This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

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814 W. A. KÖNIG • STRU KTU RA U FK LÄ RU N G N E U E R ARGININ-ANTAGONISTEN

Massenspektrometrische Strukturaufklärung neuer Arginin - Antagonisten

M ass S pec trom etric S tru c tu re E lu c id a tio n of N ew A rginine A ntagonists

W i l f r i e d A. K ö n i g

Chemisches Institut der Universität Tübingen

(Z. Naturforsch. 38 b, 814-819 [1973]; eingegangen am 3. Mai 1973)

Mass spectrometry, arginine antagonists

The structure of two new arginine antagonists, isolated from microorganisms, was determined by mass spectrometry after formation of adequate derivatives and by com­parison with derivatives of reference compounds.

Antibiotisch wirksame Substanzen, deren W ir­kung durch Arginin aufgehoben wird, tre ten in der N atu r in auffallender Häufigkeit auf. Sie wurden als Stoffwechselprodukte verschiedener M ikroorga­nismen oder auch aus Pflanzen isoliert und weisen in ihrem chemischen V erhalten und in ihrer S truk­tu r Ähnlichkeit m it Arginin auf (Tab. I).

Tab. I. Die bisher bekannten Arginin-Antagonisten und ihre Strukturen.

Canavanin1 H 2N -C -N H -0-C H 2-C H 2-C H -C 00HIINH N H 2

Homoarginin2 H 2N -C -N H -(C H 2)4-CH-COOHII

NH N H 2

Indospicin3 H 2N-C-(CH2)4-CH-COOHII 1

NH N H 2

Imino-äthyl- H 3C-C-NH-(CH2)3-CH-COOHII 1ornithin4 NH N H 2

Bei der S trukturaufklärung von zwei neuen A r­ginin-Antagonisten erwies sich die M assenspektro­metrie von großem Nutzen. Besonders durch Ver­gleich der Massenspektren von bekannten Arginin- Antagonisten m it den Spektren der unbekannten Verbindungen konnten wertvolle Erkenntnisse ge­

Sonderdruckanforderungen an Dr. W ilfried A.K ö n i g , Chemisches In s titu t d. Univ. Tübingen,JJ-7400 Tübingen, Auf der Morgenstelle,

wonnen werden. Arginin und die analogen arginin- ähnlichen Antibiotica sind sehr polare V erbindun­gen und können daher nicht unzersetzt verdam pft werden, so daß die direkte Aufnahme von Massen - Spektren nicht möglich ist. Es ist daher zweckmäßig, die P o laritä t dieser Verbindungen durch H erstel­lung flüchtiger Derivate zu reduzieren. Hierbei eignet sich besonders die Substitution der W asser­stoff-Atome der polaren funktionellen Gruppen durch Trimethylsilyl(TMS)-Gruppen. Diese Me­thode ha t sich zur Herstellung flüchtiger D erivate für die Gas-Chromatographie und M assenspektro­m etrie einer Vielzahl von Naturstoffen bewährt, da das flüchtige Derivat in nur einem R eaktionsschritt erhalten wird.

Die M assenspektren von TMS-Derivaten lassen in den meisten Fällen ein Molekül-Ion und ein cha­rakteristisches Fragm ent-Ion M t-1 5 (Abspaltung eines CH 3 -Radikals) erkennen. E in Nachteil der TMS-Derivate ist die auffallend große Tendenz zu intram olekularen Umlagerungsreaktionen der TMS- Gruppen, was in vielen Fällen zu intensiven, jedoch nicht strukturspezifischen Bruchstücken führt. Das TMS-Ion (m/e 73) selbst ist in der Regel das in ten ­sivste Bruchstück in den Massenspektren von TMS-Derivaten.

