osborne und Mende l 5,5%, Coeosfett 3,5%, Here 5,0%, dazu 9,5 ecru einer 5]igen L6sung yon kristallisiertem Vitamin D~ mit insgesamt 0,02 mg kristallisiertem Vitamin D2 (vgl. 53).

Substanzen, die auf ihre Vitamin A-Wirksamkeit zu prfifen waren, wurden stets in Erdnul~61 gel6st gegeben. Kontrollversuche ohne jede Zulage yon Vitamin A, also mit reinem Erdnul~51, zeigten, aal~ die Tiere alle innerhalb 12--20 Tagen unter schwerer Gewiehtsabnahme starben. Das yon uns verwandte Erdnu1361 enthielt 0,01% Hydrochinon, um die MSglichkeit einer Oxydation der in 0l gelSsten Sub- stanzen auszusehliel~en. Fehlte dieses tIydrochinon, so ging, wie wir mehrfaeh beobaehteten, die Wirksamkeit yon Vitamin A-Praparaten rasch zuriiek.

Die Verdiinnung der zu prfifenden Substanz erfolgt dureh W~gungen, die wegen der Viskosit~t des 01es erheblieh genauer sind als volumetrische Verd~innungen (1 ccm 01 = 0,92 g). Jedes Tier bekam t~glieh 0,01 ecru der 51igen L6sung mit Pipette ins Maul. Die zu prfifende Substanz wurde fiir jede Dosis besonders ver- dtinnt, so daI3 also alle Dosen yon Vitamin A in einer Gesamtmenge yon 0,01 ccm O1 gel6st waren. Im einzelnen erfolgte die Verdfinnung in der Weise, daI~ die ge- samte for den 5 Woehen dauernden Versuch nStige ~enge auf fiinf kleine yell- standig gefiillte Einzelgefal3e verteilt wurde. Die • L6~ungen wurden im Eis- sehrank bet § 2 ~ aufbewahrt. Ftir jede Woehe wurde ein neues Flitschchen in den Versuch genommen, so dab man stets mit praktisch fl'isehen L6sungen arbeitete.

3. S t a n d a r d .

Als Standardsubstanz benutzen wir das internationale Standardpr~parat, eine 0,03%ige L6sung yon reinem fl-Carotin in Cocos61. 2 mg dieser 01igen LSsung enthalten 0,6 7 reinesfi-Carotin und entspreehen derWirksamkeit yon 1 internationalen Einheit. Das intemationale Standardpraparat bezogen wir in zwei Lieferungen in besonderen versehiedenen Einzelproben 1935 und 1938. Da die Mengen dieses internationalen Standardpr'@arats nieht so groI~ sind, dal~ man bet jeder Versuehs- reihe zur Vitamin A-Auswertung ein Standardpr~parat mitlaufen lassen kann, wurde ein sogenannter Hilfsstandard eingefiihrt, eine Mai~nahme, die aueh die internationale Vitaminkommission sehon vorgesehen hat. Als H_ilfsstandard be- nutzen wir im Bedarfsfalle fl-Carotin-Merck, das mit seinen ehemischen Kon- stanten mit den flit fl-Carotin in der Literatur angegebenen Werten fibereinstimmt.

Die der Sendung des in~ernationalen Standardpr~parats beigegebenen An- weisungen ffir den Gebrauch des Pr~parats wurden genau belolgt.

4. A u s w e r t u n g y o n V i t a m i n A - P r ~ i p a r a t e n .

Die biologisehe Auswertung yon Vitamin A-Praparaten erfolgt ja heute aus- sohliel~lieh dureh Vergleieh des zu prfifenden Pr~parats mit dem internationalen

Beziehungen zwischen ehemiseher Form und Wirksamkeit von Vitamin A usw. ] 95

Standardpr/iparat, das in einem ganz genau ebenso durehgeffihrten Parallelversueh gleiehzeitig mit der gleiehen Versuchsanordnung ~uf seine Wirksamkeit geprtift werden mul3. An Stelle des internationalen Pr~parats kann der Hilfsstandard treten, dessen Wirksamkeit, bezogen auf das Standardpriiparat, aus vielen Einzel- versuchen bekannt sein mug.

Die Bestimmung eines a b s o l u t e n Grenzwertes der Wirksamkeit (Ermitt]ung jener kleinsten Menge, die bestimmte bio]ogisehe Wirkung hervorbringt), wird heute meistens ~urfiekgestellt, zugunsten der Messung der r e l a t i v e n Wirks~mkei~ des zu prOfenden Pr~parats gegentiber einem gleiehzeitig untersuehten Standard- pr~parat. Diese Vergleiehsmessung schaltet eine grunds~tzliche Eigenheit der Tierversuehe aus, dal] sie n~mlieh in ihren Ergebnissen periodisehen Sehwankungen unterworfen sind. Aueh wir haben des 6fteren beobaehtet, daI~ in manehen Zeit- absetmitten die Ergebnisse der Vitamin A-Versuche erheblich yon den Werten aus anderen Zeitabscbnitten abwichen. Eine Beziehung dieser Abweichungen zur Jahreszeit haben wir aber bisher niehL linden kbnnen. Diese Beobachtung ~.eigt, dal~ die g l e i ehze i t i ge ~Prfifung der beiden zu vergleichenden Pr/iparate eine unabdingliche: Forderung darstellt.

Wit verfilgen fiber eine grol~e Anzahl yon Einzelbestimmungen der Wirksam- keit des internationaten Standardpriiparats zu versehiedenen Jahreszeiten yon 1936--1938, um daraus eine Durehschnittskurve der Werte aufstellen zu kbnnen.

5. R e e h ' n e r i s c h e A u s w e r t u n g .

Als Mall der Wirksamkeit yon Vitamin A wurde in jedem Versueh die du reh - s c h n i t t l i e h e G e w i e h t s z u n a h m e D bestimmt, das ist die Summe der Gewiehts- zunahmen gl, g2, g3 . . . . . g,n aller n Tiere wghrend des 35 Tage dauernden Versuehs, dividiert dureh die Zahl n der den ganzen Versueh f i b e r l e b e n d e n Versuchstiere.

Naeh den Untersuchungen yon Coward und anderen (5, 18, 19, 40, 52) kbnnen die Versuehe mit Messung der Zuwaehswirkung eines Stoffes sehr wohl ebenso zuverl~ssig gestaltet werden, wie ~ndere tierexperimente]le Verfahren aueh. Notwendig ist nur die peinlich genaue Beriieksichtigung aller Vorsichtsmal~nahmen.

Da nach den Angaben yon Coward (18, 19) de r Gewichtsanstieg der Ratten- weibchen schon normalerweise flacher erfolgt, ist das Versuehsergebnis bei Ver- wendung yon Weibchen ungenauer, da die logarithmisehe Varianz ~ doppelt so groB ist als bei M~nnchen. Wir nahrnen daher ausseblie:6lich M~nnehen.

Als Ma$ ffir die Wirksamkeit der Vitamin A-Pr~parate kbnnte man an Stelle der durehsehnittliehen Gewiehtszunahme zwar auch andere Zah]enwerte w&hlen; wir haben nun alle Mbgliehkeiten, um zu genauen MaBzahlen der Vitamin A-Wirkung zu kommen, erprobt; in jedem einzelnen Falle wurde die Streuung bereehnet, und zwar die sogenannte

mittlere Abweichung a = ~= V n __ 1 (Standarddeviation)*.

Es zeigte sieh nun, dab die Streuung bei den Werten ffir die Durehschnitts- gewiehtszunahme ein Minimum erreicht. Wir konnten tins also auf die Ermittlung dieser durehsehnittlichen Gewiehtszunahme D beschr~inken.

* Es ist riehtiger yon mittlerer Abweichung zu spreehen, als von mitt]erem Fehler, da die biologischen Streuungen ja keine Mel]fehler sind, sondern nur auf der verschiedenen Empfindliehkeit der einzelnen Tiere beruhen. Die biologisehe Variation der Empfindliohkeit der Tiere wird nut mathematiseh-formal dureh die gleichen Formeln dargestellt, wie die Fehlerrechnung.

