Das Auftreten von Metachromasie, Doppelbrechung und Dichroismus durch die Toluidinblaureaktion

Metachromasia, Double Refraction and

Dichroism Caused by Toluidine Blue Reaction

GEORG SCHEUNER JURGEN HUTSCHENREITER

Mit 48 Abbildungcn

GUSTAV FISCHER VERLAG· STUTTGART· 1975

Doz. Dr. sc. med. GEORG SCHEUNER Dr. rer. nat.JURGEN HUTSCHENREITER Anatomisches Institut der Karl-Marx-Universitat 701 Leipzig (DDR), Liebigstr. 13

Die Untersuchungen wurden durch die klinische Forschungsabteilung Perinatologie des Bereichs Medizi der Karl-Marx-Universitat Leipzig unterstiitzt

[SBN 3-437-10401-2

g Gustav Fischer Verlag· Stuttgart· 1975 . Aile Rechte vorbehalten ::;esamtherstellung: Druckerei Mayr, Miesbach Printed in Germany

Inhaltsverzeichnis

Summary.

1. Einleitung

2. Material und Technik ..

3· Eigenschaften von Toluidinblau .

4· Bindungspartner fiir Toluidinblau

5. Durchfiihrung der Toluidinblaureak­tion

4

7

8

6. 6.1. 6.1. 1.

Auswertung der Toluidinblaureaktion IO

Analyseder Absorptionserscheinungen IO

Deutung der Ursache der Metachro-masle II

6.1.2. EinfluBmoglichkeiten auf die meta-chromatische Reaktion . 16

6.1.2.1. EinfluB des pH-Wertes der Farbstoff-losung .. 17

6. I .2.2. EinfluB der Temperatur 18

6.1.2.3. EinfluB von Athylalkohol 20

6.2. Analyse der Doppelbrechungserschei-nungen 22

6.2.1. Physikalische Grundlagen der Doppel-brechung biologischer Objekte 22

6.2.2. Wirkung der Toluidinblauanlagerung auf die Doppelbrechung von Gewebs-strukturen 25

6.2.2.1. Dispersion der Doppelbrechung . 26 6.2.2.1.1. EinfluB der Brechzahl des Durchtran­

kungsmediums und des pH-W ertes der Farbstofflosung 27

6.2.2.1.2. EinfluB der Temperatur 6.2.2. 1.3. EinfluB von Athylalkohol 6.2.2.2. Moglichkeiten der polarisationsopti­

schen Auswertung durch standardi­sierte Gangunterschiedsmessungen ..

6.2.2.2.1. Nachweis gerichtet angeordneter schwefelhaltiger saurer Gruppen .

6.2.2.2.2. Nachweis gerichtet angeordneter phosphorhaltiger saurer Gruppen

6.2.2.2.3. Nachweis gerichtet angeordneter Carb­oxylgruppen

6.2.2.2.4. Praktische Auswertung der standardi-

6.3. 6·3·1.

6.3.2.

sierten Gangunterschiedsmessungen

Analyse des Dichroismus " Physikalische Grundlagen des Dichro­ismus biologischer Objekte . Dispersion des Dichroismus von Ge­websstrukturen nach Toluidinblauan-lagerung.

6.3.2.1. EinfluB der Brechzahl des Durchtran­kungsmediums und des pH-Wertes der Farbstofflosung

6.3.2.2. EinfluB der Temperatur

6.4. Zusammenhang zwischen den opti­schen Erscheinungen der Toluidin­blaureaktion ..

7. Zusammenfassung

8. Literatur .

9. Sachregister ..

41

43

45

47

49

53

53

54

55 56

66

Contents

I.

2.

3·

4·

5·

6.

6.1. 6.1.1.

6.1.2.

6.1.2.1.

6.1.2.2. 6.1.2·3. 6.2.

6.2.1.

6.2.2.

Summary (in English) ..

Introduction .

Materials and methods .

Properties of toluidine blue .

Bond partners of toluidine blue ..

How the toluidine blue reaction is performed ..

Evaluation of the toluidine blue reac-tion Analysis of absorption phenomena .. Interpretation of the cause of meta­chromasia Possibilities of influencing the meta-chromatic reaction Effect of the pH value of the solution of stain .. Effect of temperature .. Effect of ethyl alcohol .. Analysis of double refraction pheno-mena Physical aspects of the birefringence of biological objects .. Effect of the addition of toluidine blue on the birefringence of tissue struc-tures

6.2.2.1. Dispersion of double refraction

3

4

7

S

IO

IO

II

I6

I7 IS 20

22

22

25

6.2.2. I. I. Effect of the refractive index of the impregnating agent and of the pH value of the solutiQll of stain 27

6.2.2.1.2. Effect of temperature .. 3 S 6.2.2. I.3. Effect of ethyl alcohol. . 40 6.2.2.2. Possibilities of polarization-optical

evaluation by standardized measure­ments of the difference in optical path 4I

6.2.2.2. I. Detection of specifically oriented sul-furous acid groups 43

6.2.2.2.2. Detection of specifically oriented phosphorous acid groups .. 45

6.2.2.2.3. Detection of specifically oriented car-boxylgroups. 47

6.2.2.2.4. Practical evaluation of standardized path difference measurements ., 49

6·3· Analysisofdichroism.. 53 6.3.1. Physical aspects of the dichroism of

biological objects.. 53 6.3.2. Dispersion of dichroism of tissue

structures after addition of toluidine blue 54

6.3.2.1. Effect of the refraction index of the impregnating agent and of the pH value of the solution of stain. 55

6.3.2.2. Effect of temperature .. . . . . . . 56 6.4. Relationship between the optical phe­

nomena of the toluidine blue reaction 56

7·

S.

Summary (in German)

Bibliography

26 9. Subject index.

Summary

The present paper is concerned with those optical phenomena which may be caused in histological structures by the toluidine blue reac­tion. They relate to absorption as well as refrac­tion properties. The paper gives a detailed description of how the toluidine blue reaction is carried out on histological preparations.

The analysis of absorption results leads, in connection with physicochemical considera­tions, to a new explanation of the cause of toluidine blue metachromasia. In this, the assumption is made that the conditions of attachment of protons to the hydrogen-bearing nitrogen of dye molecules are largely responsible for the occurrence of metachromasia, the way in which the attachment of the proton to this quaternary nitrogen is influenced being of no consequence in this particular connection. It may result from both a combination of homo­geneous toluidine blue molecules into associates and a shift to the alkaline region of the pH value of the dye solution. However, the term meta­chromasia is used to describe only that shift of the absorption spectrum which is produced by associates. The thus produced metachromasia ("concentration metachromasia") involves the development of a so-called "y-band" (with an absorption peak of A= 546 nm), there being a causal rather than a fundamental difference between the latter band and the normal meta­chromatic [L-band (with an absorption peak of A = 54onm). Whereas in the case of concentra­tion metachromasia and for an aqueous solution there may be observed an association of dye molecules having a maximum intermolecular distance of less than 5 angstrom units, which is due to the large number of toluidine blue mole­cules per unit volume, [L-metachromasia is usu­ally observed in connection with chromotropic structures. This association results in the lone­pair electrons of the hydrogen-bearing nitrogen atom being included in the intermolecular resonance system, which in turn results in the attachment of a proton to this nitrogen being weakened, which leads to the assumption of a

Metachromasic, Doppelbrechung, Dichroismus . I

red color. The difference to y-metachromasia lies in the fact that even by treatment with dilute solutions, in which the dye is present in a monomeric form, such a metachromasia may be produced on account of the sufficiently dense charge pattern of the chromotropic structure. This particular pattern tends to induce an asso­ciation of dye molecules which in turn are asso­ciated, through hydrogen bridges, with the anionic groups.

The orthochromatic toluidine blue reaction was found to be a possible method of detecting bridge-bond-active hydrogen in histological structures. The cause of the assumption of a blue color, which is observed in this connection, is a monomeric attachment of the dye. Additional factors leading to ortho-chromatism are also discussed.

Yielding important information on both the submicroscopical structure of histological ob­jects and the kind of attachment of toluidine blue are variations in the optical anisotropy of structures dyed with toluidine blue in addition to characteristic absorption phenomena. There­fore, on the basis of information on the physical aspects of double refraction of biological objects, statements are made regarding the polarization­optical behavior of metachromatic structures, con­sideration being given in this respect to the question of the effect that the refractive index of the imbibition medium has on the dispersion of birefringence.

Also, an attempt is made to offer an explana­tion, or give an interpretation, of the curves of dispersion. This involves a reinterpretation of the role played by the so-called point of inflec­tion. The variations in intrinsic double refraction and form birefringence of histological structures, which are due to the attachment of toluidine blue, are also discussed. Standardized measure­ments of the relative retardation of optical paths or path difference, respectively, enable a rela­tively quantitative determination of acid groups attached to chromo tropic structures to be made through the medium of the toluidine blue

2 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

reaction. This new method makes it possible, with the aid of quotients that may be deter­mined thereby, to obtain additional information on the positiOIlS of lIlacromolecules within struc­tures which may be made visible by the agency of light optics. In this connection, tabulation permits to distinguish between sulforous acid groups as well as carboxyl groups.

The predictive value of an evaluation of the dispersiol1 of dichroism after toluidine blue staining is discussed, and this provides valuable information for improving the conditions of observation of these dichroic phenomena.

In addition, the effects on the above-described optical phenomena of the pH value of the dye solution, the temperature, and of ethyl alcohol are discussed.

Considerations regarding the interplay of these optical properties of histological objects stained using toluidine blue lead to the realiza­tion that double refraction and dichroism need not necessarily occur concurrently. However, metachromatic effects, birefringence, and di­chroism usually occur concurrently because biological structures in the submicroscopic realm are very often based upon preferred directions of orientation of macromolecules. Different 1I1odels are presented along with infor­mation for their mutual delimitation, which facilitate a submicroscopic structural analysis in the case of concurrent occurrence of optical pheno­mena and also illustrate and show those struc­tures of biological objects, which lend themselves for attachment thereto of toluidine blue.

1. Einleitung

Bei den histochemischen Verfahren entstehcn im allgemeinen Reaktionsprodukte, die einen qualitativel1 Nachweis entsprechender Substanzen ermoglichen. In den letzten Jahren hat sich ver­starkt das Bedlirfnis entwickelt, darliber hinaus zu reproduzierbaren quantitativen Aussagen zu gelangen. Der Einsatz der histophysikalischen Technik ist gecignet, uns in dicser Richtung einen Schritt weiter zu bring en. Noch 1962 wurde auf dem Kolloquium der Gcsell­schaft flir Histochemie in Wien festgestellt, daB die Polarisationsmikroskopie nur sehr gering en Nutz~n bei der Strukturaufklarung von Inter­zellularsubstanzen besitzt (LINDNER 1962). Aus­gchend von den Untersuchungen ROMHANYIS (1963) liber die submikroskopische strukturelle Grundlagc der metachromatischen Reaktion folgten aber dann experimentelle Arbeitcn, die die Brauchbarkeit der polarisationsoptischen Technik zum qualitativcn sowie quantitativen histochemischen Nachweis defmierter chemi­scher Gruppen oder Substanzen aufzeigten (ROMHANYI und JOBST 1962; NEMETH-CSOKA 1965; NEuMARK 1966; ROMHANY1 1967, 1968, 1971; ROMHANYI und DEAK 1967, 1969; ROMHANYI et al. 1970, 1972, 1973; SCHEUNER und WEISS 1967; SCHEUNER und HANTZSCHEL 1967; SCHEUNER 1968; DEAK 1970; MODIS et al. 1971; SCHEUNER et al. 1971; VIDAL 1972; SCHEUNER und HUTSCHENREITER 1972; HUT­SCHENREITER und SCHEUNER 1973; MODIS 1974). In diesem Zusammenhang wollen wir mit vor­liegendem Beitrag versuchen, zum Auftreten der optischen Anisotropie und Metachromasic histologischer Objekte Stellung zu nehmen sowie gleichzeitig mit Hilfe dieser Erscheinungen Moglichkeiten flir ihren verbreiterten Einsatz in der morphologischen Forschung anzugeben.

2. Material und Technik

Flir die Untersuchungen verwendeten wir geburtsreife Plazenten, Augen (4. Dezennium) und Trachea k Dezennium) von Menschen.

Mctachromasic, Doppelbrechung, Dichroismus . 3

Von einem Teil des Gewcbcs wurden Kryostat­schnitte angefertigt (Schnittdicke 5 fLm). Das restliche Material sowic die Kryostatschnitte fixierten wir in ro%igem neutralisierten Formaldehyd. Nach Paraffincinbettung des verbleibenden Gcwebes wurden Schnittc mit einer Dicke von 5 fLm hergestellt.

Um das Paraffin aus dem Gewebe herauszu­losen, behandelt man die Schnittc normaler­weise mit Xylol. Flir polarisationsoptische Untersuchungen reicht jedoch eine Xylolein­wirkung auch Uber lang ere Zeit nicht aus, da nicht das gesamtc Paraffin auf diese Weise aus dem Gewebe entfernt wird. Weil Paraffm selbst doppelbrechend ist, kommt es dadurch zu unerwi.inschten starken Verandcrungen der Doppelbrechungserscheinungen im Gewebe. Zur vollstandigen Elltfemung von Paraffin aus Paraffinschnitten haben wir deshalb flir die polarisationsoptische Untersuchung folgende V orbehandlung durchgefUhrt:

1. Paraffinschnitte in Xylol 30 min

2. Oberfiihren in absoluten Alkohol 5 min

3. Methanol-Chloroform (r: r) bei 50° C, 24 h

4. Oberfiihrcn in absoluten Alkohol 5 min

5. In Abhangigkeit von der Weiterbehandlung

a) cntweder Oberfiihren in 70%igen Alkdhol IO min und anschlieBend Einbringen in Wasser (von hier aus Wciterbehandlung mit hydro­philen Medien moglich)

b) oder Einstellen in Xylol I und Xylol IIje IO min

Als chromotrope Modellsuhstal1zcll fUr die Anlagerung von Toluidinblau setzten wir Kationenaustauscher ein. Es kamen dabei SE­und CM-Zellulose (Serva, Heidelberg) sowie Sephadex SE (Pharmacia, Uppsala) zur An­wendung.

Flir die Toluidinblaureaktion (Durchflihrung s. S. 8.) verwendeten wir Toluidinblau 0 (Merck, Darmstadt), das nach V orschrift von CLEMENS und TOEPFER (1968) durch zweimaliges U mkristallisieren gereinigt wurde.

Als Puffir/osungen wandten wir Phosphat­Zitronensaure-Puffer (Mc Ilvaine) und Veronal­Azetat-Puffer (nach Michaelis) an.

4 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

Histoche111ische Vorbehandlungell

Blockierungsreaktionen: Veresterung: 25 ml Methanol und I ml Thionyl­chlorid bei 56° C, 2 h (GEYER 1962). Alkylierung: 12,5 ml Methyljodid mit 87,5 ml Methanol, das mit Na2C03 gesattigt ist, bei 45° C, 24 h (TERNER 1964). Sulfatierung: 0,5 ml konz. H 2S04 in IOO ml Essigsaureanhydrid, 10 min (ROMHANYI et al. 1973)·

Oxidation mit KMn04 :

Behandlung fur 3 min mit einer Lasung aus 2 Teilen 2,5%igcr KMn04-Lasung, 2 Teilen 5%iger H 2S04 , 16 Teilen Aqua dest., Spulen (2 min) in Aqua dest., Bleichen in 3%iger Oxalsaure fUr IO sec (STERBA 1964).

Enzymatische Vorbehandlungen: Desoxiribonuklease: I mg DNase in 9 ml 0,025 M Veronal-Azetat-Puffer bei pH = 7 und I ml 0,3%ige waBrige MgCI2-Lasung, 24 h, 37° C. Ribonuklease: 1,0 mg/ml Aqua dest. bei 37° C, 3 h. Testes-Hyaluronidase (Hylase «Dessau»): 30 IEI ml Veronal-Azetat-Puffer bei pH=6, 37° C, 12 h.

Die Absorptionskurven von histologischen Objek­ten wurden mit dem Mikroskopfotometer (VEB Carl Zeiss, Jena) aufgenommen. Zur quantita­tiven fotoelektrischen Bestimmung des Dichrois-1/lUS braehten wir einen drehbaren Polarisator in den Strahlengang des Mikroskopfotometers ein (SCHEUNER und HUTSCHENREITER 1970a).

Fur die Untersuehung der Tel1lperaturabhiin­gigkeit der Metachro111asie tropft man o,l%ige Lasung von Toluidinblau 0 zu einer Sephadex­SE-Aufsehwemmung in Wasser so lange, bis das Sephadexgel bei mikroskopiseher Kontrolle rotviolett, d. h., metaehromatiseh erseheint und das Lasungsmittel noeh nieht gefarbt ist. Die mit Toluidinblau beladene Sephadex-SE-Sus­pension braehten wir auf den Objekttrager und deckten sie, urn vor Austroeknung zu sehutzen, mit einem Glasehen abo

Fur die Aufstellung der Absorptionskurven in Abhangigkeit von der Temperatur verwen­deten wir einen Heiztiseh, der mit einem umlaufthermostaten gekoppelt war. Wir ar­beiteten bei Temperaturen zwischen +4° C und +90° C. Wahrend der Messung war darauf zu aehten, daB der Quellungszustand der Sephadex-

partikel unverandert blieb. Gegebenenfalls muBtc entspreehend temperiertes Wasser zugegeben werden. Trotz WasseruberschuB kam es bei einem Temperaturanstieg von 4° C auf 90° C zur Verringerung des Durehmessers der maxi­mal gequollenen Sephadexpartikel urn 2% (HUTSCHENREITER et al. 1972).

Absorptionsl1lessungen an Losungen erfolgten mit dem Speeord (VEB Carl Zeiss, Jena).

Die polarisationsoptischen Untersuchungen wur­den mit dem Polarisationsmikroskop Amplival pol d (VEB Carl Zeiss, Jena) unter Verwendung von Braee-Kahler-Drehkompensatoren, einer Bertrand-Platte und je naeh Fragestellung mit Hilfe eines Heiztisehes durehgefuhrt (SCHEUNER und HUTSCHENREITER 1967; HUTSCHENRE1TER und SCHEUNER 1968). Fur Messungen im mono­ehromatisehen Lieht standen Metallinterferenz­filter (VEB Carl Zeiss, Jena) zur Verfligung (ausfuhrliehe Teehnik S. SCHEUNER und HUT­SCHENREITER 1972). Die Streuung der MeB­werte (s) ist dabei abhangig von der Hahe des Ganguntersehiedes und laBt sich naeh folgender Formel erreehnen: S=0,030' r (SCHEUNER und HUTSCHENREITER 1967).

Zur qualitativen Bestimmung des Dichrois11lus wendeten wir die Methode von ZaCHER und JACOBY (1927) an.

Als Imbibitionsmedien setzten wir versehiedene Mischungen von Gummi arabicum und Wasser, denen 0,2% Kaliumferrieyanid zuge­geben worden war, ein. Die den untersehied­lichen Lasungen entspreehenden Breehzahlen wurden bei Zimmertemperatur (20° C ± 2°C) und unter Zuhilfenahme eines Umlauf thermo­staten mit dem Abbc-Refraktometer (VEB Carl Zeiss, Jena) bestimmt, wobei die ermittel­ten Breehzahlen auf A= 589 nm zu beziehen sind. Zum QuellungseinfluB bei derartigen Messungen S. SCHEUNER und HUTSCHENRE1TER (1973).

3. Eigenschaften von Toluidinblau

Da alle weiteren Aussagen im Zusammenhang mit der Anwendung von Toluidinblau erfolgen, sollen die dafur wesentlichen Farbstoffcharak-

teristika angegeben werden. Beim Toluidinblau handelt es sich urn einen Thiazinfarbstoff, der in der Histochemie verb rei tete Anwendung findet. Ausfuhrliche Hinweise zu den wichtig­sten Eigenschaften dieser Farbstoffgruppe geben HARMS (1965) und TOEPFER (1970 a). Von Toluidinblau existieren die rote, in nichtwaBri­gen Losungsmitteln gut losliche Iminobase (I) und das blaue Farbsalz, das als Hydrochlorid der Iminobase (2) aufzufassen ist.

(2)

Die Molmasse des blauen Farbsalzes betragt 305,8 bei der Summenformel C15H16NgSCl. In Wasser ergibt sich fur gereinigtes Toluidinblau o bei 26°C eine Loslichkeit von 3,83% (CONN 1961, zitiert nach TOEPFER 1970a). Die pH-Werte I%iger waBriger Losungen von Toluidinblau verschiedener Hersteller variieren nach GRAU­MANN und Musso (1959) zwischen pH = 3,06 und pH = 6,62. Die genannten Autoren er­klaren damit die Unterschiede der zu erzielenden Farbeeffekte bei den einzelnen Farbstoffprapara­ten. Da die verschiedenen Firmen folglich Tolui­dinblau produzieren, das mit unterschiedlichen Substanzen verunreinigt ist, empfiehlt sich in jedem FaIle aus Grunden der Reproduzierbar­keit der Ergebnisse, den fur histochemische Re­aktionen verwendeten Farbstoff zu reinigen. Derartige Verunreinigungen sind oft anorganische Salze, die einen erheblichen unkontrollierbaren EinfluB auf den Farbevorgang haben konnen. Ein einfaches Reinigungsverfahren geben CLEMENS und TOEPFER (1968) an. Beim einmaligen «Um­losen» betragt die Ausbeute an Rekristallisat

Metachromasic, Doppelbrcchung, Dichroismus . 5

danach tiber zwei Drittel des in Losung gege­benen Farbstoffpulvers. Nach mehrmaligem «Umlosen» erhalt man einen Farbstoffgehalt von ca. 95%. Flir die Herstellung der Absorptions­kurven (Abb. I) verwendeten wir Toluidinblau o von Merck nach zweimaligem Umlosen.

Stark verdunnte Toluidinblaulosung zeigt bei pH = 4.0 (Veronal-Azetat-Puffer) ein Absorpti­onsmaximu11l bei A=630nm (Abb. I, Kurvel). Dieses Maximum (IX-Bande) ist charakteristisch flir monomer vorliegenden Farbstoff. Nach den theoretischen Berechnungen von LEWIS (1945) ergibt sich ebenfalls flir die mono mere Form ein Absorptionsmaximum bei A=630nm (vgl. auch TOEPFER 1970a). Bei Erhohung der Tolui­dinblaukonzentration kommt es zur Herausbil­dung eines neuen Maximums (~-Bande, Abb. I, Kurve 2), welches in den kurzwelligen Bereich verschoben ist und das Vorhandensein dimerer Farbstoffassoziate neben monomerem Toluidin­blau anzeigt. Durch weitere Steigerung der Konzentration entstehen immer groBere, poly­mere Assoziate. In Abhangigkeit davon ver­lagert sich das Absorptionsmaximum weiter in noch kurzwelligere Gebiete (Abb. I, Kurve 3). Andere zur Assoziatbildung fahige Farbstoffe, wie z. B. Akridinorange (SHIGEFUSA et al. 1972) zeigen gleiches Verhalten. Bei einer ge­sattigten Toluidinblaulosung bildet sich ein Maximum bei A= 546 nm heraus (y-Bande, TOEPFER 1970a). Zur Charakterisierung des visu­ellen Farbeindruckes derartiger Losungen ist es gunstiger, den Schwerpunkt der spektralen Vertei­lung anstelle des Absorptionsmaximums heranzu­ziehen (STONE 1967, HUTSCHENREITER u. Mitarb. 1972).

Das blaue Farbsalz und die Iminobase liegen in waBriger Loslmg nebeneinander in einem Gleichgewicht vor, welches durch exogene Fak­toren beeinfluBt werden kann. So ist beispiels­weise bei alkalischen pH-W erten das Gleich­gewicht in Richtung der Iminobase verschoben (Abb. I, Kurve 4). Das spiegelt sich in der Absorptionskurve deutlich wider, da ein flir die Iminobase charakteristisches Absorptionsmaxi­mum bei A = 540 nm neben einem Maximum im langwelligen Bereich (typisch fur Farbstoff­assoziate) auftritt. Bei der gleichen Wellenlange

6 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

E

1,5

7,0

0,5

3 /',

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~: ..... :.~~.~:?~~--// ... ~:~;~~ 400 '+50 500 550 600 700 ;t[nm]

Abb.1. Absorptionskurven waBrigerToluidinblaulosungen - 1: Konzentration 3' ro-S%ig, Veronal-Azetat­Puffer, pH=4,0, Sehiehtdieke 5,0 em; 2: Konzentration 1,25' ro-2 %ig, Veronal-Azetat-Puffer, pH=4,0, Sehiehtdieke 0,1 em; 3: Konzentration 5' ro-2 %ig, Veronal-Azetat-Puffer, pH=4,0, Sehiehtdieke 0,1 em; 4: Konzentration ro-2 %ig. pH =14,0 (mit NaOH eingestellt), Schichtdicke 0,2 cm; 5: Konzentration ro-2 %ig nach Zugabe von 500 IE Heparin/ml, Veronal-Azetat-Puffer pH =4,0, Sehiehtdicke 0,2 cm.

Figure 1. Absorption curves of aqueous solutions of toluidine blue. - 1: Concentration 3 . ro-S%. Veronal­acetate buffer, pH = 4.0. Layer thickness 5.0 cm. 2: Concentration 1.25' ro-2 %. Veronal-acetate buffer, pH = 4.0. Layer thickness 0.1 cm. 3: Concentration 5' ro-2 %. Veronal-acetate buffer, pH = 4.0. Layer thickness 0.1 cm. 4: Concentration ro-2 %. pH = 14.0 (adjusted with the use of NaOH). Layer thickness 0.2 cm. 5: Concentration ro-2 % after addition of 500 1. U. of heparin/m!. Veronal-acetate buffer, pH = 4.0. Layer thickness 0.2 cm.

(A= 540 nm) bildet sich ein Maximum heraus, weun der Farbstofflosung Heparin zugesetzt wird (Abb. I, Kurve 5). Diese sog. fL-Bande (<<metachromatische» Bande, S. S. I2) entsteht durch Assoziation von Toluidinblauassoziaten an die dissoziiert vorliegenden sauren Gruppen des Heparins. Auch durch andere chromotrope Substanzen kaun die gleiche fL-Bande entstehen.

Neben den interessanten Absorptionseigen­schaften kann Toluidinblau noch andere opti­sche phanomene wie Doppelbrechung und

Lineardichroistllus hervorrufen. Streicht man Toluidinblaulosung oder Toluidinblausubstanz auf dem Objekttrager aus und poliert vorsichtig in einer Richtung, so erhalt man durchsichtige Schichten von Toluidinblau, die im Polarisa­tionsmikroskop zwischen gekreuzten Polarisa­toren Doppelbrechung zeigen. In Abb.2 ist der Dispersionsverlauf dieser Doppelbrechung an­gegeben. Aus den Dispersionskurven folgt, daB in beiden Fallen die Toluidinblauassoziate zur Bezugsrichtung unterschiedlich orientiert sind:

Mctachromasic, Doppelbrcchung, Dichroismus . 7

T[nm]

70

50

30

10 x ....

........ x .... 2 ' ..... x ..... __

-10 500 550 600 650 .:l[nm]

-30

-50

-70 x

Abb.2. Dispcrsionskurvcn der Doppclbrechung. - 1: Ausstrich einer r%igcn waBrigcn Toluidinblaulosung; 2: Ausstrich von Toluidinblausubstanz.

Figure 2. Dispersion curves of double refraction. -1: Smcar of a r % aqucus solution of toluidinc blue. 2: Smcar of toluidine-blue substancc.

beim Ausstrich der Lasung in Strichrichtung, beim Ausstrich der Substanz senkrecht dazu. Der Dichroismus zeigt ebenfalls ein entgegen­gesetztes verhalten (MrSSMAHL 1964). Der Farb­sto££lasungsausstrich hat negatives Vorzeichen, der Farbstoffsubstanzausstrich positives V or­zeichen des Dichroismus.

