Der EPO-Rezeptor und seine Funktionen

Das ‘Janus-Gesicht’ der Tumorhypoxie

SchlüsselbotschaftDie überwiegende Mehrzahl hypoxischer Tumorzellen leiden unter diesen

Folgen.Ein kleiner Teil (< 5%?) der Zellen zeigt jedoch ein ganz anderes Verhalten, sie

bestimmen das Schicksal des Krebspatienten.

Hypoxie

VerringerteProliferationDifferenzierungApoptoseNekrose

Adaptive ProzesseAggressiver PhänotypTumorprogressionErworbeneTherapieresistenz

Eine Hypoxie führt zur Selektion eines Phänotyps aggressiver Tumorzellen

Anämie

Hypoxie

Resistenz gegenResistenz gegen ChemotherapieChemotherapieund Bestrahlungund Bestrahlung

Selektionsdruck Selektionsdruck GenominstabilitätGenominstabilität

Adaptationsvorgänge Adaptationsvorgänge

Maligne ProgressionNegative Beeinflussung des langfristigen

Ergebnisses

Schlechte Durchblutung

Teufelskreis von Tumorhypoxie und maligner Progression

Veränderungen der GenexpressionProteomveränderungen (< 1% O2)Tumor-

förderung

Maligne Progression Aggressivität

Genomveränderungen (< 0,1% O2) Klonselektion

Tumorhypoxie(feindliche Mikroumgebung)

Tumorhypoxie/Anämie:– verstärkt die Aggressivität des Tumors– verstärkt die Therapie- resistenz– verkürzt die Überlebenszeit– vermindert die lokale Kontrolle

Vaupel et al. In: Nowrousian MR, ed. Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) in Clinical Oncology. Berlin, Springer, 2002:127–46.

Es gibt einen optimalen Oxygenierungsstatus innerhalb eines geschlechtsspezifischen cHb-Bereichs

Oxygenierungsstatus als Funktion der Hämoglobinspiegel (cHb)

Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66. Vaupel et al. Strahlenther Onkol 2001.

Med

iane

r pO

2 (m

mH

g)

Karzinome im HNO-Bereichn=142Durchschnitt +/- SEM

cHb (g/dl)

Karzinome der Zervix uterin=104Durchschnitt +/- SEM

cHb (g/dl)M

edia

ner p

O2 (

mm

Hg)

Oxygenierungsstatus als Funktion des Oxygenierungsstatus als Funktion des HämoglobinspiegelsHämoglobinspiegels

Vaupel et al. Cancer Res 2003;63:7634–7.

Med

iane

r pO

2 (m

mH

g)

Hb (g/dl)

100806050403020

10865432

18 10 12 14

Normale Mamma

Mammakarzinome

(5) (3) (5) (8) (3)

(3)(9) (9)

(9)

(7)

Tumoroxygenierung und Überleben

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

00 10 20 30 40 50 60 70 80

Zeitraum (Monate)

Ges

amt-Ü

berle

bens

wah

rsch

einl

ichk

eit

Log-Rank p = 0,0039

Zervixkarzinom

Alle behandelten Patientinnen (n = 89)

Medianer pO2 ≥ 10 mmHg(n = 41)

Medianer pO2 < 10 mmHg(n = 48)

Höckel et al. Cancer Res 1996;56:4509–15.

Oxygenierung von normalem Gewebe und Tumoren im HNO-Bereich

NormalerHb-Wert

Leichte AnämieHb F: 11,0–11,9 g/dL

M: 11,0–12,9 g/dL

Mäßige/starkeAnämie (Hb <11 g/dl)

50

0

Gew

ebe -

pO2 (

mm

Hg)

Normalgewebe(M. sternocleidom.)

Tumor

Normalgewebe kann eine leichte Anämie kompensieren; Tumoren können dies nicht

p < 0,0001Tumoren im HNO-Bereich

Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66.

Maximale Tumoroxygenierung im Hb-Bereich zwischen 12,2 und 14,4 g/dl

18

16

14

12

10

Hb

(g/d

l)

0 2 4 6 8 10Zeit (Wochen)

Placebo

EPO

Henke (2003)HNO

Becker (2000), Vaupel (2002)Plattenepithelkarzinom

Medianer pO2 (mmHg)0 4 8 12 16 20

18

16

14

12

10

Henke (2003) RT –Studie lag über diesem Wert

Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66. Henke et al. Lancet 2003;362:1255–60.Vaupel et al. In: Nowrousian MR, ed. Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) in Clinical Oncology. Berlin, Springer, 2002:127–46.