196 W. G x i n :

Die Bestimmung des D-Wertes yon einer Versuchsgruppe gilt als e ine Beob- achtung far eine bestimmte Dosis eines Vitamin A-Pr~parats. Nun wurden die N versehiedenen Werte D l, D 2, D a , . . . , D~ yon gleiehen Dosen der Vitamin A-Pri~parate gleicher ArL wiederum zusammengefagt zu einem Mittelwert M, und Yon diesem Mittelwert wiederum die mittlere Abweiehung ~u errechnet.

Noeh ein Wort zu den wi~hrend des Versuehs vorzeitig sterbenden Tieren. Wir haben uns nieht entschliel~en kSnnen, die sterbenden Tiere bei der Berechnung von D irgendwie in Reehnung zu stellen, und zwar aus zwei Griinden:

1. Die BerecSnung eines Mittelwertes D far eine Versuchsgruppe setzt voraus, dag ~lle Tiere die gleiche Menge Vitamin A erhalten haben. Dies ist jedoch bei den toten Tieren nicht der Fall, die oft nut die Hilfte, oder sogar nur den dritten Tell der Gesamtdosis bekommen haben, well sie ja zu friih gestorben sind. (Wir fiitterten tgglich bis zdm Ende des Versuchs.)

2. Die Bereehnung des Mittelwertes einer Versuehsgruppe setzt weiterhin . . . . . # .

voraus, dal3 dm Elnzelwerte fur den Mlttelwert zum glelchen Zeltpunkt abgelesen werden; auch das ist bei den toten Tieren nieht mSglich, da ja bei diesen bestenfalls die Gewichtsver~nderung am Todestag festgestellt werden kSnnte und vSllig un- bekannt ist, wie sich das Gewieht dieser Tiere ver~ndert haben warde, wenn sie bis zum Ende des Versuehs gelebt hitten.

Der einzige Nachteil des Ausseheidens aller vorzeitig gestorbenen Tiere besteht darin, dag far eine Versuehsgruppe yon l0 Tieren bei kleinen Vitamin A-Dosen am Ende desVersuehs oft nur 3--4 Tiere far die Bereehnung des Mittelwertes ~brig- bleiben. Diese Mil]lichkeit fiberwindet man aber dadureh, dab man bei ldeinen Dosen Vitamin A yon Anfang an mit einer Tiergruppe yon mehr. als 10 Tieren starter. Auf diese Weise ist es gut mSglieh, die bei kleinen Dosen Vitamin A zu erwartende geringe Gewiehtszunahme oder sogar Gewichtsabnahme zu ermitteln, wie wir vielfaoh beobaehteten.

Die Grfmde, weswegen ein Tier im Vitamin s vorzeitig stirbt, sind im Einzelfall unbekannt; meist liegt eine manifest gewordene Infektion vor, die das Tier infolge seines Mangels an Vitamin A-Reserven nieht mehr iibersteht.

Selbstversthndlich haben aueh wir beobaehtet, dag sehr wohl ein Zusammen- hang zwisehen der Vitamin A-Dosis und der Absterber~te der Tiergruppe besteht. Diese Beziehung zwisehen Absterberate and Vitamin A-Dosis liefert eine zweite Msgliehkeit, die Wirksamkeit yon Vitamin A-Prgparaten zu bestimmen, die aber mit der Messung der Zuwachswerte yon ]ebenden Tieren niehts zu tun hat.

Aus den vor s t ehenden Ausf i ihrungen e n t n i m m t man, dab wir die durchsehni t t ] iehe Gewichtszunahme w~hrend des 35 Tage daue rnden Versuchs als das bes te M a t fiir die W i r k u n g einer b e s t i m m t e n Dosis V i t amin A in unsere Berechnungen einsetzten.

W i e oben sehon a u s g e f i i h i t , be rechne ten auch wi t die biologisehe S t reunng bei jeder einzelnen Tiergruppe, die die gleiehe V i t a min A-Dosis erhiel t , gesondert , und erhie l ten so die W e r t e a i , (~2, �9 �9 -, a~..

D a wi t die gleiche V i t amin A-Dosis an mehreren T ie rg ruppen mehrfaeh pri i f ten, erhiel ten wi t eine g e i h e yon D u r e h s e h n i t t s w e r t e n D i �9 �9 �9 D~v fi ir eine Reihe aus 2( Beobaehtungen , die wir zu einem Mit te lwer t M zusammen- f a t t e n , na t i i r l ieh anger Ber i ieks ieht igung des Gewiehts der Beobaohtungen , wie sie sieh aus der Anzahl der einzelnen den ganzen Versuch i iber lebenden Tiere ergibt (weighted mean).

Beziehungen zwischen chemischer Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 197

Zur Berechnung des Mittelwertes iVl nach dem wirkliehen Gewicht der Beob- aehtung miil~ten eigentlieh die tats~chlieh gefundenen Streuungen ~1 �9 . air inner- ha]b der Einzelbeobaehtung eingesetzt werden, entspreehend der Formeh

D 1 D~ D s

M = 1 1 16.. .

Zur Vereinfaehung der Bereehnungen des naeh dem Gewieht der Beobachtungen korrigierten Mittelwertes haben wit nun nicht die wirklichen Gewiehte, sondern die nach der Wahrseheinlichkeitsrechnung vorauszusehenden Gewichte der Eingel- beobaehtungen benutzt, und dementsprechend die Formel sngewandt:

M ~ hi" D1 + n2. D~ + %. Ds + -" �9 nl + n2 + n3 + . ."

Hatte man so die Mittelwerte M der Gewiehtszunahme fiir die einzelnen Dosen erhalten, so wurden diese in ha]blogarithmische Koordinaten eingetragen, nnd man erhielt auf diese Weise das Bild der Abb. 1.

Da die bei einer abgestuften Zugabe yon Vitamin A zu beobaehtenden Gewichts- ~,unahmen eine ,,graduierte Reaktion" darste]len, go sollte die Zuwaehswirkung y direkt proportional dem Logarithmus der Dosis z ansteigen; Coward, Key , Dyer und l\~organ (40)und andere haben Beispie]e ftir eine solche Gesetzm~f~igkeit beim Vitamin A-Versueh gegeben; tr~gt man die gefundenen Mittelwerte 5/I der Zuwachs- wirkung als Ordinate y und den Logarithmus der Dosis z als Abszisse x im I4oordi- natennetz ein, so so]lten im Idealfa]l alle Werte auf einer Geraden liegen.

Da aber nun wegen der biologischen Streuung die einzelnen gefundenen Wdrte 5/i nicht direkt auf einer Geraden liegen, mull diejenige Gerade, die am besten allen Punkten gereeht wird, erst ermittelt werden.

Diese N~herungsgerade mu~ selbstverst~ndlich diehter an denjenigen Punkten vorbeiziehen, die auf Grund einer grSi3eren Anzahl yon Tieren und mit geringerer Streuung ermittelt wurden, als an anderen Punkten, die nur auf Beobachtungen an weniger Tieren beruhen, d. h. also: alle l%nkte sind nach dem ,,Gewieht der Beob- achtungen" zu werten. Eine exakte M6gliehkeit einer solehen Bewertung liefert die B e r e e h n u n g der R e g r e s s i o n s g l e i c h u n g naeh F i s h e r [vgl. dazu Burn(57)], die in der Ausdrucksweise der analytischen Geometrie die Gleichung der ,,besten N~herungsgeraden" fiir alle naeh dem @ewicht ihrer Beobachtungen korrigierten Punkte darstellt.

Die allgemeine Gleichung heil3t:

y = ~ §

~) = Mittelwerte aller Yl, Y2, Ya . . . . d. h. also der Werte Mi , M 2 , .M 3 . . ;

x - - log z; z = Dosis yon Vi tamin A; s --~ log S; S ---- Dosis yon fl-Carotin;

~-- Mit telwert aller x l . . . x,~;

b = Z y . ( x - - ~ )

Diese l~egressionsgleichungen haben wir fiir alle unsere Prgparate bereehnef% und in Abb. 1 die entspreehende Gerade eingezeiehnet.

