Das Vorkommen von Fumarase im Samen gewisserCucurbitaceen, 1

VonT. Thunberg.

(Aus dem Physiologischen Institut in Lund.)

Vor nunmehr 25 j ahren beobachtete ich mittels meiner Mikro­respirometermethode, daB ein Zusatz von Fumarsaure zu feinverteilterFroschmuskulatur eine ausgepragte Steigerung der Sauerstoffauf­nahme der Muskulatur bewirkt, Zehn Jahre sparer, als ich die vor­her mit Hilfe der Mikrospiratormethode untersuchten Stoffe mit dervon mir ausgearbeiteten Methylenblaumethode priifte, fand ich, daBFumarsaure, in Abwesenheit von Sauerstoff, eine Reduktion desMethylenblaus bewirkt. Es war am nachstliegenden, dies in der Weisezu deuten, daB dies auf eine direkte Dehydrogenisierung von Fumar­saure unter Entstehung von Azetylendikarbonsaure zuriickzufiihrensei, welche Moglichkeit ich auch unter Vorbehalt aussprach. Indessenwurde bald klar, daB Fumarsaure nicht als ein direkter Wasserstoff­donator wirkt. Die Wirkung derselben ist eine indirekte. Unter Ein­wirkung des im Jahre 1920 von Battelli und Stern beschriebenenEnzyms Fumarase wird die Fumarsaure partiell in r-Apfelsaure um­gewandelt, und die r-Apfelsaure ist es, die unter Einwirkung desfriiher von mir beschriebenen Enzyms, der Malikodehydrogenase, alsder wirkliche Wasserstoffdonator auftritt.

Gegen eine direkte Dehydrogenisierung der Fumarsaure sprichteinesteils, daB es nicht gelungen ist, Azetylendikarbonsaure als Reak­tionsprodukt nachzuweisen, sowie ferner, daB eine derartige direkteDehydrogenisierung vom thermodynamischen Gesichtspunkt aus we­nig wahrscheinlich ist. Schon die Elimination von H aus Bernstein­saute ist ein endothermischer ProzeB, der die Zufuhr von Energie er­fordert, Eine noch grofsere Energiemenge ist fur die Eliminationvon H aus Fumarsaure erforderlich (siehe Walter Hiickel, 1935).Dberhaupt ist zu beachten, daB die endothermischen Dehydrogenisie-

1 Der Redaktion am 26. Oktober 1935 zugegangen.

s·

t38 T. THUNBERG:

rungsprozesse erst dadurch zustande gebracht werden konnen, daBman sie mit vom energetischen Gesichtspunkt aus iiberkompensie­renden exothermischen Hydrogenisierungsprozessen zusammenkop­pelt. Eine Analogie zu einer derartigen energetischen Verkoppelungfindet man in dem Verhalten einer Fliissigkeit in einern Heber. DasAufsteigen der Fliissigkeit in dem kiirzeren Schenkel wird durchHinabflieBen derselben in dem anderen Heberschenke1 auf ein nie­drigeres Niveau ermoglicht. Was nun einen solchen Wasserstoff­akzeptor wie Methylenblau angeht, so deutet nichts darauf hin, daBdie bei Hydrogenisierung desselben gebildete Energie zur Kompen­sation der Energie ausreichen wiirde, die fur die Verwandlung derFumarsaure in Azetylendikarbonsaure notig ware.

Die Fumarase ist seit ihrer Entdeckung zum Gegenstand zahl­reicher Untersuchungen gemacht worden; die umfassendsten wurdenvon Kurt P. Jacobsohn (1932) und seinen Schiilern in Lissabonausgefiihrt, Schon Jacobsohn dehnte seine Untersuchungen aufSamenarten aus und konstatierte das Vorhandensein von Fumaraseim Erbsmehl. Doch scheinen die aus dies em Meh1 hergestelltenEnzymlosungen nicht besonders kraftig zu sein. Jacobsohn (1933)gibt an, daB das durch die Fumarase bewirkte Gleichgewicht Fumar­saure : Apfelsaure auch bei den starksten von ihm aus Erbsmehlhergestellten Enzymlosungen Tage erforderte.

