Charakterisierung der Antigen-induzierten Arthritis an ... · TNF-Blockade können insbesondere therapierefraktäre RA-Verläufe positiv beeinflusst werden. Ungeklärt bleibt jedoch,

Charakterisierung der Antigen-induzierten Arthritis in TNFα- und TNF-Rezeptor-defizienten Mäusen

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor medicinae (Dr. med.)

vorgelegt dem Rat der Medizinischen Fakultät der

Friedrich-Schiller-Universität Jena

von Wilma Rademacher

geboren am 2. Juli 1976 in Merseburg

Erster Gutachter Prof. Dr. rer. nat. R. Bräuer, Friedrich-Schiller-Universität Jena

Pathologisches Institut Zweiter Gutachter Prof. Dr. med. G. Hein Friedrich-Schiller-Universität Jena Klinik für Innere Medizin III Dritter Gutachter Prof. Dr. Kriegsmann Pathologische Praxis Trier

Tag der öffentlichen Verteidigung 4. Oktober 2005

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS Ag Antigen

AIA Antigen-induzierte Arthritis

AK Antikörper

AP Alkalische Phosphatase

BrDU Brom-Desoxy-Uridin

BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin)

CD Cluster of Differentiation

CFA Komplettes Freund´sches Adjuvanz (Complete Freunds Adjuvans)

CIA Collagen-induced arthritis

CRP C-reaktives Protein

CTLA Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen

DNA Desoxyribonukleinsäure

DTH Delayed type hypersensitivity (Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion)

EAE Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

Fc Fragment crystallizable

FCS Fetal calf serum

GM-CSF Granulocyte macrophage colony-stimulating factor

HE Hämatoxylin-Eosin

HLA Human leucocyte antigen

IFN-γ Interferon-γ

IFN-γR-/- Interferon-γ Rezeptor-Knockout

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

IL-1Ra IL-1-Rezeptor-Antagonist

K I Kollagen Typ I

K II Kollagen Typ II

KO Knockout

LKN Lymphknoten

LPS Lipopolysacharid

mBSA methyliertes Rinderserumalbumin (methylated bovine serum albumin)

MCP Monocyte chemotactic protein

MΦ Macrophage

MHC Major histocompatibility complex

MMP Matrixmetalloprotease

Mz Milz

NK Natürliche Killerzellen

NO Stickstoffmonoxid

NOD Non obese diabetes OD OptischeDichte

OPD ortho-Phenyldiamin

PBS Phosphate buffered saline

PMΦ Peritonealmakrophagen PG Proteoglykan

PMA Phorbol-12-myristat-13-acetat

PO Peroxidase

RA Rheumatoide Arthritis

RF Rheumafaktor

SCID Severe combined immunodeficiency

SEM Standard Error Mean (Standardfehler)

SF Synovialflüssigkeit

SFB Synoviale Fibroblasten

TCR T cell receptor

TGF-β Transforming growth factor-β

Th T helper cell

TNFα Tumornekrosefaktor-α

TNFα−/− Tumornekrosefaktor-Knockout

TNFR1−/− TNF-Rezeptor-1-Knockout

TNFR1,2−/− TNF-Rezeptor-1,2-Knockout

WT Wildtyp

INHALTSVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

1. ZUSAMMENFASSUNG 1

2. EINLEITUNG 3

2.1 Rheumatoide Arthritis 3

2.2 Ätiologie und Pathogenese 5

2.3 Therapiestrategien 8

2.4 Zytokine und Rheumatoide Arthritis 9

2.5 Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNFα) 11

2.5.1 Homöostatische Funktion von TNFα 12

2.5.2 Pathophysiologische Bedeutung von TNFα 13

2.5.3 TNFα-Rezeptoren 14

2.6 TNFα und Rheumatoide Arthritis 14

2.6.1 Entwicklung der Anti-TNF-Therapie 14

2.6.2 Ungeklärte Aspekte der Anti-TNF-Therapie 16

2.7 Experimentelle Arthritismodelle 18

2.7.1 Unterschiedliche Rolle von TNFα in Experimentellen Arthritis

modellen 19

2.7.2 Antigen-induzierte Arthritis (AIA) 21

2.7.3 Rolle von TNFα bei der AIA 23

2.8 Problemstellung 24

3. MATERIAL UND METHODEN 26

3.1 Material 26

3.1.1 Mausstämme 26

3.1.2 Geräte 26

3.1.3 Verbrauchsmaterial 27

3.1.4 Chemikalien 27

3.1.5 Kulturmedien und Lösungen 28

3.2 Methoden 30

3.2.1 Immunisierung und Arthritisinduktion 30

3.2.2 Studienmuster 30

3.2.3 Gelenkschwellung und Körpergewicht 31

3.2.4 Messung der DTH-Reaktion 31

3.2.5 Bestimmung des Milzgewichtes 31

3.2.6 Gelenkpräparation 31

3.2.7 Histologische Bewertung der Arthritis 32

3.2.8 Makrophagenpräparation und –kultur 33

3.2.9 Lymphknoten-Zellpräparate und –kultur 34

3.2.10 Serumgewinnung 34

3.2.11 Bestimmung der Serum-Antikörper 34

3.2.12 Bestimmung der Zytokine 36

3.2.13 Proliferationstest 37

3.2.14 Kniegelenkextrakte und Zytokinbestimmung 37

3.2.15 Statistik 38

4. ERGEBNISSE 39

4.1 Langzeitstudie 39

4.1.1 Gelenkschwellung 39

4.1.2 Histologische Auswertung 40

4.1.3 Milzgewicht und Körpergewicht 44

4.2 Kurzzeitstudie ( I ) 45


4.2.2 Histologische Auswertung 46

4.2.3 Milzgewicht und Körpergewicht 49

4.3 Kurzzeitstudie ( II ) 49


4.3.2 Zytokine in den Gelenkextrakten 50

4.4 Immunologische Parameter der AIA 53

4.4.1 In-vitro-Proliferationstest 53

4.4.2 DTH-Reaktion 54

4.4.3 Serum-Antikörper 54

4.4.4 Untersuchung der Makrophagenaktivität 56

4.4.5 Th1/Th2-Balance im Lymphknoten 58

5. DISKUSSION 61

5.1 Verlauf und Schwere der AIA 63

5.2 Lokale Auswirkungen auf die Zytokinfreisetzung 67

5.3 Systemische Auswirkungen auf die Zytokinfreisetzung 68

5.4 Immunmodulation unter TNF-Abwesenheit 71

6. SCHLUSSFOLGERUNGEN 76

7. LITERATUR- UND QUELLENVERZEICHNIS 78

8. ANHANG 97

Lebenslauf

Danksagung

Ehrenwörtliche Erklärung

1. ZUSAMMENFASSUNG

Zahlreiche tierexperimentelle und klinische Studien haben dazu beigetragen, TNFα als einen

Schlüsselmediator der Rheumatoiden Arthritis (RA) zu identifizieren. Mit der medikamentösen

TNF-Blockade können insbesondere therapierefraktäre RA-Verläufe positiv beeinflusst werden.

Ungeklärt bleibt jedoch, warum ca. 30% der Patienten nicht darauf ansprechen bzw. welche

Langzeiteffekte sich ergeben. Die Charakterisierung von TNF-Knockout(KO-)-Mäusen am

Modell der Antigen-induzierten Arthritis (AIA), einem der RA ähnlichen Entzündungsmodell,

ist geeignet, Auswirkungen, Kompensationsmechanismen und Nebenwirkungen einer

kompletten TNF-Blockade zu untersuchen. In der vorliegenden Arbeit sollte deshalb die AIA

von TNFα-, TNF-Rezeptor-1 und TNF-Rezeptor-1,2-KO- mit der von Wildtyp-Mäusen (WT)

verglichen werden.

Die Auswirkungen des Knockouts auf die klinischen Arthritismerkmale wurden zunächst in

AIA-Langzeitstudien beurteilt. Eine akute Arthritis konnte mit 100% Inzidenz auch bei TNF-

bzw. TNF-Rezeptor-Abwesenheit ausgelöst werden. Im Verlauf zeigte sich im Vergleich zum

WT jedoch eine verkürzte akute Gelenkschwellung bei den KO-Tieren. Die histologische

Beurteilung der chronischen Arthritis deutete auf einen leicht verminderten Schädigungsgrad

bei Abwesenheit von TNFα und beider TNF-Rezeptoren hin. Bei alleinigem Mangel des TNF-

Rezeptor1 wurden keine Veränderungen im Vergleich zum WT festgestellt. Die Gelenk-

schwellungsverläufe ließen einen TNFα-Einfluss damit eher für die Akutphase der AIA

vermuten, woraufhin Kurzzeitstudien durchgeführt wurden, die wiederum die 100%ige

Inzidenz bei insgesamt verkürzter akuter Schwellungsphase der KO-Tiere bestätigten.

Überraschenderweise fand sich dazu histologisch kein Korrelat, sondern die Gelenkschäden

prägten sich unabhängig vom TNFα- oder TNF-Rezeptormangel unverändert stark aus. Um

mögliche lokale Kompensationsmechanismen zu untersuchen, wurde der Zytokingehalt in

Kniegelenkextrakten akut arthritischer Tiere gemessen. Es fanden sich dabei deutlich

verminderte IL-1- und IL-6-Spiegel bei den KO-Tieren. Diese Reduktion korrelierte allerdings

nur mit der beobachteten verkürzten Gelenkschwellungsdauer, ließen aber offen, welche

Mechanismen den unverändert starken Gelenkschaden verursachen. Interessanterweise blieb

das stark proinflammatorische IL-12 von der TNF- bzw TNF-Rezeptor-Abwesenheit unbeein-

flusst und weist damit möglicherweise auf von TNFα unabhängige Entzündungsvorgänge hin.

Um die Auswirkungen der TNF-Abwesenheit auf die der AIA zugrunde liegenden

immunologischen Mechanismen zu charakterisieren, erfolgten Untersuchungen zur zellulären

und humoralen Immunantwort. Mit einem in vitro durchgeführtem Lymphozytenproliferations-

test konnte eine Beeinflussung durch den KO ausgeschlossen werden, jedoch zeigte sich eine

1

Abschwächung der in vivo induzierten Typ-IV-Überempfindlichkeitsreaktion (DTH) gegen das

Immunisierungsantigen. Diese reduzierte DTH-Reaktion war in Übereinstimmung mit der

verkürzten klinischen Gelenkschwellung bei den KO-Tieren und ist möglicherweise Ausdruck

eines veränderten Entzündungsablaufs. Dieser Einfluss scheint allerdings in Hinblick auf die

histologischen Befunde eher begrenzt zu sein, weshalb auf immunologischer Ebene nach

weiteren Kompensationsmechanismen gesucht wurde. Die Untersuchung von Peritoneal-

makrophagen (PMΦ) hinsichtlich einer TNF-abhängigen Zytokinkaskade bestätigte zwar eine

vor AIA-Auslösung bestehende Reduktion der IL-1- und IL-6-Freisetzung in den KO-

Stämmen, diese verlor sich jedoch nach Arthritisauslösung und ging im Fall von IL-1 sogar in

eine stärker anhaltende Sekretion im Vergleich zum WT über. Außerdem fiel eine übersteigerte

IL-12-Freisetzung durch alle KO-PMΦ während des gesamten AIA-Verlaufs auf, die auf eine

zusätzliche Akzentuierung der Th1-Ausrichtung der AIA hinwies. In Überständen von

stimulierten Lymphknotenzellen wurde nach AIA-Auslösung eine zunehmende IFN-γ-

Sekretion im Vergleich zur unbeeinflussten IL-4-Bildung festgestellt, welches ebenfalls für eine

Verschiebung in Th1-Richtung bei den KO-Tieren spricht und als Kompensation der TNF-

Abwesenheit interpretiert werden könnte. Die Serumkonzentrationen der ebenfalls patho-

genetisch wirksamen Antigen-spezifischen AK unterschieden sich vor Arthritisauslösung nicht,

zeigten jedoch bei den KO-Tieren während des AIA-Verlaufes einen zunehmenden Abfall.

Diese humorale Defizienz beim TNF- bzw. TNF-Rezeptor-KO wurde auch von anderen

Untersuchern beschrieben und mit einer veränderten Mikroarchitektur in den AK-bildenden

Immunorganen begründet (Pasparakis et al. 1996, Körner et al. 1997).

Die insgesamt schwachen Einflüsse auf den Schädigungsgrad der AIA weisen auf ausgeprägte

TNF-unabhängige Vorgänge in den KO-Tieren hin. Dies spricht für die Anwesenheit

verschiedener proinflammatorischer und destruktiver Kompensationsmechanismen im AIA-

Entzündungsmodell und verweist auf mögliche unterschiedliche pathogenetischen Subgruppen

im RA-Patientenkollektiv, die eine 30%ige Nichtansprechrate auf TNF-Blocker erklären

könnten. Darüber hinaus wurden anhand unserer Untersuchungen das immunologische

Potenzial und die damit verbundenen Auswirkungen einer kompletten TNF-Blockade deutlich.

Einerseits ist durch die Th1-Polarisierung eine Auslösung von Autoimmunphänomenen

denkbar, andererseits führt die humorale Defizienz möglicherweise zu einer Schwächung der

Infektionsabwehr. Dies stellt sicher nicht den Nutzen der medikamentösen TNF-Blockade in

Frage, sollte aber eine bewusste Abwägung des Nutzen-Risiko-Verhältnisses beim RA-

Patienten voraussetzen und die Suche nach spezifischen therapeutischen Angriffspunkten

weiter vorantreiben.

2

2. EINLEITUNG

2.1. RHEUMATOIDE ARTHRITIS

Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine chronisch entzündliche und systemische

Autoimmunerkrankung. Im Zentrum der Erkrankung steht die schubweise, progrediente

Entzündung der Gelenkinnenhaut (Synovitis), die sich durch eine charakteristische

symmetrische Polyarthritis äußert. Damit vergesellschaftet sind entzündliche Veränderungen

periartikulärer Strukturen, wie Sehnenscheiden, Muskeln, Schleimbeuteln und die Schädigung

des Gelenkknorpels, sowie Erosionen des gelenknahen Knochens. Der schubweise,

progrediente Verlauf führt zu Deformierungen und Funktionsverlust der betroffenen Gelenke.

Abhängig von Dauer, Schwere und Ausdehnung der Erkrankung kann es zusätzlich zu

systemischen und extra-artikulären Manifestationen im Rahmen dieses chronischen Prozesses

kommen. Dazu gehören u.a. Anämie, Vaskulitis, Serositis, Amyloidose, Osteoporose,

Keratokonjunktivitis sicca, Neuropathie und kardiopulmonale Komplikationen (Sack 1997,

Burmester & Pezzutto 1998, Miehle 1999).

Überlieferte Berichte zur Rheumatoiden Arthritis reichen für Europa überraschenderweise nur

bis ins 17. Jahrhundert zurück. Anhand von paläontologischen Skelettbefunden aus

Nordamerika hingegen wurde belegt, dass die Rheumatoide Arthritis in diesen Gebieten

schon vor tausenden von Jahren auftrat. Noch heute zeichnet sich diese Region durch eine

erhöhte Prävalenz der Erkrankung im Vergleich zur Weltbevölkerung aus (Rothschild et al.

1988). Ein früher europäischer Fallbericht stammt von Sydenham aus dem Jahr 1676. Von

Garrod wurde 1859 die erste Definition der Erkrankung erarbeitet. Mit der Bezeichnung

´rheumatoid´ grenzte er sie von den damals weit verbreiteten Arthritiden ´Rheumatisches

Fieber´ und ´Gicht´ ab. Nachdem im frühen 20. Jahrhundert mit dem Begriff der Arthritis

deformans eine Differenzierung zur Osteoarthritis hergestellt wurde, definierte Charles Short

1957 die Rheumatoide Arthritis endgültig als eine eigenständige Krankheit. Dies ermöglichte

insbesondere ihre Abgrenzung zu den seronegativen Spondylarthropathien, den kristall-

induzierten Arthritiden, der Osteoarthritis und dem systemischen Lupus erythematodes.

Die RA stellt heute die häufigste Arthritisform in den westlichen Industrieländern dar. Die

Prävalenz beträgt weltweit durchschnittlich 0,8%. Mit einer Geschlechterverteilung von 3:1

erkranken Frauen häufiger als Männer. Alle Altersgruppen sind betroffen, mit einem

Häufigkeitsgipfel für Frauen zwischen dem 55.- 64. und für Männer zwischen dem 65.-75.

Lebensjahr. Frauen in dieser Altersgruppe erkranken 2,5 mal, jüngere Frauen sogar 4 mal

häufiger als Männer an RA. Im Alter gleichen sich diese Geschlechtsunterschiede aus

3

(Gabriel 2001, Symmons 2002). Auch Kinder können in Form des Morbus Still an einer

systemischen juvenilen rheumatoiden Arthritis erkranken. Die Mortalität erhöht sich je nach

Schwere der Erkrankung bzw. dem Auftreten von extraartikulären Organmanifestationen

erheblich. Die 5-Jahres-Überlebenszeit geht bei schwierigen Verläufen auf bis zu 66% zurück

und entspricht damit in etwa der eines Non- Hodgkin-Lymphoms (Pincus & Callahan 1993).

Die frühzeitige Diagnosestellung ist aufgrund der Progredienz der Erkrankung und der damit

verbundenen Zunahme von Invalidisierungen von erheblicher Bedeutung. Die

Differenzierung der verschiedenen arthritischen Krankheitsbilder gestaltet sich jedoch

aufgrund der Ähnlichkeit von Initialsymptomen und Befunden schwierig. Da weder die

Ursache der Erkrankung bekannt ist, noch pathognomonische Teste existieren, werden

gegenwärtig verschiedene klinische, laborchemische und radiologische Befunde zur

Diagnosestellung herangezogen. Zu den klinischen Charakteristika gehören unspezifische

Prodromi wie Arthralgien, Morgensteifigkeit, Kraftlosigkeit der Hände, subfebrile

Temperatur und Hyperhidrosis bzw. die im weiteren Verlauf auftretenden typischen

synovialitischen Gelenkschwellungen mit symmetrischem Befall, vor allem der Hand-, pro-

ximalen Finger- und Zehengelenke. Diese Beschwerden können zusammen mit der labor-

medizinischen Konstellation von erhöhten allgemeinentzündlichen Parametern wie C-

reaktives Protein (CRP) oder Blutkörperchen-Senkungsgeschwindigkeit (BSG) und positiven

Rheumafaktoren auf eine RA hinweisen (Emery 1994). Röntgenuntersuchungen sind

ebenfalls diagnostisch wertvoll, zumal sich nachweisbare Gelenkzerstörungen besonders in

den ersten zwei Krankheitsjahren entwickeln (Sharp 2000). Die Diagnosestellung der RA

erfolgt anhand der Kriterien der American Rheumatism Association.

1. Morgensteifigkeit in und um die Gelenke, mindestens 1 h anhaltend

2. Arthritis in mindestens 3 verschiedenen Gelenkregionen

3. Arthritis von Hand- und Fingergelenken

4. symmetrische Arthritis

5. Rheumaknoten

6. Nachweis von Rheumafaktoren im Serum

7. typische radiologische Veränderungen: Erosionen und gelenknahe Osteoporose

Die Kriterien 1- 4 müssen mindestens 6 Wochen bestehen. Bei Vorhandensein von 4 Kriterien

kommt es zur Diagnosestellung der RA (Arnett et al. 1988).

4

2.2 ÄTIOLOGIE UND PATHOGENESE

Der Auslöser der Erkrankung ist bislang noch unbekannt. Obwohl eine familiäre Häufung für

die RA besteht, beträgt die Konkordanzrate für monozygoten Zwillingen nur zwischen 12%

und 30%. Als Risikofaktoren gelten beispielsweise Umweltbelastungen durch Silikon

(Klockars et al. 1987) und Zigarettenrauchen (Silman et al. 1996). Ein erhöhtes Risiko für das

Auftreten der RA wird auch für hormonelle und reproduktive Faktoren diskutiert (Spector

1990). Östrogene haben eine stimulatorische Wirkung auf das Immunsystem, welches mit der

3-4 mal höheren Wahrscheinlichkeit der RA-Entstehung bei Frauen in Zusammenhang

gebracht wird (Ansar et al. 1985, Takagi et al. 2000). In einer Studie an 101 Männern, die an

RA erkrankt waren, fielen neben niedrigen Androgenspiegeln ebenfalls erhöhte

Konzentrationen von Östradiol auf (Tengstrand et al. 2003).

Neben den erwähnten Risikofaktoren werden insbesondere Infektionen als Auslöser der

Erkrankung diskutiert. Untersuchungsergebnisse zur Beteiligung von Viren an der Ätiologie

der RA sind dabei am eindrucksvollsten. Der Nachweis von viralem Antigen bzw. viralem

Genom im Zusammenhang mit der RA gelang insbesondere für das Epstein-Barr-Virus,

Parvovirus B19 und Retroviren, wie HTLV-1 (Hein et al. 1995, Sack 1997). Für die

Assoziation von bakteriellen Infektionen, wie beispielsweise Proteus mirabilis oder

Mycoplasmen-Spezies, gibt es dagegen bisher nur ungenügende Belege (Deighton et al. 1992,

Hoffman et al. 1997).

Mit der Entdeckung der Rheumafaktoren (RF) im Blut von RA-Patienten in der Mitte des 20.

Jahrhunderts wurde erstmals die Hypothese von einer autoimmunologisch verursachten

Erkrankung aufgestellt (Franklin et al. 1957). RF sind Autoantikörper gegen den Fc-Teil von

körpereigenem Immunglobulin vom Gamma-Typ (IgG), die im Blut von 80% der Patienten

vorhanden sind. Abgelagerte Komplexe von RF können auch im Gelenk nachgewiesen

werden (Neumann et al. 2002). Zvaifler schlug 1973 ein Modell vor, welches die

Rheumafaktoren in das Zentrum der Pathogenese der RA rückten (Zvaifler 1973).

Mittlerweile konnten jedoch eine Vielzahl weiterer Autoantikörper beispielsweise gegen

Kollagen Typ II, Zytoskelettbestandteile (Steiner & Smolen 2002, Smolen & Steiner 2003),

zitrullinierte Peptide (Schellekens et al. 1998, Nielen et al. 2004) und Glucose-6-Phosphat-

Isomerase (GPI) (Schaller et al. 2001) mit der Erkrankung assoziiert und nachgewiesen

werden. Hinzu kommt, dass auch bei anderen Autoimmunerkrankungen RF auftreten, ohne

dass eine Gelenkbeteiligung vorliegt. Damit traten die RF in der Diskussion um die Auslöser

der RA in den Hintergrund und Untersuchungen zu den zellulären Interaktionen im RA-

Gelenk erlangten mehr Gewicht.

5

Im entzündeten Gelenk können auffällig viele aktivierte CD4+ T-Zellen nachgewiesen

werden (Cush & Lipsky 1991). Stastny (1976) zeigte anhand von Untersuchungen an RA-

Lymphozyten, dass eine Assoziation zwischen der Erkrankung und dem Auftreten bestimmter

Leukozytenantigene besteht. Mit der Einführung moderner molekularbiologischer Methoden

konnte die entsprechende Genregion dem Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) auf

Chromosom 9 zugeordnet werden. Patienten mit RA weisen eine erhöhte Prävalenz be-

stimmter Allele für die innerhalb des MHC-Komplexes liegenden Gene DR1 und DR4 auf.

Diese Regionen kodieren für die β-Kette im MHC-II-Molekül. Die Gemeinsamkeit der

suszeptiblen Allele besteht in einer konservierten Aminosäuresequenz innerhalb der hyper-

variablen Region dieser Kette. Diese auch als ´shared epitop´ bezeichnete Region liegt in der

Nähe der Antigen-Bindungsstelle des MHC-II-Moleküls (Gregersen et al. 1987). Obwohl

bisher kein für diese Sequenz spezifisches arthritogenes Antigen (Ag) identifiziert werden

konnte, ist anzunehmen, dass die Ag-Präsentation in diesem Bereich eine initiale Rolle bei der

Auslösung der RA spielt. Neben dem „shared epitop“ gibt es weitere, Nicht-MHC-assoziierte

Gene, die in Verbindung mit dem Auftreten von RA gebracht werden. Darunter sind

beispielsweise Gene für die Metalloproteinase-3 (Constantin et al. 2002) oder TNFα/β

(Martinez et al. 2000). Eine Assoziation zu infektiösen Vorgängen im Rahmen eines

molekularen ´Mimikry´ ist ebenso denkbar. So beinhalten das gp 110 Oberflächenantigen des

Epstein-Barr-Virus und das Hitzeschockproteins aus E. coli ebenfalls die „shared epitop“-

Sequenz (Hein et al. 1995).

Viele experimentelle Arthritismodelle sind T-zellabhängig. Durch Immunisierung mit

bestimmten Antigenen lässt sich eine T-Zellreaktivität erzeugen, mit der eine Arthritis

induzierbar wird. Die Existenz solcher Modelle unterstützt ebenfalls das Konzept der

antigenspezifischen Aktivierung von T-Zellen als initiales Ereignis der RA.

Mit den Ende der 80-er Jahre zur Verfügung stehenden neuen biomedizinischen Techniken

sollte die T-Zellabhängigkeit der Erkrankung untermauert werden. Überraschenderweise

blieben die Ergebnisse hinter den Erwartungen zurück: bisher existieren keine eindeutigen

Hinweise auf T-Zell-Rezeptor-Modifikationen oder RA-spezifische oligoklonale TCR-

Veränderungen (van Laar et al. 1991, Kotb 1995). Die Zytokinanalysen im RA-Gelenk

zeigten eine offensichtliche Unterrepräsentation der T-Zellzytokine gegenüber denen aus

Makrophagen und Fibroblasten (Feldmann et al. 1996). Anti-CD4-Therapieversuche an RA-

Patienten zeigten im Gegensatz zum Tiermodell bisher nicht den erwarteten therapeutischen

Effekt (Schulze-Koops & Lipsky 2000, Pohlers et al. 2004). Diese Ergebnisse verstärkten das

Interesse an alternativen, T-zellunabhängigen Mechanismen der RA-Entstehung. Beachtung

6

fanden in diesem Zusammenhang insbesondere die Zellen der synovialen Deckzellschicht, die

sich hauptsächlich aus zwei Zelltypen zusammensetzt: Makrophagen (Typ A-Zellen) und

Fibroblasten (Typ B-Zellen). Sie beteiligen sich über die Ausschüttung pro-inflammatorischer

Zytokine und gewebeschädigender Mediatoren an der Aufrechterhaltung der Synovitis.

