Fachbeitrag

MikroFluidik  April 201120

Diagnostika basierend auf AutoantikörpersignaturenAussagekräftige Biomarker als Zukunftstrend in der In-vitro-Diagnostik

Bild 1: Mit dem sciFLEXARRAYER werden Protagen-Slides mit Proteinen bedruckt.

Dr. Stefan Müllner*, Dr. Holger Eickhoff**, Almut Gebhard**, Katrin Welzel**)

__________ *)  Protagen AG, Dortmund, stefan.muellner@protagen.de, www.protagen.de. 

**) Scienion AG, Berlin und Dortmund, eickhoff@scienion.de, gebhard@scienion.de, welzel@scienion.de, www.scienion.de. 

Eine genaue Diagnose ist Voraus-setzung für die richtige Therapie-entscheidung. Und: Je früher und je präziser die Diagnose erfolgen kann, desto größer die Aussicht

auf den Therapieerfolg. Eindrück-liches Beispiel sind die Überle-bensraten von Krebspatienten,

die eindeutig mit dem Zeitpunkt der Erkennung des Krebsstadiums korrelieren. Der Bedarf an schnel-

leren und verlässlicheren diagnos-tischen Tests ist insbesondere im Hinblick auf die Entwicklungen in der Personalisierten Medizin sehr hoch. Der folgende Beitrag fokus-siert sich auf die Entwicklung und den Einsatz von Protein-Microar-rays, die in Zukunft Therapieaus-wahl und Patientenstratifikation

erleichtern werden – veranschau-licht an den Indikationen Prostata-

krebs und Multiple Sklerose.

Identifizierung und Einsatz von Biomar-kern  charakterisieren  einen  zentralen 

Zukunftstrend der medizinischen For-schung. Laut einer 2010 veröffentlichten Marktstudie von Business Insights Ltd. ist die Anzahl an klinischen Studien unter Einsatz von Biomarkern in den letzten Jah-ren um das Zehnfache gestiegen. Dabei unterscheidet man Stratifizierungsmarker (bessere Auswahl der Studienkohorte)

und Biomarker zum Therapiemonitoring. Die dynamisch wachsenden Erkenntnisse der Molekularbiologie haben in den ver-gangenen Jahren dazu geführt, dass eine Vielzahl DNA-basierter Tests entstanden ist und dieser Trend setzt sich weiter fort. Tatsächlich sind es aber die Proteine, welche die biologischen Funktionen im Körper ausüben, und ihre Vielfalt sowie Komplexität übersteigt die der Gene bei weitem.  Im  Folgenden  soll  daher  eine neue Technologieplattform zur Auswahl und zum Einsatz von Protein-Biomarkern vorgestellt werden.

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Die Technologieplattform

Die  Protagen  AG,  Dortmund,  nutzt  die proprietäre    UNIarray-Plattform, um indikationsspezifische Autoantikörper-Signaturen  im  Blut  festzustellen  und  auf dieser Basis diagnostische Tests zu ent-wickeln. Autoantikörper sind nicht etwa ausschließlich  pathogenen  Ursprungs, sondern bilden einen elementaren Be-standteil des Immunsystems. Daher kön-nen sie  im Blut eines  jeden, d.h.  sowohl bei Kranken als auch bei Gesunden, auf Grund ihrer relativ hohen Konzentration und Stabilität sehr leicht nachgewiesen werden. Allerdings unterscheiden sich  je nach Krankheit und Krankheitsstadium die Sequenz und Anzahl der korrespondieren-den Antigene. Andererseits unterschei-den sich die Autoantikörper physikalisch praktisch nicht, so dass sich spezifische Signaturen mit herkömmlichen Technolo-gien nicht bestimmen lassen. Bietet man nun aber eine möglichst große Menge an  unterschiedlichen  humanen  Protei-nen auf einer Oberfläche als „Köder“ an –  UNIarray®  nutzt  hier  circa  40 000  Bin-dungspartner  –  so  lassen  sich  aus  dem Blut die spezifischen Autoantikörper sehr einfach „herausfischen“. Indikationsspezi-fische Autoantikörper-Signaturen wurden bereits bei praktisch allen chronischen Er-krankungen nachgewiesen.