Ne lson und Mitarbeiter (20) sch]agen vet, zur ErhShung der Genauigkeit des biologischen Vitamin A-Versuehs die ,,vSllig abweichend reagierenden Versuehs- tiere" (Au~enseiter) zu identifizieren und auszuseheiden. Ne lson (20) hatte eine Stand~rdabweichung ~.~ ~ von :i: :[3,9 g. Nach Ausseheidung der Au~enseiter

Archly f. experiment. Path. u. Pharmakol. Bd. 193. lzi

198 W. GaAB:

gelang es, am auf 4-12 ,0g herabzudrfieken. Coward (18) gibt als Standard- abweichung bei 672 weibliehen Batten %~ = 4- 11,0 g an, bei miinnliehen Batten ar~ = 14,72 g, bei 1110 Batten beiderlei Gesehleehts am = 4- 11,9 g.

I m Gegensatz dazu bet r i ig t die mi t t l e re Abweiebung a,~ ( = kor r ig ie r t naeh dem Gewieht der Beobaehtungen) fiir alle unsere eigenen Versuehe: = 7,91 g; sie is t also wel t geringer, als die der englisehen und amer ikan i sehen Labora to r i en ; wi t b a t t e n also zur Anbr ingung wei terer K o r r e k t u r e n an Ergebnissen unserer V i t amin A-Versuehe keine Veranlassung. Berechnung von a,~ s. S. 205.

6. B e z e i c h n u n g e n (zur no chmaligen Ubersieht).

1. W e r t e b e i V e r s u e h s r e i h e n .

N ---- Anzah l der Versuehsreihen, M = Mi t te lwer t aus D : . . . D~:,

v ~ m 2 , , a . . . . #,~ # = mi t t l e re S t reuung der Mi t te lwer te = ~2 ] " e . . . . e ~/~' 1 N' m = D i f f e r e n z M - - D 1 , M - - D 2 , M - - D e .

2. W e r t e f i i r E i n z e l v e r s u c h e .

n - - Anzah l der a m Schlul~ des Versuchs lebenden Tiere einer Einzel- beobaeh tung ,

g l - - . g, = Gewieh tszunahme eines Tieres im Ver lauf yon 5 Woctien, D = Durchschn i t t sgewieh t szunahme der Tiere einer E inze lbeobach-

gl + g2 "'" g~ tung - -

d t . . . d ~ = D i f f e r e n z D - - g l . . . D - - q z . . . D - - g , , Z d e - - Summe aller d 1 2 . . , d,], z = Dosis des Vi tamin A - P r g p a r a t s in Gamma, x - - log z,

a = mi t t l e re S t reuung ~ 4- ] / 22 d "2 [ n - - l '

y = M ~ , M2 . . .

y = Mi t te lwer t aus al len W e r t e n y,

b - - 2 2 n y ( x - - ~ ) X n ( x - ~)2'

= mi t t l e re r Feh l e r des Mit~elwer~es = | / Xd2 _ a 8

V n (n - 1) tire' S---- Dosis des f i -Carot ins tandards , s = log s.

Wi r haben unsere Recbnungen durchgef i ib r t ft ir 19 Auswer tungen (11 fiir Axeroph to l - und 8 f t ir V i t amin A-Esterprgl0ara te ) in N = 84 Vet- suebsre ihen an n---- 664- Tieren.

Beziehungen zwisehen chemiseher Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 199

Tabelle 3. B e z i e h u n g ~ w i s e h e n D o s i s v o r r f l - C a r o t i n s t a n d a r d u n d G e w i c h t s z u n a h m e be i V i t a m i n A - f r e i e r n i ~ h r t e n B a t t e n .

~r. d~s Vitamin A- V~rsuchs

Haupt- versuehszeit

Monat/Jahr

2385 XII . 1935

2403 XII . 1936

N ~ 2

2466 VII. 1936

2466 VII. 1936

N ~ 2

2385 I. 1936

2403 XII . 1936

2403 II . 1937

2471 VIII . 1938

2475 X. 1938

2478 I. 1939

N---- 6

2466 VI. 1938

2466 VI. 1938

N = 2

2385 I. 1936

2385 II . 1936

2403 XII . 1936

2403 I1. 1937

2471 VIII . 1938

2471 VIII . 1938

2475 XI. 1938

2478 I. 1939

N ~ 8

2385 I

2~o3 !

N ~ 2

I. 1936

I. 1937

TI~gliche Dosis S

7

0,3

0,3

0,5

0,5

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

0,6

1,0

1,0

1,2

1,2

1,2

1,2

1,2

1,2

1,2

1,2

1,8

1,8

Zahl der Tiere

10

10

2O

10

10

2O

10

10

1 0

10

10

10

60

10

9

19

10

10

10

10

10

9

9

10

Zahl der iiber- lebenden Tiere n

10

9

6

15

5

9

4

8

10

5

41

10

9

9

9

9

8

0

0

17

19

9

78 71

10 10

10 10

20 20

217 i76

Gewiehtszunahme in g

Durchschnitts- weft D mit Slreuung (~

Mitte]werte

1,15 ~: 6,9

9,3 ~: 2,0

11,9 • 8,0

11,1 ~ 12,0

6,0 :t: 9,0

14,4 ~: 8,0

2,0 =k 5,6

10,5 ~: 6,4

15,3 • 9,3

10,0 =l= 5,6

15,9 :k: 6,1

14,9 d: 8,2

9,33:1= 5,9

7,20 =k 5,5

14,75 =k 5,8

7,9 nk 4,6

26,4 • 6,3

15,1 d: 4,5

29,1 ~ 8,6

20,5 ~ 9,5

12,2 J : 5,5

26,7 4- 9,4

M _+/~ nach Gewicht der

Beobachtungen

3,59 :~ 5,28

11,6 :k 0,56

11,09 :~ 4,67

15',4o ~ 0,7

16,36 ~: 8,56

19,45 ~: 10,2

14"

200 W. Oxa~ :

Tabelle 4. B e z i e h u n g ~ , w i s c h e n D o s i s v o n K o n z e n t r a t A m i e V i t a m i n A - Alkoho l u n d Gewich t s~ .unahme bei V i t a m i n A-f re i e r n g h r t e n R a t t e n .

I Nr. des I Hanpt-

Vitamin A- ~ yersuchszeit gersuchs I ~onat]Jahr

2453 i III . 1938 i

iv = 1 2444 ' XII. 1937 i

i v = 1 2441 XI. 1937 2415 X. 1937 2418 VII. 1937 2450 II. 1938 2453 II. 1938 2428 IX. 1937 2428 VII. 1937 2 4 1 8 VIIL1938

N = 8

2393 ] VII. 1937 2389 V. 1936 2388 ! III. 1936

iv = 3

2453 2450 2441 2444 2411 2411 2415 2428 2418

iv ----9

2393 VIII. 1936 2 4 2 8 VIL1937 2388 VI. 1936 2411 V. 1936 2389 IV. u. V. ].936 2418 VII. 1938

i v = 6

2450 I III. 1938 2415 V. 1937 2444 : XII. 1937

iV = 3

2388 IV. 1936 2389 V. 1936 2393 VII. 1936

N = 3

2388 IV. 1936 2389 V. 1936 2393 VIII. t936

2 ? = 3

T~gliche Dosis

?