FUr die Deutung der optischen Erscheinungen biologischer Objekte nach Anlagerung von Toluidinblau sind die Untersuchungen von FAUTREZ und L1S0N (1937) interessant. Danach ergibt sich in o,s%iger waBriger Lasung ein Radius der Toluidinblauteilchen von 6,5 A bis 6,6 A.

4. Bindungspartner fur Toluidinblau

Ais Bindungspartner fUr Toluidinblau kom­men in histologischen Praparaten vor allem MakromolekUle mit sauren Gruppen (Polyan­ionen) in Frage. Es handelt sich dabei im wesent­lichen urn Glykosaminoglykane, Nukleinsauren

und Polypeptide, die Sulfat-, Sulfin-, Sul£on­sauregruppen, Phosphat- und Carboxylgruppen tragen kannen.

Der Dissoziationsgrad der anionischen Grup­pen ist in Abhangigkeit vom pH-Wert qer umgebenden Lasung unterschiedlich. Bei nied­rigen pH-Werten dissoziieren lediglich die schwefelhaltigen sauren Gruppen. Steigt der pH-Wert an, dann kommt es in zunehmendem MaBe zur Dissoziation der Phosphat- und Carboxylgruppen. Die Toluidinblaukationen binden sich auf Grund elektrostatischer Wech­selwirkungen an die dissoziierten sauren Grup­pen der Makromolehile unter Bildung eines salzartigen Komplexes. Durch diese Reaktion gelingt der qualitative histochemische Nachweis saurer Gruppen. Dabei verandern sich nicht nur die Absorptionseigenschaften der Makromole­kule, sondern es kommt auch zu meBbaren Anderungen des Gangunterschiedes der Doppel­brechung.

Die Oberschaubarkeit chemischer Reaktionen am biologischen Objekt wird haufig durch die Vielfalt der dabei in Betracht kommenden

8 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

chemischen Verbindungen bzw. funktionellen Gruppen kompliziert. Deshalb haben Modell­substanzen in diesem Zusammenhang eine be­sondere Bedeutung. Sie sollen chemisch defi­niert und Ubersichtlich strukturiert sein. Dabei ist wesentlich, daB sie der histochemisch inte­ressierenden Substanz moglichst ahnlich sind (SCHEUNER et al. 1970). Makromoleklile mit Ionenaustauscherfunktionen sind als derartige Modellsubstanzen fur die Histochemie (FRANZ und TITZE 1969) und fUr unsere hier zu be­handelnden Fragestellungen mit V orteil zu verwenden. Besonders z. B. Sephadex- und Zellulosekationenaustauscher, die -COOH­bzw. -S03H-Gruppen gebunden an Kohlen­hydratstrukturen enthalten, lassen sich hier ein­setzen. Folgende V orteile konnen dabei ausge­nutzt werden: 1. Bekannte chemische Struktur, die dem prinzi­

piellen Aufbau von Glykosaminoglykanen nahekommt (Strukturgrundlage: Kohlen­hydrat mit anionischen Gruppen vergleich­barer Aciditat).

2. Reinheit der verwendeten Substanz im Unterschied zur heterogenen Zusammen­setzung chromotroper Stoffe im Gewebe.

3. Moglichkeit der Variation funktioneller Grup­pen.

4. Leichte Handhabung bei der mikroskopischen Untersuchung.

5. GUnstige quantitative fotoelektrische Ermitt­lung der Extinktionen bei vorgegebener MeBfeldgroBe.

6. Keine speziellen Absorptionskanten im sicht­baren Spektralbereich. Auch Agar kann als Modellsubstanz Einsatz

fmden (SHUlCHI et al. 1969). Durch Modellversuche ist es mit Hilfe dieser

Substanzen moglich, zusatzliche Aussagen zur Problematik der Beziehungen zwischen Meta­chromasie und optischer Anisotropie zu ma­chen (s. S. 63).

5. Durchfiihrung der Toluidinblaureaktion

Grundlage der von ROMHANYI (1963) ange­gebenen Methode zur DurchfUhrung der

Toluidinblaureaktion an Gewebsschnitten ist die Stabilisierung u1ld Verstiirkung der Reaktiol1 durch Zugabe einer Kaliumferricyanidlosung oder Kaliumjodidlosung (ROBINSON und BACSICK 1958) nach erfolgter Toluidinblaufarbung. Da­bei kommt es zu einer komplexen Prazipitat­bildung zwischen Toluidinblau und Kalium­ferricyanid. HEBENSTREIT und KELLER (1968) sowie PAL und MANJU-BISWAS (1971) haben in dies em Zusammenhang den EinfluB komplexer Cyanide sowie ein- und mehrwertiger Anionen auf die Metachromasie von Glykosaminogly­kanen und Toluidinblau untersucht. Daraus ergibt sich, daB Kaliumferrocyanid eine groBe Affinitat zum Toluidinblau aufweist. Bei ent­sprechenden Konzentrationen der Substanzen liiBt sich spektrometrisch eine Farbverschiebung des Absorptionsmaximums des Toluidinblau von A = 640 nm nach A = 600 nm nachweisen. Daraus geht hervor wie auch PAL und MANJU-BISWAS (1971) sowie PAL und KUMAR-ASH (1973) feststellen - daB nicht nur hochmolekulare, sondern auch niedermoleku­lare Verbingungen mit Toluidinblau eine Metachromasie hervorrufen konnen. So zeigt HgCl2 mit Toluidinblau eine deutliche fur die Metachromasie typische Absorptionskurve. We­der Kaliumferricyanid, noch einwertige Anionen (CI-, Be, J-), mehrwertige Anionen (S042-, P043-, P2074-) oder andere komplex~ Cyanide wie Ni(CN)42-, CU(CN)43-, CO(CN)63- und Mo(CN)S4- fuhren jedoch zu einer solchen charakteristischen Veranderung des Absorp­tionsspektrums des Toluidinblaus. Wahrend Kaliumferrocyanid, da es selbst eine metachro­matische Reaktion des Toluidinblaus herbei­fuhrt, nach HEBENSTREIT und KEllER (1968) kein geeignetes Mittel zur Stabilisierung der Meta­chromasie Glykosaminoglykan-haltiger Ge­websschnitte ist, laBt sich Kaliumferricyanid hier gut einsetzen. Kaliumferricyanid fuhrt zu einer Verstarkung des Absorptionsmaximums des metachromatisch reagierenden Toluidin­blau-Heparin-Komplexes (Abb.3). An Ge­websschnitten tritt durch Einwirkung von Kaliumferricyanid eine Intensivierung der Me­tachromasie (Veranderung des Farbtons von violett nach rot-violett) auf. 1m Zusammenhang

Mctachromasic, Doppclbrcchung, Dichroismus . 9

E

0,20

0,10

550 600 650 A[nmJ

Abb.3. Absorptionskurven von Toludinblaulosungen mit Heparin und Kaliumferricyanid (nach HEBEN­STREIT und KELLER 1968) - 1: 2 ml Heparinlosung (Hoffmann-LaRoche, 2,14' ro- 4M) mit I ml waBriger Toluidinblaulosung (7,04' ro-SM) und I ml Aqua dest.; 2: 2 ml Heparinlosung (Hoffmann-LaRoche, 2,14' IO-4M) mit I ml waBriger Toluidinblaulosung (7,04' ro-SM) und I ml waBrigerKaliumferricyanid­losung (4 . ro-4M).

Figure 3. Absorption curve of toluidine-blue solutions with heparin and potassium ferricyanide (after HEBENSTREIT and KELLER 1968). - 1: 2 ml of heparin solution (Hoffmann, La Roche, 2, 14' ro- 4 M) with I ml of aqueous toluidine-blue solution (7.04' ro-s M) and I ml of distilled water. 2: 2 ml of heparin solution (Hoffmann, La Roche, 2, 14 . ro- 4 M) with I ml of aqueous toluidine-blue solution (7.04 . IO-s M) and I ml of aqueous potassium ferricyanide solution (4 . 10-4 M).

mit den spektrometrischen Untersuchungen von HEBENSTREIT und KELLER (1968) ist daflir unserer Ansicht nach eine Verlagerung des Schwerpullktes der spektralen Verteilung verant­wortlich zu machen. Ursachlich kommt es dabei zu einer zusatzlichen Anlagerung von Kalium­ferricyanid an den Glykosaminoglykan-To­luidinblau-Komplex, wobei die Bindung zwi­schen Glykosaminoglykan und Toluidinblau nicht gelost wird. Hierdurch erfahrt der ur­sprungliche Glykosaminoglykan-Toluidinblau­Komplex eine wesentliche molekulare Ver­groBerung und Stabilisierung (HEBENSTREIT und KELLER 1968). Die Wirkung einer solchen Prazipitationsbehandlung zur Stabilisierung der Reaktion kann danach so erklart werden, daB die Ferricyanidmoleki.ile mit den Toluidinblau­assoziaten einen orientierten Komplex bilden, ohne eine Zerstorung der primaren Farbstoff­orientierung an der Struktur bzw. ohne orien­tierte Artcfaktprazipitationen hervorzurufen.

Eine weitere wichtige V oraussetzung fi.ir die Durchfuhrung der Reaktion ist, die Praparate nach Toluidinblaubehandlung nicht mehr mit Alkohol in Beruhrung zu bringen (s. S. 40). Wir fuhren die Reaktion mit dem Ziel der polarisationsoptischen Auswertung an formal­dehydfixierten Paraffinschnitten durch. Dabei ist speziell fur eine quantitative Untersuchung zu beachten, daB verschiedenartige Fixation die Metachromasie unterschiedlich stark hervor­treten laBt (LEHY 1970). rm einzelnen geht man folgendermaBen vor:

I. Paraffinschnitte mit Methanol-Chloroform (I :1) bei 50° C 12 Stunden behandeln.

Hierbei wird alles Paraffin mit Sicherheit heraus­gelost. Fiir polarisationsoptische Untersuchungen, die sich dann anschlieBen sollen, reicht die sonst ge­brauchliche Xyloleinwirkung zur Entfernung des Paraffins nicht aus, da die Extraktion von Paraffin dabei nicht immer vollstandig erfolgt. Weil Paraffin selbst doppelbrechend ist, kommt es dadurch zu unerwunschten starken Veranderungen der Doppel­brechungserscheinungen im Gewebe. Eine quantita-

I') • G. SCHEUNER . ]. HUrSCHENREITER

tive und auch qualitative optische Analyse ist 111

diesen Eillen dann nicht moglich. 2. Dberfiihren in absoluten Alkohol (5 min),

anschlieBend in 70%igcn Alkohol (10 min) und zuletzt in Aqua dest. (10 min). Soli die Toluidinblau­reaktion an Gefrierschnitten durchgefiihrt werden, dann empfiehlt es sich, unfixierte oder mit Formal­dehyd fixicrte Gcfrierschnitte 30 min flieBend zu wassern und anschlieBend 10 min in Aqua dest. zu bringen. Der weitere Untersuchungsgang verlauft dann genauso wie fUr Paraffinschnitte.

3. Praparate mit Filterpapier vorsichtig abtrocknen und anschlieBend mit Gummi arabicum iiberziehen, mindestens 10 h trocknen lassen und die fUr die Trocknung gewahlte Zeit bei allen Praparaten eines zusammenhangenden Untersuchungsganges gleich halten. Polarisationsoptischc Messung des Objekt­Gangunterschiedes (r 0) bei der gewiinschten Wellen­lange.

4. Lagc des MeBobjekts im Gesichtsfeld genau festhalten, damit eine exakte Messung an der gleichen Objektstelle nach Toluidinblauanlagerung moglich ist. Dazu unbedingt die Koordinaten des Kreuz­tisches und die Winkelcinstellung des Objekttisches fUr das jeweilige Praparat notieren. AuBerdem gegebenenfalls Anfcrtigung eines Mikrofotos oder einer Zeichnung. AnschlieBend durch Einstellen in Aqua dest. (10 min) vorsichtiges Ablosen der Gummi-arabicum-Schicht.

5. Farbung mit einer o,I%igen Losung von gereinigtem Toluidinblau 0 (Reinigungsvorschrift nach CLEMENS und TOEPFER 1968) in Veronal­Azetat-Puffer (MICHAELIS) ohne Natriumchlorid oder in Phosphat-Zitronensaure-Puffer (MelLV AINE) bei dem gewiinschten pH-Wert fUr 10 min. Obwohl REUTTER et al. (1970) Dichlorpseudoisocyanin fUr den Nachweis saurer Gruppen dem Toluidinblau vorziehen, wiirden wir dieses Problem auf Grund der fUr das Dichlorpscudoisocyanin nicht moglichen pH-Wert-Abstufung differenzierter betrachten.

Die Verwendung von Pufferlosung zur Unter­suchung chromotroper Strukturen ist auf Grund der unterschiedlich starken Salzkonzentrationen bei den verschiedenen Puffereinstellungen nicht ideal (KAWA­MOTO und GRAUMANN 1969). Daher muB in jedem Faile der Untersuchungsgang standardisiert werden. Aile Aussagen haben auch deshalb nur relativ quantitativen Charakter.

6. Kurzes Spiilen der Prapatate in der jeweils verwendeten Pufferlosung.

7. Einstellen der Schnitte in cine 2%igc waBrigc Kaliumferricyanidlosung (oder in cine Losung aus 7 Teilen 2%iger Kaliumjodidlosung und I Teil 2%iger Kaliumferricyanidlosung, ROMHANYI und DEAK 1969) fUr I min. Auch anderen Substanzen wie Kaliumrhodanid, Kaliumpermanganat oder Ammoniummolybdat konnen fUr diese Prazipita­tion Verwendung finden.

8. Praparate vorsichtig mit Filterpapier abtrock­nen.

9. Dberziehcn mit Gummi arabicum, in dem 0,2% Kaliumferricyanid (oder das entsprechendc Prazipitationsmittel) gclost ist.

10. Schnitte mindestens 10 h trocknen lassen (vgl. Punkt 3). Polarisationsoptische Messung des Objektgangunterschieds (rllI) bci det gewiinschten Wellenlange.

Je nach Fragestellung kann man die so gewonne­nen Gangunterschiede (r 0 und rl\I) zucinander in Beziehung setzen (s. S. 42), urn ein MaB fiir den Grad der Toluidinblauanlagerung zu erhalten, oder zur Ermittlung des Dispersionsverlaufes rl\I in Ab­hangigkeit von der Wellenlange auftragen (s. S. 27).

6. Auswertung der Toluidinblaureaktion

1m Zusammenhang mit der Untersuchung der Anlagerung von Toluidinblau an Gewebs­strukturen konnen in Abhangigkeit von der Art des mikroskopischen Verfahrens unterschied­liche Erscheinungen beobachtet werden, durch die jeweils andersartige Angaben zur gleichen molekularen Struktur moglich sind. Es sind dadurch qualitative und quantitative Aussagen tiber das V orkommen und den Orientierungs­grad interessierender Substanzen und zugehori­ger funktioneller Gruppen zu erhalten. Wah­rend die normale Hellfeldmikroskopie eine Analyse der Absorptionseigcnschaftcn nur un­abhangig von der Schwingungsrichtung des durchfallenden Lichtes gestattet, werden mit dem Polarisationslllikroskop einmal Veranderun­gen der Doppelbrechung festgestellt und zum anderen Absorptionseigenschaften in Abhangig­keit von der Schwingungsrichtung des durch­fallenden Lichtes ermittelt.

6.1. Analyse der Absorptions­erscheinungen

Die Toluidinblaureaktion, die in der Histo­chemie zum Nachweis saurer Gruppen vcr­wendet wird (s. S. 42), kann entweder visuell oder aber besser fotometrisch beurteilt werden. Unter Metachro1l1asie (Lit. s. TOEPFER 197oa) ver­steht man dabei die Anderung des Absorptions-

spektrums des reinen Farbstoffes, die durch die Anwesenheit chromotroper Stoffe hervor­gerufen wird. Beim Toluidinblau kommt es hier bei Durchstrahlung der Praparate mit weiBem Licht zu einer fiir das Auge sichtbaren Farbverschiebung von Blau nach Rot, die foto­metrisch erfaBbar ist. In einem sehr allgemeinen Sinne verstehen BOOl] et al. (1953) sowie BOOl] (1958) unter Metachromasie die rever­sible Verschiebung im Spektrum eines organi­schen Farbstoffes, wobei Veranderungen durch pH-Wechsel oder Losungsmittel ausgeschlossen werden. In der Definition von BOOl] (1958) bleibt offen, wodurch es zu einer reversiblen Verschiebung im Spektrum eines Farbstoffes kommcn kann. Die Ursache einer derartigen Verschiebung kann also unterschiedlich sein und spielt danach fiir die Beurteilung der Metachro­masie keine Rolle.

6.1.1. Deutung der Ursache der Metachromasie

Als Ursache der Metachromasie kann die Bildung von Farbstoffassoziaten aus mehreren Toluidinblaumolekiilen angesehen werden. Die Bedingungen, welche zur Assoziatbildung fiih­ren, sind unterschiedlich. Derartige Assoziate konnen sich z. B. in waBriger Losung bei stei­gender Farbstoffkonzentration bilden, aber auch durch das Vorkommen chromotroper Struktu­ren in Farbstofflosungen induziert werden. D. h., das Vorhandensein chromotroper Struk­turen Wr das Zustandekommen der Metachro­masie istzwar hinreichend, aber nicht notwendig.

Das Medium, in dem metachromatische Reaktionen auftreten, ist von groBer Bedeutung. Bei biologischen Objekten spielt in diesem Zusammenhang das Wasser eine wichtige Doppelrolle. Da es selbst durch die Ausbildung von Wasserstoffbriicken zwischen den einsamen Elektronenpaaren des Sauerstoffs und den Wasserstoffatomen der benachbarten Wasser­molekiile eine ausgepragte Struktur besitzt, kann es nach SCHEIBE (1970) seinen Ordnungs­grad durch die Anlagerung an die hydrophoben Oberflachen von Farbstoffmolekiilen und Ma­kromolekiilen erhohen. Die dadurch bewirkte

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . I I

Entropieerniedrigung versucht das System durch Oberflachenverkleinerung auszugleichen. Damit wird die Anlagerung des Farbstoffes an Makro­moleklile begiinstigt. Sind die anionischen chromotropen Strukturen so angeordnet, daB die Abstande dieser Gruppen den Abstanden det Moleklile im Toluidinblauassoziat etwa ent­sprechen, so wird durch eine derartige chromo­trope Struktur (Matrize) die Assoziation seht beglinstigt. Nach SCHEIBE (1970) kommt es in solchen Fallen schon zur Assoziation bei um Zehnerpotenzen niedrigeren Farbstoffkonzen­trationen.

Die durch die Funktion des Wassers ausgeloste Oberflachenvetkleinerung des Systems kann auch durch Assoziation der Fatbstoffmoleklile untereinander zustande kommen. Nach SCHEIBE (1970) ist dieser Effekt im Wasser als Losungs­mittel am groBten. Eine damit zusatzliche Rolle bei der Assoziatbildung des Farbstoffes spielen die Wassermoleklile durch die Abschirmung der gleichnamigen elektrischen Ladungen der Farb­stoffmoleklile (SCHEIBE und ZANKER 1958). Unter Assoziation an die chromotrope Substanz ist in diesem Zusammenhang eine Wasserstoff­briickenbindung zwischen den elektronegativen Gruppen der chromotropen Struktur und dem Farbstoffkationassoziat zu verstehen.

Flir die Erscheinung der Metachromasie. ist weiterhin eine andere Form der Assoziation wesentlich, wie sie auch in Losungen und Gemischen auftritt. Wir gehen dabei von der Annahme aus, daB sich die benachbarten To­luidinblaumoleklile gegeneinander verdrehen, wobei die potentielle Energie dieses Systems ein Minimum erreicht. Daraus ergibt sich, daB diese weitere Form der Assoziation nur auf­treten kann, wenn die von einem Molekiil ausgehenden Bindungskrafte in verschiedenen Richtungen verschieden sind. Diese Disper­sionskrafte Whren deshalb bei symmetrisch ge­bauten Moleklilen niemals zur Assoziation. Bei unsymmetrisch gebauten Molekiilen ist jedoch eine Assoziation moglich (GRIMSEHL 1968). Beim Toluidinblau kommt es hier zur Bildung dimerer und polymerer Assoziate. Die Bedin­gungen flir deren Auftreten sowie ihre Eigen­schaften werden von TOEPFER (1970a) im einzel-

12 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

nen angegeben. Flir monomer vorliegendes Toluidinblau ergibt sich cine Absorptionskurvc, die als IX-Bat/de bezeichnet wird (Absorptions­maximum A = 630 nm); bei dimer vorliegendem Toluidinblau tritt eine sog. ~-Ballde auf (Ab­sorptionsmaximum A= 593 nm). Nach SCHEIBE (1970) kann man die dimere Form des Farb­stoffcs als Kopplung zweier Elektronenoszilla­toren mit gleicher Eigenfrcquenz auffassen. Dabei kommt es zum Auftreten von zwei neuen Frequenzen, wobei die eine hoher und die andere niedriger ist als die Eigenfrequenz der Einzeloszillatoren. Hat das dimere Moleklil eine hohe Symmetrie, so bleibt ein Obergangs­moment cntsprechend einer starken Lichtab­sorption nur flir die hohere Frequenz. Das zu beobachtende Absorptionsband ist im Vergleich zum Monomeren nach kiirzeren Wellen ver­schoben. Flir polymeres Toluidinblau (gesattigtc Farbstofflosung) entsteht eine "{-Ban de (Ab­sorptionsmaximumA= 546 nm).

Bei der Rcaktion chromotroper Substanzen mit Toluidinblau ergibt sich in der Absorptions­kurve die sogenannte fl.-Bande (A = 540 nm), die Ausdruck eines metachromatischen Zustandes ist (Abb. I). Dabei kommt es in Anlehnung an SCHEIBE und WORZ (1966) sowie SCHEIBE (1970) durch die Anlagerung der chromotropen Struktur moglicherweise zu einer Storung der Assoziatsymmetrie, wodurch die langwellig verschobene Bande schwach erscheint. Begriffe wie «IX-, ~- oder y-Metachromasie» am histolo­gischen Schnitt, die weitverbreitet angewandt werden (KrsZELY und POSALAKY 1964), sind unzutreffend. Die metachromatische Reaktion ist stets mit delll A~tftreten einer fl.-Ban de verbunden. In Abhangigkeit von den Reaktionsbedingungen ist es moglich, visuell trotzdem einen unter­schiedlichen Farbeindruck von metachromatisch reagierenden histologischen Strukturen zu ge­winnen. obwohl in allen derartigen Fallen eine fl.-Bande vorhanden ist, kann doch das gesamte Absorptionsspektrum unterschiedlich aussehen. Zur Charakterisierung des Absorptionsver­haltens sollte deshalb der Schwerpunkt der spek­tralen Verteilung dienen (s. S. 18).

Da trotz zahlreicher Untersuchungen der Chemismus der Toluidinblaumetachromasie

he ute immer noch nicht als vollsrandig geklart betrachtet werden kann, fiihrten wir zu dieser Frage ausgehend von unseren friiheren Unter­suchungen (FRANZ et al. 1971) weitere Modell­versuche durch:

1. Sephadex-Kationenaustauscher (CM-Sepha­dex), die enge Beziehungen zu Glykosaminogly­kanen haben (s. S. 8), wurden mit einer alkoholi­schen Toluidinblaulosung in athanolischcr Suspen­sion nach dem Cetylpyridiniummechanismus (FRANZ und GLOCKNER 1971) gefarbt. Dabei bleibt der Quellungszustand wcitgehend erhalten. Beim Er­warmen der alkoholischen Suspensionen auf 60° C bis 70° C ist eine Rot-Violettfarbung (Absorptions­maximum bei A = 530 nm) des alkoholischen Uberstandes festzustellen. Die Intensitat der Blau­farbung der Sephadex-Partikel nimmt da bei abo Abkiihlung des Systems fiihrt zur Entfarbung des Uberstandes, wobei die Farbung der Partikel wieder etwa die Ausgangsintensitat erreicht.

2. Werden alkalisierte waBrige Losungen von Toluidinblau mit unpolaren organischen Losungs­mitteln wie Benzol oder Hexan extrahiert, so erhalt man rote bzw. gelbrote Losungen. Extrahiert man diese wiederum mit Wasser, so resultiert bei Ent­far bung der organischen Phase eine blaue Losung des Farbstoffs in Wasser. Destilliert man nach scharfer Trocknung der roten oder gelbroten Losungen das organische Losungsmittel unter strengem FeuchtigkeitsabschluB ab, so verbleibt ein tiefblauer fester Riickstand.

3. Wenn zu den roten Farbstofflosungen in Benzol bzw. zu den gelbroten in Hexan Losungs­mittel gegeben werden, die zu Briickenbindungen befahigte Wasserstoffatome enthalten, so tritt Farb­verschiebung nach Blau auf, deren AusmaB von der Konzentration des zugesetzten Losungsmittels ab­hangig ist (System Farbstofflosung in Benzol! Athanol siehe Abb.4).

4. Behandelt man histologische Praparate mit einer o,l%igen Toluidinblaulosung bei pH = 14, dann farben sich Strukturen, die zur Briickenbindung fahigen Wasserstoff enthalten (z. B. Kohlenhydrate im Fibrin), blau an, wahrend Strukturen mit vor­wiegend sauren Gruppen stark metachromatisch reagieren. Zu einem qualitativ gleichen Ergebnis kommt man bei Farbung histologischer Schnitte mit der in Chloroform gelosten roten Iminobase. Liegen Lipide z. B. in Form paraplasmatischer Zellein­schliisse vor, dann kommt es zur roten Anfarbung dieser Fettstoffe auf Grund der Losung der Iminobase in den Lipiden (BECKER und QUADBECK 1952). Diese Erscheinung bezeichnet man als «Pseudometa­chromasie» (FAUTREZ-FIRLEFEYN 1954).

5. Nach Einwirkung einer o,l%igen Toluidin­blaulosung bei pH = 1,0 farben sich - abgesehen von metachromatisch reagierenden, stark saure Gruppen

T[%J

o

20

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60

80

Metachromasic, Doppclbrcchung, Dichroismus . 13

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Abb.4. Transmissionsgrad (T) benzolischer Losungen der Iminobase von Toluidinblau in Abhangigkeit vom Athanolgehalt.

Figure 4. Degree of transmission (T) of benzolic solutions of the imino base of toluidine blue as a function of the ethanol content.

enthaltenden Strukturen - die gleichen Gewebs­bestandteile blau an, die auch bei pH = 14 blau er­schein en.

6. Sulfoathyl (SE) - und Carboxymethyl (CM) -Zellulose farben sich nach Behandlung mit o,l%iger Toluidinblaulosung bei pH = 7,0 blau an (Abb.S). Nach gleichartiger Farbung und anschlieBender Einwirkung von Kaliumferricyanid, das Bedeutung bei der polarisationsoptischen Analyse der Toluidin­blauanlagerung besitzt, werden Zellulosepartikel metachromatisch.

Diese experimentellen Befunde deuten Wlr folgendermaBen:

Bei der Bindung des blauen Farbsalz-Kations (s. S. 5) an metachromotrope Strukturen kommt es infolge der Wechselwirkungen der n:-Elektronen der konjugierten, in definiertem Abstand angeordneten Ringsysteme der Farb­stoffmolekiile, d. h., durch deren Assoziation

zu einer Einbeziehung des freien Elektronen­paares des wasserstofftragenden Stickstoffatoms in das intermolekulare Resonanzsystem. Die Bindung eines Protons an diesen Stickstoff, von der die Blaufarbung abhangt, wird dadurch geschwacht. Dieser V organg fiihrt zu einer Verschiebung des Gleichgcwichts zur roten Iminobase hin (3).

sePhOdex) -- COO-- H+- I ~ = (TOIUidinbIOU CM OSsozlote

zunehmende Rotfdrbung Iminobose

(3)

zunehmende Bloufdrbung Farbsolz

Erwarmen der Sephadex-Partikel in waBriger Suspension (s. S. 4) fiihrt infolge Zunahme des

14 • G. SCHEUNER • J. HUISCHENREITER

Abb.5. «Orthochromatische» Toluidinblaufarbung bei pH=7 einer SE-Zellulosefaser. EinschluBme­dium: Gummiarabicum. 320: 1.

