Chlorophyll�uoreszenz

Das heimliche Leuchten der P�anzen

Kevin Klemmer, Markus Perle und Leo Schorling

12. April 2019

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 2

2 Angewendete Arbeitsmethoden 3

2.1 Theorie - Fotosynthese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.1.1 Die Überträgermoleküle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32.1.2 Die lichtabhängige Reaktion der Fotosynthese . . . . . . . . . . . . . . . 32.1.3 Die lichtunabhängige Reaktion der Fotosynthese . . . . . . . . . . . . . . 5

2.2 Theorie - Chlorophyll�uoreszenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.3 Die qualitative Messmethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

2.3.1 Versuch I - Test der Hilfsmittel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72.3.2 Versuch II - Versuch mit F-Schablone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.3.3 Fazit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4 Die quantitative Messmethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

3 Dokumentation der Ergebnisse 12

3.1 Versuch I - Vergleich zwischen einem vertrockneten und einem lebenden Blatt . 123.2 Versuch II - Kälteversuch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

3.2.1 Qualitative Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.2.2 Quantitative Messmethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

4 Ergebnis und Ausblick 18

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Kapitel 1

Einleitung

Die Fotosynthese ist sicherlich jedem ein Begri�. Sie ist ein entscheidender Faktor für das Er-möglichen von p�anzlichem Leben auf der Erde. Die P�anze betreibt Fotosynthese, um ausWasser, Lichtenergie und Kohlensto� Glukose (Traubenzucker) zu produzieren. Dabei entstehtauch Sauersto�, der für uns Menschen, aber auch für die Tiere, die Grundlage des Lebensscha�t. Somit ist die Fotosynthese nicht nur für die P�anzen, die auÿerdem die Grundlage derNahrungskette bilden, lebensnotwendig, sondern auch für alle anderen Lebewesen.

Die Chlorophyll�uoreszenz ist ein Nebenprodukt der Fotosynthese, aus welchem man viel überden Zustand einer P�anze erfahren kann, ohne diese dabei zu beschädigen. Die Fluoreszenz ent-steht durch überschüssige Energie, die bei der Fotosynthese nicht verwendet werden kann. Sieist ein entscheidender Indikator für die Landwirtschaft und für die Gesundheit von P�anzen imAllgemeinen. Schon heute wird die Chlorophyll�uoreszenz von Förstern als Methode benutzt,um den Schädigungsgrad von Wäldern zu bemessen. In der Landwirtschaft oder auch im Alltagkann man durch diese Methode zum Beispiel den Einsatz von Düngemitteln oder das Gieÿender P�anzen durch präzise Dosierung deutlich optimieren. Aber was genau ist Chlorophyll�uo-reszenz überhaupt und wie kann man sie nutzen?

Um diese Frage zu beantworten und um den komplexen Prozess in seiner Ganzheit erfassenzu können, haben wir uns zunächst mit der Theorie zu den Themen Fotosynthese und Chlo-rophyll�uoreszenz beschäftigt. Mithilfe weiterer Recherchen haben wir eine anschauliche Me-thode gefunden, mit der man die Chlorophyll�uoreszenz einfach und schnell sichtbar machenkann. Quantitative Aussagen zur Chlorophyll�uoreszenz sind mit dieser Methode allerdingsnicht möglich. Daher haben wir eine für Forschungszwecke geeignete, digitalisierte Messmetho-de entwickelt, sodass man die Chlorophyll�uoreszenz auch quantitativ untersuchen kann. DieseMethode ermöglicht es, Werte zur Stärke und den zeitlichen Verlauf der Fluoreszenz zu ermit-teln.

Mithilfe dieser zwei Methoden konnten wir nun Untersuchungen zum Verhalten der Chloro-phyll�uoreszenz bei P�anzen in Stresssituationen durchführen. Hierfür haben wir bei P�anzeneinen Kältestress verursacht und die Auswirkungen auf die Chlorophyll�uoreszenz untersucht.

2

Kapitel 2

Angewendete Arbeitsmethoden

2.1 Theorie - Fotosynthese

Die Fotosynthese ist ein physiologischer Prozess bei dem aus Kohlensto�dioxid und Wasserdurch Lichtenergie Glukose und Sauersto� entstehen. Die Reaktionsgleichung 2.1 zeigt diese che-mische Reaktion. Der Vorgang der Fotosynthese wird in zwei Teilvorgänge, die lichtabhängigeund die lichtunabhängige Reaktion unterteilt ( [1], [2]). Diese Reaktionen sind miteinanderverbunden. Die Produkte der lichtabhängigen Reaktion werden durch Überträgermoleküle alsEdukte der lichtunabhängigen Reaktion zur Verfügung gestellt.

6CO2 + 6H2OLichtenergie−−−−−−→ C6H12O6 + 6O2 (2.1)

2.1.1 Die Überträgermoleküle

Man unterscheidet zwischen zwei Überträgermolekülen, die für den Transport von Wassersto�oder Energie vom lichtabhängigen Prozess zum lichtunabhängigen Prozess zuständig sind.

