Zeitschrift fiir Krebsforschung 68, 14--24 (1966)

Das Verteilungs- und Einbaumuster radioaktiv markierter Carcinogene in der M~iuseepidermis nach lokaler Applikation *, **

W. O~HLW~T und D. G ~ N Ludwig Aschoff-tIaus, Pathologisehes Institut der Universit~t Freiburg i. Br.

(Direktor: Prof. Dr. H. U. ZOLLINGEP-)

Eingegangen am 7. April 1965

Die in der M~useepidermis naeh lokaler App l ika t i on eareinogener Kohlen- wasserstoffe ab laufenden Zell- und Gewebsver~nderungen (HAMP~gL, GRAFFr U. LAXG~,R), die mi t einer Ste igerung der Prote in- , RNS- und DNS-Neub i ldung verknf ipf t s ind ( G 6 s s ~ R und ZA~I)~g; O~HL~gT, COTs u n d B ~ C H N ~ ; OEHL~gT und v. P ~ ) , s ind nur un te r der A n n a h m e verst / indlieh, dab die Careinogene setbst odor ihre Abbau- bzw. S tof fweehse lprodukte in den Stoffwechsel der Zelle selbst eingreifen, t I i e rbe i e rheb t sieh die Frage , ob diesem Eingriff eine Anlage- rung odor ein E i n b a u des Carcinogens in be s t immte n Ze l l s t ruk tu ren zugrunde l iegen k6nnte . Bisher wurde versueh t mi t te l s b ioehemiseher Methoden (D~v~N- POlgT u. I-IEIDELBEICGER; SOMMERVILLE U. I~EIDELBEI~G1gR) und mi t t t i l fe der F luoreseenzmikroskopie (GaAFF~) diese F rage zu bean twor ten . Die Hers te l lung t r i t f ie r ten Benzpyrens und Methy leho lan th rens ermSgliehte es, der F rage naeh dam Vertei lungs- und E i n b a u m u s t e r dieser Careinogene nach lokaler App l ika t i on aueh un te r Verwendung der au to rad iograph i sehen Methode naehzugehen.

Versuchsanordnung und Methode Bei 30 ausgewaehsenen weigen M/~usen eines Inzuchts~ammes wurde chemisch ein I-Iaut-

areal auf dem Riicken epiliert und die en~haarte S~elle 7 real jeweils im Abstand yon 24 Std mit Tween 60 bepinselt. Hierbei entwickel~e sich eine Hyperplasie des Oberfl~chenepithels. Bei den Tieren des Methylcholanthrenversuches und der beiden l~ngsten Benzpyrenver- suchszeiten konnte keine so ausgepr~gte I-Iyperplasie erzielt werden, da sie dureh eine drei- wSehige Vorbehandlung mit Tween 60 an jedem 2. Tage bereits an das Hyperplasiogen adaptiert waren.

Nach einer eint~gigen Ruhepause wurden die epflierten und mit Tween 60 behandelten Hautstellen yon 18 Tieren mit einer 0,07%igen Benzpyren-Benzol-Aceton-L5sung 3real jeweils im Abstand yon 3 Std betropft. Bei 12 Tieren erfo]gte eine gleiehe Behandhmg mit einer 0,003%igen Methylcholanthren-Benzol-Aeeton-LSsung. Die spezifisehe Akt iv i~t des markierten Benzpyrens be~rug 520 mC/mMol, die des markierten Methylcholanthrens 3150 txC/mMol (Hersteller: The I~adioehemicM Centre, Amersham, England). Jedes mit Benzpyren behandelte Tier erhielt eine Gesamtdosis yon 330 ~C, dies entspricht 0,17 mg Benzpyren. Bei den mit Methyleholan~hren behande]ten Tieren betrug die Aktivi~tsdosis pro Tier 63 #C, das entspricht 0,05 mg Methylcholanthren. Jeweils 3 mit Benzpyren und 2 mit Methy]cholanthren betropfte Tiere wurden 2 und 24 Std und 2, 4, 8 und 10 Tage nach der letzten Tropfung durch Dekapita~ion in Athernarkose getStet.