Figure 5. "Orthochromatic" toluidine-blue staining (atpH=7) of an SEcellulose fiber. Inclusion medium: Gum arabic. 320:1.

Unordnungsgrades zu einer Schwachung der Wechselwirkungen zwischen den Farbstoff­molekiilen (HUTSCHENREITER et al. 1972). Das bedeutet nach unserer Anschauung eine «Frei­setzung» des N-Elektronenpaars und damit eine zunehmende Protonenbindungsfahigkeit des

H

betrachteten Stickstoffatoms. Obereinstimmend mit den experimentellen Erfahrungen resultiert mit steigender Temperatur zunehmende Farb­verschiebung nach Blau. Dagegen findet in athanolischer Suspension beim Erwarmen Spal­tung der Bindung des Farbstoffkations an die Carboxylgruppe des Austauschers statt. Dabei entstehen Austauscherpartikel in der H+-Form sowie die freie Iminobase in alkoholischer Lasung (4).

Dieser V organg ist reversibel. Die Blaufar­bung der urspriinglich roten Lasung der Imino­base, die nach Zusatz von Substanzen mit briickenbindungsfahigem Wasserstoff bei nied­rigen Temperaturen eintritt, fiihren wir auf die Ausbildung von Wasserstoffbriickenbindungen zu dem wasserstofftragenden Stickstoffatom zuriick. In Obereinstimmung damit geben z. B. reine Ketone keine Farbanderungen, wahrend aIle untersuchten Alkohole nach (5) reagieren.

H I CH3

CH3CH20H .. ·IN~/~/S"/~~~jN/

I I II I / CH3

H C/'\/'\N//f" 3

(5)

Diese Befunde stehen in der Erklarung im Gegensatz zu den Angaben von TOEPFER (197oa), der waBrige Lasungen von Toluidinblau in

Sephadex ) _ coo­CM

I /CH3 +N S N

~ ~(I/ /111/ /CH3

sePhadex) -COOH CM

H3C/'\/~N//f"

+f,T if -f,T

(4)

alkalischem Milieu mit Butanol uberschichtete und den Farbstoff durch Ausschutteln in die alkoholische phase uberfuhrte. TOEPFER (I970a) stellte fest, daB sich die rote Farbbase in Butanol lost und daB sie «sehr empfindlich gegen den EinfluB von CO 2 aus der Luft» ist, was sich nach 5 bis 8 min in einer Blaufarbung der butanoli­schen Farbstofflosung auBert. Diese Blaufarbung laBt sich nach unserer Ansicht nicht mit dem CO 2-EinfluB erklaren, sondern folgt dem unter (5) angegebenen Reaktionsmechanismus, d. h., daB es zu einer Wasserstoffbruckenbindung zwischen der OH-Gruppe des Alkohols und dem Stickstoffatom des FarbstoffmolekUls kommt. Diese Erklarung laBt sich durch folgende Ver­suche stutzen: Sorgt man dafur, daB die CO2-

freie waBrige Toluidinblaulosung unter COr AbschluB mit Butanol uberschichtet wird, dann tritt auch in Abwesenheit von CO2 nach der von TOEPFER (I970a) angegebenen Zeit eine Blau­farbung ein. Lost man die Iminobase in Chloro­form, welches keinen zur Bruckenbindung fahigen Wasserstoff besitzt, so sieht die Losung rot aus. Nach Zugabe von Butanol entsteht an den Stellen der Einwirkung des Alkohols schlagartig eine blaue Farbe. Die Verzogerung der Farbverschiebung nach blau bei der Dber­schichtung waBriger Farbstofflosung fuhren wir auf - durch das Schutteln mitgerissene Wasser­teilchen - zuruck, da beim vorsichtigen Dber­schichten mit Butanol sofort eine Blaufarbung in der alkoholischen Phase eintritt.

Diese Dberlegungen fuhren dazu, die Wirkung des metachromotropen Substrates auf eine Schwa­chung der Bindung von Protonen an wasser­stoffsubstituierte Stickstoffatome des Farbstoffes aufzufassen. Keinesfalls ist jedoch - wie von KIESER (1969) angenommen - die Freisetzung der roten Iminobase durch Hydroxidionen als metachromatischer Effekt zu bezeichnen. Nach unserer Ansicht existiert neben der bekannten noch eine andere Form der Toluidinblaumetachroma­sie. Die chemische Fixierung der Iminobase an Substrate mit zur Bruckenbildung fahigem Wasserstoff fuhrt zur Blaufarbung. So erklart sich auch die blaue Anforbung histologischer Strukturen, die keine stark sauren Gruppen enthalten, selbst bei einem pH = I (z. B. Fibrin),

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 15

sofern sie brUckenbindungsfahigen Wasserstoff enthalten. Diese Erklarung wird erhartet durch den prinzipiell gleichen Reaktionsausfall bei pH = 14 in waBriger Losung und Chloroform. Experimentell laBt sich dieser V organg auch anders erklaren. Werden Filterpapierteilchen (OH-Gruppen der Zellulose, jedoch keine Saure­gruppen) zu einer gelbroten Losung der Iminobase in Hexan gegeben, so farben sie sich tiefblau. Nach der Defmition der Metachromasie (s. S. II) handelt es sich dabei ebenso urn einen metachromatischen Effekt wie bei der Rot-Violett-Farbung von Polyanionen mit waBrigen Toluidinblaulosungen.

Die blaue Anfarbung histologischer Strukturen durch Toluidinblau wird von einer monomeren Anlagerung des Farbstoffs verursacht. 1m Gegen­satz zur Metachromasie muB in diesem Falle nicht unbedingt Dichroismus und ein wellen­langenabhangiger Vorzeichenwechsel der Dop­pelbrechung eintreten. Die Intensitat der Blau­farbung ist sowohl von der Struktur als auch vom pH-Wert der Farbelosung abhangig. Bei niedrigem pH-Wert kann sogar eine Anlage­rung von Toluidinblau ausbleiben (z. B. an Zonulafasern bei pH = 2,0). Wir erklaren das hauptsachlich mit einer zunehmenden Proto­nierung des betreffenden Stickstoffatoms. Da­durch steht dieser Stickstoff fur die wassersto£[­bruckenaktiven Gruppen, d. h., fUr die Brucken­bildung nicht mehr zur Verfugung.

Die Blaufarbung histologischer Strukturen, welche durch bruckenbindungsfahigen Wasser­stoff (z. B. an OH-Gruppen neutraler Polysac­charide) hervorgerufen wird, dad im Zusam­menhang mit histochemischen Untersuchungen nicht als Bindung an Sulfat-, Phosphat- oder Carboxylgruppen aufgefaBt werden. Somit muB nach Toluidinblaubehandlung biologi­scher Objekte scharf zwischen einer blauen (sog. «Orthochromasie») und einer rotlichen Anfar­bung (<<Metachromasie») unterschieden werden. Es kann auch Strukturen geben, die auf Grund eines Gehaltes an neutralen Polysacchariden und Glykosaminoglykanen beide Formen erkennen lassen. So farben sich Z. B. Zonulafasern zwi­schen pH = 3,2 und pH = 3,8 aus den genann­ten Grunden blau an (entsprechend dem posi-

16 • G. SCHEUNER • J. HUTsCHENREITER

tiven Ausfall der P AS-Reaktion), wahrend ab pH = 4,4 eine deutliche Mctachromasie zu beobachten ist (Abb. 6).

Das Entstehen einer metachromatischen Eir­bung an SE- und CM-Zellulose nach Toluidin­blau- und Kaliumferricyanidbehandlung weist im Zusammenhang mit dem charakteristischen Absorptionsmaximum bei A= 540 nm auf die Notwendigkeit der Anlagerung mehrerer To­luidinblaumolekiile an eine saure Gruppe hin. Nach HEBENSTREIT und KELLER (I968) werden von I [LMol Kaliumferricyanid 3 [LMol Tolui­dinblau gebunden. Dadurch laBt sich beweisen, daB fiir das Auftreten der [L-Bande eine Asso­ziation mehrerer Farbstoffmolekiile notig ist und die «Orthochromasie» nur durch Anlagerung von Toluidinblau in monomerer Form entsteht. Aus diesen Ergebnissen folgt, daB fiir das Auf­treten von Metachromasie nicht unbedingt ein Maximalbestand der sauren Gruppen von 5 A (SYLVEN I954) an der chromotropen Struktur erforderlich ist, wenn Substanzen, die die Assoziation der Farbstoffmolekiile unterstiitzen, mit vorhanden sind. Man kann daraus schlieBen, daB bei Nichtvorhandensein derartiger Sub­stanzen (z. B. Kaliumferricyanid) die Unter­schreitung des geforderten Maximalabstandes der sauren Gruppen die V oraussetzung fiir die

E

1,0

0,5

500 550

Anregung zur Assoziierung der Toluidinblau­molekiile darstellt.

6.1.2. EinfluBmoglichkeiten auf die metachromatische Reaktion

Die EinfluBmoglichkeiten auf die Meta­chromasie sind im allgemeinen unter dem Gesichtspunkt der Resistenz der metachromati­schen Reaktion gegen verschiedene Faktoren untersucht worden. Ziel dieser Arbeitcn war es, zu weitreichenderen SchluBfolgerungen iiber die chromotropen Strukturen zu gelangen, die Metachromasie zeigen. Die gebrauchlichsten Faktoren sind hier der pH-Wert, die Salzkon­zentration der Eirbelosung, der Temperatur­und AlkoholeinfluB. Auf die Wirkung anorgani­scher Salze soIl hier nur im Zusammenhang mit der Reinigung des Farbstoffs hingewiesen wer­den. Die Versuche mit unterschiedlichen Salz­konzentrationsreihen zur Differenzierung der metachromatischen Reaktion, wie sie z. B. BANK et al. (I939), Boor] et al. (I953), GRAU­MANN (I961), ARNOLD (I966), GRAUMANN et al. (I966), PRAS und SCHUBERT (I969) sowie TOEPFER (1970a, I970b) aushihrten, £lnden im weiteren keine Beriicksichtigung, da bisher

600 650 ;UnmJ

Abb. 6. Absorptionskurven von zwei Zonulafasern aus einem menschlichen Auge nach Farbung mit Toluidin­blau. Imbibitionsmedium: Gummi arabicum. - 1: Farbung bei pH 3,4; 2: Farbung bei pH 6,0.

Figure 6. Absorption curves of two zonula fibers from a human eye after toluidine-blue staining. Imbibition medium: Gum arabic. - 1: Staining at pH 3.4, 2: Staining at pH 6.0.

keine Einwirkung auf die polarisationsoptische Auswertung der metachromatischen Reaktion bekannt ist.

6.1.2.1. EinflufJ des pH-Wertes der Farbstofflosung

Durch Veranderung des pH-W ertes der Farbstofflosung kann die Anzahl der dissozierten sauren Gruppen, die als Reaktionspartner fiir Toluidinblau zur Verfiigung stehen, beeinfluBt werden. Sofern der Abstand der anionischen Gruppen unter einem Maximalabstand von 5 A (SYLVEN 1954) liegt, ergibt sich fotome­trisch in jedem Fall eine fl.-Bande (s. S. 6) mit einem Absorptionsmaximum bei A = S40 nm (Abb.7). Die relative Anzahl der vorhandenen dissoziierten sauren Gruppen auBert sich bei sonst gleichen Versuchsbedingungen in der Hohe des Absorptionsmaximums. Die Menge der Farbstoffmolekiilaggregate, die ARNOLD (1968) fiir eine Bandenverlagerung verantwort­lich macht, kann sich danach nicht in der dort angenommenen Verschiebung des Spektrums auBern. Auch bei geringster Ausbildung von Chromotrop-Farbstoff-Assoziaten kommt es

E

1,0

0,5

500 550

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 17

zur metachromatischen fl.-Bande, deren Nach­weis lediglich durch die Empfindlichkeit der fotometrischen Anordnung begrenzt wird.

Auch beim Vorliegen anderer funktioneller Gruppen an histologischen Strukturen, die zur Briickenbindung befahigten Wasserstoff ent­halten (s. S. IS), kommt es zu einer pH-ab­hangigen Anlagerung von Toluidinblau, welche allerdings eine «orthochromatische» Blaufarbung herbeifiihrt. Die fotometrisch gewonnenen Absorptionskurven (Abb.8) lassen entsprechend der Erklarung (s. S. 14) ein Maximum bei A = 630 nm erkennen, dessen Hohe mit anstei­gendem pH-Wert zunimmt. Tritt bei Erhohung des pH-Wertes zusatzlich eine fl.-Bande im Absorptionsspektrum auf, so liegen entspre­chend den Darlegungen auf S. IS auBerdem noch saure Gruppen vor (Abb.6). Durch dieses Verhalten kann z. B. in Anlehnung an unsere friiheren Untersuchungen (SCHEUNER und HUT­SCHENREITER 1971) Kollagen von Zonulafasern zusatzlich abgegrenzt werden. Beim Vorliegen von Phenolderivat-Glykosaminoglykan-Kom­plexen wird neben einer «Orthochromasie» auch eine sog. «griine Metachromasie» beobach­tet (RAMALINGAM und RAVINDRANATH 1970).

600 650 ::lfnmJ

Abb.7. Absorptionskurven einer kollagenen Faser aus der Cornea eines menschlichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau ohne Kaliumferricyanid. Als Imbibitionsmedien wurden die jeweiligen Pufferliisungen verwendet. -1: Farbung bei pH = 2,2; 2: Farbung bei pH = 4,0; 3: Farbung bei pH = 5,4.

Figure 7. Absorption curves of a collagenic fiber from the cornea of a human eye after staining using toluidine blue without potassium ferricyanide. The respective buffer solutions were used as imbibition media. 1: Stained at pH = 2.2,2: Stained at pH = 4.0,3: Stained at pH = 5.4.

18 • G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

E

1,0 /",--- .... ,

I , I \

/ \ / \

/1 \ 0,5 / \

;; \ ",; \ -- \ ,

550 600 650

, ',2

1 700 ;Unm]

Abb.8. Absorptionskurven von Fibrin aus dem intervillosen Raum der menschlichen Plazenta nach Farbung mit Toluidinblau. Imbibitionsmedium: Gummi arabicum. - 1: Farbung bei pH = 1,0; 2: Farbung bei pH= 7,0.

Figure 8. Absorption curves of fibrin from the intervillous space of the human placenta after toluidine-blue staining. Imbibition medium: Gum arabic. - 1: Stained at pH = 1.0; 2: Stained at pH = 7.0.

In diesen Fallen konnten zusatzlich dimere Toluidinblauassoziate vorliegen.

1m Unterschied Zur Bedeutung des Einflusses der Brechzahl des Imbibitionsmediums bei der polarisationsoptischen Auswertung der Meta­chromasie laBt sich fotometrisch keine prinzi­pielle Einwirkung der Brechzahl auf die Lage der Absorptionsbanden feststellen.

6.1.2.2. Einfluj3 der Temperatur

Es ist bekannt, daB metachromatische Er­scheinungen temperaturabhangig sind (LISON 1935; BOOI] et al. 1952; ROSENBAUM und DEANE 1959; HARMS 1965; KELLY und CHANG 1969; KELLY et al. 1969). Daraus ergibt sich die Moglichkeit, metachromatische Effekte unter bestimmten V oraussetzungen starker hervor­treten zu lassen. U m die dazu erforderlichen Bedingungen zu ermitteln, prliften wir an einer Modellsubstanz (Sephadex-SE) die Temperatur­abhangigkeit der Toluidinblaumetachromasie (HUTSCHENREITER et al. 1972).

In Abb.9 sind 3 ausgewahlte Extinktions­kurven angegeben, die von einem mit Toluidin­blau gefarbten Sephadexpartikel bei verschie-

denen Temperaturen aufgenommen wurden. Die Kurven veranschaulichen den auch flir das Auge erkennbaren Eindruck einer deutlichen spektralen Verschiebung bei Temperaturver­anderung. Die angenaherten Berechnungen der Schwerpunkte der spektralen Verteilung (A, B, C) zeigen die Verlagerung des spektralen Schwerpunktes in das Gebiet klirzerer' Wellen­lang en bei abfallender Temperatur. Die verstarkt im kurzwelligen Gebiet auftretende Absorption laBt das Objekt rot erscheinen. Obwohl auch eine Verschiebung des Absorptionsmaximums zu beobachten ist, wird der optische Eindruck hier im wesentlichen durch die Art der spektra­len Verteilung hervorgerufen, die in diesem Zusammenhang auch STONE (1967) diskutiert. Die unterschiedlichen Amplitudenverhaltnisse bei gleicher Wellenlange deuten auf verschiedene Durchlassigkeiten im untersuchten Temperatur­bereich hin. Dieser Zusammenhang kommt besonders in Abb. IO zum Ausdruck. Hier sind die Isochromaten, welche die Extinktion in Abhangigkeit von der Temperatur bei kon­stanter Wellenlange wiedergeben, dargestellt. Daraus ist ersichtlich, daB eine Beziehung zwischen Anstieg der Isochromaten und wel-

Metachromasie, Doppclbrechullg, Dichroismus . I9

E

7,3

7,1

0,9

0,7

0,5

0,3

0,7

1150 500 600 650 A [nmJ

Abb.9. Absorptionskurven von Sephadex-SE nach Farbung mit Toluidinblau bei unterschiedlichen Tempe­raturen (1: 5,5° C; 2: 4Io C; 3: 90° C). Die Punkte A, E und C auf der Abszisse entsprechen den Schwer­punkten der jeweiligen Kurve.

Figure 9. Absorption curves of Sephadex-SE after toluidine-blue staining at different temperatures (I : 5.5 deg C; 2 : 4I deg C; 3 : 90 deg C). Points A, E, and C on the abscissa correspond to the centroids of the respective curves.

lenlange vorliegt. Besonders beachtenswert ist der Umstand, daB es eine Wellenlange gibt (hier z. B. A= 594 nm, Kurve 4), bei der die Isochromate etwa als Parallele zur Abszisse in Erscheinung tritt. Bei dieser Wellenlange hat also die Temperaturanderung im vorgegebenen Bereich praktisch keinen EinBuB auf die GroBe der Extinktion, weil die fUr verschiedene Tem­peraturen erhaltenen Absorptionskurven ange­nahert durch einen gemeinsamen Punkt laufen: sog. «isosbestischer Punh> (IP), der von physio­logisch-chemischer Seite (STAAB I962) im Zu­sammenhang mit Assoziationsgleichgewichten dimerer und monomerer Formen von organi­schen Farbstoffionen diskutiert wird.

Die auftrctenden Absorptionskurven erklaren wir folgendermaBen: Durch die Zufuhr von thermischer Energie kommt es zunachst zur Zerstorung der Toluidinblauassoziate und bei Erhohung der Energiezufuhr auch zur Auf­spaltung der WasserstoffbrUckenbindung zwi­schen Farbstoff und Chromotrop, wenn die thermische Energie groBer als die Bindungs­encrgie wird. Nach der Bolzmann-Statistik ergibt sich Z. B. flir die thermische Energie bei rooD C ein Wert von 0,0322 eV. Da bei 900 C praktisch keine Metachromasie mehr vorliegt (Abb.9, Kurve 3) muB dort die thermische Energie groBer als die Bindungsenergie an die chromotrope Struktur sein. AST (I965) er-

20 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

E

7,3

1,1

0,9

0,7

o,s

0,3

0,7

o 20 40 60 80

Abb.10. Darstellung der Isochromaten in Abhangigkeit von Extinktion und Temperatur an Sephadex-SE nach Toluidinblaubehandlung (1: 490 nm; 2: 532 nm; 3: 552 nm; 4: 594 nm; 5: 626 nm).

Figure ro. Plot of isochromatic lines as a function of the extinction and temperature of Sephadex-SE after treatment with toluidine blue (1: 490 nm; 2: 532 nm; 3: 552 nm; 4: 594 nm; 5: 626 nm).

mittelte bei der Bindung von einem Molekiil Toluidinblau an ein Molekiil Pentosanpoly­sulfoester eine freiwerdende Bindungsenergie von 0,039 eV.

Bei der quantitativen Auswertung der meta­chromatischen Reaktion sollten die Tempera­turbedingungen beriicksichtigt werden. Durch Temperaturerniedrigung treten die metachro­matischen Strukturen deutlicher hervor.

6.1.2.3. Einjluj] VOIl Athylalkohol

Die Wirkung von Athylalkohol auf die Metachromasie, welche sich im allgemeinen in einem Obergang zur Orthochromasie auBert, wurde von SCHEIBE und ZANKER (1958) ein-

gehend untersucht. Danach fiihrt man die Wirkung des Alkohols auf seine im Vergleich zu Wasser niedrige Dielektrizitiitskonstante (bei 20° C fUr Athanol DK=26, fiir Wasser DK = 80,3) zuriick. Auf dieser Erklarung auf­bauend, faBt TOEPFER (1970a) den Sachverhalt folgendermaBen zusammen: «Die Assoziation in waBriger Lasung fiihrt zur Polymerisation der Farbstoffmolekiile bis zur tetrameren Form. Die Assoziation des Farbstoffes entlang von chromotropen Anionen fiihrt. zur Erscheinung der Metachromasie. In beiden Fallen wird die Tendenz der Farbstoffmolekiile, sich aneinander zu lagern, durch van der Waalssche Krafte her­vorgerufen. Diese Dispersionskrafte, oft auch als Heitler-Londonsche Dispersionskrafte be-

zeichnet, hangen nur von der Verschieblichkeit der Elektronen im Atom, d. h. von des sen Pola­risierbarkeit ab, mit der die Ladungen der beiden in Resonanzbindung tretenden induzierten Di­pole schwingen. Die verschieblichen Elektronen sind die sogenannten 7t-Elektronen. Durch ihre Oberlappung in Form der Wechselwirkung zwischen stark angenaherten Farbstoffmole­kiilen (7t-7t-Elektronenubergange) sind sie fur die anziehenden Krafte verantwortlich. Damit diese i.iberhaupt zwischen einzelnen Farbstoff­molekulen zur Geltung kommen konnen, ist die wirkungsvolle Herabsetzung der AbstoBung infolge Coulombscher Krafte Voraussetzung, die durch die Abschirmung der Coulombschen Ladung der einzelnen Farbstoffmolekule durch die starken Dipole des Wassers erfolgt. Wird nun diese Abschirmung als V oraussetzung fur die Existenz einer metachromatischen Verbin­dung in waBriger Losung durch die Zugabe von Athanol entscheidend geschwacht, so kommt es zur teilweisen oder vollstandigen Zerstorung der Metachromasie».

Wir vertreten die Ansicht, daB durch diese Erklarung zwar die Auflosung der Farbstoff­assoziate untereinander verstandlich wird, daB aber in diesem Zusammenhang noch zwei Fragen offen sind:

I. Warum bleibt monomeres Toluidinblau an die chromotrope Struktur gebunden?

2. Warum kommt es zur «orthochromatischen» Blaufarbung?

Nach den SchluBfolgerungen aus unseren Versuchen (s. S. 12) fuhrt die Auflosung der Assoziate zu einer «Freisetzung» der n:-Elektro­nen. Dadurch wird eine starkere Bindung jeweils eines Protons an je ein Farbstoffmolekul erreicht. Davon hangt unserer Ansicht nach die Blau­farbung ab (s. S. 14.). Gleichzeitig bleibt bei diesem V organg die Bindung des Farbstoffs an die chromotrope Struktur erhalten. Der Be­hauptung von MrssMAHL (1964), daB nach Zugabe von Alkohol zu toluidinblau-gefarbten Praparaten das Toluidinblau den am Ausstrich der Substanz gefundenen Zustand annimmt, konnen wir uns nicht anschlieBen, da die Disper­sionskurve der Doppelbrechung nicht den fur

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 21

den Ausstrich der Toluidinblausubstanz charak­teristischen Vorzeichenwechsels (s. S. 7) er­kennen laBt.

1m Zusammenhang mit der Einwirkung von Athylalkohol auf metachromatisch gefarbte Praparate lassen sich Aussagen uber die unter­schiedlichen Bindungskrafte zwischen Farbstoff und Chromotrop sowie zwischen derz ToluidinblaulIlole­kiilen untereinander machen. Wirkt auf toluidin­blau-gefarbte (ohne Kaliumferricyanid) meta­chromatisch reagierende Strukturen (z. B. Kolla­gen bei pH = 6,5) absoluter Athylalkohol ein, so kommt es zum Entstehen einer Orthochromasie. Dabei losen sich blaue Farbstoffschlieren yom Praparat abo AnschlieBendes Einstellen in Wasser fiihrt erneut nach kurzer Zeit zu schwacherer, aber deutlich metachromatischer Anfarbung der betrachteten Stellen. Bei Wieder­holung des Versuchs werden die phanomene immer schwacher, bis schlieBlich vollige Ent­farbung der entsprechenden histologischen Struktur eintritt. Auf Grund der Alkohol­wirkung kommt es hier - wie beschrieben - zur Zerstorung der Toluidinblauassoziate. Es liegt danach an die sauren Gruppen der chromo­tropen Struktur assoziiert jeweils nur ein Tolui­dinblaumolekul vor. Bei Zugabe von Wasser sind offensichtlich die Krafte, die eine Asso­ziierung der Farbstoffmolekule untereinancler bewirken groBer als die Krafte, welche die Bindung an die funktionellen Gruppen des Chromotrops verursachen. Dabei wird wahr­scheinlich die Assoziation zwischen den schwa­cher sauren Gruppen und den Toluidinblau­molekiilen zerstort. Die freiwerdenden Farb­stoffmolekiile wandern zu den an starker saure Gruppen gebundenen Toluidinblaumolekiilen und bilden dort erneut Farbstoffassoziate, die fur die Metachromasie verantwortlich sind.

FUr die histochemische Auswertung der metachromatischen Reaktion kann es durchaus vorteilhaft sein, Athylalkohol zur Differenzierung histologischer Strukturen zu verwenden (HEMPEL­MANN 1940; SYLVEN 1941,1945; BUNTING 1950; FRIBERG et al. 1951; GRAUMANN und Musso 1959), denn es gibt auch «alkoholresistente» metachromatische Strukturen. Allerdings ist dabei zu beachten, daB entsprechende Unter-

22 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

suchungen l1nter moglichst standardisierten Bedingungen durchgefuhrt werden. So bleibt nach Einwirkung von absolutem Athylalkohol die Metachromasie von Glykosaminoglykanen mit schwefelsauren Gruppen (z. B. Interterri­torialsubstanz des hyalinen Knorpels) erhalten, wahrend Strukturen, die diesbczUglich nur proteingebundene Carboxylgruppen enthalten (z. B. Kollagen) orthochromatisch reagieren. Dies steht im Gegensatz zur Mcinung von WISLOCKI und SINGER (1950), die gemeinsam mit anderen Autoren (Lit. s. TOEfFER 1970a) behaupten, daB Alkohol die Metachromasie immer vollstandig zerstort. Die «Alkohol­resistenz der Metachromasie» konnen wir uns nur so erklaren, daB dabei eine bestimmte dichte Packung stark saurer Gruppen vorliegt, wodurch der Alkohol nicht in der sonst Ublichen Weise wirken kann.