1. NADP+(Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat)ist ein Überträgermolekül, das,wie in der Gleichung 2.3 zu sehen, Wassersto� (2 Elektronen und 2 Protonen) transpor-tiert:

NADP+ + 2H+ + 2 e−Lichtenergie−−−−−−→ NADPH+ H+ (2.2)

Um das für diese Reaktion notwendige H2 zu erhalten, wurde zuvor das von der P�anzeaufgenommene Wasser in 2H+ + 2 e�und Sauersto� aufgelöst.

2. ADP (Adenosindiphosphat) ist ein Überträgermolekül, das Energie transportiert:

ADP + PiLichtenergie−−−−−−→ ATP (2.3)

Wie in der Gleichung 2.3 zu erkennen, reagiert ADP mit Pi (anorganisches Phosphat) zuATP (Adenosintriphosphat). ATP ist energiereicher als ADP und gilt in der P�anze alseine universelle Energiewährung.

2.1.2 Die lichtabhängige Reaktion der Fotosynthese

In Abbildung 2.1 ist die lichtabhängige Reaktion mit den Wegen der Elektronen und Protonendargestellt. Der Prozess läuft wie folgt ab:

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Abbildung 2.1: Lichtabhängige Reaktion [2]

1. Licht fällt auf das Blatt und somit auch auf das Fotosystem II 1, bestehend aus einigen100 Pigmentmolekülen. Dabei wird die Energie der Lichtquanten, die je nach Wellenlängeverschieden viel Energie innehaben (Energie etwa umgekehrt proportional zur Wellen-länge), von passenden Pigmentmolekülen aufgenommen. Diese nun angeregten Pigment-moleküle leiten diese Anregungsenergie weiter. Die Energie sammelt sich so schlieÿlichin einem zentralen Chlorophyllmolekül, dem sogenannten Reaktionszentrum (RZ). Dortwerden Elektronen angeregt und auf ein höheres Niveau gehoben. Das heiÿt, dass das amschwächsten gebundene Elektron auf eine höhere Schale springt.

2. Durch Akzeptormoleküle wie Plastochinon und Plastocyanin (Redoxsysteme) wird dasElektron nun in der Thylakoidmembran aufgenommen und weitergegeben.

3. Gleichzeitig werden in einem Fotolysekomplex zwei Wassermoleküle in ihre Bestandteilegespalten: O2 verlässt sofort als Sauersto� die P�anze und es bleiben 4 Protonen und 4Elektronen übrig. Ein Elektron füllt die Lücke, die durch die Bewegung des Elektrons,welches in Schritt 1 angeregt und in Schritt 2 in die Elektronentransportkette (ETK)abgegeben wurde, entstanden ist.

4. Das Elektron auf dem höheren Energieniveau gelangt zum Cytochromkomplex. Durch dieEnergie des Elektrons kann der Cytochromkomplex wie eine Pumpe betrieben werden:Protonen (H+ � Ionen) werden aus dem Stroma in den Thylakoidinnenraum gepumpt.Hierbei entsteht eine elektrische Spannung sowie ein chemischer Gradient, da durch denPumpvorgang eine unterschiedliche Protonenkonzentration erlangt wird. Der Thylakoid-innenraum hat einen Protonenüberschuss und ist daher positiv geladen, wohingegen imStroma eine negative Ladung vorherrscht.

5. Das Elektron verliert im Verlauf der Elektronentransportkette seine Energie und kommtbeim Fotosystem I an. Zeitgleich wird ein anderes Elektron auf ein höheres Energieniveaugehoben, sodass das zuvor betrachtete Elektron die neu entstandene Lücke füllen kann.

6. Das neu angeregte zweite Elektron aus dem Reaktionszentrum I wird durch einen Enzym-komplex vom Ferredoxin auf NADP+ übertragen. Es entsteht NADPH+H+ im Stroma.

1Das Fotosystem II wurde später entdeckt als das Fotosystem I. Obwohl das Fotosystem II im Prozess vor

dem Fotosystem I steht, wird es aufgrund der Entdeckung weiterhin Fotosystem II genannt.

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7. Durch einen ATP-Synthase-Komplex wird die stark unterschiedliche Protonenkonzentra-tion ausgeglichen: Die Protonen strömen zurück ins Stroma und durch diesen Ladungs-ausgleich entsteht Energie, die man an ADP-Moleküle binden kann. Es entsteht das zweiteÜberträgermolekül ATP.

Bei der lichtabhängigen Reaktion wird die Lichtenergie chemisch gebunden (Reaktionsglei-chung 2.4).

2H2O+2NADP++3 (ADP+P)Lichtenergie (8 Lichtquanten)−−−−−−−−−−−−−−−−→ O2+2 (NADPH+H+)+3ATP (2.4)

2.1.3 Die lichtunabhängige Reaktion der Fotosynthese

Im Stroma �ndet der Calvin-Zyklus statt (Abbildung 2.2). Um diesen zu vereinfachen, wird erim Folgenden nur mit Kohlensto� dargestellt:

Abbildung 2.2: Calvin-Zyklus [2]

1. Kohlensto�dioxid tri�t auf Ribulose-1,5-diphosphat (C5-Moleküle) und kurzfristig ent-steht ein C6-Molekül, welches aber schnell zu zwei C3-Molekülen zerfällt. Bei der Fi-xierung eines Kohlensto�dioxid-Moleküls entstehen durch die Energieabgabe von ATP,welches nun wieder zu ADP wird, zwei 3-Phosphoglycerat-Moleküle (PGS).