Die Nutzung des Nachweises von Au-toantikörpern in Serum/Plasma bzw. Ce-rebrospinal-Flüssigkeit (CSF, Liquor) hat außerdem gegenüber anderen Biomar-kern einige weitere Vorteile:• Nahezu unbegrenzte Haltbarkeit bei

richtiger Lagerung aufgrund spezi-fischer Struktur und Stabilität von An-tikörpern.

• Nutzung sehr robuster und gut repro-duzierbarer Technologien zum Nach-weis und zur Quantifizierung, da Anti-körper in ausreichender Konzentration in Serum/Plasma und CSF enthalten sind.

• Eine Anreicherung oder komplizierte Probenvorbereitung ist nicht notwen-dig aufgrund ihrer spezifischen und hochaffinen Bindungsmöglichkeit an ihr korrespondierendes Autoantigen. Die  Anreicherung  erfolgt  quasi  wäh-rend der Analyse durch Bindung an das korrespondierende Autoantigen.

• Die Probennahme ist unabhängig von Tageszeit,  Nahrungsaufnahme  etc., da die Antikörperproduktion der B-Zellen keinem  circardianen  Rhythmus  unter-liegt.

• Die Nutzung von Autoantikörpern in der Diagnostik hat das Potential zur Entwicklung von prognostischen Tests.  Studien  in  den  USA  mit  an  Sys-temischem  Lupus  erythematodes erkrankten Patienten haben kürzlich

nachgewiesen, dass bestimmte Auto-antikörper schon 10 Jahre vor Krank-heitsausbruch nachweisbar sind.Die unter dem Begriff UNIarray  zu-

sammengefasste Technologieplattform von Protagen erlaubt nun sowohl die systematische Identifizierung und Vali-dierung von indikationsspezifischen Bi-omarkern als auch die Herstellung und Nutzung von diagnostischen Produkten in Form von Protein-Microarrays. Protagen besitzt fünf gewebsspezifische Expressi-onsbibliotheken, welche in etwa 200 000 Klonen mehr als 40 000 Expressionspro-dukte von circa 10 000 humanen Genen repräsentieren. Mit diesen putativen Au-toantigenen kann die Interaktion von Im-munglobulinen aus Patientenserum sehr schnell  und  sicher  nachgewiesen  wer-den. Zusammen mit akademischen Part-nern wurden von Protagen bereits Prote-in-Biomarker für zahlreiche Indikationen, so etwa Multiple Sklerose, Rheumatoide Arthritis, Prostatakarzinom, Morbus Par-kinson,  Alzheimer,  Systemischer  Lupus, Alopecia areata und Dilatative Cardiomy-opathie identifiziert und zum Patent an-gemeldet. Derzeit sind bei Protagen die Entwicklungsprogramme für die Indikati-onen Prostatakrebs und Multiple Sklero-se am weitesten fortgeschritten.

Prostatakrebs-Diagnostik

Prostatakrebs ist mit 26 % mittlerweile die häufigste Krebserkrankung bei Män-nern und verursacht 10 % der Krebsster-befälle in Deutschland. Nach einer Schät-zung des Robert-Koch-Instituts werden ab 2010 pro Jahr mehr als 64 300 neue Fälle diagnostiziert. Neben dem gesetz-lichen Früherkennungsprogramm, das ab dem 45. Lebensjahr jährlich die Un-tersuchung  der  Geschlechtsorgane  und eine  Untersuchung  der  Prostata  durch Tastbefund beinhaltet, ist der PSA-Test, eine immunologische Quantifizierung des „Prostata-spezifischen Antigens“ im Blut, sehr bekannt und verbreitet. Auf-grund der unzureichenden Sensitivität und Spezifität wird der PSA-Test jedoch nicht für die generelle Früherkennung in Deutschland  empfohlen  und  daher  die Kosten von den gesetzlichen Kranken-kassen nicht erstattet. In den USA wird der PSA-Test ab dem Alter von 50 Jahren empfohlen. Wobei ein erhöhter PSA-Wert allerdings nicht mit einer Krebsdiag-nose gleichzusetzen ist. Vielmehr gibt er einen Hinweis darauf, wann eine Biopsie angezeigt ist. Aber auch mit der Biopsie lässt sich Krebs nicht immer mit Sicher-heit  feststellen.  Tragischer  Weise  kann dies erst nach der operativen Entfernung der  Prostata  festgestellt  werden.  Dies hat erhebliche Konsequenzen für die be-

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Fachbeitrag

MikroFluidik  April 201122

troffenen Patienten. Daher ist der Bedarf nach einem sicheren diagnostischen Test für Früherkennung, Verlaufskontrolle und Nachsorge sehr hoch. 

