• 论著 •

抑制Claudin-3表达对体外培养鼠视网膜神经节细胞的作用研究

曹迪   张晓梅   卢晶   王肖   刘入源   刘秋慧   罗燕   吕林

510060 广州，中山大学中山眼科中心 眼科学国家重点实验室

通信作者: 罗燕, Email: luoyan2@mail.sysu.edu.cnDOI: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.02

【摘要】 目的    观察腺相关病毒（AAV）介导小发夹RNA（shRNA）干扰抑制Claudin-3表达对体外培养

小鼠视网膜神经节细胞（RGC）的影响。 方法    原代培养小鼠RGC分为正常对照组、AAV-shScramble组、

AAV-shClaudin3组。细胞接种24 h后，AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组RGC分别转染AAV-

shScramble和AAV-shClaudin3。转染96 h后，活细胞荧光动态显微镜观察目的病毒转染效率；β-微管蛋白免疫

荧光染色检测RGC轴突长度；免疫荧光4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染色观察RGC凋亡形态；实时聚合酶链反应

(RT-PCR)检测各组RGC Claudin-3、血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达；蛋白免疫印迹法（Western

Blot）检测各组RGC Claudin-3、VEGF、B淋巴细胞瘤/白血病-2基因（Bcl-2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-

3（Caspase-3）蛋白表达水平。  结果        活细胞动态荧光显微镜观察发现 ,AAV-shScramble组、AAV-

shClaudin3组RGC病毒转染效率均＞50%；病毒转染96 h后，AAV-shClaudin3组RGC轴突长度明显低于正常对

照组、AAV-shScramble组，差异有统计学意义（F=2363.274，P＜0.05）；AAV-shClaudin3组RGC密度较正常

对照组、AAV-shScramble组明显减低，可见细胞核皱缩、趋边以及细胞核裂解形成的凋亡小体。AAV-

shClaudin组RGC的Claudin-3、VEGF mRNA表达明显低于正常对照对照组和AAV-shScramble组，差异有统计

学意义（F=257.408、160.533，P＜0.05）。AAV-shClaudin3组RGC的Claudin-3、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显

低于正常对照组和AAV-shScramble组（F=129.671、420.552、62.669，P＜0.05）；Caspase-3蛋白表达明显高

于正常对照组、AAV-shScramble组，差异均有统计学意义（F=231.348，P＜0.05）。 结论    AAV介导

shRNA干扰抑制Claudin-3的表达可下调VEGF、Bcl-2及上调Caspase-3的表达，促进RGC凋亡，抑制RGC轴突

生长。

【关键词】 视网膜神经节细胞/生理学；  紧密连接蛋白质类；  RNA，小分子干扰；  动物实验

        基金项目： 国家自然科学基金（81371020）中图分类号：R774

 The effects of down-regulation of Claudin-3 on the cultured retinal ganglion cells in vitro Cao Di, ZhangXiaomei, Lu Jing, Wang Xiao, Liu Ruyuan, Liu Qiuhui, Luo Yan, Lyu LinState Key Laboratory of Ophthalmology, Zhongshan Ophthalmic Center, Guangzhou 510060, ChinaCorresponding author: Luo Yan, Email: luoyan2@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】 Objective    To study the effect of down-regulation of Claudin-3 mediated by adeno-associated virus (AAV) of shRNA on the cultured retinal ganglion cells (RGCs) in vitro. Methods    RGCsisolated from mouse eyes were divided into normal control group, AAV-shScramble group, and AAV-shClaudin-3 group. The RGCs in AAV-shScramble group and AAV-shClaudin3 group were treated with AAV-shScramble and AAV-shClaudin-3 respectively 24 hours after cell seeding. Dynamic live cell fluorescencemicroscopy was used to observe the transfection efficiency 96 hours after transfection. Immunofluorescentstaining of β-tubulin was used to measure the length of RGCs′ axon. 4′, 6-diamidino-2-phenylindole staining wasused to observe the nuclei of apoptotic cells. The mRNA level of Claudin-3 and VEGF was measured by real-time polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein levels of Claudin-3, vascular endothelial growth factor(VEGF), Bcl-2 and Caspase-3 was determined by Western blot. Results    The positive transfection rate wasmore than 50% in both AAV-shScramble group and AAV-shClaudin-3 group. The length of RGCs' axon inAAV-shClaudin-3 group was shorter than that in normal control group and AAV-shScramble group

