Z. Lebensm. Unters.-l%rsch. 159, 329--336 (1975) © by J. F. Bergmann, MSnchen 1975

Bittere Peptide aus dem Maisprotein Zein durch Hydrolyse mit Pepsin

H e r b e r t Wieser und Hans -Die t e r Beli tz

Deutsche Forsehungsanstalt fiir Lebensmittelchemie, Miinchen und Institut ffir Lebensmittelchemie der Technischen Universit~t Mfinchen (BRD)

Eingegangen am 11. Dezember 1974

B i t t e r Pep t ides I so l a t ed f rom Corn Pro te in Zein b y Hydro lys i s wi th Peps;m Summary. Eight peptides with bitter taste were isolated from a hydrolyzate of the corn protein

zein using several chromatographic procedures. The peptides have the following amino acid sequences and taste thresholds (~M/ml): Ala-Ile-Ala (50--100), Ala-Ala-Leu (50--100), Gly-Ala- Leu (50--100), Leu-Gln-Leu (2.5--3.5), Leu-Glu-Leu (8--12), Leu-Val-Leu (1.5~2.5), Leu-Pro- Phe-Asn-Gln-Leu (0.1--0.2), Leu-Pro-Phe-Ser-Gln.Leu (0.1--0.2). The threshold for bitter taste decreases with increasing number of hydrophobic side chains ~, ~> C~) in the peptide. I t increases in the presence of hydrophilie side chains parallel to their polarity.

Zusammen]assung. Aus einem Hydrolysat des Maisproteins Zein mit Pepsin wurden durch Kombination verschiedener chromatographischer Methoden acht bittere Peptide isoliert. Folgende Aminos/£uresequenzen und Geschmacksschwellenwerte (y2VI/ml) wurden ermittelt: Ala-Ile-Ala (50--100), Ala-Ala-Leu (50--100), Gly-Ala-Leu (50--100), Leu-Gln-Leu (2,5--3,5), Leu-Glu-Leu (8--12), Leu-Val-Leu (1,5--2,5), Leu-Pro-Phe-Asn-Gln-Leu (0,1--0,2) Leu-Pro-Phe-Ser-Gln-Leu (0,1--0,2). Der Sehwellenwert fiir den Bittergeschmack nimmt ab mit der Anzahl hydrophober Seitenketten ( > C3) im Peptid. Hydrophile Seitenketten erhShen den Schwellenwert in Abh~ngig- keit yon ihrer Polaritat.

Einleitung Die Einwirkung yon Papain, Pepsin und Pronase auf Zein fiihrt zu stark bitteren Hydrolysaten [1], die aufgrund der Aminos~iurezusammensetzung des :Proteins aueh zu erwarten sind [2]. In dieser Arbeit wird fiber Isolierung, Strukturaufklartmg und fiber Gesehmacksschwellenwerte yon Bitterpeptiden aus einem peptischen Zeinhydrolysat berichtet.

Exper imentel le Angaben 1. Isollerung der Peptide

a) Gewinnung eines Rohbittersto]]s: Zein (10 g, from corn, grade II, Sigma) in 0,01 n-ttCl (1 l) suspendieren, mit Pepsin (1 g, krist., 100 mU/mg, Merck) versetzen und 6 Std bei 35°C incubieren. AnsehlieBend 20 rain in siedendem Wasserbad inaktivieren, filtrieren und das I~iltrat gefriertrocknen.

b) Gelchromatographie: Vorbereiten yon Sephadex G 25 sf und Packen der S~ule nach [3]. Weitere experimentelle Angaben bei Abb. 1. ZusammengehSrende Fraktionen vereinigen, ge- friertrocknen und sensorisch analysieren.

e) 1onenaustauschchromatographie: Harze (Dowex 50 WX 2, 200--400 mesh, Dowex 1 X 2, 200--400 mesh) vorbereiten und Trennungen durchfiihren naeh [4] und [5] mit den bei [6] angegebenen Ab~nderungen. Weitere experimentelle Angaben bei Abb. 2 und Abb. 3 a---e. Alle an Dowex 1 X 2 erhaltenen Peaks zur Entfernung yon sensorisch stSrenden Begleitstoffen am Kationenaustauscher M 27 (Beckman) naehreinigen. Dazu Harz in der angegebenen Weise vor- behandeln und dann unter folgenden Bedingungen chromatographieren: S£ule 0,6 × 60 em (37 ° C), Peptide in je 0,5 ml 0,01 n-HC1 15sen und aufgeben, eluieren mit Pyridin/Essigs/iure (linearer Gradient, 300 ml + 300 ml) 0,2 tool pH 3,1 - - -> 1,0 tool pH 4,2. l~'liellgeschwindigkeit 20 ml/Std, :Fraktionen 1,0 ml, je 0,05 ml mit Ninhydrin anf/~rben. 1Nach Gefriertrocknen sensoriseh analysieren.

