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Ad Zellkulturen zur Biomaterialuntersuchung:••Uberwachung mit DNA-FingerabdriickenErwin Falkner, Wolfgang Frick, Barbara Kapeller, Heidrun Eberl, Karin Macfelda und Udo M. LosertInstitut fur Biomedizinische Forschung, Universitat A-Wien

ZusammenfassungZur Erfassung des Einflusses von Biomaterialien auf zellularerEbene werden vermehrt aus Primdrkultur stammende Zellenunterschiedlicher Gewebespezifitdt eingesetzt. Diese Entwick-lung ist prinzipiell positiv im Sinne der 3R zu sehen, daRefinement durch Vorschalten von derartigen in vitro Ansatzenvor den Gang in vivo bzw. Reduction/Replacement durch dasEinschriinken (Prescreening) der potentiell in Frage kommen-den Materialien moglicli wird. Die in vitro ermittelten Datenwerden aber nur bei befriedigender Qualittit und Nachvoll-ziehbarkeit akzeptiert werden: Probleme ergeben sich beziig-lich des Nachweises der Identitiit des eingesetzten Zellmateri-als, der moglichen Kontamination mit unerwiinschten Zellar-ten, sowie eventueller kultivierungs- oder biomaterialbedingterMutationen, die durch die Kultivierungsparameter oderEinfliisse des Biomaterials hervorgerufen werden konnen. AlsMethode der Wahl untersuchten wir das Multilocus-DNA-Fingerprinting an Hand von Fibroblasten, Endothelzellen undChondrozyten, die von Primarkulturen von Rind, Schaf,Schwein, Kaninchen und Ratte stammten. In der biomedizini-schen Forschung werden diese Spezies am hiiufigsten zurTestung von Biomaterialien und Implantaten eingesetzt. 1mweiteren wurde Material humanen Ursprungs, zwecks Unter-sue hung der Korrelation der tierspezifischen mit den empfiin-gerspezifischen Daten verwendet. Die genetischen Fingerab-driicke des u.a. for Austestungen bestimmten Zellmaterialsunterschiedlicher Passage wurden zwecks Uberwachung desKultivierungsverlaufes verglichen. Zudem wurden Printsderart verifizierter und iiberwachter Kulturen mit solchen vonZellen, die fiir in vitro Untersuchungen verwendet wurden,analysiert:

Summary: Concerning cell cultures for biocompatibility-testing: Monitoring by DNA-fingerprintingCell cultures are innovative tools for e.g. biocompatibilitytesting of biomaterials in vitro. In our studies we usedfibroblast, endothelial cell and chondrocyte cultures of humanorigin and of the test animal species most common for thispurpose in vivo. Verification of the identity of these cells isobligatory for reproducibility of the tests and validinterpretation of the results. Cultured cells have to be checkedfor identity, contaminations of various origins and also forgenomic mutations occuring during prolonged cultivation invitro or due to exposition to biomaterials. Furthermore, therisk of genetic cross-contamination with other cells increaseswith the number of cell cultures passaged parallel in the samelaboratory. Therefore, we generated reference fingerprints ofthe cultures in varying passages for comparative monitoring ofcells purposed for in vitro tests.Minisatelite DNA polymorhism resulting in reproducibleindividual DNA fingerprints is very discriminatory and can beused for cell culture monitoring. The patterns are stable overseveral passages, although sudden changes did happen in twocases, i.e. loss/gain of bands or changes in band-intensity,indicating massive genomic mutations of the cultures in vitro.Influences of biomaterials on the prints could not be detected.Several tasks can be followed at the same time: detection ofcontaminant cel/s, identification of these cells of primaryculture origin used for in vitro testing and finally, monitoringfor eventual genomic mutations due to prolonged cultivation orcontact to biomaterials. Inconclusive results in just one ofthese aspects should lead to the disqualification of themonitored cultures from usage in vitro.

