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JOHANNA SCHOLBACH1, MARGARETHE KÖBERLE2, ANJA RODEWOHL3,

FRANZISKA LANGE2

1INSTITUT FÜR KLINISCHE IMMUNOLOGIE, UNIVERSITÄT LEIPZIG2FRAUNHOFER-INSTITUT FÜR ZELLTHERAPIE UND IMMUNOLOGIE, LEIPZIG3TRANSLATIONSZENTRUM FÜR REGENERATIVE MEDIZIN, UNIVERSITÄT LEIPZIG

Animal models are a useful tool to study pathomechanisms and thera -peutic targets in biomedical research. In the last decade the investigationof different humanized mouse models became important in research. Theexistence of human immune cells in immunodeficient mice allows thebridging between rodent model and human immune system. The methodof choice to characterize these humanized mice is flow cytometry. Here,we explain facts about human immune cells in mice and show how todetect them.

DOI: 10.1007/s12268-013-0269-1© Springer-Verlag 2013

ó Tiermodelle sind seit Jahrzehnten einwichtiges Werkzeug der biomedizinischenForschung. Zum einen finden Tiermodelle inder Grundlagenforschung Anwendung, zumanderen dienen sie auch der Erprobung neuerTherapeutika und sind hier aus ethischenGründen nicht mehr wegzudenken. Durch dieVielfalt an Inzucht- und Auszuchtstämmenfindet sich bei der Forschung mit Nagetierenvor allem bei Labormäusen für beinahe jedeKrankheit ein passendes Modell. Nahezuunendlich erweitert sich dieses Feld durchdie modernen Methoden der Gentechnik, daheute sowohl Knock-in- als auch Knock-out-Tiere selbst erzeugt oder kommerziell erwor-ben werden können. Nichtsdestowenigerkommt es häufig vor, dass sich die im Tier-modell gefundenen Sachverhalte nicht auf dieSituation im Menschen übertragen lassen. Sotreten beispielsweise gravierende Nebenwir-kungen eines Medikamentes in der klinischenTestphase auf, obwohl im Tierversuch dieseNebenwirkungen nicht abzusehen waren [1].In weniger schweren Fällen gibt es lediglicheinen Unterschied zwischen dem krank-heitsverursachenden Pathomechanismus imTiermodell und dem tatsächlichen Pathome-chanismus im Menschen.

Der Weg zur humanisierten MausAus dem Wunsch, diese Unzulänglichkeitenzu beheben, ergab sich in den 1980er-Jahrendas Konzept der humanisierten Maus [2]. Beidiesem Tiermodell steht der Gedanke derErschaffung eines humanen Immunsystemsin handlichem Laborformat im Vordergrund.Um die Voraussetzungen dafür zu schaffen,war die Züchtung immundefizienter Mäuseals Ansiedlungsort für die speziesfremdenZellen vonnöten. Vorangegangen war diesemModell eine spontane, zu B- und T-Zell-Defek-ten führende Mutation in Labormäusen [3]. Eswurden humane Stammzellen, aber auch Kno-chenmark, Thymus und embryonales Leber-gewebe in Mäuse transplantiert, dochdie Annahme der Transplante erfolgte inSCID(severe combined immunodeficiency)-Mäusen nur unzureichend durch die Funk-

Biomedizin

Detektion von menschlichen Immun -zellen in der humanisierten Maus

¯ Abb. 1: Charak -terisierung vonmenschlichenImmunzellen in derhumanisierten Maus.A, Der Anteil anhumanem CD45(huCD45) steigertsich von Woche 10 zuWoche 14 und bleibtdann mit kleinenSchwankungen biszum Ende des Beob-achtungszeitraumskonstant. B, DerAnteil an B-Lympho-zyten an huCD45nimmt von Woche 10an ab, wohingegendie T-Lymphozytenzunehmen.

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tionalität der Natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) in diesen Modellen. ErfolgreichereModelle konnten erst mit der Kreuzung vonSCID- und NOD(non-obese diabetic)-Mäusenetabliert werden. Sehr gute Ergebnisse inBezug auf die Annahme eines humanenStammzelltransplantats werden aktuell mitdem Mausstamm der NOD-scid-Il2rγ0-Linieerreicht [4]. Die NOD-Mutation führt zu einemVerlust von NK-Zellen und zu einer vermin-derten Phagozytoseleistung der Makropha-gen. Der IL-2Rγ-Knock-out bezieht sich aufdie γ-Kette des IL-2-Rezeptors, die zur Ver-mittlung der Zytokinantwort benötigt wird.Es resultiert eine verminderte Reaktions-möglichkeit der Maus auf die humanenStammzellen. Somit ist eine Transplantatab-stoßung unwahrscheinlich. Darüber hinausentwickelt sich aus den Stammzellen, die inder Regel aus Nabelschnurblut gewonnen wer-den, ein funktionelles menschliches Immun-system.