Von jedem Tier wurde das behandelte Hautstfiek, I Niere und 1 Leberlappen en~nommen und in 4 %igem, neu~ralem Formalin fixiert. Durch die ~ufsteigende Alkoholrelhe wurden die Gewebsstficke entw~ssert und fiber Methy]benzoat und Benzol in :Paraffin eingebettet. Von etwa 5 # dieken Gewebsschnitten wurden unter Verwendung flfissiger Emulsion (Ilford G 5) Autoradiogramme hergestellt.

* Teil einer Dissertationsarbeit yon D. G~r~M. ** Mi~ Unters~iitzung der Deutschen Forschungsanstalt.

Verteilungs- und Einbauinuster radioaktiv markierter Carcinogene 15

Zwei ausschlieBlich mit Tween 60 behandelte und nicht mit Carcinogen betropfte Tiere wurden in gleicher Weise untersucht nnd Ms Kontro]ltiere bewertet.

N~ch einer Expositionszeit yon 10 Tagen wurden Autoradiogramme entwickelt, fixiert und mit H~matoxylin-Eosin durch die Emulsionsschicht hindurch angef~rbt.

Um Aussagen fiber die chemische Bindung der in den Schnitten vorhandenen Radio- ~ktivit~t zu erhMten, wurde bei einem Teil der Schnitte jeder Versuchszeit eine Lipoid- und NucMns~ureextraktion folgendermaBen durchgefiihrt: Die entparaffinierten Schnitte k~men: ftir 5 min in eine kMte 10%ige Trichloressigs~ure. AnschlieBend wurden sie durch die auf- steigende Alkoholreihe in 100%igen Alkohol gebracht und dann 10 rain in eine Chloroform- Ather-LSsung gesSellt (1 : 1). Nach Durchffihren durch die absteigende Alkoholreihe und an- schliegende W/isserung ~olgte eine neuerliche Behandlung in 5%iger kMter Trichloressig- s~ure ffir 15 rain und anschliegend eine solche in 5%iger Trichloressigs~iure bei 90 ~ Nach er- neutem Einste]len in 5 % ige kalte Trichloressigs~ure erfolgte dann eine 24stfindige W/~sserung.

Weitere Sctmitte jeder Versuchzeit wurden ffir 1 Std in eine Ribonucleasel6sung gebracht, welche 1 mg kristMline Ribonuclease pro 1 m] Aqu~ bidestillata enthielt. AnschlieBend er- folgte eine W~sserung ffir 2 Std.

Die entsprechenden Gewebsschnitte wurden nach Lipoid- und Nucleins/iureextraktion bzw. nach der l~ibonucleasebehandlung wie die unbehandelten Schnitte mittels flfissiger Emulsion zu Autoradiogrammen verarbeitet.

Ergebnisse In vorliegender Arbeit solien ausschlieBlich die Autoradiogramme der Haut

besprochen werden. Die autoradiographischen Ergebnisse der Untersuchungen yon Leber- und Nierengewebe bleiben einer weiteren Ver6ffentlichung vor- behalten.

Benzpyren. 2 Std nach 3mMiger Tropfung mit Benzpyren aH finder sich im Autoradiogramm der Epidermis eine starke diffuse Schw~trzung fiber allen Zell- schichten des hyperplastischen Plattenepithels (Abb. 1).

Die SilberkSrner liegen sowohl fiber den Zellkernen als auch fiber dem Cyto- plasma, wobei vereinzelt eine Betonung der Kernmembran und des Nucleolus nachweisbar ist. Im lockeren subepithelialen Bindegewebe finder man einzelne markierte Ze]lkerne fiber mesenchymalen Zellelementen, wobei es sich um Fibro- blasten und ttistiocyten handelt. Sowohl die Zellen der Haarfollikel und Haar- scheiden als auch die der TMgdrfisen sind st~trker markiert Ms die Epithelien des Plattenepithels. Die quergestreifte Muskulatur zeigt eine nur sehr geringgradige Silberkornbelegung. Die Haarsch~fte sind ausnahmslos frei yon Radioaktiviti~t.

