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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik

Prof. Jörg Kudla (Freisemester) Prof. Dr. Antje von SchaewenInstitut für Biologie &Biotechnologie der PflanzenSchlossplatz 7Email: jkudla@uni-muenster.de schaewen@uni-muenster.de

Schwerpunkte:

Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der GentechnikVorlesung 2: Methoden der GentechnikVorlesung 3: Vektoren & KlonierungVorlesung 4: ReportergeneVorlesung 5: Transgene OrganismenVorlesung 6: Genomik und moderne MethodenVorlesung 7: Proteine

Klonierung: Das Grundlegende Experiment der Gentechnologie

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Animation Plasmid cloning

Klonierungsvektoren - das Prinzip

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Klonierungsvektoren

- Vektoren zum Klonieren genomischer DNA

- ermöglichen Vermehrung und Analyse von bestimmten DNA-Fragmenten

- Klonierungskapazität ?- Handhabbarkeit ?- Anwendung ?- Stabilität der klonierten DNA?

Handhabbarkeit versus Klonierungskapazität (DNA-Fragmente)Plasmide max. 8 kb ( 1- 5 kb)Lambda-Phagen max. 25 kb ( 10- 20 kb)Cosmide max. 44 kb ( 30- 44 kb)P1-Phagen max. 100 kb ( 75- 100 kb)BAC max. 300 kb (100- 300 kb)YAC max. 1000 kb (100-1000 kb)

BAC: bacterial artificial chromosomeYAC: yeast artificial chromosome

Plasmide• Klonierungskapazität bis 8 kb

• leichte Handhabbarkeit

• relativ stabil

• einfache Transformation von E. coli

• einfache Vermehrung in E. coli

• einfache Plasmid-Isolierung

• hohe DNA-Ausbeuten (ori-abhängig)

• einfache Insert-Analyse

• für versch. Organismen

Selektionsmarker

Reporter-Gen

Vektor + Insert Trafo in E.coli

Ligase

Klonierung:

Ligation DNA-IsolierungVermehrung in E.coli

ori MCS

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Shuttle-Vektoren

E. coliS. cerevisiae

Der Phage Lambda ()

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• Temperenter E. coli -Phage

• Kopf und Schwanz (nicht kontraktil)

• DNA (linear, 48.502 bp)

• Komplexe Regulation

Der (Bakterio-) Phage Lambda ()

Bacterium - altgriechisch βακτήριον „Stäbchen“Phage - altgriechisch φαγεῖν „fressen“Temperent - lateinisch Temperantia „Mässigung“

Der Phage Lambda - Lytischer und lysogener Zyklus

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Der Phage Lambda - Plaque-Bildung auf Bakterienrasen

Phagenplatte Bakterienplatte

Der Phage Lambda - Regulation von lytischem vs. lysogenem Zyklus

schematisch

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Das Genom des Phagen Lambda ()

detailliert

17 kb 17 kb 14 kb

halb-schematischcos cohesive site (or end)cosmid half phage half plasmid

Das Genom des Phagen Lambda ()

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Der Phage Lambda ()

left arm right armstuffer fragmentcos cos

Infektion der Wirtszelle

VermehrungLyse der Wirtszelle

LytischerZyklus

DNA des Phagen Lambda: 48,5 kb

cohesive site cohesive site

Replacement Vektoren

Nach Entfernen des stuffer Fragments können DNA-Fragmente, d.h. 10-23 kb Inserts, eingebracht werden

Restriction digest

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Insertionsvektoren

Concatemer = Concatamer(Wiederholungseinheit)

Der Phage Lambda () - Assemblierung

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In vitro Verpacken von DNA in Phagen

Extrakt Extrakt

-Dts -Ets

+ DNA

Herstellung einer Phagen DNA-Bank

Klone finden durchSouthern Blotting, d.h. Hybridisieren mitmarkierten DNA-Sonden

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Screening einer genomischen Phagen DNA-BankKlone auffinden:

Filter lift von Phagen-Platten & “Southern blot”-Hybridisierungmit markierten DNA-Sonden(nach Lyse & Denaturierung in DNA-Einzelstränge)