Das Aufspüren der menschlichenZellenDie Funktionalität dieses Immunsystemskann mit verschiedenen Möglichkeiten veri-fiziert werden. Im Vordergrund steht in unse-rer Arbeitsgruppe die durchflusszytometri-sche Analyse von verschiedenen Organen derTiere. Häufig untersucht werden Blut, Milzund Knochenmark der Tiere, aber auch ande-

re hämatopoetische Organe [5]. Man machtsich in diesem Fall die Expression unter-schiedlicher Oberflächenantigene der einzel-nen immunologischen Subpopulationenzunutze. Es gibt für viele bekannte Zell -populationen einen solchen spezifischen Mar-ker. B-Lymphozyten lassen sich beispielsweisedurch CD19, T-Lymphozyten durch CD3 undMonozyten durch CD14 charakterisieren. Isteine eindeutige Zuordnung von Zellpopula-tion zu Oberflächenmarker nicht möglich,kann auch durch die Kombination verschie-dener Marker auf eine bestimmte Subpopu-lation geschlossen werden. Eine solche Kom-bination wird zur Identifizierung von Granu-lozyten verwendet. Man macht sich hier zumeinen das Vorhandensein von CD16, zumanderen aber das Fehlen von CD56 zunutze.Hinzu kommen morphologische Eigenschaf-ten der Granulozyten. Es ist auch möglich,über indirekte Kombinationen auf Zellpopu-lationen zu schließen. Diese Kombinationenkönnen sehr weit gefächert sein, wie es beider Charakterisierung von dendritischen Zel-len der Fall ist. Dort werden zuerst über einenLineage-Marker alle Zellen der Hauptpopu-lationen der hämatopoetischen Zelllinie aus-geschlossen. Es handelt sich bei diesem Mar-ker um eine fixe Kombination, die unter ande-rem B-Zellen, T-Zellen und Granulozytendetektiert. Alle Zellen, die auf den Markerpositiv reagieren, werden nicht weiter aus-

gewertet. Dann wird über den HLA-DR-Markerdie verbleibende Population eingegrenzt. AlleHLA-DR-positiven Zellen werden über einenspezifischen dendritischen Zellmarker (CD11cbzw. CD123) als dendritische Zellen erkannt.Diese Vorgehensweise wird notwendig, sobaldmehrere unterschiedliche Zellpopulationengleiche Marker exprimieren. Durch unter-schiedlichste Kombinationen und die Mög-lichkeit, sowohl die positive als auch die nega-tive Expression der Oberflächenmarker zubewerten, können simultan zahlreiche Zell-populationen in einer Probe detektiert wer-den. Speziell in der humanisierten Mausgestaltet sich das Aufspüren der einzelnenSubpopulationen als schwierig. Zumal sichdie menschlichen Immunzellen nach derintrahepatischen Transplantation von CD34+-Zellen in neugeborene, präkonditionierte Tie-re nur langsam entwickeln. Der Anteil derhumanen Leukozyten, die im FACS mit demPan-Leukozytenmarker CD45 angefärbt wer-den, steigert sich über die Zeit und bleibt dannin einem Bereich. Die humanen Leukozytensetzen sich nach ca. zehn Wochen aus einemhohen Anteil von B-Zellen und einem gerin-gen Anteil von T-Zellen zusammen. AndereZellpopulationen wie Monozyten oder NK-Zellen sind nur zu einem geringen Anteil vor-handen (Abb. 1). Dieses Verhältnis ändertsich mit dem Alter der Tiere. Der B-Zell-Anteilsinkt kontinuierlich, während die T-Zell-Popu-

¯ Abb. 2: Durchflusszy-tometrische Untersu-chung von Immunzellpo-pulationen in der huma-nisierten Maus und imMenschen. A, Vorwärts-/Seitwärtsstreuungunter Ausschluss vonZelltrümmern (Lifegate)eines gesunden Men-schen und im Vergleichdazu einer humanisier-ten Maus. Nur die Lym-phozytenpopulationlässt sich morphologischabgrenzen. B, relativerAnteil muriner undhumaner Leukozyteneiner humanisiertenMaus, darunter Anteilvon B- und T-Zellen anLeuko zyten. C, Verände-rung der B- und T-Zell-verteilung bei der Graft-versus-Host-Disease(GvHD) zugunsten der T-Zellen.

A B C

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lation an Größe gewinnt. Zusätzlich tretenvermehrt Monozyten und NK-Zellen inErscheinung. Auch das Vorhandensein vonplasmazytoiden dendritischen Zellen undmyeloiden dendritischen Zellen variiert mitdem Alter. Ein Zustand, der sich in humani-sierten Mäusen zum Teil einstellen kann, istdie Graft-versus-Host-Disease (GvHD), die vorallem durch das massive Auftreten von huma-nen T-Lymphozyten und den Verlust von muri-nen Leukozyten gekennzeichnet ist (Abb. 2).