24 Std nach der letzten Tropfung hat sich das autoradiographische Bild in- sofern gei~ndert, als die starke Markierung der Talgdrfisen weitgehend verschwun- den ist. Die Haarschhfte selbst sind wie bei der frfiheren Zeit in ihrer ganzen L~nge unmarkiert, dagegen beobachtet man innerh~lb der ttaarscheiden weiter- hin eine deutliehe Markierung (Abb. 3a). Bindegewebe und Muskulatur sind praktisch frei yon Silberk6rnern.

48 Std nach Tropfung finder man markierte Zellen nur noch in den oberen zwei Dritteln des Epithels, die basalen Zellagen sind frei von l~adioaktivit~t (Abb. 2). Die Talgdrfisen zeigen keine Markierung. Die Zellen der Haarfollikel sind kaum markiert, dagcgen besteht weiterhin eine starke Silberkornbelegung der Zellen der Haarscheiden in oberen Anteilen der Haut. Der Haarschaft selbst zeigt unmittelbar oberhMb der Itaarfo]likel ein nach oben und unten begrenztes Markierungsband. Die stellenweise abgel6ste Hornschicht ist stark mit Silber- k6rnern bedeckt. Bindegewebe und Muskulatur sind unmarkiert.

16 W . O n ~ I L ~ T u n d D . G ~ I M ~ :

Abb. 1. Autoradiogral~am vom hyperplastischen Plattenepithel der M~usehaut, 2 Std naeh dl'eiinaliger Tropfung mit ~l~-Benzpyren. Diffuse Markierung in Cytoplasma und Zellkern al]er Epithelzellen im verdickten

Plattenepithel und in t taarscheiden

Abb. 2. Autoradiogramm der hyperplastisehen M~useepidermis, 48 Std nach dreimaliger Tropfung mit 3tt- :Benzpyren. :Erhaltene ]garkierung oberer :Epithellsgen bei verminde~ter Silberkorndiehte der Basalzellen

Verteilungs- und Einbnumuster radioaktiv markierter C~rcinogene 17

a b Abb. 3a u. b. Autoradiogramme der hyperplastischen Mituseepidermis, 24 Std (a) und 8 Tage (b) nach letzter Tropfung mit ~H-Benzpyren. Stark markiertes Epithel und unmarkierter ]~aarschaft (a) 24 Std, unmarkiertes

Epithel und umschriebene Markiertmg des Haarschaftes (b) 8 Tage nach ]etzter Tropfung

Abb. 4. Au~oradiogramm quergeschnittener Haare in der Cutis der Maus, 4 Tage nach le~zter Tropfung mit ~H-iKethylcholanthren. lgarkierung der Haarsch~fte und Haarscheiden bei fehlender Markierung tier Umgebung

4 Tage nach Behandlung mit Benzpyren finder sich nur noch in den obersten verhornben Zellschichten Markierung. Auf quergetroffenen Haaren in oberen Epidermisanteilen finder man ringfSrmig angeordnete Silberkornansammlungen, welche auch den Haarschaft betreffen. T~lgdrfisen, lockeres Bindegewebe und Muskul~tur sind unmarkiert (Abb. 4).

Z. Krebsforsch. Bd. 68 2 a

18 W. O~ERT und D. G ~ M :

8 und 10 Tage nach Tropfung liegen stellenweise in kleinen, oberfl~chlichen Epithelkrypten abgeschilferte und stark markierte Hornmassen (Abb. 5).

Die das Epithel fiberragenden Haare und auch unmittelbar innerhalb des Epithels liegende Anteile des Haares zeigen ein umschriebenes Silberkornband (Abb. 3b). Alle anderen Epidermisanteile sind frei yon autographisch nach- weisbarer Aktivitiit.

