Originalien und Ubersichtsarbeiten

ausgew~ihlter St~imme zeigt die starke Heterogenifiit der insbesondere in Rin- derhack vorkommenden VTEC auf. Verotoxinbildende E. coli-St~imme, die in Deutschland bereits mit EHEC-In - fektionen in Zusammenhang gebracht wurden, wie z.B. O157, 026, 022 und O111, wurden aus den Hackfleisch- und Weichk~iseproben nicht isoliert.

Das Auftreten VT-positiver Befunde war in Rinderhackfleisch mit hohen Gesamtkeimzahlen (> 107 KbE/g) und h6heren Enterobacteriaceae-Keimge- halten (> 105 KbE/g), in Rohmilchk~ise- proben mit hohen Coliformen-Keim- gehalten (> 105 KbE/g) assoziiert. Die Menge der nachweisbaren E. coli scheint hingegen kein geeigneter Indikator fiir das m6gliche Vorhandensein von VTEC in Hackfleisch und in Weichk~ise zu sein.

Danksagung: Wir danken Dr. Steinriick, Robert Koch-Institut, Berlin, ffir die Serotypisierung der VTEC-Isolate. Wit danken Frau Petra Vogt, Frau Monika Mfiller, Frau Christine Fester, Frau Petra Werner und Frau Ursula Maslanka fiir die technische Durchffihrung der Laborarbeiten.

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[7] Verordnung fiber Hygiene- und Qualit~.tsan- forderungen an Milch und Erzeugnisse auf Milchbasis (Milchverordnung) vom 24. April I995, Anlage 6.

Anschrift der Verfasser: Dr. P. Teufel, Dr. Edda Bartelt, Dr. Juliane Br~.u- nig, Dr. L. EUerbroek, A. Telo und Dr. Heidi Wichmann-Schauer, Bundesinstitut ffir gesund- heitlichen Verbraucherschutz und Veterin~irmedi- zin (BgVV), Bereich Marienfelde, Diedersdorfer Weg 1,12277 Berlin; Dr. P. Gallien, Dr.H. Richter, Dr. Helma Klie, Marita Timm und Dr. K.-W. Perl- berg, Bundesinstitut ffir gesundheitlichen Verbrau- cherschutz und Veterin~irmedizin (BgVV), Bereich Dessau, Jahnstrafle 8, 06846 Dessau

Charakterisierung chromogener N ihrmedien zum Nachweis yon E. coli O 157:H7/H- Von R. Reissbrodt, U. Sachse, H. Steinriick und H. TscMpe

Einfiihrung E. coli-Bakterien des Serovars O157: H 7 / H stellen die bekanntesten und am besten untersuchten Vertreter der Shiga- toxine produzierenden enteroMmorr- hagischen E. coli (EHEC) dar. Sic waren die Verursacher der meisten EHEC- Ausbrfiche weltweit. Durch ihre Shiga- toxinogenit~it, das Vorhandensein wei- terer chromosomal oder plasmidal ko- dierter Virulenzfaktoren: der Pathoge- nit~itsinsel LEE mit dem Sekretion-III- System und dem eaeA-Gen (Intimin), das EnteroMmolysin (ehxA), das hitze- stabile enterotoxische Protein EAST1 (ast-A), die Katalase/Peroxidase (catP), der Hemin-Aufnahmerezeptor (chuA) sowie durch ihre niedrige Infektionsdo- sis (10-100 Keime) gehfren diese Bak- terien zu den hoch infekti6sen Infek- tionserregern. Sie verursachen Durch- f~ille mit w~if~rigen und w~igrig-blutigen Sttihlen, H~imorrhagische Colitis, k6n- nen postinfekti6se extraintestinale Er- krankungen wie HUS und TTP ausl6- sen und sind als Erreger yon Lebensmit- telinfektionen anzusehen, aber auch von

