Schultek, Tode und Wood: Caeruloplasmin in der Diagnostik gynäkologischer Tumoren 179

J. Clin. Chem. Clin. Biochem.Vol. 24, 1986, pp. 179-184© 1986 by Walter de Gruyter & Co.

Berlin · New York

Caeruloplasmin in der Diagnostik gynäkologischer Tumoren

Von Th. Schultek, B. Tode und W. G. Wood

Klinik für Innere Medizin (Direktor: Prof. Dr. P. C. Scriba) Medizinische Universität zu Lübeck

(Eingegangen am 30. Juli/27. November 1985)

Zusammenfassung: Es wurde die Caeruloplasmin-Konzentration im Serum von Patientinnen mit Ovarial-,Collum- und Corpuskarzinomen untersucht. Die Konzentration im Serum wurde aufgrund seiner enzyma-tischen Aktivität und mittels der chemiluminometrischen Verfahren ILMA (immunoluminometrischer Assay)und SPALT (solid phase antigen luminescence technique) bestimmt. Der Mediän der mit dem SPALT-Assaygemessenen Caeruloplasmin-Konzentration der Tumor-Patientinnen (Mediän: 0,78 g/l) war signifikant höherals der nach den beiden anderen Verfahren bestimmte (enzymatische Meßmethode: Mediän 0,26 g/l, ILMA-Assay: Mediän 0,44 g/l). Im Vergleich mit dem Referenzkollektiv (Mediän 0,29 g/l) zeigte sich eine deutlicherhöhte mittlere Konzentration bei Tumorpatientinnen, deren Caeruloplasmin-Gehalt mit dem SPALT-Assaygemessen wurde. Die nach den beiden anderen Methoden gemessenen Konzentrationen unterschieden sichnicht vom gesunden Referenzkollektiv. Mit dem SPALT-Assay werden im Gegensatz zu den beiden anderenVerfahren möglicherweise paraneoplastische Substanzen mit Caeruloplasmin-ähnlicher Immunreaktivitäterfaßt.Die Medianwerte der tissue polypeptide antigen (TPA)-Konzentration der Tumorpatientinnen waren gegen-über dem gesunden Vergleichskollektiv signifikant erhöht, der Mediän der Konzentration von carcinoembryo-nalem Antigen (CEA) entsprach dem Referenzkollektiv.

The use of Caeruloplasmin in the diagnosis of gynaecological tumours

Summary: Serum Caeruloplasmin levels were measured in women with ovarian, collum and corpus carcinomatausing three different assay methods. The enzyme assay gave a median value of 0.26 g/l, the SPALT (solidphase antigen luminescence technique) a median value of 0.78 g/l and the ILMA (immunoluminometricassay) a median of 0.44 g/l. A group of blood doiiors, taken äs the reference group, had a median value of0.29 g/l in the SPALT assay, which was significantly lower than in the tumour group measured by thismethod. The ILMA and enzymatic assay values were not significantly different from those measured in thereference group.The differences in the SPALT method can be ascribed to the possibility that this assay measures not only"intact" Caeruloplasmin but also paraheoplastic substances with "caeruloplasmin-like immunoactivity".

The median of the concentration of tissue polypeptide antigen (TPA) was significantly different from thosemeasured in the reference group. The concentrations of carcinoembryonic antigen (CEA) were not differentfrom the reference group.

Einführung -Kette (N-terminal: Valin) beträgt 16 000, das der ß-Caeruloplasmin ist ein Protein der a2-Glpbulinfrak- Kette 59000 (N-terminal: Lysin) (7). Die Eigenschafttion des Serums, bestehend aus zwei leichten und des Caeruloplasmins als kupferbindendes Proteinzwei schweren Polypeptidfcetten. Das Molgewicht der wurde schon vor längerer Zeit beschrieben. Andere

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in vivo-Funktionen dieser Substanz sind, außer einerOxidase-Aktivität, noch nicht bekannt. Von besonde-rem klinischen Interesse ist, daß die Konzentrationvon Caeruloplasmin im Serum bei Patienten mit Wil-son'scher Erkrankung signifikant erniedrigt ist. BeiTumorerkrankungen kommt es dagegen oft, parallelzu einem Anstieg des Kupfers im Serum, zu einerErhöhung der Caeruloplasmin-Konzentration.

In dieser Studie untersuchten wir die Caeruloplasmin-Konzentrationen im Serum von Patientinnen mit gy-näkologischen Tumoren. Die Bestimmung erfolgteunter Anwendung dreier unterschiedlicher Untersu-chungsmethoden: enzymatisch und immunologischmittels zweier von uns entwickelter luminometrischerAssays. Die Ergebnisse der nach den verschiedenenMethoden erhaltenen Konzentrationen werden unter-einander und mit den konventionellen Tumormarkerncarinoembryonales Antigen (CEA)'und tissue poly-peptide antigene (TPA) verglichen.