Filter aus Nitrocellulose (NC) oder Nylon (stabiler)

Nachweisfrüher radioaktiv, heute auchcolorimetrisch oderchemilumineszent

Re-Infektion von Bakterienzur Vermehrung & Archivierungals Lysat (bei -20/-80 C, stabilisiert mit 10% DMSO, Dimethylsulfoxid)

Phage screening I

Freezer(-20/-80 C)

Maltose transportprotein = Phage receptor

cold room(4 C)

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Phage screening II

Filter lift assay

Phage screening III

glassPasteur pipette

Primary pick

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Phage screening IV

Phage suspensionbuffer (PSB)

Primary pick

Secondarypick

Tertiarypick

Identifizierung von positiven Phagen

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cDNA Banken: 1. Strang (cDNA-Synthese)

Synthese des komplementären Doppelstrangs

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cDNA-Klonierung in Phagen

Cosmide

- Verbinden der cos sites des Phagen Lambda mit einem Plasmid

in vitro Verpackung

Infektion von E. coliVermehrung als Plasmid

cos-site

Cos siteMCS

Reportergen

Selektions-marker

ori

Cosmid + Insert

Isolierung von Plasmiden

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Herstellung einer Cosmid DNA-Bank

BAC - bacterial artificial chromosome

genomische DNA

partiell verdaute DNA

Transformationvon E. coli

DNA-Isolierung Vermehrung in E. coli

MCS

Reportergen

Selektions-marker

(ParA, ParB)ori

Cosmid + Insert

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YAC - Yeast artificial chromosome

EcoRI

URA3

TEL

TEL

TRP1ARS CEN

TRP1 ARS CENTEL URA3 TELEco Eco

genomische DNA

partial Verdau mit EcoRI

Ligation und Transformation von Hefezellen

TRP1 ARS CENTEL URA3 TELEco Eco

linker Arm rechter ArmInsert: bis 1Mbp

Restriktionskartierung (1)

- definiert die Lage von Restriktionsenzym-Schnittstellen auf einem DNA-Molekül

- funktioniert nur für DNA-Moleküle 500 kb

E1 E2

E1E2

E2

E2

E1

E1

Marker ohne Enzym E1

8kb

E1 + E2

6kb

4kb

2kb

E2

5 kb

8 kb

3 kb

7 kb

1 kb

5 kb

2 kb

1 kb

Wie?1. DNA Verdau Gel-Elektrophorese

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Restriktionskartierung (2)

Marker

30kb

E1 + E2

20kb

5kb

10kb

E1 E2

Fragment:- eluieren(- klonieren) (- amplifizieren)- markieren- hybridisieren

Marker

30kb

E1 + E2

20kb

5kb

10kb

E1 E2

Restriktionskartierung (3)Marker

30kb

E1 + E2

20kb

5kb

10kb

E1 E2

E1 E1

15 kb

E2 E2E2

25 kb 12 kb

Verdau mit E1 und Hybridisierung mit E1-Fragment:

Verdau mit E2 und Hybridisierung mit E1-Fragment:

Verdau mit E1+E2 und Hybridisierung mit E1-Fragment:

Grenzen:

- Auftrennung im Gel

- Komplexität des Musters:

4n = 1/256

6n = 1/4096

8n = 1/65536 E2 E2E1 E1

10 kb 5 kb

E2

??

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Kartierung mittels rekombinierter Klone

- Kombination von Genbank-Hybridisierung + Restriktionskartierung

Eco EcoSalSal XhoBamXho

YAC BAC

? ? ?

in silico Kartierung

- in situ Hybridisierung- Restriktionskartierung- Karte rekombinater Klone

Sequenz unbekannt

Analyse-Algorithmen:- Vergleich mit bekannten Genen (cDNA-Sequenzen) anderer Organismen- Exon/Intron-Grenzen- konservierte Prozessierungssignale

- in silico Kartierung Sequenz bekannt .....ACGTGTCCGTAAC.....

Aber: Wo liegen die Gene?