2. Diese zwei 3-Phosphoglycerat-Moleküle werden unter der Wassersto�übertragung durchNADPH+H+, welches nun wieder zu NADP+ oxidiert, zu.

3. Um Kohlensto�dioxid weiterhin zu binden, muss unter der Energieabgabe von ATP Ri-bulosediphosphat aus dem vorhandenen Glycerinaldehyd-3-phosphat (PGA) regeneriertwerden.

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Wenn bei diesem Calvin-Zyklus pro Runde stets ein Kohlensto�dioxid gebunden wird, entstehtpro drei Runden ein Glycerinaldehyd-3-phosphat, welches zum Bilden von Glukose benötigtwird. Dieser Kreislauf benötigt kein Licht. Trotzdem kann er nicht ohne Licht funktionieren,da er die Produkte der lichtabhängigen Reaktion braucht.

Bei der lichtunabhängigen Reaktion wird die Lichtenergie in Glukose �xiert (Gleichung 2.5).

6CO2+12 (NADPH+H+)+18ATP −−→ C6H12O6+6H2O+12NADP++18 (ADP+P) (2.5)

2.2 Theorie - Chlorophyll�uoreszenz

Ein Elektron wird also durch die Lichtenergie auf ein höheres Energieniveau gehoben und derElektronentransport wird eingeleitet, sodass die P�anze diese Energie für die Fotosynthesenutzen kann. Die Entstehung der Chlorophyll�uoreszenz in diesem Prozess lässt sich mithilfeder Abbildung 2.3 erklären. Diese Gra�k erklärt vereinfacht die lichtabhängige Reaktion undweist dabei auch auf die Nebenprodukte dieses Vorgangs hin.

Abbildung 2.3: Entstehung der Chlorophyll�uoreszenz [2]

1. Im ersten Schritt wird ein Elektron des Chlorophyll a-Moleküls durch rotes Licht in denersten Anregungszustand gebracht, das Elektron wird also auf ein höheres Energieniveaugehoben.

2. Danach wird das angeregte Elektron auf ein Nachbarmolekül übertragen, welches nunreduziert wird und somit in ein höheres Energieniveau gehoben wird.

3. Das heiÿt, die Energie wird für die photochemische Arbeit also für die Fotosyntheseverwendet und das ursprüngliche Molekül gelangt wieder in den Grundzustand.

4. Wenn keine photochemische Arbeit betrieben werden kann, geht diese Energie als Wärmeverloren.

5. Ein anderes Nebenprodukt, das in diesem Fall entsteht, ist ein langwelliges, energiearmes,rotes Fluoreszenzlicht, das die P�anze emittiert und so die überschüssige Energie abgibt.

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6. Mit blauem Licht gelingt es sogar ein Elektron des Chlorophyll a-Moleküls auf den zweitenAnregungszustand zu heben.

7. Von diesem noch energiereicherem Zustand fällt das Elektron unter Abgabe von Wärmeauf den ersten Anregungszustand. Die weitere Energieabgabe entspricht folglich der desroten Lichtes.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Chlorophyll�uoreszenz durch die überschüssigeEnergie entsteht, die die P�anze nicht verwenden kann und daher ein Nebenprodukt der Fo-tosynthese ist. Dieses verlässt die P�anze als rotes Fluoreszenzlicht und ermöglicht Aussagenüber den Zustand der P�anze.

2.3 Die qualitative Messmethode

Die Chlorophyll�uoreszenz ist ein langwelliges, rotes Licht, das die P�anze von sich gibt. Aberwieso leuchten unsere Bäume dann nicht alle rot? Das liegt daran, dass der sichtbare Teil derFluoreszenz viel schwächer ist als das Sonnenlicht. Die Floureszenz lässt sich mit einem kleinenTrick sichtbar machen, den wir unter [3] gefunden haben.

2.3.1 Versuch I - Test der Hilfsmittel

Materialien: P�anze (Spathiphyllum wallisii) in Dunkelkammer, UV-Taschenlampe (395nm),Rot�lterbrille, blauer Stift, grüner Stift, roter Stift, roter Gegenstand (Basketball)

Wir haben die Zwerg-Blattfahne (Spathiphyllum wallisii) für unsere Experimente aufgrund dereinfachen P�ege und den langen sowie breiten Blättern gewählt (Abbildung 2.4). Des Weiterenist diese P�anze recht robust, was unseren Experimenten zugute kommt.

Abbildung 2.4: Spathiphyllum wallisii [4]

Durchführung:

1. Setze die Rot�lterbrille in einer Dunkelkammer auf.

2. Beleuchte die Gegenstände mit der UV-Taschenlampe.

3. Wiederhole diesen Vorgang mit der P�anze und induziere auf dem Blatt mit der Taschen-lampe Fotosynthese.

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(a) Ball (b) Stifte

Abbildung 2.5: Test an Gegenständen

Beobachtung: Rote Gegenstände, wie den Basketball in Abbildung 2.5, kann man durchdie Rot�lterbrille sehen und Gegenstände, die keine rote Farbe enthalten, kann man kaumbeziehungsweise nicht erkennen. Dies wird auch bei den Stiften in Abbildung 2.5 deutlich. Denblauen Stift ganz unten erkennt man bis auf seine Spitze so gut wie gar nicht. Ähnlich verhältes sich beim grünen Stift in der Mitte, wohingegen der rote sehr gut zu erkennen ist. Das Blattder P�anze, in Abbildung 2.6 zu sehen, ist ebenfalls gut zu erkennen, obwohl es im Sonnenlichtgrün aussieht.