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(F=22 363.274, P＜0.05). Down-regulation of Claudin-3 accelerated RGCs' apoptosis with nuclei shrinkage,tapering, and nucleolus formation of apoptotic bodies. The mRNA levels of Claudin-3 and VEGF in AAV-shClaudin-3 group were lower than those in normal control group and AAV-shScramble group (F=257.408,160.533; P＜0.05). The protein levels of Claudin-3, VEGF and Bcl-2 in AAV-shClaudin-3 group were lowerthan those in normal control group and AAV-shScramble group (F=129.671, 420.552, 62.669; P＜0.05), whilethe protein level of Caspase-3 in AAV-shClaudin-3 group was higher than that in normal control group andAAV-shScramble group (F=231.348, P＜0.05). Conclusions    Down-regulation of Claudin-3 increases theexpression of Caspase-3, reduces the expression of VEGF and Bcl-2, accelerates RGCs' apoptosis and inhibit theRGCs' axon growth.

【Key words】 Retinal ganglion cells/physiology;    Claudins;    RNA, small interfering;    Animalexperimentation

Fund program:  National Natural Science Foundation of China (81371020)  

视网膜神经节细胞（RGC）功能障碍是糖尿病视

网膜病变、青光眼等多种眼科疾病发生和发展的重要

因素之一[1, 2]。本课题组前期研究首次发现Claudin-3表达于小鼠RGC中，且在不同的发育阶段及病理状态下

Claudin-3的表达和分布不同，提示Claudin-3参与小鼠

RGC氧化损伤的病理过程[3]。Claudin-3是近年来新发现

的Claudins蛋白超家族成员之一，参与细胞增生分化、

基因转录、肿瘤抑制等信号转导过程[4]。为进一步探讨

Claudin-3对RGC的作用，我们通过用携带Claudin-3小发夹RNA（shRNA）的腺相关病毒（AAV）转染体外

培养的小鼠RGC，探讨干扰抑制Claudin-3表达对

RGC轴突生长、存活及凋亡的可能机制。现将结果报

道如下。

1    材料和方法

鼠龄1～3 d的新生C57BL/6J小鼠购于中山大学动

物实验中心。293T细胞（人胚肾细胞系，购自深圳市

百恩维生物科技有限公司）；Neurobasal®-A培养基、

谷氨酰胺、青霉素和链霉素（美国Gibco公司），木瓜

蛋白酶（美国Worthington公司），β-肌动蛋白（β-actin）一抗、抗兔Claudin-3一抗（美国Invitrogen公司），抗鼠β -微管蛋白（β - t ubu l i n）一抗（美国