Abb. 5. Autoradiogramm oberfl~tclflicher Anteile des hyperplas~ischen Plattenepithels der ]~[~usehau~, 8 Tage nach letzter Tropfung mit 3tt-~ethylcholanthren. Verlust der Markierung in allen Epithelien. Ak~ivit~tsreste

in kernlosen Hornschuppen an der Hautoberfl~che

Methylcholanthren. Wie die Versuchsergebnisse gezeigt haben, beobaehte& man naeh Applikation yon Methyleholanthren-H ~ die gleiehe Aktivitgtsverteilung und die gleiehen zeitliehen Vergnderungen hinsiehtlieh der Markierung einzelner Epidermisstrukturen, wie naeh Applikation von Brenzpyren-3H. Die Sflberkorn- diehte ist stets geringer als naeh Benzpyrentropfung, da die applizierte Aktivit/~ts- menge geringer war.

Wie die Abbildungen erkennen lassen, ist die Hyperplasie bei den Methyl- eholanthrentieren nur geringgradig. Vereinzelt besitzt das Epithel noeh normale Dieke.

Autoradiogramme nach Lipoid- und Nucleins~iureextralction. Die Gewebs- sehnitte sind naeh der drastisehen Behandlung gegeniiber unbehandelten Sehnit- ten stark ver~nder~ und stellenweise nur sehleeht erhalten. Jegllche Kernf/~rbung fehlt wegen der vollst/~ndigen Entfernung beider Nucleins~uren. Dagegen be- obaehtet man anstelle des Zellkerns optiseh leere Hohlrttume, in denen vereinzelt nur noeh ein umschriebenes Proteingerfist erhalten geblieben ist. Von den iibrigen

Verteilungs- und Einbaumuster radioaktiv markier~er Carcinogene 19

Anteilen der Epidermis ist nur das Eiwefl~ erhalten geblieben, welches sich mit Eosin rot anfarbt.

Im Autoradiogramm ist das ursprfingliche Markierungsmuster erha]ten gebtieben. Die Silberkorndichte ist bei gleicher Belichtungszeit gegenfiber den unbehandelten Schnitten geringer. Vor ahem sind die Zellkerne bzw. die ursprfinglich den Ze]ikern enthaltenden optisch leeren R/~ume frei yon Silber-

Abb. 6. Autoradiogramra der M~,useepidermis, 2 Std nach Tropfung mit 3H-Benzpyren und anschliel~ender Ribonuclease-Behandlung. Erhaltene Markierung der Zellkerne bei Verlust der Radioaktivitat in Nukleolen

kSrnern. Die Markierung des Cytoplasmas der Epithelien des Plattenepithels, der Itaarfollikel und der Talgdr/isen ist abgeschw/~cht. Die Kernmarkierung der Itistiocyten und Fibroblasten im lockeren subepithelialen Bindegwebe fehlt.

Bei sps Versuchszeiten, bei denen nut noch eine Markierung der Horn- schichten und der Haare vorliegt, wurde durch die Extr~ktion keine ~nderung der Silberkornverteilung und der Silberkorndichte erreicht.

Autoradiogramme nach Ribonucleasebehandlung. Die Gewebsstruktur in den behandelten Gewebsabschnitten ist vSllig erhalten. Die Nucleo]en der Epithel- ze]len erscheinen als ]eere Vacuolen mit geringgradiger Eosinophilie. Im tibrigen stellen sich die einzelnen Zellelemente nicht anders als in unbehandelten Pr~Lpa- raten dar.

Im Autoradiogramm ist eine J~nderung des Markierungsmusters insofern nachweisbar, als die Nucleolen ausnahmslos frei yon SilberkSrnern sind (Abb. 6).

2*

20 W. O~L~RT und D. GRI~:

Aaeh im Cytoplasma besteht eine Verringerung der Silberkorndichte, wodureh die erhaitene Marlderung des tibrigen Ze]lkerns (ohne Nucleolus) deutlieher hervortritt .

Am Markierungsmuster und der Markierungsintensitgt der Talgdriisen und Haare ist keine Xnderung gegeniiber unbehandelten Prgparaten eingetreten.