10,0

12,5

15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0

20,0 20,0 20,0

25,0 25,0 25,0 25,0

�9 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0

40,0 40,0 40,0 40,0 40,0 40,0

50,0 50,0 50,0

Zahl der Tiere

10 10 1o

6 10 10 10 72

10 i0 I0 3O

9 10 10

s

10 10 10 10

Z a h l - -

d e r f i b e r - lebenden

Tiere

i;

5 3

47

10 10 10

87

10 10 10

10

@ewiehtszunahme in g

Durehsehnitts- ~vert /) mit Strennng o

12,3 4- 10,5

6,0

17,5 4- 6,5 15,3 4- 4,5 3,3 4- 7,6 8,6 • 2,75 5,0 ~ 9,1

12,0 4- 5,2 8,0:6 8,5 9,6 4- 9,4

16,2 4- 15,8 ~-

3,4 •

II. 1938 II. 1938 XI. 1937

XII. 1937 1V. 1937 V. 1937 V. 1937

VII. 1937 VII. 1937

60,0 60,0 60,0

80,0 80,0 80,0

3O

6 7

10

69

10 10 10

1! 59 56

I~ 10

8 27 24

10 10 i0 10 10 10 30 30

10 10 10 10 ]0 I0 30 30

350 290

22,8 • 18,2 • 15,9 • ] 11,3 i 14,2 i

112,0 4- 14,0 3= 13,7 :k

110,6 • r

22,O :t: i 19,6 • 18,4 •

115,8 • 17,3 • 14,1 4-

23,1 4- 16,7 • 22,4 4-

21,2 :i: 26,1 • 20,2 :h

9,8 5,0 4,8

8,1 9,6

13,9 13,2 3,25 1 5,7 5,5 4,6 8,6

4,8 7,1 8,2 4,9 8,9 5,1

7,0 10,6 3,4

5,5 8,6 5,5

4,1 9,9

2o,4

21,54- 27,1 4- 17,6 •

Mittelwerte M-+# nach Gewleht der

Beobaehtu~ge~

12,3

6,0

11,01 ___ 5,1

11,8 4- 7,3

14,36zh3,66

18,11 :h 3,3

20,5 :E 3,66

22,75 ~ 3,2

22,16 4- 4,8

Beziehungen zwischen chernischer Form und Wirks~mkeit yon Vitamin A usw. 201

Tabelle 5. B e z i e h u n g z w i s c h e n Dos is K o n z e n t r a t E m i t V i t a m i n A - E s t e r und der

G e w i c h t s ~ u n a h m e be i V i t a m i n A - f r e i e r n ~ h r t e n R a t t e n .

Nr. des Vitamin A-

Versuehs

Haupt- versuchszeit

Monat/Jahr

2448 II. 1938 2457 I IL 1938 2473 X. 1938

N = 3

2443 [ XII. 1937 J

2399 ] X. 1936

N = 2

2423 VI. 1937 2457 II I . 1938 2448 I. 1938 2474 IX. 1938 2473 IX. 1938 2477 I. 1939

N = 6

2399 X. 1936 2399 XL 1936 2457 III . 1938 2448 I. 1938 2423 VI. 1937 2474 IX. 1938 2443 XII. 1937 2473 IX. 1938 2477 I. 1939

N = 9

2399 r x i i . 1937 N ~ 1

2423 VII. 1937 2477 ~ I. 1939

N = 2

2443 I XII. 1937 2423 ] X. 1936

N ~ 2

Tagliche Dosis z

7

8,3 8,3 8,3

12,5 12,5

15,0 15,0 15,0 15,0 15,0 15,0

25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0

37,5

40,0 40,0

50,0 50,0

Zahl der Tiere

9 10 10

29

8 10

18

9 10 10 10 10 10

59

10 10 10 10 10 10

7 10 10

87

9

10 10

Zahl der fiber- lebenden Tie~e n

Oewichtszunahme in g

Durchschnltts- wef t D mit Streaung (~

10,2 ~ 6,6 - - 2 ,0 4- 5,0

11,0 4- 5,4

14

5 17,8 ~: 7,2 3 1.3,3 4- 11,4

8

9 7 7

10 9

7

49

7 1o 10

9 10

9 6

10 9

80

9

10 10

20 20

10 8 10 10

20 18

242 198

17,4 ~: 4,75 17,1 4- 12,4 21,0 4- 3,2 21,9 ~ 7,2 23,4 :~ 9,2 19,8 ~: 7,2

9,3 4- 15,0 4- ]8,0 4- 20,3 4- 25,5 :h 21,1 24,3 28,2 ~: 16,2 4-

7,2 4,7 6,3

12,5 14,0

6,4 9,2 8,7

10,5

20,1 :/: 10,2

25,1 • 8,1 33,6 5:11,2

24,9 :J: 15,1 23,8 4- 6,0

Mittelwerte M_+# naeh Gewicht der

Beobachtungen

8,90 4- 3,8

16,11 4- 3,1

20,23 4- 2,54

19,95 4- 6,05

20,1

29,35

24,3 • 0,88

2 0 2 W. GRAB :

Tabelle 6. L i s t e d e r g e m e s s e n e n W e r t e b e i v e r s e h i e d e n e n K o n z e n - t r a t e n , u n d de r s i c h aus d i e s e n W e r t e n e r g e b e n d e n U m r e e h n u n g s -

f a k t o r e n .

a) Eigene Konzentrate A mit Vitamin A-Alkohol, dureh Verseifen

erhalten.

Nr. des Yersuehs

2388 40,6 2389 33,6 2393 33,2 2411 46,2 2415 41,3 2418 42,5 2428 41,3 2441 36,0 2444 26,5 2450 46,7 2453 34,4

Mittelwert: 38,6

b) Eigene Konzentrate E, deren Vitamin A-Gehalt zu mindestens 95 % ausverestertem Vitamin A besteht.

Biologisehe! Quotient Wirksam- I beider

keit / Werte Nr. des W~rt in inter- = Urn- u

nationalen reehnungs- Einh./g faktor L

42 000 85 000 60 000 70 000 65 000 60 000 70 000 80 000 45 000 85 000 80 000

1480 2399 2530 2423 1700 2443 1520 2448 1570 2457 1410 2473 1690 2474 2220 2477 1700 Mittelwert: 1820 2330

1810 69 200

40,0 32,5 31,5 42,1 42,1 41,2 39,8 46,2

39,4

Biologisch~ Wirksam-

keit in inter-

nat.ionaien Einh./g

90 000 120 000 120 000 140 000 100 000 160 000 150 000 170 000

130 000

Quotient bolder Werte

Um- reehnungs-

faktor

2250 3680 3810 3320 2380 3880 3760 3680

3380

Aus den einzelnen Werten der Umrechnungsfaktoren wurden nun nach den iiblichen Formeln, unter Beriieksiehtigung des Gewichts der Beobaehtung, die mittleren Abweichungen der Mittelwerte bereehnet, und zwar zu 1810 ~: 375 oder fund 1800 -~ 400 fiir Konzentrate A mit freiem Vitamin A-Alkohol, und zu 3380 :t: 605 oder fund 3400 : : 600 fiir Konzentrate E m i t Vitamin A-Ester.

TabelleT. V i t a m i n A - P r i ~ p a r a t e a u s d e m H a n d e l b e z o g e n , H e r s t e l l u n g s - v e r f a h r e n u n b e k a n n t ,

Kolonne 1

Nummer des

~/ersuehs

Cart- Priee- Weft

3 !

Biologisehe 100 cem_ Wirksamkeitin

g am intorn~tionMen Einheitenlg

Umrechnungsfaktoren = Quotient der Kolonnen

4]2 4,:8 2i3

2469 2472 2409 2409a 2485

2468 2476

2400 160 267

4800 4525

2000 1250

Verseifte Pr~,parate :

49,4 90000 37,5 1,7 1200 7,5 7,5 6000 22,5

123,5 ] etwa 140000 I etwa 29,0 7,6 [ 120 000 I 26,5

Veresterte Pr~parate:

40,6 120 000 63,0 32,0 120000 96,0

2020 700 800

etwa 1130 1580

2950 3750

48,6

35,5 33,8 59,5

46,8 39,1

]3eziehungen v.wisehen ehemiseher Form und Wirksamkeit yon Vitamin Ausw. 203

Tabette 8. E x t i n k t i o n s k o e f f i z i e n t , C a r r - P r i e e - W e r t , b i o l o g i s e h e W i r k - s a m k e i t u n d die Q u o t i e n t e n aus d i e s e n W e r t e n .