Mensch zu Mensch iibertragbar [1, 2]. Die meisten E. coli O157:H7-St~imme unterscheiden sich biochemisch von den kommensalen E. coli sowie von den an- deren enteropathogenen und extrain- testinal pathogenen E. coli-St~mmen durch die Eigenschaften S~iuren aus Sorbitol sowie 13-D-Glucuronidase zu bilden. E. coli O157:H7-St~imme sind zu ca. 95 % in diesen Eigenschaften negativ, E. coli non-O157-St~imme zu 94-96 % positiv [3, 4, 5, 6]. Diese Eigenschaften korrelieren bei E. coli O157:H- nicht mehr so eindeutig und sind fiir E. coli non-O157 als dia- gnostisch verwertbare Merkmale nicht zu nutzen. March and Ratnam [7] be- schrieben das Sorbitol-MacConkey- Medium (SMAC) zum Nachweis von E. coli O157:H7 aus Stuhlproben. Hier wurden die Begriffe NSF (non-sorbitol- fermenting organisms in fecal flora) und SF eingefiihrt. NSF wachsen auf diesem N~ihrmedium als helle, durchscheinende Kolonien und SF als rote bis pinkfar- bene. Da nicht nut E. coli O157:H7/H- als NSF wachsen, sondern auch andere

S~iuren aus Sorbitol negative Bakterien (z. B. die Proteus/Providencia/Morga- nella-Gruppe, Hafnia alvei, E. fergus- onii, E. hermannii u. a.), ist die prakti- sche Anwendung eingeschr~inkt, beson- ders durch die Notwendigkeit der sero- logischen Oberpriifung vieler heller Kolonien. Eine Verbesserung brachte der Zusatz des fluorogenen 4-Methyl- umbelliferyl-13-D-glucuronids (MUG) oder des chromogenen 5-Bromo-4- c h l o r o - 3 - i n d o l y l - 1 3 - D - g l u c u r o n i d s (BCIG) zum zus~itzlichen Nachweis der 13-D-Glucuronidase [8]. Solche N~ihr- medien geh6ren gegenw~irtig zum Stan- dard fiir den E. coli O157:H7/H--Nach- weis. Durch den Zusatz von Hemmstof- fen, z. B. Cefixim (50 lag/l) und Kalium- tetlurit (1 mg/1) zu SMAC (CT-SMAC, [9]) konnte die Selektivit~it zugunsten E. coli O157 erh6ht werden. E. coli O157:H7 und Shigella sonnei-St~imme wachsen auf diesem N~ihrmedium, das Wachstum der anderen E. coli-St~mme und der Begleitflora ist gehemmt. Leider traten immer mehr Tellurit-sensible E. coli O157-St~imme, besonders H- auf,

36 Bundesgesundhbl. Sonderheft Oktober 1998

Originalien und Llbersichtsarbeiten

die oft nur noch maximal 0,2 mg K2TeOs/1 tolerierten (unver6ffentlichte Ergebnisse). Damit war das Selektions- prinzip weitgehend unterwandert. Da E. coli O157:H7-St~imme L-Rhamnose auf festen N~ihrmedien nicht verwerten k6nnen, wurde durch Zusatz von Rhamnose zum SMAC (mit Cefixim als CR-SMAC bezeichnet) der Anteil farb- loser E. coli O157-Kolonien etwas er- h6ht [10]. Eine Weiterentwicklung zum Nachweis yon E. coli OI57-Bakterien stellen die chromogenen N~ihrmedien dar. Zus~itzlich zu den hier angefiihrten biochemischen Markern nutzen diese Niihrmedien verschiedene pH-abh~in- gige chromogene Substrate fiir ~-D- Galactosidase zur besseren Differen- zierung. Die gegenw~irtig auf dem Markt erh~iltlichen chromogenen N~ihr- medien Rainbow@ Agar O157 (Biolog Hayward CA, USA), CHROMagar@ O157 (Paris, Frankreich) und BCM TM

E. coli O157:H7 (+) culture medium (Biosynth AG, Staad, Schweiz; Fertig- platte heipha, Heidelberg) sind nach den hier erhaltenen Ergebnissen ftir die schnelle Isolierung der meisten E. coli O157:H7/H-St~imme geeignet.