Material und MethodenProbandenUntersucht wurden die Seren von n = 64 Patientinnen mitOvarial-, Collum- und Corpuskarzinomen der TumorstadienIII und IV nach FIGO1), 2). Die Seren waren bis zur Untersu-chung bei — 20 °C tiefgefroren, allerdings nie länger als 14Tage. Als Vergleichskollektiv dienten 74 gesunde Blutspenderunterschiedlichen Geschlechts mit normalen Aminotransfera-sen, -Glutamyltransferasen und einer Blutsenkungsgeschwin-digkeit unter 30 mm nach Westergren. Ausgeschlossen wurdenRaucher. Sämtliche Referenzwerte lagen innerhalb der 2,5 und97,5 Percentile (Tab. 1).

*) Wir danken der Klinik für Gynäkologie und Geburtshilfeder Medizinischen Hochschule Lübeck (Direktor: Prof. Dr.F. Oberheuser) für die Überlassung des Untersuchungsmate-rials.

2) FIGO: Federation international de gynaecologie et d'obste-trie.

CaeruloplasminDie Bestimmung der Caeruloplasmin-Konzentration im Serumwurde nach folgenden Verfahren durchgeführt:

Methode AMessung der enzymatischen Oxidation von p-Phenylendiamindurch Caeruloplasmin unter Verwendung äer 2rPünkt-Methode(3). Bei der Berechnung der Konzentrationen verwendeten wirnicht den bekannten Umrechnungsfaktor von Enzymaktivitätzu Konzentration, sondern erstellten eine Standardkurve.

Methode BImmunoluminometrische Bestimmung nach der Festphasenan-tigen-Lumineszenztechnik (SPALT) (11). Hierzu wurden 100einer l : 50 verdünnten Seruniprobe (entsprechend verdünnteStandards von 2,5 bis 0,08 g/l; Caeruloplasmin, Sigma Nr. C-4770) mit 100 l : 1000 verdünntem Sheepranti-human Caeru-loplasmin-Antikörper (Seward Laboratories, London) 10 Mi-nuten inkubiert. Anschließend erfolgte eine Inkubation miteiner Antigen-beschichteten Polystyrolkugel für 55 Minuten beiRaumtemperatur. Nach Waschen mit 4L-PBS-Tween (Tab. 2)55 Minuten Inkubation mit einem Antikörper gegen Schaf-IgG(DAKOPATTS, Hamburg), markiert mit N<6-(4-aminobutyl-Isf-ethyljisolumino^hemisuccinamid (ABEI-H). Die himinome-trische Messung erfolgte in einem vollautomatischen Lumino-meter der Fa. Bertold, Wildbad, (LB-950 T) in einem 1-Dispen-serbetrieb (12). Jeder Küvette wurden 300 eines NaCi/Mikro-peroxidase-Gemisches als Startreagenz im Volumenverhältnis2: l vorgegeben.

Methode CImmunoluminometrische Analyse mit Antihuman-Caeruloplas^min-Antikörpern beschichteten Polystyrolkugeln (ILMA) (11).Anti-human-Caeruloplasmin-beschichtete Kugeln (Sheep-anti-human-Caeruloplasmin-Antikörper, gereinigte IgG-Fraktion,Seward Laboratories, London) wurden mit 20 Serum bzw.Standard (jeweils l : 1000 vorverdünnt) in 2000 4L-PBS-Tween eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schütteln inku-biert. Nach zweimaligem Waschen eine Stunde Inkubation mitAnti-human-Caeruloplasmin t (Rabbit-a-h-Caeruloplasmin,mittels· Adsorption und AffinitätscÜfomatographie gereinigteIgG-Fraktion, JDAKOPATTS, Hamburg) (l : 1000 verdünnt),markiert mit 7-N-(4-aminobutyl)-N-ethyl) naphthalin-l,2-di-carbonsäurehydrazid (ABEN-H)3). Anschließend lumraometri-sche Messung wie oben beschrieben.

3) Die Substanz wurde uns freundlicherweise von Dr. H.Schroeder (Miles Laboratories, Elkhart, Indiana, USA) über-lassen.

Tab. 1. Caeruloplasmin-CEA-TPAReferenzwerte eines gesunden Kollektivs (Blutspenderbeiderlei Geschlechts).

Tab. 2. „4 L-PBS-Tween" Pufferlösung.