Keywords: 3R, cell culture, animal cells, DNA-Fingerprinting,biocompatibility

2 Material und Methoden

In Sauger-Genomen gibt es viele hoch-polymorphe Minisatelliten-DNA-Regio-nen, die aus unterschiedlich vielen Tan-dem-repetitiven Einheiten zusammenge-setzt sind. Die im Rahmen des Finger-printings verwendeten Jeffreys-DNA-Sonden (NICPM) bestehen aus Tandem-Wiederholungen, die eine Minisatelliten-Konsensus-Sequenz beinhalten, die

gleichzeitig eine ganze Reihe hochpoly-morpher Regionen im humanen Genomdetektieren konnen und so einen indivi-duellen genetischen Fingerabdruck gene-rieren. NICpM-Sonden sind synthetisier-te Oligonukleotide komplementar zu derhumanen 33.15 bzw. 33.6-Sequenz, fin-den z.B. in der Gerichtsmedizin Verwen-dung und sind fur die Analyse eukaryon-tischer Genome einsetzbar (Jeffreys et al.,1986).

2.1 Zellmaterial~ Endothelzellen: Isolierung aus A. ca-rotis, Aorta bzw. V cava sowie V Jugu-laris tierischen bzw. V umbilicalis huma-nen Ursprungs mit vorgewarmter (3rC)Collagenase Typ II (lOOU/ml) oder Dis-pase (0,8 U/ml) (GibcoLifeTechnologies,UK), Inkubation fur 10-30 min (je nachSpezies) bei 37°C: Mensch (20min), Rind

1 Einleitung

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F_A_L_KN_E_R_E_T_A_L_. ~----

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(30 min), Schaf (10-15 min), Schwein(20-30 min), Kaninchen(15-20 min), Rat-te (5-10 min).~ Fibroblasten: Isolierung aus gesiebtem(40flm) Homogenisat von kleinen Blut-gefaBwand-Biopsien bzw. Bindegewebe.~ Chondrozyten: Inkubation von CaputJemurbzw. Sternum-Knorpelschnitten invorgewarmter (37°C) Collagenase Typ II(s.o.) fur 24-36 Std.

2.2 ZellkuItivierung~ Endothelzellen: ECGM + 2 ml ECGS/Heparin (Wachstumsfaktor) (Prornocell,BRD)~ Fibroblasten: RPMI 1640 (GibcoLi-fe'Iechnologies, UK) + 10& FCS (PAA,AUT)~ Chondrozyten: DMEM + 20% FCS(PAA, AUT) + 5ml Ascorbinaure (lg/200ml) (Sigma, USA) + 4ml Fungizone/Amphoterizin B (250 UGfml) (GibcoLi-feTechnologies, UK).

Allen Medien wurden 5ml PenicilinfStreptomycin (10000 IV resp. UG/ml)(GibcoLifeTechnologies, UK) zugesetzt.Inkubation der Kulturen bei 37°C, 95%Luftfeuchtigkeit und 5% CO2 (Chondro-zyten: 8,5%); Medienwechsel aile 72Stunden; enzymatische Zellernte mit37°C TrypsinfEDTA (0,5g [1 :250] +0,2gfJ mod. Puck's Salzlosung A) (Gib-coLifeTechnologies, UK); Zellsplitting1:4 in groliere Kulturgefafse.

2.3 ZelltypcharakterisierungImmunhistochemisch mittelsAntikorpern~ Endothelzellen: von Willebrand Fak-torfCD31fCD62 (alle Dako, DK)~ Fibroblasten: Collagen Typ I (Chemi-con, USA)~ Chondrocyten: Collagen Typ II (Che-micon, USA).

2.4 DNA IsolierungPro Ansatz (0,5x106 Zellen) 5 ug geno-mische DNA, Genomicf'rep'?" IsolationKit (Pharrnacia, USA).

2.5 ElektrophoresefSouthern Blot~ Restriktionsverdau: 5 ug DNA/An-satz, Verdau 3 Std. bei 30°C mit 4 ul a10 U Hinf I (Appligene-Epignost,AUT)~ Elektrophorese: in 0,8 % Agarosegel20 Std. bei 3 V fcm

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~ Marker: Lambda/Hind III (Gibeo,UK); NICpM DNA Analysis Ladder(Cellmark Diagnostics, UK)~ Southern Blot: Spiilung des Gels sauer(0,1 M HCI, 15 min), alkalisch (0,2 MNaOH; 0,6 M NaCI, 30 min), neutralisie-rend (0,5 M Tris pH 7,6; 1,5 M NaC!, 30min)

Transfer der separierten DNA aus Gelauf neutrale Membran (Nytran, Schleicher& Schuell, BRD) mit 2x SSC; DNA-Fi-xierung durch 5 min UV-Exposition (302nm).