Außerdem tragen sie zur Gelenkzerstörung bei, indem sie die Chondrozytenfunktion

beeinträchtigen, die Aktivierung von Osteoklasten vermitteln und Synoviozyten zur Sekretion

von matrixabbauenden Enzymen anregen (Burmester & Pezzutto 1998). Ausgehend von der

synovialen Hyperplasie entwickelt sich ein proliferationsaktiver, aggressiv wachsender

Zellverband, der ins das umgebende Knorpel- und Knochengewebe vordringt. Dieses Gewebe

wird als Pannus bezeichnet und setzt sich aus aktivierten Typ-A- und Typ-B-Zellen

zusammen. Molekularbiologische Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine Transformation

der Fibroblasten, die mit einem veränderten Wachstumsverhalten und einem veränderten

Aktivierungszustand der Fibroblasten einhergehen. Übereinstimmend damit können vermehrt

somatische Mutationen wie beispielsweise im p53 Tumorsuppressorgen, monoklonale

Expansionen innerhalb der Synoviozytenpopulation und Störungen im DNA-Reparatursystem

nachgewiesen werden (Inazuka et al. 2000, Lee et al. 2003). Diese Veränderungen entstehen

möglicherweise nicht erst sekundär im Rahmen des oxidativen Stress im Entzündungsgebiet,

sondern sind Ausdruck des primär veränderten Aktivitätszustandes transformierter

Synoviozyten (Pap et al. 2000).

Die Trias der Pathogenese der RA − Entzündung, abnormale Immunantwort, verändertes

Wachstum − stellt ein komplexes Krankheitsgeschehen dar. Firestein (2003) versucht die

bekannten Pathomechanismen in ein mehrstufiges Krankheitsmodell zu integrieren:

unbekannte Faktoren stimulieren die Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren, die eine

Frühsynovitis erzeugen. Durch die Synovitis werden bei entsprechender genetischer

Disposition, beispielsweise dem „shared epitop“, autoimmune Mechanismen provoziert.

Spezifische Immunzellen werden damit zur treibenden Kraft des Krankheitsgeschehens und

aktivieren Makrophagen und B-Zellen. Damit wird die Entzündung unabhängig vom

eigentlichen Auslöser, richtet sich nunmehr gegen autologe Antigene und schreitet fort. Die

Chronifizierung und der permanente entzündliche Reiz provozieren eine Überempfindlichkeit

des Gewebes gegen exogene und endogene Stimuli, die sich durch charakteristische

Erkrankungsschübe äußert. Proinflammatorische Mediatoren werden nun konstitutiv

freigesetzt. Im chronisch entzündeten Gewebe kommt es zum reaktiven, überschießenden

Zellwachstum, welches sich funktionell von der Synovitis abgrenzt und letztlich als

Pannusgewebe das Korrelat der Gelenkdestruktion darstellt (Firestein 2003).

7

2.3 THERAPIESTRATEGIEN

Aufgrund der unklaren Ätiologie der RA existiert bisher kein kausaler Therapieansatz. Die

Therapieziele beinhalten deshalb, entsprechend den Richtlinien des American College of

Rheumatology, die Remission der lokalen und systemischen Entzündung, die Erhaltung und

Verbesserung der Gelenkfunktion und die medikamentöse Kontrolle der Erkrankungsaktivität

(Guidelines ACR 2002). Da die RA eine heterogene Erkrankung mit variablen Krankheits-

verläufen darstellt, ist die sorgfältige und regelmäßige klinische, radiologische und

laborchemische Kontrolle unabdingbare Voraussetzung einer individuell optimierten Therapie

(Maini 2003). Unabhängig vom Krankheitsstadium sollte das Behandlungskonzept jedoch

auch einen ganzheitlichen Ansatz verfolgen, der neben dem medikamentösen Einsatz vor

allem auch physio-, ergo-, psycho- und soziotherapeutische Therapieformen vorsieht. Die im

Spätstadium auftretenden Funktionsverluste und Sekundärkomplikationen sind oftmals nur

noch durch chirurgische Maßnahmen korrigierbar.

Die Medikamente zur Behandlung der RA werden in 3 Hauptklassen eingeteilt: Nicht-

steroidale Antirheumatika (NSAID), Kortikosteroide und die so genannten ´Disease

Modifying Anti-Rheumatic Drugs´ (DMARD), zu denen sowohl die Basistherapeutika als

auch die neue Gruppe der ´Biologicals´ gezählt werden (O'Dell 2004).

NSAIDs eignen sich zur Schmerztherapie. Sie können zudem in begrenztem Maße die lokale

Entzündung eindämmen. Als Monotherapie sind sie allerdings aufgrund ihrer Neben-

wirkungen bei unzureichendem antiinflammatorischen Potenzial ungeeignet. Vor allem das

mit der Langzeitanwendung der NSAIDs einhergehende Risiko gastrointestinaler Komplika-

tionen, wie Ulkusbildung und Blutungen, begrenzen ihren Einsatz. In den letzten Jahren

wurden allerdings mit den Cyclooxygenase-2-Inhibitoren Präparate entwickelt, die aufgrund

ihres selektiveren Wirkmechanismus weniger Nebenwirkungen erwarten lassen (Silverstein et

al. 2000, FitzGerald & Patrono 2001).

Die Basistherapeutika, aus der Gruppe der DMARDs, werden als langsamwirkende Anti-

Rheumatika klassifiziert, da sich der antiinflammatorische Effekt erst nach einigen Wochen

entwickelt. Die Medikamente dieser Gruppe bewirken über sehr verschiedene Mechanismen

eine Verzögerung der Krankheitsprogression. Zu ihnen zählen Malariawirkstoffe,

Goldverbindungen, Sulphasalazin und Immunsuppressiva wie Methotrexat, Azathioprin,

Ciclosporin und Leflunomid. Nachteilig ist die oftmals unvollständige Wirksamkeit bei

häufigen Nebenwirkungen, die zum Abbruch der Einnahme führen können. Methotrexat weist

im Gegensatz dazu eine relativ gute Langzeitverträglichkeit bei besserer Wirksamkeit auf und

scheint deshalb den anderen Basistherapeutika überlegen zu sein (Ortendahl et al. 2002). Die

8

Kombination von Methotrexat, Chloroquin und Sulfasalazin hat in Studien günstige Effekte

im Vergleich zur Monotherapie gezeigt (O'Dell et al. 2002).

Kortikosteroide besitzen potente antiphlogistische und immunsuppressive Eigenschaften.

Während Entzündungsschüben sind sie im Sinne einer Stoß- oder Pulstherapie geeignet, die

Krankheitsaktivität rasch einzudämmen. Ihr Einsatz in der Langzeitherapie wird allerdings

aufgrund der bekannten Nebenwirkungen, wie Osteoporose, Arterieller Hypertonie oder

Hyperlipidämie kritisch betrachtet (Saag et al. 1994).

Seit kurzem steht mit den ´Biologicals´ eine neue Wirkstoffgruppe für die Behandlung der RA

zur Verfügung. Bei diesen Medikamenten handelt es sich um gentechnisch hergestellte

Proteine, die spezifische Hemmstoffe körpereigener entzündungsfördernder Botenstoffe, den

so genannten Zytokinen, darstellen. TNFα und Interleukin-1 gehören zu diesen Mediatoren.

Sie werden bei aktiver RA im Überschuss freigesetzt und vermitteln einen Großteil der

entzündlichen und destruktiven Mechanismen der Erkrankung. Aktuell sind drei TNF-

Hemmstoffe (Etanercept©, Infliximab©, Adalimumab©) und ein IL-1-Antagonist (Anakinra©)

zur Behandlung von RA-Patienten zugelassen, die auf andere Basistherapeutika nur

ungenügend reagiert haben (Olsen & Stein 2004). Der Vorteil dieser Medikamentengruppe

besteht in der guten Ansprechbarkeit von zuvor therapierefraktären RA-Verläufen und dem

relativ schnellen Wirkungseintritt im Vergleich zu anderen Basistherapeutika. Die derzeitig

restriktive Indikationsstellung begründet sich auf der noch unzureichenden Datenlage zur

Langzeitverträglichkeit und den hohen Medikamentenkosten. Neben den bisher zugelassenen

Biologicals sind andere Substanzen noch in der Testphase. Dazu gehören unter anderem

weitere Anti-Zytokin-Antagonisten, wie ein Anti-IL-6-AK (Choy et al. 2002) oder spezifisch

gegen die Aktivierung von T- oder B-Zellen gerichtete Wirkstoffe, wie Anti-CTLA4-AK oder

Anti-CD20-AK (Rituximab) (Olsen & Stein 2004).

2.4 ZYTOKINE UND RHEUMATOIDE ARTHRITIS

Zytokine sind niedermolekulare lösliche Proteine, die von einer Zelle sezerniert werden und

den Funktionszustand der Zelle selbst oder einer anderen Zelle verändern. Sie beeinflussen

lokale Zellinteraktionen, können aber auch systemische Wirkungen entfalten. Zytokine

vermitteln und regulieren komplexe biologische Funktionen wie Zellwachstum, Entzündung,

Immunabwehr und Zelldifferenzierung. Ihre Wirkungen werden über hochaffine

Zytokinrezeptoren vermittelt und amplifiziert. Im Rahmen von Entzündungsprozessen stellen

sie wichtige Effektormoleküle dar, die Art, Ausmaß und Dauer dieser Reaktionen

beeinflussen können (Dinarello & Moldawer 2000, Janeway et al. 2002).

9

Durch die Einführung neuer molekularbiologischer Untersuchungsmethoden in den

vergangenen 20 Jahren konnte bestätigt werden, dass sich Zytokine in erheblichem Maß am

chronischen Entzündungsprozess der RA beteiligen (Feldmann & Maini 1999).

Aufgrund der Komplexität des Zytokinnetzwerkes erscheint die folgende Einteilung in

funktionelle Hauptgruppen oder in Zytokinkaskaden hilfreich, sollte aber aufgrund der un-

vollständig geklärten Pathogenese der RA nicht unkritisch angewandt werden (Sack 1997):

1. Zytokine, die den Einstrom und die Aktivierung von Entzündungszellen, die Proliferation

von Synoviozyten, Knorpel- und Knochendestruktion und die systemischen

Auswirkungen wie Leukozytose, Thrombozytose, Anämie und die Sekretion von Akute-

Phase-Proteinen bewirken, werden als proinflammatorisch bezeichnet.

2. Zytokine, die diese Wirkungen neutralisieren können, werden als antiinflammatorisch

bzw. immunregulatorisch bezeichnet. Zu dieser Gruppe können ebenfalls die Antizytokin-

moleküle, wie die löslichen Zytokin-Rezeptoren für TNFα oder der IL-1-Rezeptor-

antagonist gezählt werden.

Entzündungsfördernde Monozyten- und Fibroblastenzytokine, wie IL-1, TNFα, IL-6, GM-

CSF und IL-8 werden exzessiv im RA-Gelenk freigesetzt (Feldmann et al. 1996). Sie

beteiligen sich an allen Krankheitsstadien der RA: im Stadium der frühen Synovitis

induzieren IL-1 und TNFα die Expression von Adhäsionsmolekülen mit nachfolgender

Akkumulation von Entzündungszellen im Gelenk. IL-6 und IL-1 tragen zur Differenzierung

von Monozyten und dendritischen Zellen bei. In der chronischen Phase produzieren die

synovialen Makrophagen große Mengen von proinflammatorischen Zytokinen,

Angiogenesefaktoren und Chemokinen. Der kontinuierliche Entzündungsreiz führt zur

Infiltration mononukleärer Zellen, synovialer Hyperplasie, Neovaskularisation und

Pannusbildung. In der destruktiven Phase der RA wird der entzündliche Prozess durch die

fortwährende Zytokinfreisetzung aus Synoviozyten und Monozyten weiter aufrechterhalten.

Vor allem TNFα und IL-1 vermitteln durch die Induktion von matrixabbauenden Enzymen

(Kathepsine, Metalloproteinasen) und die Aktivierung von Osteoklasten die Knorpel- und

Knochendestruktion (Jorgensen et al. 1999).

Die gleichzeitig verstärkte Produktion von antiinflammatorischen Mediatoren, wie TGF-β,

IL-10, IL-1-Rezeptorantagonist und löslichen TNF-Rezeptoren, deuten auf regulatorische

Kompensationsmechanismen hin (Feldmann et al. 1996). Die Applikation von IL-10 führt zur

Hemmung, die Blockade zur Steigerung der IL-1- und TNF-Sekretion (Katsikis et al. 1994).

IL-10 induziert außerdem die Freisetzung löslicher TNF-Rezeptoren, die sowohl in der

Synovialflüssigkeit als auch im Serum von RA-Patienten nachweisbar sind und aktiviert so

10

einen endogenen TNF-Antagonismus (Cope et al. 1992, Roux-Lombard et al. 1993, Joyce &

Steer 1996). Insgesamt sind diese Kompensationsmechanismen aber unzureichend, um die

Wirkungen der proinflammatorischen Zytokine zu neutralisieren.

Im Gegensatz dazu konnten die typischen T-Zellzytokine IL-2, IL-4 und IFN-γ nur in sehr

geringem Umfang im rheumatischen Gewebe nachgewiesen werden. Inwiefern diese

Beobachtung T-zellunabhängige Mechanismen der RA beweisen, ist umstritten (Firestein &

Zvaifler 1990, Feldmann et al. 1996).

Das proinflammatorische und destruktive Potenzial der Makrophagenzytokine und der

Nachweis einer lokalen Überproduktion im RA-Gelenk unterstreicht ihre pathogenetische

Bedeutung und macht sie zu einem attraktiven therapeutischen Angriffsziel. Gerade letzteres

konnte in den vergangenen 10 Jahren Rheumaforschung für TNFα und IL-1 eindrucksvoll

demonstriert werden (Feldmann & Maini 2001, Cohen et al. 2002, Taylor 2003). Im folgen-

den soll auf TNFα näher eingegangen werden.

2.5 TUMOR-NEKROSE-FAKTOR ALPHA (TNFα)

Schon hundert Jahre bevor das Zytokinspektrum mittels molekularbiologischer Methoden

zum Gegenstand intensiver Forschung wurde, postulierte Coley 1894 die Existenz eines

Mediators, der durch Bakterienprodukte stimuliert, offensichtlich eine Reduktion von

Tumoren bewirken konnte (Coley 1991). Später wurde bakterielles Lipopolysacharid (LPS)

als Stimulus für diesen Stoff identifiziert. Die Anti-Tumoreffekte bestanden in der Induktion

hämorrhagischer Nekrosen, denen Gefäßverschlüsse, Tumorzell-Anorexie und Zelltod

vorausgingen (Algire et al. 1952). 1975 wurde diese Substanz erstmals unter der Bezeichnung

Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) aufgeführt und Makrophagen als Hauptproduzenten

identifiziert (Carswell et al. 1975). Die molekularbiologischen Methoden erlaubten es damals

noch nicht, eine eindeutige biochemische Charakterisierung von TNF vorzunehmen. Zudem

bestanden Schwierigkeiten in der Abgrenzung zu einer Substanz aus Lymphozyten, die als

Lymphotoxin (LT) bezeichnet wurde und ebenfalls eine toxische Wirkung auf Tumorzellen

hatte (Granger & Williams 1968). Erst mit der Möglichkeit zur Isolierung und Klonierung der

cDNA von LT und TNF konnten deren chemische Eigenschaften bestimmt werden (Aggarwal

et al. 1985). Die ermittelte Homologie von 30% zwischen den beiden Molekülen, das

Vorhandensein gemeinsamer Rezeptoren und funktioneller Eigenschaften führte zur

Umbenennung von TNF und LT in TNFα respektive TNFβ (Pennica et al. 1984). Kurz darauf

folgend konnte das in Mausmakrophagen nach LPS-Stimulation freigesetzte katabole Molekül

Kachektin ebenfalls als TNFα identifiziert werden (Cerami et al. 1985). Die strukturelle

11

Homologie zwischen TNF und LT bildete die Grundlage zur Isolierung weiterer verwandter

Zytokine, die zur TNF-Superfamilie zusammengefasst wurden. Mittlerweile umfasst diese

Gruppe 19 Liganden, die ihre Signale über 29 Rezeptoren vermitteln. Sie besitzen nicht nur

strukturelle Gemeinsamkeiten, sondern haben auch ähnliche funktionelle Bedeutung

(MacEwan 2002).

TNFα wird als Reaktion auf infektiöse und immunologische Stimuli von aktivierten

Makrophagen, Monozyten , dendritischen Zellen, Lymphozyten und Fibroblasten synthetisiert

und vermittelt seine multiplen biologischen Funktionen auf nahezu alle Körperzellen.

Aufgrund seiner proinflammatorischen, wachstums- und differenzierungsfördernden sowie

zytotoxischen Effekte beeinflusst TNFα Entzündungsprozesse, Infektions- und Tumorabwehr

(Burmester & Pezzutto 1998, Dinarello & Moldawer 2000). Dabei muss grundsätzlich unter-

schieden werden zwischen der homöostatischen Funktion einerseits und der

pathophysiologischen Bedeutung andererseits.

2.5.1 HOMÖOSTATISCHE FUNKTION VON TNFα

Die homöostatische Rolle von TNFα zeigt sich durch die Beteiligung an Entzündungs-

vorgängen im Rahmen von Infektionsabwehr und Gewebeschädigungen. Dabei dient TNFα

der Initiierung, Amplifikation und Aufrechterhaltung der Entzündungsreaktion (Vassalli

1992). In späteren Stadien aktiviert TNFα zunehmend immunsuppressive und anti-

inflammatorische Mechanismen und unterstützt damit Heilungsvorgänge. Dies geschieht so-

wohl über die Induktion antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10 und TGF-β, als auch über

die Apoptoseinduktion in Lymphozyten (O'Shea et al. 2002). Letzterer, als „activation-

induced cell death“ (AICD) bezeichnete Vorgang dient zur Kontrolle von Immunzellen, deren

entzündliche Aktivitäten im Rahmen von Heilungsprozessen begrenzt werden müssen. Bei

TNF-Rezeptor-defizienten Mäusen findet dies unzureichend statt, so dass eine Rückbildungs-

störung entzündlicher Läsionen beobachtet wird (Kanaly et al. 1999). Die Bedeutung von

TNFα für die Aufrechterhaltung der Homöostase lässt sich unter den experimentellen

Bedingungen einer TNF-Blockade nachvollziehen. Diese geht einerseits mit einer gestörten

Infektionsabwehr von Bakterien, Pilzen und Parasiten einher (Rothe et al. 1993, Steinshamn

et al. 1996, Marino et al. 1997, Wilhelm et al. 2001), andererseits kommt es bei Mangel an

TNFα zu einer prolongierten Gewebeschädigung, die mit einer mangelnder

Entzündungskontrolle in Zusammenhang gebracht wird (Bruce et al. 1996, Liu et al. 1998,

Kanaly et al. 1999).

12

2.5.2 PATHOPHYSIOLOGISCHE BEDEUTUNG VON TNFα

Die pathophysiologischen Wirkungen von TNFα sind mit einer inadäquat hohen Freisetzung

oder einer chronischen Überproduktion des Zytokins assoziiert. Ersteres tritt beispielsweise

im Rahmen des Septischen Schocks auf, der durch die intravenöse Applikation von TNFα

vollständig imitiert werden. Dabei löst die akute TNFα-Exposition eine komplexe Sequenz

metabolischer, hämodynamischer und pathologischer Reaktionen aus. Dies führt unter

anderem zu gesteigerter Kapillardurchlässigkeit, Endotheldysfunktion mit nachfolgender

generalisierter Vasodilatation, Plasmaexsudation und Disseminierter Intravaskulärer

Gerinnung (DIC), weiterhin zur Hypoxie und dadurch verusachten Gewebsnekrosen, die

letztlich in das Vollbild des Multiorganversagens münden (Tracey 1991, Gutierrez-Ramos &

Bluethmann 1997). Diese multiplen Reaktionen vermittelt TNFα direkt oder indirekt über die

Aktivierung von Zytokinkaskaden und über die Ausschüttung einer Vielzahl weiterer

Mediatoren beispielsweise Hormonen oder Eicosanoiden (Tracey & Cerami 1994).

Im Gegensatz zur massiven Freisetzung werden durch die anhaltende Produktion niedriger

lokaler TNF-Spiegel chronische Entzündungsreaktionen ausgelöst, aufrechterhalten und

dadurch Gewebedestruktionen und -untergänge verursacht. Neben der RA konnte für

zahlreiche chronische Krankheitsprozesse eine Mitbeteiligung von TNFα bestätigt werden.

Dazu gehören Multiple Sklerose, Diabetes mellitus, AIDS, Transplantatabstoßungsreaktionen

oder chronisch entzündliche Darmerkrankungen. Dabei bewirkt TNFα die Aktivierung von

Leukozyten, fördert die Endotheladhäsion von Entzündungszellen, steigert die Produktion

weiterer inflammatorischer Mediatoren, wie Prostaglandine, IL-1, IL-6 und stimuliert die

Fibroblastenproliferation. Neben diesen lokalen Wirkungen reagiert der Organismus auf die

prolongierte TNFα-Freisetzung systemisch mit Fieber, Gewichtsverlust, Insulinresistenz und

in der Leber mit der Produktion von Zytokinen, Akute-Phase-Proteinen und einer gesteigerten

Lipidsynthese (Locksley et al. 2001). Die pathophysiologische Bedeutung einer prolongierten

TNFα-Freisetzung kann ebenfalls am Tiermodell nachvollzogen werden: in TNF-transgenen

Mäusen führt eine anhaltende TNF-Expression zu allgemeiner und gewebespezifischer

Schädigung sowie zur Ausbildung von humanähnlichen Autoimmunerkrankungen wie

Rheumatoider Arthritis, Multipler Sklerose und entzündlichen Darmerkrankungen (Kollias et

al. 1999).

2.5.3 TNF-REZEPTOREN

TNFα wird als 26 kDa membranassoziiertes Protein synthetisiert und kann als solches durch

die Aktivität einer Serin-Metalloproteinase (TNFα converting enzym, TACE) zu einem 17

13

kDa-Molekül gespalten und in den Extrazellularraum freigesetzt werden. Sowohl membran-

gebundene als auch lösliche Form binden als Homotrimer an zwei strukturell verschiedene

TNF-Rezeptoren: einen Typ I- (TNFR1, p55, CD120a) und einen Typ II-Rezeptor (TNFR2,

p75, CD120b), zu dessen Liganden neben TNFα noch LTα gehört (Tartaglia & Goeddel

1992, Darnay & Aggarwal 1999). Der TNFR1 wird auf nahezu allen Zellen gefunden. Die

Expression des TNFR2 beschränkt sich dagegen vor allem auf Immun- und Endothelzellen

(Aggarwal 2003). Im rheumatisch erkrankten Gelenk werden beide Rezeptoren auf einer Viel-

zahl von Zellen exprimiert (Deleuran et al. 1992, Taylor 1993).

Es bestehen deutliche Unterschiede in den Bindungscharakteristika für löslichen bzw.

membrangebundenen TNFα. Grell ( 1995) zufolge wird der TNFR1 durch beide Formen, der

TNFR2 hingegen vorzugsweise durch membrangebundenen TNFα aktiviert. Anders als die

extrazellulären Anteile, unterscheiden sich die intrazellulären Anteile der Rezeptoren deutlich

voneinander. Dies äußert sich wiederum in der Nutzung verschiedener intrazellulärer

Signaltransduktionswege durch den jeweiligen Rezeptor. Dazu gehören neben der

Aktivierung von Transkriptionsfaktoren (NF-κB, AP-1) auch die Apoptoseinduktion über die

Aktivierung der Caspase-Kaskade (Wajant et al. 2003). Beide TNF-Rezeptoren können

enzymatisch von der Zelloberfläche freigesetzt werden, löslichen TNFα binden und so dessen

Aktivität regulieren (Wallach et al. 1991).

Es ist bisher umstritten, inwieweit sich die pleiotropen Funktionen von TNFα auf Rezeptor-

niveau diskriminieren lassen. Aufgrund seiner konstitutiven Expression in den meisten

Geweben ist allerdings von einer dominaten Rolle des TNFR1 vor allem bei der Vermittlung

der proinflammatorischen TNF-Effekte auszugehen. Da der TNFR2 restriktiver, aber auch

flexibler exprimiert wird, kommt ihm wahrscheinlich eine Regulatorfunktion zu. In diesem

Zusammenhang ist möglicherweise das TNFR1:TNFR2-Verhältnis auf der Zelloberfläche

ausschlaggebend dafür, welche der multiplen TNF-Effekte vermittelt werden (Wajant et al.

2003).

2.6 TNFα UND RHEUMATOIDE ARTHRITIS

2.6.1 ENTWICKLUNG DER ANTI-TNF-THERAPIE

Nachdem TNFα sowohl in der Synovialflüssigkeit als auch im Synovialgewebe von RA-

Patienten in gesteigertem Maße nachgewiesen wurde, konnten Makrophagen als Hauptquelle

von TNFα identifiziert werden (Feldmann et al. 1996). Beide TNF-Rezeptoren sind ebenfalls

überexprimiert und lassen sich in allen Schichten der entzündeten Synovialmembran sowie

auf Endothelzellen nachweisen. Außerdem sind sie an der Invasionsfront des Pannusgewebes

14

nachweisbar. Die gleichzeitig erhöhte Expression von TNFα an diesen Stellen weist auf

autokrine Mechanismen hin (Chu et al. 1991, Deleuran et al. 1992, Alsalameh et al. 1999).

Das besondere Interesse an TNFα entstand aufgrund von In-vitro-Untersuchungen an RA-

Synovialgewebe. In den Überständen dieser Zellkulturen fanden sich konstant hohe Kon-

zentrationen von proinflammatorischen Zytokinen, wie TNFα, IL-1, IL-6 und GM-CSF.

Äußerst interessant war, dass die Zugabe eines TNF-spezifischen Antikörpers zu Beginn der

Zellkultur die IL-1-Produktion blockierte (Brennan et al. 1989). In folgenden Untersuchungen

bestätigte sich dieser hemmende Effekt von Anti-TNFα-AK auch für andere

proinflammatorische Zytokine wie IL-6, IL-8 (Butler et al. 1995) und GM-CSF (Haworth et

al. 1991). Diese Interaktionen waren unidirektional und angesichts der Komplexität des

Zytokinnetzwerkes überraschend, deuteten sie doch eine Schlüsselrolle eines einzelnen

Zytokins an. In der Folge entwickelten einige Forscher das Konzept einer Zytokinkaskade mit

TNFα als Schlüsselmediator (Maini et al. 1995). Diese Hypothese beinhaltete die

Vorstellung, dass durch die Blockade eines einzelnen proinflammatorischen Zytokins wie

TNFα die Hemmung nachfolgender Zytokine bewirkt und damit der Entzündungsprozess

nachhaltig beeinflusst werden könnte. Diese In-vitro-Studien waren nicht nur aus patho-

genetischer Sicht bedeutsam, sondern vor allem auch, weil sich damit ein neuer, spezifischer

Therapieansatz bot.