Caeruloplasmin TPA CEASPALT ILMA

AnzahlMittelwertPercentile

2,51650 (Mediän)8497,5

Mittelwert/Mediän

(g/l)

740,34

0,060,180,290,500,701,17

(g/D

500,30

0,100,180,270,430,591,13

(U/l)

10836,7

17273648581,02

^g/D

1081,32

0,250,661,331,852,290,99

4 L-Stammlösung121,14 g Tris-Puffer

+ 800 ml H20 (mit 250 g/kg HC1 auf pH 7,4 einstellen)+ 14,9 g KC1+ 20 g Rinder-Serum-Albumin

PBS-Tween-Stammlösung1000 ml 0,5 mol/1 Phosphatpuffer pH 7,5

-l· 90 g NaCl+ 5mlTween

4 L-PBS-Tween Gebrauchslösung450 2

+ 25 ml 4 L-Stammlösung+ 25 ml PBS-Tween-Stammlösung

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Zur Erstellung der Standardkurven verwandten wir eine Lösungvon 50 g/l Caeruloplasmin (Sigma, München, D., No. c-4770),die mit Assaypuffer verdünnt wurde (Spannbreite 0—5 g/l).Eine Verdünnung eines kommerziellen humanen Referenzse-rums (Protein-Standard-Plasma, Behring-Institut) ergab einenparallelen Verlauf der identischen Konzentration.Die CEA-Bestimmung der Patientenseren wurde mit dem CEA-Enzym-Immunoassay von Abbott (Wiesbaden) und die TPA-Messung mit dem Prolifigen-TPA-RIA-Kit von Sangtec(Bromma, S) durchgeführt. Die ermittelten Konzentrationenwurden mit entsprechenden gesunder Blutspender verglichen.Die Referenzbereiche sind in Tabelle l aufgeführt.Mit 2 ml Serum einer Patientin mit Corpuskarzinom StadiumIII wurde eine Gelfiltrations-Chromatographie (Säule = 2 cm

20 cm, Säulenmaterial: Ultrogel AG (LKB, Bromma S),Elutionsmittel: Phosphatpuffer 0,05 mol/1, pH = 7,6) durchge-führt. In den einzelnen Fraktionen wurde Caeruloplasmin im-munoluminometrisch parallel mit dem ILMA und dem SPALTbestimmt. Den SPALT führten wir bei diesem Versuch mit zweiunterschiedlichen Antikörpern durch:SPALT l mit Rabbit-a-h-Caeruloplamin (DAKOPATTS, Ham-burg undSPALT 2 mit Sheep-a-h-Caeruloplasmin (Seward Laboratories,London).

Ergebnisse

Für die enzymatisch bestimmten Caeruloplasmin-Konzentrationen wurde eine mittlere Konzentrationeines erwachsenen Referenzkollektivs von 0,44 ±0,14 g/l (3) zugrunde gelegt. Die immunbiochemischnach dem ILMA- und SPALT-Verfahren bestimmtenCaeruloplasmin-Kpnzentrationen des gesunden Refe-renzkollektivs sind in Tabelle l aufgeführt.

Bei den Patientinnen mit Tumor bestimmten wir enzy-matisch einen Medianwert von 0,27 g/l. Die immuno-luminometrisch gemessene Caeruloplasmin-Konzen-tration der Tumorpatientinnen beträgt 0,35 g/l (Me-diän). Mit der Festphäsenantigen-Lumineszenztech-nik (SPALT) wurde in den gleichen Serumproben ein

Mediän von 0,78 g/l mit einer Spannbreite der Wertevon 0,12 bis 1,3 bestimmt. Die statistischen Datensowie die Verteilung der Einzelwerte und die Zuord-nung dieser zu Konzentrationsklassen sind in Tabelle3 und den Abbildungen l und 2 dargestellt.

Ein Vergleich der nach den drei Methoden gemesse-nen Caeruloplasmin-Konzentrationen zeigt, daß ins-besondere im SPALT-Assay der Mediän der Konzen-tration im Serum deutlich über dem entsprechendennaph der enzymatischen und der ILMA-Methode ge-messenen liegt. Im Vergleich mit dem Referenzkollek-tiv zeigt sich, wie auch aus Abbildung l ersichtlich,eine deutlich erhöhte mittlere Konzentration bei denTumorpatientinnen, deren Werte nach dem SPALT-Assay gemessen wurden. Die Caeruloplasmin-Kon-zentrationen im Serum von 48 Patientinnen (entspre-chend 75%) liegen oberhalb der 97,5 Percentile dergesunden Blutspender. Der Unterschied der Konzen-trationen ist nach dem Mann-Whilney-U-Test fürnichtparametrische Stichproben signifikant (Z =7,1).Bei den enzymatisch bestimmten Caeruloplasmin-Konzentrationen fanden sich keine pathologisch er-höhten Konzentrationen. Bei den mittels der ILMA-Technik bestimmten Konzentrationen sind, vergli-chen mit den Referenzwerten für diese Methode, nurwenige pathologisch erhöht.