Die Anzahl der von einer mehrfunktionellen, u n ­bekannten Verbindung aufgenommenen TMS-Grup- pen läßt sich am sichersten durch Herstellung des entsprechenden Perdeuterio-TM S-Derivates5 be­stimmen. Dies wird durch Reaktion m it D-9 -Bis- trim ethylsilylacetam id (Sharp und Dohme, Mün-

W. A. KÖNIG • STRUKTURAUFKLÄRUNG N E U E R A RGININ -ANTAGONISTEN 81 5

chen) hergestellt. Für jede TMS-Gruppe ergibt sich eine Verschiebung um 9 Masseneinheiten nach höherer Masse gegenüber dem entsprechenden TM S-Derivat. Auf diese Weise kann das Molekular­gewicht der unbekannten Verbindung bestim m t werden. Aus den charakteristischen Massenverschie­bungen im M assenspektrum des D-9-TMS-Derivates läß t sich außerdem die Anzahl der TMS-Gruppen in den einzelnen Fragm ent-Ionen ableiten, was für die richtige In terpretation sehr nützlich sein kann (Isotopen m arkierung).

Einzelne funktionelle Gruppen können durch spezifische Schutzgruppen charakterisiert werden. Substanzen m it Carboxylgruppen können beispiels­weise vor der Silylierung mit methanolischer HCl verestert werden. Auf diese Weise läßt sich einer­seits die Anzahl der Carboxylgruppen festlegen und andererseits erhält m an eine Zuordnungsmöglich­keit einzelner Fragm ent-Ionen, welche nun eine Car- boxym ethyl-Gruppe anstelle einer silylierten Carbo- oxylgruppe enthalten (Substituentenmarkierung).

A rginin (Abb. 1)

Als typisches Beispiel für die hier untersuchten Aminosäuren sei das Massenspektrum des TMS- D erivates von Arginin diskutiert. Man beobachtet einen Molekülpeak bei m/e 534 (34% rel. In t.), was die Aufnahme von 5 TMS-Gruppen beweist. In ge­ringerer In tensitä t kann auch der Molekülpeak des D erivates m it 4 TMS-Gruppen (m/e 462; 3,1% rel. In t.) e rkannt werden. E in charakteristisches F rag­m ent-Ion Mt-COOTMS ist bei m/e 417 zu erkennen. Diese Fragm entierung ist charakteristisch für alle silylierten Aminosäuren6. Ein für die A rt der in­ständigen funktionellen Gruppe äußerst wichtiges F ragm ent-Ion tr i t t bei m/e 348 (M t-T M S -N = C = N -

TMS) auf. Auch die Seitenkette selbst kann die positive Ladung stabilisieren und ergibt ein Bruch­stück der Masse 316 (M t-TM S-NH-CH-COOTM S). Durch A bspaltung des gesam ten Guanidinrestes und Umlagerung eines W asserstoff-Atoms wird ein Ion der Masse 259 erhalten (M +-(TM S-NH ) 2 C = N - TMS), das un ter Verlust des COOTMS-Restes wei­ter nach m/e 142 zerfällt. Ebenfalls kennzeichnend für die Guanidingruppe ist ein Fragm ent-Ion der

Masse 187 (T M S -N H =C =N -T M S ), das leicht CH 4

abspaltet (m/e 171). Die hier angegebenen In te r­pretationen für die einzelnen Fragm ent-Ionen wer­den durch die M assenspektren des D-9-TM S-Deri- vates, des TM S-Derivates des M ethylesters von Arginin und letztlich durch die entsprechenden Spektren der D erivate des Homoarginins (Tab. I) bestätigt. Beim silylierten M ethylester des Arginins (M t bei m/e 476) tre ten wie beim vollständig silylier­ten P rodukt die Fragm ent-Ionen m/e 417, 316, 187,171 und 142 auf, w ährend die Ionen, welche die Carbo- xylgruppe enthalten, um 58 Masseneinheiten nachtie- ferer Masse verschoben sind (z.B. m/e 348 -> m/e 290).ö-N -H ydroxy-Arginin

Aus dem D erm atophyten N annizzia gypsea läß t sich eine gegen N inhydrin positiv reagierende Sub­stanz isolieren, die verschiedene Bakterien und Pilze hem m t und deren W irkung durch L-Arginin oder L-Citrullin aufgehoben w ird7. Das M assenspektrum des TMS-Derivates (Abb. 2) ergab einen Molekül­peak bei m/e 550. Das gegenüber dem Arginin-Deri- va t um 16 M asseneinheiten höhere Molekularge­wicht ließ au f die Gegenwart eines zusätzlichen Sauerstoff-Atoms im Molekül schließen. Ansonsten zeigte das Spektrum der unbekannten Substanz auffallende Ähnlichkeit m it dem Spektrum des