Computeranalyse (Schnittstellenvorhersage)EcoEco SalSal XhoBamXho

EcoEco SalSal XhoBamXho

Exon 1 Exon 2 Exon 3

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Genomische Banken 1

Was? - Sammlung von tausenden rekombinanten Klonen, die ein

vollständiges Genom repräsentiert

Wozu? - zur Kartierung von Genomen und Genomabschnitten

- zum Finden und Klonieren eines Gens

- zur Sequenzanalyse (eines Genoms)

Anforderungen: - Repräsentativität (Wahrscheinlichkeit jedes beliebige Gen

zu finden)

- Technisch einfache Handhabbarkeit

- Stabilität der klonierten DNA

Genomische Banken 2

Anzahl der für genomische Banken benötigten Klone:

Spezies Zahl der Klone

Genomgröße (kb) 17 kb-Fragmente 35 kb-FragmenteE. coli 4.639 820 400S. cerevisiae 12.500 2.200 1.075Homo sapiens (Referenz-Genom) 3.500.000 535.000 258.000Zea mais (!) 5.000.000 900.000 450.000A. thaliana (Col Referenz-Genom) 125.000 22.000 10.700

Berechnet nach der Formel: N = ln (1-P)ln (1- a/b)

N = Anzahl der erforderlichen KloneP = Wahrscheinlichkeit, dass jedes Gen vorhanden ist wurde bei dieser Berechnung auf 0,95 gesetzt (d.h. 95%)a = durchschnittliche Größe der DNA-Fragmente in der Genbankb = Gesamtgröße des Genoms

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Genbanken in verschiedenen Vektoren

bei 95% Wahrscheinlichkeit für das Arabidopsis-Genom notwendig:

Plasmide max. 8 kb ( 1- 5 kb) 5 kb 75.000 KloneLambda-Phagen max. 25 kb ( 10- 20 kb) 17 kb 22.000 KloneCosmide max. 44 kb ( 30- 44 kb) 35 kb 10.700 KloneP1-Phagen max. 100 kb ( 75- 100 kb) 75 kb 5.000 KloneBAC max. 300 kb (100- 300 kb) 200 kb 1870 KloneYAC max. 1000 kb (100-1000 kb) 1 Mb 372 Klone

Genbanken unterschiedlicher Repräsentativität:

Plasmid 95%: 75.000 KlonePlasmid 99%: 115.000 KlonePlasmid 99,9%: 172.700 Klone

Einige Forschungsobjekte aus dem Fachbereich

AG Organismus Seit wann sequenziert?

Bähler Mus musculus 2002

Paul Caenorhabditis elegans 1998

Daphnia pulex Draft genome 2011

Daphnia magna -

Liebau Brugia malayi Draft genome 2007

Onchocerca volvulus -

Klämbt Drosophila melanogaster 2000

Prüfer Taraxacum koksaghyz -

Medicago truncatula 2011

Kudla Arabidopsis thaliana 2000

Nicotiana benthamiana -

Tudzynski Claviceps purpurea -

Moerschbacher Puccinia graminis f. tritici -

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Genomsequenzierung 1A (shot gun-Sequenzierung)

genomische DNA

gescherte DNA

Klonierung inLambda-Phagen

20 kb

2 kbKlonierung in

Plasmide

z.B. Haemophilus influenzae1.830.137 bp (1,83 Mb); 1743 Gene

(Wikipedia)Bei den Bakterien der Gattung Haemophilus handelt es sich um eine Gruppe stäbchenförmiger gramnegativer Bakterien der Familie der Pasteurellaceae. Die 16 Arten dieser Bakterien sind unbewegliche Stäbchen, die mitunter in den Schleimhäuten von Menschen und Tieren leben und Erkrankungen auslösen können.

genomic DNA digest

„smear“

Klonierung in Lambda-Phagen (20 kb)Klonierung in Plasmide (2 kb)

19687 Klone sequenziert

28643 Sequenzreaktionen

24304 gute Sequenzen (>400 bp)

11.631.485bp (6,3x)

140 Contigs

L1F

x 100 Phagen

L2FL1R L2R L3RL3F

c1

c2 c3c1

Lambda-Phagec2

Endsonden

Genomsequenzierung 1B (shot gun-Sequenzierung)

L = LambdaF = forwardR = reverse

bridge fragments

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Genomsequenzierung 2A (gerichtete Sequenzierung)

A B C D E

YAC BAC

? ? ?