Abbildung 2.6: Test an der P�anze: Fluoreszierendes Blatt

Ergebnis: Durch diesen Versuch kann man die Chlorophyll�uoreszenz einfach und schnellsichtbar machen.

Für alle Objekte werden in unserem Aufbau alle Farben, die nicht rot sind, vor dem Augege�ltert. Damit kann auch das helle Licht der UV-Lampe nicht direkt das Auge erreichen. DieRot�lterbrille lässt aber das rote Licht passieren und so kann dies entsprechend optisch wahr-genommen werden.

Für die farbigen Objekte kann so eine schwache rote Re�exion des Lichts festgestellt werden.Bei der grünen P�anze hingegen, bei der der oben beschriebene Fotosyntheseprozess abläuft,kann die Chlorophyll�uoreszenz im roten Spektrum sichtbar gemacht werden.

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2.3.2 Versuch II - Versuch mit F-Schablone

Materialien: P�anze (Spathiphyllum wallisii) in Dunkelkammer, UV-Taschenlampe (395nm),Rot�lterbrille, eine dunkle Schablone in Form eines F

Durchführung:

1. Setze die Rot�lterbrille in der Dunkelkammer auf.

2. Lege die Schablone auf ein Blatt der P�anze.

3. Simuliere mit der blauen Taschenlampe für 5 Minuten Sonnenlicht.

4. Nimm die Schablone ab.

Abbildung 2.7: Fluoreszierendes Blatt mit hell leuchtendem F

Beobachtung und Ergebnis: Es ist ein F zu erkennen, welches heller als der Rest desBlattes leuchtet (Abbildung 2.7). Die Stärke des leuchtenden F nimmt mit der Zeit ab, bis manes nicht mehr vom Rest des Blattes unterscheiden kann. Der beleuchtete Teil des Blattes kannsich an die Lichteinstrahlung gewöhnen, wohingegen der durch die Schablone beschattete Teildunkel adaptiert bleibt. Wenn man die Schablone abnimmt, bekommt man daher eine gröÿereFluoreszenz im dunkel adaptierten Bereich als in dem hell adaptierten Bereich.

2.3.3 Fazit

Alles in allem ist diese Methode sehr gut um Fluoreszenz einfach sichtbar und anschaulich zumachen. Für den pädagogischen Einsatz ist diese Methode daher sehr geeignet. Für eine weiter-gehende wissenschaftliche Forschung beziehungsweise einen anwendungsbezogenen Einsatz istjedoch eine quantitative Messmethode erforderlich. Wie scha�en wir es also eine für Forschungs-zwecke geeignete Methode zu entwickeln, sodass man die Messung der Chlorophyll�uoreszenzfür automatisierte Aussagen über den Zustand der P�anze nutzen kann?

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(a) Gesamter Aufbau (b) Schaltplan

Abbildung 2.8: Unsere neue, quantitative Messmethode

(a) Spektrum der Sensoren (b) Spektrum der LED

Abbildung 2.9: Spektren

2.4 Die quantitative Messmethode

Um eine für wissenschaftliche Zwecke geeignete und kostengünstige Methode zu entwickeln, ha-ben wir einen Licht- und Infrarotsensor (Adafruit TSL2591 High Dynamic Range Digital LightSensor) und eine UV-LED (UV-Emitter 375nm 5mm radial bedrahtet Nichia NSPU510CS ) ge-kauft und diese mit einem Raspberry Pi (Raspberry Pi 3 Modell B) verbunden (Abbildung 2.8).

Der Infrarotsensor sollte die infrarote Chlorophyll�uoreszenz messen können und aufgrund sei-nes Spektrums das Licht der UV-LED gröÿtenteils ignorieren. So kann man die Fluoreszenzmessen und somit den Zustand der P�anze überwachen. Wie man in Abbildung 2.8 sieht, ha-ben wir den Sensor und die LED über eine Platine und ein Flachbandkabel mit einem Steckbrettverbunden. Auf dem Steckbrett haben wir die in Abbildung 2.8 zu sehende Schaltung aufgebaut,um so die Sensoren und die LED über einen I2C-Bus (zwei-Draht-Bus) mit den Raspberry Pizu verbinden. Da die LED einen erhöhten Strombedarf hat, mussten wir auÿerdem eine Trei-berschaltung mit Transistor vor die LED vorsehen.