Verfasser ratur- Wert E-Weft Wirksamk. I I. E. Nr. = Blau Nillionen ]Bl~la I.E./E

i. E./Oramm

a) Bei h6ehs~ wirksamen Konzentraten. C a r t , J e w e l l . . . . . . . . [ 61 80000 [1600 2,000 Britiseh Drug Houses . . i 62 80000 1600 2,400 Mead . . . . . . . . . . . . . . . . I 21 86000 '1950

b) Bei kristallisiertem Vitamin A. ' sofort [I > 2,265 H o l m e s und C o r b e t . . . 45 i 100000 2100 i i 3,400 1

nach einigen Stunden: 1600 {I :> 2,265

yon Verfassern angegebener Mittelwert: 1600 i % 3,0003'400 Mead . . . . . . . . . . . . . . . . ! 21 92000 1820 i M e a d , C o w a r d und f ~. I 85000 1830 I 3,181

U n d e r h i l l [ I z l i 96000 11790 3,424

26,0 1250 30,0 1500

50,0 50,0 44,0

22,6 !]080 34,0 ]620 4~,7

14151 2125162,5 1 8 7 0 6 2 , 5

50,5 1740 46,5

i 1910 53,5

8. B e r e e h n u n g d e r R e g r e s s i o n s g l e i e h u n g e n u n d d e r s i g n i f i k a n t e n D i f f e r e n z .

Die Bereehnung der Regressionsgleiehungen ist naeh den vorstehenden Aus- ftihrungen und den in den Tabellen gegebenen Einzelwerten leieht verst/indlieh; wir verziehten daher auf eine Wiedergabe der durehgefiihrten Reehenoperationen. Es sei darauf hingewiesen, dab wit jeden Befund naeh dem ,,Gewieht der Beob- aehtungen" gewertet haben, d .h . unter Bertieksiehtigung der Zahl der Tiere, an denen der Wert gewonnen wurde und der zugehSrigen Streuung.

Die Bereehnung der signifikanten Differenz wird etwas ausfiihrlieher wieder- gegeben, da sie sonst kaum verstiindlieh ist. Die Bereehnung der signifikanten Differenz geht aus yon der Formel:

V4 + ~ - - ' e 1 = die mittlere Abweiehung des Mittelwertes M1, e 2 = die mittlere Abweiehung des Mittelwertes M 2.

Nach den grundlegenden Ausfiihrungen yon P t t t t e r (59) ist es zweifelhaft, ob im Falle des Vitamin A-Versuehs es bereehtigt ist, die mittlere Abweiehung s des Mittelwertes zu bereehnen; derm gerade bei den Mittelwerten M handelt es sieh ja nicht um eindeutig definierte GrSl3en, sondem um Werte, die, aus den einzelnen Durehsehnittswerten D bereehnet, ebenfalls eine Streuung tt besitzen.

Wir haben daher znr Bereehnung der signifikanten Differenz zwei versehiedene Wege eingesehlagen, die beide den Grad der Signifikanz des Wirkungsuntersehiedes zwisehen den Konzentraten A und E erkennen lassen.

Im allgemeinen sell k > 2 sein. Wenn k = 2 ist, so ist zu erwarten, daft der gefundene Untersehied M 1 - - M 2 bei 20 Wiederholungen des Versnehs 19real gr613er gefunden wird als die mittlere Abweiehung des Mittelwertes e; es ist also n u t einnml unter 20 Malen ein mittlerer Fehler s zu erwarten yon der Gr613e des Wirkungsuntersehiedes, der also n u t einmM als soleher nieht erkannt werden kann.

]_ ie Tatsaehe, da13 bei 20 Wiederholungen der AuswerLungen 19 real wirklieh die ge2undene L iiferenz auf einem tats~ehlichem Wirkungsuntersehied beruht, mu8 als gentigender Grad yon Signifikanz bezeiehnet werden.

204 W. GI~AB :

Tabelle 9. U r a r e c h n u n g s f a k t o r e n d e r L i t e r a t u r .

Lite- Yerfasser ta ta r -

B i r d , E m m e t 42

L a t h b u r y 46

M o r g a n , E d i s - 47 b u r y - M o r t o n

P r i t c h a r d 48

R o b i n s o n 38

H u r a e , C h i c k 37

Pri~parat

Lebertran . . . . . . . . . . . . . . . Konzent ra t 1, schwach

verseift . . . . . . . . . . . . . . . Konzent ra t 2, starker

verseift . . . . . . . . . . . . . . . Konzent ra t 3, v611ig ver-

s e i f t . . . . . . . . . . . . . . . . . . Konzent ra t 2, reacetyliert

USP Cod-Liver-Reference- Oil . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Andere 01e . . . . . . . . . . . . . Konzentra te . . . . . . . . . . . .

US1 ) Cod-Liver-t~eferenee- Oil . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Heilbutt- u. Thunfisehtran Konzentra te des I-Iandels

I-Iandelskonzentr~te aus Dorschtran . . . . . . . . . . .

Andere Konzentra te . . . . .

Konzentra te . . . . . . . . . . . . 3 0xydat ionss tufen [ I

yon Konzentra ten t I I I, II. und III III

Konzent ra t . . . . . . . . . . . . . .

Cod-Liver-t~eference Oil, Mittel aus Versuchen in 12 Laboratorien, Ein- zclwerte nieht ange- geben . . . . . . . . . . . . . . . .

Lebertran, Mittel ausVer- suchen in 2 Labora- torien . . . . . . . . . . . . . . . .

Lebertran, Mittel aus Ver- suchen in 10 Labora- torien . . . . . . . . . . . . . . . .

Mittelwert der letzten drei Lebertrane, nach Zahl der Einzelversuche ge- wertet . . . . . . . . . . . . . . . .

Umrechnungsfaktoren ~us

Biol./Blau Biol./E-Wert

2000

1970

1420

9O5 1950

44 1410 40 bis 45 1100--1700 20 ,, 25 900--1400

42 1800 20 his 21 1100 15 ,, 16 680--960

17,7 1310 34,0 < 7 0 0

21,5 1060 22,5 950 20,5 650 10,0 190

1300 :~360

2080

1430

2380

2150

Blau /•-Wert

32

42 52 44,6

52 42 31 18

E r s t e s V e r f a h r e n .

Zuns benutzten wit die gleichen Verfahren zur Berechntmg yon k, wie sie in der Li teratur bei C o w a r d (18) angewandt worden sind; dies.es Vorgehen hat den Vorteil, dal3 unsere Werte rait denen in der Literatra- verg]ichen werden k6nnen.

Fiir die obenstehende Formel ist es notwendig, die raittlere Abweichung e des Mittelwertes zu berechnen. Ira ersten Verfahren bereckmen wir sic aus der

Beziehungen zwisehen ehemischer F o r m und Wirksamkei t yon Vi tamin A usw. 205

ganzen Anzahl n a l l e r Tiere und der dazugehSrigen mi t t le ren St reuung am. Wir bezeichnen in diesem Falle die mi t t lere Abweiehung m i t e ' . :

B e r e c h n u n g y o n e'. s ' gilt als GenauigkeitsmaB for den Mit telwert ; die Abh~ngigkei t yon der St reuung a br ingt die Formel zum Ausdruek:

8p O~m =~n-"

Da nun der Wer t a b e i den Einzelversuchen etwas wechselt, wie j a die Ta- bel]en 3 bis 5 zeigen, haben wit nach einem Vorschlag yon G a d d u m [zit. bei (18)] einen Wer t a,, berechnet aus der Summe ~' aller d 2 aus allen Versuchen, und zwar nach der Formel :

~m ha t nun die Bedeutung, dab immer 2 yon 3 Tieren einen Zuwaehswert zeigen, der innerhalb der Grenzen d_ %n yore Mittelwert an gereehnet liegt, as, ist yon der Ar t der geprtif ten Vi tamin A-Priiloarate und auch yon der GrSl]e des Zu- wachswertes D in keiner Weise abh~ngig, n ~ Anzahl der R a t t e n in all unseren Versuehen zusammen = 664 (M~nnchen); N ~ Anzahl der Versuehsreihen mi t e twa je 8 Tieren pro Gruppe am Ende des Versuchs = 84; X d e ~ aus allen Ver- suchen zusammen ~ 36294. Aus allen Wer ten ergibt sich: a m ~ :~ 7,91.