100-

;75-

-50

<25 -

50

K.Z

Joa4

iTMS 1 1N H -C •; N -

i! TMS!| 187! 274

260 1246 |232 1218 1117 '89

C H2TC hZTC H2TC H f COlOT MS

i 'NH l

! ! !t m s | i288! 3021 3161 41714451

417 462rX ,

- 1 U

-5.0

100 150 200 250 300 350 A00 ^50 500 550 m/e

Abb. 1. Massenspektrum des TMS-Derivates von Arginin. LK B 9000, 70 eV, Direkt-Einlaß,

816 W. A. KÖNIG • STR U KTU R AUFKLÄRUNG N E U E R ARGININ-ANTAGONISTEN

Abb. 2. Massenspektrum des TMS-Derivates des Antibioticums aus Nannizzia gypsea. LKB 9000, 70 eV,Direkt-Einlaß.

TMS-Arginins. Vor allem das F ragm ent-Ion bei m/e 187 (T M S-N H =C =N -T M S) und das daraus resultierende m/e 171 sowie ein Bruchstück der Masse 364 (M i-T M S -N = C = N -T M S ; m* = 242) lassen die nahe Verwandtschaft zu Arginin erken­nen. Im entsprechenden D-9-TMS-Derivat der u n ­bekannten Aminosäure ist m/e 364 nach m/e 391 ver­schoben, was auf die Anwesenheit von 3 TMS-Grup- pen im Bruchstück 364 schließen läßt. Im TMS- D erivat des M ethylesters der unbekannten Sub­stanz t r i t t anstelle von m/e 364 ein Fragm ent-Ion der Masse 306 auf, was die R ichtigkeit der In te r­pretation bestätigt. Dam it ist die B indung des zu­sätzlichen Sauerstoffs an ein w-ständiges Stickstoff- Atom ausgeschlossen. Die naheliegende Vermutung, es handle sich um ein Homologes des Canavanins (Tab. I), konnte durch Aufnahme des Massenspek­trum s des TMS-Derivates von Canavanin und Ver­gleich der M assenspektren schnell widerlegt werden. Die beiden Spektren zeigten nicht die für Homologe zu erwartende Ähnlichkeit. Vor allem fehlt das aus dem Verlust des Carbodiimids resultierende F rag ­m ent-Ion der Masse 350, welches m/e 364 beim Anti- bioticum entspräche, völlig.

Auffallend beim TMS-Derivat des A ntibioticum s ist auch ein Fragm ent-Ion der Masse 258, das 2 TMS-Gruppen (D-9-TMS-Derivat!) und den Car- boxyl-Rest enthält (Verschiebung nach m/e 200 beim M ethylester!). Entsprechende Ionen m it einer TMS-Gruppe tre ten bei m/e 186 bzw. m/e 128 (Methyl­ester) auf. Mit großer W ahrscheinlichkeit handelt es sich hierbei um die folgenden S tru k tu ren :

CH, — CH, CH, — CH,

CH, CH-COOR und CH, CH-COOR\ / \ /

N NI H

TMS1 2

m/e 258 (R = TMS) m/e 186 (R = TMS)m/e 200 (R = CH3) m/e 128 (R = CH3)

D adurch kann die Gegenwart des zusätzlichen Sauerstoffatoms innerhalb der Kohlenstoff-Kette ausgeschlossen werden.