In Abbildung 2.9 sieht man die Herstellerangaben bezüglich der Spektren und es ist gutzu erkennen, dass der Infrarotsensor (CH1) die Lichtintensität im roten beziehungsweise iminfraroten Bereich (>600nm) misst. Der ultraviolette Bereich der LED (375nm) liegt nicht imSpektrum des Infrarotsensors. Der normale Lichtsensor (CH0) hingegen misst auch das UV-Licht. Wir werden daher nur den Infrarotsensor (CH1) einsetzen. Abbildung 2.10 zeigt einPython-Programm, das wir für die nachfolgenden Experimente verwendet haben. Im ersten

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Schritt werden die Objektklassen initialisiert. Es gibt jeweils eine Klasse für die UV-LED, fürden Licht- und Infrarotsensor und für den erst später benötigten Temperatur- und Feuchtig-keitssensor (Adafruit Si7021 Temperature and Humidity Sensor). Die Klassen beschreiben dieAttribute (Eigenschaften) und Methoden (Verhaltensweisen) der LED und der Sensoren.

Dann wird eine Datei erstellt und geö�net, in welche später die Messdaten geschrieben werden.Der eigentliche Messzyklus beginnt mit dem Ausschalten der LED. Dieser Teil bildet die Ab-dunkelzeit (30min), bevor die Messung mit angeschalteter LED beginnt. In dieser Abdunkelzeitsoll die P�anze in den dunkel adaptierten Zustand gelangen, damit Lichtereignisse im Zeitraumdavor keinen groÿen Ein�uss auf die Messung haben. Während dieser Phase werden mittelseiner for-Schleife 180 Messwerte aus dem Sensor ausgelesen, in die Messdatei geschrieben undzur Kontrolle auf dem Monitor wiedergegeben.

Im nächsten Schritt wird die LED angeschaltet und die gleiche for-Schleife zur Messung wirderneut aufgerufen. Dieser Teil repräsentiert die eigentliche Messung der Chlorophyll�uoreszenz.Eine halbe Stunde später geht die LED dann wieder aus und nun beginnt eine 10 Minuten langeRuhephase, in der die Chlorophyll�uoreszenz abklingen sollte. Das Programm liefert uns Wertefür die Chlorophyll�uoreszenz in regelmäÿigen Abständen und somit einen Verlauf der Fluores-zenz, den wir später einfach auswerten können. Da die Werte zur Stärke der Fluoreszenz nichtnormiert sind, interessiert uns hierbei vor allem der Verlauf. Um auch aussagekräftige Werte zuerhalten, könnte man den Abstand zwischen Sensor und Blatt immer gleich einstellen, sodassman immer unter den selben Bedingungen Versuche durchführt.

Abbildung 2.10: Hauptprogramm des Standartvorgehens

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Kapitel 3

Dokumentation der Ergebnisse

3.1 Versuch I - Vergleich zwischen einem vertrockneten

und einem lebenden Blatt

Materialien: Messgerät, Ständer für Messgerät, lebendes Blatt und ausgetrocknetes Blattder gleichen P�anze (Spathiphyllum wallisii)

Durchführung:

1. Befestige das Messgerät mit dem Ständer über dem lebenden Blatt.

2. Dunkle den Raum ab.

3. Starte das Programm beziehungsweise die Messung.

4. Wiederhole den Versuch mit dem ausgetrockneten Blatt.

Beobachtung: Die Fluoreszenz ist beim ersten Kontakt mit Lichtenergie sehr hoch, steigt aufein Fluoreszenz-Maximum an und fällt schnell wieder ab, bis sie sich langsam auf etwa einemWert einpendelt (Abbildung 3.1). Dieser Verlauf ähnelt einer exponentiell fallenden Funktion,die sich an eine Asymptote annähert. Bei dem Versuch mit einem vertrockneten Blatt ist eindeutlicher Unterschied zum gesunden Blatt zu erkennen (Abbildung 3.1). Das infrarote Lichtist beim vertrockneten Blatt viel niedriger als bei einem �uoreszierenden, gesunden Blatt.

(a) Gesamter Fluoreszenzverlauf (b) Vertrocknetes Blatt

Abbildung 3.1: Vergleich 2

2 Angabe der Stärke der Fluoreszenz in relativen Sensorwerten

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Abbildung 3.2: Zoom auf den Moment des Abschaltens der LED 2

Weiterhin wäre es interessant, wenn man messen könnte, wie lange die Fluoreszenz beim Ab-schalten der LED nachwirkt. Diese Zeitdauer war, wie in Abbildung 3.2 zu sehen ist, so kurz,dass wir sie mit der Au�ösung unserer Apparatur von 10 s nicht messen konnten.

Ergebnis: Die Energie kann bei der Anregung eines Elektrons entweder als Wärme oder Chlo-rophyll�uoreszenz abgegeben oder für die photochemische Arbeit verwendet werden. Das heiÿt,dass die Energie durch den laufenden Fotosyntheseapparat in die ETK (Elektronentransport-kette) eingespeist wird. Da der Fotosyntheseapparat anfangs noch nicht angelaufen ist, kannkaum Energie für die Fotosynthese verwendet werden und viel überschüssige Energie entsteht.Es kommt zu einem Fluoreszenzmaximum. Dies erkennt man auch am anschaulichen Versuchmit dem heller leuchtendem F, da auch dort der Bereich des F am Anfang eine Maximal�uores-zenz erreicht, die im Vergleich zu dem Bereich auÿen herum deutlich heller ist. Die Stärke derFluoreszenz fällt, wie in diesem Versuch auch, recht schnell wieder auf eine Stärke, die der Fluo-reszenz des Bereiches um das F herum entspricht. Da nun der Fotosyntheseapparat angelaufenist, geht die Energie nicht mehr in die Chlorophyll�uoreszenz, sondern in die photochemischeArbeit, das heiÿt photochemische Arbeit löscht Chlorophyll�uoreszenz. Diese Parallelen zwi-schen dem qualitativen Versuch mit der F-Schablone und dem Versuch mit den Sensoren, zeigtuns, dass unser Sensor die Chlorophyll�uoreszenz zuverlässig gemessen hat.