d) Di~nnschichtchromatographie [7]: Zur Reinheitspriifung der sKulenchromategraphisch iso- lierten Peptide bzw. zur weiteren pr~parativen Trennung yon PZ 251 und PZ 271 20 × 20 cm- Platten von Kieselgel G bzw. t t (Schichtdicke 0,25 ram, Merck) verwenden. 5%ige PeptidlSsungen auftragen, mit n-Butanol/Eisessig/Wasser 4 + 1 H- 1 (bei allen analytischen L~ufen und bei der pr~parativen Trennnng yon PZ 272) bzw. 5 -~ 1 + 1 (bei PZ 251) chromatographieren und mit Ninhydrin anf/irben. Bei prKparativen Trennungen nur zwei Rand- nnd einen Mittelstreifen an- f/~rben, Peptidzonen markieren, abkratzen, mit Wasser eluieren und filtrieren. ~iltrat gefrier- trocknen und gelSste Kiesels~ure dureh zweimaliges Chromatographieren an Dowex 50 WX 2, 200~400 mesh entfernen.

e) Desamidierung van Leu-Gln-Leu (PZ 262): Peptid (45 mg) in 2 n-HC1 (45 ml) 15sen und 30 rain bei 90 ° C halten. LSsung im Vakuumrotationsverdampfer einengen, l~iickstand in Wasser aufnehmen und gefriertrocknen, Nach dfinnschichtehromatograp.hischer Reinheitspriifung sen- sorisch analysieren.

330

2. Sequenzanalyse a) Aminogiureanalysen: Peptide mit 6 n-HCl bei 110 ° C fiber 24 Std in einem evakuierten

Gef/~B hydrolysieren. Bestimmungcn mit dem AminosEureanalysator ,,Unichrom" (Beckman) durchffihren.

b) N-termlnale Aminosiiuren: Dansylieren und chromatographiercn naeh [8--10] mit den in [6, 11] beschriebenen Abweiehungen.

c) Hydrolyse mit Exopeptidasen: Peptide nach der in [6] gegebenen Vorschrift hydrolysieren mit Aminopeptidase M (ApM, 50000 mUll0 rag, R6hm GmbH), Amine peptidase 0 (ApO, 50000 mU/13,5 rag, R6hm GmbH), Carboxypeptidase A (CpA aus Rinderpankreas, 1000 mU/25 rag, Sigma), Carboxypeptidase C (CpC 9000 mU]580 rag, R6hm GmbH). Hydrolysate mit Unichrom (Beckman) analysieren.

D254 n= ~ ~ ~ L', I"

~o: (~) ~ ~

60.~

70-

80-

90-

20 30 40 50 60 Prakt £onen

Abb. l, Chromatographie des Rohbitterstoffes an Sephadex G 25 sf. S~ule: 2,3 × 60 cm; Auf- gabe: 150 mg Rohbitterstoff; Elutionsmitteh H20; DurchfluB: 10 ml/Std; Fraktionen: 3 ml, Registrierung yon D~4 (%) mit Uvicord; Bittergesehmack: PZ 1 (+) , PZ 2a ( + + + ) , PZ 2b

(+++), Pz 3 (++)

E575 n=

1 , 0 -

0,8'

0,6,

0,4' - = !