Besprechung der Ergebnisse

Bei der Beurteflung der yon uns erhMtenen ~utoradiographischen Unter- suehungsergebnisse an der M~Lusehaut nach lokaler Applikation radioaktiv mar- kierten Benzpyrens und Methylcholanthrens hat man sich zungehst zu fragen, inwieweit der yon uns nachgewiesenen Radioaktivitgt in den verschiedenen Gewebsanteflen eine An]agerung oder ein Einbau des unveriinderten Carcinogens zugrunde liegt.

Die in unseren Autoradiogrammen siehtbare Schwgrzung ist zwar ein Beweis fiir das Vorhandensein radioaktiv markierter Substanzen, welche dureh die Vor- behandlung der Gewebe (Fixation, Einbettung in Paraffin) und der histologischen Sehnitte (Entparaffinierung, Wgsserung) nicht entfernt worden sind, nicht aber fiir das Vorhandensein des unvergnderten markierten Carcinogens. Wit kSnnen auf Grand der von uns gewghlten Versuchsanordnang nicht entscheiden, ob die autoradiographisch nachweisbare aH-Aktivitgt der Markierung des unvergnderten Benzpyrens- bzw. Methyleholanthren-Molekfils oder der Markierung yon Abbau- produkten der beiden Carcinogene zuzuordnen ist.

Andererseits wissen wir aas chenfisehen Untersuchungen, dag nach par- enteraler und lokaler Applikation auf die Haut unveri~ndertes Benzpyren in der Leber nachweisbar ist, and dag der Abbau des Benzpyrens zu Benzpyren-X 1 und Benzpyren-X 2 durch 0xydat ion in der Leber erfolgt (WEmEI~T U. MOTTI~A~, CALOVT u. PAYNE). Biochemische Untersuehungen mit 14 C-Methylcholanthren haben gezeigt, dab chemisch unvergndertes Methylchotanthren in Bindung ~n Proteine nach ]okaler Applikation in den versehiedenen Zellarten der Epidermis nachweisbar ist (DAvENe0~T u. HEIDELBElCGER). Wir d/irfen somit auf Grund derartiger Untersachungsergebnisse annehmen, dab die yon uns aa~oradio- graphiseh naehgewiesene Radioaktivit/~t in den versehiedenen Zellarten der M/~usehaut znmindest zum grogen Teil auf die unver/~nderten markierten Carci- nogene zuriiekzufiihren ist.

Die Tatsaehe, dM3 in unseren Prgparaten Radioaktivit/~t an den versehie- denen Sgruktaren der Haut aufgefunden wurde, obgleich die Gewebssehnitte naeh der vorangehenden Behandlung ffei yon wasser- and fettl6sliehen Snb- stanzen sein sollten, sprieht f/it die Annahme, dab die markierten Careinogene oder ihre Abbauprodukte in einer Form oder Bindung vorliegen, welehe ihr tterausl6sen dureh Wasser bzw. dureh Fettl6sungsmittel verhindert.

Zur weiteren Abklgrung dieser Frage hatten wit Gewebssehnitte jeder Ver- suehszeit vor der Herstellung yon Autoradiogrammen einer drastisehen Lipoid- and Nueleinsgure-Extraktion nnterworfen (s. Absehnitt: Versuchsanordnung und Methode). Diese Behandlung f/ihrte zu einer nahezu vollstgndigen Entfer- hung aller IApoide und Nueleins~Luren mit praktiseh absolutem Verlust der Kern- fi~rbbarkeit and erheblicher Alteration der Gewebsstraktur. Trotz dieser Be- handlang war das autoradiographisch nachweisbare Markierungsmuster des