Aus den Spektrum des Infrarotsensors und der LED lässt sich schlieÿen, dass selbst das vomInfrarotsensor gemessene Licht keine Fluoreszenz ist, sondern nur ein Messfehler, der durch dieminimale Überlappung des Spektrums der UV-LED und des Infrarotsensors zu begründen ist.

3.2 Versuch II - Kälteversuch

In diesem Versuch wollen wir die Auswirkungen von Kältestress bei einer P�anze auf die Chlo-rophyll�uoreszenz untersuchen. Unsere Hypothese basiert auf der RGT-Regel, die besagt, dassje höher die Temperatur ist, desto schneller verlaufen chemische Reaktionen. Also denken wir,dass die P�anze unter Kältestress stark eingeschränkt in ihrer Glukoseproduktion durch Foto-synthese ist. Der Calvin-Zyklus kann aufgrund der temperaturabhängigen Enzyme nicht funk-tionieren, so werden dann auch die Überträgermoleküle (NADP+ undADP) nicht regeneriertund schlieÿlich gibt es einen Elektronenrückstau in der ETK. Die Energie kann daher nicht fürdie photochemische Arbeit verwendet werden und verlässt die P�anze unter anderem als Chlo-rophyll�uoreszenz. Eine starke, exponentielle Abnahme der Chlorophyll�uoreszenz aufgrundanlaufender Fotosynthese tritt nicht auf. Mit abnehmender Kälte sollte auch wieder mehr Fo-tosynthese betrieben werden können und die Fluoreszenz sollte sich abschwächen.

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3.2.1 Qualitative Methode

Materialien: P�anze (Spathiphyllum wallisii) in Dunkelkammer, UV-Taschenlampe (395nm),Rot�lterbrille, Lux-Meter, Taschenlampe mit weiÿem Licht, Laserthermometer, Kühlelement

Durchführung:

1. Stelle die P�anze in einen abgedunkelten Raum für ca. 30 min.

2. Lege ein Kühlelement (Temperatur bei etwa -30 ◦C) unter das Blatt.

3. Beleuchte den Bereich mit einer weiÿen Taschenlampe bei 3,000 bis 5,000 Lux, sieheAbbildung 3.3.

4. Messe in regelmäÿigen Abständen die Temperatur im Bereich über dem Kühlelement undim Bereich ohne Kühlelement.

5. Setze die Rot�lterbrille auf und beleuchte den Bereich mit der UV-Taschenlampe (schaltedabei die weiÿe Taschenlampe aus).

6. Die Messzeit soll 75 min betragen.

Abbildung 3.3: Versuch unter Kältestress - Aufbau

Abbildung 3.4: Temperaturverlauf

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(a) Nach 20min (b) Nach 90min

Abbildung 3.5: Verlauf der Chlorophyll�uoreszenz - 20min/90min Vergleich (Kühlelement ober-halb des blauen Balkens)

Beobachtung und Ergebnis: Die Temperatur im Bereich ohne Kühlelement und die Tem-peratur im Bereich mit dem Kühlelement gleichen sich langsam an, da das Kühlelement mit derZeit an Kälte verliert (Abbildung 3.4). Diese Angleichung der Temperaturdi�erenz ist auch beider Fluoreszenz deutlich zu erkennen: Anfangs ist ein deutlicher Unterschied zwischen beidenBereichen zu sehen. Der kalte Bereich leuchtet deutlich heller. Dieser Unterschied gleicht sichwie der Temperaturunterschied mit der Zeit aus. Unsere Hypothese wurde bestätigt: Im kaltenBereich ist die Fluoreszenz länger stärker.

An einigen Stellen werden die Zellen der Blätter durch die Kälte physisch zerstört. Dort trittkeine Fluoreszenz und keine Fotosynthese mehr auf. Diese Stellen sind in Abbildung 3.5 alsdunkle Flecken zu erkennen.

3.2.2 Quantitative Messmethode

Um aussagekräftigere Werte zu erhalten, haben wir den Versuch unter Kältestress noch mit derquantitativen Messmethode wiederholt.

Materialien: Messgerät, Ständer für Messgerät, P�anze (Spathiphyllum wallisii), Kühlelement

Durchführung:

1. Befestige das Messgerät mit dem Ständer über dem lebendem Blatt.

2. Dunkle den Raum ab.

3. Lege das Kühlelement unter das Blatt im Bereich unter dem Sensor.

4. Starte das Programm beziehungsweise die Messung.

Beobachtung: Abbildung 3.6 zeigt den Verlauf der Chlorophyll�uoreszenz bei einer P�an-ze, die unter Kältestress steht. Dieser Verlauf unterscheidet sich deutlich vom Verlauf ohneKältestress. Die Fluoreszenz fällt exponentiell ab, jedoch verläuft der Abfall von der Maximal-�uoreszenz viel langsamer.