6.2. Analyse der Doppelbrechungs­erscheinungen

6.2.1. Physikalische Grundlagen der Doppelbrechung biologischer Objekte

Wenn die Ausbreitung des Lichtes in cinem Objekt in allen Richtungen des Raumes gleich­artig, d. h. unabhangig vom Strahlungseinfall nach allen Seiten mit der gleichen Geschwindig­keit erfolgt, dann spricht man von Isotropic. Das Verhaltnis von Lichtgeschwindigkeit im Va­kuum zur Lichtgeschwindigkeit in der be­treffenden Substanz (Brechungskoeffizient, Brechzahl, Brechungsindex) ist hier fUr aile Richtungen konstant. Optische Anisotropie liegt vor, wenn die Ausbreitung des Lichtes in einer Substanz als Ausdruck einer bestimmten orien­tierten submikroskopischen Struktur in ver­schiedenen Richtungen des Raumes mit unter­schiedlicher Geschwindigkeit erfolgt. Daraus ergibt sich auch eine fUr die jeweilige Richtung verschiedene Brechzahl (n). Das Licht wird weiterhin fUr die meisten Einfallsrichtungen -mit Ausnahme besonders ausgezeichneter Rich­tung en wie der optischen Achse des Objekts - in zwei linear polarisierte Teilwellen aufgespalten,

deren Schwingungsebenen senkrecht zueinander stehen. Man bezeichnet dicsc Erschcinung als Doppelbrechullg. Die anschauliche Darstellung dieser Verhaltnisse gelingt durch Konstruktion der Indikatrix (Abb. 11 und 12, s. SCHEUNER und HUTSCHENREITER 1972). Diesc optische Indi­katrix kann theoretisch aus der elektromagneti­schen Lichtthcorie abgeleitet werden und ergibt sich experimentell aus Lichtbrechungsmessun­gen.

z

Abb. 11. Darstellullg eiller optisch positiven Indika­trix. Die z-Achse ist Rotatiollsachse und optische Achse. L gibt die Lichteinfallsrichtung an, nA und no sind die Halbachsen der fUr diese Einfallsrichtung wirksamell Indexfl;iche (Indexellipse).

Figure 11. Plot of an optically positive indicatrix. The z axis is the rotation axis and optical axis. Lis the direction of incidence of light, and n A and n a are the half axes of the index surface (index ellipse) de­termining this incidence direction.

Die Indikatrix stellt eine im Raum gekrUmmte Flache dar, deren Radienvektoren den Brech­zahlen in den verschiedenen Lichteinfallsrich­tung en proportional sind. FUr die Darstellung der Eigenschaften optisch anisotroper biologi­scher Objekte in Abhangigkeit von der Licht­einfallsrichtung ergibt sich als Indikatrix im

z

Abb.12. Darstellung einer optisch positiven Indika­trix flir den Fall senkrechten Lichteinfalls (L) zur optischen Achse. Dabei hat die wirksame Index­ellipse die hochste Elliptizitat, d. h., die Starke der Doppelbrechung (nA-na) ist am groBten.

Figure 12. Plot of an optically positive indicatrix for light incidence (L) normal to the optical axis. The effective index ellipse has the highest degree of ellipticity, i. e., the strength of birefringence (nA-nO) is at a maximum.

allgemeinen ein Rotationsellipsoid. Bei Eintritt des Lichtes in den nicht absorbierenden optisch anisotropen Korper wird das Licht vollstandig polarisiert. Daflir sind nur zwei bestimmte Schwingungsrichtungen moglich, die senkrecht aufeinander stehen. nA (Brechzahl des auBer­ordentlichen Strahls) liegt mit der Lichteinfalls­richtung in einer Ebene, no (Brechzahl des ordentlichen Strahls) steht senkrecht dazu. Die Verknlipfung mit der Indikatrix ist tiber den Fundamentalsatz der Kristalloptik moglich. Danach ergeben sich fUr beliebige Lichteinfalls­richtungen die Schwingungsrichtungen der beiden polarisierten Teilwellen und ihre Bre­chungsindices durch die Lage der Achsen bzw. die Lange der Halbachse der Schnittellipse in der Indikatrix. Dazu legt man eine zur Lichteinfalls-

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 23

richtung senkrechte Ebene durch den Mittel­punkt der Indikatrix. Die Schnittfiguren stellen Ellipsen oder Kreise dar. Man bezeichnet sie als Indexellipsen (Abb. II). Die groBte Elliptizitat entsteht bei Lichteinfall senkrecht zur optischen Achse (Abb.12). Unabhangig von der Einfalls­rich tung behalt eine Ellipsenachse stets die gIeiche Lange und wird der ordentlichen Brechzahl (no) zugeordnet. Die Differenz (nA-no) bezeichnet man als Doppelbrechung. Sie kann je nach den entsprechenden Verhaltnissen, d. h. nA>nO oder nA<nO positiv oder negativ sein. Durch I (nA-no)I wird die Starkeder Doppel­brechung eines Objektes gekennzeichnet.

Die Form der Indikatrix und damit der jeweils wirksamen Indexellipse, mit denen man in der Praxis fast ausschlieBlich arbeitet, hangt auch von der Wellenlange ab, da die Brechzahl bei ver­schiedenen Farben unterschiedliche Werte an­nimmt. Diesen Zusammenhang bezeichnet man als Dispersion. Unter Grunddispersion versteht man dabei die Differenz zweier Brechzahlen bei den Wellenlangen AF = 486, I nm und AC =

656,3 nm. Man unterscheidet weiterhin zwi­schen normaler und anomaler Dispersion (Abb. I3). Bei normaler Dispersion nimmt der

n

L-----r---------~----~A blau rot

Abb. 13. Schematische Darstellung von normaler (1) und anomaler (2) Dispersion.

Figure 13. Schematic representation of normal (1) and abnormal (2) dispersion.

Zahlenwert der Brechzahl mit zunehmender Wellenlange abo Er steigt bei anomaler Disper­sion mit zunehmender Wellenlange an. In der

24 • G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

Histochemie treten diese FaIle bei Dispersions­kurven, die Extremwerte haben, praktisch immer kombiniert auf. Es liegt deshalb meist nur fUr ganz bestimmte, haufig charakteristische Wellenlangenbereiche entweder normale oder anomale Dispersion vor. Da die beiden Brech­zahlen fUr unterschiedliche Wellenlangen ver­schiedene Werte annehmen, kann auch die Differenz dieser Brechzahlen, d. h. die Starke der Doppelbrechung, wellenlangenabhangig sein. Diese Abhangigkeit wird als Dispersion der Doppelbrechung bezeichnet.

Zwischen gekreuzten Polarisatoren erscheinen anisotrope Objekte in Abhangigkeit von ihrer Lage bei Betrachtung durch den Analysator hell oder dunkel. 1st das Material so orientiert, daB der Lichteinfall parallel zur optischen Achse erfolgt, dann bleibt das Gesichtsfeld unabhangig vom Azimut (Winkel zwischen der Schwingungsrichtung des Polarisators und den Schwingungsrichtungen im Material) Uber dem Analysator in allen Stellungen dunkel. Es ver­halt sich bei dieser Orientierung wie ein optisch isotropes Objekt. Orientiert man die Substanz so zwischen den Polarisatoren, daB das aus dem Polarisator austretende Licht senkrecht zur optischen Achse auf das Versuchsmaterial auf­trifft, dann wird die einfallende Schwingung in eine Komponente in Richtung der optischen Achse des Untersuchungsmaterials und in eine Komponente senkrecht hierzu zerlegt. Beide Teilwellen durchlaufen das Material mit unter­schiedlicher Geschwindigkeit, so daB beim Aus­tritt aus der Substanz eine PhasC11verschiebung (,) bzw. ein Gangunterschied (r) zwischen ihnen besteht, die vom Material, der Materialdicke und von der Farbe des verwendeten Lichts abhangen.

(6)

d: Dicke der durchstrahlten Matcrialschicht n A und nO : Brechungsindices £iir die beiden polari­

sierten Teilwellen

Biologische Objekte, die histologisch bzw. histochemisch untersucht werden, bestehen im submikroskopischen Bereich im allgemeinen aus einem System von MakromolekUlen (z. B. Polypeptide, Polysaccharide, Polynukleotide)

zwischen denen sich LUcken befinden, in denen unterschiedliche Substanzen (z. B. waBrige Losungen, Lipide) auftreten. In Anlehnung an die Modellvorstellungen von WIENER (1912) spricht man hier von sog. Mischkorpern. Diese WIENERSchen Vorstellungen sind nach FREY­WYSSLING (1938) fiir den biologischen Bereich jedoch dahingehend einzuschranken, als einzelne FadenmolekUle z. B. fUr sich nicht als Misch­korper aufgefaBt werden konnen, weil die Elemente eines Mischkorpers zueinander echte Phasengrenzen besitzen mUssen. Die einzelnen Elemente des Mischkorpers konnen jeweils isotrop oder anisotrop sein. Auch wenn beide Anteile isotrop sind, kann sich der Mischkorper optisch anisotrop verhalten. Die Doppelbrechung des Mischkorpers, die auf seiner charakteristi­schen Bauweise beruht, bezeichnet man als Formdoppelbrechung (F).

Man unterscheidet zwischen Schichtenmisch­korpern und Stabchen- oder Zylindermisch­korpern. Der Schichtenmischkorper, z. B. AuBen­glied der Sehstabchen (SCHMIDT, 1938), besteht aus parallel liegenden Platten mit den Brech­zahlen n l und n2 • Der Stiibchenmischkorper (z. B. kollagene Faser) ist aus parallelliegenden Zylindern mit der mittleren Brechzahl n l

zusammengesetzt, die durch ein Medium abwei­chender Brechzahl (n2) getrennt sind (A,bb. 14).

SolI an biologischen Objekten festgestellt werden, ob Formdoppelbrechung vorliegt, dann kann das Ambronnsche ImbibitionsverfahrC11 angewandt werden. Es beruht darauf, das zu untersuchende Praparat mit unterschiedlichen Fliissigkeiten bekannter Brechzahlen zu durch­tranken. Bei kontinuierlicher Anderung von n 2 erreicht man den Punkt, fUr den n l = n 2 wird. Hier laBt sich keine Formdoppelbrechung mehr feststellen. Tragt man die Doppelbrechung in Abhangigkeit von der Brechzahl n 2 der ver­wendeten ImbibitionsflUssigkeit auf, so ent­stehen Kurven, deren Extremwerte die Forde­rung n l = n 2 erfUllen. Der Durchbiegungsgrad der Kurven ist von den V olumenverhaltnissen (a l und a2) der Mischkorperelemente abhangig.

In einem biologischen Objekt liegt Eigen­doppelbrechung (E) vor, wenn das GefUge selbst (ohne GefUgelUcken) Doppelbrechung

optische Achse

Abb.14. Schematische Darstellung eines Zylinder­mischkorpers. n l und n 2 entsprechen den Brech­zahlen der beiden Anteile.

Figure 14. Schematic representation of a cylindrical Wiener body, with n l and n 2 corresponding to the refractive indices of the two parts.

zeigt. Die Starke der Eigendoppelbrechung ergibt sich aus der Differenz der beiden Haupt­brechzahlen ny und nIX. Die Eigendoppelbre­chung eines Objektes ist eine charakteristische Materialkonstante und wird durch die kri­stalline Konfiguration eines im Mischkorper vorkommenden Strukturelementes hervorge­rufen. Ein unterschiedlicher chemischer Aufbau verursacht auch eine verschiedenartige Eigen­doppelbrechung. Die Gesamtdoppelbrechung (G) des Mischkorpers setzt sich aus Eigendoppel­brechung und Formdoppelbrechung zusammen.

Das Vorzeichen der Doppelbrechung interessie­render Objekte spielt fiir die submikroskopische Strukturanalyse eine groBe Rolle. Man unter­scheidet hierbei das wahre yom relativen V or­zeichen. Das wahre Vorzeichen wird durch die Lage der Indikatrix zur optischen Achse der doppelbrechenden Struktur bestimmt. Zu seiner

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 25

Ermittlung muB deshalb die Lage der optischen Achse als Bezugsrichtung im optisch anisotropen Objekt bekannt sein. An doppelbrechenden histologischen Objekten ist die Bestimmung der Lage der optischen Achse haufig schwierig, da die Gangunterschiede meist sehr niedrig, die Objekte selten zu isolieren und schwer in die notwendigen Lagen zu orientieren sind. Deshalb verwendet man aus ZweckmaBigkeitsgriinden das relative Vorzeichen der Doppelbrechung, welches sich nicht auf die optische Achse be­ziehen muB, sondern sich auch auf eine morpho­logisch ausgezeichnete Richtung beziehen kann (z. B. bei Fasern die Langsachse, bei Membranen die Flachennormale usw.). Positives Vorzeichen der Doppelbrechung liegt vor, wenn die lange Achse der Indexellipse des Objektes parallel zur gewahlten Bezugsrichtung verlauft, bei nega­tivem V orzeichen ist diese Achse senkrecht zur Bezugsrichtung orientiert (Abb. IS).

6.2.2. Wirkung der Toluidinblau­anlagerung auf die Doppel­brechung von Gewebsstrukturen

Nach Anfarbung histologischer Praparate mit Toluidinblau zeigen chromo trope Gewebs­bestandteile im allgemeinen eine Anderung des Gangunterschiedes der Doppelbrechung. Diese Anderung ist abhangig von verschiedenen Faktoren, die ihren EinfluB wahrend und nach der Farbstoffanlagerung ausiiben. In dies em Sinne spielt der pH-Wert der Farbstofflosung sowie deren Salzkonzentration, eine eventuelle Alkoholbehandlung def gefarbten Schnitte, die Temperatur und die Brechzahl des Einbettungs­mediums eine wesentliche Rolle. AuBerdem besteht cine starke Abhangigkeit des Gang­unterschiedes von der Wellenlange des zur Untersuchung verwendeten Lichtes.

Neben der quantitativen kommt auch der qualitativen polarisationsoptischen Analyse der Toluidinblauanlagerung Bedeutung zu. Mit Hilfe dieser Reaktion kann eine betrachtliche Verstarkung des primar vorhandenen Gang­unterschiedes der Doppelbrechung erzielt wer­den, so daB beispielswcise sogar die Doppel-

26 • G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

FA FA

B e

a + b

Abb. 15. Relatives Vorzeichen der Doppelbrechung an Fasern. FA: FaserHingsachse, B: Bezugsrichtung; a: Lange Achse der Indexellipse parallel zu B (bzw. FA) - positives Vorzeichen der Doppelbrechung; b: Lange Achse der Indexellipse senkrecht zu B (bzw. FA) - negatives Vorzeichen der Doppel­brechung.

Figure 15. Relative sign of double refraction on fibers. FA: Longitudinal fiber axis; B: reference direction; a: long axis of index ellipse parallel to B (or FA, respectively) - positive sign of double refrac­tion; b: long of index ellipse normal to B (or FA, respectively) - negative sign of double refraction.

brechungserscheinungen an der Erythrozyten­membran sichtbar werden (Abb. 16). In dies em Zusammenhang sei auch noch auf die Arbeiten von BREWER (1957), D1EZEL (1958), ROMHANY1 (1958, 1963, 1965, 1967, 1970, 1973 a, b), ROMHANY1 und DEAK (1967, 1969), JOBST und KELLERMAYER (1967), ROMHANY1 et al. (1970, 1972), Musy et al. (1972), DEAK und ROMHANY1 (1973) sowie MODIS und KERN (1973) hinge­wIesen.

6.2.2.1. Dispersion der Doppelbrechul1g

Untersuchungen iiber den Dispersionsvcrlauf der Gcsamtdoppelbrechung wurden bisher nul' relativ seltcn an histologischen Strukturen durch­gefiihrt, obwohl damit wertvolle Informationen zu erhalten sind. Nach Einlagerung von To­luidinblau treten Erscheinungen auf, die im Zusammenhang mit der Kenntnis des histo­chemischen Reaktionsmechanismus der Farbung Riickschliisse im submikroskopischen Gr6Ben­ordnungsbcreich zulassen. Durch die Toluidin­blauanlagerung kommt es zu selektiven Ab­sorptionserscheinungen (s. S. 6) bei bestimm­ten Wellenlangen, die mit eincr anomalen Dispersion von ny oder n" (s. S. 58) in diesem Bereich verbunden sind. Deshalb andcrt sich auch in Abhangigkeit von der Wellenlange die Starke und mitunter damit auch das Vorzeichen der Doppelbrechung. Je nachdem ob sich ny oder n" bei dies em V organg verandert, ergibt sich in Beziehung zur Lage der langen Achse der Fadenmolekel im biologischen Objekt eine charakteristische Veranderung der Dispersions­kurve der Doppelbrechung der histologischen Struktur. Fur die auftretenden Veranderungen der Dispersion der Doppelbrechung nach meta­chromatischer Toluidinblaufarbung gel ten im Zusammenhang mit den Angaben von ROM­HANY1 und SCHNABEL (1971) bei Imbibition mit Gummi arabicum folgende Regeln (vgl. S. 59):

1. Bei Senkung bis Vorzeichenwechsel der urspriinglichen Doppelbrechung im lang­welligen und Erh6hung im kurzwelligen Bereich liegt der starker absorbierte Strahl senkrecht zur Hauptvalenzkette.

2. Bei Erh6hung der urspriinglichen Doppel­brechung im langwelligen und Senkung bis V orzeichenwechsel im kurzwelligen Bereich liegt der starker absorbierte Strahl parallel zur Hauptvalenzkette. 1m weiBen Licht fiihrt die orientierte An­

lagerung von Toluidinblau zum Auftreten anomaler Polarisationsfarben (Abb.17). Durch Oxidation (TSUNEO und KEN1CHI 1968) oder Sulfatierung (ROMHANY1 et al. 1973) k6nnen die optischen Effekte infolge einer erh6hten To­luidinblauanlagerung verstarkt werden.

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 27

Abb. I6. Polarisationsoptische Darstellung von Erythrozytenmembranen bei Toluidinblaufarbung nach ROMHANYI und DEAK (I969). IOso : 1.

Figure I6. Polarization-optical representation of red ccllmcmbranes with toluidine-blue staining according to the method of ROMHANYI and DEAK (1969). IOSO : 1.

6.2.2.1.1. EinfiujJ der Brechzahl des Durchtriin­kungsmediums und des pH-Werles der FarbstojJlosung

Nach Durchtrankung doppelbrechender to­luidinblau-gefarbter Strukturen mit Imbibi­tionsmedien verschiedener Brechzahl ergeben sich bei Bestimmung der Gesamtdoppelbrechung in Abhangigkeit von der Wellenlange unter­schiedliche Dispersionskurven. Dabei ist der Ein­fluB der Brechzahl des Durchtrankungsmediums auf den Verlauf der Dispersionskurven von der Anzahl der orientiert an die chromo trope Struk­tur gebundenen Toluidinblaumolekiile abhangig. Die Farbstoffbindung wird nun wiederum durch den pH-Wert der Toluidinblaulosung beein­fluBt. Bei pH = 2,2 lagert sich an kollagene Fasem kein Toluidinblau an (s. S. 17). Die ent­sprechenden Dispersionskurven zeigen infolge­dessen nur die Dispersion der Gesamtdoppel­brechung des Kollagens (Abb. IS). Mit zuneh­mender Wellenlange sinken die Gangunter­schiede geringfiigig abo Der BrechzahleinfluB auBert sich in unterschiedlich hohen Gangunter­schieden bei der gleichen Wellenlange. Dabei bewirkt eine Brechzahlerhohung der Imbibi­tionsfliissigkeit das Absinken der entsprechenden Gangunterschiede der Doppelbrechnung. Die

Form der Kurven wird durch die Brechzahl­anderung jedoch nicht beeinfluBt. Ahnliche Resultate ergeben sich bei pH = 3,4 (Abb.I9). Ganz anders liegen die Verhaltnisse bei pH = 4,4 (Abb.20). Wahrend mit aufsteigender Brech­zahl bis zu n 2 = 1,4075 Dispersionskurven vor­liegen, die sich prinzipiell nicht von den Kurven bei niedrigeren pH-W erten unterscheiden, kommt es bei n 2 = 1,4622 zur Umkehr der Doppelbrechung. Dabei steigt der Gangunter­schied zunachst bis A= 525 nm an. Bei A=

575 nm liegt umgekehrtes Vorzeichen der Doppelbrechung vor, dann verringern sich die Gangunterschiede mit zunehmender Wellen­lange. Zwischen A= 525 nm und A= 575 nm ist eine Gangunterschiedsmessung mit dem Polari­sationsmikroskop nicht moglich, da die aufge­hellten Fasern nicht zu kompensieren sind, ob­wohl es bei Drehung urn 3600 zu einer vier­maligen Abdunklung und viermaligen maxi­malen Aufhellung des Objektes kommt. Der Dichroismus des Objektes ist allerdings in diesem Wellenlangenbereich sehr gut nachweis­bar (s. S. 57). Es gibt also in diesem Gebiet eine Wellenlange, fiir die eine Schwingungs­richtung im optisch-anisotropen Objekt nahezu vollstandig absorbiert wird. Daraus folgt, daB bei dieser Wellenlange linear polarisiertes Licht

28 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENRE1TER

a b

c d

Abb.17. Kollagene Fasern im Zentrum von Chorionzotten einer geburtsreifen menschlichen Plazenta. Toluidinblaufarbung bei pH =4,4 nach Sulfatierung. EinschluBmedium: Gummi arabicum. 202 : I. - a: Dar­stellung im Hellfeld. Die kollagenen Fasern sind metachromatisch; b: Darstellung zwischen gekreuzten Polarisatoren. Die kollagenen Fasern erscheinen in einer gelben anomalen Polarisationsfarbe; c: Darstellung des Dichroismus nach ZOCHER und JACOBY; Drehung des Analysators im Uhrzeigersinn. d: Darstellung des Dichroismus nach ZOCHER und JACOBY. Drehung des Analysators gegen den Uhrzeigersinn.

Figure 17. Collagenous fibers in the centers of chorionic villi of a full-term human placenta. Toluidine-blue staining (at pH = 4.4) after sulfating. Imbibition medium: Gum arabic. 202 :1.- a: Bright-field representation. The collagenous fibers are metachromatic. b: Representation between crossed polarizers. The" collagenous fibers have a yellow, abnormal color of polarization. c: Representation of dichroism after ZOCHER and JACOBY. Clockwise rotation of the analyzer. d: Representation of dichroism after ZOCHER and JACOBY. Counterclock­wise rotation of the analyzer.

Metachromasic, Doppelbrechung, Dichroismus . 29

rrnm]

70 pH=2,2

30

x---x-x ____ x_ x-----x--___ x _____ x _____

x---_x ____ x__ _ ___ x__ x ____ x n2= 7,3350 -_x ___ -x --x----x-___ x ____ x n = 7,371J.O

X_e_._x_._._x_ .. ___ x_._._x_._. 2 -x-,-,_x_,-,-x-·-.-x_._._xn2=1.4070

50

70 x············x············x············x············x···········.x· ... ·· .... ··x··········.·x............ ............ n = 1.4622

450 500 550 600 650 ;UnmJ

Abb. 18. Dispersionskurven der Gesamtdoppclbrechung einer kollagenen Faser der Sclera eines mensch lichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau bei pH =2,2 in Abhangigkeit ven der Brechzahl (n2) des Imbibitions­mediums. n2 : Brechzahl bei A = 589nm. -n2 = 1,3350; nF -ne - 0,0061; n2 = 1,3740; nF - ne = 0,0069; n 2 = 1,4070; nF -ne = 0,0073; n2 = 1,4622; nF - ne = 0,0082. Jeder MeBpunkt stellt das arithmetische Mittel aus 30 Einzelmessungen dar.

Figure 18. Dispersion curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH =2.2) as a function of the index of refraction (n2) of the imbibition medium; n 2 : refractive index at A=589nm. n2 = 1.3350; nF -ne= 0.0061, n2 = 1.3740; nF - ne= 0.0069, n2 = 1.4070; nF -ne = 0.0073, n2 = 1.4622; nF - ne = 0.0082. Each measuring point is the arithmetic mean of thirty individual measurements.

aus dem Objekt austritt. Es kann deshalb in der Dispersionskurve keinen Punkt geben, an dem Isotropie vorliegt. In der Literatur (ZOCHER und JACOBY 1927; ROMHANY1 1963; ROMHANYI und DEAK 1967; VIDAL 1972 a, b; MELLO und VIDAL 1973) wird dieser Punkt als Inversions- bzw. Inflexionspunkt bezeichnet. Er solI die Stelle des

nnm]

Umschlags von positiver zu negativer Doppel­brechung kennzeichnen. Ein solcher Punkt, der nur durch isotropes Verhalten der toluidinblau­gefarbten Fasern erHirbar ware, ist jedoch nicht vorhanden. Es ist deshalb nicht gerechtfertigt, in diesem Sinne den Kurvenzug die Abszisse schneiden zu lassen.

70 pH = 3/!-

50 x-----x-----x-----x _____ x _____ x _____ x _____ x ____

x----x----x ____ x ____ x__ x-x n2 = 13354 x_. --x----x----x ____ x ____ x n = 13742

-.-x-._--x-----x___ 2 I ,-x-._.-x-._.-x-·_·-x-._.-x-,-.-xn2=7,4079 30

10 x····· ....... x ......................... x···········.x .. ··········x··.· ........ x ............ x............ ........... n = 1.4622

450 500 550 600 650 ::!.£nm]

Abb. 19. Dispersionskurven der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser der Sklera eines menschlichen Auges nach Eirbung mit Toluidinblau bei pH = 3,4 in Abhangigkeit von der Brechzahl (n2) des Imbibitions­mediums (vgl. Abb.18). n2 = 1,3354; nF -ne = 0,0061; n2 = 1,3742; nF -ne = 0,0069; n2 = 1,4079; nF -ne = 0,0073, n2 = 1,4622; nF -ne = 0,0082.

Figure 19. Dispersion curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH = 3 .4) as a function ofthe index of refraction (n2) of the imbibition medium; (d. Fig. 18). n2 = 1.3354; nF -ne = 0.0061, n2 = 1.3742; nF - ne = 0.0069, n2 = 1.4079; nF -ne = 0.0073, n2 = 1.4622; nF - ne = 0.0082.

30 . G. SCHEUNER . J. HUTsCHENREITER

rfnml

pH = 4,4

50 X--X __ x~

30

x--__ x ____ x_ x ____ ---x___ X--X--X-x __ x __ x n2 =7,3362 _._x_.~.~ -x___ '3738 x _____ x_- ...... .x....... x-.-.-x_._.::.~:=---::.~:.~-:-.::::.. ___ x ____ x nz= I,

x .... ·······«······ n2=1,4622 '-·-x_'_'_x n2 = 7,4075 70

-70 450 500 550 x •••••••••• ~~~ •••••••••• x···;;;·:·j;4622······')( A [nml

-30

Abb. 20. Dispersionskurven der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser der Sklera eines menschlichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau bei pH =4,4 in Abhangigkeit von der Brechzahl (nz) des Imbibitions­mediums (vgl. Abb.rS). nz =r,3362; nF-nc=0,006r; nz=r,373S; nF-ne =0,0069; nz=r,407S; nF - ne = 0,0073 ; nz = r ,4622; nF -ne = 0,00S2.

Figure 20. Dispersion curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH =4.4) as a function of the index of refraction (n2) of the imbibition medium; (d. Fig. rS). nz = 1.3362; nF-ne = 0.006r, nz = 1.373S; nF-nc = 0.0069, nz = 1.4075; nF -ne = 0.0073, nz = 1.4622; nF-nc = 0.00S2.

Die Dispersionskurven nach Behandlung der kollagenen Fasern oberhalb von pH = 4,4 (Abb. 2 I, 22) zeigen sinngemaB ein gleiches verhalten.

