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Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik

Prof. Jörg Kudla (Freisemester) Dr. Stefan WeinlInstitut für Biologie &Biotechnologie der PflanzenSchlossplatz 7

Schwerpunkte:

Vorlesung 1: Einführung & Enzyme der GentechnikVorlesung 2: Methoden der GentechnikVorlesung 3: Vektoren & KlonierungVorlesung 4: ReportergeneVorlesung 5: Transgene OrganismenVorlesung 6: Genomik und moderne MethodenVorlesung 7: Proteine

Transgene Organismen

"Gentechnisch verändert ist ein Organismus, dessen genetisches Material in einerWeise verändert worden ist, wie sie unter natürlichen Bedingungen durch Kreuzenoder natürliche Rekombination nicht vorkommt"

Gentechnik Gesetz

„Postgenomics“ – Die AusgangssituationTransgene Pflanzen: das Grundprinzip der Transformation

DNA Vektor Übertragungsweg Zielorgan(ismus)

z.B. - cDNA

- genDNA

z.B. - Ti-Plasmid- Plasmid mit

pflanzlichenSteuersequenzen

z.B. - Agrobakterium-Transformation

- Partikel-Kanone- Elektroporation

z.B. - ganze Pflanze- Blattscheiben- Protoplasten- Wurzeln

aber auch:- Kerntransformation- Plastidentransformation

stabile Transformation:

Integration in das Genom des Empfängerorganismus

dauerhaft exprimiert und vererbt

i.d.R. Expression einer Genkopie

transiente Expression:

Expression der Fremd-DNA im Zytoplasma des Empfänger (i.d.R. ohne Replikation)

nur für einen begrenzten Zeitraum exprimiert (nicht vererbt)

(i.d.R. (Über-)Expression von zahlreichen Genkopien)

stabile und transiente Transformation

stabile Transformation:

Integration durch nichthomologe Rekombinationz.B. Säuger: Injektion in Eizellen, retrovirale Vektoren

Integration durch homologe Rekombinationz.B. Hefe: Transformation mit linearer DNA und Selektion des Markergens

Partikelbombardierung und Rekombination (z.B. Pflanzen) T-DNA vermittelte Transformation (z.B. Pflanzen)

transiente Expression: Transfer von Plasmid DNA in Zellkulturen (z.B. chemisch, Elektroporation,

Säuger: Transfektion) Transiente Transformation mit Agrobakterien (Zellkulturen, Blätter) Partikelbombardierung

stabile und transiente Transformation

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Prinzip der Transformation: das Ti-Plasmid

vir-Gene

ori

tra

nocTi-Plasmid

modifizierte Transfer-DNA (T-DNA)LB RBPromotor Gen X Terminator Selektionsmarker

Prinzip der Transformation: das Ti-Plasmid

Requirements for (plant) transformation

1. Selectable marker gene

kanamycin resistance: neomycin phosphotransferase (nptII),

hygromycin B: hygromycin phosphotransferase (hygB)

streptomycin: streptomycin phosphotransferase

herbicide bialaphos (phosphinothricin, BASTA): bacterial gene bar encoding the BASTA-inactivating enzyme phosphinothricin acetyltransferase (PAT)

2. Promoter (constitutive, tissue-specific or inducible)

3. coding region

4. polyadenylation site

Transformation von Arabidopsis: Tauchtransformation

Agrobacterium Kultur 28°C 2 Tage

“Dipping” ( 5% Sucrose + 0.03% L-77 )

Kultivierung in Anzuchtschrank für 2 – 3 Wochen

Samen Reifung (Trocknung)

Selektion (oberflächensterilisierte Samenauf Gewebekulturmedium

mit Kanamycin)

Prinzip der Transformation: Infektion und Regeneration

Transformation von Pflanzen: Promotor-Reportergen-Fusionen

Prinzip:

Gen X:ATG TAA

cod. RegionPromotor

GUSPromotor

Transformationsvektor

GUSPromotor

X

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Transformation von Pflanzen: Promotor-Reportergen-Fusionen

Prinzip:

Gen X:ATG TAA

cod. RegionPromotor

GUSPromotor

Transformationsvektor

GUSPromotor

XPromotor cod.Region

ATG TAA

Promotor cod.RegionATG TAA

Promotor cod.RegionATG TAA

Promotor cod.RegionGUSATG TAA

Promotor cod.RegionATG TAA

Transformation von Pflanzen: Protein-Reporterprotein-Fusionen

Zellkultur

CBL1::GFP

Prinzip:

ATG TAA

GFPGen

Transformationsvektor

Pflanze

CRY2::GFPPromotor

Transgene Pflanzen: Struktur- Funktions-Untersuchungen

Gen X: ATG TAA

x

Gen

GUS

GUS

GUS

GUS

Protein

GFP

(Komplementation von Mutanten)

X

GFP

GFPX

ATG TAA

Mutante

Transformation von Pflanzen: Über-Expression von Genen

- Viraler Promotor (CaM)- Konstitutive Expression- starker Promotor

Prinzip:

ATG TAA

Gen XProm.