Wir haben fiir jede unserer drei P r a p a r a t t y p e n die mit t lere St reuung a m aueh einzein bereelmet. Die entspreehenden Werte sind:

bei fl-Carotin: n = 176; N = 22, 2 : d e = 8095; daher a~n = ~ 7,25

bei Konzen t r a t A: n = 290; N = 37, s 2 = 14617; daher a~j'~ ~ ~: 7,60 ppv bei Konzen t r a t E : n = 198; N = 25, X d e = 13582; daher am = :~ 8,86

Die Einzelwerte der mi t t le ren St reuung s t immen befriedigend mi te inander i iberein; der etwas hShere Wer t bei g o n z e n t r a t E erklgrt sich durch die etwas geringere Zahl der Tiere und der Versuehsreihen.

Zur Durchf i ihrung der Bereehnung yon k w~ihlen wir die Zuwaehswerte bei der Dosis 25 Y der Konzen t ra t e E und A. also Mz = 19,25 und M e ~ 14,36. Setzt m a n in die obige Formel diese Ziffern und a m = • 7,91 ein, so erreehnet sich k ~ ~t,3.

Auf Grund unserer Erfahrungen halter wir aber den Vitamin A- Wachstumsversuch fiir wesentlich ungenauer, als es sich aus der vorstehenden Berechnung ergibt. Wit haben deshalb s noch auf eine zweite Art be- rechnet; dabei haben wit jene Werte in Rechnung gestelIt, die man bei einer zu beliebiger Zeit angestellten Wiederh01ung des Vitamin A-Wachs- tumversuchs erhalten wfirde. Auf diese Weise bekommt man in Gestalt yon s ein sehr viel Verl~l]licheres Genauigkeitsmal~ des Vitamin A-Versnchs, das den Befunden in der Praxis auch wirklich angemessen ist.

Auf Grund der vorstehenden Uberlegungen haben wit daher zur Berechnung der Genanigkeit des Vitamin A-Versuchs noch ein zweites V e r f a h r e n a n g e w a n d t :

Z w e i t e s V e r f a h r e n .

Eine Auswer tung von Vi tamin A muB ja in der Praxis stets so durehgef i ihr t ~verden, dal3 mehrere Gruppen yon Tieren ( ~ Versuchsreihen) mi t versehiedenen Dosen des zu pr~ifenden F rapa ra t s behandel t werden, und entspreehend andere

206 W. GRAB:

Tiergruppen mit ebenso vielen Dosen des StandardprSparats; man muB daher die durchschnittliche Gewichtszunahme D einer ganzen Gruppe yon Versuchstieren als Einzelwert ansehen; da man bei Wiederholung des Versuchs mit der gleichen Dosis immer wieder andere Werte yon D erhSlt, ist zu priifen, mit weleher Streuung fl diese Einzelwerte D um den Mittelwert M der betreffenden Dosis herumliegen. Zur Berechnung yon/ t dient wieder die Forrael:

IN-- i "

N = Anzahl der Versuehsreihen bei der betreffenden Dosis. Da die Anzahl N bei manchen Versuchsreihen klein ist, haben wit eine mittlere

Streuung i% aus a l l en Versuehen erreehnet, ganz entspreehend wie oben die GrSl3e a m bereehnet wurde. Selbstverstgndlieh wurde zur Bereehnung yon ,%~ jeder Einzelwert naeh dem Gewieht seiner Beobaehtung eingesetzt.

Auf diese Weise erreetmet sieh die mittlere Streuung aus allen N = 84 Ver- suehsreihen zu Pm = 4,65.

iCm erweist sieh wie am, yon der Art der geprOften Pr~parate und yon der GrSge des Zuwaehswertes M vSllig unabh~ngig. !~m kann daher Ms allgemeine m i t t l e r e S t r e u u n g clef V e r s u e h s r e i h e n angesehen werden.

Aus dem Weft /~m erreetmet sieh nun leieht wieder die mittlere Abweiehung des Mittelwertes e, die wir in diesem Falle m i t e " bezeiebnen.

e'" bereehnet sieh aus der Formel:

/2m

Prtift man nun mit dem so erhaltenen Wert ~on s" wiederum, ob die gefundene Differenz M~ -- M 2 in der Wirkung der Konzentrate A und E bei der Dosis ~-on 25 y signifikant ist, so erreehnet sieh k aus diesen Werten zu k = 2,55.

Dieser Wert yon k bedeutet, dab unter 30 Wiederholungen der ganzen Aus- wertung 29real die mittlere Abweiehung des ~viittelwertes kleiner ist als die ge- fundene Wirkungsdifferenz; d.h. also, dab unter 30 F~llen 29real die gefundene Differenz zwisehen den Konzentraten A und E auf einem Unterschied in ihrer Wirksamkeit beruht.

Dieser Wert yon k erreehnet sieh daraus, dal~ far die I(onzentrate E der Wert N = 8 ist, und far die Konzentrate A der Wert = 11 ist.

Die der GrSBe yon k entspreehenden Wahrseheinliehkeitswerte entnimmt man aus den bei B u r n (57) abgedruekten Fishersehen Tabellen.

D i e s e s E r g e b n i s b e d e u t e t , d a b d e r g e f u n d e n e W i r k u n g s -

u n t e r s c h i e d t a t s i i e h l i e h s i g n i f i k a n t i s t .

Wir ha l ten die Benu tzung der GrSl]e #~ zur Bereehnung yon e und

dami t zur Berechnung der s ignif ikanten Differenz ftir viel verliil31icher

als die Benu tzung yon am, da es sich ja beim typischen Vi t amin A-Versueh nieht um einzelne Tiere handel t , sondern ]miner nu t um Gruppen yon

Tieren in F o r m ganzer Versuehsreihen.

Mit Hilfe der OrSl3e i~m kann man jetzt aueh die Frage beantworten, wieviel Einzelversuehe man anstellen mug, um zu beweisen, dag der Wirkungsuntersehied zwisehen zwei Priiparaten wirklieh signifikant ist, also k mindestens = 2 ist.

Zur Durehfiihrung der t~eehnung braueht man wiederum die Differenz in der Wirksamkeit yon zwei gleieh groBen Desert versehiedener Priiparate. FOr Pr~- parate mit Vitamin A-Estern oder freiem Axerophtol entnimmt man einen mitt- leren Wirkungsuntersehied aus der Abb. 1 (Ordinatenabstand der Kurve far Alkohol

Beziehungen zwisehen ehemiseher Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 207

und Ester bei gleichen Abszissen) zu = 6,6. Ftir k = 2 und , ~ = 4,65 errechnen sieh nun N zu = 4,0. Das heist also, da$ man, um den Wirkungsuntersetfied zwischen Vitamin A-Alkohol und -Ester sicher zu erfassen, vier Versuehsreihen zu etwa je 10 Tieren mit dem Axerophtolpr/~parat anste]len ram3, und ebenso vier Versuehsreihen mit der gleichen Tierzahl bei entspreehenden Desert mit dem Vita- min A-Esterpr/iparat.

Mit Hilfe der GrSl3e ,%n l~il3t sich auch noch die weitere Frage beantworten, wie grog die Erwartungen sind, dab bei einer Wiederholung einer ganzen Auswertung in der bei uns iiblichen Ausfiihrung die erhaltenen Ergebnisse dem ,,wahren" Wert nahekommen.

Zur Beantwortung dieser Frage mull man aus den Regressionsgleiehungen ftir y = M ~ e, y = M ~: 2 ~ und y ~ M ~ 2,576 s die zu diesen Werten y geh6rigen Dosen z berechnen. Wir haben dies durehgeffihrt.

Wir haben, wie aus den Tabellen 3 bis 5 zu entnehmen ist, gewShnlioh bei einer Auswertung drei bis vier versehiedene Dosen eines Pr~parats in ebenso vielen Versuchsreihen mit je 10 Tieren geprtift. Nehmen wit an, dal~ im Wiederholungsfall einer Auswertung immer N = 3 Versuchsreihen angesetzt werden, so erreehnet sich aus der Formel

/z~ __ 4,65

Dieses Ergebnis bedeutet, dab bei Ausftihrung yon drei Auswertungen (mit je drei Versuchsreihen zu je :[0 Tieren) die Ergebnisse yon zweien dieser Auswertungen grSBer als 70 % und kleiner als 143 ~o des ,,wahren" Wertes sind.