Abcam公司），Alexa f luor 488 荧光二抗、Alexafluor555荧光二抗（美国Cell Signaling公司），反转录

及cDNA合成试剂盒、实时聚合酶链反应（RT-PCR）

试 剂 盒 （ 瑞 士 R o c h e公 司 ） ， 辣 根 过 氧 化 物 酶

（（HRP））标记的二抗（美国DAKO公司）。

AAV-shClaudin3 AAV、AAV-shScramble阴性

AAV构建于深圳市百恩维生物科技有限公司，经合成

送测序鉴定。

AAV转染293T细胞。培养293T细胞，细胞融合度

达60%～80%时，加入AAV-shClaudin3 AAV或AAV-

shScramble阴性AAV，按最佳感染复数（MOI）=106转

染293T细胞。转染96 h后，活细胞动态荧光显微镜观察

绿色荧光蛋白（GFP）表达情况，判断转染效率。

MOI=加入病毒总数/细胞总数。

RGC原代培养。取鼠龄1～3 d的新生C57BL/6J小鼠视网膜，消化后吸取含2%B27和1%谷氨酰胺的

Neurobasal®-A培养基计数，调整细胞密度至1×106个/ml。将细胞悬液接种于经多聚赖氨酸包被的24孔培养

板或6孔培养板中，置于37℃、5% CO2孵箱内培养。其

后每3天半定量换液，倒置荧光显微镜观察细胞形态。

RGC免疫荧光鉴定。取原代RGC接种于置有盖玻

片的24孔板中，细胞培养至5 d时，行β-tubulin免疫荧光

染色，激光共聚焦显微镜下随机取4个视野对β-tubulin标记为阳性的RGC进行计数并拍照，以上实验重复3次取平均值。

AAV转染RGC。将细胞悬液接种于6孔培养板中，

分为正常对照组、AAV-shScramble组和AAV-shClaudin3组。培养24 h后，按MOI=106转染，AAV-shClaudin3组加入AAV-shClaudin-3 AAV液，AAV-shScramble组加入

AAV-shScramble阴性AAV液，正常对照组加入正常神

经细胞培养液，混匀，置于37℃、5%CO2培养箱中孵

育培养，转染96 h后，活细胞动态荧光显微镜观察拍

照。

RGC轴突长度测量。取原代RGC分为正常对照

组、AAV-shScramble组和AAV-shClaudin3组；AAV转

染96 h后免疫荧光染色鉴定RGC。倒置荧光显微镜高倍

镜下拍照并记录。采用 Image   J图像处理软件测量

RGC轴突。每组至少随机选择30个RGC测量轴突长

度，测量距离为胞体至每个细胞最长轴突位置。以上

实验重复3次取平均值。

RT-PCR检测各组RGC Claudin-3、血管内皮生长因

子（VEGF）mRNA表达。Claudin-3：上游引物5′-

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CGTACAAGACGAGACGGCCAAG-3′，下游引物 5′-CACGTACAACCCAGCTCCCATC-3′；VEGF：上游引

物5′-TGAAGCCCTGGAGTGCGT-3′，下游引物5’-AGGTTTGATCCGCATGATCTG-3′；β-actin：上游引

物5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′，下游

引物5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′。接种于6孔培

养板的RGC分为正常对照组、AAV-shScramble组、

AAV-shClaudin3组，AAV转染96 h后，提取总RNA，

将总RNA逆转录成cDNA。将各组RGC的cDNA行RT-PCR检测，采用相对定量方法，设定正常对照组表达量

为基准，定为1.0，其他各组与之作比较。实验均重复

3次取平均值。

蛋白免疫印迹法（Wes t e r n   b l o t）检测RGCClaudin-3、VEGF、Bcl-2、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表达水平。接种于6孔培养板的

RGC分为正常对照组、AAV-shScramble组、AAV-shClaudin3组，AAV转染96 h后，取蛋白样品于十二烷

基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶中电泳，经电转、

孵育相应一抗和二抗后行增强化学发光定影、显影并

扫描分析。

采用SPSS 19.0统计软件行统计学分析处理。多组

间比较行单因素方差分析；两两比较行最小显著差法

（每组n＞3）或Student t检验（每组n=3）。α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2    结果

pAAV-ZsGreen-shClaudin-3测序结果显示，插入片

断与设计序列完全一致，shRNA编码序列被正确插入

质粒骨架，pAAV-ZsGreen-shClaudin-3质粒构建成功

（图1）。

活细胞动态荧光显微镜观察发现，AAV转染

293T细胞96  h后，293T细胞病毒转染效率＞90%

（图2）。

倒置相差显微镜观察发现，细胞接种24 h后，可见

细胞基本贴壁，大部分细胞聚集成簇（图 3A）；

48 h后，具有轴突的细胞数量明显增多（图3B）；

72 h后，部分轴突长度可达到胞体的4倍以上，细胞间

或细胞自身轴突间相互连接（图3C）；7 d后，细胞开

始出现凋亡，数量减少（图3D）。激光共聚焦显微镜

像观察发现，分离混合培养的RGC阳性率＞80%，

Claudin-3和RGC呈共定位表达（图4）。

活细胞动态荧光显微镜像观察发现，AAV以

MOI=106转染RGC 96 h后，AAV-shScramble组和AAV-shClaudin3组RGC病毒转染效率均＞50%（图5）。

激光共聚焦显微镜观察发现，β-tubulin抗体免疫荧

光染色显示的RGC胞体和轴突，AAV转染RGC 96h后，AAV-shClaudin3组RGC轴突长度较正常对照组、

AAV-shScramble组明显降低（图6），差异有统计学意

义（F=2 363.274，P＜0.05），正常对照组、AAV-shScramble组之间RGC轴突长度比较，差异无统计学意

义（F=2.785，P＞0.05）（图7）。

荧光显微镜观察发现，AAV转染RGC 96 h后，

 