: I " , t , I * t ¢ t t

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~a

r ' ~ r - -~ ,- --,

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,, I I , I o )

50 100 150 200 ~raktionen

Abb. 2. Chromatographie yon PZ 2 an Dowex 50 WX 2. S~ule: 1,4 x 100 cm; Aufgabe: 200 mg PZ 2; Elutionsmitteh Pyridin/Essigs~ure (linearer Gradient 1/1) 0,2 tool pH 3,1 -+ 1,0 tool p i t 4,2; DurchituB: 30 ml/Std; Fraktionen: 3 ml, 0,1 ml zur Ninhydrinanf~rbung; Bittergeschmaek: PZ 21 (+), PZ 22 (+), PZ 23 (+), PZ 24 (++), PZ 25 (++), PZ 26 (++), PZ 27 (-{-++),

Pz 2s ( + + + )

O, 6 -

3. Sensorische Analyse a) Qualitative Pri~]ung: Zur sensorisehen Priifung wKhrend der Trennung Lyophilisate in 0,5 ml

frisch dest. Wasser 16sen und LSsung mit Glasstab auf den Zungengrund bringen. Drei Personen priifen unabhiingig voneinander. Verwendete Skala: stark bitter ( + -[- +) , deutlieh bitter ( + -}-), sehwach bitter (+), neutral (o).

b) Sehwellenwerte: In einer Verdiinnungsreihe diejenige Konzentration ([zM/ml) bestimmen, die gerade noch als bitter empfunden wird (recognition threshold); als L6sungsmittel frisehes Leitungswasser verwenden, L6sungen (1 ml) mit zwei Wasserproben versehlfisseln (Dreieekstest) und mit Hilfe eines kleinen Uhrglases auf den Zungengrund bringen. Ausffihrliche Diskussion des Verfahrens bei [12].

E575 nm v~ ra~

0,8-

0,6-

0,4"

0,2"

I

88

0,8.

! I , ! )

104 120 136 ~raktionen

3a

0,4-

E575 nm

0,2" ~ ,

i

88

I i I I I | |

I

104 120 ~ra~ionen

3b

0,8.

O, 6-

0,4"

0,2- i

i I 88 104

~, ~ E57~ =m

/

0,8.

0,6.

0 ,4

' t J 0,2

120 112

~575 nm

0,8 I

I 0,4.

i 0,2'

: : i ~ T. ) 128 144

331

I

96 112 128 ~raktionen

3e ~raktionen Praktionen

30 3d Abb. 3a--e. Ctu'omatographie yon PZ 24--PZ 28 an Dowex 1 X 2. Sgule: 0,6..x 60 em; Auf- gabe: Je 50 nag PZ 24---PZ 27, 10 nag PZ 28; Elutionsmittel: Gradient N-Athylmorpholin/ ~-Picolin/Pyridin/Essigs~ure pH 9,4 (10 hal) -+ pH 8,4 (30 ml) -+ pH 6,5 (40 ml) -> 0,5 reel Essig- s~ure (60 ml) -+ 2 reel Essigsgure (100 ml); DurehfiuB: 30 ml/Std; l%aktionen: 1 ml, 0,05 ml zur Ninhydrinanf/irbung; Bit%ergesehmaek: PZ 241 (o), PZ 242 (+), PZ 243 (-{-), PZ 244 (+), PZ 251 (+), PZ 252 ( + + ) , PZ 253 (+-}-), PZ 261 ( + + ) , PZ 262 ( + + ) , PZ 271 (-}-++),

PZ 281--PZ 283 konnten nicht sensorisch geprfift werden

332

Ergebnisse 1. Isolierung yon bitteren Peptiden

Die optimalen Bedingungen ffir die Zeinhydrolyse mit Pepsin wurden in Vor- versuchen ermittelt. Ein Enzym/Substrat-Verh&ltnis yon 1 : 10 und eine Hydrolyse- zeit yon 6 Std bei pit 2,0 ffihrte in 95 %iger Ausbeute (bezogen auf eingesetztes Zein) zu einem Rohbitterstoff, der zur Isolierung yon Peptiden eingesetzt wurde.

Bei der Chromatographie an Sephadex G 25 sind die bitteren Peptide in einem zusammenh£ngenden, aber untergliederten Bereieh (PZ 1-PZ 3) lokalisiert (Abb. 1). Das Maximum der Geschmacksintensit~t ]iegt bei PZ 2a/PZ 2b, die zu PZ 2 zusam- mengefa~t wurden, da sich bei einer zun&ehst getrennten Weiterverarbeitung nur geringe Unterschiede zeigten.