Aus demselben Wert yon s = j : 2,69 errechnet sich aueh, dab bei Ausftihrung yon 22 Auswertungen die gefundenen Ergebnisse in 21 Fitllen grSBer als 49 % und kleiner als 20~% des ,,wahren" Wertes sin&

Wenn man endlieh M i 2,575 82 e einsetzt, so erh~lt man die Wahrsoheinlieh- keitsgrenze fiir 100 Auswertungen; ffir s = • 2,69 erreehnet sieh, dab bei 100 Wiederholungen der g~nzen Auswertung die gefundenen Ergebnisse in 99 F~illen grSl]er als 40~ und kleiner als 250% des ,,wahren" Ergebnisses sind. Dieser Wert stellt ein GenauigkeitsmaB far den Vitamin A-Versueh dar far P = 0,99. Die britisehe Pharmakopoe (16) gibt fiir denselben Wert P die Grenzen an > 37 % und -< 272%. Die Ubereinstimmung unserer Ergebnisse mit dieser Angabe ist befriedigend.

Die drei nach den Regressionsgleichungen gezeiehneten Geraden in Abb. 1 haben alle ungef~ihr diese]be Neigung. Der algebraisehe Ausdruek dieser Neigung ist der Koeffizient b in der Regressionsgleichung. Bildet man aus den drei ver- schiedenen Koeffizienten der drei Gleichungen der Abb. 1 den Mittelwert, so erh~lt man b = 17,4.

Aus diesem Wer[ b ~ 17,4 und der mittleren Streuung G~ erreetmen sieh aueh gleich die fotgenden Werte:

/ t m / b ~ mitt]ere Abweichung des Logarithmus des Ergebnisses = ~ 2, 12 = logarithmische Varianz und a ~ = mittlere Varianz des Ergebnisses.

VII. Schlulllolgerungen. 1. Die W i r k s a m k e i t yon Vi tamin A-PrKparaten wird gemessen in

i n t e r n a t i o n a l e n E i n h e i t e n , die im al lgemeinen durch einen biologi- schen Vergleichsversuch mi t dem in te rna t iona len S tandardpr~para t

f l-Carotin e rmi t t e l t werden mu$. Zur Er le ich te rung der Auswer tung yon

208 W. GgAB:

Vitamin A-Prgparaten war vorgesehlagen worden, nut den Extinktions- koeffizienten E bei der Wellenlgnge von 328 m# zu messen, und aus diesem Weft dutch Multiplikation mit dem Faktor 1600 die Wirksamkeit des betreffenden Prgparats (in internationalen Einheiten pro Gramm) zu erreehnen.

Es wurde nun in unseren Versuchen gefunden, dal~ die im biologisehen Versueh t a t s i i eh l i eh e r m i t t e l t e Wirksamkeit yon Vitamin A-Pri~- paraten nicht immer iibereinstimmt mit der aus dem spektrophotometriseh gemessenem E-Weft (mit dem Faktor 1600) e r r e ch net e n,,Wirksamkeit". Dieser Umreehnungsfaktor 1600 ist also nieht fiir alle Fglle giiltig.

2. Die U n s t i m m i g k e i t e n zwisehen der biologiseh gemessenen Wirksamkeit und dem a~us dem Extinktionskoeffizienten e r r e c h n e t e n Wirkungswert kommen besonders eindrueksvoll zur Geltung, wenn dutch Anstellung breiter Versnehsreihen und mathematiseher Analyse der Ergebnisse die Streuung des Tierversuehs in alien Einzelheiten beriiek- siehtigt wird.

3. In unseren Versuehen fanden wit nun, daft die Abweiehung zwisehen dem aus dem B-Weft erreehneten und der wirklieh im Tierversueh ge- messenen Wirksamkeit yon Vitamin A auf einem u n t e r s e h i e d l i e h e n W i r k u n g s t y p u s der be iden ehemisehen F o r m e n des V i t a m i n A beruht; Vitamin A kann n~mlieh als freier Alkohol oder als Ester vorliegen.

Vitamin A-Konzentrate, die n ieh t dutch Verseifen hergestellt wurden, enthalten das Vitamin A in der Esterform, also gewissermagen in der nativen Form, da das Vitamin A aueh in der Leber fast aussehlieNieh in der veresterten Form vorliegt.

Vitamin A-Konzentrate, die dutch Verseifen yon Fischleber61en ge- wonnen sind, enthalten das Vitamin A in der Form des Alkohols Axe- rophtol.

4. Die nativen Vitamin A-Ester sind, auf gleiehen E-Wert bezogen, besser wirksam als Vitamin A-Alkohol aus Konzentraten, die dutch Ver- seifung yon Fischleber61en dargestellt wurden.

Vitamin A als Ester ist in Niger LSsung besser haltbar als freies Vitamin A. Die spektrophotometris.eh gemessenen E-Werte und die bei der Carr-Priee-Reaktion erhaltenen Blauwerte nehmen unter dem Einflug von Luftsauerstoff und Lieht beim Vitamin A-Ester wenig oder kaum ab, wi~hrend in der gleiehen Zeit bei Konzentraten mit freiem Vitamin A- Blauwert und E-Weft bereits auf die Hi~lfte der Ausgangsziffern ab- gesunken sin& Wahrseheinlieh beruht aueh die bessere biologisehe Wirk- samkeit der Vitamin A-Ester auf einer giinstigeren Ausnutzung des Vita- min Aim K6rper infolge seiner geringeren Zerst/Srbarkeit.

5. Berechnet man aus nnseren Versuehen den Faktor, mit dem der spektrophotometriseh gemessene E-Weft zn multiplizieren ist, um daraus die biologisehe Wirksamkeit in internationalen Einheiten pro Gramm zu

Beziehungen zwisehen chemischer Form und Wirksamkeit yon Vitamin A usw. 209

erhalten, so finder man einen Wert yon etwa 3400, der also etwa doppelt so hoch ist, wie der frfiher allgemein benutzte Wert yon 1600.

Man kann also nicht generell yon nur einem Umrechnungsfaktor bei den Vitamin A-Pr~iparaten sprechen, sondern es mul3 mehrere Umrech- nungsfaktoren geben, die dem verschiedenen Wirkungstypus der beiden chemisehen Formen des Vitamin A angepa~t sind. Ausgangsmaterial, Herstellung und Behandlung der Vitamin A-Konzentrate sind ffir ihre Wirksamkeit und damit fiir den Umrechnungsfaktor yon aussehlag- gebender Bedeutung.

6. Da alle Umreehnungsfaktoren auf einer Vergleiehsprfifung ein und desselben Prgparats im Spektrophotometer uncl im biotogisehen Versueh gewonnen sind, sind sie mit der Streuungsbreite des Tierversuehs behaftet; sie miissen also eigentlieh angegeben werden mit ihrem mittleren Fehler, z. B. also ffir den Umreehnungsfaktor aus freiem Vitamin A = 1800 ~ 400, oder ffir ein verestertes Vitamin A-Praiqarat 3400 ~ 600.

7. Die Umreehnungsfaktoren, die in besonderen Versuehen fiir ein bestimmtes Pr~parat ermittelt wurden, dfirfen fiir andere Priipara~e nut dann benutzt werden, wenn Herkunft und Herstellung mit dem Bezugs- pr~parat tibereinstimmen; sie kSnnen also nieht fiir ein PrSparat un- bekannter Vorgesehiehte ohne weiteres zur Ermitt lung der ,,Wirksamkeit" Verwendung linden.

8. Das Vitamin A-Pr~para~ ,,Vogan" ist ohne jede Verseifung aus hoehwertigen FisehleberSlen hergestellt, und enthglt daher das Vitamin A in Form der nativen Ester. Die Messung seiner biologisehen Wirksamkeit dureh Vergleieh mit dem internationalen Standardpr~parat ergab den Weft yon 120000 ~ 20000 internationalen Einheiten pro Gramm. Da Vogan das Vitamin A als Ester enthglt, so ist naeh dem Vorstehenden gerade ffir dieses Priiparat der Umrechnungsfaktor 3400 ~ 600 anzu- wenden (14). Bezfiglieh Haltbarkeit des Vitamin A i m Vogan gelten die oben gegebenen Ausfiihrungen fiber die grSl3ere Stabilitiit der Vitamin A- Ester gegeniiber dem freien Axerophtol.