2.6 SondenhybridisierungAlkalische Phosphatase-markierte Multi-locus DNA-Sonden 33.15 bzw. 33.6 so-wie NICpM MW 100 Marker-Sonde (alleCellmark Diagnostics, UK); Hybridisie-rung nach Firmenprotokoll; Chemolumi-neszenz-Detektion dureh Inkubation mtCDP Star™ - Substrat und Rontgenfilm-Exposition 30 bis 120 min.

2.7 Computerunterstiitzte AuswertungZusatzlich zur herkornmlichen Visualisie-rung mittels Leuchtbox wurden die Fil-me gescant und mit Imagemaster IDTM -Software (Pharmacia, USA) analysiert,fallweise wurden mit Corel Photopaint7™ nach variierenden Expositionszeiten

eindeutig erkennbare Banden zu einemzusammengestzten Muster vereint.

2.8 BiomaterialBei Abbildung 1 handelt es sich um einenPolytetrafluorethylen (PTFE) -Patch (Va-scoprot, USA).

3 Ergebnisse und Diskussion

Aus Primarkultur stammende Zellen wer-den neben etablierten Linien vermehrt furBiokompatibilitats-Untersuchungen in vi-tro eingesetzt (Lewandowska-Szumiel etal., 1999). Zellulare Kreuzkontaminatio-nen sind ein allgemeines Problem vonZellkultur-Systemen: Berichte sprechenvon 17-36 % fehlerhaften Zuordnungenvon Kulturen sowie 11-25 % intraiinter-speziesspezifischen Kontaminationen(Hukku et aI., 1984). Gerade beim Ein-satz von Zellkulturen fill" in vitro Testsy-sterne sollte die Uberwachung des Zell-materials beziiglich Kontaminationen undgenetische Stabilitat luckenlos dokumen-tiert sein, urn Aussagekraft und Reprodu-zierbarkeit der Testergebnisse zu gewahr-leisten.

Un sere Gruppe verwendete 33.15 bzw.33.6-Sonden nicht nur zwecks Identifizie-rung, d.h. Zuordnung zu dokumentierten

Abbildung 1: Zellen der Isolierung FibScha 1 in Passage 43 auf PTFE-Patch, REM-Auf-nahme, Vergr. 750x

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Isolierungen und zur Vermeidung vonKontaminationen, wie es die AmericanType Culture Collection bespricht (ATCC,1992), sondern auch zur Uberwachungdes Zellstatus auf genetischer Ebene. Sieschlagt vor, Kulturen mit detektiertenBandenvariationen von der Verwendungin in vitro Systemen auszuschlieBen. Diesentspricht auch der im Rahmen des 3.Weltkongresses fur Ersatz- und Ergan-zungsmethoden (Workshop 18) erhobe-nen Forderung nach GLP-analoger "GoodCell Culture Practice".Die Hybridisierungen mit beiden ein-

gesetzten Multilocus-Sonden liefertenfur Endothelzellen, Fibroblasten undChondrozyten humanen bzw. tierischenUrsprungs individuenspezifische geneti-sche Fingerabdrucke. Diese waren beiBeibehaltung der Versuchsprotokolle re-produzierbar. Ausnahmen waren auf un-terschiedliche Qualitat oder Quantitatdes Ausgangsmaterials bzw. auf massi-ve Veranderungen im Versuchsablauf,wie z.B. Parameter der elektrophoreti-

't I.•.'to.•. 1

't... '

2 3 5 6

Abbildung 2: Generierung eines kombi-nierten Fingerabdrucks mit Bildverarbei-tungs-Software; bei unterschiedlicher Ex-positionszeit eindeutige Banden (1 bis 3)ergeben nach Optimierung von z.B. Kon-trastlHelligkeit ein zusammengesetztesMuster (5), das in Relation zum GroBen-marker (6) die Identifizierung auch bei DNAungeniigender Oualltat ermoqllcht,

schen Auftrennung der Nukleinsauren,zuruckzuftihren. Die Sonden-spezifi-schen Hybridisierungsmuster erwiesensich bis auf unten dokumentierte Ausnah-men ilber bis zu 43 Passagierungen, d.h.langere Kultivierung inlvitro, hinweg als