PZ 2 1£6t sieh am Katlonenaustauscher Dowex 50 in eh~e Reihe yon bitteren Fraktionen trennen (Abb. 2), deren Geschmaeksintensit£t yon PZ 21 nach PZ 28 zunimmt. Die bittersten Peaks, PZ 24-PZ 28 wurden am Anionenaustauseher Dowex 1 ehromatographiert (Abb. 3a-e) und erwiesen sich dabei als ziemlich kom- plex. Aufgrund von Intensit&t des Bittergeschmacks und Ausbeute kamen yon den erhaltenen Peaks PZ 251, PZ 252, PZ 253, PZ 262, PZ 271 und PZ 272 ffir weitere Untersuchungen in Frage.

Bei der dfinnschichtchromatographischen Prfifung auf Einheitlichkeit zeigte sich, da6 PZ 252 und PZ 253 immer noch aus mindestens vier bis ffinf Komponenten be- stehen. Sie wurden nicht aufgearbeitet, da die zur Veffiigung stehenden Mengen nieht ausreichten. Die fibrigen Peaks (Abb. 4) waren entweder weitgehend einheitlieh (PZ 262, PZ 272) oder bestanden aus zwei (PZ 271) bzw. drei (PZ 251) Komponenten, die dureh pri~parative Dfinnschiehtchromatographie in reiner Form isoliert werden konnten.

PZ 2711 0

PZ 2511~) 27, 2512,(:) 2Z 262(9 £Z 2513 0

PZ 251

PZ 2712 0

o ...-:

. z

PZ 262 PZ 271

e PZ 262m 0

,,[:

2Z 272 0 "~ .:.'..

'2:

v

PZ 272 PZ 262m

Abb. 4. Diinnschichtchromatographie isolierter Bitterpeptide. Schicht: Kieselgel G 0,25 ram; Aufgabe: 0,002 ml einer l°/oigen L6sung; :Fliel]mittel: n-Butanol/Eisessig/H20 (4 -5 1 -5 l)

In Abb. 5 ist der verwendete Trennungsgang nochmals sehematisch zusammen- gefal3t.

2. Sequenzen der isolierten Peptide Die isolierten Peptide erwiesen sich aufgrund der diinnschichtehromatographi-

schen Analyse, der Aminos~urezusammensetzung und der N-Termini als einheitlich. Ihre Sequenzen wurden durch Dansylierung und dureh enzymatischen Abbau mit Exopeptidasen ermittelt. Tab. 1 enth£]$ die Ergebnisse.

3. Desamidierung yon Peptid PZ 262 (Leu-Gln.Leu) Das Peptid konnte durch Hydrolyse mit 2 n-HC1 bei 90 ° C in 30 rain quantitativ

desamidiert werden. Das erhaltene PZ 262 m (Leu-Glu-Leu) verhielt sieh bei der Dfinnschichtchromatographie weitgehend einheitlieh (Abb. 4).

333

4. Sensorische Analyse der Peptide Zur Charak~erisierung der Geschmacksintensiti~ten der isoliel~en Bitterpeptide

wurden die Schwe]lenwerte bestimmt. Tab. 2 zeigt, dab die beiden Hexapeptide den gleichen Schwellenwerb haben und weitaus am bittersten shad. Die Schwellen-

ZEIN "~ ROHBIT- __~ - TERSTOFF

o

--PZ I

g

PZ 2---

= 4~

• PZ 3

~ laZ 241 -'PZ 21 PZ 242

-PZ 22 I LPZPz 244243

Q r-- PZ 2511

--PZ 26--.: '~ PZ 2712 _____~PZ 271-~ PZ 272

--PZ 27 PZ 272 - "~

~PZ 281 --PZ 28 ....

PZ 282

PZ 283 Abb. 5. Schema des Trennungsganges zur Isolierung yon Bitterpeptiden aus einem peptischen

Zeinhy&'olysat

T~belle 1. Sequenzanalyse der Bitterpeptide

Peptid: PZ 2511 Zusammensetzung: Al%, Ile N-Terminus: Ala ~ Hydrolyse mit CpA (180 min): Ala (0,79) b, Ile (0,0) Sequenz: Ala-Ile-Ala

Peptid: PZ 2512 Zusammensetzung: Ala.z, Leu N-Terminus: Ala Hydrolyse mit CpA (180 min): Leu (0,54), Ala (0,0) Sequenz : Ala-Ala-Leu

Peptid: PZ 2513 Zusammensetzung: Ala, Gly, Leu N-Terminus: Gly Hydrolyse mit CpA (180 rain) : Leu (0,90), Ala (0,0), Gly (0,0) Sequenz: Gly-Ala-Leu