Ein Beispiel flir die Aussagemoglichkeit aus dem Dispersionsverlauf der Gesamtdoppelbre­chung ist die Unterscheidung von sog. Stenokol­lagen und Porokollagen nach ROMHANYI und DEAK (1967). Die Anfarbung kollagener Fasern mit o,l%igem Toluidinblau bei pH= 5,0 und nach Behandlung mit 2%igem Kaliumferricyanid flihrt zu einem typischen Dispersionsverlauf der Gesamtdoppelbrechung der gefarbten kollage­nen Fasern (Abb.23). Daraus sind allein nicht ohne weiteres Aussagen liber die submikrosko­pische Struktur zulassig. Man muB zusatzlich den Dichroismus (s. S. 53) untersuchen, der bei Stenokollagen ein positives und bei Porokollagen ein negatives Vorzeichen hat (VIDAL 1963,1964; VIDAL und MELLO 1970). Aus der Dispersions­kurve der Doppelbrechung flir Stenokollagen­fasern (gewonnen durch Gefrierschnitte aus Material, das mit Formaldehyd fixiert ist) ergibt sich im Zusammenhang mit dem positiven Dichroismus, daB die Toluidinblaumoleklile in einer Richtung parallel zur Faserlangsachse ge­bunden sind. V orbehandlung von nativem Kol­lagen mit 3%iger Essigsaure oder Erwarmung

liber 60° C vor der Formaldehydfixierung aber auch die Paraffmeinbettung des in Formaldehyd fixierten Materials flihrt zur Umwandlung in sog. Porokollagen. Die Dispersionskurve ver­lauft nach Toluidinblaubehandlung hier im Ver­gleich zur Stenokollagenkurve gerade umge­kehrt. Das spricht so wie der negative Dichrois­mus daflir, daB sich die Toluidinblaumoleklile im Gegensatz zum Stenokollagen senkrecht zu den Mizellen des Porokollagens einlagern. Flir die Anlagerung des Toluidinblaus an das Kolla­gen sind die Carboyxlgruppen der Glutamin­saure und Asparaginsaure verantwortlich zu machen. So bildet Poly-I-Glutaminsaure mit Toluidinblau doppelbrechende Komplexe, die auch den charakteristischen V orzeichenwechsel und D ichroismus erkennen lassen (VIDAL 1972 b).

Die Dispersion der Formdoppelbrechung ist nicht nur von der Wellenlange, sondern auch von der Brechzahl des Imbibitionsmediums (n2) abhangig, das sich in den Gefligellicken des Mischkorpers befindet. Die Imbibitionskurven zeigen bei unterschiedlichen Wellenlangen des Lichtes eine verschiedenartige Form und Lage. Bei anomaler Dispersion der Brechzahl des Ge­fliges (n l ) verschieben sich die Imbibitionskurven

Metachromasic, Doppelbrechung, Dichroismus . 3 I

nnml

70 x __ x--x_............ pH=5,4

x_---x----x_ x_............ ..... - ..... x x~

.. x .............. x_x __ x--x-_x n" = 1,3363 50 _._x........... x .....................

x_·_·_x-· x," -'-x x----x-___ x ____ x ____ x n" = 13736 30 .......... ..................... '

x ...... ······x·n" = 1,4622 x_·-·_x_._._x_._·-x_·_._x_._._x n" = 1,4078

10

-10 450 500 550

-30

-50 x.······· ....

600 ~Q ..•....... x A [nml x··········

,,·········~2 = 1,4622 .. . '

Abb.21. Dispersionskurven der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser der Sclera eines menschlichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau bei pH = 5,4 in Abhangigkeit von der Brechzahl (n2) des Imbibitions­mediums (vgl. Abb. 18). n 2 = 1,3363; nF-ne =0,0061; n 2= 1,3736; nF-ne = 0,0069; n 2 = 1,4078; nF - ne = 0,0073; n 2 = 1,4622; nF - ne = 0,0082.

Figure 21. Dispersion curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH = 5.4) as afunction of the index of refraction (n2) of the imbibition medium; (cf. Fig. 18).112 = 1.3363; 11F - 11e = 0.0061,112 = 1.3736; nF - ne = 0.0069,112 = 1.4078; 11F - ne = 0.0073, n 2 = 1.4622; 11F - 11e = 0.0082.

mit zunehmender Wellenlange nach rechts, wahrend sich bei normaler Dispersion eine Ver­schiebung nach links ergibt, weil bei anomaler Dispersion die Brechzahl n l mit zunehmender Wellenlange ansteigt und umgekehrt (Abb.24). Aus der Naherungsformel von SCHMITT (1938) flir die Formdoppelbrechung

313z (nZl - nZz)Z

-----

2[(31 + I)nzz + 3znzl l (31nl + 3znz)

III undll2 :

Volumi11a der Mischkorperelemente n l undnz: Brechzahlen der Mischkorperclemente

(7)

folgt weiterhin, daB bei anomaler Dispersion von n l mit Zunahme der Wellenlange der An­stieg der Kurvenflanken abnimmt, wahrend der Anstieg bei normaler Dispersion von n l mit zunehmender Wellenlange zunimmt. Der Aus­druck flir die Starke der Dispersion der Form-

doppelbrechung (DiFo) laBt sich aus Abb.24 abIes en. Es gilt:

(8)

An dem Verlauf der Imbibitionskurven bei unterschiedlichen Wellenlangen laBt sich deshalb in der Praxis erkennen, ob die Brechzahl des Gefliges (n l ) normale oder anomale Dispersion zeigt.

In Abb.25 sind Kurven der Gesamtdoppel­brechung (Form- und Eigendoppelbrechung) kollagener Fasern nach Behandlung mit Toluidin­blau bei pH=2,2 in Abhangigkeit von der Wellenlange angegeben. Die Kurven zeigen den typischen Verlauf, wie er flir Kollagen, das im Modell als Stabchenmischkorper aufgefaBt wer­den kann, charakteristisch ist. Sic entsprechen dem linken Schenkel einer Imbibitionskurve. Bei weiterer Erh6hung der Brechzahl des Durch­trankungsmediums wiirden die Kurven durch

32 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

Hnml

110 •• x n2=1,4622

90 .....•.• /

..... x··· x ____ x__ .....

x~ x· x _____

70

so pH=6,O

••••••••• x'__

x----x_.:a --............ ... --x--__ x_ x-x_x-x_xn2=13354 30 x_._.~.,..:~-.- .. -)(-.-.-x_~-:::x..... I

..... x .................

10 x···· ·,.:;:x----x----x--__ x ____ x n2~ 1,3756

x-·-·_x_·_._x_._·_x-._._x n2= 1,4035

-10 450 500 550 600 650 :1. [nm]

-30

-so

-70

••••••• 0)( n2= 1,4622

X .... ········..,.············X •...

X.··········...-

Abb.22. Dispersionskurven der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser der Sclera eines menschlichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau bei pH =6,0 in Abhangigkeit von der Brechzahl (n2) des Imbibitions­medinms (vgl. Abb. IS). n 2 = 1,3354; nF-ne = 0,0061; n2 = 1,3756; nF-ne = 0.0069; n 2 = 1,4035; nF - ne = 0,0073; n 2 = 1,4622; nF - ne = 0,00S2.

Figure 22. Dispersion curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH =6.0) as a function of the index of refraction (n2) of the imbibition medium; (cf. Fig. IS). n 2 = 1.3354; nF - ne = 0.0061, n 2 = 1.3756; nF - ne = 0.0069, n 2 = 1.4035; nF - ne = 0.0073, n 2 = 1.4622; nF - ne = 0.00S2.

ein Minimum gehen und anschlieBend wieder ansteigen. Aus dem negativen Anstieg und dem V orliegen eines zu folgernden Minimums bei dieser Kurvenschar folgt, daB die Langsachsen der KollagenmolekUle unter + 45°, d. h. im Gesichtsfeld von links unten nach rechts oben orientiert sind. Wir verwendeten hydrophile Imbibitionsmedien. Eine hCihere Brechzahl als n 2 = 1,4622 (Gummi arabicum) lieB sich aus technischen GrUnden nicht erreichen. Nach Toluidinblaubehandlung bei pH= 3,4 (Abb.26) ist keine prinzipielle Veranderung des Kurven­verlaufes festzustellen. Anders jedoch verhalt sich der Dichroismus (s. S. 57).

Ein deutlicher Wandel der optischen Eigen­schaften der kollagenen Fasern tritt nach Be­handlung mit Toluidinblau bei pH = 4,4 auf

(Abb.27). Wahrend sich die Kurven bei A= 450 nm, A=475 nm und A= 500 nm ahnlich den Kurven bei niedrigeren pH-Werten ver­halten, wird ein Minimum in der Kurve fUr A = 525 nm bei n 2 = 1,4070 erreicht. Mit zunehmen­der ErhCihung der Wellenlange tritt eine vollstan­dige Veranderung der Kurvenform ein. Diese Befunde sind ahnlich auch fUr Toluidinblaube­handlung bei pH= 5,4 (Abb.28). Die ausge­pragtesten Veranderungen gegenUber einer Be­handlung bei pH=2,2 treten nach Toluidin­blaueinwirkung bei pH=6,0 auf (Abb.29). Vergleichbar zu pH = 2,2 ist nur die Imbibi­tionskurve bei A=450 nm. Mit ansteigender Wellenlange bis zu A = 550 nm kommt es zu Kurven, die ein leichtes Abfallen der linken Flanke gegenUber einem starkeren Ansteigen in

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 33

T[nm]

so

30

70

500 550 600 //[nm]

-70

x~ 1 x ............... x ..... x -30

-so

Abb.23. Dispersionskurven der Doppelbrechung von Steno- und Porokollagenfasern aus der Achillessehne nach Toluidinblaufarbung bei pH = 5,0. Die Stenokollagenfasern (1) sind oberhalb von A = 560 nm positiv doppelbrechend und negativ doppelbrechend unterhalb von A = 510 nm. Die Dispersionskurve der Poro­kollagenfasern (2) zeigt in diesen Bereichen ein entgegengesetztes Vorzeichen (in Anlehnung an ROMHMITJ und DEAK 1967).

Figure 23. Dispersion curves of the double refraction of steno- and porocollagenous fibers from the tendo achillis after toluidine-blue staining at pH = 5.0. The stenocollagenous fibers (1) show pcsitive birefringence above A = 560 nm and negative birefringence below A = 510 nm. The dispersion curve of porocollagenous fibers (2) shows an opposite behavior in these regions (in accordance with ROMHANYJ and DEAK, 1967).

der rechten Flanke erkennen lassen. Das wahr­scheinliche Minimum dieser Kurven verschiebt sich dabei mit zunehmender Wellenlange nach links. Eine weitere Erhohung der Wellenlange iiber A= 550 nm fiihrt zu einer Umkehr des Vorzeichens der Doppelbrechung, wobei es gleichzeitig zu einer prinzipiellen Anderung des Kurvenverlaufs kommt. 1m Gegensatz zu den Kurven, die ausschlieBlich im positiven Bereich verlaufen, weisen diese Kurven auf Grund ihres Durchbiegungsgrades auf ein Maximum hin, wobei mit ansteigender Wellenlange eine Ab-

flachung der Flanken eintritt. Flir die Deutung dieses Verhaltens spielt die Brechzahl (n1) des Gefiiges eine besondere Rolle. Dem sog. Gefiige konnen bei biologischen Objekten Fadenmolekel zugeordnet werden, die von Einer bestimmten GroBenordnung an Eigendoppelbrechung zei­gen. Den sog. Gefiigeliicken entspr.echen die dazwischen liegenden RauUlc, in denen sich im allgemeinen Fliissigkeiten bcfinden. Gerichtet angeordnete Substanzen (z. B. Farbstoffmolekel oder Lipide), die an die Fadenmolekel gebunden sind, gehoren mit zum Gefiigc und verandern

34 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

Ac Ax I I / i

/ i I j

/ I I I

/ / / /

..... ~./ .,,/ r---------------------~~-3~~~-C~----------~_n2

a

I \ \ \

\ " \ \ \ \ . \

-------\---+--. \ \ \. . \.

(na-no)Cf-_-_--=--_-_-_-_-_-_:\.-'-'~_-~..Ao_:~._L_"""_'""""" _________ _ n2

b

Abb.24. Schematische Darstellung der Dispersion der Formdoppelbrechung. Die einzelnen Kurven ent­sprechen dem Verlauf der Formdoppelbrechung bei unterschiedlichen WellenHingen (Ac = 656,3 nm; AF = 486,r nm; Ax > Ac). - a: anomaler Verlauf der Brechzahl des Gefiiges n 1 (DiFo < I); b: normaler Verlauf der Brechzahl des Gefiiges n 1 (DiFo > I).

Figure 24. Schematic representation of the dispersion of form birefringence. The individual curves corres­pond to the behavior of form birefringence at different wavelengths (Ac = 656.3 nm; AF = 486.r nm; Ax > Ac). - a: Abnormal behavior of the index of refraction of structure n 1 (DiFo < r); b: normal behavior of the index of refraction of structure n1 (DiFo > I).

die urspriingliche Eigendoppelbrechung der Fadenmolekel. Dariiber hinaus kommt es durch die Anlagerung dicser Substanzen auch zur Be­einflussung der Formdoppelbrechung, da sich das verhaltnis der Ge£iigeliicken zum Ge£iige

andert (SCHEUNER und HUTSCHENREITER 1970 b). Die optischen Eigenschaften des Gesamtobjektes werden deshalb durch orientierte Anlagerung von Farbstoffen wesentlich beeinfluBt. Das gilt besonders dann, wenn die angelagerten Farb-

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 35

r[nmJ

w ~~

-._._.- 575 nm

------ 650 nm

50 x

30

10

1,300 1,336 1,373 1,407 1,462 Brechzahl nz

Abb.25. Imbibitionskurven der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser der Sclera eines menschlichen Auges nach Eirbung mit Toluidinblau bei pH =2,2 in Abhangigkeit von der WellenHinge (vgl. Abb. I8).

Figure 25. Imbibition curves of the total birefrigence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH =2.2) as a function of the wavelength (d. Fig. I8).

stoffe bei bestimmten Wellenlangen starke Ab­sorptionseigenschaften zeigen.

Wahrend beim ungefarbten Kollagen die Eigendoppelbrechung der Polypeptidketten da­durch charakterisiert wird, daB ny > n" und ny in der Langsrichtung der Polypeptidketten (z. B. Kollagenmoleklile) liegt, verandern sich nach Anlagerung von Toluidinblau diese Verhalt­nisse. Auf Grund der Dispersion der Brech­zahlen kommt es mit zunehmender Wellenlange zu einem Ansteigen der Brechzahl nIX gegenliber ny. Entsprechend unseren Messungen ist bei A= 575 nm dann n,,>ny' Damit liegt ein anderer Fall gegeniiber der nicht erfolgten An­lagerung mit Toluidinblau vor, wenn man da­von ausgeht, daB der h6heren Brechzahl auch die Langsrichtung der Bausteine des Gefiiges zugeordnet ist. Diese Erklarung wird gestiitzt durch die Lage des Maximums des negativen Dichroismus bei etwa A = 540 nm (s. S. 55) und

dadurch, daB fiir langere Wellenlangen als die, die dem Maximum des Dichroismus entsprechen auch der starker absorbierte Strahl der starker gebrochene ist. AuBerdem ist zu beachten, daB negativer Dichroismus bei einer bestimmten Wellenlange dadurch charakterisiert wird, daB senkrecht zu der gewahlten Bezugsrichtung schwingendes Licht starker absorbiert wird als parallel dazu schwingendes.

1m Sinne der submikroskopischen Struktur­analyse laBt sich das Auftreten der Maxima durch die Vorzugsrichtung der Hauptstruktur (Langsrich­tung der etwa senkrecht zu den Polypeptid­ketten angeordneten Toluidinblauassoziate) deu­ten, die in diesem FaIle unter - 45°; d. h. von rechts unten nach links oben im Gesichtsfeld verlauft. Bei den Gesamtdoppelbrechungskur­ven, die Minima zeigen, liegt normale Disper­sion der Brechzahl des Gefliges (nt) vor. Bei den Kurven, die auf Maxima hinweisen, handelt es

36 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

Tfnml

t w ~~

_.-._.- 575 nm

------ 650 nm

50

30

10

1,300 1,336 1,373 1,407 1,462 Brechzahl nz

Abb.26. Imbibitionskurven der Gesamtdoppclbrechung einer kollagenen Faser der Sclera eines menschlichcn Augcs nach Farbung mit Toluidinblau bei pH = 3,4 in Abhangigkcit von der Wellenlange (vgl. Abb. IS).

Figure 26. Imbibition curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH = 3.4) as a function of the wavelength (d. Fig. IS).

sich urn anomale Dispersion der Brechzahl des Gefuges (n1), wobei hier das Gefuge aus Poly­peptidketten und den angelagerten Toluidin­blauassoziaten besteht.

Ausgehend von den Eigenschaften chromo­troper Strukturen (s. S. 7) ergibt sich, daB bei niedrigeren pH-W erten weniger Toluidinblau als bei hoheren pH-Werten gebunden wird, wenn verschiedenartige saure Gruppen vor­liegen. Polarisationsoptisch gelingt hier der relativ quantitative Nachweis saurer Gruppen. Beim V orhandensein gleichartiger Anionen wird man mit diesem Verfahren nur grobe Unterschiede in der Anzahl der Gruppen feststellen kounen, wahrend Differenzen bei verschiedenartigen sauren Gruppen empfindlicher nachzuweisen sind.

Zur Durchfuhrung der Methode farbt man bei unterschiedlichen pH-W erten in moglichst engem Abstand eine Reihe von histologischen

Schnitten in der iiblichen Weise mit Toluidin­blau an. Nach Eindecken mit Gummi arabicum bestimmt man an den interessierenden Struk­turen das V orzeichen der Doppelbrechung bei A = 500 nm und bei A = 600 nm. 1m Ergebnis kaun fur die zwei Wellenlangen entweder gleiches oder unterschiedliches V orzeichen bei einem bestimmten pH-Wert festgestellt werden. Durch den Vergleich gleichartiger Strukturen nach unterschiedlicher V orbehandlung oder den Vergleich unterschiedlicher Strukturen nach gleichartiger V orbehandlung ist eine entspre­chende Aussage moglich. Am Beispiel der ver­gleichenden histochemisch-polarisationsopti­schen Untersuchung von kollagenen Fasern in den Processus ciliares des Auges und Zonula­fasern solI das Prinzip einer moglichen Aussage angegeben werden (Tab. I).

Zonulafasern zeigen nach Durchfiihrung einer Toluidinblauanlagerung von pH= 3,8 bis pH=

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 37

T£nml

70

pH = 4,11

50

30

10

.. 7,300 1,336 7,373 7,407 Brechzahl n2

-70 450 nm 575 nm

475 nm 600 nm _ ... _ ... - 500 nm -_._ .. - 625 nm .. __ .. __ .. 525 nm ------ 650 nm

-30 ................. 550 nm -_ ... __ ... 675 nm

Abb.27. Imbibitiollskurvell der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser der Sclera eines menschlichell Auges nach Farbung mit Toluidinblau bei pH = 4,4 in Abhangigkeit von der Wellenlange (vgl. Abb. I8).

Figure 27. Imbibition curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH =4.4) as a function of the wavelength (c£. Fig. I8).

5,4 eine Anderung ihres polarisationsoptischen verhaltens in Abhangigkeit vom pH-Wert der Toluidinblaulosung. Die beziiglich der Faser­langsachse positive Doppelbrechung der Zonula-

fasern schlagt dabei zwischen pH = 4,2 und pH = 4,4 in negative Doppelbrechung urn. 1m Ver­gleich dazu zeigen kollagene Fasern aus den Processus ciliares einen Wechsel des V orzeichens

Tab. 1. Vorzeichen der Doppelbrechung von kollagenen Fasern in einem Processus ciliaris und Zonulafasern vor und nach Behandlung mit Hyaluronidase nach Toluidinblaubehandlung bei verschiedenen pH-Werten. Die Untersuchung erfolgte bei A = 600 nm. Imbibitionsmedium: Gummi arabicum.

pH-Wert 3,8 4,2 4,4 4,6 4,8 5,01 --------T---T---r-~r-~~~--~I----

Zonula + + . Zonula nach Hyaluronidase + + + 1

Kollagen + + + + 1

38 . G. SCHEUNER • J. HUTsCHENREITER

nnml

70

50

30

70

1,300

-10

---.--_. _ ... _ ... -.. __ .. __ ..

-30 ................

x. x..:: ........

:~·:~:-::::.· ...... x .... ". \ ", 'x \ ..... x, '.

X,, " '. \ .... '. ',\ ~,....... "'x .~

pH=5,'+

x". ". ,,' ~~~~', .•.••• '" \" x _ ... '" -. ,\ . -", .... '~ .... >, ..... ,'~. -.... "':-... '. \'. ... ...

1,336

450 nm

475 nm

500 nm

525 nm

550 nm

~'S:. X," '\' ..........

','" '. \ X_ ••. _ ," "'. ". " \ ... ""-.. ':s .... .,~ .... <., '-"'-"'X

"':::"iiri ..... X ................

"'~ .... ... ....... .,~~ ·····x ............... ,~, .... ·x '·,~~x

• "x\ " .. ~'. '\\ \~. ',\ ~.

\\ . '::-. \. \'.

1,373 7,'+07 \ \'. \

\ '. \ _._._.- 575 nm \

--.--.-- 600 nm , _ .. _ .. - 625 nm ------ 650 nm __ 0 •• __ ••• 675 nm

x

, 1,462

\ ,

'. 'x \

\ \ , \

\ x

\ \ \ x

Brechzahl n2

Abb. 28. Imbibitionskurven der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser der Sclera eines menschlichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau bei pH = 5,4 in Abhangigkeit von der Wellenlange (vgl. Abb. 18).

Figure 2S. Imbibition curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH = 5.4) as a function of the wavelength (d. Fig. IS).

der Doppelbrechung zwischen pH = 4,6 und pH = 4,8. Daraus geht hervor, daB die Zonula­fasem im Unterschied zu Kollagen gerichtet eingebaute saure Gruppen enthalten, die bei pH = 4,4 so stark dissoziiert vorliegen, daB dadurch eine U mkehr des V orzeichens der Doppelbre­chung herbeigefuhrt wird. Nach Einwirkung von Hyaluronidase auf Zonulafasem ergibt sich eine Verschiebung des V orzeichenwechsels urn etwa 0,2 pH-Einheiten. Man kann daraus den SchluB ziehen, daB ein Teil der sauren Gruppen, welche u. a. fur die Toluidinblaueinlagerung verantwortlich sind, in die Zonulafasem einge-

lagerter Hyaluronsaure bzw. Chondroitinschwe­felsaure A und C angehoren.

6.2.2.1.2. EinfluJ3 der Temperatur

Es ist von Absorptionsmessungen toluidin­blau-gefarbter Praparate her bekannt, daB die Metachromasie temperaturabhangig ist (s. S. 18). Angaben uber den EinfluB der Temperatur auf die Dispersion der Doppelbrechung fehlen bisher in diesem Zusammenhang. Aus Abb.30 geht der TemperatureinfluB hervor. Bei 4°C steigen die Gangunterschiede im positivem Be-

T[nm]

90

70

50

30

10

1,300

-70

-30

-50

-70

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 39

!! ~::: .I

;' x ! , :' / " : , ~, " ./ /:

'. , , , x. .~ '. ..',: x 500 nm

" ". \ .. ,/ x •••••• '.<, .. \ .y,/ . <~\ /' /"

••••• " x" ., / ...

~.... . ... "x~' ", ~.... ' ... ~ Ii" .. ~ ••••.• "~~.:'. __ . ___ . ___ .x 4-75 nm

~":~" x ............. ~~. ·~~ .... x .. ~~ ....

x~:::,.. x 4-50 nm .. ~~, .~~

t.". ""'. \\", 7,332 1,375 1,4-03\~. '~', 1,4-62 Brechzahl n2

\'\ """ \.,\, \', \ . ., , ' . . \~ \', \ :', " 675 \ \" ,,x nm

\ \{" 'x 650 nm \ \\

, \" PH= 6,0 \. \.,

\ '.' \ \X 625 nm \ x 600 nm

\ \ \ \ x 575 nm

Abb.29. Imbibitionskurven der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser der Sclera eines menschlichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau bei pH =6,0 in Abhangigkeit von der Wellenlange (vgl. Abb. 18).

Figure 29. Imbibition curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH =6.0) as a function of the wavelength (d. Fig. 18).

reich von A=450 nrn bis A= 525 nrn an. Ab A = 575 nrn hat die Doppelbrechung ihr Vor­zeichen gewechselt. Die Gangunterschiede fallen irn negativen Bereich bis A = 675 nrn abo Bei 30° C ist ein ahnlicher quantitativ aber geringer

ausgepragter Gang festzustellen. Fur das Fehlen von MeBpunkten bei A= 550 nrn gilt die Er­klarung aufS. 27, 29. Andere Kurven ergebensich bei 60° C und 75° C. Bier kornrnt es irn gesarnten sichtbaren Wellenlangenbereich nicht zurn V or-

40 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

nnmJ

50

30

//: . /

/// ~".,."

~)(,,;

pH = 5,8

10 ~--)( _._oX--___ .x_ ~~:.,,:,,:,:,:·.~:l::::: ........... x ............... x .... :~.::::::x:::-::.""" .. ~.: :.:.:':.~._. _._ .. _. ___ 0_. _._._.

450 -10

-30

500

4°e ------ 30 0e _._._.- 60 0e ................. 7Soe

550

Abb.30. Dispersionskurven der Gesamtdoppelbreehung einer kollagenen Faser aus cern Zentrum einer menschlichen Cornea nach Farbung mit Toluidinblau bei pH = 5,8 in Abhangigkeit ven cler Temperatur. Imbibitionsmedium: Mischung aus Glyzerin, Wasser und Kaliumferricyanid. n 2 ~ nD; nD4 = I,45I7; nD 30 = I,45IO; nD 60 = I,4438; nD 75 = I,4397·

Figure 30. Dispersion curves of the total birefringence of a collagenous fiber from the center of a human cornea after toluidine-blue staining (at pH = 5.8) as a function ofthe temperature. Imbibition medium: Mixture of glycerol, water, and potassium ferricyanide. n 2 ~ nD; nD4 = I,45I7; IlD30 = 1.45IO; IlD60 = 1.4438; nD75 = 1.4397.

zeichenwechsel. Die Gangunterschiede sind nied­rig und zeigen nur schwache Veranderungen.

Bei Temperaturerhohung wird durch ther­mische Energie die Bindung zwischen den Tolui­dinblaumolekulen gelockert. Deshalb nimmt die Anzahl der orientierten Toluidinblaumole­kule mit steigender Temperatur abo AuBerdem ist zu beachten, daB dieser ProzeB durch die mit ansteigender Temperatur sinkenden Brech­zahlen unterstutzt wird. Umgekehrt kann man sich dieses Verhalten nutzbar machen, indem entsprechende Untersuchungen besonders an schwach metachromatischen Strukturen bei moglichst niedriger Temperatur durchgefuhrt werden, da hierbei die charakteristischen Dop­pelbrechungserscheinungen verstarkt hervor­treten.

6.2.2.1.3. Einjluj] von Athylalkohol

Da immer noch histochemische Methoden gebrauchlich sind, bei denen nach Toluidinblau­farbung Athanol zur Dehydratisierung der ge-

farbten Praparate Verwendung findet (KRAMER

und WINDRUM 1955), solI darauf hingewiesen werden, daB Alkoholbehandlung auch einen Einjluj] auf die Dispersion der Doppelbrechung hat. N ach Einwirkung von absolutem Athylalkohol (5 min) auf kollagene Fasern der Sclera, die bei pH= 5,4 mit Toluidinblau behandelt wurden, verandert sich die Form der Dispersionskurve (Abb.31, vgl. auch Abb.20). Sie zeigt keine Umkehr des Vorzeichens der Doppclbrechung. Daraus laBt sich schlieBen, daB die Assoziatbil­dung der Farbstoffmolekule beeintrachtigt wird.