Transformationsvektor

XGen X35S

Transformation von Pflanzen: Über-Expression des CBL1-Gens

CBL1

RD29A

CBF1

CBF2

PR1

actin

WT cbl1 35S35S-Prom CBL1 Term

planttransformation

Transformation von Pflanzen: Methoden

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Biolistic (biological+ballistic) transformation

Gene guns

Biolistic (biological+ballistic) transformation

Biolistic (biological+ballistic) transformationTransiente Expression des GUS-Reporter Genes

in Blättern nach Partikelbombardierung

Transiente Expression des GFP-Reporter Genesin Zwiebeln nach Partikelbombardierung

(onion epidermal cells transiently transformed with CBL6::GFP)

Stabile Transformation nach Partikel-Bombardierung

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Anwendung der Partikelbombardierung:Die Transformation von Plastiden

Gentransfer durch homologe Rekombination

Anwendung der Partikelbombardierung:Die Transformation von Plastiden

Gentransfer durch homologe Rekombination

Anwendung der Partikelbombardierung:Die Transformation von Plastiden

Regeneration der transgenen Pflanzen

BlattscheibeRegenerationsmedium

mit Antibiotika

Resistenter Callus mit sich regenerierender Pflanze

Stabile Transformation von Pflanzenzellen

CDPK

Syntide-2 - P

Syntide-22-3 d

Transiente Expression: Injektion von Agrobakterien

Plasmid

Agrobacterium

1 Infiltration of Agrobacteriumcontaining NtCDPK2-myc

2 TreatmentBiotic stress (elicitor, Cf-9/Avr9)Abiotic stress (wounding, flooding)

3 Preparation of extractsWestern blot analysis

5 Immunoprecipitation in vitro kinase assay

time course

4 Signallingresponses

Transiente Transformation von Pflanzenzellen

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Transiente Transformation von Pflanzenzellen Funktionsaufklärung von Genen (und ihren Produkten)durch Reverse Genetik

Methoden der Reversen Genetik zur Funktionsaufklärung:

zwei grundlegende Möglichkeiten:

A) gerichtete Mutagenese B) zufällige Mutagenese

1. Rekombination (A, B)

2. T-DNA Insertions-Mutagenese

3. Transponible Elemente

4. RNA Interferenz

5. CRISPR/Cas9

„forward / reverse genetics“

1. „forward genetics“-Vorwärts-Genetik: vom Phän (otyp) zum Gen(otyp)

Ausgangssituation: „Ich isoliere eine interessante Mutante (d.h. ich analysiere das äußere Erscheinungsbild einer mutierten Genfunktion), kenne aber nicht die Sequenz des dazugehörigen Gens“

Experimentelle Situation und Strategien:

Erlauben: - Beschreibung der Genfunktion

Erfordern: - Gezielte Kartierung des Mutantenallels und die Isolierung des Gens

2. „reverse genetics“-Reverse Genetik: vom Gen(otyp) zum Phän(otyp)

Ausgangssituation: „Ich kenne die Sequenz eines Gens, weiß aber nichts über seine Funktion“

Experimentelle Situation und Strategien:

Erlauben: - Gezielte Isolation einer Mutante

Erfordern: - Suche nach dem Phänotyp der Mutante

„forward / reverse genetics“

Reverse Genetik

Funktion ?