Im Folgenden wurde die Wirkung von TNFα in vivo untersucht. Thorbecke (1992)

demonstrierte am Modell der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA), dass die systemische

Applikation von TNFα eine höhere Inzidenz und einen schwereren Arthritisverlauf zur Folge

hatte. Umgekehrt bewirkte die Applikation von Anti-TNF-AK am gleichen Modell eine

dosisabhängige Abschwächung der klinischen und histologischen Arthritisparameter

(Williams et al. 1992, Piguet et al. 1992). In einem weiteren Tiermodell fiel ebenfalls die

besondere proinflammatorische Bedeutung von TNFα auf: Keffer et al. (1991) entwickelten

eine transgene Maus mit dysreguliertem humanen TNFα-Gen. Die inadäquat hohe Produktion

von TNF verursachte eine spontane erosive Polyarthritis, die durch die Gabe von Anti-TNF-

AK, aber auch Anti-IL-1-AK unterdrückt werden konnte (Probert et al. 1995). Vor allem

letzteres wurde als Bestätigung einer TNF-abhängigen Zytokinkaskade gewertet.

Diese Ergebnisse bildeten die Grundlage zur Initiierung von klinischen Studien zur

Wirksamkeit einer medikamentösen TNF-Blockade bei der RA. Um die Wirkung von TNFα

zu unterbinden, wurden entweder monoklonale AK oder lösliche TNF-Rezeptoren eingesetzt

(Feldmann 2002). In plazebo-kontrollierten, multizentrischen Studien (RPCT) konnte eine

Hemmung der akuten Krankheitsaktivität anhand klinischer Kriterien und systemischer

15

Entzündungsparameter wie CRP und BSG nachgewiesen werden. Die Ansprechrate der zuvor

therapierefraktären, seit Jahren an aggressiver RA leidenden Patienten lag studienabhängig

bei 60− 80 % (Elliott et al. 1994, Moreland et al. 1997). Dieser Wirksamkeitsnachweis führte

1998 in den USA zur Zulassung von Etanercept©, einem Fusionsprotein, bestehend aus einem

Dimer des TNFR-p75 und dem Fc-Teil von humanem IgG1.

Aufgrund der Bildung von neutralisierenden Antikörpern gegen den murinen Teil des Anti-

TNF-AK cA2 wurde eine nachlassende Wirksamkeit bei wiederholten Applikationen fest-

gestellt (Elliott et al. 1994). Die Kombination mit Methotrexat verringerte die Immunogenität

des Anti-TNF-AK und zeigte in einer weiteren Studie synergistische Wirksamkeit (Maini et

al. 1998), so dass auch dieser Anti-TNF-AK als Infliximab© 1999 in den USA seine

Zulassung erhielt. 2003 konnte für die Kombination von MTX und Adalimumab©, ein im

Gegensatz zu Infliximab© vollständig humanisierter Anti-TNF-AK, ebenfalls ein zusätzlicher

Effekt im Vergleich zur MTX-Monotherapie demonstriert werden (Weinblatt et al. 2003).

Damit wurden die DMARDs um eine neue Wirkstoffgruppe erweitert: Zytokinantagonisten,

deren spezifischer biologischer Hemmungsmechanismus den chronisch entzündlichen Prozess

der RA blockieren sollte.

Bisherige klinische Untersuchungen lassen vermuten, dass die positiven Effekte der

medikamentösen TNF-Blockade auf der Reduktion von proinflammatorischen Mediatoren

wie IL-1 und IL-6, Adhäsionsmolekülen und Angiogenese-Faktoren beruhen (Charles et al.

1999, Taylor 2003).

Inwieweit die Blockade von TNFα den hauptsächlich durch IL-1 vermittelten Effekt der

destruktiven Veränderungen beeinflussen kann, ist Gegenstand aktueller Studien-

auswertungen. Die Auswerter der ATTRACT-Studie (Anti-TNF-Therapy in RA with

Concomitant Therapy) beschreiben das Sistieren erosiver Veränderungen unter der

Kombinationstherapie von Infliximab© und MTX (Lipsky et al. 2000, Breedveld et al. 2004).

In der Enbrel-ERA-(Early Rheumatoid Arthritis) Studie wurden Etanercept© mit MTX über 2

Jahre hinsichtlich klinischer und radiologischer Parameter verglichen. Etanercept© war MTX

in allen Parametern überlegen (Genovese et al. 2002).

2.6.2 UNGEKLÄRTE ASPEKTE DER ANTI-TNF-THERAPIE

In-vitro-Untersuchungen, Tierversuche und klinische Studien haben dazu beigetragen, TNFα

als einen Schlüsselmediator der RA zu identifizieren. Ohne Zweifel bietet die medikamentöse

TNF-Blockade eine Möglichkeit der Beeinflussung der entzündlichen Komponenten der RA

wie Gelenkschwellung, Schmerz und Fatigue.

16

Die Nebenwirkungen der Langzeitblockade eines Zytokins wie TNFα mit seinen durchaus

protektiven Funktionen bei Immunabwehr und Tumorentstehung sind jedoch nicht unerheb-

lich. Bei über 2 Jahre mit Infliximab© und Etanercept© behandelten Patienten traten

signifikant mehr Fälle von aktiver Tuberkulose auf (Gomez-Reino et al. 2003, Long &

Gardam 2003). Ebenso scheinen Infektionen wie Listeriose und Histoplasmose eine

Komplikation der Kombination von Antizytokin- mit immunsuppressiver Therapie dar-

zustellen (Lee et al. 2002, Day 2002, Slifman et al. 2003). Unklarheit besteht über eine

mögliche Assoziation zwischen Anti-TNF-Therapie und einer erhöhten Inzidenz von

Multipler Sklerose (Mohan et al. 2001). Das mit der RA verbundene Risiko, vermehrt

lymphoproliferative Erkrankungen zu entwickeln, wird unter Umständen durch die Anti-TNF-

Therapie erhöht (Brown et al. 2002). Die daraus abgeleitete Konsequenz einer restriktiven

Verschreibungspraxis und relativ niedrige, eventuell unzureichende Dosierungen setzen der

Monotherapie Grenzen. Additive und synergistische Effekte einer Kombinationstherapie

könnten sowohl hinsichtlich des Therapieerfolges als auch der Nebenwirkungsrate einen

Fortschritt darstellen.

Hinzukommt, dass nicht alle Patienten mit therapierefraktärer RA von der Anti-TNF-Therapie

profitieren. Dies betrifft studienübergreifend ca. 30− 50% der Studienteilnehmer (Feldmann

2002). Einerseits vermutet man eine ungenügende Blockade, wobei eine Korrelation zwischen

Höhe der Dosis und der Ansprechrate angenommen wird. Andererseits sprechen sowohl

Ergebnisse aus klinischen Studien und insbesondere experimentelle Arthritismodelle für

alternative proinflammatorische Mechanismen, die TNF-unabhängig sind.

Ulfgren et al. (2000a) beobachteten eine positive Korrelation zwischen prätherapeutischen

synovialen TNF-Spiegeln und der Ansprechrate auf Infliximab©. Weiterhin sprechen

Untersuchungen an Biopsiematerial von RA-Synovialgewebe für ein heterogenes

Zytokinmuster gerade in Bezug auf die TNF-Beteiligung. Immunhistochemische Nachweise

von IL-1, TNFα und IL-6 an RA-Biopsiematerial ergaben neben einer dominierenden

Expression von IL-1 eine starke Variabilität im Zytokinmuster. Insbesondere fiel auf, dass

diese Unterschiede trotz gleichem makro- und mikroskopischen Schweregrad der Arthritis

bestanden (Ulfgren et al. 2000b). Klimiuk et al. (1997) bringen dies in Zusammenhang mit

bestimmten histopathologischen Subgruppen der RA. In seinen Untersuchungen konnten

verschiedene Synovitisformen mikroanatomisch abgrenzt werden, wobei nur eine der

insgesamt 3 Ausprägungen mit erhöhten TNFα-Spiegeln einherging:

17

1) Synovitis mit diffusen Makrophagen- und Lymphozyteninfiltrat, assoziiert mit

negativen Rheumafaktoren, milden RA-Verläufen und geringer Zytokinfreisetzung

(schwacher lokaler TNFα-Nachweis)

2) follikuläre Synovitis mit dem Nachweis von Keimzentren, assoziiert mit RF-positiver

RA und hohen IL-10-Konzentrationen (mäßige lokale TNFα-Konzentrationen)

3) granulomatöse Synovitis assoziiert mit schweren Krankheitsverläufen und extra-

artikulärer RA-Manifestation (Rheumaknoten), starker Freisetzung von T-Zell- und

Makrophagenzytokinen (hohe lokale TNFα-Konzentrationen)

Übereinstimmend damit konnte kürzlich die Heterogenität der RA-Formen auch auf

molekularbiologischer Ebene mittels DNA-Microarray-Analyse demonstriert werden: van der

Pouw Kraan et al. (2003) fanden mindestens 2 verschiedene Genexpressionsmuster innerhalb

eines RA-Patientenkollektivs und deuten dies nicht nur als Hinweis auf unterschiedliche

Pathogenesemechanismen, sondern auch in Hinblick auf die erfolgreiche Anwendung

medikamentöser Therapien.

Die offensichtliche Unterrepräsentation von TNFα in einigen RA-Gelenken und ebenso das

mangelnde Ansprechen auf die Anti-TNF-Therapie bei einem Drittel der Patienten spricht für

alternative pathophysiologische Mechanismen. Eine geeignete Möglichkeit zur Erforschung

TNF-abhängiger und unabhängiger Mechanismen bieten experimentelle Arthritismodelle.

2.7 EXPERIMENTELLE ARTHRITISMODELLE

Es existiert eine Reihe von Tiermodellen, die Ähnlichkeiten zur humanen RA besitzen. Durch

die Reproduzierbarkeit und Durchführung unter definierten Bedingungen lassen sich nicht nur

einzelne Pathomechanismen untersuchen, sondern auch neue Pharmaka testen. Ein weiterer

Vorteil besteht in der Möglichkeit, die Veränderungen der frühen Arthritisphase zu

charakterisieren.

Die Modelle der experimentellen Arthritiden sind vielfältig. Sie lassen sich in Gruppen ein-

teilen: 1) immunologisch induzierte Arthritiden, 2) Spontanarthritiden in transgenen Tieren

und 3) Destruktionsmodelle in immundefizienten SCID-Mäusen. Ein Großteil der Erkennt-

nisse zur RA stammt aus solchen Modellen. Auch wenn aufgrund der unvollständigen

Nachahmung des Einzelmodells Rückschlüsse auf die humane RA nur bedingt möglich sind,

eignen sich diese Modelle doch gerade für spezielle Fragestellungen zur Pathogenese-

erforschung oder zur Evaluierung neuartiger Therapieansätze bzw. -strategien.

18

2.7.1 UNTERSCHIEDLICHE ROLLE VON TNFα IN EXPERIMENTELLEN

ARTHRITISMODELLEN

Im Hinblick auf die umstrittene Schlüsselfunktion von TNFα, der unklaren

Langzeitverträglichkeit bzw. dem Nebenwirkungspotenzial und der Optimierung von

Therapiestrategien sind Erkenntnisse aus den verschiedenen Tiermodellen essenziell. Streptokokken-Zellwand-induzierte Arthritis (SCWIA)

Im Modell der SCWIA wird bei Mäusen oder Ratten durch einmalige intraperitoneale

Injektion von Zellwänden oder Zellwandbestandteilen von Streptococcus pyogenes eine

Polyarthritis ausgelöst (Cromartie et al. 1977). Der akuten Arthritis folgt eine relativ milde

erosive Phase. In der akuten Phase kann die Gabe von Anti-TNF-AK eine Verminderung der

akuten Entzündungsreaktion bewirken. Eine TNF-Beeinflussung der Erosionen und der durch

wiederholte Injektion des Antigens ausgelösten Entzündungsschübe besteht nicht, da selbst

TNF-defiziente Mäuse Erosionen aufweisen, IL-1-defiziente Mäuse hingegen nicht (van den

Berg et al. 1999). Kollagen-induzierte Arthritis (CIA)

Nach subkutaner Injektion von in Freund´schem Adjuvanz gelösten Kollagen Typ II kommt

es zu einem verzögerten Ausbruch einer Polyarthritis bei Mäusen und Ratten (Trentham et al.

1977, Courtenay et al. 1980). Nur Tiere eines bestimmten MHC-II-Haplotyps sind

suszeptibel. Die entzündliche Reaktion ist wahrscheinlich Folge der Antikörperproduktion mit

anschließender Immunkomplexbildung und einer erhöhten T-Zellreaktivität gegen Kollagen

Typ II. Die Inzidenz der Erkrankung beträgt 60−100%. Die chronische Phase der CIA ist ge-

kennzeichnet durch Erosion und Pannusbildung (Brand et al. 2003). Die CIA war das erste

Modell, an dem die Wirksamkeit von Anti-TNF für die akut arthritische Phase demonstriert

werden konnte (Williams et al. 1992). Bei der Hemmung einer etablierten Erkrankung war

eine Anti-IL-1-Therapie allerdings der TNF-Blockade überlegen (Joosten et al. 1996).

TNFR1- und TNFα-Knockout-Mäuse entwickelten die CIA verzögert und mit geringerer

Inzidenz. Eine absolute Abhängigkeit von TNFα bestand jedoch in keiner Krankheitsphase.

Schwere Arthritisverläufe waren damit in beiden Mausstämmen möglich (Mori et al. 1996,

Campbell et al. 2001). K/BxN Arthritis

Mäuse mit einem spezifischen transgenen T-Zell-Rezeptor können eine autoimmune Reaktion

gegenüber dem ubiquitär vorhandenen Antigen Glucose-6-Phosphat-Isomerase (GPI)

19

entwickeln. Dadurch kommt es zu einer veränderten Selbsttoleranz und zur verstärkten

Produktion von Auto-AK gegen GPI. Die Expression von GPI an der Oberfläche von

Gelenkknorpel ist wahrscheinlich verantwortlich für die Krankheitslokalisation als

entzündlichen Arthritis (Kouskoff et al. 1996). Anti-TNF-AK zeigten keine Auswirkung auf

den Verlauf der K/BxN-Arthritis (Kyburz et al. 2000). Interessanterweise kann die Arthritis

mittels Serumtransfer auch auf Normaltiere übertragen werden, selbst wenn der Empfänger

keine funktionsfähigen Lymphozyten besitzt. Immunkomplexe und FcγIII-Rezeptoren sind

Voraussetzung für die Etablierung der Arthritis nach dem Transfer (Ji et al. 2002a). Die

Bedeutung von TNFα in diesem Modell ist allerdings noch umstritten, da die Arthritis bei

TNFα- und TNFR-Knockout-Mäusen sehr stark variierte. Alle Rezeptor-defizienten Mäuse

entwickelten die Arthritis mit unveränderter Schwere, während die TNFα-Abwesenheit zwar

eine verringerte Inzidenz, jedoch keine Arthritisabschwächung nach sich zog (Ji et al. 2002b). Adjuvanz-Arthritis (AA)

Durch die Injektion von komplettem Freund´schen Adjuvanz in die Schwanzbasis von Ratten

wird eine akute Polyarthritis ausgelöst (Pearson 1956). Die Inzidenz der Erkrankung beträgt

100%. Grundlage der AA ist eine T-Zell-vermittelte Kreuzreaktivität zwischen den

Zellwandbestandteilen der Mykobakterien und verschiedenen Autoantigenen, wie

Proteoglykanen oder Hitze-Schock-Proteinen (Holmdahl et al. 1992). Die Gabe eines

löslichen TNF-Rezeptor wirkte protektiv (McComb et al. 1999). Interessanterweise zeigte die

Kombination von Anti-TNF mit rekombinaten IL-1-Rezeptorantagonisten, ebenso wie die

zusätzliche Gabe von MTX, Dexamethason oder Indomethazin eine gesteigerte Wirksamkeit

(Bendele et al. 1999). Dies unterstreicht die Vorteile einer Kombinationstherapie: reduzierte

Einzeldosen senken das Nebenwirkungsrisiko bei verbesserter Wirksamkeit. Human-murine SCID Arthritis

Severe-Combined-Immuno-Deficiency Mäuse (SCID) haben aufgrund eines defekten

Rekombinasesystems keine funktionierenden T-Zellen und Immunglobuline (Custer et al.

1985). Die Abwesenheit einer reaktionsfähigen Lymphozytenfraktion ermöglicht es

Pathogenesemechanismen unabhängig von der spezifischen Immunabwehr zu untersuchen.

Entnimmt man RA-Patienten entzündetes Synovialgewebe und implantiert es in das Knie

einer SCID-Maus, dann entwickelt sich ein mehrphasiger Krankheitsprozess, der mit der

Zerstörung des Gelenkes einhergeht (Sack et al. 1994). Das histologische Bild mit dem aus

Fibroblasten und mononukleären Zellen bestehenden Entzündungsgewebe weist starke

Ähnlichkeiten zum Bild der humanen RA auf. In Anti-TNF-Studien zeigte sich eine lokale

20

und systemische Hemmung des entzündlichen Prozesses, jedoch keine Beeinflussung der

Knorpelschädigung (Schädlich et al. 1999, Matsuno et al. 2002). Arthritis bei hTNF-transgenen Mäusen

Keffer et al. (1991) generierten einen transgenen Mausstamm, der ein am 3´-Ende

modifiziertes humanes TNF-Gen exprimiert. Diese Mäuse haben aufgrund einer

dysregulierten Synthese hohe TNF-Spiegel und entwickeln im Alter von 9 Wochen spontan

eine chronisch destruktive Polyarthritis. Die Inzidenz liegt bei 100%. Die Arthritis kann

sowohl durch Anti-TNF-AK als durch die Gabe von Anti-IL-1-AK vollständig unterdrückt

werden. Letzteres geht mit einem gleichzeitigen Abfall der TNF-Serumspiegel einher (Probert

et al. 1995).

2.7.2 ANTIGEN-INDUZIERTE ARTHRITIS (AIA)

Die AIA gehört zu den immunologisch induzierten Arthritismodellen. In diesen Modellen ist

eine Immunisierung mit einem Ag notwendig. Dumonde und Glynn etablierten das Modell

1962 erstmalig am Kaninchen (Dumonde & Glynn 1962). Später folgten Beschreibungen des

Modells an Meerschweinchen (Loewi et al. 1968), Mäusen (Brackertz et al. 1977a) und

Ratten (Griffiths 1992). Anfänglich wurde humanes Fibrin, später Ovalbumin (Consden et al.

1971), humanes IgG (Goldberg et al. 1974) und Rinderserumalbumin (Cooke & Jasin 1972,

Brackertz et al. 1977a) als exogene Antigene verwendet. Am Modell der AIA der Maus

werden die Tiere durch zweimalige subkutane Injektion von methyliertem

Rinderserumalbumin (mBSA) vorimmunisiert. Die Emulsifikation des mBSA in komplettem

Freundschen Adjuvanz und die gleichzeitige intraperitoneale Applikation von abgetöteten

Bordetella pertussis verstärkt die Immunogenität des Proteinantigens (Hunneyball et al.

1986).

Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung erfolgt die Auslösung der Arthritis durch intra-

artikuläre Injektion des spezifischen Antigens. Mit einer Inzidenz von 100% entwickelt sich

eine akute Arthritis mit den klinischen Zeichen Gelenkschwellung, Überwärmung und

Rötung, damit einhergehend eine Erhöhung der BSG, der Serum-Immunkomplexe und der

Akute-Phase-Proteine (Bräuer et al. 1988). Das histologische Bild der akuten AIA gleicht

dem der RA: kurz nach der Injektion kommt es zur Akkumulation von Granulozyten,

Erythrozyten, zu Fibrinablagerungen und Flüssigkeitsansammlungen im Gelenk. Diese Ver-

änderungen verstärken sich bis zum Ende der ersten Woche weiter. Es kommt neben einer

massiven Infiltration von Synovium und Gelenkhöhle mit polymorphonukleären und mono-

nukleären Zellen zu einer deutlichen Hypertrophie und Hyperplasie der Synovialmembran mit

21

Beteiligung auch periartikulärer Strukturen. Schon nach 2 Tagen fällt eine ausgeprägte

Chondrozytenfunktionsstörung auf, die gekennzeichnet ist durch eine verminderte

Proteoglykansynthese sowie vereinzelt durch nekrotischen Zellverlust (Kruijsen et al. 1983,

Hunneyball et al. 1986, Crossley et al. 1989). Es kommt zu Knorpelerosionen, die sich in der

chronischen Phase der Erkrankung weiter ausdehnen und in subchondrale knöcherne Struk-

turen vordringen. Das zelluläre Infiltrat, bestehend aus synovialen Fibroblasten (SFB) und

Makrophagen (MΦ), organisiert sich im Subsynovium bzw. als erosive Formation an den

Rändern des Gelenkes. Dieses proliferationsaktive Gewebe wird als Pannus bezeichnet

(Steinberg et al. 1973, Crossley et al. 1989).

Trotz des monoartikulären Befalls der AIA, im Gegensatz zum polyarthritischen Verlauf der

RA, sind die Gemeinsamkeiten im histopathologischen Bild und der Chronizität der Gelenk-

schädigung sowie die Wirksamkeit anti-rheumatischer Pharmaka deutlich.

Die Akutphase der Arthritis wird pathogenetisch über eine Arthus-Reaktion vermittelt:

injiziertes Ag und zirkulierende AK bilden In-situ-Immunkomplexe, die über Komplement-

aktivierung und FcRγ-Vernetzung eine Entzündungskaskade einleiten (van Lent et al. 2000).

Dazu gehören Mastzell-, Neutrophilen- und MΦ-Aktivierung, die die Bildung von

Chemokinen, Adhäsionsmolekülen und proinflammatorischen Zytokinen bewirken. Wechsel-

seitige Amplifikationen dieser entzündlichen Stimuli führen letztlich zum Vollbild einer

akuten Entzündung.

Die Beteiligung von humoralen Immunmechanismen bestätigte sich in Serumtransfer-

experimenten. Bei naiven Tieren löste der Transfer von Serum aus arthritischen Tieren eine

akute Gelenkschwellung aus, die jedoch nicht chronifizierte (Brackertz et al. 1977b). Die

Pathogenese der chronischen Phase der AIA ist noch nicht eindeutig geklärt. Eine Voraus-

setzung ist die lokale Persistenz des Ag. Die Ag-Retention ist optimal, wenn sich Ag in Form

von Immunkomplexen an Gelenkstrukturen anlagert und kationische Antigene verwendet

werden, die aufgrund ihrer Ladung eine besondere Affinität zur Knorpelmatrix besitzen

(Cooke & Jasin 1972, van den Berg et al. 1984).

Außerdem sind zellvermittelte Immunreaktionen wesentlich an der Chronifizierung beteiligt.

Insbesondere CD4+ Zellen vom Th1-Typ wandern verstärkt in das Gewebe ein und befinden

sich häufig in unmittelbarer Nachbarschaft zu aktivierten MΦ (Buchner et al. 1995, Austrup

et al. 1997). Die Bedeutung von CD4+ Zellen für die AIA unterstreichen insbesondere Unter-

suchungen an athymischen Nude-Mäusen, bei denen das Modell nur durch die Substitution

der T-Zellfraktion induzierbar war (Brackertz et al. 1977a). Isoliert man Lymphozyten aus

arthritischen Tieren und transferiert sie in SCID-Mäuse, entwickelt sich eine AIA. Werden

22

vor dem Transfer allerdings die CD4+ Zellen depletiert, zeigt sich eine vorübergehende akute

Synovitis, jedoch keine chronische Gelenkschädigung (Petrow et al. 1996). Die CD4-

Depletion geht unter anderem mit verminderten AK-Spiegeln gegen das Immunisierungs-

antigen sowie verminderten Auto-AK gegen Kollagene und Proteoglykane einher. Die

erwähnte Auto-AK-Bildung scheint mehr als nur ein Begleitphänomen des Gewebeschadens

zu sein. Die Serumkonzentrationen dieser AK korrelieren mit der Schwere der AIA (Bräuer et

al. 1993). Durch orale Toleranzinduktion gegenüber Kollagen Typ II kann eine

Abschwächung der Arthritis bewirkt werden (Yoshino et al. 1995). Die milde, nicht

chronifizierende Arthritis nach Serumtransferexperimenten spricht allerdings gegen eine

dominierende humorale Komponente in späteren AIA-Phasen. Untersuchungen an der

Ovalbumin-induzierten Arthritis unterstützen dies: durch AK gegen den T-Zellrezeptor war

eine Suppression der chronischen Arthritis trotz unverändert hoher Serum-AK möglich

(Yoshino & Cleland 1992). Allerdings war die DTH-Reaktion gegen Ovalbumin signifikant

reduziert, was die Beteiligung von CD4+ Zellen unterstreicht. Wahrscheinlich erfolgt von T-

Zellen ausgehend eine Aktivierung der MΦ, die über die Produktion proinflammatorischer

Mediatoren und die Wechselwirkungen mit anderen Zellen zur Chronifizierung des

entzündlichen Prozess beitragen. MΦ sind damit sowohl in der akuten als auch in der

chronischen Phase als Effektorzellen von großer Bedeutung.

2.7.3 ROLLE VON TNFα BEI DER AIA

TNFα konnte sowohl lokal in Gelenkextrakten als auch systemisch im Serum im Verlauf der

AIA nachgewiesen werden (Hersmann et al. 1998, Kleinstäuber 2001, Simon et al. 2001). Die

akute Arthritis ging dabei mit einem lokalen TNFα-Anstieg im arthritischen Gelenk einher,

der ein Maximum am Tag 3 der AIA zeigte und bereits am Tag 7 wieder auf das Niveau von

immunisierten nicht-arthritischen Mäusen abfiel. Anhand von Serumbestimmungen und der

Zytokinfreisetzung durch stimulierte Peritonealmakrophagen (PMΦ) konnten Rückschlüsse

auf systemische TNFα-Effekte gezogen werden. Bei PMΦ kam es am ersten Tag nach AIA-

Auslösung zu einer maximalen TNFα-Freisetzung, was für eine systemisch entzündliche

Mitreaktion spricht. Allerdings blieben die Serumwerte für TNFα vor und nach der

Arthritisauslösung bis zum Übergang in die chronische Phase konstant erhöht. Im Gegensatz

dazu korrelierte das zeitliche Profil der IL-1 bzw. der IL-6-Freisetzung sowohl im Gelenk als

auch im Serum deutlicher mit der akut entzündlichen Aktivität der AIA. IL-1 war zudem das

einzige proinflammatorische Zytokin, welches lokal und systemisch bis zum Tag 7 erhöht war

und von MΦ auch in der chronischen Phase verstärkt freigesetzt wurde (Simon et al. 2001).

23

Kleinstäuber (2001) konnte in unserem Labor die Wirkung eines Anti-TNF-AK auf die AIA

untersuchen. Der Einsatz von zwei verschieden hohen Konzentrationen des AK zeigte eine

positive Beeinflussbarkeit der Symptome der akuten und chronischen Arthritis. Es bestand

eine Dosisabhängigkeit, wobei die höchste Konzentration des AK stärkere Effekte zeigte.