Bei unseren Strukturuntersuchungen von unbe­kannten Aminosäuren 8 ergaben die M assenspektren der trifluoracetylierten (TFA) Aminosäureester9

wertvolle ergänzende Strukturhinweise zu denen, die aus den Spektren der TMS-Derivate gewonnen wurden. Beim hier beschriebenen A ntibioticum konnte zwar ebenfalls ein M ethylester und anschlie- send ein TFA-Derivat hergestellt werden, doch ließ das Molekulargewicht von 474 (Abb. 3) (nach E in ­führung von einer Methyl- und 3 TFA-Gruppen) e r­kennen, daß das Molekulargewicht der unbekann­ten Substanz um 18 Masseneinheiten von 190 auf172 reduziert ist. Es liegt nahe, diese Beobachtung m it der Eliminierung eines WTassermoleküls zu e r­klären, was wiederum auf eine Hydroxylgruppe im Molekül des Antibioticums schließen läßt. Dem TFA-Derivat wurde auf Grund der im Massenspek­tru m auftretenden Bruchstücke die S truk tur 3 zu­geordnet :

W. A. KÖ NIG ■ STRU KTU RA U FK LÄ RU N G N E U E R ARGININ-ANTAGONISTEN 817

Abb. 3. Massenspektrum des Antibioticums aus Nannizzia gypsea nach Veresterung mit HCl/CH3OH undTrifluoracetylierung. LKB 9000, 70 eV, GC-MS.

CF 3 — CO — NH — C — N H — ^IIN

CO— c f 33

N '

CO

CF,

COOCH,

Die H auptfragm ente lassen sich m it dieser S truk­tu r sehr gu t erklären. Die A bspaltung der G uanidin­gruppe führt zu m/e 224. D araus wird u n te r Ab­spaltung von HCOOCH 3 das Fragm ent-Ion m/e 164 gebildet (m* = 120). Diese In terp re ta tion wird durch Vergleich m it dem M assenspektrum des en t­sprechenden Isopropylesters bestätigt. Anstelle von m/e 224 tr i t t hier m/e 252 auf, während m/e 164 un ­verändert bleibt. Die S truk turen der Ionen m/e 224 bzw. m/e 252 dürften analog zu 1 und 2 bei den oben beschriebenen TM S-Derivaten sein. Auffallend ist in den M assenspektren der TFA-Derivate ein F rag ­m ent-Ion bei m/e 6 8 , bei dem es sich um das dem Ion der Masse 164 entsprechende Ion m it freier Im inogruppe handeln dürfte. Die Spektren der TFA-Derivate erinnern in einigen Fragm entierun­gen stark an die entsprechenden Spektren von Hy- droxyprolin. Auch hier findet sich das Fragm ent- Ion m/e 164 (M -(TFA O H +CO O R)) als intensivstes Ion. Ebenso werden die Bruchstücke bei m/e 224 bzw. 252 beobachtet.

Wichtige Hinweise au f die S truk tur des A nti­bioticums wurden bei der U ntersuchung der A bbau­produkte nach Behandeln m it 6 n HCl oder H ydra­zin erhalten. In beiden Fällen wurde ein TMS-Deri- v a t m it Molekulargewicht 364 erhalten (Abb. 4).

Durch Vergleich m it dem entsprechenden D-9- TM S-Derivat einerseits und m it dem silylierten

M ethylester andererseits ließ sich nachweisen, daß das Spaltprodukt das Molekulargewicht 148 und eine Carboxylgruppe besitzt. Beim Vergleich m it dem TMS-Derivat des Antibioticum s fällt sofort auf, daß das dort bei m/e 364 auftretende Fragm ent- Ion, das durch Abspaltung von T M S -N = C = N - TMS aus dem Molekül-Ion entsteht, nun im Spalt­produkt als Molekül-Ion auftritt. Auch die F rag ­m ent-Ionen bei m/e 258 bzw. 186 (1 und 2) können in beiden Fällen beobachtet werden. Das bedeutet, daß bei der Einwirkung von Säure oder H ydrazin auf das Antibioticum ein Molekül Carbodiimid ab ­gespalten wird. Das analoge Verhalten ist bei Ar- ginin bekannt, das m it H ydrazin in O rnithin über­geführt w ird10.

Es war naheliegend, für das Spaltprodukt die S truk tu r eines <5-iV̂ H ydroxy-Ornithins (4) anzu­nehmen. Diese Annahme konnte durch Vergleich

[275 [260 |246 |232 |218 |117 |

TMS-0-:NHi-CH27CH2|CH2!-CH J-CojoTMS

i I ! NH Ii ! ! |TMS |

104t 118! 1321 146! 247! 275!