M a t e r i a l u n d M e t h o d e n

Bakterienst~imme Die E. coli O157:H7/H--St~imme und die zum Vergleich mitgepriiften Entero- bacteriaceae und Pseudomonaden wur- den der Stammsammlung des Nationa- fen Referenzzentrums fiir Salmonellen und andere Enteritiserreger am RKI Wernigerode und am Hygiene Institut Hamburg entnommen.

Priifung der biochemischen Eigen- schaften

Die untersuchten E. coli O157:H7/H- St~imme sowie die anderen Entero- bacteriaceae und Pseudomonaden wur- den zur Reinheitskontrolle auf Gatle- Chrysoidin-Glycerol-Agar (SIFIN, Berlin) mit MUG ausgestrichen. Gleich- zeitig wurde so die 13-D-Glucuronidase durch Fluoreszenz bestimmt. Die unter- suchten Enterobacteriaceae wurden mit dem computergestiitzten Bactid-System /iberpr/.ift [11]. Die verwendeten N~ihr- medien und Methoden ffir die 47 Reak- tionen (u. a. S~iuren aus Sorbitol) des Bactid-Systems basieren auf den in den CDC Atlanta genutzten Rezepturen und Vorschriften. Die Pseudomonaden wurden mit dem MicroStationTM-Sy- stem (Biolog Hayward, CA, USA) iden- tifiziert.

Chromogene N/ihrmedien

Rainbow@ Agar O157 und CHROM- agar@ O157 wurden uns von den Her- stellern zur Priifung /.iberlassen. Die N/ihrmedien wurden nach deren Anga- ben hergestellt (Rainbow@ Agar O157 mit 0,8 mg Kaliumtellurit/1 und 10 mg Novobiocin/1, CHROMagar@ O157 ohne Hemmstoffe).

BCM TM E. coli O157:H7 (+) culture me- dium wurde in Pulverform von Bio- synth AG gekauft und nach Priifung mit nur 0,2 mg Kaliumtellurit/1 und 10 mg Novobiocin/1 angesetzt.

Rainbow@ Agar O 157 enth~.lt chromo- gene Substrate fiir [~-D-Galactosidase (blau-schwarzes Chromophor) und 13- D-Glucuronidase (rot-violettes Chrom- ophor), BCM TM E. coli O157:H7 (+) culture medium chromogene Substrate fiir 13-D-Galactosidase. Die detaillierte N~ihrmedienzusammensetzung war uns aus patentrechtlichen Griinden unbe- kannt.

Inokulation und Bebriitung Die bei -70 °C in der Microbank TM

(Mast Diagnostica, Reinfeld) gehaltenen St~imme wurden auf Niihragar (Oxoid) fiber Nacht bei 37 °C angeziichtet, und nach Suspendieren in NaC1 (0,85 %) fraktioniert auf die getrockneten Platten der chromogenen N~ihrmedien geimpft. Zum Vergleich wurden SMAC und CT-SMAC-N~ihrmedien (Oxoid, We- sel) mitgepriift. Die Bebriitung erfolgte 18-20 Std. bei 36 _+ 1 °C.

Serologische Oberpriifung der gewachsenen Kolonien Die auf den chromogenen N/ihrme- dien gewachsenen E. coli O157-Kolo- nien wurden mit E. coli O157-Antise- rum (SIFIN, Berlin) und mit E. coli OI57:H7 Latextest (Wellcolex E. coli O157:H7 Latextest, Abbott GmbH Diagnostika, Wiesbaden) geprfift. Die H-Antigene wurden nach dreimaliger Passage der Bakterien durch mit Veal Infusion Broth (Difco) unter Zusatz yon 0,1% Agar (Oxoid, No. 1) geffillte U- R6hrchen getestet [12]. Hier wurden einmal Anti-E. coli-H-Seren, zum ande- render E. coli O157:H7-Latextest (s. o.) angewendet. Der H7-Latextest wur- de auch mit auf N~ihragar (Nutrient broth, Difco (8g/l), Yeast extract, Difco (3 g/l)), NaCI (5 g/l) und Agar (15 g/l)] gewachsenen Kolonien durch- gefiihrt.