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Abbildung 3.6: Vergleich: Referenz - Kältestress

Ergebnis: Diese Beobachtung lässt sich auf die Enzyme im Calvin-Zyklus zurückführen. DieEnzyme, die den Calvin-Zyklus am Laufen halten, sind sehr kälteemp�ndlich und deswegen hörtder Calvin-Zyklus bei Kälte auf zu funktionieren. Es gibt einen Rückstau in der ETK, da dieÜberträgermoleküle nicht im Calvin-Zyklus regeneriert werden können. Die Energie, die vomFotosystem aufgenommen wird, verlässt die P�anze als Chloropyhll�uoreszenz. Weil sich dasKühlelement nun mit der Zeit der Raumtemperatur angleicht, steigert sich die enzymatischeUmsatzrate des Calvin-Zyklus und die Fotosynthese kann wieder langsam anlaufen. Daher wärees interessant den Versuch bei konstant bleibender Kälte zu wiederholen.

Um die Kälteabnahme aus dem Kältestressversuch herauszu�ltern, haben wir den Versuchdrauÿen an einem kalten Wintertag wiederholt.

Materialien: Messgerät, Ständer für Messgerät, Schuhkarton zum Abdunkeln des Messauf-baus, P�anze (Spathiphyllum wallisii), Kühlelement

Durchführung:

1. Starte eine Referenzmessung in einer Dunkelkammer (bei etwa 22◦C), indem du das Pro-gramm laufen lässt. Das Programm beinhaltet wie zuvor auch eine 30 min Abdunkelphase,eine 30 min Beleuchtungsphase und eine 10 min Dunkelphase zum Schluss.

2. Wiederhole die Messung drauÿen (bei etwa -5◦C) und dunkle den Messaufbau mit einemSchuhkarton so ab, dass kein Licht auf das Blatt fällt. Das Blatt ist also 30 min der Kälteausgesetzt bevor die UV-LED zur Messung angeschaltet wird.

Beobachtung: Abbildung 3.7 zeigt den Verlauf der Fluoreszenz der Referenzmessung imdirekten Vergleich mit dem der Messung unter Kältestress. Der Verlauf bei Kältestress hatnicht mehr die Form einer exponentiellen Funktion, dennoch sinkt die Fluoreszenz. Da wir beidiesem Versuch bei beiden Messungen den gleichen Abstand verwendet haben, lassen sich nunauch die absoluten Werte vergleichen. So lässt sich erkennen, dass das Maximum der Fluoreszenzbei Kältestress bei etwa der Hälfte der normalen maximalen Fluoreszenz liegt. Jedoch ist das

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Abbildung 3.7: Vergleich zwischen Referenzmessung und Messung bei Kältestress

Minimum der Fluoreszenz bei der Referenzmessung niedriger. Der Abfall der Fluoreszenz beider Messung bei Kältestress ist deutlich geringer.

Ergebnis: Diese Beobachtungen sind anhand des Calvin-Zyklus zu erklären, welcher von En-zymen katalysiert wird. Diese Enzyme sind sehr temperaturemp�ndlich und somit stoppt dannder Calvin-Zyklus bei Kältestress. Im Vergleich zum Ausgangsversuch zu Kältestress mit denKühlelementen ist zu erkennen, dass die Maximal�uoreszenz in diesem Versuch im Vergleichzur jeweiligen Referenz geringer ist. Das liegt daran, dass die P�anze bei diesem Versuch schoneine halbe Stunde davor und im anderen Versuch die P�anze erst direkt zur Messung dem Käl-testress ausgesetzt wurde. Da wir durch die konstante Temperatur keinen Temperaturanstieghaben, läuft der Calvin-Zyklus nicht wieder an und daher kann keine photochemische Arbeitgeleistet werden. Dennoch ist ein leichter Abfall der Fluoreszenz zu beobachten. Dieser Abfallberuht daher weder auf dem Temperaturanstieg noch auf der photochemischen Arbeit. Dahergibt es wahrscheinlich andere Faktoren, die die Fluoreszenz löschen können.

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Kapitel 4

Ergebnis und Ausblick

Wir haben erfahren, dass die Fotosynthese ein sehr komplexer Prozess ist, der aus einem lichtab-hängigen und einem lichtunabhängigen Vorgang besteht. Ein Bestandteil dieser für alle Lebewe-sen lebensnotwendigen Fotosynthese ist die Chlorphyll�uoreszenz, die durch die überschüssigeEnergie entsteht, die von der P�anze nicht verwendet werden kann und daher von dieser alsrotes, langwelliges, energiearmes Licht abgegeben wird.

Des Weiteren haben wir eine Methode gefunden, um die sonst nicht-sichtbare Fluoreszenz ein-fach und schnell durch den Gebrauch von zwei Hilfsmitteln sichtbar zu machen. Hierfür habenwir die P�anze in einen abgedunkelten Raum gestellt, mit einer UV-Taschenlampe das Sonnen-licht imitiert und so Fotosynthese induziert. Schlieÿlich konnten wir durch eine Rot�lterbrille,die das UV-Licht heraus�ltert, die (infra-)rote Fluoreszenz sehen.

