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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik

Dr. Maik BöhmerInstitut für Biologie und Biotechnologie der PflanzenSchlossplatz 7

Schwerpunkte:

Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der GentechnikVorlesung 2: Methoden der GentechnikVorlesung 3: Vektoren & KlonierungVorlesung 4: ReportergeneVorlesung 5: Transgene OrganismenVorlesung 6: Genomik und moderne MethodenVorlesung 7: Proteine

Enzyme der Gentechnologie

I. Nukleasen1. Restrikonsendonukleasen2. Exonukleasen

II. Modifizierende Enzyme1. Ligasen2. Phosphatasen / Kinasen / Transferasen

III. Polymerasen1. DNA - Polymerasen2. RNA - Polymerasen3. reverse Transkriptasen

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Klonierung: Das Grundlegende Experiment der Gentechnologie

DNA - Isolation: Wie erhalte ich die DNA die ich untersuchen möchte?

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Aufbrechen der Zellen/Gewebe

Zentrifugation: Trennung von Fraktionen/ Fällung

rpm: rounds per minute

RCF: relative Zentrifugalkraft g

RCF=11,17 x r x (rpm/1000)2

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Phenolextraktion zum Abtrennen von Proteinen

1. Phenol 2. Phenol/Chloroform 3. Chloroform

Ethanolfällung von Nukleinsäuren

+ 0,1 Vol. 3 M NaCl+ 2.5 Vol. Ethanol

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Reinigung von DNA an Silikat- und Anionenaustausch-Säulen

Agarosegelelektrophorese

Ethidiumbromid: 0,5 g/ml

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Ethidiumbromid färbt DNA

Agarose-Konzentrationen zur Separationvon DNA-Fragmenten

Fragmentlänge Agarosekonzentration

1 - 30 kb 0,5 %0,8 - 12 kb 0,7 %0,5 - 7 kb 1,0 %0,4 - 6 kb 1,2 %0,2 - 3 kb 1,5 %0,1 - 2 kb 2,0 %

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Gelelektrophorese zur Separationvon DNA-Fragmenten

Spannung: 0,5 - 5 V/cm Elektrodenabstand

Gelelektrophorese zur Separationvon DNA-Fragmenten

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Gelelektrophorese zur Separationvon DNA-Fragmenten: Das Prinzip

Gelelektrophorese zur Separationvon DNA-Fragmenten: Größenbestimmung

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Autoradiographie zum radioaktiven Nachweis von Nukleinsäuren

„Southern Blot“ zum radioaktiven Nachweis von DNA

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Southern Blot: Transfer der DNA-Fragmente

Southern Blot: Transfer der DNA

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Southern Blot

„Northern Blot“ zum radioaktiven Nachweis von RNA

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Radioaktive Markierungvon DNA - „nick translation“ und „end labeling“

Radioaktive Markierungvon DNA - „random priming“

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Nachweis von Nukleinsäuren-Hybridisierung

Hybridisierung: 1. Denaturierung und Fixierung

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Hybridisierung: 2. Hybridisierung mit markierter Sonde

Hybridisierung: 3. „Waschen“ und Exposition

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Hybridisierung

Nachweis von Nukleinsäuren:Kolonie-Hybridisierung

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Oligonukleotide

in vitro definiert synthetisierte einzelsträngige DNA Fragmente von meist ca. 20 Nukleotiden (im Normalfall kein 5‘-Phosphat)

z.B. 5‘-CCGATGCACTGAATTC-3‘

Anwendung: Primer für „random priming“ (Hexamere)Primer für „primer extension“Primer für PCR

aber auch (doppelsträngige)LinkerAdaptoren

Linker

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Adapter

Nukleotid 1 an Glasmatrix gebunden:

5´OH-Gruppe liegt frei vor

Folgenukleotid ist am 5´Ende mit einer DMT Schutzgruppe abgeschirmtDMT:4‘,4‘-dimethoxytritylam 3‘Ende mit hochreaktiver Gruppebesetzt (z. B. Phosphoamidit)

Nur das 3´Ende des Folgenukleotids kann mit Nukleotid 1 reagieren

Oligonukleotid-Synthese I

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Oligonukleotid-Synthese II

Nach der Kopplung:

Entfernung der Schutzgruppe vom 5‘ durch ZnBr2

Stabilisierung der Phosphatgruppe durch Oxidation mit I2

Nach der Synthese:

Finale Entfernung der Methylgruppen(alkalisch)

Lösen des Oligos von der Matrix

Oligonukleotid-Synthese III

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DNA-Sequenzierung

Didesoxy-Methode nach Sanger

DNA-Sequenzierung

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DNA-Sequenzierung

Radioaktive DNA-Sequenzierung

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DNA-Sequenzierung mit Fluoreszenzfarbstoffen

Animation Sequenzierung

http://bcs.whfreeman.com/lodish5e

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Wichtige Begriffe der PCR

Template: Substrat der PCR-Reaktion

Primer: kurze Oligo-Nukleotide zur Initiation der Polymerisation

dNTPs: Nukleotidtriphosphate werden in den neuen Strang eingebaut

Polymerase: Enzym zur Synthese der Doppelstränge

Denaturierung: Trennung der Doppelstränge bei 92-98°C

Annealing: Anlagerung der Primer an den geöffneten Doppelstrang

Elongation: Neusynthese des fehlenden Doppelstrangs (1min/kb)

Ablauf einer typischen PCR

Amplifikation eines 1kb DNA Fragments:

Initiale Denaturierung 2 min 95°C

Denaturierung 30 sec95°C

Annealing 45 sec55°C

Elongation 60 sec72°C

Finale Elongation 5 min 72°C

40 Wiederholungen

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Anwendungen der PCR

Amplifikation definierter DNA Fragmente

Nachweis bestimmter Sequenzen im Genom

„geneitscher Fingerabdruck, Vaterschaftstest“

Nachweis von Mutationen „Gendiagnostik“

Herstellung von DNA-Fragmenten zur Klonierung

Nachweis von transgenen Organismen

DNA Sequenzierung

RT-PCR zum Nachweis von Genprodukten / Transkripten

III Polymerasen- Thermostabile DNA Polymerasen -

DNA abhängige Polymerasen, tolerant gegenüber hohen Temperaturen (~ 95 °C)- besonders geeignet für PCR Reaktionen, Sequenzierungen

Eigenschaften:

Bedingungen:- Mg2+, dNTPs, Primer (3‘-OH Ende)

Name Organismus 5’-Exonuclease 3’-Exonuclease

(„Proofreading“)

Produkt-Enden

Taq Pol. Thermus aquaticus ja nein 3’A

Pfu Pol. Pyrococcus furiusus ja ja glatt

Pwo Pol. Pyrococcus woesei ja ja glatt

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PCR

PCR-Polymerase Ketten Reaktion

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PCR

PCR - im Überblick

30 Zyklen = 229 = 536 870 912 Kopien

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Animation PCR

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PCR- zur Klonierung von Fragmenten

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PCR- zur Klonierung von Fragmenten

RT- PCR

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T - Klonierung und Xcm - Vektoren

Xcm I:

5‘-CCANNNNN/NNNNTGCC-3‘ GGTNNNN/NNNNNACGG

Klonierungsvektoren - das Prinzip