E rgebn i s se

E. coli O157:H7/H--St~imme mit den biochemischen Eigenschaften S~iuren aus Sorbitol negativ und [3-D-Glucuro- nidase negativ wachsen typisch entspre- chend den Beschreibungen der Herstel- ler (Tab. 1). Sorbitol und 13-D-Glucuro- nidase positive O157:H7/H--St~imme lassen sich auch auf diesen chromogenen N~ihrmedien nicht yon E. coli non- O157-St~immen unterscheiden. Da das BCM TM E. coli O157:H7 (+) culture me- dium (BCM) kein chromogenes Sub- strat for J3-D-Glucuronidase enth~ilt, er- scheinen die Sorbitol negativen, ~-D- Glucuronidase-positiven-St~imme noch als blau-schwarze Kolonien typisch fiir E. coli O157.

Von den sieben SF und [3-D-Glucuroni- dase positiven E. coli O157:H7-St~im- men wuchsen sechs aufgrund ihrer Tel- luritsensibilit~it nicht auf CT-SMAC. Ei- ner dieser St~imme wuchs nicht auf Rain- bow@ Agar O157 bzw. BCM, jedoch auf CHROMagar@ OI57. Allerdings wurde der CHROMagar@ O157 nach Angaben des Herstellers ohne Hemm- stoff gepriift. Von den anderen gepr/if- ten Enterobacteriaceae waren einige gehemmt. Citrobacter spp.- und Entero- bacter-cloacae-St;imme wuchsen als kleine griine Kolonien auf gelbem N~ihrbodengrund, Proteus rnirabilis, P. rettgeri, Serratia marcescens und Salmonellen als kleine, helle bis gelb- liche Kolonien auf BCM. Hier erschie- nen P. aeruginosa, P. fluorescens und P. putida als helle durchscheinende kleine Kolonien auf rotviolettem Niihr- medium. Zwei von vier geprOften Hafnia-alvei-Isolaten wuchsen sowohl auf diesem chromogenen N~ihrmedium als auch auf Rainbow@ Agar O157 ~ihn- lich den E. coli O157-Kolonien. Da die fiir E. coli O157 typischen Kolonien ge- nerell serologisch best~itigt werden miis- sen, konnte hier schneI1 entschieden wet- den. Eine weitere Unterscheidungsm6g- lichkeit bestand im Indolschnelltest (Hafnia alvei negativ, E. coli positiv) oder im Hafnia-Test, beides z. B. durch Reagnost@-Streifentests von Feinche- mie Sebnitz, Sebnitz/Sachsen. Auf Rain- bow@ Agar O157 wuchsen die genann- ten Enterobacteriaceae weif~ bis gelblich. Allerdings erschienen J3-D-Galactosi- dase positive Enterobacteriaceae eben- falls rotviolett, auch Salmonellen der Subspezies III a und III b. Pseudomona- den wuchsen als weit~e, kleine Kolonien, gram-positive Bakterien wa- ren gehemmt.

Bundesgesundhbl. Sonderheft Oktober 1998 37

Originalien und Ubersichtsarbeiten

Tabelle 1: Eigenschaften, Wachstum und Kolonieaussehen von E. coli O157:H7/H-Stiimmen auf drei chromogenen Niihrmedien

Eigenschaften der E. coli-0157-St~mme H-Antigen S~ure aus ~3-D-Glucu-

Sorbitot ronidase

7 + +

Anzahl

79

3

26 7 2 36

- - + +

- - _ +

non-Of57 + +

Rainbow ®, Agar O 157 mit Novobiocin (10 rag/l) und K2TeO3 (0,8 mg/1), lot 710282

Anstrich grau-schwarz, Ein- zelkolonie grau mit schwar- zero Zen:rum, grauer Saum, grau-schwarzes Priizipitat um die Kolonie, bis 1,5 mm im Durchmesser, NM klar. Kolonietyp: grau-schwarz Anstrich und Einzelkolonie rot-violett bis purpur, rot- violettes Pr~izipitat Kolonietyp: rot-violett

Chromogenes N~ihrmedium BCM T M E. coli O157:H7 (+) culture medium mit Novo- biocin (10 mg/l) und K2TeO3 (0,2 rag/l), lot 23086)