Verteilungs- und Einbaumuster radioaktiv m~rkierter Carcinogene 21

Gewebes unveriindert geblieben. Zwar war in den einzelnen Strukturen der Epidermis, in denen nur noch das Proteingerfist erhalten war, die Silberkorn- belegung der Zellkerne vollsti~ndig gesehwunden. AuBerdem bestand eine Ab- nahme der Markierung des Cytoplasmas. Demgegenfiber war die Sflberkornbe- legung der oberfl~ehlichen Hornschichten und der gaare unver/~ndert geblieben. Diese Beobaehtungen k6nnen als Beweis daffir gelten, dab ein groBer Tefl der autoradiographiseh nachweisbaren Radioaktivit/~t in einer sehr festen Bin- dung an Proteine vorliegen muB. Diese Annahme steht in Ubereinstimmung mit Versuchsergebnissen anderer Autoren, die eine Bindung eareinogener Kohlen- wasserstoffe an Proteine der Miiusehaut mit anderer Methodik naehweisen konnten (DAVENPORT n. ~t~EIDELBERGER; SOMERVILLE U. HEIDELBERGER).

Zusiitzlich m/issen wir jedoeh annehmen, dab eine Bindung yon SH-Benzpyren und 8H-Methylcholanthren an Ribonuelein- und Desoxyribonueleins/iure existiert, da naeh Nucleins~ureextraktion und Ribonucleasebehandlung ein Aktivit/~ts- verlust eintrit~, der vor allem die Markierung des Zellkerns der Epithelien be- trifft. Vor aUem die Beobachtung, dab nach Ribonucleasebehandlung die Mar- kierung des Nueleolus verlorengeht, w/~hrend die Markierung des /ibrigen ZeU- kernes erhalten bleibt, sprieht fiir die Annahme, daI] ein Tell der markierten Careinogene in fester Bindung an Desoxyribonueleins~ure vorliegt. Diese An- nahme findet eine Bests in Versuehen, bei denen naeh Applikation mar- kierter earcinogener Kohlenwasserstoffe und krebserzeugender Amine die Radio- aktivit~t in der RNS- und DNS-Fraktion aufgefunden wurde (It~,IDV.LB~,RG~,g U. DAVENPORT; M_ARROQUIN U. ~ARBER).

M_it dem Naehweis einer Markierung der Zellkerne kommen wir zur Bespre- ehung einer Diskrepanz zwisehen den Ergebnissen unserer Versuche und denen fr/iher durehgef/ihrter fluoreseenzmikroskopischer Untersuchungen fiber die Verteilung earcinogener Kohlenwasserstoffe (Benzpyren) in der 1V[/~usehaut (GaA~FI).

Wiihrend bei diesen genannten Versuchen das Verteflungsmuster innerhalb der Haut und ihrer Anhangsgebflde mit dem yon uns aufgefundenen identiseh war, bestand stets--gleiehgfiltig welehe Gewebe untersueht wurden--eine scharfe Ausspartmg der Zellkerne im fluorescenzmikroskopisehen Bfld. Diese Beobach- tung veranlaBte die genannten Autoren zu der Annahme, dab das yon ihnen untersuchte Benzpyren vorwiegend in den Mitochondrien, nieht aber im Zell- kern abgelagert wurde. In unseren Versuehen bestand stets sowohl in den Zell- elementen des Epithels als aueh in mesenchymalen Zellelementen des subeutanen Bindegewebes neben einer Markierung des Cytoplasmas eine deutliehe Sflber- kornbelegung der Zellkerne, insbesondere aueh der Nucleolen.

Diese Diskrepanz kl/~rt sich jedoeh unter Berficksichtigung der Beobachtung yon BOYLAIqD und G~v,]~, dab die F]uorescenz yon Benzpyren dureh Desoxy- ribonucleins/iure gel6seht wird.

Gleiehzeitig machen unsere Untersuchungsergebnisse die Annahme wahr- seheinlich, dab nicht die Mitochondrien die Orte der st~rksten Carcinogen- an]agerung sind, sondern vielmehr die Strttkturen des Ergastoplasmas im Cyto- plasma und das nucleolusassozfierte Chromatin bzw. der Nueteolus selbst im Zellkern. Die yon uns erhaltenen Autoradiogramme naeh Applikation yon mar- kierten Careinogenen entspreehen hinsichtlich der Sehwiirzungsverteflung im