Sind die humanen Zellenfunktionstüchtig?Um zu verifizieren, ob es sich bei den vor-handenen humanen Zellen tatsächlich umfunktionelle Zellen handelt, können ver-schiedene Parameter bestimmt werden. Hier-bei lässt sich beispielsweise die Expressionvon Oberflächenmarkern im Durchflusszyto-meter bestimmen. Präsentieren bestimmteZellen diese Marker als Antwort auf einenimmunstimulatorischen Reiz, geht man davonaus, dass diese Zelle ein bestimmtes funktio-nales Stadium erreicht hat. Zur Betrachtungdieses Aspekts haben wir die Oberflächen-marker HLA-DR und CD80/CD86 auf Anti-gen-präsentierenden Zellen bestimmt. Auchdie Aktivierung von B- und T-Zellen kannmittels CD25 erkannt werden. Eine weitereMöglichkeit stellt das Messen der Produktionvon Antikörpern wie IgM und IgG, als Nach-weis für die Funktionalität von B-Zellen, dar.Um letztendlich die Interaktion der verschie-denen Zellpopulationen beurteilen zu kön-nen, kommt die Messung einzelner Zytokineinfrage.

Welche Möglichkeiten eröffnet diehumanisierte Maus?Je nach Zeitpunkt nach der Transplantationfindet man Unterschiede in der zellulärenZusammensetzung des humanen Immun-

systems. Diese spielen eine wichtige Rolle fürdie erfolgreiche Etablierung diverser Krank-heitsmodelle in den humanisierten Tieren. Jenachdem, durch welchen Zelltyp die Erkran-kung hauptsächlich vermittelt wird, oder obsich die Immunreaktion innerhalb der Krank-heit vor allem im adaptiven oder angebore-nen Immunsystem abspielt, kommen unter-schiedliche Zeitpunkte für die Induktion desModells nach der Transplantation infrage. Tie-re werden also in unterschiedlichen Alters-stufen für bestimmte Krankheitsbilder nutz-bar. So nimmt man an, dass eine durch dieangeborene Abwehr vermittelte Immunant-wort auch schon kurze Zeit nach der Trans-plantation der Stammzellen möglich ist. Möch-te man jedoch komplexere, adaptiv vermittelteKrankheitsbilder etablieren, so bedarf eseiner längeren Verweildauer der Stammzel-len im Tier. So eröffnet die humanisierte Mausein breites Forschungsspektrum und kannzum einen für die Forschung maligner Tumor-erkrankungen, Infektionen durch HIV [6]oder Dengue-Virus, aber auch zum Erkennt-nisgewinn in Krankheitsbildern wie einerSepsis beitragen. Auch wenn die Etablierungdes Modells eine umfangreiche und von ver-schiedenen Variablen abhängige Prozedurdarstellt, bietet sie eine ausgezeichnete Mög-lichkeit, einen Schritt näher an die Erfor-schung menschlicher Krankheitsprozesseheranzutreten, und wird durch ihren Einsatzin verschiedenen Themengebieten Licht insDunkel bringen. ó

Literatur[1] Suntharalingam G, Perry MR, Ward S et al. (2006)Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonalantibody TGN1412. N Engl J Med 355:1018–1028[2] McCune JM, Namikawa R, Kaneshima H et al. (1988) TheSCID-hu mouse: murine model for the analysis of humanhematolymphoid differentiation and function. Science 241:1632–1639[3] Bosma GC, Custer RP, Bosma MJ (1983) A severe combi-ned immunodeficiency mutation in the mouse. Nature 301:527–530

[4] Ishikawa F, Yasukawa M, Lyons B et al. (2005)Development of functional human blood and immune systemsin NOD/SCID/IL2 receptor {gamma} chain(null) mice. Blood 106:1565–1573[5] Scholbach J, Schulz A, Westphal F et al. (2012)Comparison of hematopoietic stem cells derived from freshand cryopreserved whole cord blood in the generation ofhumanized mice. PLoS One 7:e46772[6] Chargui J, Dye D, Blomberg J et al. (1995) The humanizedsevere combined immunodeficient mouse as a model for pri-mary human humoral response against HIV1 peptides. JImmunol Methods 181:91–100

Korrespondenzadresse:Margarethe KöberleFraunhofer-Institut für Zelltherapie und ImmunologieJohannisallee 30D-04103 LeipzigTel.: 0341-9725-821Margarethe.Koeberle@izi.fraunhofer.de

AUTORINNEN

Franziska Lange, Johanna Scholbach,Anja Rodewohl und Margarethe Köberle(v. l. n. r.)

Die Arbeitsgruppenleiterin Dr. Franziska Lange,die Doktorandin Johanna Scholbach sowie diewissenschaftlichen Mitarbeiterinnen Anja Rodewohl und Margarethe Köberle arbeitenseit 2010 am Projekt „humanisierte Maus“ desFraunhofer- Instituts für Zelltherapie und Immu-nologie, Leipzig. Im Vordergrund stehen die Cha-rakterisierung des Mausmodells sowie die wis-senschaftliche Nutzung im Krankheitsmodell.