Zwischen der enzymatisch gemessenen und mittelsSPALT-Technik bestimmten Caeruloplasmin-Kon-zentration besteht keine signifikante lineare Korrela-tion (r = -0,25; Ayx = 0,88, Byx = -0,3, Axy = 0,6,Bxy = —0,21). Ebensowenig besteht eine Korrelationzwischen der enzymatisch und der immunoluminome-trischen nach dem ILMA-Prinzip gemessenen Kon-zentration (r = 0,28; Ayx = 0,23, B^ = 0,08, Axy =0,18, Bxy = 0,99).

Tab. 3. Caeruloplasmin—ClEA—TPA.Konzentrationen im Serum von Patientinnen mit Ovarial-, Colhim- und Corpuskarzinom. Bestimmung des Caeruloplas-mins nach drei unterschiedlichen Verfahren.

-AnzahlMittelwertPercentile

2,51650 (Mediän)8497,5

Mittelwert/MediänSpannbreite

Enzym *

640,27

0,0010,210,270,330,370,980-0,41

Caeruloplasmin(g/l)

SPALT

640,74

0,120,370,781,061,200;950,12-1,3

ILMA

640,44

0,120,230,350,611,201,260,12-1,47

TPA(U/l)

64204

125599

1841596

2,0612-3000

CEAÖig/1)

649,2

111,8

16,2605,0

1-65

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U

1.3

1.2

1.1

- 1,0

c*g 0.8t 0.7

u 0,50,4

0.3

0,2

0.1Q

-

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SPALT ILMA

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Enzym-bestimmung

Abb. 1. Caeruloplasmin-Konzentration im Serum von Patien-tinnen mit Ovarial-, Collum- und Corpuskarzinom.Darstellung der nach unterschiedlichen Meßmethodenermittelten Einzelwerte.( = Mediän).

Der Mediän der gemessenen TPA-Konzentration be-trägt 99 U/l, der Mediän der CEA-Konzentration 1,8

g/l (Tab. 2). Die entsprechenden Konzentrationenvon 108 Blutspendern als Referenzwerte sind in Ta-belle l aufgeführt.

Ein Vergleich der TPA-Konzentrationen der Karzi-nompatientinnen mit dein Referenzkollektiv zeigteinen erhöhten Medianwert. Dieser Unterschied istim Mann- Whiiney-U-Test für nichtparametrische Ver-teilung signifikant (Z = 3,65, p < 0,01). Von den 64Probandinnen hatten 51 TPA-Werte oberhalb desoberen Grenzwertes von 60 U/l. Die mittlere CEA-Konzentration unterscheidet sich nicht vom Ver-gleichskollektiv. Von 64 Patientinnen hatten lediglich14 CEA-Werte oberhalb der 97,5 Percentile des ge-sunden Referenzkollektivs.

Vergleicht man die CEA- und TPA-Konzentrationenmit den entsprechenden nach verschiedenen Metho-den gemessenen Caeruloplasmin-Konzentrationen,findet sich keine signifikante Korrelation.

70

60

1,50

i40

303

~20

10

0

SPALT ILMA Enzym-bestimmung

D> cn

S — l I S S

Caeruloplasmin, Konzentrationsbereiche [g/l]

Abb. 2. Histogramme der Caeruloplasmin-Konzentrationen(siehe Abb. 1).

In Abbildung 5 ist das Elutionsprofil der Gelfiltra-tions-Chromatographie dargestellt. Es zeigt sich, daßmit den SPALT-Assays (SPALT l und 2) Hoch einehohe Caeruloplasmin-Konzentration in Fraktionennachgewiesen wird, in denen die nach dem ILMAgemessene an der unteren Nachweisgrenze oder un-terhalb dieser liegt.