Personlich bin ich durch meine seit etwa 10 J ahren betriebenenStudien tiber die Dehydrogenasen in Pflanzensamen auf die Fragedes Vorkommens von Fumarase in Samen gekommen. Die allgemeineMethodik bestand in einer Untersuchung dessen, wie die Entfarbungeines mit Methylenblau versetzten Phosphatextraktes durch verschie­dene Stoffe beeinfluBt wird, besonders durch solche Stoffe, die mansich eventuell als Wasserstoffdonatoren denken kann. Wie aus einerAnzahl frtiherer, diese Frage betreffenden Mitteilungen (sieheThunberg, 1934, 2) hervorgeht, erweist sich Apfelsaure in einergroBen Zahi von Samenextrakten ais Wasserstoffdonator. In einigenHillen bewirkte jedoch auch Fumarsaure eine unzweideutige und bis­weilen recht kraftige Mb-Entfarbung. Die oben hinsichtlich der hierin Frage stehenden Wasserstofftransportprozesse genannten Cesichts­punkte schienen nun die Moglichkeit dessen auszuschliefsen, daB dieFumarsaure als ein direkter Wasserstoffdonator wirkte. Die einzigeiibrigbleibende oder wenigstens wahrscheinlichste Erkllirung fiir diebei Zusatz von Fumarsaure erzielte Mb-Entfarbung ist, daB Fumar­saure zunachst in r-Apfelsaure verwandelt wird und daB diese Sub­stanz dann als Wasserstoffdonator wirkt. Es lieB sich auch leichtfeststellen, daB in den Samenextrakten, die beim Zusatz von Fumar-

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saure eine gesteigerte Mb-Entfarbung zeigten, Malikodehydrogenasevorhanden war.

1st also das Vermogen der Fumarsaure, in einem Enzymsystemeine Indikatorentfarbung hervorzurufen, darauf zurilckzufiihren, daBdie Fumarsaure zuerst unter Bildung von Apfelsiiure Wasser addiert,und daB die Apfelsaure der direkte Wasserstoffdonator ist, so bedeu­tet die Beobachtung einer durch Fumarsaure hervorgerufenen enzy­matischen Indikatorentfarbung gleichzeitig den Nachweis des Vor­handenseins teils von Fumarase, teils von Malicodehydrogenase indem enzymatischen Extrakt. Hierdurch ist die Indikatorenfarbungs­methode auch eine Methode, zum Nachweis von Fumarase, trotzdemder durch die Fumarase direkt beherrschte Prozefs keine Aktivierungvon Wasserstoff bedeutet.

Der Wert der hier in Frage stehenden Methode fiir den Nachweisvon Fumarase wird offenbar dadurch eingeschrankt, daB diese Me­thode nur bei Samen angewendet werden kann, die neben Fumaraseauch Malicodehydrogenase enthalten. 1st keine Malicodehydrogenasevorhanden, so kann man mit Hilfe dieser Methode die eventuell ineinem Samenextrakt vorhandene Fumarase nicht feststellen. Indes­sen kann man sich wohl die Moglichkeit denken, daB man mit Hilfeeiner fumarasefreien Malicodehydrogenase Fumarase in einer an­deren Samenart entdecken kann. Ferner ist die Malicodehydrogenaseein in Pflanzensamen recht allgemein vorkommendes Enzym, weshalbdie Moglichkeit, mit der hier angegebenen Methode das Vorkommenvon Fumarase festzustellen, von nicht geringer Verwendbarkeit ist,

Versuchsprotokoll.

Es sei hier ein Versuchsprotokoll mitgeteilt, aus dem hervorgeht,wie das Vorhandensein von Fumarase in einem Samenextrakt zumAusdruck kommt,

Bei den Versuchen wurde eine Apparatur benutzt, die im hie­sigen Laboratorium bei Dehydrogenasestudien iiberhaupt zur Anwen­dung kommt, und die ich letzthin in Abderhaldens Handbuch aus­fiihrlich beschrieben habe. Auch sei auf eine vor nicht langer Zeitveroffentlichte Mitteilung (1934, I) verwiesen, wo ebenfalls der Gangeines Versuchs nach der hier in Frage stehenden Methodik geschil­dert wird. 1m folgenden wird die Kenntnis der Einzelheiten derMethode vorausgesetzt. Nur soviel wird mitgeteilt, wie zur Beleuch­tung der Konzentration notwendig ist, in denen die bei den Ver­suchen benutzten Losungen verwendet worden sind.