Literatur. la) Karrer , Morf, Sch6pp: Helv. chim. Act. 14, 1033, 1036, 1431 (1931);

16, 557, 625 (1933); Heilbron, Morton, Webster : Biochem. J. (Brit.) 26, 1194 (1932). -- lb) Kuhnu. Morris: Ber. dtseh, chem. Ges. 70, 853 (]937). -- 2) Bessey u. Wolbaeh: J. americ, reed. Assoc. llO, 2072 (1938); Munsel]: Ebenda 111,245 (1938; Clausen: Ebenda 111,144 (]938). -- 3a) Report of the permanent Commis- sion on biological Standardisation, Genf, 1931, League of Nations, Health Organisa- tion, S. 68 ff. -- 3 b) Quarterly Bulletin of the Health Organisation, League of Nations, Vol. iII, Nr. 3, Genf, September 1934, S. 428ff. -- 4) Sher- man u. Munsell: J. Amer. Chem. Soc. 47, ].639 (1925). -- 5) Steenbock, Coward: J. biol. Chem. (Am.)72,765 (1927). -- 6)Moore: Bioehem. J. (Brit.)24, 692 (1930); Lancet 1929, II, 380; Bioehem. J. 25, 275 (1931). -- 7) Editorial, J. arnerie, reed. Assoc. 109, 1045 (1937); De, Indian J. reed. Res. (Am.) 24, 751 (1937). -- 8) Morton u. t t e i lbron: Bioehem. J. (Brit.) 22, 987 (]928). -- 9) Morton u. Hei lbron, Thompson: Ebenda 25, 20 (1931). -- 10) Coward, Dyer , Morton, Gaddum:

210 W. GttAB: Beziehungen zwischen chemischer Form und Wirksamkeit usw.

Ebenda 25, 1102 (1931). -- 11) C o w a r d , D y e r , M o r t o n : Ebenda 26, 1593 (1932). -- 12) C a r r u. P r i s e : Ebenda 20,497 (1926); R o s e n h e i m u. S c h u s t e r : Ebenda 21, 1329 (1927). -- 13) R i t s e r ~ : Mereks Jahresbericht 1935, S. 19. - - 14) G r a b u. Mo l l : Klin. Wschr., Nr. 16, S. 563ff., vom 22. April 1939. -- 15) m o l l u. R e i d : Z. physiol. Chem. 269, 9 (1939). -- 16) Pharmacopoea Britannica 1932, Addend. 1936, S. 86ff., insbesondere S. 90. -- 17) S h e r m a n u. B u r t i s : J. biol. Chem. (Am.) 78, 671 (1928). -- 18) C o w a r d : Biochem. J. (Brit.) 26, 691 (1932). -- 19) C o w a r d : Ebenda 27, 445 (1933).-- 20) S w a n s o n , S t e v e n s o n , N e l s o n : J. Nutrit . (Am.) 15,103 (1938). -- 21) C o w a r d , M e a d u. U n d e r h i l l : Chem. and Ind. 57, 1189 (1938); Bioehem. J. (Brit.) 33, 589 (1939). -- 22) H i c k r a a n : Industry and Engineering Chemistry 29, 1107 (1937). -- 23) R e t i : C. r. Soc. Biol. 129, 577 (1935). -- 24) H a m a n o : Scientific Papers of the Inst i tute of Physik. and Chem. Research 28, 69 (1935); 32, 44 (1937); 26, 87 (1935). -- 25) T i s c h e r : J. biol. Chem. (Am.) 125, 475 (1938). -- 26) L o v e r n , M o r t o n , I r e l a n d , 1Kead: Bioehem. J. (Brit.) 33,325, 338 (1939). -- 27) Me W a l t e r : Ebenda 28, 472 (1934). -- 28) N i j - v e l d : Chem. Weekblad 34, 379 (1937); Ref. Chem. Abstracts 31, 7461. -- 29) Che- v a l l i e r u. Mitarbeiter: C. r. l 'acad~mie des sciences 194, 174,452 (1932); C. r. Sos. Bio1.115,1297 (1934) ; 118,159 (1935); 117,10 (1934). -- 30) I-I e i l b r on , t t e s l o p , M o r- t o n , R e a , D r u m m o n d , W e b s t e r : Biochem. J. (Brit.) 26, 1182 (1932). - -31) C o t - b e t , G e i s i n g e r , H o l m e s : J. biol. Chem. (Am.) 100,657 (1933). -- 32) E m m e r i e : Nature 131,364 (1933); 128, 495 (1931). -- 33) R y g h : Bull. Sos. Chim. biol. (Ft.) 16, 609 (1934). -- 34) S m i t h u. H a z l e y : Biochem. J. (Brit.) 24, 1942 (1930). -- 35) G i l l a m u. M o r t o n : Ebenda 25, 1346 (1931). -- 36) N o t e v a r p u. W e e d o n : Ebenda 32, 1668 (1938). -- 37) H u m s u. C h i c k : Die Best immung yon Vitamin A, His Majesty's stationary office. London 1935. -- 38) R o b ins o n: Biochem. J. (Bxit) 32,807 (1938). -- 39) S m i t h , R o b i n s o n ~ S t e r n , Y o u n g : Ebenda 33,207 (1939); 33, 201 (1939). -- 40) C o w a r d , D y e r , K e y , M o r g a n : Ebenda 28, 875 (1934). -- 41) A n d e r s e n : Klin. Wschr. 1939, S. 499. -- 42) B i r d u. E m m e t : J. biol. Chem. (Am.) 119, Pros. Am. soc. Biol. chem. S. 31 (1937). -- 43) R i t s e r t : DRP. Nr. 636277. --44) H u m s : Nature 143, Nr. 3610, S. 22, vom 7. Januar 1939. - -45) t t o l m e s u . C o r b e t : J. Amer. Chem. Soc. 59, 2042 (1937). -- 46) L a t h b u r y : Biochem. J. (Brit.) 28, 2254 (1934). -- 47) M o r g a n , E d i s b u r y , M o r t o n : Ebenda 29, 1645 (1935). -- 48) P r i t c h a r d , W i l k i n s o n , E d i s b u r y , M o r t o n : Ebenda 31, 258 (1937); Chem. and Ind. 1936, S. 1030. -- 49) G i l l a m , H e i l b r o n , J o n e s , L e d e r e r : Biochem. J. (Brit.) 32, 405 (1938). -- 50) Berichte des Medical Research Council 1936, S. 93ff.; 1937, S. 63ff., 109ft.; 1938, S. 102. -- 51) W o l f f : Z. Vitamin- forschg. 7,227, 229ff. (1938). -- 52) C o w a r d , I4ey , D y e r , M o r g a n : Bioehem. J. (Brit.) 24, 1952 (1930). -- 5 3 ) M o l l , D a l m e r , v. D o b e n e e k , D o m a g k , L a q u e r : Naunyn-Schmiedebergs Arch. 170, 176 (1933). -- 54) N e l s o n u. J o n e s : J. biol. Chem. (Am.) 80, 215 (1928). -- 55) H u m e u. S m i t h : Bioehem. J. (Brit.) 22, 504 (1928). -- 56) G i l l a m u. El R i d i : Ebeiada 32,820 (1938); S m i t h , S t e r n , Y o u n g : Nature 141, 551 (1938). -- 57) B u r n : Biologische Auswertungsmethoden. Berlin, Verlag Julius Springer, 1937. -- 58) H u m s : Nature 139,467 (1937). -- 59) P t i t t e r : Die Auswertung zahlenm~if~iger Beobaehtnngen in der Biologie, S. 15ff. Leipzig, Verlag De Gruyter, 1929. -- 60) W a g n e r : Biochem. Z. 296,193 (1938). -- 61) C a r r u. J e w e l l : Nature 131, 92 (!933). -- 62) British Drug Houses Ltd., Chem. and Ind., Snppl. ,Bd. 8, yore 13. Februar 1937. -- 6 3 ) E m b r e e : J. biol. Chem. (Am.)128, 187 (1939).