Auch ROMHANYI (1963) nimmt zum Problem des Alkoholeinflusses auf die Doppelbrechung nach Toluidinblauanlagerung Stellung. Aus Abb.32 ergibt sich danach eine mit dem Alko­holgehalt der Farbstofflosung lineare Abschwa­chung des Gangunterschiedes .der Doppelbre­chung. Es laBt sich daraus kein Bereich einer «Alkoholresistenz» fur den Gangunterschied er­kennen, der fur eine polarisationsoptische Unter­scheidung chromotroper Strukturen geeignet ware.

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 41

Tfnml

70 pH=5,q.

50

30

10 x _____ x-----x-----X~

x--- x ____ x_x __ __

450 500 550 600 650 A [nmJ

Abb. 3 I. Dispcrsionskurve der Gesamtdoppelbrechung einer kollagenen Faser aus der Sclera des menschlichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau bei pH = 5,4 und anschlieBender Behandlung mit absolutem Alkohol (5 min). Imbibitionsmedium: Gummi arabicum.

Figure 3 I. Dispersion curve of the total birefringence of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining (at pH = 5.4) and subsequent treatment with absolute alcohol (5 min). Imbibition medium: Gum arabic.

Tfnml

30

20 I

I I I

10 I I I I

10 I I

-10 I I I I

10 2yO /X

-20 \/x -30 !

40 50 60 Alkohol [%J

Abb. 32. Quantitativer Veri auf des Gangunterschiedes der Doppelbrechung der Corneafasern in Abhangigkeit vom Alkoholgehalt der Farbstofflosung. Die Messungen wurden noch in der FarbstofflOsung £iir jede ange­wendete Konzentration nach IO min Farbungsdauer durchgefi.ihrt. A = 600 nm (nach ROMHANY1 1963).

Figure 32. Quantitative course of the path difference of birefringence of corneal fibers as a function of the alcohol content of the solution of stain. The measurements were made in the solution of stain (after a duration of staining of IO min) for each of the concentrations used; A = 600 nm (after ROMHANY1 1963).

6.2.2.2. Moglichkeiten der poiarisationsoptischen Auswertung durch standardisierte Gang­unterschiedsmessungen

Die gerichtete pH-abhangige Anlagerung von

Toluidinblau laBt sich nicht nur qualitativ son-

dern auch quantitativ polarisationsoptisch analy­

sieren. Fur die quantitative Auswertung, sowohl an Paraffin- als auch an Gefrierschnitten ist es erforderlich, standardisierte Verfahren einzu­

halten (s. S. 9ff).

42 • G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

Die quantitative Auswertung dey Toluidinblau­reaktion erfolgt liber die Bestimmung von f 0

und fM und die Erredmung eines Quotienten Q.

r 0: Gangunterschied bei A = 600 nm bzw. A = 500 nm; EinschluBmedium: Gummi arabicum

rM: Gangunterschied bei A= 600 nm bzw. A= 500 nm nach ToluidinblauHirbung. EinschluBmedium: Gummi arabicum

Wenn Jr oJ;::; JrMJ, dann gilt unabhangig von den V orzeichen der Doppelbrechung

Q = fo-fM

fo

Wenn JfoJ<JrMJ und das Vorzeichen von f 0 sich gegensatzlich zum Vorzeichen von fM verhalt, dann gilt:

Q = fo-fM

fo (10)

Wenn JfoJ<JfMJ und die Vorzeichen vonfo und fM gleich sind, dann gilt:

(II)

Dabei ist zu beachten, die Bezugsrichtung des MeBobjektes so zu wahlen, daB das Vorzeichen von f 0 stets positiv wird. Das V orzeichen von fM ergibt sich dann ebenfalls durch diese fest­gelegte Bezugsrichtung. In die Zahler und Nenner der Quotienten gehen found fM mit ihren so bestimmten V orzeichen ein. Der Quo­tient stellt ein relativ quantitatives MaE flir die gerichtet angeordneten, dissoziiert vorliegenden sauren Gruppen dar. Kommt es zu keiner orien­tierten Anlagerung von Toluidinblau, mliBte theoretisch f 0 = fM sein. Daraus wlirde sich ein Quotient von Q =0 ergeben. In der Praxis wird dieses Ergebnis im allgemeinen nur an­nahernd erreicht, da durch MeBungenauig­keiten und Anderungen des Quellungszustandes kleine Abweichungen auftreten konnen. Es ist im speziellen Fall yom Untersucher auf Grund der Kenntnisse liber das Objekt zu entscheiden, wie kleine Abweichungen yom theoretischen Idealfall zu beurteilen sind.

Wir haben versucht, diese Abweichungell groBenordnungsmaBig zu erfassen. Dazu ver­wendeten wir kollagene Fasern, die 24h mit Methyljodid behandelt worden waren, so daB keine sauren Gruppen mehr als Anlagerungs­punkte flir Toluidinblau vorlagen. Die aus den Messungen errechneten Quotienten lagen in jedem Fall unter Q = 0,20. Wir empfehlen des­halb, diesen Wert als oberc Grenze dey zulassigcn Abweichung von einem in den nachfolgenden Tabellen angegebenen moglichen Ergebnis an­zusehen. Wird diese Grenze liberschritten, so muB das als Ausdruck flir eine Veranderung an der untersuchten Struktur angesehen werden. Es bleibt im librigen dem jeweiligen Unter­sucher liberlassen, im speziellen Fall den Wert flir die obereGrenze der moglichenAbweichung selbst in Abhangigkeit von den entsprechenden Versuchsbedingungen festzulegen.

Aus dem Vergleich der Quotienten ergibt sich die Moglichkeit der gegenseitigen Abgren­zung verschiedener gerichtet angeordneter saurer Gruppen zur getrennten polarisationsoptischen Erfassung. Ein solcher Vergleich muB gegebe­nenfalls mit Hilfe eines statistischen verfahrens vorgenommen werden, wobei nach Vorgabe einer bestimmten statistischen Sicherheit die Nullhypothese geprlift wird. Wir empfehlen, dazu ein parameterfreies Verfahren zu ver­wenden (z. B. U-Test nach WILCOXON, MANN und WHITNEY).

Bei der Betrachtung der Dispersionskurven der Doppelbrechung (s. Abb.21, 22) fallen nach Imbibition mit Gummi arabicum Bereiche urn A~ 500 nm und A~ 600 nm auf, wo eine be­sondere Verstarkung der Doppelbrechung nach Toluidinblaubehandlung im positiven bzw. ne­gativen Sinne zu beobachten ist. AuBerdem tritt zwischen diesen beiden Wellenlangen - wenn liberhaupt - der Vorzeichenwechsel ein. Aus diesem Grunde empfehlen wir flir den haufi­geren Fall einer positiven Doppelbrechung bei A = 500 nm, die Gangunterschiedsmessung flir die Quotientenbildung bei A = 600 nm durchzu­flihren. 1m umgekehrten Fall kann man bei A= 500 nm messen. Eine Messung bei A = 600 nm hat noeh den V orteil, daB sie weitgehend temperaturunabhangig ist (s. S. 19).

44 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

molekel), welche schwdelhaltige saure Gruppen tragen, zu erweitern, k6nnen spezijische Enzyme als histochemische Reagentien eingesetzt werden. Testeshyaluronidase z. B. baut Hyaluronsaure sowie Chondroitinsulfat A und C ab (PEARSE 1961). Zur Feststellung, ob die nachgewiesenen, gerichtet angeordneten Sulfatgruppen Substan­zen angeh6ren, die durch Testeshyaluronidase abgebaut werden, behandelt man Parallelschnitte vor der Farbung durch Toluidinblau mit diesem Enzym. Stehen die verschiedenen Chondroiti­nasen zur Verfiigung, gelingt eine Differenzie­rung miiheloser. Der Einsatz von Testeshyaluro­nidase weist lediglich auf das eventuelle V or­handensein von Chondroitinsulfat A und Chin, da Hyaluronsaure nur Carboxylgruppen und

Tab. 2 b. Anleitung fiir die Beurteilung der Quotien­ten Q, bis Q6 beim Nachweis von gerichtet ange­ordneten schwefelhaltigen sauren Gruppen.

Quo- Mogliches Aussage tient Ergebnis

Q, Q, < 0,2 Es liegen keine schwefelhaltigen sauren Gruppen vor. Wenn Q, < 0,2, dann miissen auch alle anderen Quotienten (Q2 bis Q6) kleiner als 0,2 sein. Die Unter­suchung muB abgebrochen werden.

Q, = a Schwefelhaltige saure Gruppen a ~ 0,2 sind vorhanden, wenn Q2 < 0,2

Es ist keine gerichtete Anlage­rung von Toluidinblau erfolgt, weil alle sauren Gruppen ein-schlieBlich der Sulfatgruppen blockiert sind. Damit wird bestatigt, daB die Ursache der orientierten Einlagerung von Toluidinblau nur saure Gruppen sind.

Die Einlagerung von Toluidin­blau ist nicht durch schwefel­haltige saure Gruppen bedingt. Die Untersuchung kann an dem Objekt nicht durchgefiihrt werden.

Quo- Mogliches Aussage tient Ergebnis

Q3 Ql=Q,=a DasErgebnisQ, ~ 0,2wird ausschlieBlich durch schwefel­haltige saure Gruppen hervor­gerufen.

Q3 < Q, Neben schwcfelhaltigen sauren Q, ~ 0,2 Gruppen sind noch andere saure

Gruppen fiir den Reaktionsaus­fall verantwortlich. Wahrschein­lich liegen zusatzliche Phosphat­gruppen vor.

Q4 Q4=Q, =a Kontrollreaktion fiir Alkylie-rung. Alkylierung kann angewendet werden.

Q4 =F Q, Kontrollreaktion fUr Alkylie­rung. Alkylierungsverfahren kann zur Beurteilung nicht herangezogen werden.

Qs=Q, =a Chondroitinsulfat B, Kerato­sulfat, Heparin, Heparitinsulfat oder andere Substanzen mit gerichtet angeordneten sauren Gruppen sind fUr den Reaktions­ausfall verantwortlich.

Es kann Chondroitinsulfat A und Chondroitinsulfat C vorliegen. Die Differenz (Q,-Qs) kann ein relativ quantitatives MaB fiir andere orientierte Makromolekiilc mit schwefelsauren Gruppen sem.

Alle schwefelsauren Gruppen des Untersuchungsobjektes sind an Chondroitinsulfat A bzw. C gebunden.

Q6=Q, =a Kontrollreaktion fUr Hyaluron­idaseverdauung. Die Behand­lung mit der fUr Hyaluronidase verwendeten InkubationslOsung ruft keine unerwiinschten Losungscffckte hervor. Das Verfahren der Hyaluronidase­verdauung kann angewandt werden.

Kontrollreaktion fUr Hyaluron­idascverdauung. Die Behand­lung mit Hyaluronidase kann nicht zur Beurteilung herangezogen werden,

Metachromasie, Doppclbrechung, Dichroismus . 43

6.2.2.2.1. Nachweis gerichtet angeordneter schwe!elhaltiger saurer Gruppen

1st der Quotient (Q) bei Verwendung von Toluidinblaulosungen mit pH-Werten unter 2,6 groBer als 0,2 dann ist eine orientierte An­lagerung des Farbstoffes an saure Gruppen, die bei diesem niedrigen pH-Wert dissoziert vor­liegen, erfolgt. Es wird sich dabei vorwiegend urn schwefelhaltige saure Gruppen handeln, da die anderen in biologischen Objekten im aIlge­meinen auftretenden clektronegativen Gruppen bei hoheren pH-W erten dissoziieren. Diese Aus­sage laBt sich durch Alkylierung (TERNER 1964) erharten. Nach Einwirkung von Methyljodid i.1ber 24 h sind Carboxyl- und Phosphatgruppen alkyliert, d. h. mit Toluidinblau nicht mehr reaktionsfahig. Nur die Sulfatgruppen liegen noch unverandert vor. Bleibt der Quotient (Q)

im Parallelschnitt nach Alkylierung und an­schlieBender Toluidinblaubehandlung unveran­dert, so waren an der Reaktion ausschlieBlich schwefelhaltige saure Gruppen beteiligt. Tritt hingegen eine Erniedrigung des Quotienten ein, der aber noch groBer als 0,2 ist, so sind auch andere jetzt alkylierte saure Gruppen £iir den Reaktionsausfall verantwortlich zu machen. Nach Veresterung (GEYER 1962) darf der Quo­tient nicht groBer als 0,2 sein, weil hier aIle sauren Gruppen einschlieBlich der schwefelhalti­gen blockiert werden. Da diese Reaktion das Gewebe stark angreifen kann, empfiehlt es sich, mehrere Praparate da£iir einzusetzen.

Die schwefelsauren Gruppen sind an be­stimmte Substanzen gebunden. Dabei spielen vor allem Glykosaminoglykane eine Rolle. Urn die quantitative polarisationsoptische Aussage in dieser Beziehung auf Substanzen (z. B. Faden-

Tab. 2 a. Praktische Durchflihrung des quantitativen polarisationsoptischen Nachweises gerichtet angeordne­ter schwefelhaltiger saurer Gruppen. Sechs nebeneinanderliegende Schnitte (1 bis 6) werden folgendem Untersuchungsgang unterworfen:

Vorbehand-lung

E E

rgebnis: rrechneter

Quotient

2 4 6

Messung von roan allen sechs Praparaten

keine Veresterung Alkylierung Behandlung Hyaluron- Behandlwlg mit Methyl- mit derbei idaseinkuba- mit der flir jodid24 h Alkylierung tion Hyaluron-

verwendeten idasever-Lasung ohne dauung ver-Methyljodid wendeten 24h Inkubations-

lasung (ohne Hyaluron-idase)

Behandlung aller sechs Praparate mit o,I%iger Toluidinblaulasung bei pH = 2,2 entsprechend der Vorschrift auf S .... 10

Messung von rM an allen sechs Praparaten

Ql Qz Q3 Q4 Qs Q6

Die erhaltenen sech, Quotienten kannen nach einem Schema (Tab. 2 b) beurteilt werden, wobei zu beachten ist, daB man den gesamten Vorgang der Ermittlung von sechs Quotienten an Farallelschnitten genugend oft wiederholt, um zu gesicherten, statistisch auswertbaren Ergebnissen zu gelangen.

keine Sulfatgruppen enthalt. Die quantitative Auswertung wird ebcnfalls tiber den angegebe­nen Quotienten vorgenommen.

6.2.2.2.2. Nachweis gerichtet angeordneter phosphorhaltiger saurer Gruppen

Phosphorhaltige saure Gruppen spielen inner­halb des Gewebes im Zusammenhang mit pola­risationsoptischen N achweismoglichkeiten bis­her bei den Nucleinsauren eine Rolle. MATSU­HASHI und KUMAGAI (1963) untersuchten in diesem Zusammenhang die metachromatische Reaktion mit Toluidinblau an Oligophosphaten. Sie stell ten eine mit steigender Kettenlange der phosphate zunehmende Metachromasie fest. Liegen reaktionsfahige phosphorhaltige saure Gruppen vor (z. B. nach Phosphorylierung), so konnen zur orientierenden Untersuchung ver-

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 45

schiedene Methoden verwendet werden. 1m Unterschied zu den Sulfatgruppen arbeitet man hier beipH·Werten vonpH= 3 bis pH=4,6. Es ist zu beachten, daB in diesem pH-Bereich neben den phosphatgruppen nattirlich auch die schwe­felhaltigen sauren Gruppen dissoziiert vorliegen. Wahrend 24sttindige Alkylierung mit Methyl­jodid Sulfatgruppen nicht beeinfluBt, gelingt in diesem Zeitraum die Blockierung der Phosphat­gruppen. Sind die phosphorhaltigen elektrone­gativen Gruppen an Nukleinsauren gebunden, dann lassen sie sich durch Einsatz von Ribo­nuklease bzw. Desoxyribonuklease leicht erfas­sen. Die quantitative Auswertung erfolgt tiber den angegebenen Quotienten.

Die erhaltenen sieben Quotienten wertet man nach einem Schema (Tab. 3 b) aus. AIle Quo­tienten sind dabei an Parallelschnitten gentigend oft zu ermitteln, damit eine statistische Auswer­tung moglich wird.

Tab. 3 a. Praktische DurchfUhrung des quantitativen polarisationsoptischen Nachweises gerichtet angeordne­ter phosphorhaltiger saurer Gruppen. Sieben nebeneinanderliegende Schnitte (Ibis 7) werden entsprechend der vorher angegebenen Vorschrift folgendem Untersuchungsgang unterworfen:

2 3 7 ~ - Praparat-~ nummer 4 6 5

M ----~----~----~~------~----------~----------~----------~----------::: Messung vonr 0 an allen sieben Praparaten

.E u

~ ~

:5 ... ~ ()

bJl

J

Vorbehand-lung

E E

rgebnis: rrechnetcr

Quotient

keine keine Vcreste- Alkylierung Behandlung RNase- bzw. Behandlung rung mit Methyl- mit der bei der DNase-Inku- mit der bei

jodid24h Alkylierung bation RNase- bzw. verwendeten DNase-Inku-Lasung ohne bation ver-Methyljodid wendeten 24h Lasung ohne

die Enzyme

Behandlung aller sieben Praparate mit o,I%iger Toluidinblaulasung entsprechend der Vor-schrift auf S. 10 bei I)

pH~3,6IpH=2,21 pH~3,6 I

pH~3,6 I

pH~3,6 I

pH~3,6 I

pH=3,6

Messung vonrM an allen sieben Praparaten

QI Q2 Q3 Q4 Qs Q6

I Q7

I) Besteht die Vermutung, daB Sialinsaure am Reaktionsausfall beteiligt ist, die Carboxylgruppen ent­halt, welche zwischen pH = 3,0 und pH ~ 3,6 dissoziieren, dann muB zur Kontrolle das Extraktionsverfahren (milde Hydrolyse bei pH = 2,5) nach QUINTARELLI (1961) angewandt werden.

46 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

Tab.3 b. Anleitung flir die Beurteilung der Quo­tienten Ql bis Q7 beim Nachweis von gerichtet angeordneten phosphorhaltigen sauren Gruppen.

Quo- Mogliches Aussage tient Ergebnis

Ql Ql < 0,2 Es Iiegen keine sehwefelhaltigen

Ql=b b >0,2

und phosphorhaltigen sauren Gruppen vor. Wenn Ql < 0,2, dann miissen aueh alle anderen Quotienten (Q2 bis Q7) kleiner aIs 0,2 sein. Die Untersuchung muB abgebrochen werden.

Phosphorhaltige oder schwefc1-haltige saure Gruppen bzw. beide Arten der Gruppen sind vorhanden, wenn Q3 < 0,2.

Es liegen keine sehwefelhaltigen sauren Gruppen vor. Tritt der Fall ein, daB Ql = b, dann sind fUr den Reaktionsausfall aussehlieBIieh phosphorhaltige saure Gruppen verantwortlich.

b>Q2>0,2 Neben sehwefelhaltigen liegen auch phosphorhaltige saure Gruppen vor. Die Differenz (Ql-Q2) stellt ein relativ quantitatives MaB fUr die phosphorhaltigen Gruppen dar.

Phosphorhaltige saure Gruppen treten nicht auf.

Bei pH = 3 ,61iegen mit ihter V orzugsrichtung senkrecht zueinander orientierte Toluidin­blauassoziate vor. Das IaBt darauf sehlieBen, daB auch die entspreehenden sauren Gruppen mit ihrer Vorzugsriehtung senkrecht zueinander liegen. In diesem Falle wiirden Phosphat­gruppen mit ihrer Vorzugs­riehtung zu Sulfatgruppen, die bei pH = 2,2 dissoziieren, senkreeht angeordnet sein.

Es ist keine Einlagerung von Toluidinblau erfolgt, weiI alle sauren Gruppen bloekiert sind. Damit wird bestatigt, daB die Ursache der orientierten Ein­Iagerung von Toluidinblau nur saure Gruppen sind.

Quo- Mogliehes Aussage tient Ergebnis

Q3 ~ 0,2 Die Einlagerung von Toluidin­blau ist nieht durch saure Gruppen bedingt. Die Unter­suehung kann an dem Objekt nieht durehgefiihrt werden.

Q4 Q4=Ql =b Es liegen aussehlieBlieh sehwefeI-

Q4 < 0,2 Ql=b

haltige saure Gruppen vor, da Phosphatgruppen naeh 24 h mit Methyljodid alkyliert werden.

Phosphorhaltige liegen neben sehwcfelhaltigen sauren Gruppen vor. (Ql-Q4) stellt ein relativ quantitatives MaB fUr die gerichtet angeordneten phosphorhaltigen sauren Gruppen dar.

Es Iiegen aussehlieBlieh phos­phorhaltige saure Gruppen vor, die allein fUr die geriehtetc Einlagerung von Toluidinblau verantwortlich sind.

Qs=Ql=b KontrollreaktionfUr Alky­lierung. Alkylierungsverfahren kann angewendet werden.

Qs oF Ql Ql ~ 0,2 Qs ~ 0,2

Kontrollreaktion fUr Alky­lierung. Alkylierungsverfahren kann zur Beurteilung nieht herangezogen werden ..

Q6=Ql=b RNase- bzw. DNase-Einwir­kung fUhrt nicht zum Abbau von Substanzen mit sauren Gruppen, d. h. RNS und DNS konnen fUr die geriehtete Toluidinblaueinlagerung nieht verantwortlieh gemacht werden.

Q6<Ql Ql ~ 0,2 Q6 ~ 0,2

Neben Nukleinsauren sind auch noch andere Substanzen mit sehwefelhaltigen bzw. phosphorhaltigen sauren Gruppen fUr die geriehtete Einlagerung von Toluidinblau verantwortlieh. Die Differenz (QCQ6) kann ein relativ quantitatives MaB fUr orientiert angeordnete Nukleinsauren sein.

Die Nukleinsauren sind allein fiir die geriehtete Einlagerung von Toluidinblau verantwort­lieh.

Quo- Magliches Aussage tient Ergebnis

Q7 Q7=Ql=b Kontrollreaktion fUr DNase-bzw. RNase-Behandlung. Die Einwirkung der entsprechenden Inkubationslamngen ruft keine unerwunschten Lasuugseffekte hervor. Das Verfahren der DNase- bzw. RNase­Behandlung kann angewandt werden.

Kontrollreaktion fur DNase­bzw. RNase-Behandlung. Das Verfahren der DNase- bzw. RNase-Behandlung kann zur Beurteilung nicht herangezogen werden.

6.2.2.2.3. Nachweis gerichtet angeordneter Carboxylgruppen

Carboxylgruppen kommen im Gewebe vor­wiegend an Glykosaminoglykane oder an Pro-

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 47

teine gebunden vor. Bei den Nachweisverfahren ist deshalb zu beachten, daB diese Gruppen in einem relativ breiten pH-Wert-Bereich disso­ziiert vorliegen konnen, der von den jeweiligen Substanzen, die Carboxylgruppen tragen, ab­hangig ist. Die Carboxylgruppen der Hyaluron­saure zum Beispiel dissoziieren bei niedrigeren pH-W erten als proteingebundene Carboxyl­gruppen. Man arbeitet hier im allgemeinen bei pH-W erten zwischen pH = 3,6 und pH = 7,0. In diesem Bereich dissoziieren allerdings teilweise auch phosphorhaltige saure Gruppen, so daB es schwierig sein kann, diese beiden Arten saurer Gruppen eindeutig voneinander zu unterschei­den. In den meisten Fallen werden die phos­phorhaltigen sauren Gruppen aber an Nuklein­sauren gebunden sein.

Die Abgrenzung gelingt dann einfach durch Einsatz von RNase und DNase. 1m Unterschied zu Sulfatgruppen werden Carboxylgruppen mit Methyljodid bereits nach etwa 8 h alkyliert. Differenzierungsmoglichkeiten zwischen den

Tab.4a. Praktische DurchfUhrung des quantitativen polarisationsoptischen Nachweiscs gerichtet angeordne­ter Carboxylgruppen. Acht nebeneinanderliegende Schnitte (I bis 8) werden entsprechend der vorher ange­gebenen Vorschrift folgendem Untersuchungsgang unterworfen:

Praparat­nummer

Vorbe-handlung

IS: Ergebn Errechn ter

e-

" Quotie nt

2 4 5 6 7 8

Messung vom roan allen acht Praparaten

keine keine kcine Vereste- Alkylierung I Behandlung Hyaluro- Behandlung rung mit Methyl- mit der bei nidasein- mit der fUr

jodid24 h Alkylierung kubation Hyaluroni-verwendeten dase ver-Lasung ohne wendeten Methyljodid Inkubations-24h lasung (ohne

Hyaluroni-dase)

Behandlung aller acht Praparate mit o,l%iger Toluidinblaulasung entsprechend der Vorschrift auf S. 10 bei

pH~5'4IpH~4,0IpH~2,21 pH~5,4 I

pH~5,4 I

pH~5,4 I pH~5,4 I

pH~5,4

Messung vonrM an allen acht Praparaten

Ql Q2 Q3 Q4 Qs Q6 Q7 Qs

48 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

carboxylgruppenhaltigen Substanzen bietet die Anwendung von Hyaluronidase. Die quantita­tive Auswertung erfolgt tiber den angegebenen Quotienten.

Die erhaltenen acht Quotienten wertet man nach einem Schema (Tab. 4 b.) aus. AIle Quo­tienten sind dabei an Parallelschnitten gentigend oft zu ermitteln, damit eine statistische Auswer­tung moglich wird.

Tab. 4 b. Anleitung flir die Beurteilung der Quo­tienten Q 1 bis Qs beim Nachweis von gerichtet angeordneten Carboxylgruppen.

Quo- Mogliches Aussage tient Ergebnis

Ql=C C > 0,2

Q2 < 0,2 Ql ~ 0,2

Es liegen keine sauren Gruppen vor. Wenn Ql < 0,2, dann miissen auch aile anderen Quotienten (Ql bis Qs) kleiner als 0,2 sein. Die Untersuchung muB abgebrochen werden.

Saure Gruppen sind vorhanden, wenn Q4 < 0,2. Es kann aber zunachst nicht zwi~chen schwefelhaltigen, phosphorhaltigen bzw. Carboxylgruppen unterschieden werden.

Es liegen im wesentlichen Carboxylgruppen vor.

C >Q2 >0,2 Es konnen andere saure Gruppen, aber auch Carboxylgruppen, die bereits bei pH~4,0 dissoziieren, vorliegen.

Q2 = c Es liegen keine Carboxyl­gruppen vor, die zwischen pH ~ 4, I und pH ~ 5,4 dissoziieren.

Q2 > Ql Bei pH~ 5,41iegen mit ihrer V orzugsrichtung senkrecht zueinander orientierte Toluidinblauassoziate vor. Das JaBt darauf schlieBen, daB auch die entsprechenden sauren Gruppen mit ihrer Vorzugs­richtung senkrecht zueinander liegen. In dies em Faile wiirden Carboxylgruppen mit ihrer Vorzugsrichtung zu sauren Gruppen, die bei pH~4,0 dissoziieren, senkrecht angeordnet sein.

Quo- Mogliches Aussage tient Ergebnis

Q3 Q3 < 0,2 Es liegen nur Carboxylgruppen Q2 < 0,2 vor. Ql ~ 0,2

Q3 < 0,2 Q" ~ 0,2 Ql ~ 0,2

Es liegen gerichtet angeordnete Carboxylgruppen oder phosphorhaltige saure Gruppen vor. Beide Gruppcn konnen auch gemeinsam vorhandcn sein.

Q3<Q2<Ql Es konnen neben Sulfat- und Ql = c Carboxylgruppen auch Q3 ~ 0,2 Phosphatgruppen vorliegen.

Es liegen lediglich schwefel­haltige saure Gruppen vor.