Anämie, Hypoxie und Ergebnis einer Bestrahlung

• Die Entwicklung einer Tumorhypoxie steht mit einer Anämie im Zusammenhang (Hb <13 g/dl)1,2

• Hypoxische Regionen sind bei soliden Tumoren aufgrund einer unzureichenden Blutversorgung und hohem intratumoralem Sauerstoffverbrauch häufig.

• Molekularer Sauerstoff scheint hoch reaktive Hydroxylradikale, die eine DNA-Schädigung vermitteln, zu stabilisieren

• Zum Abtöten von Zellen ist unter hypoxischen Bedingungen im Vergleich zu Normalbedingungen das 2,5- bis 3,5-Fache der Standard-Bestrahlungsdosis erforderlich.

1. Brizel et al. Radiother Oncol 1999;53:113–17.2. Becker et al. Int J Radiat Oncol Biol Phys 2000;46:459–66.

Zusammenfassung zur Tumoroxygenierung

• Nur für Anstiege der Hb-Werte, die zu einer Verbesserung der Tumoroxygenierung führen, ist eine günstige Auswirkung auf die Prognose zu erwarten.

• Bei höheren Hb-Werten (Hb >14 g/dl) ist ein erheblicher Anstieg der viskösen Resistenz innerhalb der chaotischen Mikrogefäße zu erwarten, was zu einer Nettoreduktion der Sauerstoffzufuhr führt (schlechte Tumoroxygenierung)

• Nur Anstiege bis zu den gegenwärtig empfohlenen Hb-Werten führen zu Verbesserungen der Tumoroxygenierung, was die Prognose verbessern kann.

Rekombinante Epoetine verschlechtern die Wirksamkeit einer CT bei Krebs nicht

Ergebnisse• In Mammakarzinom-Zelllinien

– Eine EPO-Therapie beeinträchtigte die antiproliferativen und/oder zytotoxischen Wirkungen von Adriamycin, Taxol und Tamoxifen nicht

• Bei Mäusen– Durch Zugabe von EPO zu Paclitaxel wurde das Therapieergebnis nicht

beeinflusst LaMontagne et al. Mol Cancer Ther 2006;5:347–55.

Gewirtz et al. Clin Cancer Res 2006;12:2232–38.

Prol

ifera

tion

(% d

er K

ontr

olle

n)

Keine

Prol

ifera

tion

(% d

er K

ontr

olle

n)

Kein

e

Kenntnisse über den EPO-Rezeptor

• Offene Fragen– Gibt es auf Tumorzellen EPO-Rezeptoren?– Ist der EPO-Rezeptor auf Tumorzellen

funktionsfähig?– Können ESA in vivo den EPO-Rezeptor auf

Tumorzellen stimulieren?

EPO-Rezeptoren (EPO-R) auf menschlichen Tumoren?

• Indirekte Belege1,2

– Elimination von IHC-Färbung des Tumors bei vorheriger Resorption von EPO-R

– In klinischen Studien lassen sich eine Verringerung des lokoregionalen PFS oder des Gesamtüberlebens in der mit ESA behandelten Gruppe beobachten

• Direkte Belege3

– Demonstration eines EPO-R-Effekts in Tumorzelllinien oder Tumorproben mit polyklonalen Antiseren von Kaninchen (IHC)

– Förderung des Tumorzellwachstums und/oder Therapieresistenz in vitro

1. Osterborg et al. Eur J Cancer 2007;43:510–9. 2. Lai et al. J Clin Oncol 2006;24:4675–6. 3. Sinclair et al. Cancer 2007;110:477–88.

IHC = Immunhistochemie.

Rekombinantes Epoetin ist nicht mit einem Tumorwachstum assoziiert

Präklinische Studien• Untersuchung der EPO-Rezeptor-Expression und Auswirkung

einer Therapie mit rekombinanten Epoetinen auf das Tumorwachstum

Ergebnisse• In Mammakarzinom-Zelllinien

– Es wurde eine EPO-Rezeptor-Expression nachgewiesen– Es war keine spezifische Bindung von Epoetin an den Rezeptor

zu beobachten, was darauf hinweist, dass der EPO-Rezeptor nicht funktionsfähig ist

– Eine Epoetin-Therapie führte nicht zu Tumorwachstum• Epoetin löste keine physiologische Reaktion des Tumors

aus (Proliferation, Migration, Signaltransduktion)

LaMontagne et al. Mol Cancer Ther 2006;5:347–55.Gewirtz et al. Clin Cancer Res 2006;12:2232–38.