Peptid: PZ 262 Zusammensetzung: Glx, Leu~ N-Terminus: Leu Hydrolyse mi~ CpA (180 min): Leu (0,92), Glx (0,0) Hydrolyse mib ApM (60 rain): Leu (1,36), Gin (0,55) Sequenz: Leu-Gln-Leu

Peptid: PZ 2711 Zusammense~zung: Leu,, Val N-Terminus: Leu Hydrolyse mit CpA (360 min): Leu (1,15), Val (0,11) Sequenz: Leu-Val-Leu

334

Tabello 1 (Fortsetzung)

Peptid: PZ 2712 Zusammensetzung: Asx, Glx, Leu2, Phe, Pro l~-Terminus: Leu Hydrolyse mit ApO: Kein Umsatz Hydrolyse mit CpA:

5 rain 15 rain 30 min 45 min 60 rain

Leu 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 Gln ¢ 0,2 0,5 0,8 1,0 1,1 Asn ~ 0,0 0,1 0,5 0,8 1,0 Phe 0,0 0,0 0,1 0,3 0,5 Pro 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Sequenz: Leu-Pro-Phe-Asn-Gln-Leu

Peptid: PZ 272 Zusammensetzung: Glx, Leu2, Phe, Pro, Ser N-Terminus: Leu Hydrolyse mit ApM und ApO: Kein Umsatz Hydrolyse mit CpA:

30 rain 60 rain 120 min 240 rain 360 rain

Leu 1,0 1,1 1,1 1,1 1,1 Gln d 0,4 0,8 1,0 1,0 1,0 Ser a 0,2 0,4 0,8 0,9 1,0 Phe 0,0 0,1 0,2 0,3 0,3 Pro 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Sequenz: Leu-Pro-Phe-Ser-Gln-Leu

a Die N-Termini aller Peptide wurden dureh Dansylierung ermittelt. b Mole Aminos~uref~¢Iol Peptid.

Zur Trennung yon Ash und Gln wurde bei der Aminos~ureanalyse der pit.Weft des 1. Puffers auf 2,75 erniedrigt.

d Da Ser und Gln nieht trennbar sind, wurden sie zun~chst als Summe bestimmt. In einem zweiten Ansatz wurden die beiden Aminos~uren dann veto Restpeptid fiber eine Kationenaus- tauschers~iule abgetrennt und nach S~urehydrolyse als Ser und Glu bestimmt.

Tabelle 2. Gesehmackssehwellenwerte von Bitterpeptiden aus Zein

Peptid Struktur Geschmack Schwellenwert ~M]ml

PZ 2 5 1 1 Ala-Ile-Ala bitter 50 --100 a PZ 2512 Ala-Ala-Leu bitter 50 --100 a PZ 2 5 1 3 Gly-Ala-Leu bitter 50 --100 ~ PZ 262 Leu-Gln-Leu bitter 2,5-- 3,5 PZ 262 m Leu-Glu-Leu b bitter/sauer 8,0--- 12,0 PZ 2 7 1 1 Leu-Val-Leu bitter 1,5-- 2,5 PZ 2712 Leu-Pro-Phe-Asn-Gln-Leu bitter 0,1-- 0,2 PZ 272 Leu-Pro-Phe-Ser-Gln-Leu bitter 0,1-- 0,2

Da nur kleine Mengen des Peptids zur Verfiigung standen, konnte der Sehwellenwert nur grob abgeseh~tzt werden.

b Aus Peptid PZ 262 dutch Desamidierung erhalten.

335

we~e der Tripeptide PZ 262 und PZ 2711 sind demgegeniiber um eine Zehnerpotenz grSl~er. Die Desamidierung yon PZ 262 zu Leu-Glu-Leu ist mit einer deutlichen Er- hShung des Schwellenwertes verbunden und aueh mit dem Auftreten einer sauren Gesehmackskomponente. Die Tripeptide PZ 2511, PZ 2512 und PZ 2513 sind nur sehwach bitter.