Q3>Q2>Ql Eine mogliche Interpretation ist, daB bei pH~ 5,4 mit inrer Vorzugsrichtung senkrecht zueinander orientierte Tolu­idinblauassoziate vorliegen. Das laBt darauf schlieBen, daB auch die entsprechenden sauren Gruppen mit ihrer Vorzugs­rich tung senkrecht zueinander liegen. In diesem Faile konnten schwefelhaltige saure Gruppen mit ihrer Vorzugsrichtung zu anderen sauren GruppeJ;l senkrecht angeordnet sein. Wenn Q3 sich stark von Ql unterscheidet, so liegen relativ viele schwefelhaltige saure Gruppen gegeniiber anderen sauren Gruppen vor.

Es ist keine Einlagerung von Toluidinblau erfolgt, wei! aile sauren Gruppen blockiert sind. Damit wird bestatigt, daB die Ursache der orientierten Einlagerung von Toluidinblau nur saure Gruppen sind.

Die Einlagerung von Toluidin­blau ist nicht durch saure Gruppen bedingt. Die Untersuchung kann an dies em Objekt nicht durchgefiihrt werden.

Quo- Moglichcs Aussagc tient Ergebnis

Q5 Q5=Q, =c Es liegen ausschlieBlich schwe-felhaltige saure Gruppen vor, da phosphorhaltige und Carboxylgruppen nach 24 h mit Methyljodid alkyliert werden.

Schwefelhaltige liegen neben anderen saurcn Gruppen vor.

Es liegen keine schwefclhaltigen sauren Gruppen vor.

Q6=Q, =c Kontrollreaktion fUr Alky­lierung. Alkylicrung kann angewendet werden.

Q6 =l= Q, Ql;::; 0,2 Q6;::; 0,2

Kontrollreaktion fUr Alky­lierung. Alkylierungsverfahren kann zur Beurteilung nicht herangczogen werden.

Q7=Q,=C Hyaluronsaure, Chondroitin­sul£at A und C liegcn nicht vor.

Hyaluronsaure bzw. Chondro­itinsul£at A oder Coder Kombinationcn dieser Substanzen sind neben andcrcn Substanzcn, die saure Gruppen tragen, vorhanden.

Qs=Q, =c Kontrollreaktion fUr Hyaluronidaseverdauung. Die Behandlung mit der fUr Hyaluronidaseverdauung verwendeten Inkubationslosung ruft keine wlerwunschten Losungseffekte hervor.

Qs =l= Q, Kontrollreaktion fur Hyaluronidaseverdauung. Die Behandlung mit Hyaluronidase kann zur Beurteilung nicht herangezogen werden.

6.2.2.2.4. Praktische Auswertung der standardisier­ten Gangunterschiedslllessungen

Am Beispiel entsprechender Messungen an Strukturen von Knorpel- (Abb. 33), Sclera- und Corneapraparaten wird die Einsatzfahigkeit des vorher angegebenen Untersuchungsschemasauf­gezeigt. Die dabei gewonnenen Ergebnisse stehen in prinzipieller Obereinstimmung zu den

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 49

Angaben am Sehnenkollagen von MELLO und

VIDAL (1973). Die Untersuchung erfolgte nach den Angaben zum Nachweis gerichtet angeord­neter Carboxylgruppen. Dabei flihrten wir die

Messungen an jeweils 40 Praparaten durch, so daB im Ergebnis jeder Quotient (Ql bis Qs) flinfmal vorliegt. Die Folgerungen beruhen auf dem statistischen Vergleich der Quotienten ent­

sprechend der Tab.4 nach Anwendung des U-Tests bei einer Irrtumswahrscheinlichkeit von

1%.

Tab. 5. Quotienten der Toluidinblaureaktion von kollagenen Fasern aus der menschlichen Cornea. Fixation IO%iges neutralisiertes Formaldehyd, Pa­raffineinbettung, Schnittdicke 5 [J.m.

Q bei Q bei Aussage 1.=600 nm 1.= 500 nm

Ql 3I,60 34,20 27,45 36,84 29,26

Qz 7,24 IO,3 6 5,75 6,82 9,34

Q3 2,IO I,79 I,89 3,46 2,95

Q4 0,04 0,I7 0,12

0,09 0,I8

Q5 I,85 2,20 I,63 4,81 3,47

15,59 17,81 19,23 13.47 16,08

4,71

IO,22 6,87 3,I7 8,33

0,90 I,3 2

3,OI 2,78 I,22

0,03 0,08 0,I2 0,07 0,I6

I,3 2

0,90

2,73 3,68 I,21

Saure Gruppen sind vorhanden, da Q4< 0,20. Es kann aber zunachst nicht zwischen schwefel­haltigen, phosphor­haltigen bzw. Carboxylgruppen unterschieden werden.

Es konnen andere saure Gruppen, aber auch Carboxyl­gruppen, die bereits bei pH=4,0 dissoziie­ren, vorliegen.

Es konnen neben Sul£at- und Carbo­xylgruppen auch Phosphatgruppen vorliegen.

Es ist keine Ein­lagerung von Toluidinblau erfolgt, weil aile sauren Gruppen blockiert sind.

Schwefelhaltige liegen neben anderen sauren Gruppen vor.

50 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

2

Abb. 33. Polarisationsoptische Darstellung. des hyalinen Knorpels aus der menschlichen Trachea nach Tolui­dinblaureaktion. Imbibitionsmedium: Gummi arabicum. Kompensation mit A/8Brace-Kohler-Kompcnsator. 200 : 1. - a: Farbung bei pH = 2,2. Kollagene Fasern des Perichondriums (I) positiv doppelbrechend (dunkel), gleichsinnig orientierte Interterritorialsubstanz (2) durch gerichtete Toluidinblauanlagerung negativ doppel­brechend (hell); b: Farbung bei pH = 5,4. Kollagene Fasern des Perichondriums (I) und glcichsinnig orientierte Interterritorialsubstanz (2) negativ doppelbrechend (hell).

Figure 33. Polarization-optical representation of the hyaline cartilage from a human trachea after toluidine­blue reaction. Imbibition medium: Gum arabic. Compensation with A/8Brace-Kohler compensator. 200 : L­

a: Stained at pH = 2.2. Collagenous fibers of the perichondrium (I) show positive birefringence (dark). The codirectionally oriented interterritorial substance (2) shows negative birefringence (bright) on directional toluidine-blue attachment. b: Stained at pH = 5.4. The collagenous fibers of the perichondrium (I) aJ:d the codirectionally orientedi nterterritorial substance (2) show negative birefringence (bright).

Tab.6. Quotienten der Toluidinblaureaktion von Qbei Qbei Aussage kollagenen Fasern aus der menschlichen Sclera. A=600nm A=500nm Fixation ro%iges neutralisiertes Formaldehyd, Pa-

Q6 29,86 13,10 Alkylierung kann raffineinbettung, Schnittdicke 5 iJ-m.

34,21 18,77 angewel1det werden. 28,17 16,57 Qbei Qbei Aussage 35,50 14,85 A=600nm A=500nm 26,45 15,20

Q7 7,90 2,77 Hyaluronsaurc bzw. QI 3,01 1,62 Saure Gruppen sind 8,20 5,61 Chondroitinsul£at A 2,78 2,08 vorhanden, da 6,67 1,21 oder Coder 4,83 1,43 Q4 < 0,20. Es kann 4.31 4.83 Kombinationen 2,40 1,97 aber zunachst nicht 3,72 7.36 dieser Substanzen

2,10 3,00 zwischen schwefel-sind neben anderen haltigen, phosphor-Substanzen, die saure haltigen bzw. Gruppen tragen. Carboxylgruppen vorhanden. 1) unterschieden

Qs 30•21 13.57 H yaluronidase- werden.

34.74 17.81 inkubation ist 26,13 16,26 zulassig.

Q2 0.83 Es konnen andere 30,20 17,89 1,74

25.10 11,13 2,04 1.01 saure Gruppen. aber 1.67 0.72 auch Carboxyl-

I) Nach biochemischcn Untersuchungen von STUHL- 1.53 1,44 gruppen. die bereits

SALZ et al. (1974) handelt es sich bei den anderen 2,43 1,36 bei pH=4.0 dissoziie-

Substanzen. die saure Gruppen tragen, hauptsachlich ren, vorliegen.

urn Keratansul£at.

Metachromasie, Doppelbrechul1g, Dichroismus . 5 I

Qbei Qbei Aussage Qbei Qbei Aussage 1.=600 11m 1.= 500 11m 1.=600 nm 1.= 500 nm

Q3 0,02 0,06 Es liegen gcrichtet Qz 44,35 21,18 Carboxylgruppcn 0,06 0,08 angeordnete Carbo- 50,25 25,35 ,ind mit ihrer Vor-0,09 0,11 xylgruppen oder 35,72 18,77 zugsrichtung zu 0,16 0,01 phosphorhaltige 40,83 24,87 sauren Gruppen, die 0,08 0,08 saure Gruppen bzw. 46,08 23,17 bei pH=4,0 dissoziie-

beide gemeinsam vor. ren, senkrecht

Q4 0,03 0,02 Es ist keine Ein- al1gcordnet.

0,19 0,08 lagerung von Q3 71,72 Schwefelhaltige

0,17 0,09 Toluidinblau erfolgt, 34.93

0,1 I 0,07 weil aile sauren 80,94 32,39 saure Gruppcn sind

0,08 0,03 Gruppen blockiert 66,14 38,54 mit ihrer Vorzugs-

sind. 77,03 34,83 richtung zu anderen 65,22 32,05 sauren Gruppen

Qs 0,19 0,19 Es liegen keine senkrecht angeordnet. 0,18 0,02 schwefelhaltigen Es liegen relativ viele 0,06 0,07 sauren Gruppen vor. schwefelhaltigc 0,14 0,03 saure Gruppen 0,18 0,15 gegeniiber anderen

Q6 Alkylierung kann saurcn Gruppen vor.

1,73 1,84 2,64 1,43 angewendet werden. Q4 0,17 0,18 Es ist keine Ein-4,53 1,36 0,08 0,03 lagerung von 3,47 1,94 0,06 0,02 Toluidinblau erfolgt, 3,67 1,65 0,14 0,05 weil aile sauren

Q7 3,49 1,77 Hyaluronsaure, 0,15 0,09 Gruppen blockiert

2,68 2,01 Chondroitinsulfat sind.

3,22 1,33 A und C liegen nicht Schwefelhaltige 2,87 1,67 vor. Qs 1,28 1,53

3,02 1,65 1,43 0,96 liegcn neben anderen 1,68 1,29 sauren Gruppen vor.

Q8 3,21 1,88 Hyaluronida;e- 1,43 1,44 3,18 1,64 inkubation ist 2,01 1,12

3,00 1,46 zuJassig. 2,77 1,53 Q6 12,63 II,87 Alkylierung kann 3,68 1,75 17,84 9,39 angewendet werden.

10,56 13,77

Tab. 7. Quotienten der Toluidinblaureaktion von 12,94 12,81

der Knorpelkapsel. Material: menschlicher Tra-13,09 10,21

chealknorpel. Fixation 1O%iges neutralisiertes For-Q7 6,82 5,34 Hyaluronsaure bzw.

maldehyd, Paraffineinbettung, Schnittdicke 5 [Lm. 10,17 4,83 Chondroitinsulfat

Qbei Qbei Aussage 8,72 7,95 AoderC oder

A=600nm 1.=500 nm 5,34 6,66 Kombinationen 6,97 5,25 dieser Substanzen

Q\ 12,43 II,77 Saure Gruppen sind sind neben anderen 16,67 10,63 vorhanden, da Substanzen, die saure 10,72 9,84 Q4 < 0,2. Es kann Gruppen tragen, 19,83 13,77 aber zunachst nicht vorhanden. 13,07 12,03 zwischen schwefel-

haltigen, phosphor- Q8 12,93 13,01 Hyaluronidase-haltigen bzw. 10,94 10,33 inkubation ist Carboxylgruppen 13,07 II,75 zulassig unterschieden 14,21 10,23 werden. 12,19 12,83

52 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

Tab. 8. Quotienten der Toluidinblaureaktion von kollagenen Fasern des Perichondriums. Material: menschlicher Trachealknorpel. Fixation ro%iges neutralisiertes Formaldehyd, Paraffineinbettung, Schnittdicke 5 !Lm.

Q bei Q bei Aussage A=600nm A=500nm

Ql 19.73 25,33 18,25 22,22 20,28

Q2 14,08 17,33 II,44 15,28 14,77

Q3 0,I4 0,I6 0,11

0,12

0,09

Q4 0,I9 0,I3 0,I4 0,02 0,I6

Qs 0,I6 0,I9 0,I6 0,12

O,IO

Q6 20,I2 23,84 19,36 20,74 23,I3

Q7 17,98 22.44 19,76 20,36 2I,54

13,21 17,87 IO,72 15,36 12,I4

8,70

IO,22 6,44 9,83 7,I7

0,I9 0,I6 0,04 0,I5 0,11

0,I7 0,I8 O,II O,II 0,06

0,I2 0,02 0,03 0,09 0,I5

14,23 12,72 15,64 II,3 6 13,87

IJ,72

16,84 IO,22 13,45 14,I8

Saure Gruppen sind vorhanden, da Q4 < 0,20. Es kann aber zunachst nicht zwischen schwefel­haltigen, phosphor­haltigen bzw. Carboxylgruppen unterschieden werden.

Es konnen andere saure Gruppen, aber auch Carboxyl­gruppen, die bereits bei pH=4,0 dissoziie­ren, vorliegen.

Es liegen gerichtet angeordnete Carbo­xylgruppen oder phosphorhaltige saure Gruppen bzw. beide gemeinsam VOL

Es ist keine Ein­lagerung von Toluidinblau erfolgt, weil aile sauren Gruppen blockiert sind.

Es liegen keine schwefelhaltigen sauren Gruppen VOL

Alkylierung kann angewendet werden.

Hyaluronsaure, Chondroitinsulfat A und C liegen nicht VOL

Qbei Qbei A=600nm A=500nm

18,60 15,ro 20,56 II,84 20,88 17,63 2I,93 13,06 19,40 14,87

Aussage

Hyaluronidasc­inkubation ist zulassig.

Die polarisationsoptische Auswertung der Toluidinblaureaktion entsprechend den angege­benen Tabellen hat gegenliber der sonst liblichen lichtmikroskopischen Beurteilung dieses histo­chemischen Verfahrens verschiedene V orteile. Die E111pfindlichkeit flir den Nachweis saurer Gruppen ist beim Einsatz der polarisationsop­tischen Technik hoher. So zeigen z. B. kollagene Fasern der Cornea nach Toluidinblaubehandlung bis pH 2,2 keine erkennbare Anfarbung. Der ermittelte Quotient (Q3, Tab. 5) weist aber dar­auf hin, daB eine gerichtete Anlagerung von Toluidinblau erfolgt sein muB.

1m Unterschied zu anderen histochemischen Verfahren erlaubt diese Methode auch Rlick­schllisse auf die Orientierung unterschiedlicher saurer Gruppen zueinander. An dem Beispiel der Knorpelkapsel (Q3, Tab. 7) ist eine solche Diffe­renzierungsmoglichkeit aufgezeigt. Ein weiterer V orteil liegt darin, daB beim Vergleich von Quotienten, die unter den angegebenen standar­disierten Bedingungen gewonnen wurden, rela­tiv quantitative Aussagen liber das V orkommen saurer Gruppen gemacht werden konnen.

So geht aus den jeweiligen Quotienten (Ql) in Tab.6 und Tab.S hervor, daB kollagene Fasern des Perichondriums mehr freie, gerichtet angeordnete saure Gruppen besitzen als kollagene Fasern aus der Sclera. Beide Strukturen zeigen nach Anfarbung mit Toluidinblau bei pH= 5,4 starke Metachromasie, die in ihrer Intensitat lichtmikroskopisch nicht unterscheidbar ist. Flir die Anwendung der Tabellen 2 b, 3 b und 4 b soll noch darauf hingewiesen werden, daB in den Schemata zwar die wesentlichsten Faktoren be­rlicksichtigt wurden, die zur polarisationsop­tischenAuswertung erforderlich sind. Es gibt jedoch auch noch andere Spezialfalle der Quoti-

entenbeziehungen, die der jeweilige Unter­sucher auf dcr Grundlage der vorgegebenen Darstellung entwickeln kann.

6.3. Analyse des Dichroismus

Wie bei der Analyse der Doppelbrechungser­scheimmgen metachromatisch gefarbter histolo­gischcr Objekte lassen sich aus dem Absorptions­vcrhaltet1 im polarisierten Licht zusatzliche Infor­mationen uber die submikroskopische Struktur der chromotropen Substanz und die Art der Farbstoffanlagerung gewinnen.

6.3.1. Physikalische Grundlagen des Dichroismus biologischer Objekte

Die Abhangigkeit der Absorption von der Lichteinfallsrichtung wird bei doppelbrechenden histologischen Objekten durch den Dichroismus (Doppelabsorption) wiedergegeben. Darunter versteht man die verschiedene Absorption des Lichtes fur die beiden polarisierten Teilwellen (s. S. 22). Zu jeder Lichteinfallsrichtung gchort eine Absorptionsellipse, aus der sich die ent­sprechenden Absorptionsstarken ablesen lassen. Die Differenz der zugehorigen Absorptionsko­cffizienten (kA - ko) bezeichnet man als Dichro­ismus. Er ist positiv fur gestreckte Indexellip­soide (kA > ko) und negativ fur abgeflachte Indexellipsoide (kA <ko), wobei l(kA - ko)l die absolute Starke des Dichroismus kennzeich­net. Die Form der Absorptionsindikatrix ist wellenlangenabhangig, da die Absorptionsstarke fur verschiedene Farben unterschiedliche Werte annimmt (Dispersion der Absorptionsstarke). Wenn die Dispersion von ko anders verlauft als von kA, so ist die Starke des Dichroismus eben­falls wellenlangenabhangig (Dispersion des Di­chroislttus). Bei biologischen Objekten liegt sogenannter natarlicher Dichroislttus vor, wenn die Struktur selbst Dichroismus zeigt. Kiinstli­cher Dichroislllus entsteht in primar nicht dich­roitischen Objekten durch die Einlagerung von geeigneten Substanzen (SCHEUNER und HUT­SCHENREITER 1972.)

Mctachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 53

Prinzipiell muB zwischen Eigen- und For11l­dichroismus unterschieden werden, auch wenn es sich in der Praxis als schwierig erwiesen hat, diese beiden Formen voneinander zu trennen. Das auBert sich in der Literatur darin, daB im allgemeinen nur von «Dichroism us» gesprochen wird (BREWER 1957; ROMHANY1 1963; M1SS­MAHL 1964; VIDAL 1972).

Theoretisch betrachtet, tritt Eigendichroislllus auf, wenn im submikroskopischen Bereich eine bevorzugte Orientierungsrichtung dichroitischer Substanz vorliegt. Zwei Moglichkeiten spielen dabei eine Rolle: einmal der Eigendichroismus dichroitischer Farbstoffe, der nach mechanischer Behandlung (Polieren von Farbstoffausstrichen in einer Richtung) sichtbar wird, und zum anderen der Eigendichroismus, welcher durch gerichtete Einlagerung von dichroitischen Farb­stoffmolekulen in histologischen Strukturen ent­steht.

Formdichroismus kann auch durch nicht not­wendigerweise gerichtete Einlagerung von Sub­stanzen hervorgerufen werden, die selbst keinen Eigendichroismus zeigen, z. B. Metallimpragna­tionen biologischer Objekte (FREY 1925; SCHMIDT 1932, 1938). Bei der Behandlung his to­logischer Strukturen mit dichroitischen Farb­stoff en ist in Analogie zur Metallimpragnation in Abhangigkeit von den Bindungsverhaltnissen das Auftreten von Formdichroismus zu ver­muten.

Fur die Untersuchung und praktische Be­stimmung des Vorzeichens des Dichroismus ist es gunstig, bestimmte Grundregeln zu beachten. Positiver Dichroismus liegt fur eine bestimmte Wellenlange vor, wenn das parallel zu der ge­wahlten Bezugsrichtung (s. S.25) schwingende Licht starker absorbiert wird als das senkrecht dazu schwingende, wahrend bei negativem Dichroismus fur das senkrecht zu der Bezugs­richtung schwingende Licht starkere Absorption festzustellen ist.

Einen Hinweis auf das Vorliegen .von Form­dichroismus gibt die Abhangigkeit des beobach­teten Dichroismus von der Brechzahl des Imbibi­tionsmediums. Beim V orhandensein von reinem Formdichroismus sol1 es daher einen Punkt geben (FREY-WYSSLING 1964), in dem die Brech-

54 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

zahl der DurchtrankungsflUssigkeit so gewahlt werden kann, daB der Dichroismus verschwin­det. Am einfachsten kann man den Form­dichroismus danach erkennen, wenn fUr eine konstante Wellenlange bei zwei unterschied­lichen Brechzahlen beobachtet wird, ob sich die Starke des Dichroismus verandert. Auch bei zusatzlichem Eigendichroismus soll so der Form­dichroismus nachweisbar sein. Hinweise auf das V orliegen von Eigendichroismus ergeben sich, wenn die Einlagerung des dichroitischen Farb­stoffes vom pH-Wert der verwendeten Farb­losung abhangig ist, weil hierbei die Bindungs­verhaltnisse beeinfluBt werden.

Aus dem Auftreten von Formdichroismus lassen sich Aussagen zur submikroskopischen Anordtlung der Fade1111lo1ekel und damit auch der GefUgelUcken machen. Dabei schlieBt man Uber das V orzeichen des Dichroismus einer bekannten Struktur (Testobjekt) auf die unbekannte Struk­tur des Untersuchungsobjektes durch Vergleich zwischen den beiden Dichroismuserscheinungen. Bei konstanter WellenHinge, die dem Maximum des Dichroismus entspricht, und gleicher Brech­zahl des Imbibitionsmediums vergleicht man das V orzeichen des Dichroismus. Ergibt sich fUr Testobjekt und Untersuchungsobjekt unter den angegebenen Versuchsbedingungen das gleiche V orzeichen des Dichroismus, dann sind die Fadenmolekel bzw. GefUgelUcken zur jeweils gewahlten Bezugsrichtung auch gleichartig ori­entiert.

Beim V orliegen von Eigendichroismus kann man nicht ohne wei teres aus dem V orzeichen des Dichroismus von einem Vergleichsobjekt auf die submikroskopische Struktur des Unter­suchungsobjektes schlieBen, da sich die Farb­stoffmolekel unterschiedlich (z. B. parallel oder senkrecht zu den Fadenmolekeln) anlagern konnen. Bei fast allen dichroitischen Farbstoffen liegt - wie beim Toluidinblau - die Richtung der starkeren Absorption parallel zur Langsachse der Farbstoffmolekel. Dadurch gelingt es, die Lage dieser Farbstoffmolekel innerhalb des Objektes festzustellen.

Oft erfolgt die Untersuchung im weiBen Licht. Das V orzeichen des Dichroismus ist dabei nicht ohne wei teres anzugeben, da es fUr ver-

schiedene Wellenlangen unterschiedlich sem kann. Je nach Starke der Absorption in den einzelnen Spektralbereichen ergeben sich fur die zwei Schwingungsrichtungen andere Farbein­drUcke. Man charakterisiert den Dichroismus zur Bezugsrichtung hier durch den jeweiligen Farbeindruck, den das Objekt bei paralleler und senkrechter Orientierung zur Schwingungsrich­tung des polarisierten Lichtes hervorruft.

6.3.2. Dispersion des Dichroismus von Gewebsstrukturen nach Toluidinblauanlagerung

Entsprechend der Anderung des Gangunter­schiedes der Doppelbrechung histologischer Strukturen nach Anfarbung mit Toluidinblau kommt es zum Auftreten von kUnstlichem Dichroismus. Eine Abhangigkeit dieser opti­schen Erscheinung von den Faktoren, die auf S. 16 angegeben sind, laBt sich auch hier fest­stellen. N ach Einwirkutlg V011 Atha1101 allerdings ist im sichtbaren Spektralbereich kein Dichrois­mus mehr nachweisbar.

Bei der Untersuchung im linear polarisierten weiBen Licht erscheinen Strukturen, in die sich Toluidinblauassoziate senkrecht zur Langsrich­tung der Makromolekule eingelagert haben auf Grund des Dichroismus bei Durchstrahlung mit parallel zur Langsrichtung der Makro~olekUle schwingendem Licht blaulich, bei senkrecht dazu schwingendem Licht rotlich (vgl. Abb. 17). Die Absorptionskurven (Abb. 34) weisen auf die Ab­hangigkeit der Extinktion von der Schwingungs­richtung des Lichtes hin. Aus der Differenz von Ell und El ergibt sich die relative Starke des Dichroisl11us Ll E, d. h. Ll E = Ell - E l' In diesem Fall hat der Dichroismus ein negatives V or­zeichen, da Ell < E l' Tragt man die erhaltenen Werte von LlE in Abhangigkeit von den ver­wendeten Wellenlangen auf, so erhalt man die Kurve der Dispersion des Dichroismus. Dber die Formel

E·" k=--47t· d . log e

(12)

errechnen sich die zu den Extinktionen gehori­gen Absorptionskoeffizienten (k

ll und k

1). In

Metachromasie, Doppclbrechung, Dichroismus . 55

E

1,5

1,0

0,5

l{.50 500 550 600 ..:l[nmJ - .... " ,----

" "" -0,5

'\ / \ / \ I \ I \ /

\ /

\ "" ,--",,"" -1,0

Abb.34. Absorptionskurven einer kollagenen Faser aus der Cornea eines menschlichen Auges nach Eirbung mit Toluidinblau bei pH=6,2. Imbibitionsmedium: Gummi arabicum. Ell: Schwingungsrichtung des polarisierten Lichtes parallel zur Faserlangsrichtung; E 1 : Schwingungsrichtung des polarisierten Lichtes senkrecht zur Faserlangsrichtung; EII-El : Kurve der Dispersion des Dichroismus.

Figure 34. Absorption curvens of a collagenous fiber from the cornea of a human eye after staining with toluidine blue at pH = 6.2. Imbibition medium: Gum arabic. Ell : Direction of vibration of polarized light parallel to the longitudinal direction of the fiber; El : Direction of vibration of polarized light normal to the longitudinal direction of the fiber; EII-E 1 : Curve of dispersion of dichroism.

dieser Beziehung ist nur die Objektdicke (d) zu­nachst unbekannt. Sie kann interferenzmikro­skopisch bestimmt werden. Dber die Absorp­tionskoeffizienten ist es moglich, die absolute Starke des Dichroisl11us (~k) zu ermitteln:

6.3.2.1. EinfiufJ der Brechzahl des Durchtrankungs­mediums und des pH-Wertes der Farbstofflosung

In dem von uns untcrsuchten Brechzahlbe­reich (n2= I,336 bis n 2 = I,462) nimmt mit steigender Brechzahl des Imbibitionsmediums

56 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

die Starke des Dichroismus metachromatischer Strukturen zu (Abb. 35). Dieser Sachverhalt gilt natUrlich nur fUr die Wellenlange, bei denen nach Toluidinblauanlagerung auch Dichroismus zu bcobachten ist. Er sollte deshalb immer in EinschluBmedien betrachtet werden, die eine moglichst hohe Brechzahl haben.

Mit sinkendem pH-Wert der Toluidinblau­losung lagern sich weniger gerichtete Farbstoff­assoziate an die chromo trope Struktur an. Der Dichroismus ist deshalb bei niedrigeren pH­Werten im allgemeinen schwacher (Abb.35), sofern nicht ausschlieBlich Sulfatgruppen fur die Farbstoffanlagerung verantwortlich zu machen sind. Bemerkenswert ist allerdings, daB der Dichroismus bei pH = 3,4 zwar schwach aber deutlich nachweisbar ist, wahrend die Doppel­brechung am gleichen Praparat bei pH=3,4 (vgl. Abb.26) keinen Umschlag des Vorzeichens crkennen laBt.

Da sich sowohl eine Abhangigkeit des Tolui­dinblau-Dichroismus von der Brechzahl des Imbibitionsmediums als auch yom pH-Wert der Farbstofflosung nachweisen laBt, muB ange­nommen werden, daB hier Form- und Eigen­dichroismus vorliegen.