Darunter kam es zu einem Rückgang der Gelenkschwellung um circa 50% und einer

signifikanten Verringerung des histologischen Arthritisscores im Vergleich zur

Kontrollgruppe. Dabei zeigte sich histopathologisch eine positive Wirkung sowohl auf

entzündliche als auch auf destruktive Arthritisparameter. Der AK verringerte außerdem die

lokalen Konzentrationen von IL-1 und IL-6 im arthritischen Gelenk und senkte die In-vitro-

Synthese dieser Zytokine in Makrophagenkulturen. Letzteres allerdings, ohne dass die lokalen

TNF-Spiegel im Gelenk durch den AK beeinflusst wurden, womit die antiinflammatorische

Wirkung dieses Anti-TNF-Antikörpers vorangig als systemisch gewertet wurde.

Die Wirksamkeit des gleichen Anti-TNF-AK wird durch eine andere Untersuchung am AIA-

Modell in Frage gestellt. Van de Loo et al. (1995b) konnten weder eine Beeinflussung der

akuten Gelenkschwellung noch eine Protektion des Proteoglykanstoffwechsels im

arthritischen Gelenk durch den Anti-TNF-AK feststellen.

Ein Vergleich dieser beiden Studien erklärt die differenten Ergebnisse möglicherweise mit

Unterschieden hinsichtlich der Applikationsart (intravenös versus intraperitoneal), der

unterschiedlichen Applikationshäufigkeit (einmalig versus mehrmals) und der abweichenden

Dosierung des Antikörpers (100 µg versus 300 µg).

2.8 PROBLEMSTELLUNG

Zytokin-Knockout(KO)-Mäuse bieten eine attraktive Möglichkeit, die vollständige Blockade

eines Zytokins und deren Auswirkungen zu simulieren. Der Einsatz von TNFα-Knockout-

Mäusen am Modell der AIA empfiehlt sich insbesondere aufgrund der widersprüchlichen

Beobachtungen aus den erwähnten Anti-TNF-AK-Studien (van de Loo et al. 1995b,

Kleinstäuber 2001). Die Interpretationsschwierigkeiten beim Einsatz eines Antikörpers, wie

beispielsweise ungenügende Dosierung oder ungünstige Applikationsart, werden durch das

KO-System umgangen. Außerdem bietet sich bei vollständiger TNF-Abwesenheit die

Möglichkeit zur Untersuchung alternativer TNF-unabhängiger Reaktionswege und möglicher

Auswirkungen einer TNF-Langzeitblockade.

In der vorliegenden Arbeit wurden deshalb folgende Fragestellungen bearbeitet:

24

1. Hat die TNFα-Abwesenheit Auswirkungen auf den Verlauf der akuten und chronischen

Phase der AIA? In Kurz- und Langzeitstudien wurden die klinischen Parameter

Kniegelenkschwellung, Körpergewicht und Milzgewicht sowie die Arthritismerkmale

Entzündung und Gelenkdestruktion am histologischen Präparat bewertet. 2. Welche Zytokine werden lokal von der TNF-Abwesenheit beeinflusst? Welche

Kompensationsmechanismen fallen auf? In Gelenkextrakten von Tieren mit akuter

Arthritis wurden die Konzentrationen für TNFα, IL-1, IL- 6 und IL-12 bestimmt.

3. Welche der AIA zugrundeliegenden Immunparameter werden durch die TNFα-

Abwesenheit beeinflusst? In diesem Zusammenhang erfolgte die Beurteilung

der antigenspezifischen zellulären Immunantwort anhand der DTH-Reaktion, der

Untersuchung der In-vitro-Proliferation und Zytokinsekretion (IFN-γ, IL-4) von

Lymphknotenzellen,

der humoralen Immunantwort anhand der antigenspezifischen Serum-Immunglobuline

und matrixspezifischen Antikörper sowie

der systemischen Makrophagenaktivität anhand der Freisetzung von TNFα, IL-1, IL-6

und IL-12.

Parallel dazu standen uns TNFR1- und TNFR1,2-Knockout-Mäuse zur Verfügung. Mit der

simultanen Untersuchung der drei KO-Stämme sollten die folgenden Punkte Berücksichti-

gung finden:

Ist es möglich, die TNF-Effekte auf Rezeptorniveau zu differenzieren?

Ist die Blockade von TNFR1-Signalen der Wirksamkeit einer TNFα-Blockade über-

legen?

Wirkt sich die Abwesenheit beider Rezeptoren stärker auf den Verlauf der AIA aus,

als die alleinige Abwesenheit von TNFα oder des TNFR1? Mit der Charakterisierung der AIA an diesen KO-Mäusen sollte ein Beitrag zur Klärung der

Pathogenese der Arthritis insbesondere der Bedeutung von TNFα geleistet werden und damit

weitere Voraussetzungen für die Entwicklung und Evaluierung neuartiger Therapiestrategien

geschaffen werden.

25

3. MATERIAL UND METHODEN3.1 MATERIAL

3.1.1 MAUSSTÄMME

Folgende Mausstämme wurden in die Untersuchungen der Antigen-induzierten Arthritis

eingesetzt :

C57BL/6 : 8-12 Wochen alte ♀♀

TNFα-Knockout (C57BL/6) : 8-12 Wochen alte ♀♀

TNFR1-Knockout (C57BL/6) : 8-12 Wochen alte ♀♀

TNFR1,2-Knockout (C57BL/6) : 8-12 Wochen alte ♀♀

Alle Tiere stammen aus dem Institut für Versuchstierkunde am Klinikum der FSU Jena. Die

Mäuse wurden in Gruppen von maximal 10 Tieren unter standardisierten Bedingungen bei

einem konstanten 12 h Hell-/ Dunkelrhythmus gehalten. Als Nahrung diente standardisiertes

Haltungsfutter (ALTROMIN, Lage) und Wasser ad libitum. Die Durchführung der tier-

experimentellen Untersuchungen war vom Verwaltungsamt des Freistaates Thüringen

genehmigt.

Die TNFα-KO-Mäuse wurden von Herrn PD Dr. Heiner Körner, Institut für Klinische

Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen, die

TNF-Rezeptor-KO-Mäuse von Frau Dr. Carola Leipner Institut für Virologie der FSU Jena

zur Verfügung gestellt und durch homologe Rekombination in embryonalen Stammzellen von

C57/BL/6-Mäusen erzeugt (Körner et al. 1997a, 1997b, Rothe et al. 1993, Kalb et al. 1996).

3.1.2 GERÄTE

Außentaster „Oditest“, Kroeplin Längenmesstechnik, Schlüchtern

Bead-Mill (Mikro-Dismembranotor), Braun

Begasungsbrutschrank Cellstar, Nunc, Wiesbaden

ELISA-Reader EAR 400FT, SLT Labinstruments Deutschland, Crailsheim

Fuchs-Rosenthal-Zählkammer, Fein-Optik, Bad Blankenburg

Kühlzentrifuge CR 312, Jouan, Unterhaching

Labor-Tischzentrifuge 30F, Hettich, Tuttlingen

Labor-pH-Meter, Hanna Instruments, Karlsruhe

Laminar Flow-Box, Elektromat, Dresden

Mikrospkop Jenamed, Carl Zeiss Jena, Jena

Mikro-Dismembranator Polytron PT 1200, Kinematica, Littau

26

Präparationsbesteck (Scheren und Pinzetten), Aeskulap, Tuttlingen

Umgekehrtes Mikroskop Televal3, Carl Zeiss Jena, Jena

Vortexgerät VFZ, IKA-Labortechnik, Crailsheim

Waschgerät Columbus, SLT Labinstruments, Crailsheim

Wasserbad Thermostat, Julabo, Seelbach

3.1.3 VERBRAUCHSMATERIAL

Edelstahl-Gewebesiebe, Tissue Grinder Kit, 80 mesh, Sigma, Deisenhofen

Einmalfilter (0,2 µm), Schleicher & Schüll, Dassel

Einmalspitzen (10, 100, 1000 µl), Eppendorf, Hamburg

Einmalspritzen und –kanülen, Braun-Melsungen, Melsungen

Einmalstangenpipetten in verschiedenen Größen, Greiner, Nürtlingen

Eppendorfbecher, 1,5ml, Greiner

Gewebekulturschalen, 60/20 mm, steril, Greiner

Gewebekulturplatten 12 Well, 24 Well, 96 Well, Greiner

Kolbenhubpipetten in verschiedenen Größen, Eppendorf

Mikrotiterplatten für ELISA, hochbindend Kaminausführung, F-Form, Greiner

Mikrotiterplatten für ELISA, Maxisorb, Nunc

Polystyrolröhrchen, 14ml, 17,0/100mm, steril, Greiner

Polypropylröhrchen, 50ml, 30,0/115mm, steril, Greiner

Polystyrol-Gewebekulturplatten, 24-Well, oberflächenbehandelt, steril, Greiner

Polystyrol-Gewebekulturplatten, 96-Well, oberflächenbehandelt, steril, Greiner

Reagiergefäße (MicroTubes) 1,5ml, 39×10,8mm, Sarstedt, Nürnbrecht

Reagiergefäße 0,5ml, 30× mm, Sarstedt

3.1.4 CHEMIKALIEN BCA Protein Assay Reagent A+ B, Perbio, Rockford

Bordetella pertussis, hitzeinaktiviert, Chiron-Behring, Marburg

EDTA, Sigma, Deisenhofen

Fetales Kälberserum (FCS), Gibco Brl, Gaithersburg, USA

Heparin (Liquemin N20000), Roche, Grenzach-Wyhlen

Hepes-Puffer, Gibco Brl

Interferon-γ (IFN-γ), Maus, rekombinant, Boehringer, Mannheim

Komplettes Freundsches Adjuvans (CFA), Sigma

27

L-Glutamin, Ferak, Berlin

Lipopolysaccharid (LPS) von E.coli, Serotyp O26:B6, Sigma

2-Mercaptoethanol, Gibco Brl

Methyliertes Rinderserumalbumin (mBSA), Sigma, Deisenhofen

Mycobacterium tuberculosis (Stamm H37RA), Becton Dickinson, Heidelberg

Ortho-Phenylendiamin (OPD), Sigma Aldrich Chemie, Steinheim

Para-Nitrophenylphosphat (pNPP), Serva

Penicillin/Streptomycin/Glutamin, Gibco, Karlsruhe

Peroxidase-conjugated Streptavidin, Jackson Immunoresearch Laboratories

RPMI-1640, Zellkulturmedium, Gibco Brl

Serumfreies Makrophagenmedium (SFM), Gibco Brl

Streptavidin-Peroxidase, Dianova, Hamburg

Trypanblau, Sigma

Tween 20, Sigma

3.1.5 KULTURMEDIEN UND LÖSUNGEN

Beladungspuffer für Zytokin-ELISA Natriumcarbonatpuffer, pH 9,5

0,84 g NaHCO3 in 100 ml Aqua dest. lösen

Natriumphosphatpuffer, pH 6,5 1,48 g Na2HPO4 x 2 H2O + 1,85 g NaH2PO4 x H2O in 100 ml Aqua dest. lösen

Natriumphosphatpuffer; pH 9,0 1,38g NaH2PO4 x H2O in 100 ml Aqua dest. lösen

Cell Proliferation ELISA, BrDU (colorimetric), Roche

Komplettes Medium RPMI 1640, supplementiert mit

FCS 10% Penicillin G 100U/ml Streptomycin 100µg/ml L-Glutamin 2mM HEPES-Puffer 10mM 2-Mercaptoethanol 0,5µM

PBS (Phosphatgepufferte Kochsalzlösung) 8 g NaCl 1,44 g Na2HPO4 x 2 H2O 0,2 g KH2PO40,2 g KCl in 1 l Aqua dest. lösen und auf pH 7,4 einstellen

Protein- Nachweis mit BCA BCA Protein Reagent A, Pierce

28

BCA Protein Reagent B, Pierce

Serumfreies Makrophagen-Medium

Stopplösung für Alkalische Phosphatase 5,3 g Na2CO3 in 100 ml Aqua dest. lösen.

Stopplösung für Peroxidase 2 N H2SO4

Substratpuffer Stammlösung TRIS und Aqua dest. 1:1 (V/V) gemischt und 0,2 mg/ml MgCl2 x 6H2O) gelöst

Substratlösung für Peroxidase 2 mg/ml ortho-Phenylendiamin (OPD) gelöst in Zitratpuffer 20 µl/ml H2O2 (3 %)1 M)

Substratlösung für alkalische Phosphatase 2,6 mg/ml para-Nitrophenylphosphat (pNPP) in Substratpuffer

Waschpuffer für Zytokin-ELISA 0,05 % Tween 20 gelöst in PBS

Zitratpuffer (pH 4,8) 2,1 g Zitronensäure 16,2 ml 1 N NaOH in 84 ml Aqua dest. lösen

29

3.2 METHODEN 3.2.1 IMMUNISIERUNG UND ARTHRITISINDUKTION

Jede Studie beinhaltet die Untersuchung von 4 Mausstämmen :

TNFα-Knockout-Mäuse (TNFα−/−),

TNFR1-Knockout-Mäuse (TNFR1−/−),

TNFR1,2-Knockout-Mäuse (TNFR1,2−/−) und

C57BL/6 als Wildtyp-Kontrolle (WT).

Aufgrund wechselnder Anzahl von Nachkommen variierte die Gruppengröße von 4-10 Tieren

pro Stamm und Studie. Das Immunisierungsregime und die Arthritisinduktion wurden für alle

Mausstämme übereinstimmend durchgeführt. Die Immunisierungen wurden im Abstand von

einer Woche durchgeführt. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurde die Arthritis

ausgelöst.

Als Immunisierungs-Antigen diente mBSA (2 mg/ml, in 0,9% NaCl) kombiniert mit CFA

(mit Mykobakterien auf die Endkonzentration von 2 mg/ml supplementiert). Aus beiden

Substanzen wurde eine 1:1-Mischung als stabile Emulsion hergestellt. Die Immunisierung

beginnt am Tag –21 (d-21) mit der subkutanen Injektion von 100 µl Antigen in die rechte

Flanke zusammen mit einer intraperitonealen Gabe von 2×109 abgetöteten Bordetella

pertussis. Eine Woche später, am Tag –14 (d-14), erfolgte als Reimmunisierung (Boosterung)

eine erneute Antigen-Injektion subkutan in die Schwanzbasis. Nach 14 Tagen findet die

Arthritisinduktion (Tag 0, d0) unter leichter Äthernarkose statt. Dazu wurden 100 µg mBSA

in 25µl NaCl (0,9%) gelöst und intra-artikulär in das rechte Kniegelenk appliziert. Auf die

Kontrollinjektion (physiologische Kochsalzlösung) in das linke Kniegelenk wurde verzichtet,

da vorausgegangene Untersuchungen in unserem Labor gezeigt hatten, dass hierbei keine

Entzündung verursacht wird.

3.2.2 STUDIENDESIGN

Die Untersuchungen stellen einen Vergleich des jeweiligen Knockout-Stammes mit dem

Wildtypstamm C57BL/6 dar. Dazu wurden Knockout-Mäuse und Wildtypmäuse zeitgleich

immunisiert und ausgelöst. Soweit möglich wurden alle 3 transgenen Mausstämme parallel

untersucht.

Die Beobachtung der Arthritis erfolgte in Kurz- und Langzeitstudien, wobei erstere der

Charakterisierung der akuten Phase der AIA dienen sollte und bei letzterer der Verlauf der

chronischen Entzündung im Vordergrund stand. Abhängig von der geplanten Studiendauer

wurden die Tiere am Tag 3 (d3) bzw. am Tag 21 (d21) getötet, um mittels verschiedener

30

unten aufgeführter Untersuchungen das arthritische und ergänzend das immunologische Ge-

schehen beschreiben zu können. Um Unterschiede im Immunisierungsverhalten der

Knockout-Tiere von abweichenden Arthritisausprägungen differenzieren zu können, wurde

eine Studie an vollständig immunisierten, nicht arthritischen Tieren am Tag 0 (d0)

durchgeführt.

3.2.3 GELENKSCHWELLUNG UND KÖRPERGEWICHT

Mittels Präzisionsstärke-Messinstrument wurde der mediolaterale Gelenkdurchmesser am Tag

0, 1, 2, 3, 5, 7, 14 und 21 gemessen. Die Differenz aus der aktuellen Gelenkschwellung des

rechten Gelenks und dem Gelenkdurchmesser vom Tag 0 ergab die Gelenkschwellung und

wurde zur klinischen Beurteilung der Entzündungsreaktion herangezogen. Um eine

Schwellungsreduktion durch Ödemauspressung zu vermeiden, wurde die Messung zügig und

ohne Druck auf das Gelenk in leichter Äthernarkose durchgeführt.

Die Körpermasse [g] als empfindlicher Parameter der Stoffwechselsituation im Rahmen von

Entzündungen wurde von Beginn der Immunisierung bis zum Töten der Tiere mittels Waage

bestimmt.

3.2.4 MESSUNG DER DTH-REAKTION

Zur separaten Bewertung der zellulären Immunreaktion gegen das zur Arthritisauslösung

verwendete Antigen steht mit dem Ohrtest eine In-vivo-Testmethode zur Verfügung. Diesem

Test liegt eine Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ IV zugrunde.

Jeder Maus wurden 5 µg mBSA gelöst in 10 µl 0,9%igem NaCl in das rechte Ohr intradermal

gespritzt. Die Messung der Ohrschwellung fand 24 h und 48 h nach Injektion statt. Die

Differenz zur Ausgangsdicke ergab die reaktive Schwellung. Die DTH-Messung wurde

innerhalb der Langzeitstudien am Tag 5 bis 7 durchgeführt.

3.2.5 BESTIMMUNG DES MILZGEWICHTES

Nach dem Töten der Tiere wurde die Milz entnommen und gewogen. Um die verschiedenen

Gruppen untereinander vergleichen zu können, wurden die Milzgewichte als relativ, auf das

Körpergewicht bezogen, angegeben [%].

3.2.6 GELENKPRÄPARATION

Nach dem Töten der Tiere wurden beide Kniegelenke in toto entnommen und von

anhaftenden Hautresten frei präpariert. Nach der Fixation in Formalin (4,5 %), fand die Ent-

31

kalkung mit Ethylendiamin-Tetraessigsäure (EDTA) statt. Die Gelenke wurden anschließend

in der aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und in Paraplast eingebettet. Nach der

Anfertigung von mindestens drei 5 µm-Frontalschnitten wurden diese in der absteigenden

Alkoholreihe entparaffiniert und mit Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt.

3.2.7 HISTOLOGISCHE BEWERTUNG DER ARTHRITIS

Die histologischen Kniegelenkschnitte wurden anhand eines festgelegten Punktesystems von

mindestens einem unabhängigen Gutachter beurteilt (Tabelle 1). Dabei standen einerseits

akute Entzündungsparameter wie hyperplastische Veränderungen der Synovialmembran und

zelluläres Infiltrat, andererseits chronische Destruktionszeichen wie Pannuswachstum und

Knorpelnekrosen im Vordergrund. Hyperplasie und Infiltrat wurden als Entzündungsscore,

Pannus und Knorpelnekrose als Destruktionsscore zusammengefasst.

Tabelle 1: Histologische Kriterien der AIA (lichtmikroskopische Beurteilung)

Bewertung Mesothel/ Synovialmembran

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Geringe Abnormität, kubische Transformation (einschichtig herdförmig)

Herdförmige kubische Transformation, einschichtig an mehrere Stellen

Kubische Transformation, Großteil der Synovialmembran betreffend

Kubische Transformation mehrreihig-herdförmig

Kubische Transformation mehrreihig-herdförmig, Großteil der Synovialmembran

betreffend

Mehrreihiges Mesothel mit ausgeprägten Nekrosen

Zelluläres Infiltrat

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Einzelne, schütter, herdförmige, auf Recessus beschränkt

Herdförmig, an mehreren Stellen, beschränkt

Diffuse, beschränkt

Herdförmige, ausgedehnt im ganzen Gelenk

Diffuse, ausgedehnt im ganzen Gelenk

Ausgeprägt, auf Kapsel übergreifend oder herdförmige Aggregation

Knorpelnekrosen

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Oberflächlich, herdförmig, auf Recessus beschränkt

Oberflächlich, herdförmig, in mehr als einer Gelenkregion

In mehr als einer Gelenkregion bzw. eine Region vollständig umfassend

Bis zur Tidemark reichend, herdförmig ausgeprägt

Bis zur Tidemark reichend, in mehr als einer Gelenkregion

Ausgedehnt, tief greifend, mindestens bis zur Tide mark reichend, mehr als eine Region

32

Pannus

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ausgedehnt, ein bis zwei Stellen mit geringer Infiltration

Ein bis zwei Stellen mit deutlicher Infiltration

Mehrere Stellen mit zungenförmiger Anlagerung auf Knorpel oder zangenförmiger

Infiltration an einer Stelle

Mehrere Stellen mit zangenförmiger Infiltration oder flaches Überwachsen einer Ge-

lenkfläche

Deutlich ausgeprägt an mehreren Stellen mit zangenförmiger Infiltration oder zungen-

förmiges Überwachsen mehrerer Gelenkflächen

Mehr als vier Stellen oder exzessive Ausbildung an zwei Stellen

3.2.8 MAKROPHAGENPRÄPARATION UND – KULTUR

Abhängig von der Studiendauer wurden die Mäuse am Tag 0, 3 oder 21 nach

Arthritisinduktion unter leichter Äthernarkose durch zervikale Dislokation getötet und nach

Aufschneiden der Karotiden zur Blutserumgewinnung ausgeblutet. Zur Desinfektion erfolgte

das Eintauchen der Mäuse in 70%igem Alkohol. Die sich anschließende Gelenk- und

Zellpräparation wurde unter „Laminar-Flow“-Bedingungen durchgeführt. Zur Makrophagen-

präparation legte man das Peritoneum frei, spülte unter leichter Peritonealmassage vorsichtig

mit 4 ml gekühlter Heparinlösung, nachfolgend noch einmal mit 3 ml und sammelte so ca. 7

ml in einem PS-Röhrchen, welches zur Vermeidung der Adhärenz der Makrophagen gekühlt

werden musste. Die Proben wurden bei 1200 rpm 8min zentrifugiert und der Überstand

abgegossen. Nach Aufschlagen des Zellpellets und Zugabe von 5 ml kalter PBS-Lösung

wurde dieser Vorgang wiederholt, um die Zellen anschließend in 2 ml komplettem RPMI-

Medium zur Zellzählung aufzunehmen. Diese erfolgte mit einer 1:10-Verdünnung in

Türkscher Lösung. Anschließend konnten die Proben auf 1×106 Zellen/ml eingestellt werden.

Zur Separation der Makrophagen lies man die Zellen für 2 h bei 37°C auf 24-Well-Platten mit

1×106 Zellen/ml adhärieren. Nach 2 h wurde das Medium vorsichtig abgesaugt. Die

adhärierten Zellen sind > 95% Makrophagen. Die Platten werden zweimalig mit Spülmedium

gewaschen, um die Zellen anschließend in RPMI-Medium bzw. zur TNFα-Bestimmung in

SFM aufzunehmen und mit verschiedenen Stimulanzien für 24 h bei 37°C, 5% CO2 zu

inkubieren.

Folgende Stimulationsbedinungen wurden getestet :

ohne Stimulation,

Kostimulation mit LPS (1 µg/ml) + IFN-γ (10 Units/ml)

33

Nach 24 h wurden die Überstände abgesaugt und 15 min bei 3000 rpm kühl zentrifugiert,

proportioniert und in entsprechenden Aufbewahrungsgefäßen bis zur Testung bei

–70°C tiefgefroren.

3.2.9 LYMPHKNOTEN-ZELLPRÄPARATION UND -KULTUR

Die inguinalen, poplitealen und axialen Lymphknoten (LKN) wurden entnommen, an-

schließend sorgfältig zerzupft, mit Hilfe eines Spritzenstempels durch ein Zellsieb gepresst

und in 5 ml Kulturmedium aufgenommen.

Diese Zellsuspension wurde 10 min bei 1000 rpm zentrifugiert, die Überstände abgegossen

und das aufgeschüttelte Zellpellett in Kulturmedium aufgenommen. Dieser Waschschritt

wurde noch zweimal wiederholt. Anschließend fertigte man eine 1:10-Verdünnung mit

Trypanblau an und ermittelte in der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer die Zellzahl. Tote Zellen

erscheinen unter dem Mikroskop als blaue Zellen, vitale Zellen dagegen ungefärbt. Die Zahl

der lebenden Zellen wurde auf 1×106/ ml eingestellt. Auf 24-Well-Platten wurden 1×106

Zellen/ ml pipettiert und nach folgendem Schema für

42 h bei 37°, 5% CO2 stimuliert:

ohne Stimulation

Stimulation mit mBSA 25 µg/ 1×106 Zellen ml-1 (Stocklösung 1mg/ml)

Stimulation mit PMA 5 ng/ 1×106 Zellen ml-1 (Stocklösung 0,5mg/ml) + Ionomycin

500 ng/ 1×106 Zellen ml-1 (Stocklösung 500 µg/ml)

Nach Ende der Stimulationszeit wurden die Überstände vorsichtig abpipettiert, zentrifugiert,

portioniert und bis zur weiteren Verwendung bei –70°C aufbewahrt.

3.2.10 SERUMGEWINNUNG

Das durch Ausbluten gesammelte Blut wurde bis zum Abschluss der Gerinnung für 4 h bei

4°C aufbewahrt. Anschließend nahm man den Überstand ab und gewann durch Zentri-

fugation das Serum, welches bis zur Testung bei –70 °C in 0,5-ml-Aufbewahrungsgefäßen

eingefroren wurde.