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A. Benutzte Ldsungen,

I. Methylenblau medicinale, Wasserlosung I: 5°000 = »Mb.«2. Kaliumfumaratlosung, 0,1 molar, hergestellt durch Neutrali­

sierung von Fumarsaure mit Kalilauge. 116 mg Fumarsaure (Mol.­Gew. 116,03) werden mit 0,5 normalen KOH versetzt, worauf auf10 ccm verdiinnt wird. Die Neutralisierung findet ohne Zusatz cinesIndikators zu der fertigen Losung statt, urn eventuelle Giftwirkungenzu vermeiden. Die Reaktion wird mit kleinen Tropfen der Losungauf Reagenzpaiper gepriift. Durch Verdiinnung einer passendenMenge dieser Fumaratlosung im Verhaltnis 1 +- 4 und im Verhaltnis1+ 24 erhalt man Fumaratlosung von 0,02 molar bzw. 0.004 molar(20 bzw. 4 millomolar).

3. Phosphatextrakt von Cucumis sativus. 5 g geschalte Curken­samen wurden mit 25 ccm 0,870J0igem K2HP04 griindlich mit Morserzerkleinert. Nach 30 Min. wird das Gemisch in einer schnell rotie­renden Zentrifuge zentrifugiert. Nach 15 Min. Zentrifugieren zeigtdie Zentrifugierrohre 3 Schichten, namlich einen Bodensatz, eineziemlich klare Mittelschicht und eine die Oberflache bedeckende Haut,Die Mittelschicht wird in ein Probierrohrchen gebracht, welches un­mittelbar in Eiswasser gestellt wird. Die Mittelschicht bildet die be­nutzte Dehydrogenaselosung = »Enz.«,

B. Benutzte Geriite.I. 1 1 Vakuumrohren.2. Luftpumpe.3. Wasserthermostat, dessen Temp. auf 350 C gehalten wird.

c. Ausfiihrung des Versuchs.

Jetzt wird die notwendige Anzahl von Thunbergrohren (Vakuum­rohren) in der Weise beschickt, daB die fertig beschickte Rohre 0,5cern Mb., 0,5 ccm Enz., die aus der Tabelle ersichtlichen MengenFumaratlosung sowie schlieBlich destilliertes Wasser in einer Mengeenthalt, daB die Gesamtfliissigkeitsmenge in samtlichen Rohren 2 ccmbetriigt.

D. Resultat.

Beziiglich des Einflusses auf die Mb.-Entfiirbung, der also durchden Zusatz von Kaliumfumarat in verschiedenen Mengen unter deneben beschriebenen Versuchsbedingungen ausgeiibt wird, sei auf Ta­belle 1 verwiesen. In der zweiten Kolumne dieser Tabelle ist tibrigensdie jeder einzelnen Rohre zugesetzte Menge Fumarat in mg angegeben.In der dritten Kolumne sind die Zeiten fiir die vollstandige Entfar-

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bung in den fumaratfreien Kontrollrohren angegeben und in dervierten Kolumne die entsprechenden Zeiten fiir die mit Fumarat ver­setzten Rohren.

Zur Beleuchtung der Zahlenwerte der Tabelle sei noch folgendesmitgeteilt:

Die in der Tabelle angegebenen, in mg ausgedriickten abso­luten Fumarsauremengen stellen, in Mikromol ausgedriickt, folgendeSerie dar: 0,4 - 0,8 - 1,6 - 2 - 4 - 8 - 10 - 20 - 40. Die kleinstebenutzte Menge Fumarsaure verhalt sich also zur grolsten wie I: 100.

Da die angegebenen Mengen Fumarsaure in 2 ccm Wasser gelostsind, stellt die Fumarsaurekonzentration folgende Werte dar: 0,2'­

0,4 - 0,8 - 1- 2 - 4 - 5 - 10 -20 Millimolar.

Tabelle I.

Rohre Fumarsaure EntfarbungszeitenNr. mg Minuten.

K. I Fum.

I 31.52 0,046 243 0,093 214 0,186 185 0,232 16,56" 0,464 147 0,928 14,58 1,160 159 2,320 16

10 4,640 17II 35

E. Diskussion der Tabelle.Wie aus der Tabelle hervorgeht, wird die Entfarbungsgeschwin­

digkeit durch einen Zusatz von Fumarat unzweideutig beschleunigt.Wahrend die Entfarbungsdauer in den Kontrollrohren im Durch­schnitt 33 Min. betragt, sinkt dieselbe schon nach einem Zusatz von46 Mikrogramm auf 24 Min. und erreicht bei einem Zusatz von un­gefahr 0,5 mg ein Minimum von 14 Min., urn dann bei noch gro­Beren Mengen Fumarsaure wieder langsam zu steigen.