Diskussion

Die in der Literatur anhand yon Bitterpeptiden aus Casein- und Sojaprotein- hydrolysaten abgeleiteten Zusammenh~nge zwisehen Struktur und Gesehmaek sind im einzelnen recht untersehiedlich, haben jedoch eine Gemeinsamkeit : Hydrophobe Seitenketten werden allgemein als Voraussetzung fiir das Auftreten yon bitterem Gesehmack angesehen. Aus diesem Grunde ersehien das hydrophobe Maisprotein Zein als geeignetes Material zur Gewinnung bitterer Peptide. Nach Versuehen yon Petritsehek [1] werden mit Papain, Pepsin und Pronase stark bittere Hydrolysate erhalten. Im vorliegenden Fall wurde Pepsin ausgew~hlt. Aufgrund der Aminos~ure- zusammensetzung des Zeins war im Hydrolysat mit dem Auftreten von Peptiden mit sehr ~hnlicher Aminos~urezusammensetzung zu reehnen, die sehwer trennbar sein wfirden. Es zeigte sieh dann auch, dal~ in einer Reihe von F~l]en Gelchromato- graphie und Chromatographie an Kationenaustauschern und Anionenaustauschern nieht zu einheitliehen Peptiden ffihrten, so dal3 zus~tzliche Trennungen an Kieselgel notwendig wurden. Die Sequenzanalysen wurden mit den iibliehen Methoden durch- gefiihrt und boten keine Probleme.

Die isolierten Peptide ffigen sieh in die Reihe bekannter Bitterpeptide gut ein. Das Vorkommen yon Leu, Phe, Pro, Val und Ile best~tigt die bereits versehiedentlich [6, 13-16] erkannte Bedeutung l~ngerer hydrophober Seitenketten (~ C3) ffir Bitter- gesehmack. Das geh~ufte Auftreten yon Leu in terminaler Position - bei den 7 isolierten Peptiden tritt Leu zehnmal terminal auf - ist auf die Spezifit~t des Pepsins zurfiekzufiihren und wurde z. B. auch bei Peptiden aus einem Hydrolysat yon Soja- protein mit Pepsin beobaehtet [17]. Wie die sensorische Untersuehung einer grSl]eren Zahl anderer Peptide aber eindeutig zeigt [12], ist terminales Leucin keinesfalls - wie yon einigen Autoren [14, 15, 17] vermutet wurde - als eine Voraussetzung fiir das Au~treten yon Bittergeschmack anzusehen.

~ber diese qualitativen Betraehtungen hinausgehende Aussagen sind aufgrund der Sehwellenwerte mSglieh. Es zeigt sich ein Zusammenhang zwischen Anzahl der hydrophoben Seitenketten im Peptid und Gesehmacksintensit~t. Die Schwellen- werte der Tripeptide fallen z. B. yon 50-100 ~M/ml bei einer hydrophoben Seiten- kette (Ala-Ile.Ala, Ala.Ala.Leu, Gly-Ala-Leu) auf 2.,5-3,5 ~M/ml bei zwei (Leu- Gln-Leu) und auf 1,5-2,5 ~M/ml bei drei (Leu-Val-Leu) solehen Resten. Die Schwellenwerte der Hexapeptide mit vier hydrophoben Seitenketten (Leu-Pro-Phe- Asn.Gln-Leu, Leu.Pro-Phe.Ser-Gln-Leu) liegen mit 0,1-0,2. ~M/ml noah um eine Zehnerpotenz niedriger.

Dal~ gegenfiber dem EinfluB der Anzahl hydrophober Seitenketten das Verh~Itnis hydrophile Reste/hydrophobe Reste von geringerer Bedeutung ist, zeigt ein Vergleieh yon Leu.Pro-Phe-Asn-Gln-Leu und Leu-Gln.Leu. In beiden Peptiden ist dieses Ver- h~ltnis 1:2, die Sehwellenwerte als Mall ffir die Geschmacksintensit~t differieren dagegen um eine Zehnerpotenz.

ttydrophile Seitenketten erhShen den Sehwellenwert, offensichtlich parallel zu ihrer Polarit~t. So steJgt bei der Desamidierung yon Leu-Gln-Leu zu Leu-Glu.Leu der Schwellenwert yon 2,5-3,5 y2Cl/ml auf 8-12 ~M/ml.

Literatur

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Dr. H. Wieser und Professor Dr. H.-D. Belitz Deutsche :Forschungsanstalt fiir Lebensmittelchemie D-8000 Miinchen 40, Leopoldstr. 175 Bundesrepublik Deutschland