Präklinische Studien zur Auswirkung von ESA auf menschliche Tumoren

• Die Mehrzahl der in-vitro- und in-vivo-Studien zeigte eine neutrale Auswirkung

• In einigen wenigen in-vitro- Studien zeigte sich eine gewisse Auswirkung auf die Proliferation und/oder Apoptoseresistenz– Suprapharmakologische Konzentration von ESA– Nicht statistisch signifikant; synchronisierte Zellen– Nicht konsistent, was positive/negative Kontrollen betrifft– Keine eindeutigen Belege für intrazelluläre Signalgebung

Osterborg et al. Eur J Cancer 2007;43:510–9.

Präklinische Daten deuten nicht auf eine Bedeutung von EPO-R für die

Tumorprogression hin• Das EPO-R-Gen ist kein Onkogen, und eine Überexpression dieses

Gens bringt für Tumoren keinen Selektionsvorteil

• EPO-R-mRNA-Spiegel sind in Tumorzelllinien nachweisbar, im Vergleich zu nicht tumorösen Geweben aber nicht erhöht

• Tumorzelllinien zeigen eine schwache oder nicht nachweisbare EPO-Bindung

• Eine Oberflächenexpression von EPO-R auf Tumoren wurde nicht zweifelsfrei gezeigt

• In den meisten klinischen Modellen zeigen sich verbesserte Ergebnisse (keine Tumorprogression in 23 unabhängigen Studien)

Sinclair et al. Cancer 2007;110:477–88.

60

80

40

20

100

020 40 60 80

Wah

rsch

einl

ichk

eit

für L

DFS

(%)

Monate

Placebo

Epoetin beta

Mit RisikoPlacebo 52 28 20 7Epoetin beta 52 18 10 3

p = 0,003A

60

80

40

20

100

020 40 60 80

Wah

rsch

einl

ichk

eit

für

LDFS

(%)

Monate

Placebo

Epoetin beta

Mit RisikoPlacebo 26 10 6 2Epoetin beta 24 11 6 2

p = 0 ,36B

EPO-R pos.

EPO-R neg.

Henke et al. J Clin Oncol 2006;24:4708–13.

• Zusätzliche Analyse einer Studie mit Bestrahlung ± EPO bei Karzinomen im HNO-Bereich

• EPO-R (unter Verwendung von C20 -Antiserum) korrelierte in der EPO-Studie mit einem schlechten Ergebnis

– Seren von 154 oder 351 Originalprobanden– 2/3 exprimierten EPO-R

• Rezeptoraktivität nicht untersucht, nur Expression

– EPO-R-Expression lässt sich ohne Signaltransduktion zeigen

– HSP70-Kontrollen wurden nicht vorgestellt (falls durchgeführt)

• ‘Validierte’ eine Hypothese mit dem gleichen Datensatz, der zu ihrer Formulierung gebraucht wurde

• Sehr große Fehlerwahrscheinlichkeit für Beta-Fehler in der ‘EPO-R-negativen’ Gruppe

Korrelation von EPO-R und EPO mit schlechtem Ergebnis?

Welche weiteren möglichen Erklärungen gibt es?

Anämie

Hypoxie

Chemotherapie-ResistenzChemotherapie-ResistenzBestrahlungsresistenzBestrahlungsresistenz

Selektionsdruck Selektionsdruck Genom-Instabilität Genom-Instabilität

Angiogenese Angiogenese

Maligne Progression

Negative Auswirkungen auf das langfristige Ergebnis

Vaupel et al. Med Oncol 2001;18:243–59.

Kommerzielle polyklonale Anti-EPO-R- Antikörper sind nicht spezifisch und

weisen multiple Proteine nach

EPOR EPOR

Elliott et al. Blood 2006;107:1892–5.

Leer

er V

ekto

r

Leer

er V

ekto

r

Hitzeschockprotein 70 (HSP70)• Sehr gut erhaltene Familie von Chaperon-Proteinen, die in normalen

Zellen durch Stress induziert werden und wichtige Funktionen für das Überleben der Zelle und die Apoptoseresistenz haben

• Die Expression wird bei vielen menschlichen Tumoren verstärkt– Die Expression korreliert bei vielen Tumorarten (Bronchien,

Mamma, HNO, Prostata, Darm, Magen, Blase) mit einem kürzeren Überleben und einer Therapieresistenz

– Die Expression wird unter hypoxischen Bedingungen verstärkt– Eine Hinunterregulierung (z.B. Antisense) induziert den Tod von

Tumorzellen• Homologe Sequenz mit Antigen, das zur Bildung von polyklonalen

Antikörpern C20 verwendet wird (insbesondere HSP70-2 und HSP70-5)

Viele der ‘EPO-R’, die mit C20 nachgewiesen werden, könnten auch HSP70-2 oder HSP70-5 sein

Schmitt et al. J Leukoc Biol 2007; 81:15–27.