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 图 1     pAAV-ZsGreen-shClaudin3质粒测序图。插入片断与设计序列完全一致，shRNA编码序列被正确插入质粒骨架

 

50 μm

50 μm

50 μm

2 293T

2A 2C.

AAV-shScramblAAV

AAV-shClaudin3 AAV 96 h

293T

GFP AAV 293T

GFP

90% 50 μm

2A

2C

2B

  

3A

3C 3D

3B

50 μm 50 μm

50 μm 50 μm

 图 3     培养的RGC倒置相差显微镜像。3A. 培养24 h后，细胞基本贴壁；3B. 培养48 h后，伸出轴突的细胞数量明显增多；3C. 培养72 h后，部分轴突长度可达到胞体的4倍以上（如图中白色箭头标示），细胞间或细胞自身轴突间相互连接；3D. 培养7 d后，RGC开始出现凋亡，数量减少 标尺：50μm

中华眼底病杂志  2017 年  3 月第  33 卷第  2 期  Chin J Ocul Fundus Dis, March 2017, Vol. 33, No. 2   • 3 •    

AAV-shClaudin3组RGC密度较正常对照组、AAV-

shScramble组明显减低；AAV-shClaudin3组呈现细胞核

凋亡特征，细胞核皱缩、趋边以及细胞核裂解形成的

凋亡小体（图8）。

RT-PCR检测结果显示，AAV-shClaudin3组RGCClaudin-3、VEGF mRNA表达较正常对照组、AAV-shScramble组下降，差异均有统计学意义（F=257.408、160.533，P＜0.05），正常对照组、AAV-shScramble组之间RGC Claudin-3、VEGF mRNA表达比较，差异无

统计学（F=2.375，3.028，P＞0.05）（图9）。

Western blot检测结果显示，与正常对照组、AAV-shScramble组比较，AAV-shClaudin3组RGC Claudin-3、VEGF、Bcl-2蛋白表达明显降低（F=129.671、420.552、62.669），Caspase-3蛋白表达明显升高（F=231.348），

差异均有统计学意义（P＜0.05），正常对照组、AAV-

 

4A

4C 4D

4B

10 μm 10 μm

10 μm 10 μm

 图  4          RGC激光共聚焦显微镜像。4A. β-tubulin标记的RGC呈红色荧光；4B. RGC可见GFP；4G. 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚标记的RGC呈蓝色荧光；4H. 共定位。混合培养的RGC阳性率＞80%，Claudin-3和RGC呈共定位表达 标尺：10μm

 

10 μm

10 μm

10 μm

5A

5C

5B

5 RGC

5A 5C.

AAV-shScramble

AAV-shClaudin3 AAV

RGC 96 h AV-shScramble

AAV-shClaudin3 RGC

GFP 50%

10 μm  

10 μm

6C

10 μm

6A

10 μm

6B

6 β-tubulin

RGC

β-tubulin GFP

DAPI

6A 6C. AAV-

shScramble AAV-shClaudin3

AAV-shScramble

RGC AAV-shClaudin3 RGC

10 μm 

 

300

200

100

0

RG

C

AAV-shClaudin3AV-shScramble

Ctrl

AAV-scramble

AAV-shClaudin-3

7

* *

 图  7     三组RGC轴突长度测量结果。AAV-shClaudin3组RGC轴突长度较正常对照组、AAV-shScramble组明显缩短。*与AAV-shClaudin3组比较，P＜0.05

 