Obwohl diese einfache Methode praktisch ist und darüber hinaus auch mögliche Unterschiededer Fluoreszenz in verschiedenen Blattregionen zeigt (Kälteversuch), ist es schwer, nur anhandvon Fotos Schlüsse über die Stärke der Fluoreszenz und über den zeitlichen Verlauf zu ziehen.Für eine wissenschaftliche Verwendung eignen sich eher quantitative Messwerte, da man so bes-ser Verläufe und Intensitäten darstellen, auswerten und miteinander vergleichen kann. Daherhaben wir eine neue Messmethode mit Hilfe eines Sensors, einer UV-LED und eines RaspberryPi entwickelt. Diese neue Methode liefert uns nun Daten bezüglich der Stärke der Fluoreszenzund letztendlich auch deren Verlauf. Da die Messwerte nicht normiert sind, interessiert unshierbei vor allem der Verlauf der Messkurven. Bei einem gesunden Blatt, welches vom dunklenins helle Licht kommt, erreicht die Fluoreszenz ein Maximum. Die Intensität fällt dann schnellab und bleibt dann auf einem annähernd konstanten Wert.

Mithilfe dieser zwei Messmethoden konnten wir nun einen ersten Versuch zum Verhalten derFluoreszenz bei einer P�anze, die einer Stresssituation ausgesetzt wurde, durchführen. Wir ha-ben mit beiden Methoden das Verhalten der Chlorophyll�uoreszenz bei Kältestress erforschtund unsere These bestätigt, dass die Fluoreszenz bei Kälte langsamer vom Maximum abfällt,da der durch temperaturemp�ndliche Enzyme katalysierte Calvin-Zyklus nicht mehr funktio-niert und so durch die fehlende Regeneration der Überträgermoleküle ein Rückstau in der ETKentsteht. Die Energie, die auf das Blatt tri�t, kann nicht verwendet werden und geht daher alsChlorophyll�uoreszenz verloren.

Die oben beschriebenen Forschungsergebnisse motivieren uns das Thema weiter zu untersu-chen. Daher wollen wir die Löschfaktoren, auf die wir im Kälteversuch gestoÿen sind, weiterhinerforschen und sie in unsere Versuche einbinden. So würden wir gerne mit anderen Stresssi-tuationen (z.B. Lichtstress, Feuchte- bzw. Trockenheitsstress etc.) und anderen P�anzenarten

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experimentieren. So könnten wir eine Datenbank der Fluoreszenzverläufe anlegen und mit derenHilfe Rückschlüsse aus einer Fluoreszenzmessung auf die spezi�sche Stresssituation einer P�an-ze ziehen. Sollten wir in der Lage sein, eine groÿe Datenbank anzulegen, würden Algorithmenaus der künstlichen Intelligenz für die Kategorisierung geeignet sein. Darüber hinaus wollenwir unsere quantitative Methode noch modi�zieren, um die betro�ene P�anze nicht immer ineine Dunkelkammer transportieren zu müssen. Stattdessen wollen wir vor Ort die Chlorophyll-�uoreszenz messen können. Auch in diesem Gebiet arbeiten wir schon am Entwurf eines erstenPrototypen.

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Wir danken unseren LehrernDr. Sabrina Alfonso

undAndreas Meier

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Abbildungsverzeichnis

2.1 Lichtabhängige Reaktion [2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42.2 Calvin-Zyklus [2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52.3 Entstehung der Chlorophyll�uoreszenz [2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62.4 Spathiphyllum wallisii [4] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72.5 Test an Gegenständen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.6 Test an der P�anze: Fluoreszierendes Blatt . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82.7 Fluoreszierendes Blatt mit hell leuchtendem F . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92.8 Unsere neue, quantitative Messmethode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.9 Spektren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102.10 Hauptprogramm des Standartvorgehens . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

3.1 Vergleich 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123.2 Zoom auf den Moment des Abschaltens der LED 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . 133.3 Versuch unter Kältestress - Aufbau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.4 Temperaturverlauf . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143.5 Verlauf der Chlorophyll�uoreszenz - 20min/90min Vergleich (Kühlelement ober-

halb des blauen Balkens) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153.6 Vergleich: Referenz - Kältestress . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 163.7 Vergleich zwischen Referenzmessung und Messung bei Kältestress . . . . . . . . 17

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Literaturverzeichnis

[1] GIDA, GmbH: Fotosynthese II - Assimilation organischer Nährsto�e (DVD). 2006

[2] Kapitel Zellatmung und Fotosynthese - Lichtabsorption in Chloroplasten. In:Zellbiologieund Sto�wechsel - Grüne Reihe. Schroedel, 2015, S. 172�173

[3] ForschungszentrumJülich: Chlorophyll�uoreszenz: Das Leuchten der P�anzen.https://www.youtube.com/watch?v=3Doj6Behc2s. � Eingesehen am 7. Januar 2017

[4] Spathiphyllum wallisii. http://plantsrescue.com/wp-content/uploads/2013/10/

Spathiphyllum-wallisii.jpg. � Eingesehen am 16. Januar 2018

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