MG 364

100

! 75

50

25

50 100 150

-12.1

6.0

200 250 m/e

300 350

Abb. 4. Massenspektrum des Antibioticums aus N annizzia gypsea nach Hydrolyse und Trimethyl-

silylierung. LKB 9000, 70 eV, GC-MS.

818 W. A. KÖNIG • STRU KTURAUFKLÄRUNG N E U E R AR GININ-ANTAGONISTEN

m it authentischem d-Ä^Hydroxy-Ornithin bestä­tig t werden, das schon früher als Baustein verschie­dener A ntibiotica erkannt worden w ar11.

Aus all diesen Ergebnissen ergibt sich die Ge­sam tstruk tu r des A rginin-Antagonisten aus Nanniz- zia gypsea als d-Ä^Hydroxy-Arginin (5).

HO — N H — CH 2 — CH, — CH 2 — CH — COOOHI

n h 2

4OH

H 2N — C — N — CH, — CH 2 —CH2— CH — COOHII I

N H N H 2

5

0-[L-Norvalyl-5]-isoharnstoff

Ein weiterer Arginin-Antagonist, dessen W irkung durch Arginin, Ornithin und Citrullin aufgehoben wird, konnte aus einem Gram -negativen Bacterium isoliert werden (Tü 222)13. Auch hier handelte es sich um eine, entsprechend ihrem chrom atographi­schen V erhalten auf Ionenaustauscher-Säulen und auf D ünnschichtplatten, sehr polare Substanz m it positiver N inhydrin-Reaktion.

E in TM S-Derivat der Substanz konnte unter den üblichen Bedingungen (Bis-trimethylsilyltrifluor- acetam id, 100 °C, 1 Stde.) nicht erhalten werden. Im Gas-Chromatogramm des Reaktionsgemisches ließen sich jedoch drei Produkte nachweisen, die durch Vergleich der M assenspektren authentischer Substanzen als L-Prolin, H arnstoff und d-Hydroxy- L-Norvalin identifiziert wurden (Abb. 5). Die K on­figuration der Aminosäuren konnte durch gaschro­m atographische Enantiom eren-Trennung an einer m it N-TFA-L-Phenylalanyl-L-Leucin-Cyclohexyl- ester als stationärer Phase belegten Kapillarsäule bestim m t w erden14. Auch bei alkalischer Hydrolyse

und anschließender Silylierung erhält m an ein Ge­misch mehrerer Produkte im Gas-Chromatogramm, die durch Vergleichsmassenspektren als Carbodi- imid, Harnstoff, Prolin und <5-Hydroxy-Norvalin erkannt wurden.

Ähnliche Ergebnisse wurden bei gaschromato- graphisch-m assenspektrom etrischer Untersuchung der R eaktionsprodukte des Antibioticum s nach Hydrolyse in 6 n HCl, Trifluoracetylierung und Ver­esterung m it D iazom ethan erhalten. H ier tre ten neben Prolin u nd (5-Hydroxy-Norvalin noch <5-Chlor- Norvalin und das Lacton des d-Hydroxy-Norvalins auf (Abb. 6 ).

Schließlich konnte nach sehr schonender Silylie­rung m it Ar-Methyl-A7 -trim ethylsilyl-trifhioracet- amid bei R aum tem peratur doch ein TMS-Derivat des Antibioticum s erhalten werden, das ein Massen­spektrum (Abb. 7) mit einem Molekülpeak bei m/e 463 ergab.

Der Zerfall des Antibioticums in Carbodiimid und <5-Hydroxy-Norvalin ist im M assenspektrum eben­falls erkennbar. Analog wie beim TM S-Derivat des Arginins und des (5-iV-Hydroxy-Arginins führt hier die A bspaltung von TM S-N =C =N -T M S zur Bil­dung des Ions bei m/e 277. Die für die Guanidin- Gruppe typischen Ionen bei m/e 187 und m/e 171 tre ten hier ebenfalls auf. Durch Abspaltung der silylierten Carboxylgruppe (m/e 463 -> m/e 346) und des ic-ständigen Isoharnstoffs erhält m an das in ten ­sive Fragm ent-Ion bei m/e 142 (CH 2 = C H —CH2—

C H = N H —TMS). Das A uftreten der Ionen bei m/e 349 und m/e 334 kann au f eine Verunreinigung durch (3-Hydroxy-Norvalin zurückgeführt werden (M t und M -C H 3), das durch Abspaltung von Car­bodiimid aus dem Antibioticum entsteht.