50 μm

50 μm

50 μm

10 μm

10 μm

10 μm

8A 8B

8C 8D

8E 8F

 图 8     三组RGC荧光显微镜像。8A、8B. 正常对照组；8C、8D. AAV-shScramble组；8E、8F. AAV-shClaudin3组。AAV-shClaudin3组RGC密度明显减低；AAV-shClaudin3组可见细胞核皱缩、趋边以及细胞核裂解形成的凋亡小体DAPI 8A、8B、8E标尺：50 μm；8B、8D、8F 标尺：10 μm

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shScramble组之间Claudin-3、VEGF、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达比较，差异无统计学意义（F=0 . 5 2 9、4.011、2.286、4.378，P＞0.05）（图10B）。

3    讨论

shRNA进入细胞后形成RNA诱导沉默复合体，导

致靶mRNA的降解，从而抑制相关基因表达，目前已广

泛应用于各种基因干扰设计 [5]。AAV载体具有无致病

性，低免疫原性，可介导外源基因长期表达等优点，

已尝试用于多种疾病的治疗 [ 6 ,   7 ]。本研究首次应用

AAV介导shRNA干扰抑制Claudin-3显著下调Claudin-3基因和蛋白表达水平，进而抑制体外培养小鼠RGC轴突生长，促进其凋亡。

Claudin-3作为Claudins蛋白超家族成员之一，在调

控细胞增生凋亡、肿瘤生长等信号转导过程中有重要

作用 [8]。本研究结果发现，抑制Claudin-3表达会抑制

RGC的轴突生长、促进其凋亡；同时可降低VEGF、Bcl-2蛋白表达，促进Caspase-3蛋白表达。Bcl-2可阻止

凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来 [ 9 ]，

Caspase-3可促进细胞DNA的降解从而导致细胞凋

亡[10]。因此，我们初步推测抑制Claudin-3表达可能通过

降低抗凋亡基因Bcl-2及促进凋亡基因Caspase-3的表达

来影响RGC轴突生长及凋亡，其具体机制将在今后的

研究中进一步深入的探讨。

本研究结果还发现，抑制Claudin-3基因表达会减

少VEGF的表达。近年来一些研究均证实VEGF具有神

经保护作用。VEGF会促进损伤后神经功能的恢复[11]；

直接作用于神经，如VEGF可促进神经轴突的生长和体

外培养神经细胞的存活[12]。VEGF可保护由于缺氧引起

的小鼠海马神经元细胞和体外培养的大脑皮质神经元

的死亡[13, 14]。因此，我们推测AAV介导shRNA干扰抑制

Claudin-3表达抑制RGC轴突的生长，促进细胞的凋亡

可能与其下调VEGF表达也有关，具体机制有待进一步

深入研究。

本研究首次发现AAV介导shRNA干扰抑制Claudin-3的表达会下调VEGF、Bcl-2及上调Caspase-3的表达，

抑制RGC轴突的生长，促进RGC凋亡，降低其存活

率。为视网膜神经细胞性疾病的治疗提供了新思路。

4    参考文献

Li CP, Wang SH, Wang WQ, et al. Long Noncoding RNA-Sox2OTknockdown alleviates diabetes mellitus-induced retinal ganglion cell(RGC) injury[J]. Cell Mol Neurobiol, 2017, 37(2): 361-369. DOI:10.1007/s10571-016-0380-1.

[1]

Wang AL, Carroll RC, Nawy S.Down-regulation of the RNA editingenzyme ADAR2 contributes to RGC death in a mouse model of

[2]

 

1.5

1.0

0.5

0

9A

9B

AAV-shClaudin3AV-shScramble

**

Cla

ud

in-3

mR

NA

1.5

1.0

0.5

0

AAV-shClaudin3AV-shScramble

*

*

VE

GF

mR

NA

 图 9     Claudin-3、VEGF mRNA表达结果。9A. Claudin-3mRNA；9B. VEGF mRNA。AAV-shClaudin3组RGC Claudin-3、VEGF mRNA表达较正常对照组、AAV-shScramble组降低。*与AAV-shClaudin3组比较，P＜0.05

 