3.2.11 BESTIMMUNG DER SERUM- ANTIKÖRPER

Im Serum wurden mit der ELISA-Methode folgende Antikörper bestimmt:

mBSA-spezifische Immunglobuline der Subklassen IgM, IgG1, IgG2b

matrixspezifische Antikörper (IgG) gegen Kollagen Typ 1 (K I), Kollagen Typ 2

(K II) und Proteoglykane (PG)

34

Die Beladung der ELISA-Platten erfolgte mit dem jeweiligen Antigen (mBSA, KI, KII, PG),

woran die sich in der Probe befindlichen AK binden konnten. Für die Lösung der Kollagene

(1mg/ml) wurden zuerst 0,5 M Essigsäure, für Proteoglykane (1 mg/ml) 0,9 %iges NaCl

eingesetzt. Die Beladung der 96-Well-Platten erfolgte mit in Bikarbonatpuffer (0,1M, pH 9,6)

gelöstem Antigen (1 µg/ml mBSA, 10 µg/ml K I, K I oder PG) (Tab. 2). Die Platten wurden

über Nacht bei 4°C inkubiert und anschließend viermal mit PBS/Tween gewaschen. Durch

Versetzen mit 300 µl 2%igem BSA in PBS für 2 h wurden unspezifische Proteinbindungs-

stellen blockiert. Nach erneutem Waschen erfolgte der Probenauftrag mit 50 µl verdünnter

Probe im Doppelauftrag. Anschließend wurden die Platten wiederum über Nacht bei 4°C

inkubiert. Am Folgetag wurde nach dreimaligem Waschen ein enzymgekoppelter AK

(Detektor) mit 100 µl/Well aufgetragen und für 1 h inkubiert. Dieser AK ist an ein Enzym

gekoppelt, im vorliegenden Fall entweder eine Peroxidase (PO) bzw. Alkalische Phosphatase

(AP). Nach Abwaschen der ungebundenen AK war der letzte Schritt die Zugabe von Substrat

(OPD in Zitratpuffer, pNPP in Substratpuffer) und das Abwarten eines Farbumschlages. Die

Reaktion wurde mit 100 µl 5,3%igem Na2CO3 für AP bzw. 2N H2SO4 für POD abgestoppt.

Tabelle 2: ELISA für Serum-Antikörper

Serum-AK Capture Proben Detektion Substrat/ Puffer

mBSA-spezifische Ig-Subklassen

Ag-spezifische AK

0,1 µg/ml mBSA

0,1 µg/ml mBSA

0,1 µg/ml mBSA

1 µg/ml mBSA

10 µg/ml Kollagen-I

10 µg/ml Kollagen-II

10 µg/ml Proteoglykan

1:500

1:1000

1:1000

1:50000

1:100

1:100

1:100

1 µg/ml Anti-IgM-AP

0,5 µg/ml Anti-IgG1-AP

0,5 µg/ml Anti-IgG2b-AP

0,5 µg/ml Anti-IgG-PO




pNPP

pNPP

pNPP

OPD

OPD

OPD

OPD

Die Messung der Extinktionen erfolgt im jeweiligen Referenzbereich des ELISA-Readers: für

AP bei 405 nm (Referenzbereich 690 nm) und für POD bei 492 nm (Referenzbereich 620nm).

Zur Auswertung werden die jeweiligen Extinktionen relativ zur Kontrolltiergruppe anhand

der optischen Dichte [OD] beurteilt. Da für diese antigenspezifischen IgG keine Standards zur

Verfügung stehen, wurde als Kontrolle für die Linearität des Assay eine Verdünnungsreihe

aus gepooltem Serum immunisierter Mäuse mitgeführt.

35

3.2.12 BESTIMMUNG DER ZYTOKINE

Die Konzentrationsbestimmungen pro- bzw. antiinflammatorisch wirkender Zytokine in den

Überständen der Zellkulturen (Makrophagen, Lymphknoten) wurden mittels Sandwich-

ELISA durchgeführt. Dazu bestand der erste Schritt im Auftrag des Capture-AK auf 96-Well-

Platten verdünnt in Beladungspuffer und die Inkubation über Nacht bei 4 °C (Tabelle 3).

Tabelle 3: Antikörper für ELISA-Bestimmungen

Antikörper Klon Konzentration Beladungspuffer Quelle IL-1β

IL-1β-Biotin MAB401 BAF401

2 µg/ml 50 ng/ml

Na-CO pH 9,5 -

R&D R&D

IL-2 IL-2-Biotin

JES6-1A12 JES6-5H4

1 µg/ml 0,5 µg/ml

Na-PP pH 9,0 -

Becton Dickinson Becton Dickinson

IL-4 IL-4-Biotin

BVD4-1D11 BVD6-24G2

1 µg/ml 0,1µg/ml

Na-PP pH 9,0 -


IL-6 IL-6-Biotin

MP5-20F3 MP5-32C11

2 µg/ml 0,25 µg/ml

Na-CO pH 9,5 -


IL-12(p70) IL-12(p70)-Biotin

(nicht angegeben) (nicht angegeben)

- -

Na-PP pH 6,5 -

OptEIATM Sets, BD OptEIATM Sets, BD

TNF-α TNF-α-Biotin

G281-2626 MP6-XT3

6 µg/ml 0,5 µg/ml

Na-PP pH 6,5 -


IFN-γ IFN-γ- Biotin

R4-6A2 XMG1.2

1 µg/ml 0,5 µg/ml

Na-PP pH 9,0 -


Tabelle 4: Standards für die ELISA-Bestimmung

Zytokin Quelle rm IL-1β Becton Dickinson rm IL-2 Prepro Tech rm IL-4 Prepro Tech rm IL-6 Prepro Tech rm IL-10 Becton Dickinson, OptEIATMSets rm IL-12(p70) Becton Dickinson, OptEIATMSets rm TNF-α Becton Dickinson rm IFN-γ Gibco Nach dreimaligem Waschen wurden unspezifische Bindungen mit 2%igem mBSA in PBS

für 2 h geblockt. Dann erfolgte der Proben- und Standardauftrag (Tabelle 4). Nach 2 h

Inkubationszeit bei Raumtemperatur und viermaligem Waschen wurde ein zweiter Biotin-

gekoppelter spezifischer AK, gelöst in PBS/Tween, aufgetragen und für 2 h inkubiert. Nach

viermaligem Waschen konnte Peroxidase-konjugiertes Streptavidin als Enzym mit

100µl/Well pipettiert werden. 40 Minuten danach wurde überschüssiges Konjugat durch

erneutes Waschen entfernt und die Substratlösung für die Peroxidase mit 100 µl/Well

zugegeben. Die folgende enzymatische Reaktion lief im Dunkeln ab. Der Farbumschlag

36

wurde abgewartet und die Reaktion durch Zugabe von 2n H2SO4 (100 µl/Well) gestoppt. Der

Farbumschlag wurde mittels Extinktionsmessung bei 492 nm (Referenz 620 nm) im ELISA-

Reader quantifiziert. Im Anschluss erfolgte die Berechnung der Standardkurve bzw. –

gleichung mit einem Softwareprogramm (Microsoft Excel). Damit konnten im Folgenden die

Konzentrationen in den Proben berechnet werden.

3.2.13 PROLIFERATIONSTEST

Um die Zellproliferation innerhalb von Lymphknotenzell-Suspensionen mit und ohne

Stimulation zu beurteilen, wurde auf ein BrDU-KIT-System zurückgegriffen. Der Vorteil

gegenüber dem [3H]-Thymidin-Proliferationstest besteht in der Durchführung ohne

radioaktive Belastung. Die Lymphknoten wurden wie in 2.2.9. beschrieben aufbereitet. Auf

einer 96-Well-Platte wurden 100 µl Probe (5×104 Zellen/100µl) pipettiert und wie folgt als

Doppelauftrag inkubiert:

ohne Stimulation

Stimulation mit mBSA (25 µg/ml)

Stimulation mit PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml)

Nach einer Inkubationszeit von 72 h bei 37°C, 5% CO2 wurden 10 µl BrDU (5´Brom-2´-

Desoxyuridin) zugegeben und für weitere 18 h unter gleichen Bedingungen reinkubiert.

Entsprechend den Anweisungen des Herstellers erfolgten nach Ablauf dieser Zeit die

folgenden Schritte: Nach Zentrifugation wurde die DNA denaturiert, damit im nächsten

Schritt die anti-BrDU-Peroxidase binden konnte. Die sich bildenden Komplexe konnten im

sich anschließenden Schritt mittels Substrat (Tetramethyl-Benzidin) sichtbar gemacht werden.

Im ELISA-Reader erfolgte die Absorptionsmessung bei 450 nm (Referenz 690 nm). Die

Auswertung der ermittelten Extinktionen erfolgte anhand des Vergleichs der mittleren

optischen Dichten der Einzelproben [OD].

3.2.14 KNIEGELENKEXTRAKTE UND ZYTOKINBESTIMMUNG

Die Kniee wurden am 3. Tag nach Arthritisauslösung präpariert und bei –70°C eingefroren.

Zur Herstellung der Gelenkextrakte wurden alle Arbeitsutensilien mit flüssigem Stickstoff,

das Probenmaterial in einem Eiskübel gekühlt. Die grobe Zertrümmerung erfolgte mit Mörser

und Stößel, anschließend fand die Zertrümmerung und Pulverisierung mittels „Bead-Mill"

statt. Dazu wurden unter zweiminütiger Zwischenkühlung zwei Pulverisierungsintervalle von

jeweils 30 Sekunden bei 3000 rpm durchgeführt.

37

Anschließend konnte das Gelenkpulver in 2 ml steriler, physiologischer Kochsalzlösung

mittels „Mikro-Dismembranator“ 90 Sekunden zum vollständigen Aufschluss homogenisiert

werden. Das Homogenisat wurde für 10 min unter 3°C bei 3000 rpm zentrifugiert,

anschließend die Überstände abgenommen und nochmals bei 13000 rpm in einer kleineren

gekühlten Zentrifuge für 10 min zentrifugiert. Aus den Überständen wurde mittels BCA-

Assay der Gesamtproteingehalt bestimmt. Damit der Zytokingehalt in den verschiedenen

Gelenkextrakten vergleichbar wurde, wurden die mit ELISA bestimmten Konzentrationen

von IL-1β, IL-6, TNFα und IL-12 auf den Gesamtproteingehalt der Probe bezogen [pg/mg

Gesamtprotein].

3.2.15 STATISTIK

Die klinischen Daten als auch die im Labor ermittelten Werte stellen Einzeltierbestimmungen

dar, die zur Berechnung des Mittelwertes und des Standardfehlers (SEM, Standard Error

Mean) herangezogen wurden. Für die statistische Auswertung wurde das Softwareprogramm

„SPSS for Windows“ eingesetzt. Die Signifikanzprüfung von Gruppenunterschieden erfolgte

mit dem Mann-Whitney U-Test. Für die Korrelationsanalysen wurde der Korrelations-

koeffizient nach Pearson berechnet. Die Bewertung der Signifikanzen wurde wie folgt

vorgenommen (Tabelle 5):

Tabelle 5: Signifikanzniveau

Bezeichnung p Darstellung im Diagramm

Begrenzt signifikant 0,05-0,10 (*)

Signifikant 0,01-0,05 *

Sehr signifikant 0,001-0,01 **

Extrem signifikant < 0,001 ***

Die Darstellung der signifikanten Unterschiede erfolgt in den Abbildungen mit Symbolen.

38

39

4. ERGEBNISSE 4.1 LANGZEITSTUDIE

In der folgenden Studie wurde die chronische Phase der AIA von Wildtypmäusen (WT) mit

der von folgenden Knockout-Tieren verglichen:

TNFα-Knockout- (TNFα −/−)

TNFR1-Knockout- (TNFR1−/−) und

TNFR1,2-Knockout-Mäusen (TNFR1,2 −/−) verglichen.

Alle Mäuse wurden entsprechend dem einheitlichen Versuchsprotokoll immunisiert. Die

Arthritisinduktion fand am Tag 0 (d0) statt. Als klinisch relevante Parameter der AIA wurden

die Änderung der Gelenkschwellung und das Körpergewicht im Verlauf der Arthritis

gemessen. Nach Tötung der Tiere am Tag 21 erfolgte die Entnahme der Kniegelenke und der

Milz. Die histologische Bewertung der entzündlichen und destruktiven Veränderungen der

Kniegelenke wurde von einem unabhängigen Untersucher durchgeführt.

4.1.1 GELENKSCHWELLUNG

Alle vier Mausstämme reagierten auf die intraartikuläre Applikation des

Immunisierungsantigens mBSA mit einer starken Gelenkschwellung am Tag 1 (Abb. 1). Im

Gegensatz zum Wildtyp (WT), dessen Knieumfang am Folgetag nochmals zunahm, zeigten

die Knockout-Mäuse (KO-) einen Rückgang der Schwellung schon am Tag 2. In allen KO-

Stämmen sanken die Gelenkschwellungen zwischen Tag 5 und 7 etwa auf das Niveau der

Ausgangswerte vom Tag 0. In diesem Zeitraum ergaben sich signifikante Unterschiede zum

WT, dessen Werte zwar bis zum Tag 7 ebenfalls abfielen, dann aber konstant erhöht blieben.

Die starken Abfälle am Tag 21 bei der TNFα−/− und der TNFR1,2−/− Gruppe können mit einer

Gewichtsabnahme in diesen Gruppen in Zusammenhang gebracht werden. Die Verläufe der

Gelenkschwellungen und gerade der deutlich frühere Rückgang bei TNFα−/− bzw. TNF-

Rezeptorabwesenheit waren in zwei weiteren Langzeitstudien reproduzierbar.

40

Abb. 1: Verlauf der Gelenkschwellung während einer Langzeitstudie der AIA. Dargestellt sind die Mittelwerte der Gelenkschwellung der jeweiligen Mausstämme. Dem Wildtypstamm (n=10) sind in A) TNFα−/− (n=7), in B) TNFR1−/− (n=6) und in C) TNFR1,2−/− Mäuse (n=4) gegenübergestellt. Unter D) werden die Gelenkschwellungen der 3 Knockout-Gruppen miteinander verglichen. ((*)p<0,1,*p<0,05, **p< 0,01, U-Test verglichen mit dem WT)

4.1.2 HISTOLOGISCHE AUSWERTUNG

Zur histologischen Beurteilung der chronischen Phase der AIA wurden nach Tötung der Tiere

am Tag 21 Gelenkschnitte angefertigt und anschließend im HE-Schnitt ausgewertet. Folgende

Veränderungen gingen in die Bewertung ein: synoviale Hyperplasie, zelluläres Infiltrat,

41

Knorpelnekrosen und Pannusformation. Die ersten 2 Kriterien wurden im Entzündungsscore,

die beiden letzten im Destruktionsscore zusammengefasst.

Gelenkschädigungen traten bei allen Mäusen unabhängig vom Gendefekt auf. Abweichungen

beim Vergleich der Stämme wurden jedoch deutlich, als die Einzelergebnisse (Abb. 2, 3 und

4) der Langzeitstudien studienübergreifend zusammengefasst analysiert wurden (Tab. 6).

Dabei fiel auf, dass die Schäden bei Abwesenheit von TNFα bzw. der beiden TNF-

Rezeptoren milder ausgeprägt waren als beim WT und bei alleiniger Abwesenheit des

TNFR1. TNFR1−/− Tiere zeigten ein ähnlich breites Spektrum entzündlicher Veränderungen

wie der WT. Die Gelenke von TNFα−/− und TNFR1,2−/− Mäusen wiesen etwas weniger

schwere, aber häufiger leichtere Entzündungszeichen auf (Tab. 6). Diese Unterschiede waren

allerdings nicht signifikant. In den arthritischen Knien der TNFR1,2−/− Gruppe waren keine

Destruktionen vorhanden, bei TNFα−/− Mäusen waren sie seltener als unter den Wildtyptieren.

Die TNFR1−/− Tiere zeigten keine Veränderungen im Vergleich zum WT. Es muss allerdings

auf die insgesamt schwache, chronische Phase der AIA hingewiesen werden. Hinzukommt,

dass uns zur Untersuchung der Rezeptor-KO-Mäuse nur eine begrenzte Anzahl Tiere pro

Studie zur Verfügung stand.

Abb. 2: Histologische Veränderungen in der chronischen Phase der AIA am Tag 21. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment mit den Mittelwerten für arthritische WT (n=10), TNFα−/− (n=7), TNFR1−/− (n=6) und TNFR1,2−/− (n=4).

42

Tabelle 6 Auswertung der histologischen Veränderungen der chronischen Phase der AIA am Tag 21.

ENTZÜNDUNGSSCORE DESTRUKTIONSSCORE

SCORE

WT n= 28

TNFα −/−

n= 20 TNFR1 −/−

n= 11 TNFR1,2−/−

n= 8 WT

n= 28 TNFα −/−

n= 20 TNFR1 −/−

n= 11 TNFR1,2−/−

n= 8 0 25 % 5 % 27 % 12,5 % 81 % 95 % 81 % 100 %

0,5- 1,0 32 % 65 % 27 % 75 % 18 % 5 % 18 % -

1,5- 2,5 39 % 30 % 27 % 12,5 % - - - -

≥ 3,0 4 % - 18 % - - - - -

Tabellarische Zusammenfassung aller durchgeführten Langzeitstudien. Die Veränderungen wurden in keine (0), milde (0,5- 1,0), mittlere (1,5- 2,5) und starke arthritische Veränderungen (≥ 3) eingeteilt. Die relative Häufigkeit [%] ergibt sich aus der Anzahl der Tiere mit gleichem Schweregrad zur Gesamtzahl der Tiere dieses Stammes. In den Entzündungsscore gehen synoviale Hyperplasie sowie zelluläres Infiltrat, in den Destruktionsscore Knorpelnekrosen und Pannusformation ein.

43

Abb. 3: Linkes, nicht-arthritisches Kniegelenk einer C57BL/6-Maus vom Tag 21 der AIA mit femoro-patellarem (A), bzw. des femoro-tibialen Gelenkanteils (B). (F=Femur, K=Kapsel, M=Meniskus, P=Patella, SM=Synovialmembran, T=Tibia,)

Abb. 4: Rechtes, arthritisches Kniegelenk am Tag 21 der AIA vom (A) WT, (B) TNFα−/−, (C) TNFR1−/− und (D) TNFR1,2−/−. Dargestellt ist der femoro-patellare Gelenkspalt (Ds=Destruktion, EE=Entzündungszell- Exsudat, Pn=Pannus)

44

4.1.3 MILZGEWICHT UND KÖRPERGEWICHT

Aufgrund der Beeinflussung des Fettstoffwechsels durch TNFα und dem Einfluss auf die

Mikroarchitektur von Immunorganen wurden Milz- und Körpergewicht bestimmt (Beutler et

al. 1985, Pasparakis et al. 1996).

Alle Mausstämme reagierten auf die Arthritisinduktion mit einem Gewichtsverlust. Eine

Erholung findet zwischen Tag 3 und Tag 5 statt. Im Unterschied zum WT haben die KO-

Mäuse Schwierigkeiten, das Ausgangsgewicht von Tag 0 zu erreichen bzw. entwickeln im

Fall von TNFα−/− Tieren eine Art protrahierten Gewichtsverlust. Dies war in Folgestudien

reproduzierbar. Im Gegensatz dazu waren die Milzen bei den KO-Mäusen 21 Tage nach

Arthritisauslösung auffallend groß und wogen signifikant mehr als die Milzen in den

arthritischen Wildtypmäusen. Interessanterweise hatte sich bei immunisierten nicht-

arthritischen Tieren noch ein umgekehrtes Bild dargestellt. Insgesamt prägten sich diese Ver-

änderungen vor allem bei Abwesenheit von TNFα und beider TNF-Rezeptoren aus (Abb. 5).

Abb. 5: Dargestellt ist die Änderung des Körpergewichtes als prozentuale Abweichung zum Tag der Arthritisinduktion am Tag 0. Das relative Milzgewicht wurde anhand des Körpergewichts ermittelt. Die Abbildung zeigt die prozentuale Abweichung der Mittelwerte der jeweiligen Knockout-Gruppe vom Mittelwert des Wildtypstammes (100%) für immunisierte (d 0) und arthritische Tiere (d 21). (WT nd0/21=6/9, TNFα−/− nd0/21=7/4, TNFR1−/− nd0/21=7/5, TNFR1,2−/− nd0/21=4/4 ((*)p<0,1, *p<0,05 im Vergleich zum WT, U-Test)

45

4.2 KURZZEITSTUDIE ( I )

Die Gelenkschwellungsdaten aus der Langzeitstudie deuten auf Veränderungen in der akuten

Phase der AIA durch die TNFα- bzw. TNF-Rezeptordefizienz.

Inwieweit sich dies in den histologischen Befunden des Akutstadiums der Arthritis nieder-

schlagen würde, sollte mit einer Studie am 3. Tag nach Arthritisauslösung untersucht werden.

Zur Durchführung der Kurzzeitstudie standen uns zeitgleich alle vier Mausstämme zur Verfü-

gung : Wildtypmäuse C57BL/6 (WT), TNFα−/−, TNFR1−/− und TNFR1,2−/− Mäuse.

Alle Mäuse wurden nach dem einheitlichen Versuchsprotokoll immunisiert. Am Tag 0

erfolgte die Arthritisauslösung. Die arthritischen Wildtypmäuse dienten wiederum als

Kontrollgruppe für die KO-Tiere. Bis zum Tag 3 wurden einmal täglich die Knie-

gelenkschwellung und das Körpergewicht gemessen. Nach dem Töten aller Tiere am Tag 3

erfolgte die Entnahme der Kniegelenke mit anschließender histologischer Aufbereitung im

HE-Präparat.


Die Untersuchungen am Tag 1 zeigten, wie schon in den vorhergegangenen Langzeitstudien,

24 Stunden nach Arthritisinduktion eine offenbar TNFα-unabhängige, hyperakute

Schwellungsreaktion in allen vier Gruppen. Am Folgetag zeigten sich Unterschiede im

Verlauf der Gelenkschwellung zum WT, die nochmals eine Zunahme des Knieumfangs

aufwiesen, und den KO-Mäusen mit deutlich abgefallenen Werten. Die Maxima der

Gelenkschwellung waren wiederum bei den Wildtypmäusen stärker und lang anhaltender als

bei den transgenen Tieren. Die Unterschiede am Tag 3 fielen dementsprechend aus: Die KO-

Tiere lagen 40 % unter den Werten der Wildtypmäuse, für TNFα−/− Mäuse war dies

signifikant (Abb. 6).

46

Abb. 6: Verlauf der Gelenkschwellung während einer Kurzzeitstudie der AIA. Dargestellt sind die Mittelwerte der Gelenkschwellung der jeweiligen Mausstämme. Dem WT (n=10) sind in A) TNFα−/− (n=6), in B) TNFR1−/− (n=7) und in C) TNFR1,2−/− Mäuse (n=4) gegenübergestellt. Unter D) werden die Gelenkschwellungen der 3 KO-Gruppen miteinander verglichen. ((*)p<0,1 verglichen mit dem WT, U-Test)

4.2.2 HISTOLOGISCHE AUSWERTUNG

Die histologische Beurteilung der entzündlichen und destruktiven Veränderungen erfolgte wie

schon in der Langzeitstudie getrennt für jede Einzelstudie (Abb. 7, 8 und 9) und als

Zusammenfassung aller Studienergebnisse anhand der Schweregrade (Tab. 7): keine, milde,

mittelstarke und starke Veränderung. Alle Mäusestämme zeigten histologisch

Entzündungszeichen, die in der überwiegenden Anzahl den schweren Veränderungen

zugerechnet wurden. Es zeigten sich keine Unterschiede in der Arthritisausprägung zum WT

(Abb. 6, Tab. 7).

Auch bei der Beurteilung der destruktiven Veränderungen konnten keine signifikanten

Unterschiede zum Wildtyp festgestellt werden. Der Destruktionsscore ist bei der TNFR1,2−/−

47

Gruppe aufgrund der geringen zur Verfügung stehenden Tierzahl nur eingeschränkt zu

interpretieren.

Abb. 7: Histologische Veränderungen in der akuten Phase der AIA am Tag 3. Dargestellt ist ein repräsentatives Experiment mit den Mittelwerten für arthritische WT (n=10), TNFα −/− (n=6), TNFR1 −/− (n=7) und TNFR1,2 −/− Tiere (n=4).

Tabelle 7 Histologische Veränderungen der akuten Phase der AIA am Tag 3.

ENTZÜNDUNGS-SCORE DESTRUKTIONS-SCORE

Score WT n= 16

TNFα−/−

n= 12 TNFR1−/−

n= 13 TNFR1,2−/−

n= 4 WT

n= 16 TNFα−/−

n= 12 TNFR1−/−

n= 13 TNFR1,2−/−

n= 4 0 6 % - - - 63 % 50 % 62 % 25 % 0,5- 1,0 6 % 8 % 15 % - 37 % 50 % 31 % 50 % 1,5- 2,5 31 % 33 % 46 % 25 % - - 7 % 25 %

≥ 3,0 56 % 58 % 38 % 75 % - - - -

Tabellarische Zusammenfassung aller durchgeführten Langzeitstudien. Die Veränderungen wurden in keine (0), milde (0,5- 1,0), mittlere (0,5-2,5) und starke arthritische Veränderungen (≥ 3,0) eingeteilt. Die relative Häufigkeit [%] ergibt sich aus der Anzahl der Tiere mit gleichem Schweregrad zur Gesamtzahl der Tiere dieses Stammes (n). In den Entzündungsscore gehen synoviale Hyperplasie sowie zelluläres Infiltrat, in den Destruktionsscore Knorpelnekrosen und Pannusformation ein.

48

Abb. 8: Linkes nicht-arthritisches Kniegelenk einer C57BL/6-Maus vom Tag 3 der AIA mit tibio-fibulären (A), bzw. des femoro-patellaren Gelenkanteils (B). (M= Meniskus, F= Femur, T= Tibia, P= Patella, K= Kapsel, SM= Synovialmembran)

Abb. 9: Rechtes Kniegelenk am Tag 3 der AIA vom (A) WT, (B) TNFα−/−, (C) TNFR1−/− und (D) TNFR1,2−/−. Dargestellt ist der femoro-tibiale Gelenkspalt (Ds=Destruktion, EE=Entzündungszell- Exsudat, EI=Entzündungszell-Infiltrat, Pn=Pannus)

49

4.2.3 MILZGEWICHT UND KÖRPERGEWICHT

Der Langzeitverlauf hatte Auffälligkeiten sowohl im Gewichtsverhalten als auch in der Milz-

größe ergeben. In der Kurzeitstudie deutet sich bei TNFα−/− und TNFR1,2−/− Stamm im Ver-

gleich zum WT wiederum ein gewisser protrahierter Gewichtsverlust an. Für TNFR1−/− trifft

dies nicht zu, wobei dieser im Gegensatz zu den anderen Gruppen eine signifikante Erhöhung

des Milzgewichtes aufwies (Abb. 10).