Zusammenfassung der Datenlage: ESA sind nicht mit Tumorwachstum/Proliferation assoziiert

• Präklinische und klinische Daten sprechen nicht für die Hypothese, eine ESA-Therapie führe zu Tumorwachstum/-proliferation

• Der Antikörper, der zum Nachweis des EPO-Rezeptors verwendet wird, ist unspezifisch und weist auch das Hitzeschockprotein 70 nach ( HSP70-2, HSP70-5)

• In Modellen heterologer Transplantate wurde EPO-R auf der Plasmamembran von Tumorzellen nicht funktionell exprimiert

• In keiner Studie zeigte sich, dass pharmakologisch relevante ESA-Dosen das Tumorzellwachstum stimulieren

• ESA hatten keinen negativen Einfluss auf die Zytotoxizität einer CT• Erythropoetin war nicht proangiogen und verstärkte die

Metastasenentstehung nicht

Laufende Studien werden Informationen zur Funktion von EPO-R bei Tumoren liefern

Zusammenfassung: Kenntnisse über EPO-R

Offene Fragen• Gibt es auf Tumorzellen EPO-R? • Rezeptoren lassen sich mit Hilfe eines unspezifischen

Antikörpers auf Tumorzellen nachweisen– EPO-R und HSP-70 haben sehr ähnliche Strukturen

• Ist der EPO-R auf Tumorzellen funktionsfähig? • Es gibt keine Belege dafür, dass EPO-R oder HSP-70 durch ESA

aktiviert werden

• Können ESA in vivo EPO-R auf Tumorzellen stimulieren?• Es gibt keine Belege dafür, dass ESA innerhalb der

zugelassenen Anwendungsgebiete bei Patienten mit CT Tumorzellen stimulieren

Kontrolle der Erythropoetin-Synthese

Verlust des GleichgewichtsNormaler Sauerstoffgehalt

Verlust des Gleichgewichts

Stimulus: Hypoxie aufgrund vonverminderter Erythrozytenzahl, verminderter Verfügbarkeit von Sauerstoff im Blut oder gesteigertem Sauerstoffbedarfder Gewebe

Erhöhung des Sauerstoff-gehalts des Plasmas

Verringert den Sauerstoffgehalt des Plasmas

Niere: Freisetzungvon Erythropoetin

Erythropoetin stimuliert das KnochenmarkGesteigerte

Erythropoese erhöht die Erythrozytenzahl

Veränderungen der endogenen Plasmakonzentrationen von Erythropoetin

und Hb-Anstiege

Modified from Al-Huniti et al. J Pharmacol Exp Ther 2004;310:202–8.

HämoglobinEndogenes Erythropoetin

Hb

g/dl

Tage

EPO

mIU

/ml

Liganden-induzierte Dimerisierung des EPO-R und nachfolgende Interaktion mit und Aktivierung

von JAK2

JAK2: Januskinase 2Damen et al. EMBO J 1995; 14:5557–68. Klingmuller et al. Cell 1995;80:729–38.

Extrazellulär

Plasma-membran

Intrazellulär

EPO-R-Aktivierung und Signaltransduktion

Damen et al. EMBO J 1995;14:5557–68. Klingmuller et al. Cell 1995;80:729–38

Inaktiver monomerischerRezeptor

Dimerischer Rezeptorund JAK2-Aktivierung

Gen-transkription

Beendigungder Signalgebung

Internalisierung und Abbau des EPO-R-Komplexes

Modified from Walrafen et al. Blood 2005;105:600–8.

ErythropoetinUbiquitinPhospho-tyrosin

IntrazelluläreSignalgebung

0

100

200

300

400

500

600

700

800

Epoetin alfa Darbepoetin alfa

IC

for E

PO R

ecep

tor B

indi

ng (p

M)

Elliott et al. Blood. 2000;96(abstract 352).

Die Bindungsaffinität für Epoetin alfa ist 4-mal höher als für Darbepoetin

Bindungsaffinität von Epo alfaB

indungsaffinität sinktIC

50 für

die

EPO

-Rez

epto

r-B

indu

ng

(pM

)

Epoetin alfa Darbepoetin alfa