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1 2 43

Abbildung 3: RFLP-Muster genomischerDNA (Sonde 33.15) von, aus Prlmarkultu-ren stammenden, Schaffibroblasten unter-schledllcner Passage nach Verdau mitHinfl. Lane 1, Fischa 19/Passage 4; Lane 2,Fibscha 19/Passage 7; Lane 3, Fibscha 19/Passage 13; Lane 4, Fibscha 19/Passage15; Lane 5, DNA Analysis Ladder/MarkerSond MW 100. Die Pfeile weisen auf neueBanden bei ca. 4,4 kb, sowie 1,5 kb (Kilo-basenpaare).

stabil bezuglich Anzahl und Intensitat derBanden, sowie deren Position beztiglichstandardisierter Marker. Probleme beider eindeutigen Bandendetektion, be-grtindet z.B. durch die DNA-Gewinnungbeeinflussende Biomaterial-Partikel oderallgemein variierende DNA-Qualitat!Quantitat, konnten durch Variation derRontgenfilm-Expositionszeiten sowieBearbeitung mit Bildverarbeitungs-Computerprogrammen zwecks Generie-rung von zusammengesetzten Fingerab-drucken gelost werden (Abb. 2).Bei zwei, uber 15 Passagen hinweg

kultivierten, makro/mikroskopisch un-auffalligen, Isolierungen wurden repro-duzierbare Veranderungen des Banden-musters der Hybridisierung, die auf gro-Bere Veranderungen im Genom schlie-Ben lassen, festgestellt (Abb. 3). Yon mitder hier besprochenen Methode nachge-

wiesenen Genom-Veranderungen wird inder Literatur berichtet: Unterschiede nor-males/malignes Brustgewebe (Sibberinget al., 1996); Veranderungen von etablier-ten Zellinien, die toxischen Agentien aus-gesetzt waren (Sawagutchi et at, 1996).Zellen, bei denen derartige massive Ge-nommutationen nachgewiesen wurden,kamen bei unseren in vitro Tests nicht zumEinsatz. Beispiele von Veranderungendieser Art bei auf Biomaterialien kulti-vierten Zellen (Abb. 1) konnten wir beiunseren Versuchen nicht beobachten. DieKontamination einer Charge von in flus-sigem N, gelagerten Kaninchen-Fibrobla-sten mit Zellen unbekannten Ursprungskonnte durch Vergleich des Fingerprintsmit dem einer Kontrollcharge gleichenUrsprungs eindeutig belegt werden. DieVerunreinigung der Kaninchenkultur warsowohl makroskopisch als auch mikro-skopisch wahrend der Zuchtung nicht auf-gefallen, was uns die Sinnhaftigkeit desdoch erheblichen experimentellen Auf-wandes fur das Fingerprinting zur Uber-wachung der Zellen bestatigte.51Literatur

Hukku, B., Halton, D. M., Mally, M., andPeterson, W.D. Jr. (1984). Cell characte-rization by use of multiple genetic mark-ers. Adv. Exp. Med. BioI. 172, 13-31.

Jeffreys, A l Wilson, V, and Thein, S. L(1985). Individual-specific "fingerprints"of human DNA Nature 316, 76-79.

Lewandowska-Szumiel, M. (1999). Alter-native methods for assessing biocompa-tibility and function of implant materi-als.ATIA 27, 271-281.

Sawagutchi, T, Wang-X, and Sawaguchi,A (1996). Changes in DNA induced bytoxic agents. Forensic Sci. Int. 78, 169-l78.

Sibbering, M., O'Rourke, S., Stanley, r,Gilmour, A, Reid, A, Parkin, D., Ellis,1., Elston, C, and Blarney, R. (1996).DNA fingerprinting of benign and ma-lign breast lesions. Eur: 1. Surg. Oneal.22,574-577.

Korrespondenzadresse

Erwin FalknerInstitut fur Biomedizinische ForschungAKH, Leitstelle lQWahringer Gtirtell8-20A-1090 Wien

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