All diese Befunde lassen den Schluß zu, daß es sich bei der S truk tu r des Arginin-Antagonisten um ein Isoharnstoff-D erivat des <5-Hydroxy-Norvalins

Abb. 5. Massenspektrum des TMS-Derivates eines Spaltprodukts des Anti­bioticums aus Tü 222. LKB 9000, 70 eV, GC-MS.

W. A. KÖNIG • STR U KTURAUFKLÄRUNG N EU ER AR GININ-ANTAGONISTEN 819

H N-C-NH 2 2

0

CH„

H N-C-O-CH -CH -CH -CH-COOH 2 NH 2 2 2 kH

2

HO-CH^-CH-CH-CH-COOH ♦ HN=C=NH 2 2 2 i

NH

-H20 X H2°♦HCl

CH, f H 2

. CH-NH„

CH,-CH, Cl-CH-CH-CH-CH-COOHI 2 I 2 2 2 2 ,CH, CH-COOH N H 2

\ 2 / *NH

Abb. 6. Identifizierte Spalt- und Reaktionsprodukte aus dem Antibioticum aus Tü 222.

m/eAbb. 7. Massenspektrum des TMS-Derivates des Anti- bioticums aus Tü 222. LKB 9000, 70 eV, Direkt-Einlaß.

handelt (S truktur 6 ). Von Isoharnstoff-Derivaten ist bekannt, daß sie sehr labil sind und leicht in die entsprechende Hydroxy-Verbindung und H arn ­stoff übergehen15. Das A uftreten von Prolin und des Lactons läß t sich durch Ringbildung aus d-Hy- droxy-Norvalin erklären.

H 2N—C— 0 —CH 2—CH 2—CH 2— CH—C 0 0 H li I

N H 6 N H 2

Experimenteller TeilDie Isolierung und die biologischen Eigenschaften der neuen Antibiotica sind an anderer Stelle 7, 13 beschrieben.

HydrolysenE tw a 100 ng Substanz wurden entweder in 0,5 ml6 n HCl, 20 Stdn. bei 1 0 0 °C oder in 100 /d 1 -proz. K OH 10 min bei 100 °C hydrolysiert.

Herstellung der TM S-D erivateE tw a 100 //g Substanz wurden entweder in 100 /d

Bis-trim ethylsilyl-trifluoracetam id (Fa. Regis)

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I Stde. bei 100 °C erhitzt oder in 100 /d iV-Methyl-iV- trim ethylsilyl-trifluoracetam id (Fa. Macherey und Nagel) 2 Std. bei R aum tem peratur stehen gelassen. Als Reaktionsgefäße dienten Schraubdeckelgläs­chen (Volumen 1,5 ml) m it Tefloneinlage im Deckel.

Die Herstellung der Trifluoracetyl-Derivate ist in1 . c . 8 beschrieben.

M assenspektr enDie Aufnahme der M assenspektren erfolgte an

einem LKB 9000 durch ein D irekt-Einlaß-System oder durch kombinierte Gas-Chromatographie-Mas- senspektrometrie. Die gaschromatographische Tren­nung wurde an 1,5 m Glassäulen, gefüllt m it 3-proz. OV17 auf Chromosorb WAW oder 10-proz. Dexsil 300 auf Supelcoport, durchgeführt. Die Massen­spektren wurden m it 70 eV, 3,5 KV Beschleuni­gungsspannung bei 250 °C Ionenquellentem peratur aufgenommen.

Die Untersuchungen wurden durch M ittel der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG-SFB 76) unterstü tzt. Mein D ank gilt auch den H erren Dr. H. K n e i f e l und Dr. G. M ü l l e r (U niversität Tübingen) für wertvolle Anregungen, sowie H errn J . W ö l l für die Auswertung der M assenspektren.

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