Diskussion

Als auffälligster Befund fand sich ein signifikanterUnterschied der Konzentration von Caeruloplasmir^bestimmt nach der SPALT-Methode im Gegensatzzum ILMA-Assay und zur enzymatischen Meßme-thode. Es muß angenommen werden, daß mit demSPALT auch paraneoplstisch gebildetes, Caeruloplas-min-ähnliches Protein erfaßt .wird, möglicherweiseauch isolierte Proteinketten oder metabplische Ab-bauprodukte. Beim SPALT (Abb. 3) ist nur eine Anti-gen-Determinante zur Bestimmung und somit für denAblauf des Assays notwendig, beim ILMA (Abb. 4)dagegen mindestens -zwei. Somit ist die Wahrschein-lichkeit, paraneoplastisch gebildetes Eiweiß mit einerdem Caeruloplasmin identischen immunreaktiven Se-quenz (z. B. isolierte Ketten) zu erfassen, größer alsbeim ILMA, bei dem zwei aktive unterschiedlicheZentren zur quantitativen Erfassung notwendig sind.Dies wird in den Abbildungen 3 und 4 verdeutlicht.

Das Konzentrationsprofil der Gelfiltrations-Chroma-tographie (Abb. 5) bestätigt, daß der SPALT einehöhere Konzentration Caeruloplasmin-identischerAktivität erfaßt als der ILMA.

Im enzymatischen Test wird das physiologische, enzy-matisch aktive Caeruloplasmin mittels Oxidase-Akti-vität bestimmt. Das im SPALT bestimmte Protein miteiner odem Caeruloplasmin entsprechenden aktivenTeilsequenz zeigt in unserem Falle keine meßbar er-höhte enzymatische Aktivität. * »

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_^1. ̂— <— <

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4. Ό*

Abb. 3.

Α „Α. — *

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Ι — «Ι

> * ζ^ * < * φ Α ·ς>*- * zj * «> — «>/-^ .Χ Ι-**^ = ο->-*· ^*> — > jfc— · — -» h · ν

Darstellung des SPALT f r Caeruloplasmin (O) mitvermuteter Erfassung paraneoplastisch gebildeten Pro-teins mit Caeruloplasminantigeneigenschaft (<)

γ 2 t

i15

U

13

12

Ξ Νϊκ>l—i

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2

1

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I··Γ:

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>0 30 40 50 60 70 80Fraktion

2.

λ

>-*

>—*

Abb. 5. Elutionsprofil einer Gelfiltrations-Chromatographie:Bestimmungen der Caeruloplasmin-Konzentrationnach drei unterschiedlichen Methoden (s. Text).

ILMA. . . . SPALT l

SPALT 2

3. —· — -* h - v

Abb. 4. Darstellung der ILMA-Me methode f r Caeruloplas-min (φ) mit vermuteter Erfassung paraneoplastischgebildeten Proteins mit Caeruloplasminantigeneigen-schaft (<).

F r das Ovarial- und Collum- bzw. Corpuskarzinomhat somit das im SPALT-Assay bestimmte Caerulo-plasmin (bzw. das paraneoplastische Protein mit Cae-ruloplasmin identischer, immunologisch erfa barerTeilsequenz) Eigenschaften eines Tumbrmarkers.

Linder et al. (5) fanden bei Lungenttimoren eine signi-fikante Erh hung sowohl des enzymatisch als auchdes als Antigen (Radio^Immuno-Diffusion-Methpde)bestimmten Caeruloplasmins in Abh ngigkeit vomTumorausbreitungsgrad. Auch das Kupfer im Serumwar deutlich erh ht. Bei der Untersuchung von Pa-tienten mit Brustkrebs fanden sich normale Antigen-konzentrationen, dagegen ein im Mittel erh hterKupfergehalt.

ber hnliche Ergebnisse berichteten auch andereAutoren (l, 6). Auch bei Patienten mit chronischobstruktiver Lungenerkrankung k nnen erh hteCaeruloplasmin-Konzentrationen sowohl im immu-nologischen als auch im enzymatischen Assay nachge-wiesen werden (5). Beim Caeruloplasmin handelt essich somit nicht um einen tumorspezifischen Marker,bei einer Reihe anderer Erkrankungen (13) fand manparallel zur Kupferkonzentration erh hte Konzentra-tionen im Serum. Am h ufigsten sind Caeruloplas-min- nderungen bei iVilson'scher Erkrankung, Nie-reninsuffizienz (9), verschiedenen Lebererkrankungen(8) sowie nach Einnahme von Ovulationshemmern(2) nachzuweisen. Gray & Walker (4) fanden einenAnstieg des Caeruloplasmins beim Rezidiv eines Co-lon- und Sigma-Karzinorns in guter Korrelation zumCEA.Die in unseren Studien bestimmten, im Vergleich zumNormalkollektiv erh hten CEA- und TPA-Konzen-trationen sind in bereinstimmung mit fr heren Er-gebnissen (10).

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Dr. med. Dipl.-Cheni. Thomas SchultekKlinik für Innere MedizinMedizinische Universität zu LübeckRatzeburger Allee 160D-2400 Lübeck l

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