Abb. 10: Dargestellt ist die Änderung des Körpergewichtes von WT (n=10), TNFα−/− (n=6), TNFR1−/− (n=7) und TNFR1,2−/− Stämme (n=4) als prozentuale Abweichung zum Tag der Arthritisinduktion am Tag 0 bzw. das Milzgewicht als prozentualer Anteil vom Körpergewicht am Tag 3. (**p<0,01, U-Test im Vergleich zum WT) 4.3 KURZZEITSTUDIE (II)

In der Kurzzeit- als auch in der Langzeitstudie entwickelten alle Mausstämme 24 Stunden

nach der Arthritisinduktion akute Kniegelenkschwellungen. Die Schwellungsreaktionen

waren jedoch bei Abwesenheit von TNFα- bzw. TNF-Rezeptoren im Gegensatz zum Wildtyp

von kürzerer Dauer. Die KO-Mäuse zeigten nach 48 Stunden zurückgehende

Gelenkschwellungen, der WT hingegen ein Schwellungsmaximum. Schwere histologische

Arthritisausprägungen traten jedoch trotz Abwesenheit von TNFα bzw. seiner Rezeptoren

auf. Vorhergegangene Untersuchungen an Gelenkextrakten (Kleinstäuber 2001) ergaben

Konzentrationsmaxima von TNFα, IL-1 und IL-6 für den 3. Tag der AIA. Die Auswirkungen

der vollständigen Abwesenheit von TNFα auf die lokalen Zytokinspiegel wurden deshalb für

diesen Zeitpunkt überprüft. Dazu wurden wiederum WT, TNFα−/−, TNFR1−/− und TNFR1,2−/−

50

nach bekanntem Schema immunisiert und ausgelöst. Am 3. Tag wurden die Tiere getötet und

die Kniegelenke zur Herstellung von Gelenkextrakten entnommen.


Die Verläufe der Kniegelenkschwellung bestätigten die Ergebnisse aus den vorangegangenen

Studien. Nach einer kurzen akuten Schwellungsreaktion am Tag 1 zeigten die KO-Mäuse im

Gegensatz zum Wildtyp schon am Tag 2 zurückgehende Werte. Am Tag 3 waren die

Unterschiede zum WT signifikant (Abb. 11).

Abb. 11: Gelenkschwellung im Verlauf einer Kurzzeitstudie. In die Darstellung gingen die Mittelwerte der der WT (n=5), TNFα−/− (n=7), TNFR1−/− (n=4) und TNFR1,2−/− Gruppe (n=3) ein. (*p<0,05, U-Test verglichen mit dem WT)

4.3.2 ZYTOKINE IN DEN GELENKEXTRAKTEN

Drei Tage nach Arthritisauslösung wurden die Tiere getötet. Wie unter 2.2.14. angegeben,

wurden aus den präparierten Knien Gelenkextrakte hergestellt und darin enthaltenes TNFα,

IL-1β, IL-6 und IL-12p70 mittels Sandwich-ELISA bestimmt. Die Ergebnisse waren ein-

deutig (Abb. 12): Bei kompletter Abwesenheit von TNFα bzw. seiner Rezeptoren waren die

proinflammatorischen Zytokine IL-1β und IL-6 zwar nachweisbar, jedoch im Vergleich zu

den arthritischen Wildtypmäusen um 50− 60 % vermindert. Diese Reduktionen waren

signifikant. Die TNFR1,2−/− Tiere wiesen die niedrigsten IL-1- und IL-6-Konzentrationen

51

auf, jedoch signifikant höhere TNFα-Werte als der WT, TNFα −/− und TNFR1−/− Tiere. Im

Unterschied zum Fehlen beider Rezeptoren, kommt es bei Abwesenheit des Rezeptor-1 nicht

zu einer gesteigerten TNFα-Freisetzung. Die Gehalt an IL-12 blieb vom TNFα- bzw. TNF-

Rezeptormangel unbeeinflusst.

Abb. 12: Zytokine in Gelenkextrakten vom Tag 3 der AIA. Dargestellt ist ein Vergleich der Mittelwerte

des WT (n=4) und A) TNFα−/− (n=5), B) TNFR1−/− (n=4) und C) TNFR1,2−/− Tieren (n=3). (*p<0,05 im

Vergleich zu WT, §p<0,05 im Vergleich zu TNFα −/−, Οp<0,05 im Vergleich zu TNFR1 −/−)

52

Um herauszufinden, ob die ermittelten Zytokine in den Gelenkextrakten in Zusammenhang

mit der klinischen Gelenkschwellung am Tag 3 standen, wurden Korrelationsanalysen durch-

geführt (Tab. 8). Der Pearson-Test ergab, dass signifikante Korrelationen zwischen der Höhe

der lokalen IL-1- und IL-6-Spiegel und der Stärke der Gelenkschwellung am Tag 3 bestanden

(Abb. 13). Da Letztere bei den KO-Tieren reduziert waren, zeigte sich damit eine indirekte

Abhängigkeit der Gelenkschwellung von der TNFα-Wirkung.

Tabelle 8 Korrelationsanalyse nach Pearson. Die Werte der Gelenkschwellung am 3. Tag nach Arthritisinduktion korrelieren mit den intraartikulären Zytokinkonzentrationen von IL-1 und IL-6 an diesem Tag.

IL-1β im Gelenkextrakt IL-6 im Gelenkextrakt

Gelenkschwellung d 3

Korrelationskoeffizient nach Pearson Signifikanzniveau p n

0,737

<0,001 (**) 16

0,791

<0,000 (**) 16

Abb. 13: Korrelationsanalyse nach Pearson zwischen der Gelenkschwellung am Tag 3 und den im Gelenkextrakt nachgewiesenen Konzentrationen von IL-1 und IL-6 zu diesem Zeitpunkt (n=16).

53

4.4 IMMUNOLOGISCHE PARAMETER DER AIA Die AIA als immunologisch induziertes Arthritismodell ist abhängig von zellulären und

humoralen Immunreaktionen. TNFα als proinflammatorisches Zytokin aktivierter

Makrophagen ist nicht nur ein potenter Mediator der angeborenen Immunabwehr, sondern

auch ein wichtiges Bindeglied zwischen spezifischer und unspezifischer Immunität.

Um zu überprüfen, ob das TNFα-Defizit oder der Mangel seiner Rezeptoren die der AIA

zugrunde liegenden, antigenspezifischen Immunreaktionen beeinflusst, wurden folgende

immunologischen Merkmale erfasst :

die antigenspezifische Lymphozytenfunktion in vivo und in vitro

die Makrophagenaktivität und -aktivierbarkeit in vitro

Untersuchung der Th1/Th2-Zytokin-Balance in vitro

Die entsprechenden Parameter wurden an Tieren im immunisierten bzw. arthritischen Zustand

bestimmt. Auf die Darstellung der zugehörigen klinischen und histologischen Befunde wird

im Folgenden verzichtet, da sie den unter 4.1. und 4.2. beschriebenen entstammen bzw.

entsprechend ausfielen.

4.4.1 IN-VITRO-PROLIFERATIONSTEST

Der Proliferationstest wurde mit dem BrDU-Agenz an Lymphknotenzellen akut arthritischer

Tiere (Tag 3) durchgeführt. Eine deutliche Stimulation konnte durch Zugabe von mBSA,

geringer auch durch Zugabe von Phorbol-Myristat-Acetat und Ionomycin (PMA+I) erreicht

werden. Die TNFα bzw. TNF-Rezeptor-Abwesenheit beeinflusste jedoch die Lymphknoten-

zellproliferation weder in unstimulierten noch in mBSA- bzw. PMA+Ionomycin-stimulierten

Kulturen (Tab. 9).

Tabelle 9 BrDU-Proliferationstest an Zellen aus inguinalen Lymphknoten arthritischer Mäuse am Tag 3 der AIA. Angegeben sind die Mittelwerte der Gruppen zusammen mit dem SEM (n=4/ Mausstamm)

BrDU-Proliferationstest [OD ± SEM]

Inguinaler LK, d3 AIA unstimuliert mBSA PMA+Ionomycin

WT 0,259 ± 0,008 0,365 ± 0,018 0,294 ± 0,022

TNFα −/− 0,245 ± 0,009 0,354 ± 0,016 0,307 ± 0,027

TNFR1 −/− 0,241 ± 0,010 0,368 ± 0,035 0,241 ± 0,030

TNFR1,2 −/− 0,229 ± 0,009 0,346 ± 0,025 0,258 ± 0,030

54

4.4.2 DTH-REAKTION

Die DTH (Delayed Type Hypersensitivity)-Reaktion als ein In-vivo-Test zur Überprüfung der

zellulären Immunreaktivität gegen das Antigen mBSA wurde mittels Ohrtest durchgeführt.

Nachdem der Test am 5. Tag nach Arthritisinduktion ausgelöst wurde, entwickelten alle

Mäuse eine Ohrschwellung. Allerdings zeigten die KO-Mäuse nach 24 h und 48 h geringere

Reaktionen auf die intradermale mBSA-Applikation als der WT. Signifikanzniveau erreichten

nur die 24 h-Werte (Abb. 14).

Abb. 14: DTH (Delayed Type Hypersensitivity). Die Überprüfung der DTH gegen das Immuni-sierungsantigen mBSA wurde 5 Tage nach Arthritisinduktion begonnen. 24 und 48 h später wurde die Ohrdicke gemessen. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM für arthritische WT (n=10), TNFα−/− (n=6), TNFR1−/− (n=7) und TNFR1,2−/− (n=4). ((*)p<0,1,*p<0,05 im Vergleich zu WT, U-Test)

4.4.3 SERUM-ANTIKÖRPER

Die AK gegen mBSA wurden im Serum immunisierter Mäuse, am 3., sowie am 21. Tag der

AIA bestimmt. Die Abwesenheit von TNFα oder seiner Rezeptoren störte die mBSA-Anti-

körperbildung während der Immunisierungsphase nicht, sodass kurz vor Arthritisinduktion

von gleichem Serumgehalt mBSA-spezifischer AK in allen Gruppen ausgegangen werden

konnte (Abb. 15). Auffallend ist allerdings, dass sich nach erneutem Antigenkontakt im

Rahmen der Arthritisauslösung Unterschiede im Serumgehalt zwischen WT und KO-Mäusen

zeigten. Bei Abwesenheit von TNFα bzw. der TNF-Rezeptoren sind nach Ausbruch der AIA

deutlich weniger mBSA-AK vorhanden als beim WT. 21 Tage nach Arthritisauslösung prägte

sich dies noch deutlicher aus: Im Serum aller 3 KO-Stämme befanden sich signifikant

weniger mBSA-AK.

55

Abb. 15: mBSA-spezifisches Gesamt-IgG im immunisierten Zustand (d 0) und nach Arthritis-auslösung am Tag 3 (d 3) , bzw. Tag 21 (d 21) der AIA. Dargestellt sind die Mittelwerte für den Wild- typ (nd0/3/21=6/7/7), TNFα−/− (nd0/3/21=7/4/4), TNFR1−/− (nd0/3/21=7/7/5) und TNFR1,2−/− Mäuse (nd0/3/21=4/4/4). (*p<0,05, **p<0,01, U-Test im Vergleich zum WT) Entsprechend den mBSA-Antikörpern wurden AK gegen Knorpelmatrixbestandteile wie

Proteoglykane (PG), Kollagen Typ I (K I) und Typ II (K II) im Serum bestimmt (Abb. 16). Im

immunisierten Zustand unterschieden sich die Mausstämme untereinander minimal, obgleich

der TNFR1,2−/− Stamm kontinuierlich zu geringeren AK-Spiegeln tendierte. Antikörper gegen

Proteoglykane waren am Tag 3 in den Rezeptor-KO-Gruppen signifikant reduziert. TNFα−/−

Mäuse zeigten allerdings teilweise höhere AK-Konzentrationen als die Wildtypmäuse. Wie

schon bei den mBSA-AK sind die Matrix-AK nach 21 Tagen AIA im Vergleich zum Wildtyp

deutlich reduziert. Am deutlichsten zeigt sich dies wiederum bei Abwesenheit beider TNF-

Rezeptoren.

56

Abb. 16: Serum-AK am Tag 21 der AIA. Es wurden die Immunglobulin-Subklassen der mBSA- spezifischen AK (IgM, IgG, IgG1, IgG2b) und die matrixspezifischen AK gegen Kollagen Typ I und II, sowie Proteoglykane bestimmt. Dargestellt sind die Mittelwerte für den WT (n=7), TNFα−/− (n=4), TNFR1−/− (n=5) und TNFR1,2−/− (n=4). (*p<0,05, **p<0,01, U-Test im Vergleich zum WT)

4.4.4 UNTERSUCHUNG DER MAKROPHAGENAKTIVITÄT

Bei der AIA kommt es neben einer lokalen auch zu einer systemischen Aktivierung von

Makrophagen (MΦ), nachweisbar durch erhöhte Spiegel von TNFα, IL-1 und IL-6 (Simon et

al. 2001). Peritonealmakrophagen (PMΦ) eignen sich deshalb für die Bestimmung der

systemischen Grundaktivität in vivo sowie für In-vitro-Stimulationsversuche. Letztere

kennzeichnen die funktionelle Kapazität der MΦ, u.a. bei der Reaktion auf infektiöses

Material im Rahmen von Abwehrvorgängen. Bakterielles Endotoxin (LPS) zusammen mit

IFN-γ ist solch ein starkes Stimulanz der TNFα-Freisetzung. Bei den folgenden Messungen

wurden PMΦ aus immunisierten oder akut bzw. chronisch arthritischen Mäusen präpariert

und anschließend unstimuliert bzw. mit LPS+IFN-γ stimuliert. Die Kulturüberstände wurden

mittels Sandwich-ELISA auf TNFα, IL-1β, IL-6 und IL-12 überprüft.

57

TNFα-FREISETZUNG

TNFα war bei allen Messungen nur nach Stimulation mit LPS+IFN-γ nachweisbar. Die

TNFα−/− Mäuse produzierten wie erwartet kein TNFα. Bei Abwesenheit des TNF-R1 traten

bei immunisierten und akut-arthritischen Mäusen keine Unterschiede zum WT auf. In der

chronischen Phase allerdings zeigte sich eine verstärkte Freisetzung von TNFα. Ähnliches

wurde für die Abwesenheit beider Rezeptoren beobachtet: Im Unterschied zu den Mäusen von

Tag 0 und 3, die weniger TNFα produzierten als der WT, wiesen am Tag 21 diese Mäuse

erhöhte TNFα-Konzentrationen auf (Abb. 17 A, B, C).

IL-1β-FREISETZUNG

Vor Arthritisauslösung war IL-1β nur nach Stimulation messbar (Abb. 17 D, E, F). Zu diesem

Zeitpunkt wiesen alle KO-Mäuse signifikant weniger IL-1 auf als der WT. Mit

Arthritisausbruch ändert sich dies deutlich. Am Tag 3 der AIA produzierten bereits

unstimulierte MΦ aller Stämme spontan IL-1 als Zeichen der systemischen Aktivierung. Dies

blieb bis zum Tag 21 erhalten. Unter Stimulation fiel bei TNFα−/− und TNFR1−/− nach

Arthritisausbruch eine verstärkte IL-1-Freisetzung im Vergleich zum WT in der akuten aber

vor allem in der chronische Phase auf. Nachdem bei TNFR1,2−/− die IL-1-Freisetzung am Tag

3 noch geringer als beim WT ausgefallen war, konnte ebenfalls eine erhöhte IL-1-

Konzentrationen stimulierter PMΦ am Tag 21 beobachtet werden. IL-6-FREISETZUNG

Auch IL-6 konnte bei immunisierten Tieren nur nach Stimulation nachgewiesen werden (Abb.

17 G, H, I). Stimulierte PMΦ von KO-Tieren setzten zu diesem Zeitpunkt signifikant weniger

IL-6 frei als der WT. Nach Arthritisausbruch kommt es bei allen Mausstämmen zu einer

beträchtlichen spontanen IL-6-Sekretion, ebenfalls wieder als Zeichen der systemischen

Aktivierung zu deuten. In der akuten und vor allem in der chronischen Arthritisphase

produzierten die unstimulierten PMΦ aus KO-Mäusen jedoch weniger IL-6 als der WT.

Auffallend war jedoch, dass die Stimulierbarkeit von TNFα−/− und TNFR1−/− PMΦ in der

chronischen Phase im Gegensatz zur relativen Abnahme der Stimulierbarkeit von WT- PMΦ

persistierte. Letzteres bestätigte sich nicht für den TNFR1,2−/− Stamm, der sich mit der

Kinetik der IL-6-Stimulierbarkeit weitestgehend ´parallel´ zum WT verhielt.

58

59

Abb. 17: In-vitro-Zytokinbestimmung kultivierter Peritonealmakrophagen. In den Überständen von unstimulierten (d0,d3,d21) und LPS/IFN-γ-stimulierten (d0+,d3+, d21+) PMΦ gemessene Zytokine: TNFα, IL-1β, IL-6, IL12p70. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM im Vergleich zum WT (nd0/3/21=6/7/7): TNFα−/− (nd0/3/21=7/4/4), TNFR1−/− (nd0/3/21=7/7/5) und TNFR1,2−/− (nd0/3/21=4/4/4). ((*)p<0,1. *p<0,05. **p<0,01. U-Test im Vergleich zum WT)

IL-12-FREISETZUNG

Auch IL-12p70 wurde bei immunisierten Tieren nur nach Stimulation freigesetzt (Abb. 17 J,

K, L). Hier wiesen vor allem TNFα−/− und TNFR1−/− stark erhöhte Konzentrationen in den

Überständen auf. Alle Mausstämme produzierten nach Arthritisausbruch spontan IL-12,

wobei vor allem am Tag 21 TNFα−/− und TNFR1−/− PMΦ signifikant höhere Spiegel als der

WT freisetzten. Die IL-12-Konzentrationen bei den TNFR1,2−/− PMΦ waren im Verlauf der

AIA zwar ebenfalls erhöht im Vergleich zum WT, dieser Unterschied war jedoch schwächer

als bei den beiden anderen KO-Stämmen ausgeprägt. Unabhängig vom Zeitpunkt der AIA

produzierten die PMΦ aller KO-Stämme im stimulierten Zustand signifikant mehr IL-12 als

der WT.

4.4.5 Th1/Th2-BALANCE IM LYMPHKNOTEN

An der AIA sind sowohl Th1- als auch Th2-Zellen beteiligt. IFN-γ als typisches Th1-Zytokin

und IL-4 als typisches Th2-Zytokin wurden vor und nach der Arthritisauslösung in Zellkultur-

überständen von kultivierten Lymphknotenzellen bestimmt (Abb. 18).

Lymphknotenzellen aus immunisierten KO-Mäusen produzierten IFN-γ in ähnlichen Kon-

zentrationen wie der WT. Insbesondere konnten bei allen Stämmen Reaktionen auf das

Immunisierungsantigen mBSA provoziert werden.

Nach 3 Tagen AIA setzen die Lymphknotenzellen aus den KO-Tieren deutlich mehr IFN-γ

frei als der WT. Dies blieb nicht auf die mBSA-Stimulation begrenzt, sondern zeigte sich

auch in unstimulierten bzw. PMA+Ionomycin-stimulierten Zellkulturen. IL-4 wurde weder im

unstimuliertem Zustand noch unter mBSA-Einwirkung von Lymphknotenzellen produziert.

Nach PMA+I-Stimulation allerdings fielen erhöhte Werte für die KO-Tiere auf.

Nach mBSA-Stimulation ist bei den KO-Mäusen die Th1/Th2-Balance stärker in Richtung

Th1 verschoben als beim WT. Bei PMA+I-Stimulation ist allerdings durch die gleichzeitige

Erhöhung von IFN-γ und IL-4 die Th1/Th2-Balance kaum beeinflusst.

60

Abb. 18: Th1/Th2-Balance in Überständen kultivierter Lymphknotenzellen. Die IFN-γ-, bzw. IL-4-Konzentrationen wurden in Lymphknoten immunisierter Tiere (d0) und arthritischer Tiere (d3) in unstimulierter, mBSA- bzw. PMA+I-stimulierter Zellkultur bestimmt. Messbare IL-4-Konzentrationen waren sowohl bei Zellkulturen aus immunisierten als auch aus arthritischen Mäusen nur nach PMA+I-Stimulation vorhanden (n.n.= nicht nachweisbar). Es wurden die Mittelwerte des WT (nd0/3=6/6) mit denen von TNFα−/−(nd0/3=7/6), TNFR1−/−(nd0/3=7/6) und TNFR1,2−/−(nd0/3= 4/4) verglichen. ((*)p<0,1, *p<0,05, U-Test verglichen mit dem WT)

5. DISKUSSION

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Bedeutung TNFα-abhängiger und

unabhängiger Mechanismen im Verlauf der Antigen-induzierten Arthritis (AIA).

TNFα spielt eine entscheidende Rolle bei der Induktion und Perpetuierung der entzündlichen

und destruktiven Mechanismen im Rahmen der RA (Dinarello & Moldawer 2000). Erhöhte

TNFα-Spiegel sind in der Synovialflüssigkeit und im Serum von RA-Patienten nachweisbar

(Feldmann et al. 1996). In den vergangenen Jahren konnte mit der Entwicklung von TNFα-

blockierenden Substanzen ein beeindruckender neuer Therapieansatz etabliert werden.

Insbesondere Patienten mit therapierefraktären RA-Verläufen profitieren von dieser

Wirkstoffgruppe. Ein weiterer Vorteil besteht in der Beeinflussbarkeit früher RA-Stadien und

der Protektion gegenüber den Destruktionsprozessen (Feldmann & Maini 2003).

Im Vorfeld des klinischen Einsatzes war auf der Grundlage von zahlreichen In-vitro- und In-

vivo-Experimenten die Bedeutung von TNFα für den Pathogeneseprozess der RA untersucht

worden. Beeindruckend ist der Zusammenhang zwischen der Überexpression von TNFα in

der transgenen Tg917-Maus und der Ausbildung einer spontanen erosiven Polyarthritis, die

wiederum durch einen Anti-TNF-AK komplett verhindert werden konnte (Keffer et al. 1991).

Dies unterstreicht die pathogenetische Bedeutung erhöhter TNFα-Spiegel und unterstützt den

therapeutischen Einsatz TNF-blockierender Substanzen.

Dennoch profitieren nicht alle Patienten mit chronisch aktiver, therapierefraktärer RA von der

Anti-TNF-Therapie. Ungefähr ein Drittel der Patienten reagiert nicht auf diese Behandlung.

Fraglich ist, ob TNFα-unabhängige Mechanismen oder eine ungenügende lokale bzw. syste-

mische Antikörperkonzentration die fehlende Ansprechbarkeit bedingen. Letzterem könnte

durch individuelle Dosisanpassungen entgegnet werden, dies aber mit dem nicht zu unter-

schätzenden Risiko stärkerer Nebenwirkungen. Solche sind zwar bisher nur in begrenzten

Umfang in Erscheinung getreten, müssen aber in Zusammenhang mit der immun-

modulatorischen Funktion von TNFα, vor allem hinsichtlich der Langzeitanwendung, abge-

klärt werden. Es gibt Hinweise, dass unter der TNF-Blockade neben einer höheren Inzidenz

infektiöser Zwischenfälle die Ausbildung sekundärer Autoimmunphänomene getriggert wird

(O'Shea et al. 2002, Day 2002).

Experimentelle Arthritismodelle wie die AIA eignen sich insbesondere zur Klärung von

pathogenetischen Teilaspekten der humanen RA. Im Rahmen der TNFα-Forschung betrifft

dies insbesondere folgende Fragestellungen :

61

Besteht eine Schlüsselfunktion von TNFα im Sinne einer Zytokinkaskade ?

Welche anderen Zytokine oder Mechanismen wirken synergistisch mit TNF oder ver-

mitteln proinflammatorische Aktivitäten unabhängig von TNFα ?

Welche Nebenwirkungen insbesondere immunologischer Art treten bei einer anhalten-

den (therapeutischen) TNF-Blockade auf ?

Am Modell der AIA konnte die Rolle von TNFα bisher nicht eindeutig geklärt werden. Ob-

wohl zum Zeitpunkt der Immunisierung und der Arthritisauslösung erhöhte lokale und

systemische TNFα-Konzentrationen gemessen wurden (Simon et al. 2001), erbrachten Anti-

TNFα-AK-Studien unterschiedliche Ergebnisse. Van de Loo et al. (1995b) stellen die Be-

teiligung von TNFα an der AIA in Frage, nachdem die Applikation eines Anti-TNFα-AK, im

Gegensatz zur Blockade von IL-1, keinerlei Auswirkungen auf die AIA hatte. Kleinstäuber

hingegen konnte mit dem gleichen AK eine Reduktion der klinischen und histologischen

Parameter sowie eine Beeinflussung der lokalen IL-1- und IL-6-Konzentrationen beobachten

(Kleinstäuber 2001). Die abweichenden Studienergebnisse müssen möglicherweise auf die

unterschiedliche Applikationsart, das Applikationsschema und die Dosierung des AK zurück-

geführt werden.

Einen attraktiven Ansatz zur Klärung dieser Fragen bietet das System der „Knockout-Maus“

(KO-Maus). In diesen Tieren wurden bestimmte Gene gegen defekte, also funktionslose Gen-

Kopien ausgetauscht. Das zugehörige Verfahren beinhaltet die In-vitro-Deletion des Gens mit

anschließendem Transfer in das Blastozystenstadium einer sich entwickelnden Maus. Die

dadurch entstehendenden heterozygoten Mäuse bringen nach entsprechender Züchtung

homozygote Nachkommen hervor, denen dieses Genprodukt vollständig fehlt (Mansour et al.

1988, Janeway 2002).

In der vorliegenden Arbeit wurden TNFα-, TNF-Rezeptor-1-, und TNF-Rezeptor-1,2-KO-

Mäuse untersucht, um festzustellen,

ob sich der Verlauf und die Schwere der Antigen-induzierten Arthritis vom

Wildtypstamm unterscheidet,

inwieweit die Ergebnisse der Antikörperstudien erweitert werden können,

ob Veränderungen der immunologische Merkmale der AIA auftraten und

inwieweit sich die KO- Stämme untereinander unterscheiden.

Der Vorteil des KO-Systems besteht in der Möglichkeit, eine komplette Blockade von TNFα

zu imitieren, die mit der Applikation von AK trotz hoher Konzentrationen unerreicht bleibt.

Weiterhin wird die potenzielle Gefahr der Immunogenität von Antikörpern und damit einher-

62

gehende Interpretationsschwierigkeiten der Ergebnisse umgangen. Unterschiede bestehen hin-

sichtlich der Ausgangsbedingungen der beiden Systeme: im AK-System werden erhöhte

TNFα-Spiegeln reduziert, im Organismus der KO-Maus besteht eine obligatorische Ab-

wesenheit dieses Zytokins. Unter diesem Gesichtspunkt ergeben sich möglicherweise

interessante Hinweise auf potenzielle Kompensationsmechanismen, die in der vorliegenden

Untersuchung mitberücksichtigt werden sollten.

5.1 VERLAUF UND SCHWERE DER AIA

Zur Einschätzung der klinischen und histologischen Merkmale der AIA bei den KO-Mäusen

wurden in Kurz- und Langzeitstudien der klinische Verlauf der AIA anhand der Gelenk-

schwellung beobachtet. Die histopathologische Beurteilung des Schweregrades der Arthritis

erfolgte am Versuchsende anhand der entzündlichen und destruktiven Arthritiszeichen.

Wildtypmäuse (WT) dienten als Kontrollgruppe zu den KO-Mäusen.