Z. Krebsforschung Bd. 68 2 b

22 W. O~mER~ und D. G~M:

Gewebe und in der Einzelzelle v611ig denen, die naeh Injektion markierter Amino- sguren beobachtet wurden (NIKLAS U. OEHLEt%T, SCHULTZ]~, OEItLERT U. MAuaE~). Wir finden somit die st/~rkste Ablagerung bzw. den st~rksten Einbau markierter Careinogene in den Gewebs- und Zellstrukturen, die aueh den grSl~ten Amino- saureeinbau in Proteine erkennen ]assen. Dies grit insbesondere such fiir die sehr starke Markierung der Talgdriisen. Im Zellkern selbst ahnelt des Einbaumuster ffir Carcinogene insofern dem flit Ribonucleinsaurevorlaufer (sH-Cytidin), als die Silberkornbelegung des Nucleolus und seiner Umgebung stets gr52er als die des fibrigen Zellkerns ist. Diese Beobaehtung wiirde in Ubereinstimmung mit der Annahme yon DANN~N~El~G stehen, der eine Anlagerung bzw, eine Einschie- bung der Molekiile carcinogener Kohlenwasserstoffe in des DIqS-Molekiil ffir die eareinogene Wirkung dieser Substanzen verantwortlich macht. Dabei wird ver- mutet, dab diejenigen Bezirke des Chromosoms einen Einsehub des Carcinogen- molekiils ermSglichen, die stoffwechse]aktiv und deshalb besonders stark hydra- tisiert sind.

Wie unsere Ergebnisse bei langeren Versuchszeiten (8 und 10 Tage) erkennen lessen, erfolgt, beginnend mit der 48. Std nach einmaliger Applikation der Car- cinogene, eine Anderung des Markierungsmusters der ttaut, die durch eine Ver- sehiebung der Radioaktivit~t in obere Zellagen des Epithels beim Auftreten unmarkierter Zellen in basalen Zellschichten charakterisiert ist. Gleichzeitig kommt es dabei zu einer schnellen Abnahme der Schw~rzung im Bereiche der Talgdriisen, die bereits 24 Std nach Applikation des Carcinogens frei yon Radio- aktivitat sind. Daneben beobachteten wir ein allmahliches Hoehwandern einer Markierungsbande des Haarschaftes, die 8--10 Tage naeh einmaliger Carcinogen- applikation in den unmittelbar unter dem Epithel liegenden oder in den die Haut iiberragenden Anteflen der Haare sichtbar wird. A1]e diese Beobachtungen sprechen fiir die Annahme, dab die markierten Careinogene oder ihre markierten Stoffweehselprodukte test in den Epithelzellen der Haut- bzw. in der Haarsub- stanz fixiert sind und erst mit den Zell- oder Gewebselementen zusammen aus dem Gewebe eliminiert werden. Bei den Talgdriisen mug angenommen werden, daI~ die Markierung zusammen mit den hier produzierten Talgmassen ausge- sehieden wird. ttierbei diirften jedoch nieht die hier vorhandenen Lipoide sondern die Eiweil3substanzen ffir die starke Markierung der Talgdr/isen verantwortlich zu maehen sein. Gleichzeitig sprieht diese Beobaehtung ffir die Auffassung, de8 die ]okal applizierten Careinogene so test an Proteine und Iquelein- sauren gebunden werden, da~ sie entweder mit den Zellen selbst oder aber mit ihren Stoifwechselprodukten aus dem Gewebsverbancl eliminiert werden kSnnen. Diese Annahme wird auch durch die Beobachtung gestiitzt, dal~ bei sp&ten Versuchszeiten (8 und 10 Tage) aul~er in Haarseh&ften nur noch in den in kleinen Krypten angesammelten Hornschuppen Radioaktivit~t nachweis- bar ist.