Ein Contig (von engl. contiguous = angrenzend, zusammenhängend) ist ein Satz überlappender DNA- oder Protein-Stücke (reads), die von derselben genetischen Quelle stammen. Ein solches Contig kann dazu genutzt werden, die Original-DNA-Sequenz dieser genetischen Quelle (z. B. die Sequenz eines Chromosoms) abzuleiten.

Guthals et al. (2012) Shotgun protein sequencing with meta-contig assembly. In: Molecular & cellularproteomics: MCP. Band 11, Nummer 10, Oktober 2012, ISSN 1535-9484, S. 1084–1096.

Hybridisierung - Chromosome walking

YAC 1

Kultivierung

DNA-Isolierung

shot gun Sequenzierung

“Endsonde”

radioaktiv markieren

Hybridisieren mit YAC-Bankx YACs

YAC 2

YAC 1YAC 3

neue YAC-Klone

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A B C D E

YAC BAC

PCR aufLambda Phagen

(Lysat)

shot gun-Sequenzierung einzelner YACs/BACs(scheren, klonieren in Plasmide)

Assemblierung

Sequenzauswertung

Genomsequenzierung 2B (gerichtete Sequenzierung)

gap

Next generation sequencinghttp://www.medizinische-genetik.de/index.php?id=next-generation-sequencingDie Einführung der Next Generation Sequencing (NGS)-Technologien hat die Etablierung bedeutender, neuer diagnostischer Anwendungen in der täglichen Routine ermöglicht. Obwohl der Einsatz der NGS-Technologie in der klinischen Diagnostik mit Herausforderungen verbunden ist, wird die Umstellung aufgrund der sich bietenden Vorteile dennoch unumgänglich sein. Neben der extrem hohen Sequenzierkapazität ermöglicht NGS die klonale Sequenzierung einzelner Moleküle, eine höhere diagnostische Sensitivität durch parallele Sequenzierung von ganzen Genpanels, vereinfachte Handhabung sowie die parallele und dadurch kostengünstigere Bearbeitung der Proben. Neueste technische Fortschritte haben NGS zu einer verlässlichen Alternative für die klassische Sanger-Sequenzierung entwickelt.

Roche 454Roche Life Sciences war 2005 mit der Vorstellung des GS 20 Sequenziergeräts das erste Unternehmen, das eine Next Generation Sequencing Plattform kommerziell angeboten hat. Die Roche 454 Sequenziersysteme benutzen emulsions-PCR (emPCR) für die klonale Amplifikation der Proben, gefolgt von hochparallelem Pyrosequencing. Während der emPCR wird die zu sequenzierende DNA an spezifische Beads gebunden und klonal amplifiziert. DNA-tragende Beadswerden dann angereichert und in spezielle Reaktionskammern auf so genannten Pico Titre Plates (PTP) befördert. Diese Reaktionskammern enthalten alle für die Sequenzierung nötigen Reagenzien. Anschließend wird sequentiell je eine Art von fluoreszenzmarkierten Desoxyribonucleotiden (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) in definierter Reihenfolge zugegeben. Ist ein Nukleotid komplementär zu der Base im DNA-Template, erfolgt ein Einbau und ein Lichtsignal wird detektiert. Sind in der zu sequenzierenden DNA mehrere aufeinanderfolgende, identische Nukleotide vorhanden (Homopolymere) werden mehrere gleiche Nukleotide hintereinander eingebaut und das korrespondierende Lichtsignal ist proportional stärker. Auf dieser Technologie basieren der Roche GS FLX Titanium Sequencer, der GS FLX+, eine verbesserte Version, die längere Leseweiten ermöglicht und die Benchtop Version, der Roche 454 Junior. Mit dem GS FLX und Junior Geräten können durchschnittliche Leseweiten von 450-550 bp erreicht werden, während mit dem FLX+ Upgrade die Leseweiten auf 750-850 bp gesteigert werden können. Mit diesen Geräten kann ein Durchsatz von 350-700 Mb pro 10 Stunden Lauf ( Homo sapiens: 3.500 Mb, ca. 1 Woche)auf den GS FLX Systemen und 30-50 Mb pro 8 Stunden Lauf auf dem GS Junior Gerät erreicht werden.