Auf die praktische Bedeutung des Dichrois­mus nach Toluidinblauanlagerung fur die Unter­suchung der submikroskopischen Struktur von Gewebsbestandteilen, die im Zusammenhang mit der Dispersion der Doppelbrechung zu be­trachten ist, wurde bereits hingewiesen. FUr Analysen der Verlaufsrichtung von Faserpro­teinen innerhalb des Gewebes kann der Einsatz einer dichroitischen Farbung mit Toluidinblau eine wertvolle Bereicherung darstellen. Bei Be­obachtungen in linear polarisiertem Licht er­scheinen die Fasern je nach Schwingungsazimut bei Betrachtung im weiBen Licht in einer anderen Farbe (blau oder rot). AuBerdem kann der Toluidinblaudichroismus zur Unterschei­dung von verschiedenen Strukturen herange­zogen werden. Ein Beispiel dafur ist die Ab­grenzung von Kollagen gegenUber Retikulin (BREWER 1957). Wahrend kollagene Fasern Dichroismus zeigen, tritt diese Erscheinung bei retikularen Fasern nach Toluidinblaufarbung nicht auf.

6.3.2.2. Eil1flu}3 der Teillperatur

Ein Einfl.uB der Temperatur auf die Dispersion des Dichroismus laBt sich nach Toluidinblau­farbung nachweisen. Wahrend sich an kollage­nen Fasern der menschlichen Cornea (pH = 5,8; n 2

20 = 1,4593) bei 4°C der typische Kurvenver­lauf ergibt, der fUr einen intensiven negativen Dichroismus charakteristisch ist, nimmt die Starke des Dichroismus bei Tempcraturerho­hung Uber 30° C deutlich abo Bei 75° C liegt kein Dichroismus mehr vor. Der Vergleich mit Abb. 30 zeigt, daB bei 60° C keine Umkchr des Vor­zeichens der Doppelbrechung stattfindet, wah­rend ein schwacher Dichroismus hier noch zu beobachten ist. Die Deutung dieses Verhaltens insgesamt entspricht den Angaben im Abschnitt 6.2.2.1.2.

6.4. Zusammenhang zwischen den optischen Erscheinungen der Toluidinblaureaktion

Geht man fur die Erklarung der Metachroma­sie von der V orstellung aus, daB letztlich die Assoziation der ToluidinblaumolekUle fUr diese Erscheinung verantwortlich ist (s. S. II), so lassen sich daraus fUr das Auftreten der anderen optischen Phanomene, die hier zu beQbachten sind, Hinweise finden. Ein eil1zell1es Assoziat zeigt zwar im Prinzip Metachromasie; es sind aber viele Assoziate notig, damit der praktische Nachweis der Metachromasie gelingt. Dabei ist es vollig gleichgultig, ob diese Assoziate regellos oder in einer bevorzugten Richtung angeordnet sind. Kommt es zur Assoziierung der Assoziate an Makromolekule, dann ist es fUr das Auf­treten von Metachromasie ebenfalls belanglos, ob diese Makromolekule zueinander orientiert sind oder nicht. Daraus kann im Unterschied zur Ansicht von ROMHANY1 (1963) der SchluB gezogen werden, daB gemeinsam mit Meta­chromasie weder Doppelbrechung noch Dichro­ismus auftreten mUssen. In biologischen Objek­ten liegen allerdings meist gerichtete Makro­molekUle vor, die als Strukturgrundlage fur die Toluidinblauanlagerung anzusehen sind. Da­durch kommt es in diesen Fallen zu Metachro-

LlE

450 500 550 600 /i[nmJ

---pH=6,0 n2 = 1,336 ------ pH = 5,4

-'-'-'- pH= 4,4 ................ pH=3,4

LlE

450 500 550 600 ;UnmJ

JE

450 500 550 600 /i[nmJ

------ .--:.:-:-............ ;;>,. --------- ............ -. ,."..--".,,-

'....... " .............. -----_ ...... ".".

n2 = 1,462

Abb.35. Schematisierte Darstellung der Dispersionskurven des Dichroismns einer kollagenen Faser aus der Sclera eines menschlichen Auges nach Farbung mit Toluidinblau in Abhangigkeit von der Brechzahl des Imbibitionsmediums (n2) und vom pH-Wert der Farbstofflosung. Die Beurteilung des Dichroismus erfolgte im Abstand von 25 nm. Dadurch kann der Anschein erweckt werden, daB bei niedrigen Brechzahlen bzw. bei niedrigem pH-Wert das Maximum des Dichroismus bei ). = 550 nm liegt. Die nachste Wellenlange, bei der der Dichroismus nach Erhohung der Brechzahl bzw. des pH-Wertes zu beobachten ist, liegt bei ). =

525 nm. Daraus kann der SchluB gezogen werden, daB das Maximum des Dichroismus zwischen). = 525 nm und). = 550 nm liegt. Figure 35. Schematic representation of the dispersion curves of the dichroism of a collagenous fiber from the sclera of a human eye after toluidine-blue staining as a function of the refractive index of the imbibition medium (n2) and the pH value solution of stain. The evaluation of dichroism was at a distance of 25 nm. Therefore, it appears that maximum dichroism is of the order of). = 550 nm for low refractive indices or pH values, respectively. The nearest wavelength, where dichroism may be observed after an increase in the index of refraction or pH value, respectively, is ). = 525 nm. From this it is possible to conclude that the maximum of dichroism lies between). = 525 nm and). = 550 nm.

58 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

masie gemeinsam mit Doppelbrechung und Dichroismus.

Die Zusammenhange zwischen Absorption, Dispersion der Doppelbrechung und Dispersion des Dichroismus wurden von ZaCHER und JACOBY (1927) an selektiv absorbierenden Farb­stoffen untersucht. Die dabei gewonnenen V or­stellungen lassen sich jedoch nicht allgemein­gultig auf angefarbte biologische Strukturen iibertragen, da die Rolle der Brechzahl des Imbi­bitionsmediums unberiicksichtigt bleibt. Nach metachromatischer Toluidinblaufarbung kolla­gener Fasern bei pH = 6,0 (Abb.29) kommt es beispielsweise nach Imbibition mit einem Medi­um, dessen Brechzahl n 2 < 1,4040, im sichtbaren Spektralbereich nicht zur Umkehr des Vor­zeichens der Doppelbrechung, obwohl der Dichroismus deutlich nachweis bar ist. Die Er­hohung der Brechzahl des Durchtrankungsme­diums auf n 2 = 1,4622 fiihrt zum Vorzeichen­wechsel der Doppelbrechung (Abb.36). Fur lang ere Wellen als die dem Maximum des Dichroismus entsprechenden ist dem starker absorbierten Strahl die groBere, £lir kurzere Wellen ist die kleinere Brechzahl zuzuordnen. D. h., bei gr6Beren Wellenlangen als die dem Maximum des Dichroismus entsprechenden hat die Doppelbrechung dasselbe, bei kurzeren Wellenlangen das entgegengesetzte V orzeichen wie der Dichroismus. Die Absorptionskurven Ell und E.l zeigen das fUr die Toluidinblaumeta­chromasie charakteristische Maximum bei A =

540 nm ([1. - Bande). Daraus laBt sich in diesem Spektralbereich fur nil und n.l anomale Disper­sion ableiten.

Der Zusammenhang zwischen Dichroismus und Doppelbrechung ergibt sich aus folgenden Oberlegungen: Absorption von Licht durch ein Objekt wird als Resonanzerscheinung des Lichtes mit der Materie des Untersuchungsobjektes auf­gefaBt. Resonanz tritt dann auf, wenn die Licht­wellen und die schwingenden Dipole des Medi­ums die gleiche Frequenz haben. Lichtfrequen­zen in der Nahe einer solchen Absorptionsstelle werden wesentlich schwacher absorbiert. Auf der langwelligen Seite dieser Absorptionsbande kommt es zur Verringerung der Lichtgeschwin­digkeit (Erh6hung der Brechzahl), wahrend auf

der kurzwelligen Seite eine Erhohung der Licht­geschwindigkeit eintritt (Erniedrigung der Brechzahl). Das ist die Erklarung £lir das V or­kommen von anomaler Dispersion der Brech­zahlen in dem stark absorbierenden Bereich. Solche Absorptionsstellen konnen entweder fiir den ordentlichen oder fur den auBerordentlichen Strahl oder fur beide auftreten. Daraus ergibt sich fur die zugehorigen Brechzahlen (nil' n.l) ein anomaler Dispersionsverlauf. Das erklart die damit verbundenen charakteristischen Doppel­brechungsanderungen.

MISSMAHL (1964) versucht den Zusammen­hang zwischen Dichroismus und Metachromasie auf der Grundlage von Gesetzen der geometri­schen Optik mit Hilfe einfacher mathematischer Beziehungen zu klaren. Er kommt dabei sowohl fur Farbstoffausstriche als auch fiir die Reaktion von Toluidinblau mit chromotropen Strukturen zu dem Ergebnis, «daB von den Wellenlangen, fUr welche Dichroismus besteht, mehr Licht durchgelassen wird». Diese Aussage bBt sich nicht mit den Beobachtungen in Obereinstim­mung bring en, wonach gerade die Wellen­langen, bei denen maximaler Dichroismus be­steht, eben auch stark absorbiert werden.

1m Gebiet des Absorptionsmaximums der metachromatischen Struktur ist keine Doppel­brechung nachweisbar, da auf Grund des dort vorliegenden maximalen Dichroismus linear polarisiertes Licht aus dem Untersuchungsob­jekt austritt (s. S. 27).

Aus unseren Beobachtungen geht hervor, daB es durch Ausrichtung der Toluidinblauassoziate zueinander zu keiner Veranderung der Meta­chromasie kommt, daB jedoch Doppelbrechung und Dichroismus auftreten, die vorher nicht nachweisbar waren. MISSMAHL (I964) spricht bei «besserer Ausrichtung der Feinstruktur sowie der in diese eingelagerte Farbstoffteilchen» von einer nicht naher definierten «Zunahme» der Meta­chromasie. Geht man davon aus, daB MISSMAHL (I964) unter Toluidinblauteilchen Toluidinblau­assoziate versteht, so kann seine Behauptung nicht allgemein gUltig sein. Konzentrierte Tolui­dinblaulosungen zeigen y - Metachromasie, ob­wohl die fUr diese Erscheinung verantwortlichen Assoziate offensichtlich zueinander ungeordnet

n

(n,,-n1 )

(E,,-E1 )

t

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 59

//~\ / \

/: ."-" ", .' . '\ ' . . / / '. '-.

_ •• " .,/ '-.. ....... E1 .. --........ .......... .. -- E"

Abb.36. Schematische Darstellung des Zusammenhangs zwischen Dispersion der Brechzahlen (nil und n.0, Dispersion der Doppelbrechung (nil - nl) und Dispersion des Dichroismus (Ell - El ) an kollagenen Fasern nach Farbung mit Toluidinblau bei pH = 6,0. Imbibitionsmedium: Gummi arabicum (n2 = I,4622).

Figure 36. Schematic representation of the relationship between the dispersion of refraction indices (nil - nl), dispersion of birefringence (nil - nl), and dispersion of dichroism (EII- E.0 of collagenous fibers after staining with toluidine blue at pH = 6.0. Imbibition medium: Gum arabic (n2 = 1.4622).

vorliegen und daher keine Doppelbreehung zu beobaehten ist (vgl. aueh Abb. 45,46).

Da es oft kompliziert ist, aus dem zu beobaeh­tenden optisehen Verhalten Riieksehliisse auf die Struktur zu ziehen, wollen wir im folgenden die dafiir mogliehen Strukturgrundlagen in sehema­tiseher Form angeben. Es ist besonders darauf hinzuweisen, daB aueh bei untersehiedlichem submikroskopisehen Bau gleiehartige optisehe Erseheinungen . auftreten konnen. Deshalb solI die Zusammenstellung gleiehzeitig dazu dienen, auf Grund histoehemiseher und histophysika­liseher Charakteristika Anregungen zur Unter­seheidung von Objekten zu geben, welehe

Toluidinblaumetaehromasie - eventuell ver­bunden mit Doppelbreehung und Diehroismus - zeigen. Dadureh kann die gegenseitige Ab­grenzung im histologisehen Sehnitt gelingen.

In densehematisehenAbbil:lungen (s. Abb 37)

entspreehen die dieken (r) und diinnen (2) Linien anisodiametrisehen Makromolekiilen, an denen sieh funktionelle Gruppen befinden. Es handelt sieh einmal urn anionisehe Gruppen (3) und zum anderen urn Gruppen, die zur Briieken­bindung fiihigen Wasserstoff enthalten, z. B. OH-Gruppen (4). An diese Gruppen kann sieh das Toluidinblau als Assoziat (5) oder in mono­merer Form (6) anlagern. Gestriehelte Linien (7)

60 . G. SCHEUNER . J. HUTSCHENREITER

I I T I 1 2 3 4 5 6 7

Abb. 37. Verwendete Symbole fiir die Abbildungen 38-48 (ErkJarung, siehe Text S. 59).

Figure 37. For explanation see text (p. 59).

stellen kovalente Bindungen dar. Die angege­bene Orientierung der Makromoleklile und Toluidinblaumoleklile muB als V orzugsrichtung betrachtet werden. Die Langsachsen derartiger Strukturen liegen immer in einem Bereich der kleiner als ± 45° zur angenommenen Bezugs­richtung ist. Den nachfolgenden Modellen wird eine Toluidinblaureaktion bei pH = 6,0 zugrunde gelegt. Be£und 1: Metachromasic, Doppclbrechung,

Dichroismus. Ursache (Abb. 38): Gleichsinnig orientierte Ma­

kromolehile mit gerichtet eingebauten anio­nischen Gruppen. Die Farbstoffassoziate liegen vorzugsweise parallel zu den Makromole­klilen.

Beispiel: Stenokollagen.

Abb.3 8

Be£und 2: Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus.

Ursache (Abb. 39): Gleichsinnig orienticrte Ma­kromoleklile mit gerichtet eingebauten sauren Gruppen. Die Farbstoffassoziate liegen vor­zugsweise senkrecht zu den Makromoleklilen.

Beispiel: Porokollagen, Glykosaminoglykane, Nukleinsauren im Ausstrich, Strukturlipide im Bi.irstensaum der Epithelzellen der Haupt­stlicke der Niere.

Abb.39

Be£und 3: Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus.

Ursache (Abb.40): Makromoleklile mit bevor­zugter Orientierungsrichtung (parallel, zirku­lar, radiar usw.), die gerichtet eingebaute anio­nische Gruppen enthalten. Dazwischen andere

ebenfalls zueinander gleichartig orientierte Makromolekiile mit gerichtet eingebauten sauren Gruppen. Die Lingsachsen der beiden Makromolekiilarten miissen nicht unbedingt - wie in der Zeichnung angegeben - parallel zueinander stehen. Die Lingsachsen der Tolui­dinblauassoziate liegen orthogonal zueinander.

Beispiel: Knorpelkapsel im Trachealknorpel (die dicken Striche entsprechen Stenokollagenfi­brillen, wahrend die diinnen Striche Glykosa­minoglykane symbolisieren).

Abb.40

Befund 4: Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus.

Ursache (Abb. 41): Strukturgrundlage beziiglich der Makromolekiile wie bei Befund 3. Hier liegen die Langsachsen aller Toluidinblau­assoziate im Unterschied dazu parallel zu­einander.

Beispiel: Corneafasern (die dicken Striche ent­sprechen Porokollagenfibrillen, wahrend die diinnen Striche Glykosaminoglykane sym­bolisieren) .

Befund 5: Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus.

Ursache (Abb.42): Makromolekiile mit bevor­zugter Orientierungsrichtung und gcrichtet

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 61

Abb·41

eingebauten anionischen Gruppen. Dazwi­schen andere, nicht gleichsinnig orientierte Makromolekiile, die ebenfalls gerichtet einge­baute anionische Gruppen enthalten.

Beispiel: Faserproteine, in die Glykosaminogly­kane ungerichtet eingelagert sind.

Abb·42

62 • G. SCHEUNER • J. HUTSCHENREITER

Be£und 6: Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus.

Ursache (Abb. 43): Gleichsinnig orientierte Ma­kromolekiile mit gerichtet eingebauten sauren Gruppen. Daneben andersartige orientierte Makromolekiile, die gerichtete funktionelle Gruppen mit zur Briickenbindung befahigtem Wasserstoff enthalten (z. B. OH - Gruppen).

Beispiel: Zonulafasern.

Abb·43

Unterscheidungs111og1ichkeiten zwischen den an­gegebenen Strukturgrundlagen (Befund Ibis 6), welche die gleichen optischen phanomene zeigen:

Ausgehend von den Tabellen zur polarisa­tionsoptischen Unterscheidung verschiedener sauren Gruppen (s. S.43 £f.), ist es moglich, durch Variationen des pH-Wertes der Farbstofflosung, durch enzymatische V orbehandlung des histolo­gischen Praparates, durch PrUfung der Disper­sion der Doppelbrechung und des Dichroismus sowie durch spektrofotometrische Messungen eine weitere Charakterisierung der optischen Erscheinungen zu erreichen.

Geht man von den genannten Beispielen aus, so laBt sich Befund I gegen Befund 2 allein auf Grund der unterschiedlichen Dispersion der Doppelbrechung und des unterschiedlichen V or­zeichens des Dichroismus abgrenzen.

Zur Unterscheidung von Befund 3 gegeni.iber allen iibrigen bisher genannten Befunden konnen die Quotienten der Toluidinblaureaktion heran­gezogen werden. Bei keinem anderen Fall tritt nach Steigerung des pH-W ertes ein Absinken der Quotienten ein (vgl. Tab. 7).

Zur Differenzierung zwischen Befund 4 und Befund 5 gentigt es, die Toluidinblaureaktion bei niedrigeren pH-W erten durchzuftihren. Wahrend danach bei Befund 4 die angegebenen optischen phanomene erhalten bleiben, ver­schwindet bei Befund 5 der Dichroismus, und es kommt zu einer stark en Anderung der Disper­sion der Doppelbrechung (wellenlangenabhan­gige Umkehr des Vorzeichens der Doppel­brechung ist nicht mehr nachweisbar).

Fiir die Trennung der Bcfunde 2 und 5 genligt es ebenfalls, den pH-Wert der Farbstofflosung in geeigneter Form zu senken. Dabei verschwin­det gleichsinnig bei beiden Befunden die charak­teristische Dispersion der Doppelbrechung und des Dichroismus. Bei Befund 5 jedoch bleibt im Gegensatz zu Befund 2 die Metachromasie er­halten.

Befund 6 hebt sich von allen anderen Be­funden dadurch ab, daB bei niedrigem pH-Wert Orthochromasie auftritt.

Befund I zeichnet sich gegenliber den Be­funden 4 und 5 durch einen andersartigen Ver­lauf der Dispersion der Doppelbrechung und gegensatzliches V orzeichen des Dichroismus aus.

Die Unterscheidung von Befund 2 und Befund 4 kann im Zusammenhang mit einer pH-Wert-Senkung durch die Quotienten der Toluidinblau-Reaktion erfolgen.

Be£und 7: Metachromasie, Doppelbrechung, kein Dichroismus.

Ursache (Abb.44): Makromoleklile mit bevor­zugter Orientierungsrichtung. Dazwischen andere nicht gleichsinnig orientierte Makro­moleklile, die gerichtet eingebaut saure Gruppen enthalten. Es handdt sich hier urn einen Spezialfall von Befund 5 (Toluidinblau­farbung bei niedrigem pH-Wert), der wegen seiner prinzipiellen Bedeutung beziiglich des Zusammenhanges der optischen Phanomene gesondert angegeben wird.

Beispiel: Faserproteine, in die Glykosaminogly­kane eingclagert sind.

Abb·44

Befund 8: Mctachromasie, keine Doppelbre­chung, kein Dichroismus.

Ursache (Abb. 45): Makromolcklilc (Polyani­onen), die nicht gleichsinnig orientiert sind.

Beispiel: Heparinlosung.

Abb.45

Metachromasie, Doppelbrechung, Dichroismus . 63

Befund 9: Metachromasie, keille Doppelbre­chung, kein Dichroismus.

Ursache (Abb.46): Makromoleklile (Polyani­onen) , die untereinander nicht gleichsinnig orientiert und miteinander durch kovalente Bindungen verknlipft sind.

Beispiel: Sephadex-Kationenaustauscher.

~~"'1 \ J \ ..... J

Abb·46

Befund 10: Orthochromasie, Doppelbrechung, Dichroismus.

Ursache (Abb. 47): Gleichsinnige orientierte Makromoleklile mit gerichtet eingebauten funktionellen Gruppen, die zur Brlickenbin­dung befahigten Wasserstoff enthalten. Tolui­dinblauanlagerung in monomerer Form.

Beispiel: Fibrinfasern.

Befund 11: Orthochromasie, Doppelbrechung, kein Dichroismtls.

Ursache (Abb. 48): Gleichsinnig orientierte Ma­kromoleklile mit gerichtet eingebauten sauren Gruppen. Toluidinblauanlagerung in mono­mererForm.

Beispiel: Porokollagen der Sclera nach Einwir­kung von Athylalkohol.

64 . G. SCHEUNER • J. HUTSCHENRElTER

Abb.47

Abb·48

AbschlieBend sei darauf hingewiesen, daB die angegebenen Modelle die wesentlichsten Grund­formen fiir die genannten optischen Erschei­nungen darstellen. N atiirlich ist auch die Kombi­nation mehrerer Einzelkomponenten innerhalb einer lichtmikroskopisch sichtbaren Struktur denkbar.

7. Zusammenfassung

V orliegender Beitrag befaBt sich mit den optischen Erscheinungen, die durch die Toluidin­blaureaktiol1 an histologischen Strukturen verur­sacht werden kannen. Es handelt sich dabei urn Absorptions- und Refraktionseigenschaften. Die Durchfiihrung derT oluidinblaureaktion an his to­logischen Praparaten wird detailliert angegeben.

Die Analyse der Absorptiol1sbeful1de fiihrt in Verbindung mit physikochemischen Oberle­gungen zu einer neuen Erklarung der Ursache der Toluidinblaumetachromasie. Es wird dabei davon ausgegangen, daB fiir das Auftreten von Metachro11lasie letztlich die Bindungsverhalt­nisse von Protonen am wasserstofftragenden Stickstoff der Farbstoffmolekiile verantwortlich sind. Daflir ist es gleichgiiltig, wodurch eine Beeinflussung der Bindung des Protons an diesen quarternaren Stickstoff erfolgt. Sie kann sowohl bei Zusammenlagerung gleichartiger Toluidin­blaumolekiile zu Assoziaten als auch bei Ver­schiebung des pH-W ertes der Farbstofflasung ins Alkalische auftreten. Als Metachromasie bezeichnet man jedoch nur die Verschiebung des Absorptionsspektrums, die durch Assoziate hervorgerufen wird. Bei der so entstandenen Metachromasie (<<Konzentrationsmetachroma­sie») kommt es zu einer sogenannten wy-:.Bande» (Absorptionsmaximum A = 546 nm), die sich von der gebrauchlichen metachromatischen [J.­Bande (Absorptionsmaximum A = 540 nm) zwar nicht prinzipiell aber doch ursachlich unter­scheidet. Wahrend bei der Konzentrationsmeta­chromasie in waBriger Lasung durch die groBe Anzahl der vorhandenen Toluidinblaumolekiile pro Volumeneinheit eine Zusammenlagerung der Farbstoffmolekiile unterhalb eines Maximal­abstandes von 5 A vorliegt, tritt die [J.-Meta­chromasie im Zusammenhang mit chromo­tropen Strukturen auf. Durch diese Assoziation wird eine Einbeziehung des freien Elektronen­paares des wasserstofftragenden. Stickstoffatoms in das intermolekulare Resonanzsystem bewirkt. Dadurch wird die Bindung eines Protons an diesen Stickstoff geschwacht, was zur Rotfarbung fiihrt. Der Unterschied zur y-Metachromasie besteht darin, daB auch durch Behandlung mit

verdUnnten Losungen, in denen der Farbstoff in monomerer Form vorliegt, eine derartige Meta­chromasie durch das vorgegebene genUgend dichte Ladungsmuster der chromotropen Struk­tur entstehen kann. Dieses Muster induziert eine Assoziierung von Farbstoffmolehilen, welche sich dann ihrerseits an die anionischen Gruppen iiber Wasserstoffbrlicken assoziieren.

Die orthochromatische Toluidil1blaureaktion wurde als Nachweismoglichkeit fUr briicken­bindungsaktiven Wasserstoff in histologischen Strukturen erkannt. Die Ursache fUr die dabei auftretende Blaufarbung ist eine mono mere Anlagerung des Farbstoffes. Auf zusatzliche Faktoren, die zur Orthochromasie £lihren, wird emgegangen.

Neben charakteristischen Absorptionserschei­nungen lassen sich aus Veranderungen der optischen Anisotropic toluidinblaugefarbter Struk­turen weiterreichende Erkenntnisse sowohl tiber den submikroskopischen Bau histologischer ob­jekte als auch Uber die Art der Toluidinblauan­lagerung gewinnen. Deshalb werden ausgehend von Angaben zu den physikalischen Grundlagen der Doppelbrechung biologischer Objekte, Aus­sagen iiber das polarisationsoptische Verhalten metachromatischer Strukturen gemacht. Dabei fmdet die Frage des Einflusses der Brechzahl des Imbibitionsmediums auf die Dispersion der Doppelbrechung Beriicksichtigung. Es erfolgt eine Deutung der Dispersionskurven. Hierbei wird die Rolle des dort auftretenden sogenannten «Inflexionspunktes» neu interpretiert. Die Ande­rungen der Eigen- und Formdoppclbrechung histologischer Strukturen durch Toluidinblau­anlagerung werden diskutiert.

Mit der Moglichkeit standardisierter Gang­unterschiedsmessungen gelingt iiber die Tolui-

Metachromasie, Doppelbrcchung, Dichroismus . 65

dinblaureaktion die relativ quantitative Er!assung saurer Gruppen, die an chromotrope Strukturen gebunden sind. Durch diese neue Methodik konnen mit Hilfe zu ermittelnder Quotienten zusatzlich Aussagen zur Lage der Makromolekiile innerhalb lichtoptisch sichtbarer Strukturen ge­macht werden. Die Angabe entsprechender Tabellen erlaubt hierbei die Unterscheidung von schwefelhaltigen und phosphorhaltigen sauren Gruppen sowie Carboxylgruppen.

Auf die Aussagemoglichkeit der Beurteilung der Dispersion des Dichrois111US nach Toluidin­blaufarbung wird eingegangen. Dadurch er­geben sich Hinweise zur Verbesserung der Beobachtungsbedingungen dieser dichroitischen phanomene.

Der EinfluB des pH-Wertes der Farbstoff­losung, der Te111peratur und von Athylalkohol auf die beschriebenen optischen Erscheinungen wird aufgezeigt.

Die Oberlegungen iiber das Zusammenwirken der untersuchten optischen Eigenschaften tolui­dinblaugefarbter histologischer Objekte fUhren zu der Erkenntnis, daB Doppelbrechung und Dichroismus nicht notwendigerweise gemein­sam auftreten miissen. Da den biologischen Strukturen im submikroskopischen Bereich sehr haufig bevorzugte Orientierungsrichtungen der MakromolekUle zugrunde liegen, kommen Metachromasie, Doppelbrechung und Dichr~is­mus uberwiegend gemeinsam vor. Unterschied­liche Modelle sowie Angaben fur deren gegen­seitige praktische Abgrenzung sollen die submi­kroskopische Strukturanalyse bei gleichzeitigem Auftreten der optischen phanomene erleichtern und die prinzipiell moglichen Strukturgrundlagen biologischer Objekte fUr die Toluidinblauanlage­rung erlautern.

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