Vergleichende Versuche tiber die Indikatorenfirbung bei Zusatzvon Fumarsdure, Apfelsiure und Maleinsaure.

Es sei hier unmittelbar eine Tabelle iiber Versuche mitgeteilt,we1che die in der obigen Uberschrift angedeuteten Verhaltnisse be­leuchten sollten.

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Beziiglich der Ausfiihrung sei auf die im vorstehenden Versuehs­protokoll mitgeteilten Einzelheiten verwiesen, wozu noeh hinzugefiigtsei, daB die Maleinsaurelosungen mit denselben Substanzen Mengenzubereitet wurden, wie die in obenstehendem Versueh benutztenFumarsaurelosungen. Die Kaliummalatlosung, die hier verwendetwurde, war 0, I molar und wurde in der Weise hergcstellt, daf 134 mgr-Apfelsaure mit KOH neutralisiert und dann auf 10 cern verdiinntwurden. Dureh Verdimnen dieser Losung im Verhaltnis I+-4 undI + 24 wurden Losungen von der Starke 0,02 und 0,004 molar her­gestellt.

Tabelle 2.

In dieser Tabelle bedeutet Apt. Apfelsaure, Fum. Fumarsaure,Mal. Maleinsaure. Die unter diesen Rubriken angegebenen Zahlensind die Entfarbungszeiten in Min. Unter Mmol. wird die absoluteMenge, ausgedriickt in Millimol, der drei genannten Sauren ange­geben, die den Vakuumrohren der Serie zugesetzt wurde.

Mmol, Apf. Fum. .i Mal.

o 35 35 350,4 25 31 310,8 18 25 351,6 13 23 372 12 22 384 II 20 388 9 19 45

Wie aus der Tabelle hervorgeht, bewirkt die Apfelsaure in aqui­valenten Mengen eine kraftigere Stcigerung der Entfarbungsgeschwin­digkeit als die Fumarsaure, wahrend dagegen die Maleinsaure, meg­licherweise mit Ausnahme der schwachsten verwendeten Konzen­tration, die Entfarbung nicht beschleunigt, sondern sie im Gegenteilverlangsamt.

Es war zu erwarten, dals ein direkter Zusatz von Apfelsaure, daja der durch die Fumarsaure ausgeubte beschleunigende Einfluf aufdie Indikatorentfarbung auf gebildete Apfelsaure zurilckauftihren ist,wenigstens keine schwachere Wirkung hatte als der Zusatz einer aqui­valenten Menge Fumarsaure. Unter einer gewissen Voraussetzung!ieBe sich denken, daB aquivalente Mengen Fumarsaure und Apfel­saure dieselbe Wirkung ausiiben konnten. Dies wiirde der Fall sein,wenn sich die Gleichgewichtslage Fumarsaure : Apfelsaure sehr schnelleinstellte. In diesem Fall wiirde es fur die Apfelsaurekonzentrationdes Systems und damit auch fur die Entfarbungszeit gleichgiiltigsein, ob man Apfelsaure oder Fumarsaure zusetzte. Beim Zusatz vonApfelsiiure wiirde dann unmittelbar Fumarsaure gebildet werden, bis

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die Gleichgewichtslage erreicht ware. Bei Zusatz von Fumarsaure inaquivalenter Menge wiirde statt dessen unter Bildung von Apfelsauredieselbe Gleichgewichtslage erreicht werden.

Wie aus den Versuchsprotokollen hervorgeht, iibt ein Zusatz vonApfelsaure eine kraftigere beschleunigende Wirkung auf die Mb.­Entfarbung aus als eine aquivalente Menge Fumarsaure. Dieser Urn­stand zeigt, daB die Umsetzung von Apfelsaure zu Fumarsaure undumgekehrt so lange Zeit erfordert, daB das Apfelsaureoptimum bciBeginn des Versuches nicht erreicht war.

Verstreute Beobachtungen.Bei den hier in Frage stehenden Versuchen mit Fumarsaure

wurde eine positive Fumarsaurewirkung nicht nur fur Mb., sondernauch fiir den starker positiven Redoxindikator r-Naphthol-z-Natrium­sulfonat-indo-z.o-dichlorphenol erzielt. Dagegen eignet sich ein sonegativer Indikator wie Indigodisulfonat nicht flir diese Versuche.