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Roche 454 Sequencing:

(a) Genomische DNA, (b) Fragmentierung und Adapter-Ligation, (c) emPCR I, DNA-Fragment, gebunden an Bead, (d) emPCR II, klonal amplifizierte Fragmente (an Bead), (e) Beads in den Reaktionskammern der PTP-Platte, (f) emittierte Lichtsignale (Pyrogramm).

(Mit freundlicher Genehmigung von Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland)

(a)

(b)

(d)

(e)

(c) (f)

Prinzip der Pyrosequenzierung

Licht

Schritt 1: Die zu untersuchende DNA wird extrahiert und mit Bisulfit behandelt, um unmethylierte Cytosine in Uracile zu verwandeln. Nach Amplifikation der DNA mittels PCR, durch die alle Uracile durch Thymidine ersetzt werden, wird die Probe denaturiert um einzelsträngige DNA (ssDNA) zu erhalten. Sobald ein Sequenzierprimer an die einzelsträngige DNA gebunden wurde, wird der Komplementärstrang in Gegenwart von Adenosin-5’-Phosphosulfat (APS), Luziferin und den Enzymen DNA-Polymerase, ATP-Sulfurylase, Luziferase und Apyrase gebildet.

Schritt 2: Die Pyrosequenzierung wird durch Zugabe eines der vier Desoxynukleotid-Triphosphate (dNTPs) gestartet. Wenn dieses komplementär zur ersten ungepaarten Base des Hauptstranges ist, katalysiert die DNA-Polymerase seinen Einbau in den entstehenden Strang, wobei Pyrophosphat (PPi) freigesetzt wird. Dessen Menge entspricht der Anzahl eingebauter Nukleotide.

Schritt 3: Freigesetztes PPi wird durch die ATP-Sulfurylase, die APS als Substrat verwendet, zu ATP umgesetzt, welches wiederum die Luziferase-Reaktion antreibt. Dadurch wird Luziferin in Oxyluziferin verwandelt. Dies resultiert wiederum in einem sichtbaren Lichtsignal – dessen Stärke proportional zum verbrauchten ATP ist und mit einer Kamera erfasst werden kann. Mehrere Peaks, die durch den Einbau sukzessiven Einbau mehrerer Nukleotide entstehen, ergeben ein Pyrogramm (siehe Abb.).

Schritt 4: Apyrase, ein Enyzm das Nukleotide degradiert, baut nicht eingebautes ATP und dNTP kontinuierlich ab. So wird das Licht wieder „ausgeschaltet“ und die Reaktionslösung regeneriert. Die Schritte 2 und 3 können nun mit dem nächsten dNTPbegonnen werden.

Schritt 5: Die Zugabe der dNTPs erfolgt einzeln. Desoxyadenosin-alpha-thio-triphosphat (dATPas) wird hierbei als Ersatz für das Desoxyadenosin-triphosphat verwendet, da es von der DNA-Polymerase sehr effizient, von der Luziferase jedoch nicht als Substrat erkannt wird. Der Komplementärstrang wird durch Voranschreiten des Pyrosequenzierungs-Prozesses gebildet. Die Nukleotid-Sequenz kann an den Signal-Peaks aus dem Pyrogramm abgelesen werden.

Prinzip der Pyrosequenzierung

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Illumina SBS

Schematischer Ablauf der SBS-Methode (2006): Einbau eines komplementären, fluoreszenzmarkierten Nukleotids (Detektion des Lichtsignals), Abspaltung der Terminatorgruppe und zyklusbasierte Sequenzierung (Mit freundlicher Genehmigung von Ilumina Inc., San Diego, CA, U.S.A.)

Nächste Woche

Reportergene

O. Batistic