β-actin

Claudin-3

VEGF

Bcl-2

Caspase-3

AV-shScramble 组 AAV-shClaudin3 组正常对照组

10A

AV-shScramble AAV-shClaudin3

6

4

2

0

** *

**

* *

*

cldn3 VEGF Bcl-2 Caspase-3

10B

 图 10     三组RGC Claudin-3、VEGF、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达情况。10A. 电泳图；10B. 三组RGC Claudin-3、VEGF、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达结果。AAV-shClaudin3组RGC中Claudin-3、VEGF、Bcl-2蛋白表达较正常对照组、AAV-shScramble组明显降低；Caspase-3蛋白表达明显升高。*与AAV-shClaudin3组比较，P＜0.05

中华眼底病杂志  2017 年  3 月第  33 卷第  2 期  Chin J Ocul Fundus Dis, March 2017, Vol. 33, No. 2   • 5 •    

glaucoma[J/OL].  PloS  One,  2014,  9(3):  91288  [2014-03-07].http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0091288.  DOI:  10.1371/journal.pone.0091288.Luo Y, Xiao W, Zhu X, et al. Differential expression of claudins inretinas during normal development and the angiogenesis of oxygen-induced retinopathy[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011, 52(10):7556-7564. doi: 10.1167/iovs.11-7185.

[3]

Haines RJ, Beard RS Jr3, Chen L, et al. Interleukin-1β mediates β-catenin-driven downregulation of claudin-3 and barrier dysfunctionin  Caco2  cells[J].  Dig  Dis  Sci,  2016,  61(8):  2252-2261.  DOI:10.1007/s10620-016-4145-y.

[4]

Mansoori  B,  Sandoghchian  Shotorbani  S,  Baradaran  B.RNAinterference and its role in cancer therapy[J]. Adv Pharm Bull, 2014,4(4): 313-321. DOI: 10.5681/apb.2014.046.

[5]

Flotte TR.Adeno-associated virus-mediated gene transfer for lungdiseases[J]. Human gene therapy, 2005, 16(6): 643-648.

[6]

Romano  G.Current  development  of  adeno-associated  viralvectors[J]. Drug News Perspect, 2005, 18(5): 311-316.

[7]

Morin PJ.Claudin proteins in human cancer: promising new targetsfor diagnosis and therapy [J]. Cancer Res, 2005, 65(21): 9603-9606.

[8]

Chen Q,  Xu T,  Li  D,  et  al.  JNK/PI3K/Akt  signaling pathway isinvolved in myocardial ischemia/reperfusion injury in diabetic rats:effects of salvianolic acid A intervention[J]. Am J Transl Res, 2016,

[9]

8(6): 2534-2548.Ilisso  CP,  Sapio  L,  Delle  Cave  D,  et  al.  S-AdenosylmethionineAffects  ERK1/2  and  Stat3  pathways  and  induces  apotosis  inosteosarcoma cells[J]. J Cell Physiol, 2016, 231(2): 428-435. DOI:10.1002/jcp.25089.

[10]

Wang YC, Sanchez-Mendoza EH, Doeppner TR, et al. Post-acutedelivery  of  memantine  promotes  post-ischemic  neurologicalrecovery, peri-infarct tissue remodeling, and contralesional brainplasticity[J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2017, 37(3): 980-993. DOI:10.1177/0271678X16648971.

[11]

Hubenia OV, Minchenko DO, Minchenko OH, et al. Changing ofthe  expression  of  VEGF genes  encoded important  regulators  ofangiogenesis  and  neurogenesis  under  hypoxic  and  ischemicconditions[J]. Lik Sprava, 2012(7): 103-107.

[12]

Welberg L.Adult neurogenesis: uncoupling the roles of VEGF[J].Nat Rev Neurosci, 2011, 12(5): 247. DOI: 10.1038/nrn3028.

[13]

Jin  KL,  Mao  XO,  Greenberg  DA.  Vascular  endothelial  growthfactor: direct neuroprotective effect in in vitro ischemia[J]. Proc NatlAcad Sci USA, 2000, 97(18): 10242-10247.

[14]

（收稿日期：2016-09-21）（本文编辑：江影、唐健）

    • 6 • 中华眼底病杂志  2017 年  3 月第  33 卷第  2 期  Chin J Ocul Fundus Dis, March 2017, Vol. 33, No. 2