Von den vielen Pflanzensamen, die in derselben Weise wie Cu­cumis sativus auf das Vorkommen von Fumarase hin untersuchtworden sind, hatte nur Echinocystis lobata eine an Intensitat der desCucumis-Extraktes vergleichbare Fumarasewirkung.

Die Wirkung bei dem Zusatz von Fumarsaure zu einem mitMb. versetzten Phosphatextrakt von Cucumis sativa und Echino­cystis lobata ist kein allgemeiner Cucurbitaceeneffekt. So wird zwarein Extrakt von Sicyos angulata und Citrullus vulgaris durch einenZusatz von Apfelsaure beeinfluBt, dagegen nicht, wenigstens nichtmit Sicherheit, durch einen Zusatz von Fumarsaure, Indessen findetman einen Fumarsaureeinflufs auch auBerhalb der Familie der Cucur­bitaceen, So erhalt man bei Corydalis nobilis;' einem in frischem Zu­stand ausgepragt malicodehydrogenasereichen Papaveraceensamen,eine positive derartige Wirkung.

Bei dem Versuch, durch Azetonwasche des urspriinglichenGurkensamenpulvers ein reineres Ausgangsmaterial fiir die nachfol­gende Phosphatextraktion zu erhalten, wurde die Beobachtung ge­macht, daB die Azetonwasche, wenn sie bis zu einem gewissen Gradegetrieben wird, zwar die Apfelsauredehydrogenase ziemlich unberiihrtlaBt, wahrend sie dagegen die Fumarasewirkung des Extraktes kraftigverringert. Die nachstliegende Erklarung hierfiir ist, daB die Apfel­sauredehydrogenase fiir lang anhaltende Azetonwasche wenig emp­findlich ist, wahrend die Fumarase leicht dadurch zerstort wird.

Die Moglichkeit, durch Azetonwasche die Fumaratwirkung einesEnzymextraktes zu eliminieren, der primar sowohl auf Apfelsaure alsauf Fumarsaure reagiert, sowie das Vorkommen apfelsaureempfind-

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lieher Samen ohne Empfindliehkeit fiir Fumarsaure sind u. a. Beweisedafiir, daB Malicodehydrogenase und Fumarase verschiedcne Enzymedarstellen.

Zusammenfassung.

Setzt man in Abwesenheit von Sauerstoff einem methylenblauhal­tigen Phosphatextrakt von Cucumis sativus- oder Echinocystis lobat a­Samen Alkalifumarat zu, so wird die Entfarbungsgeschwindigkeit desSystems wesentlich gesteigert. Eine Analyse der Versuchsbedin­gungen zeigt, dafs die Fumarsaure selbst hierbei nieht als Wasser­stoffdonator auftreten kann, Die Fumarsaure muB erst in 1- Apfel­saure umgewandelt werden, die dann unter dem EinfluB der Malicode­hydrogenase als Wasserstoffdonator wirkt. Die Versuche zeigen also,daB die betreffenden Samenarten teils Malicodehydrogenase ent­halten, was schon bekannt war, teils Fumarase. Von den bisher aufFumarase untersuchten Samenarten scheinen die genannten Samendie aktivsten zu sein.

Literatur.

Battelli, F. und Stern, L., Biochem. Z. 1920. 8,.. 305.Hu ckel, W., T'heoretische Gr:undlagen del' Or:ganiscken Ckemie, Leipzig

1935. Zweite Auflage. 2. Band. S. 9.Jacobsohn, K. P., Biochem. Z. 1932. 25,.. IU.

Jacobsohn, K. P., Biochem. Z. 1933.261. 267.Thunberg, T., Skand. Ar:ch.Physiol. 1910. 2". 23.Thunberg, T., Skand. Ar:ch. Physiol. 1920. 1&0, r ,Thunberg, T., Skand. Ar:ch. Physiol. 1934-.69. 247.Thunberg, T., Lunds Unioersitets Ar:sskr:ijt N. F. Avd. 2. 1934· 30.

nrv r j,

Thunberg, T.,·Hand. Bioi. Arb. Meth, 1935. IV. 2.2295·

1 Diese Mitteilung entstand vor dem Erscheinen der wichtigen IetztenArbeit von A. Szent-Gyorgyi c. s. in Hoppe-Seilers Zeitsckrijt Bd.236,H. 1. Die dort gebrachten ganz neuen Gesichtspunkte iiber die Bedeutung derFumarsaure in dem Metabolismus konnten daher hier nicht berucksichtigtwerden,