CHROMagar ®, O157 ohne Hemmstoffe, lot 243

Anstrich blau-schwarz, Ein- zelkolonie btauschwarz mit blau-schwarzem Pr~izipitat, NM griin oft rot-violett, bis 1 mm im Durehmesser. Kolonietyp: blauschwarz

Anstrich altrosa, Einzel- kolonie ahrosa, rot-violettes Zentrum, zartrosa Saum, kein Pr~.zipitat, bis 1 mmim Durchmesser, NM klar. Kolonietyp: altrosa

Anstrich und Einzelkolonie griin, teilweise mit br~iun- lichem Zentrum, bis 1,5 mm im Durchmesser, NM gelb, oft wei~es Pr~izipitat um das massive Wachstum, Kolonietyp: griin-gelb

Anstrich und Einzelkolonie blau bis tfirkis, bis 1 mm im Durchmesser, NM klar. Kolonietyp: blau-tiirkis

grau-schwarz blauschwarz altrosa rot-violett grfin-gelb blau-tfirkis rot-violett blau-schwarz blau-tfirkis rot-violett griin-gelb blau-tOrkis

Die auf den chromogenen N~ihrmedien sowie auf SMAC und CT-SMAC ge- wachsenen E. coli O157-Kolonien ag- glutinierten alle mit Anti-E. coli 0157- Serum bzw. mit dem E. coli 0157-Latex- test. In keinem Fall konnte das H7- Antigen mit H7-Latextest von diesen Kolonien bestimmt werden. Nach Oberprfifung im U-R6hrchentest wur- de von auf den obigen Niihrmedien be- stimmten 25 E. coli O157:H-Sdimmen 18 als E. coti O157:H7 agglutiniert, sie- ben St~imme blieben O157:H-. Interes- santerweise agglutinierten 15 der 18 E. coli O157:H7-St~imme mit dem H7- Latextest nach Wachstum auf N~ihragar positiv. Das deutet auf durchgehend starke Hemmung der H7-Antigenpro- duktion durch die N~ihrmedienzusiitze in den chromogenen Niihrmedien wie auch in SMAC oder CT-SMAC hin. Bei einem E. coli O157:H7-Stamm konnte ein mit der ,,klassischen,, Serologie iden- tifiziertes H7-Antigen nach gleicher Kuhivierung mit H7-Latextest nicht be- st~itigt werden.

Diskussion Chromogene N~ihrmedien fiir E. coli O157 enthalten neben einer guten N~ihr- stoffbasis (Peptone, Fleischextrakt, He- feextrakt) chromogene Substrate fLir 13- D-Galactosidase (s. z. B. Tab. 2), bei el-

nigen zus~itzlich fiir 13-D-Glucuronidase und auch Kohlenhydrate. Als Hemm- stoffe gegen die Begleitflora kommen Novobiocin und Tellurit zum Einsatz. Die genannten Enzyme spalten die an- gebotenen Enzymsubstrate, das frei- werdende Chromophor f~irbt entspre- chend seiner Struktur die wachsende Kolonie durch Pr~izipitation in der Ko- lonie, oft auch in der Umgebung dersel- ben (Tab. 1). S~iurebildung durch die Kohlenhydrate und damit Einstellung von pH-Opt ima ffihren zu unterschied- lich starker Spaltung der Enzym- substrate, z.B. ffir 13-D-Galactosidase. Gleichzeitig kann ein pH-Indikator durch S~iurebildung die Niihrmedien- farbe ~indern und so die tntensit~it der

Koloniefarben, aber auch die Differen- zierung unterst/itzen. Die Verwendung der 13-D-Galactosidase-Substrate von E. coli ist auch vorteilhaft zur Abtren- hung von 13-D-Galactosidase negativen Bakterien, die dann im Gegensatz zu den gef~irbten Kolonien hell durchsich- tig oder in N~ihrbodenfarbe wachsen.