Die akute Schwellungsreaktion am Tag 1 nach Arthritisinduktion war bei allen Mäusen unab-

hängig vom Mausstamm gleich stark ausgeprägt. Dies spricht gegen eine TNF-Abhängigkeit

der hyperakuten AIA. Dieser Phase liegt eine Arthusreaktion zugrunde, die gekennzeichnet ist

durch die Bildung von Immunkomplexen zwischen injiziertem mBSA und mBSA-

spezifischen AK (Cooke et al. 1983, Bräuer et al. 1988). Die Immunkomplexe aktivieren das

Komplementsystem und binden an Fc-Rγ auf Mastzellen, Leukozyten und MΦ. Dies führt zur

Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren und zur Initiierung der Entzündung (Mansour

et al. 1988, Janeway 2002). Im Serum vollständig immunisierter KO- und WT-Mäuse waren

vergleichbare Mengen an mBSA-spezifischen AK vorhanden, sodass eine akute

Entzündungsreaktion durchaus zustande kommen konnte. Es bestehen Hinweise, dass Immun-

komplexe starke Aktivatoren der IL-1-Freisetzung sind. Dieses Zytokin verfügt wie TNFα

über potente proinflammatorische und destruktive Eigenschaften. Insbesondere für die AIA

wird IL-1 als ein besonders relevanter Mediator diskutiert (van den Berg 2001). Am Modell

der Immunkomplex-vermittelten Arthritis (ICA) konnte durch die Applikation von Anti-IL-1-

AK sowohl die klinische als auch die histologische Gelenkschädigung verhindert werden. Im

Gegensatz dazu zeigten Anti-TNF-AK keine Wirksamkeit (van Lent et al. 1995).

Neben IL-1 existieren mit IL-15, IL-18, GM-CSF und IL-12 weitere Makrophagenzytokine,

die Entzündungsreaktionen bei Abwesenheit von TNFα vermitteln könnten (Burmester et al.

1997, Arend 2001). Die aus Mastzellen stammenden Proteasen Histamin und Tryptase

(McLachlan et al. 2003) oder die entzündungsfördernden Leukotriene und Prostglandine sind

ebenfalls potente Entzündungsmediatoren der akuten Phase.

63

48 Stunden nach der Arthritisinduktion zeigten TNFα-defiziente Mäuse regelmäßig

abfallende Gelenkschwellungen, im Gegensatz zu den Kontrolltieren, die zu diesem Zeitpunkt

Schwellungsmaxima entwickelten. In diesem Zeitraum kommt es bei der AIA zur zunehmen-

den Einwanderung von mBSA-spezifischen CD4+ Gedächtniszellen (Bräuer et al. 1988).

Diese Zellen werden durch das Ag aktiviert und sezernieren IFN-γ, welches wiederum MΦ

und Mastzellen stimuliert, Chemokine und proinflammatorische Mediatoren freizusetzen.

Diesem Prozess liegt eine verzögerte Überempfindlichkeitsreaktion zugrunde, die Folge der

Immunisierung gegen mBSA ist.

Mit dem DTH-Test kann diese Reaktionskaskade in vivo separat überprüft werden. In Über-

einstimmung mit der reduzierten Gelenkschwellung 48 h nach Arthritisauslösung zeigten die

KO-Mäuse verminderte DTH-Werte. Andere Untersuchungen an TNF-KO-Mäusen fanden

ebenfalls reduzierte DTH-Reaktionen (Pasparakis et al. 1996, Wilhelm et al. 2001).

Die DTH ist sowohl abhängig von einer ausreichenden Anzahl Ag-spezifischer Gedächtnis-

zellen als auch von der Induzierbarkeit einer lokalen Entzündungsreaktion. Die Möglichkeit

einer Funktionsstörung der T-Zellen bzw. einer geringeren Anzahl mBSA-spezifischer Zellen

konnten wir durch In-vitro-Teste an immunisierten Mäusen ausschließen: in Kulturen von

Lymphknotenzellen traten weder nach mBSA- noch nach polyklonaler Stimulation

Proliferationsstörungen auf. Auch bei anderen T-Zell-abhängigen Modellen wie der Kollagen-

induzierten Arthritis (CIA) oder der Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) waren bei

TNFα−/− Mäusen keine Proliferationsunterschiede, insbesondere nicht nach Stimulation mit

den jeweiligen Immunisierungsantigenen feststellbar (Liu et al. 1998, Campbell et al. 2001).

Damit kann die Beeinflussung der Ag-spezifischen Komponente als Ursache der verminder-

ten DTH-Reaktion in den KO-Mäusen weitgehend ausgeschlossen werden. Aus zahlreichen

Untersuchungen geht allerdings hervor, dass sich TNFα vorrangig an der Effektorphase von

lokalen Entzündungen beteiligt (Biedermann et al. 2000). Dies wird unter 4.3. ausführlicher

diskutiert.

Die verkürzte klinische Entzündungsreaktion lies sich auf histologischer Ebene nicht nach-

vollziehen. Am Tag 3 der AIA traten entzündliche und destruktive Veränderungen auf, die

dem Ausprägungsgrad des WT entsprachen. Der vorzeitige Rückgang der Gelenkschwellung

bei den KO-Tieren schlägt sich demzufolge nicht in einer Reduktion des Gelenkschadens

nieder.

Ein Erklärungsansatz für diese Diskrepanz ist die zeitliche Verzögerung zwischen klinischer

Entzündung und entsprechendem morphologischen Korrelat. Die histologische Gelenk-

schädigungen am Tag 3 würde demnach eher die starke akute Schwellungsreaktion von Tag 1

64

reflektieren. Da diese bei allen Tieren unabhängig vom Mausstamm gleich stark ausgeprägt

war, kann ein ähnliches Ausmaß an Gewebeschädigung erwartet werden. Untersuchungen

von Simon et al. ( 2001) zeigten, dass bei der AIA das Maximum der Gelenkschwellung

zeitlich vor dem Maximum der histologischen Veränderungen liegt. Das histologische

Korrelat der verkürzten Schwellungsphase der KO-Tiere würde sich demnach erst später

manifestieren.

Die Befunde aus der Langzeitstudie sind diesbezüglich jedoch nicht überzeugend: die KO-

Mäuse entwickelten auch in der chronischen Phase der AIA teilweise schwere entzündliche

Veränderungen. Jedoch fällt auf, dass bei Abwesenheit von TNFα und etwas deutlicher bei

Abwesenheit beider TNF-Rezeptoren mehr Mäuse zu schwächeren Arthritismerkmalen

tendieren als der WT. TNFα−/− und TNFR1,2−/− Mäuse zeigten in der überwiegenden Anzahl

der Fälle keine Destruktionen im chronischen Stadium der AIA. Interessant erscheint, dass

der TNF-R2 offensichtlich die Abwesenheit des TNFR1 kompensieren kann, da TNFR1−/−

Mäuse ähnlich starke Veränderungen wie der Wildtyp aufwiesen. Es muss in diesem

Zusammenhang jedoch auf die geringe Anzahl zur Verfügung stehender TNFR1,2−/−

Versuchstiere hingewiesen werden.

Ein weiterer Erklärungsansatz für die Diskrepanz zwischen TNF-beeinflusster Gelenk-

schwellung und TNF-unabhängiger Gelenkschädigung wäre, dass sich beide unabhängig

voneinander entwickeln. Ähnliches wurde auch bei der SCWI-Arthritis nach Applikation von

Anti-TNFα-AK beobachtet. Diese konnten zwar die Gelenkschwellung, aber nicht den

Gelenkschaden beeinflussen. Durch Applikation von Anti-IL-1-AK hingegen konnte die

Knorpelschädigung reduziert werden (Kuiper et al. 1998). Ein starker IL-1-Einfluss wird auch

für die AIA vermutet (van de Loo et al. 1995a, Ghivizzani et al. 1998, Joosten et al. 1999). Im

Gegensatz zur TNF-Blockade, die nur die akute Gelenkschwellung verminderte, war mit der

IL-1-Blockade auch eine Reduktion des chronischen Gelenkschadens möglich.

Interessanterweise konnte durch die Kombination beider Hemmstoffe eine stärkere Protektion

erreicht werden (Ghivizzani et al. 1998). Andere Untersuchungen wiederum fanden keine

Auswirkungen der IL-1-Blockade auf die klinischen und histologischen Merkmale der AIA

(Wooley et al. 1993).

Auch bei der humanen RA lassen sich die tatsächlichen Gelenkschäden nur in begrenztem

Maß anhand des klinischen Verlaufes vorhersagen. Mulherin et al. (1996) betonen, dass sich

der Prozess der Gelenkschädigung trotz Rückgang der klinisch messbaren Krankheitsaktivität

fortsetzen kann. In diesem Zusammenhang wird insbesondere auf die Bedeutung der frühen

Gelenkentzündung hingewiesen, von der angenommen wird, dass sie einen entscheidenden

65

Stimulus für die Progression der Gewebeschädigung darstellt (Sharp et al. 1991). Bezogen auf

die AIA der KO-Mäuse würde dies bedeuten, dass die Intensität der Gelenkschwellung am

Tag 1 ausgereicht hat, um den Gewebe schädigenden Prozess in Gang zu setzen. Der vor-

zeitige Schwellungsrückgang am Tag 2 beeinflusst möglicherweise die Ausprägung des

morphologischen Gelenkschadens im weiteren Krankheitsverlauf nur noch marginal.

Untersuchungen von TNF-KO-Mäusen am Modell der CIA und dem Serumtransfermodell der

K/BxN-Maus beobachteten ähnliche Verläufe. In beiden Modellen ist die Inzidenz der

Arthritis bei TNF-Abwesenheit zwar geringer als beim WT, sobald jedoch eine

Gelenkaffektion auftrat, kam es zur Progression des Krankheitsverlauf mit unverändert

schwerer chronischer Gelenkschädigung (Campbell et al. 2001, Ji et al. 2002). Die

intraartikuläre Injektion von Ag zur Auslösung der AIA stellt im Vergleich zur CIA und zum

Serumtransfermodell einen sehr aggressiven lokalen Stimulus dar. Dies zeigt sich u.a. in der

100 %igen Inzidenz der AIA in Normaltieren. Falls die KO-Mäuse tatsächlich eine höhere

Entzündungsschwelle als der WT hätten, ist diese bei der AIA-Auslösung vermutlich leichter

überschritten worden, als bei den erwähnten systemisch induzierten Arthritismodellen.

Die durch den Anti-TNF-AK erreichte Reduktion der histopathologischen Arthritismerkmale

(Kleinstäuber 2001) lässt sich in den hier vorliegenden Untersuchungen nicht nachvollziehen.

In diesem Zusammenhang muss auf die unterschiedlichen Ausgangsbedingungen von KO-

und AK-System hingewiesen werden. Diese bestanden beim AK-System darin, dass hohe

TNF-Spiegel nachweislich reduziert werden konnten. KO-Mäuse setzen hingegen zu keinem

Zeitpunkt TNFα frei. Obwohl diese Tatsache für sich das Vorhandensein von

Kompensationsmechanismen in der KO-Maus impliziert, sprechen die vorliegenden

Untersuchungen gegen eine Schlüsselfunktion von TNFα bei der AIA.

Damit zeigt das KO-Modell interessante Parallelen zur medikamentösen TNF-Blockade beim

RA-Patienten. Nicht alle Patienten mit chronisch aktiver, therapierefraktärer RA profitieren

von der Anti-TNF-Therapie. Dies betrifft studienübergreifend ca. 30− 50% der Teilnehmer

(Moreland 1999). Untersuchungen an RA-Synovialbiopsien weisen nicht nur auf TNF-

unabhängige histopathologische Subgruppen, sondern auch auf verschiedene

Genexpressionsmuster hin (Klimiuk et al. 1997). Aufschlussreich ist in dieser Hinsicht auch

der von Ulfgren et al. (2000) durchgeführte Vergleich zwischen prätherapeutischen TNF-

Spiegeln und der Ansprechrate auf Infliximab©: die Patienten mit den niedrigsten TNF-

Spiegeln sprachen am wenigsten auf die Therapie an. Unsere Untersuchungen an TNF- und

TNF-Rezeptor-KO-Mäusen bestätigen diese Beobachtung auch für das Tiermodell.

66

Da sowohl die Ergebnisse der vorliegenden KO-Untersuchungen als auch die klinischen

Studien für TNF-unabhängige Krankheitsmechanismen sprechen, sollten alternative

arthritogene Mechanismen auf lokaler und systemischer Ebene überprüft werden.

5.2 LOKALE AUSWIRKUNGEN DER ZYTOKINFREISETZUNG

Bisher werden zwei Effekte für den Rückgang der klinischen und laborchemischen

Entzündungszeichen im Rahmen der Anti-TNF-Therapie verantwortlich gemacht: die

verminderte Expression von Adhäsionsmolekülen und Chemokinen sowie die Unterbrechung

der inflammatorischen Zytokinkaskade (Maini et al. 1995, Paleolog et al. 1996, Taylor et al.

2000). Sowohl Ergebnisse aus klinischen als auch aus tierexperimentellen Untersuchungen

weisen darauf hin, dass TNFα v.a. die Freisetzung von IL-1 und IL-6 beeinflussen kann

(Brennan et al. 1989, Probert et al. 1995, Maini et al. 1995, Feldmann et al. 1996).

Vorangegangene Untersuchungen an Gelenkextrakten ergaben für den 3. Tag nach AIA-

Auslösung lokale Maximalwerte für TNFα, IL-1 und IL-6. Dem Konzentrationsmaximum

dieser Zytokine ging ein Anstieg von IL-12 voraus, der möglicherweise die Aktivierung der

MΦ zu einem noch früheren Zeitpunkt der AIA reflektiert (Simon et al. 2001, Kleinstäuber

2001).

Aufgrund dessen führten wir eine Kurzzeitstudie durch und stellten Gelenkextrakte von Knien

der Tiere mit akuter AIA her. Um Kompensationsmechanismen der TNF-Defizienz zu

untersuchen, wurden anschließend die Konzentrationen von TNFα, IL-1, IL-6 und IL-12 in

den Gelenkextrakten bestimmt.

Die KO-Mäuse zeigten unverändert hohe Werte für IL-12, der Gehalt an IL-1 und IL-6 war

jedoch auf die Hälfte reduziert. Zusätzlich bestand eine Korrelation zwischen lokalem IL-1

bzw. IL-6 und der Gelenkschwellung an diesem Tag. Allerdings lassen sich die unverändert

starken histologischen Arthritismerkmale damit nicht erklären. Wie schon erwähnt, könnten

diese durch die starke akute Entzündungsreaktion am Tag 1 der AIA verursacht sein und in

der Folge unabhängig vom klinischen Entzündungsverlauf fortschreiten.

Eventuell sind die Konzentrationen von IL-1 und IL-6 zusammen mit den unverändert hohen

IL-12-Spiegeln ausreichend, um die Gelenkschädigung zu vermitteln. Allerdings wurde bei

Anti-TNF-behandelten Mäusen gerade die reduzierte Gelenkpathologie auf die reduzierten

IL-1 und IL-6-Spiegel zurückgeführt (Kleinstäuber 2001). Möglicherweise deutet sich damit

wiederum an, dass Antikörper- und KO-System aufgrund der stärkeren

Kompensationsmechanismen der transgenen Tiere nur begrenzt vergleichbar sind.

67

Die Konzentration von IL-12 in den Gelenkextrakten von Tieren mit akuter AIA war

unbeeinflusst von der TNF- bzw. TNF-Rezeptor-Anwesenheit. Dies bestätigt die Existenz

alternativer proinflammatorischer Mechanismen. IL-12, genauso wie TNFα stimuliert T-

Zellen zur IFN-γ-Produktion und fördert damit eine Th1-Polarisierung von CD4+ Zellen

(Trinchieri 1995, Dinarello & Moldawer 2000). Experimentellen Arthritiden, wie der AIA

und der CIA, liegen solche Th1-abhängigen Reaktionen zugrunde. In diesem Zusammenhang

ist interessant, dass bei der CIA nicht nur durch Anti-TNF-Antikörper, sondern auch durch

Anti-IL-12-Antikörper eine Abschwächung der arthritischen Merkmale demonstriert werden

konnte (McIntyre et al. 1996, Joosten et al. 1997, Malfait et al. 1998). Durch die Kombination

beider AK konnte eine beeindruckende synergistische Wirksamkeit erreicht werden (Butler et

al. 1999).

Hinsichtlich der Th1-Abhängigkeit der AIA muss besonders auf die Befunde von Anti-CD4-

Versuchen am Modell hingewiesen werden. Der Einsatz eines monoklonalen Anti-CD4-AK

reduzierte eindeutig sowohl die klinischen als auch die histologischen Arthritiszeichen der

AIA. Darüber hinaus fiel im Gegensatz zur TNF-Blockade eine deutlich verminderte Akut-

reaktion am Tag 1 auf (Pohlers et al. 2004). Dies unterstreicht wiederum die Bedeutung der

hyperakuten Arthritisschwere für die weitere Gewebeschädigung. Durch die Kombination von

Anti-CD4 und Anti-TNF konnte am Modell der CIA eine deutlich stärkere Suppression

erreicht werden, als mit Anti-TNF-AK allein möglich war. Dies wurde v.a. mit der

wirksameren Reduktion der IL-1-Freisetzung durch die Kombinationstherapie in Verbindung

gebracht (Marinova-Mutafchieva et al. 2000, Williams et al. 2000). Williams et al. (2000)

führen dies auf die Existenz verschiedener, unabhängiger Mechanismen der Zytokin-

freisetzung zurück: diese kann in Synovialzellen einerseits durch direkten T-Zellkontakt er-

folgen oder andererseits T-zellunabhängig, durch die auto- und parakrinen Effekte von TNFα.

5.3 SYSTEMISCHE AUSWIRKUNGEN AUF DIE ZYTOKINFREISETZUNG

In vorangegangenen Untersuchungen konnte eine systemische Aktivierung von MΦ im

Verlauf der AIA nachgewiesen werden. Diese zeigte sich an der verstärkten Freisetzung

proinflammatorischer Mediatoren wie TNFα, IL-1 und IL-6 in Kulturen von Peritoneal-

makrophagen (PMΦ) (Surber 1997, Simon et al. 2001). Die Untersuchung der Zytokin-

sekretion von PMΦ bietet darüber hinaus eine adäquate Möglichkeit, Zytokinkaskaden bzw.

Zytokininteraktionen in vitro zu analysieren.

Einige Autoren gehen von einer TNF-abhängigen Zytokinkaskade im Rahmen entzündlicher

Prozesse aus, die insbesondere die IL-1- und IL-6-Freisetzung reguliert. Dem liegen

68

Beobachtungen zugrunde, nach denen die TNF-Produktion zeitlich vor der IL-1-Sekretion

einsetzt, und Anti-TNF-AK die Freisetzung von IL-1, IL-6, IL-8 und GM-CSF hemmen,

Anti-IL-1-AK dagegen keinen Einfluss auf die TNF-Produktion haben (Feldmann et al.

1998). Kleinstäuber (2001) führte den protektiven therapeutischen Effekt der Anti-TNF-AK-

Studien am Modell der AIA u.a. auf reduzierte TNFα-, IL-1- und IL-6-Spiegel zurück und

bestätigte die Hierarchie von TNFα IL-1 IL-6 auf systemischer Ebene.

Um die systemische Freisetzung von IL-1, IL-6 und IL-12 unter vollständiger TNF-

Abwesenheit zu untersuchen, wurden In-vitro-Versuche mit PMΦ aus immunisierten sowie

aus akut und chronisch arthritischen Tieren durchgeführt.

Für immunisierte KO-Tiere konnte mit der Reduktion der IL-1- und IL-6-Spiegel eine TNF-

Abhängigkeit demonstriert werden. Allerdings scheint der TNF-Einfluss nur partiell zu sein,

da die ´Rest-Freisetzung´ unter TNF-Abwesenheit immerhin noch ca. 30% für IL-1 und 80%

für IL-6 betrug. Nach Arthritisausbruch war auffällig, dass die IL-1-Sekretion sich sogar ins

Gegenteil umkehrte, d.h. eine überschießende IL-1-Freisetzung in den KO-Tieren zu

beobachten war. Für die IL-6-Produktion in KO-MΦ konnten zwar keine übersteigerten

Werte festgestellt werden, dennoch scheint auch der TNF-Einfluss auf dieses Zytokin im

AIA-Verlauf nachzulassen. Im Gegensatz zu den WT-MΦ, deren Aktivitätszustand in der

chronischen Phase der AIA teilweise unter den der Immunisierung abfiel, wurde für die KO-

Mäuse eine anhaltende Sekretion von IL-1, IL-6 und, im Fall der Rezeptor-KO-Mäuse, auch

von TNFα beobachtet. Zum einen könnte dies Ausdruck von Kompensationsmechanismen

sein, wobei aufgrund des embryonalen Defekts der KO-Mäuse der TNF-Mangel über erhöhte

IL-1- und IL-6-Spiegel ausgeglichen wird. Möglicherweise reflektiert dies aber auch eine

gestörte Deaktivierung der KO-MΦ. Interessant in dem Zusammenhang ist ein von Duffield

postulierter negativer Feedbackmechanismus von MΦ (Duffield 2003): aktivierte MΦ

induzieren Entzündungsprozesse und lösen damit u.a. vermehrt Apoptose in umliegenden

Zellen aus. Durch den anfallenden Zelldebris wird ihre Phagozytoseaktivität verstärkt

beansprucht. Dies wiederum ist das Signal für eine Funktionsänderung der MΦ-Population,

die sich im folgenden selber „auto-inaktiviert“. Eine unvollständige Aktivierung des

inflammatorischen Potenzials von MΦ führt, Duffield zufolge, auch zu einer unvollständigen

Deaktivierung dieser Zellen. Die Abwesenheit von TNFα, ein proinflammatorisches,

Apoptose-induzierendes Zytokin, könnte demnach für die anfangs abgeschwächte, im

weiteren Verlauf der AIA aber anhaltende Zytokinsekretion verantwortlich sein.

Experimentelle Studien unterstützen dieses Konzept der immunsuppressiven Effekte

apoptotischer Zellen auf MΦ (Magnus et al. 2001, van Lent et al. 2001, Huynh et al. 2002).

69

Die vorliegenden In-vitro-Untersuchungen sprechen nicht für eine rein proinflammatorische

TNFα-Funktion, sondern deuten möglicherweise antiinflammatorisches Potenzial dieses

Zytokins an. Eine solche biphasische Rolle von TNFα wird auch in anderen Tiermodellen,

wie der EAE (Kassiotis & Kollias 2001a), der CIA (Campbell et al. 2001) oder

verschiedenen Infektionsmodellen (Marino et al. 1997, Kanaly et al. 1999) festgestellt.

Kleinstäuber (2001) beobachtete in ihren Anti-TNF-AK-Studien ähnliche paradoxe Einflüsse

auf die IL-1- und IL-6-Freisetzung von kultivierten PMΦ: niedrige Dosen des Anti-TNF-AK

verursachten eine verminderte, höhere Dosen allerdings eine verstärkte Sekretion dieser

proinflammatorischen Zytokine. Dies wurde mit einer verminderten lokalen Wirksamkeit des

AK in Zusammenhang gebracht. Unsere Ergebnisse sprechen allerdings für eine Störung der

Entzündungsregulation der AIA unter hohen Anti-TNF-AK-Dosen bzw. unter der Komplett-

Blockade vor allem im chronischen Arthritisstadium.

Die Doppelrezeptor-KO-Mäuse produzierten über den gesamten Verlauf der AIA, anders als

TNFα−/− und TNFR1−/− Mäuse, niedrigere IL-6-Spiegel als der WT, was für eine andauernde

TNF-Abhängigkeit spricht. Auch die IL-1-Sekretion in der chronischen Phase der AIA war

nicht so überschießend wie bei den anderen beiden KO-Stämmen. Shalaby et al. (1989)

konnten zeigen, dass die IL-6-Produktion von PMΦ am effektivsten durch die gemeinsame

Applikation von IL-1 und TNFα induzierbar ist. Möglicherweise reicht der Anstieg der IL-1-

Spiegel im TNFR1,2−/− , anders als bei TNFα−/− und TNFR1−/−-Mäusen, nicht aus, um die

TNFα-Abwesenheit zu kompensieren.

In den Kulturüberständen von PMΦ aus immunisierten und arthritischen TNF- und TNF-

Rezeptor-KO-Mäusen war deutlich mehr IL-12 enthalten als beim WT. Dieses Zytokin

steigert die NK-Zell-vermittelte Zytotoxizität, fördert die Th1-Polarisierung und stimuliert die

IFN-γ-Produktion im Tiermodell (Seder et al. 1993, Manetti et al. 1993, Stern et al. 1996). Es

existiert ein positiver Selbstverstärkungsmechanismus zwischen IL-12 und IFN-γ. Dieser

dient der Amplifikation von Entzündungsreaktionen (Trinchieri 1995). Es gibt Hinweise, dass

bei Abwesenheit von TNFα dieser positive Feedback nicht adäquat unterbrochen werden

kann (Hodge-DuFour et al. 1998). Interessanterweise konnten wir in den KO-Mäusen neben

erhöhten IL-12-Werten auch eine im Verlauf der AIA ansteigende IFN-γ-Freisetzung in

Lymphknotenzellen beobachten. IL-12 aktiviert nicht nur NK-Zellen, sondern wirkt chemo-

taktisch auf polymorphonukleäre Zellen und fördert die Endotheladhäsion (Allavena et al.

1994). Damit deutet sich ein potenter alternativer Pathomechanismus für die AIA an: Das

70

erhöhte IL-12 könnte die TNF-Abwesenheit kompensieren, indem es die Arthritis durch seine

proinflammatorischen und immunstimulatorischen Wirkungen verstärkt.

Auch die CIA konnte durch die Applikation von IL-12 verstärkt werden. Der arthritogene

Effekt von IL-12 war dabei ebenfalls IFN-γ-abhängig (Germann et al. 1996). Die protektive

Wirksamkeit von Anti-IL-12 auf den Verlauf der CIA sowie der synergistische Therapieeffekt

von Anti-TNF zusammen mit Anti-IL-12 wurden bereits erwähnt (Malfait et al. 1998, Butler

et al. 1999). Über die Wirkung einer Anti-IL-12-Applikation am Modell der AIA ist bisher

nichts bekannt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen aber einen deutlichen Effekt

einer IL-12-Blockade auch an diesem Modell vermuten.

5.4 IMMUNMODULATION UNTER TNF-ABWESENHEIT

Im Verlauf der AIA kam es zu Auffälligkeiten im Gewichtsverhalten der Mäuse: der durch

die Arthritisinduktion ausgelöste Gewichtsverlust konnte beim WT schneller wieder ausge-

glichen werden. Dies ist insofern erstaunlich, da TNFα selber über die Hemmung der

Lipoproteinlipase eine eher katabole Stoffwechselwirkung besitzt (Beutler et al. 1985).