Bei einer mittleren Lebensdauer und einer Wanderungsgesehwindigkeit der postmitotisehen Zellen im hyperplastisehen Plattenepithel der Maus yon etwa 4 Tagen ( D o E a ~ , TuLI~gs und 0~HL~T 1964) miissen diejenigen Zetlen, wel- che zum Zeitpunkt der Tropfung in den versehiedenen Zellsehiehten oberflaeh- licher Epithelanteile lagen und hier markiert wurden, nach und naeh abgesehflfert werden, so da~ bei sps Versuchszeiten nur noeh diejenigen Itornschuppen

Verteilungs- und Einbaumuster radioaktiv raarkierter Carcinogene 23

markiert sind, die yon Zellen herrfihren, welche sich zum Zeitpunkt der Carci- nogenapplikation in basalen Zellagen befanden.

Das relativ frfihe Verschwinden der Radioaktivit/~t in basalen Zellschichten kann man sich nur so erld/ircn, dab bei den nachfolgenden Zellteilungen die Aktivit/~t entweder eliminiert wird oder aber so verdfinnt wird, dab sie autoradio- graphisch nicht mehr naehweisbar ist. Diese Beobachtung spricht jedoch gleich- zeitig dafiir, dag die in den basal liegenden und damit zur weiteren Zellteilung befghigten Zellen aufgenommencn Careinogene anscheinend nicht durch ihr Ver- bleiben in der Zeile den carcinogenen Effekt ausl6sen. Man mug somit annehmen, dal3 nicht das ceiluls fixierte Carcinogen selbst, sondern die dureh das Carcinogen gesetzten Ver/inderungen an der RNS oder DNS f/Jr den eigentlichen carcinogenen Effekt verantwortlich zu machen sind.

Zusammenfassung

In autoradiographischen Untersuchungen nach lokaler Applikation yon 3H-Benzpyren und 3H-Methylcholanthren konnte nachgewiesen werden, dal3 die Carcinogene selbst oder aber ihre markierten Abbauprodukte lest in Proteine, Ribonucleins/~uren und Desoxyribonueleins/iurcn der verschiedenen Zellelemente der M/~useepidermis eingebaut werden. Das Markierungsmuster der untersuehten tefls hyperplastischen, tefls normalen M/~usehaut entspricht weitgehend dem Incorporationsmuster, welches nach Applikation markierter Aminos/iuren er- halten wird. Mit zunehmender Versuchszeit erfolgt im mehrschichtigen Platten- epithel eine Verschiebung der radioaktiven Markierung naeh der Gewebsober- fl/iche bin. Die Eliminierung des Carcinogens erfolgt somit mit gr613ter Wahr- scheinlichkeit durch die im Zuge der phyliologischen Regeneration stattfindende Zellabstogung. Da 4--10 Tage nach einmaliger Applikation aueh in den basalen Zellagen keine markierten Carcinogene mehr nachweisbar sind, mug angenommen werden, dag die earcinogene Wirkung der untersuchten Substanzen nieht auf einem danernden Einbau der Substanzen, sondern auf der irreversiblen Vergnde- rung bestimmter Zellstrukturen beruht.

The Pattern of Distribution and Uptake of Radioactive Carcinogens in the Skin of the Mouse a~ter Their Local Application

Summary

In autoradiographic studies after the local application of It3-benzpyrene and H3-methylcholanthrene it could be demonstrated that the carcinogens themselves or their labelled breakdown products were bound firmly into the pro- teins, ribonncleie acids, and desoxyribonueleie acids of the various cells of the mouse epidermis. The pattern of labelling of the skin studied, which in part was hyperplastie, in part normal, corresponded greatly with the pattern of incorpora- tion which was obtained after the application of labelled amino acids. As the experimental period increased, there was a displacement of the radioactive labelling towards the surface of the stratifield squamous epithelium. Conse- quently, it seemed most probable that the carcinogens were eliminated by means of the cellular dcsquamation during the process of physiologic regeneration.

24 W. OEHLERT und D. G~r~M: Verteitungs- und Einbaumuster

Since labelled carcinogens were no t demonst rable in the basal cell layers from four to ten days after single applications, i t mus t be assumed t h a t the carcino- genic act ion of the substances inves t iga ted does no t depend on a last ing up take of substances, b u t on the irreversible changes of cer ta in cellular s tructures.

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