Insertion

- zerstört/verändern Genfunktion- markiert gleichzeitig das Gen

Genotyp:Bekannte Sequenz eines Gens

Mutagenese/Auffinden einer Mutante:(Mutationsereignis im Genmuss erkennbar sein)

- zufällig (T-DNA, Transposon)

- gerichtet („homologe Rekombination“):nicht in pfl.Kergenom, aber Plastom

Phänotypische Analyse

Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Hefe

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Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Hefe

Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen

Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen

Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen

Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen

Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen

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Gezielte Gen-Inaktivierung durch homologe Rekombination in Mäusen

Herstellung transgener Mäuse durch zufällige Integrationvon Fremd-DNA

Herstellung Gewebe-spezifischer „Kock-outs“durch das cre-lox System

Notwendige Elemente:

loxP-DNA-Sequenzen: locus of X-over P1

Cre-Rekombinase: causes recombination oder Cyclization recombinase

13bp 8bp 13bp

ATAACTTCGTATA - NNNTANNN -TATACGAAGTTAT

Die Sequenz zwischen den Lox-Sequenzen wird durch Rekombination entfernt

Herstellung Gewebe-spezifischer „Kock-outs“durch das cre-lox System

Herstellung Gewebe-spezifischer „Kock-ins“durch das cre-lox System

Herstellung Gewebe-spezifischer „Kock-ins“durch das cre-lox System

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Reverse genetics: T-DNA-insertion mutagenesis

LB T- DNA RB

vir-Gene

ori

tra

noc

Agrobacterium tumefaciens- enthält das Ti-plasmid- T-DNA (Region zwischen „left“ und „right“ Border)

Reverse Genetik durch T-DNA-vermittelte Insertionsmutagenese

...

Insertion

ATG TAA

Insertion

ATG TAA

Insertion

ATG TAA

T-DNA

PCR-Analyse von T-DNA-Insertionen

Mutante mit Insertion Wildtyp ohne Insertion

S+LB S+LB A+RB A+RBwt mut wt mut

Marker

T-DNALB A

RBS S

A

Herstellung von Mutantenpopulationen

BASTA

Tauch-Infiltrationmit Agrobakterium

Samenernte Selektion mit BASTA Isolierung von Insertionslinien

•Sequenzierung der flankierenden T-DNA Bereiche = FST: „flanking sequence tag“

•Bereitstellung der FST Sequenzen in einer Datenbank

•Sequenzvergleich der FSTs mit dem gewünschten Gen

•Bestellen des Samenpools, Isolierung und Verifizierung der gewünschten Mutante

•Phänotypische Analyse

Kommerzielle Generierung großer Mutantenpopulationen

Charakterisierung von Mutantenpopulationen

SP1 SP2 SP3AP AP

SP1 AP

SP2 AP

SP3 AP

AP

E E

E E

Thermal Asymmetric Interlaced (TAIL) PCR:

Adaptor PCR:

Datenbankanalyse für Insertionsmutanten

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Transposon-induced mutants

DNA elements capable of moving ("transposing") about the genome

Discovered by Barbara McClintock, largely from cytogenetic studies in maize, but

since found in most organisms

She was studying "variegation" or sectoring in leaves and seeds

She liked to call them "controlling elements“ because they affected gene expression

Transposon-induced mutants

T-DNA-induced mutants / Transposon-induced mutants

T-DNA-induced mutants:

- easy to establish in Arabidopsis

- technically restricted to Arabidopsis

- random distribution of insertions

- low insert copy number

Transposon-induced mutants:

- endogenous/heterologous transposons

- generation of stabilized transposons is genetically

complicated

- extends technology to other species

- allows generation of multiple allels and revertants

- non random distribution in genome

- can have high insert copy number

Transposon-induced mutants

Verschiedene RNAi Mechanismen

Intron

Anwendung von RNAi in Pflanzen

LB T- DNA RB

vir-Gene

ori

tra

noc

Annealing

Splicing

Transkription

in planta

Targeting

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Grundprinzipien des RNA silencing (RNA interference)

Dicer

Targeting

dsRNA

small dsRNA(ca. 21-24 nt mit 2 Nucleotid Überhang)

RISC (RNA Induced Silencing Complex)mit Argonaute Protein

mRNA

small ssRNA (siRNA) mit RISC

Silencingnächste mRNA

Komplexbindung an endogene,komplementäre mRNA Abbau der mRNA

CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9-Mechanismus CRISPR/Cas9-Mechanismus

CRISPR/Cas9-Mechanismus CRISPR/Cas9 Vorteile

Im Vergleich zu den anderen Genome Editing-Verfahren hat CRISPR/Cas9 folgende Vorteile:

Transgene Organismen sind einfacher herzustellen

Sehr viel schneller als herkömmliche Methoden

mehrere Genomveränderungen gleichzeitig durchgeführt werden

Kostengünstiger

In vielen Organismen verwendbar

CRISPR/Cas9 arbeitet es weitaus präziser

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CRISPR/Cas9 Vorteile