Die Störung der postentzündlichen Gewichtszunahme bei Abwesenheit von TNFα bzw.

seiner Rezeptoren ging mit einer zunehmenden Splenomegalie einher, vor allem in der

chronischen Phase der AIA. Am Modell der CIA konnte ebenfalls eine Splenomegalie der

TNF-KO-Mäuse im Arthritisverlauf beobachtet werden, die auf eine erhöhte Anzahl von

CD4+ Gedächtniszellen in der Milz zurückführt wurde (Campbell et al. 2001). Marino et al.

(1997) verweisen auf protrahierte Erkrankungsverläufe von TNFα−/− Mäusen, denen hitze-

inaktiviertes Corynebacterium parvum injiziert wurde. Im Gegenteil zur Kontrollgruppe

reagierten die Mäuse nur schwach auf die Injektion, entwickelten aber im weiteren Verlauf

eine progressive überschießende Entzündungsreaktion, die u.a. durch eine Splenomegalie

gekennzeichnet war. Da dieses Phänomen bei der Applikation von inaktivierten Bakterien

auftrat und dadurch eine exzessive Erregervermehrung als Ursache ausgeschlossen werden

kann, liegt dieser Reaktion keine Abwehrschwäche im eigentlichen Sinne zugrunde. Vielmehr

wird eine inadäquate Entzündungskontrolle der transgenen Mäuse vermutet. Sowohl in den

Experimenten von Marino et al. (1997) bzw. Campbell et al. (2001) als auch bei den hier vor-

liegenden Untersuchungen wurden inaktivierte Erreger verwendet. Bei der AIA nutzt man

Mycobacterium tuberculosis und hitze-inaktivierte Bordetella pertussis zur Verstärkung der

Immunisierungsreaktion gegen mBSA. Äußerst interessant ist eine Untersuchung von Hodge-

Dufour et al. (1998) an TNFα−/− Mäusen, denen ebenfalls hitze-inaktivierte Bakterien

appliziert wurden und die protrahierte Entzündungsreaktionen zeigten, die auf eine exzessive

71

IL-12-Freisetzungen zurückgeführt wurden. Durch Anti-IL-12 konnte eine Normalisierung im

Krankheitsverlauf erreicht werden.

Für die vorliegenden Untersuchungen bedeutet dies unter Umständen folgendes: bei

Abwesenheit von TNFα bzw. seiner Rezeptoren kompensiert das erhöhte IL-12 nicht nur die

fehlende arthritogene Wirkung von TNFα, sondern führt möglicherweise zu einer

dysregulierten inflammatorischen Reaktion. Immunisierte Tiere in unseren Untersuchungen

zeigten jedoch keine Auffälligkeiten, die in Zusammenhang mit einer systemischen

Entzündungsreaktion zu bringen waren. Vermutlich wird erst durch den zusätzlichen Stimulus

der Arthritisauslösung die verminderte Kapazität der KO-Mäuse zur Entzündungsregulation

überschritten: die verstärkte IFN-γ-Freisetzung im Lymphknoten, die Gewichtsstörung und

die Splenomegalie sind möglicherweise Ausdruck einer systemisch inflammatorischen

Reaktion. Das ist in Übereinstimmung mit zahlreichen experimentellen Krankheitsmodellen,

die in der prolongierten und teilweise gesteigerten Krankheitsaktivität von TNF-KO-Mäusen

einen starken Hinweis auf die immunsuppressive Funktion von TNFα sehen (O'Shea et al.

2002). Am Modell der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis werden für TNF-

KO-Mäuse deutlich schwerere Krankheitsverläufe beschrieben als für den Wildtyp (Liu et al.

1998). Werden TNF-, TNF-R1- und TNF-R1,2-KO-Mäuse mit Leishmania major infiziert,

kommt es zu Heilungsstörungen und erhöhter Mortalität im Vergleich zu Wildtypmäusen

(Nashleanas et al. 1998, Kanaly et al. 1999, Wilhelm et al. 2001).

Neben diesen Hinweisen auf veränderte Entzündungsabläufe bei den untersuchten KO-

Mäusen fanden wir in unseren Untersuchungen weitere Auffälligkeiten, die auf

immunmodulatorische Abweichungen bei Abwesenheit der TNFα-Signale hinweisen.

Nachfolgend werden dazu die Ergebnisse aus den Untersuchungen der spezifischen

Immunfunktionen diskutiert.

CD4+ T-Zellen können in mindestens 2 funktionelle Subtypen eingeteilt werden: Th1- und

Th2-Zellen. Th1-Zellen aktivieren vorrangig zelluläre, Th2-Zellen hingegen vor allem

humorale Immunreaktionen (Janeway 2002). Ähnlich der RA wird auch für die AIA eine

Th1-Polarisierung angenommen (Simon et al. 1994, Dolhain et al. 1996, Mosmann & Sad

1996). Simon (1999) machen die Verschiebung der Th1/Th2-Balance in Richtung Th1

maßgeblich für die Arthritissuszeptibiltät von C57BL/6-Mäusen verantwortlich. TNFα unter-

stützt die Aktivität von Th1-Zellen und erhöht damit die zelluläre Immunreaktivität (Dinarello

& Moldawer 2000). Th-Zellen lassen sich anhand ihres sezernierten Zytokinmusters

unterscheiden, wobei IFN-γ als ein typisches Th1- und IL-4 als ein typisches Th2-Zytokin

betrachtet werden (Janeway 2002). In der vorliegenden Arbeit sollten die IFN-γ- und die IL-4-

72

Freisetzung aus kultivierten Lymphknotenzellen immunisierter und arthritischer Mäuse

überprüft werden, um Veränderungen der Th1/Th2-Balance in den KO-Tieren beurteilen zu

können.

Die Abwesenheit von TNFα bzw. seiner Rezeptoren verursachte keine Änderung der IFN-γ-

Sekretion von immunisierten Mäusen. Die Zellen der KO-Mäuse produzierten mehr IL-4 nach

Stimulation mit PMA+Ionomycin. Nach mBSA-Stimulation produzierte keiner der

Mausstämme IL-4 bzw. lagen die Konzentrationen unter der Nachweisgrenze des ELISA-

Systems. Damit ist unklar, ob tatsächlich eine stärkere Th2-Polarisierung während der

Immunisierungsphase auftrat. Interessant ist, dass die Adjuvanz-Arthritis (AA) speziell in

Mäusen nur nach Blockade von IL-4 induziert werden kann, d.h. dieses Zytokin wirkt im AA-

Modell protektiv (Yoshino et al. 1998). Bei der AIA beobachteten wir jedoch keine vermin-

derte Empfindlichkeit der KO-Mäuse aufgrund der erhöhten IL-4-Spiegel nach polyklonaler

Stimulation. Im Gegenteil die Arthritis-Suszeptibilität war im Vergleich zum WT

unverändert.

Nach Auslösung der Arthritis kam es zu einer stärkeren IFN-γ-Freisetzung in den

Lymphknoten von KO-Mäusen im Vergleich zum WT. Außerdem fielen wiederum erhöhte

IL-4-Werte der KO-Mäuse nach polyklonaler Stimulation auf. Dies weist auf eine verstärkte

Th1-Polarisierung der arthritischen KO-Mäuse unter mBSA-Stimulation hin. Für die

polyklonale Stimulation können keine eindeutigen Aussagen zur Th1/Th2-Balance getroffen

werden.

Bei der CIA wird nach IL-4-Applikation eine Reduktion der Knorpelschädigung beschrieben.

Diese war allerdings konzentrationsabhängig, mit einer nachweisbaren Wirkung nur bei

hohen Dosen (Lubberts et al. 1999). Da IL-4 in unseren Bestimmungen nur nach

polyklonaler, nicht aber nach mBSA-Stimulation gemessen wurde, ist ein antidestruktiver

Effekt unwahrscheinlich.

Erhöhte IFN-γ-Spiegel bei TNF-Abwesenheit traten auch in anderen experimentellen Tier-

modellen auf (Vieira et al. 1996, Wilhelm et al. 2001). Campbell et al. (2001) führten die im

Verlauf der CIA ansteigenden IFN-γ-Konzentrationen der TNFα-KO-Mäuse auf eine erhöhte

Anzahl von CD4+ Gedächtniszellen in den Immunorganen zurück. Kassiotis et al. (1999)

beobachteten am EAE-Modell, dass die TNF-Abwesenheit mit der Expansion autoreaktiver

T-Zellen einhergeht und es dadurch zur Krankheits-Exazerbation kommt. Als Ursache dafür

wird eine gestörte TNF-abhängige Apoptose diskutiert. Da Apoptose jedoch zum größten Teil

über Fas reguliert wird, beteiligt sich TNF vermutlich nur unter bestimmten Umständen am

programmierten Zelltod. Dazu gehört wahrscheinlich die Apoptoseregulation im Rahmen von

73

entzündlichen Prozessen (Kanaly et al. 1999, Kassiotis & Kollias 2001b). Dieser als

„activation-induced cell death“ (AICD) bezeichnete Vorgang könnte bei den hier unter-

suchten KO-Mäusen gestört sein und zur Anhäufung von IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen in

den Lymphknoten geführt haben. Inwieweit dies tatsächlich Einfluss auf den Verlauf der AIA

hat oder nur ein Sekundärphänomen darstellt, ist unklar. Kassiotis et al. (1999) gehen von

einer dualen Rolle von TNF im EAE-Modell aus: einerseits ist es als proinflammatorisches

Zytokin an initialen Entzündungsvorgängen beteiligt, andererseits hemmt es im weiteren

Verlauf die Expansion der antigenspezifischen T-Zell-Reaktivität und trägt so zur

Rückbildung der Läsionen bei. Campbell et al. (2001) hingegen fanden am CIA-Modell keine

Korrelation zwischen lymphoproliferativer Störung, erhöhten IFN-γ-Spiegeln und der

Arthritisschwere bei TNF-KO-Mäusen. Trotzdem muss damit gerechnet werden, dass

aufgrund der verstärkten IFN-γ-Freisetzung andere Autoimmunreaktionen stimuliert werden.

Im Zusammenhang mit der TNF-Blockade werden erhöhte IFN-γ-Spiegel für das

Neuauftreten von antinukleären Faktoren verantwortlich gemacht. Dies begünstigte die

Entwicklung einer Lupusnephritis am Mausmodell und steht möglicherweise in

Zusammenhang mit dem Auftreten von SLE bei Anti-TNF-behandelten RA-Patienten

(Kontoyiannis & Kollias 2000, Ioannou & Isenberg 2000, Berg et al. 2001).

Anhand von Serumtransferexperimenten zeigte sich eine pathogenetische Mitbeteiligung von

Ag-spezifischen AK am Entzündungsprozess der AIA (Brackertz et al. 1977b). Es wurde

nachgewiesen, dass die Immunisierung neben der Th1-Polarisierung insbesondere auch die

Bildung antigen-spezifischer Immunglobuline vom Typ IgG2a/b fördert (Simon 1999). In der

vorliegenden Arbeit wurden deshalb die mBSA-spezifischen AK bestimmt. In immunisiertem

Zustand fielen keine Unterschiede zwischen WT- und KO-Mäusen auf. Nach Auslösung der

Arthritis und vor allem in der chronischen Phase kam es im Vergleich zum WT aller-dings zu

einem Abfall der mBSA-AK im Serum. Dies wurde auch bei der CIA beobachtet (Campbell

et al. 2001). Verantwortlich für den AK-Mangel ist wahrscheinlich eine gestörte

Mikroarchitektur lymphatischer Organe bei TNF- und TNF-Rezeptor-Abwesenheit

(Pasparakis et al. 1996). Diese ist charakterisiert durch normale IgM- und verminderte IgG-

Spiegel. Der Ig-Switch selber scheint nicht beeinträchtigt, vielmehr kommt es durch die

Ab-wesenheit von organisierten B-Zellfollikeln zur Störung der lokalen

Keim-zentrumsbildung in lymphatischen Organen und damit zur humoralen Insuffizienz.

Vermutlich induzieren die TNF-Signale die Expression von Chemokinen bzw. Chemokin-

Rezeptoren in den Immunorganen, die das Einwandern (Homing) von Antigen-

präsentierenden Zellen und B-Zellen erleichtern. Bei TNF-Abwesenheit kommt es zur

74

Störung dieses Homing-Prozesses und folglich seltener zu Aktivierungssignalen zwischen T-

und B-Zellen. Dies wird durch zahlreiche Untersuchungen bestätigt, die einen quantitativen

AK-Mangel bei TNFα−/− Mäusen feststellen (Pasparakis et al. 1996, Körner et al. 1997, Cook

et al. 1998, Ruuls et al. 2001). Pasparakis et al. (1996) beobachteten, dass dieser Defekt durch

wiederholte Ag-Applikation in Kombination mit einem Adjuvanz ausgeglichen werden kann.

Das könnte die unverändert hohen AK-Spiegel der immunisierten Tiere in unseren

Untersuchungen erklären. Die mBSA-spezifischen AK beteiligen sich im Rahmen der Arthus-

Reaktion an der Immunkomplexbildung und wirken so unmittelbar an der Akutphase der AIA

mit. Die unverminderte Schwere der akuten Arthritis bei den KO-Tieren kann demnach

anhand der AK-Spiegel nachvollzogen werden. Nach Arthritisauslösung wird die AK-Bildung

durch die Ag-Retention und kontinuierliche Freisetzung kleinster intraartikulärer Ag-Mengen

in das periartikuläre Gewebe aufrechterhalten. Möglicherweise ist dieser anhaltende antigene

Stimulus im Vergleich zum Immunisierungsreiz nicht stark genug, um die humorale Störung

der KO-Mäuse auszugleichen. Eventuell ist die nachlassende AK-Produktion für den milderen

klinischen Arthritisverlauf der KO-Tiere mitverantwortlich. IL-6 beeinflusst die B-Zell-

Reifung und damit die AK-Produktion (Sack 1994). Dies erklärt möglicherweise die

deutlichere Abnahme der AK-Spiegel bei den TNFR1,2−/−. Bei diesem Stamm waren, im

Gegensatz zu den beiden anderen KO-Stämmen, während des gesamten Verlauf der AIA

reduzierte IL-6-Spiegel in PMΦ-Kulturen gefunden worden.

Durch die Th1-Polarisierung immunologisch induzierter Arthritismodelle wird vor allem die

Bildung von IgG2a/b gefördert (Matthys et al. 1998, Simon 1999). IFN-γ als Th1-Zytokin

fördert demnach die Bildung dieser Subklasse. In den vorliegenden Untersuchungen kommt

es aber trotz höherer IFN-γ-Konzentrationen zum Abfall von IgG2b in der chronischen Phase

der AIA. Das unterstreicht die Bedeutung der gestörten Mikroarchitektur der Immunorgane

als Ursache für die humorale Insuffizienz.

Neben den antigenspezifischen AK kommt es durch den entzündlichen Prozess im Gelenk zur

Bildung von knorpelspezifischen Autoantikörpern, beispielsweise gegen Kollagen Typ I und

II und Proteoglykane. Dieses Sekundärphänomen kann die Entzündung und die Destruktion

der AIA zusätzlich verstärken (Petrow et al. 1996). Vor allem die TNFR1,2−/− Mäuse wiesen

in der chronischen Phase der AIA weniger matrixspezifische AK auf. Es ist möglich, dass bei

diesem Mausstamm die Abschwächung der Destruktionen in der chronischen Phase dadurch

mitverursacht wurde. Allerdings entwickelten beispielsweise IFN-γR-KO Mäuse trotz ernied-

rigter Autoantikörper eine stärkere CIA (Vermeire et al. 1997), was gegen eine dominate

pathogenetische Rolle dieser AK spricht.

75

6. SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK

Unsere Untersuchungsergebnisse sprechen nicht für eine Schlüsselfunktion von TNFα bei der

AIA. Auch unter TNF-Abwesenheit traten schwere arthritische Veränderungen auf, so dass

von alternativen bzw. kompensatorischen Pathomechanismen ausgegangen werden muss.

Untersuchungen von TNF-KO-Mäusen an anderen Arthritismodellen bestätigen dies

(Campbell et al. 2001, Ji et al. 2002b). Die Reduktion der lokalen und systemischen

Konzentrationen von IL-1 und IL-6 sprechen zwar in gewisser Weise für die Existenz einer

TNF-Abhängigkeit, allerdings mit fraglicher Relevanz in Hinblick auf die unverändert starken

Gelenkschädigungen. Dies war insofern überraschend, da in den vorangegangenen Anti-TNF-

AK-Studien eine lokale Verminderung dieser Zytokine mit einer Abschwächung der Arthritis-

merkmale einherging. Es ist anzunehmen, dass Kompensationsmechanismen im KO-System

stärker zum Tragen kommen als im AK-System. Hinzu kommt, dass die AIA stark T-Zell-

abhängig ist, wie insbesondere aktuelle Therapieversuche mit Anti-CD4 zeigen (Pohlers et al.

2004). Dadurch ist anzunehmen, dass sich der Knockout eines einzelnen

proinflammatorischen Zytokins wie TNFα von vornherein eher begrenzt auswirkt. Außerdem

ist die Lebensfähigkeit von KO-Mäusen in gewisser Weise abhängig von Kompensations-

mechanismen, insofern der KO überhaupt pathogenetisch relevante Gene im jeweiligen

Tiermodell betrifft. Einige Unter-sucher vermuten in diesem Zusammenhang eine stärkere IL-

1-Abhängigkeit der AIA (Joosten et al. 1999, van den Berg 2001). Mittlerweile stehen so

genannte Ćonditional´ Knockout-Mäuse zur Verfügung. In diesen Tieren können Gene

gewebespezifisch bzw. zu bestimmten Zeitpunkten áusgeschaltet´ werden (Rossant &

McMahon 1999). Insbesondere für Zytokine wie TNFα, die über pleiotrope Funktionen u.a.

in der embryonalen Entwicklung verfügen, stellt dies eine geeignete Möglichkeit zur

isolierten Untersuchung der proinflammatorischen Eigenschaften in Entzündungsmodellen

dar.

Die teilweise paradoxen Ergebnisse der Zytokinuntersuchungen sprechen gegen TNF-

abhängige unidirektionale Zytokinkaskaden, sondern implizieren die Existenz multipler

Regulations- und Kompensationsmechanismen. Die therapeutische und tierexperimentelle

Konsequenz wäre die Untersuchung des Effektes von Kombinationstherapien. Anhand

aktueller Studien lässt sich ihre Wirksamkeit bereits belegen: die Kombination der TNF-

Blocker mit den herkömmlichen Basistherapeutika ist ein vielversprechendes Behandlungs-

konzept und der Monotherapie überlegen (Bendele et al. 1999, Gossec & Dougados 2003).

Dies beinhaltet außerdem den Vorteil der besseren Verträglichkeit aufgrund des verminderten

Risikos von Langzeitnebenwirkungen. Obwohl die TNF-Abwesenheit den Verlauf der AIA

76

selber nur wenig beeinflusste, war sie doch geeignet, die Auswirkungen der Komplett-

blockade anzudeuten. Wir fanden Hinweise auf eine gestörte Immunregulation des Organis-

mus, die sich möglicherweise auf die Kontrolle und Limitierung der Entzündungs-prozesse

der AIA auswirkte. Eine TNFα-abhängige Regulation und Eingrenzung der Th1-Reaktivität

des Immunsystems ist wahrscheinlich verantwortlich dafür. Klinische und tierexperimentelle

Studien bestätigen dies und weisen auf Autoimmunphänomene unter der TNF-Blockade hin

(Kassiotis & Kollias 2001, O'Shea et al. 2002). Die therapeutische TNF-Blockade sollte des-

halb nicht unkritisch angewandt werden. Vor allem bei Patienten, die nicht ausreichend

ansprechen, ist der Versuch, durch Dosissteigerung eine Wirkung zu erzielen, nicht

unproblematisch. Klinischen Studien zufolge profitieren RA-Patienten mit normalen TNF-

Spiegeln weniger als solche mit erhöhten TNF-Spiegeln (Ulfgren et al. 2000b). Weiterhin

wurde gezeigt, dass durch eine Dosismaximierung bei diesen sogenannten Ńon-Respondern´

keine Verbesserung der Wirksamkeit herbeigeführt werden konnte (Conaghan et al. 2002).

Die Komplettblockade von TNFα führte in unserem Arthritismodell bei nur marginalen anti-

arthritogenen Effekten zu einer deutlichen Abschwächung der humoralen Immunabwehr.

Einerseits kam es zu einer gesteigerten T-zellabhängigen Immunreaktivität mit dem

potenziellen Risiko der Entwicklung von Autoimmunphänomen, andererseits führte die

immunsuppressive Wirkung zur Schwächung der humoralen Infektionsabwehr. Obwohl in

den Phase III-Studien nur milde Nebenwirkungen beobachtet wurden, stieg mit der Markt-

zulassung der TNF-Blocker nicht nur die Anzahl der registrierten Komplikationen, sondern

auch ihre Schwere überdurchschnittlich an. So wird von der Verstärkung demyelinisierender

Erkrankungen, der Entgleisung von Patienten mit Herzinsuffizienz und schwerwiegenden

Infektionen und Wundheilungsstörungen berichtet (Möller 2003). Dies sollte nicht den

Nutzen dieser Medikamentengruppe für therapierefraktäre RA-Verläufe in Frage stellen,

jedoch die bewusste Abwägung des Nutzen-Risiko-Verhältnis gerade bei Risikopatienten oder

Ńon-Respondern´ voraussetzen. Perspektivisch ist nicht nur die Austestung von

Kombinationstherapien erforderlich, sondern veranlasst das immunmodulatorische

Nebenwirkungspotenzial der Zytokinantagonisten zur Suche nach noch spezifischeren

Angriffspunkten der antirheumatischen Therapie.

Experimentelle Arthritismodelle eignen sich insbesondere zur kritischen Auseinandersetzung

mit speziellen Fragestellungen die RA betreffend. Die hier vorliegenden Untersuchungen am

Entzündungsmodell der AIA unterstreichen die Bedeutung TNF-unabhängiger proinflamma-

torischer Mechanismen der Arthritisentstehung und verweisen zusätzlich auf den nicht

unerheblichen immunoregulatorischen Einfluss dieses Zytokins.

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96

EHRENWÖRTLICHE ERKLÄRUNG

Hiermit erkläre ich, dass mir die Promotionsordnung der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Schiller-

Universität Jena bekannt ist,

ich die Dissertation selbst angefertigt habe und alle von mir benutzten Hilfsmittel,

persönlichen Mitteilungen und Quellen in meiner Arbeit angegeben sind,

mich folgende Personen bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der

Herstellung des Manuskriptes unterstützt haben:

Prof. Dr. rer. nat. Rolf Bräuer

Dr. med. Peter K. Petrow

Dr. med. Steffen Henzgen

PD Dr. rer. nat. Heiner Körner die Hilfe eines Promotionsberaters nicht in Anspruch genommen wurde,

Dritte weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen von mir für Arbeiten

erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation

stehen und

ich die gleiche, eine in wesentlichen Teilen ähnliche oder eine andere Abhandlung

nicht bei einer anderen Hochschule als Dissertation eingereicht habe

Jena, am 30. November 2004 Wilma Rademacher, Verfasserin

DANKSAGUNG

Hiermit möchte ich mich bei allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen

haben.

Mein besonderer Dank geht an Prof. Dr. rer. nat. Rolf Bräuer für die Überlassung des Themas

und seine wissenschaftliche Betreuung.

Allen derzeitigen und ehemaligen Kollegen aus der Arbeitsgruppe danke ich für ihre

Unterstützung, für die kritische Diskussion der Daten, sowie für die freundliche und

aufgeschlossene Arbeitsatmosphäre.

Besonders danken möchte ich auch Renate Stöckigt, Conny Hüttich, Uta Griechen, Heidi

Börner und Waltraud Kröber für ihre exzellente technische Assistenz bei der Durchführung

der Experimente.

Dr. rer. nat. Marion Hückel, Oliver Frey, Dipl.-Biol. Ingo Irmler und Dr. rer. nat. Uta Schurigt

(AG Immunpathologie der FSU Jena) gebührt mein Dank für die ausgezeichnete Zusammen-

arbeit und die stimulierenden Diskussionen zum Thema.

Herrn PD Dr. rer. nat. Heiner Körner, Institut für Klinische Mikrobiologie, Immunologie und

Hygiene der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen, danke ich für die Unterstützung und

die freundliche Überlassung der TNFα-Knockout-Mäuse.

Für die histologischen Beurteilungen bedanke ich mich bei Dr. med. Peter Petrow (Patholo-

gisches Institut FSU Jena) und bei Dr. med. Steffen Henzgen (Pathologisches Institut

Dietrich-Bonhoeffer-Klinikum Neubrandenburg)

Bei meinen lieben Eltern Dr. rer. nat. Hans-Jürgen und Dr. Ing. Barbara Rademacher möchte

ich mich für die Motivation, die Anregungen und ihre geduldige Unterstützung während der

Arbeit am Thema bedanken.

LEBENSLAUF Name: Wilma Rademacher

Geboren am: 2. Juli 1976 in Merseburg

Familienstand: ledig

Wohnhaft in: 07743 Jena, Talstraße 9A

Schulausbildung

09/1983 - 06/1984 Besuch der Polytechnischen Schule Merseburg

09/1984 – 06/1991 Besuch der Polytechnischen Schule Breitungen

09/1991 – 06/1995 Besuch des Werratal-Gymnasiums Schwallungen

Berufsausbildung

09/1995 - 06/1998 Staatliche Medizinische Fachschule Bad Salzungen,

Abschluss: Physiotherapeutin (Staatsexamen)

Studium

10/ 1998 - 07/ 2000 Vorklinisches Studium an der Universität Jena

10/ 2000 - 07/ 2003 Klinisches Studium an der Universität Jena

04/ 2004 - 03/ 2005 Praktisches Jahr

vor. 05/ 2005 Abschluss des Studiums

Praktische Erfahrung

10/ 2000 - 03/ 2003 Famulaturen in Dublin, Jena, Erfurt, Hastings

04/ 2004 - 07/ 2004 1. Tertial des Praktischen Jahres, Innere Medizin,

Universitätsspital Zürich, Departement Kardiologie

08/ 2004 - 11/ 2004 2. Tertial des Praktischen Jahres, Chirurgie, Klinikum Erfurt,

Klinik für Kinderchirurgie, Klinik für Thoraxchirurgie

12/ 2004 - 03/ 2005 3. Tertial des Praktischen Jahres, Anästhesie, Universitäts-

Klinikum Jena

Stipendien

Seit 04/2001 Begabtenförderung der Friedrich-Ebert-Stiftung

10/ 2003- 03/2004 IZKF-Promotionsstipendium der Universität Jena

Documents

Charakterisierung der Antigen-induzierten Arthritis an ... · TNF-Blockade können insbesondere therapierefraktäre RA-Verläufe positiv beeinflusst werden. Ungeklärt bleibt jedoch,