Zur tsolierung von E. coli O157 aus Stuhlproben wurde BCM TM E. coli O157:H7 (+) culture medium w~ihrend der Sentinelstudie 1997 angewandt [13]. Aus 3835 Stuhlproben wurden in 82 F~il- len verd~ichtige blau-schwarze Kolonien entdeckt, von denen serologisch und durch weitere Priifung sechs E. coli O157:H7 und drei E. coli O157 :H-

Tabelle 2: Kolonief/irbung auf chromogenen N/ihrmedien in Abh/ingigkeit von der chromatischen H/ilfte des [3-D-Glactosidase-Substrates

Chromatische H~ilfte Koloniefarbe

5-Bromo-4-chloro-3-indolyI indigoblau 5-Bromo-6-chloro-3-indolyl- magenta 5-Bromo-3-indolyl dunkel-indigoblau 4-Chloro-3-indolyl- blaugr/in 6-Chloro-3-indolyl- lachsfarben-rosa N-Methyl-3-indolyl- griin o-Nitrophenyl- getb

38 Bundesgesundhbl. Sonderheft Oktober 1998

Originalien und Obersichtsarbeiten

Stiimme best~itigt werden konnten . Grunds~tzl ich wurden die BCM-Pla t - ten hier aus einer E H E C - A n r e i c h e - rungskul tur beimpft. Friihere Unte rsu- chungen anderer Au to ren zeigten, daf~ ein Ausimpfen von Originalmaterial ge- ringere Ausbeuten brachten. Jede Stuhl- probe wurde durch P C R u n d dann ELISA auf Shigatoxine untersucht . Die- sen Ergebnissen war zu enmehmen, daf~ kein falsch negativer Befund (griin- gelbe E. coli O l 5 7 - K o l o n i e n ) auf BCM auftrat. Der Antei l falsch positiver Be- funde lag deutlich unter dem Anteil , den Wallace and Jones [14] fiir C H R O M - agar® O157 mit 9 9 % best immten. Restaino and Jung (pers6nliche Mittei- lung) fanden, dat~ auf BCM ein dreifach niedriger Antei l an falsch posit iven Ko- lonien wuchs als auf S M A C - B C I G .

Chromogene N~ihrmedien sind geeignet, E. coli O157:H7/H--St~imme mit den Ei- genschaften ~-D-Glucuronidase und S~iuren aus Sorbitol negativ sicher und schnell zu erfassen [s. a. 15, 16]. N u r ~- D-Glucuronidase positive St~imme wer- den vom BCM noch sicher angezeigt. Die durch die Chromophore geff.rbten Kolonien sind besonders auf BCM und auch auf Rainbow® Agar O157 gut zu erkennen. Diese blau-schwarzen bzw. grau-schwarzen E. coli O157-Kolonien sind auch in Mischungen gut nachweis- bar. Z. B. konnten nach Anreicherung in EHEC-Anre icherungsboui l lon (heipha, Heidelberg) ca. zehn E. coli O157:H7- Kolonien, eingemischt in 1 g Stuhl, auf BCM sicher nachgewiesen werden.

S~iuren aus Sorbitol-posit iven und ~-D-Glucuronidase-pos i t iven E. coli O157:H7/H--St~immen sind auch auf den chromogenen N~ihrmedien von den

E. co l i -non-O157-S t~mrnen nicht zu unterscheiden. Trotz der eindeutigen Vorteile, die in der M6glichkeit einer schnellen Isolierung der meisten E. coli O157:H7/H--St~imme auf den chromo- genen N~ihrmedien liegen, soll, auch aufgrund der ansteigenden Zahlen von Shigatoxine produzierenden E. coli- non-O157-St~immen, auf die N o t w e n - digkeit einer auf Shigatoxine gerichteten EHEC-Diagnos t ik (PCR, ELISA) hin- gewiesen werden.

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Anschrift der Verfasser: Dr. Roll Reissbrodt, Ulrich Sachse und Prof. Dr. Helmut Tsch~ipe, Robert Koch-Institut, Bereich Wernigerode, Burgstr. 37, 38855 Wernigerode; Dr. Hartmut Steinrfick, Robert Koch-Institut, Nord- ufer 20, 13353 Berlin; e-mail: reissbrodtr@rki.de

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