Das Ziel von Protagen ist gegenwärtig, das bereits identifizierte und verifizierte Panel von derzeit 408 Protein-Biomarkern auf seine Eignung zur Differenzierung zwischen gutartiger Prostata-Vergröße-rung und Prostatakrebs im Rahmen einer klinischen  Validierungsstudie  mit  1000 Patientenproben zu überprüfen. Hierfür wurden internationale Partner aus den USA (Johns Hopkins University, Baltimo-re), Österreich (Medizinische Universität Innsbruck) und Deutschland (Universität Münster) gewonnen.

Diagnostik der Multiplen Sklerose

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoim-munerkrankung, die mit einer Prävalenz von 1 : 1000 und einer Inzidenz von 7 : 100 000  in  Mitteleuropa  eine  der  häu-figsten neurologischen Erkrankungen ist. Die Erstmanifestation liegt über-

wiegend im jungen Erwachsenenalter. Allein in Deutschland sind ca. 130 000 Patienten, etwa 2/3 Frauen, von dieser Krankheit betroffen. Jährlich werden ca. 2500 Menschen neu mit MS diagnosti-ziert. MS ist zwar nicht heilbar, jedoch sind zahlreiche Therapiemöglichkeiten verfügbar, welche darauf abzielen, die größtmögliche Lebensqualität zu ge-währleisten.

Die meisten der bekannten Anfangs-beschwerden können eventuell auch andere Ursachen haben. Es dauert des-halb oft Monate, zuweilen auch Jahre, bis die Diagnose eindeutig feststeht. Daher ist eine sichere Frühdiagnose entscheidend für Therapieauswahl und -beginn.

In  Kooperation  mit  dem  Klinikum Lüdenscheid, dem Karolinska Institut Stockholm, der TU München und dem Accelerated Cure Project, Waltham, USA, führt Protagen derzeit auch für diese  Indikation  eine  klinische  Validie-rungsstudie mit 1000 Patientenproben durch. Ziel ist es hier, durch intelligentes Studiendesign eine finale Auswahl von relevanten Markerproteinen für den ersten Serum-basierten diagnostischen Test für MS zu treffen. Das validierte Marker-Panel wird dann zu einem Test-kit weiterentwickelt.

Diagnostische Protein-Microarrays

Im Unterschied zur Herstellung der längst etablierten DNA-Arrays erweist sich die Produktion von Protein-Arrays als diffiziler, denn Proteine umfassen eine heterogene Gruppe von Molekülen. Um eine mög-lichst uneingeschränkte Funktionsfähig-

Bild 2: Die Hybridisierungsstationen für die UNIchips ermöglichen einen Tages-durchsatz von 48 Antikörper-Analysen.

Bild 3: Die Qualität der Proteine wird bei Protagen routinemäßig mittels Massenspek-trometrie überprüft.

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Bild 4: Dispensierung von harnstoffhaltigen Lösungen mit piezoaktuierten Dispen-sierdüsen aus Glas. Das grüne Rechteck repräsentiert die „region of interest“ für die Tropfenanalyse, das rote Rechteck ist eine Softwarefunktion zur Identifikation der Düsenfrontplattengüte. Links ist eine unbeschichtete Düse abgebildet, an der einige Harnstoffablagerungen an der Dispensierspitze leicht zu erkennen sind. Rechts ist eine Düse gleichen Typs abgebildet, die mit einer speziellen Beschichtung versehen ist, die die Anhaftung von Materialien erschwert. Hier sind keine Ablagerungen zu erkennen. Gezeigt sind Stroboskopaufnahmen von dispensierten Tropfen. Bei gleichen Einstel-lungen ist klar ersichtlich, dass der Tropfen in der verkrusteten Düse eine wesentlich langsamere Tropfengeschwindigkeit und eine größere Ablenkung aufweist.

Dispensiersystem sciFLEXARRAYER �� 19

Scienion, Berlin, Tel. 030/6392-1700, Fax 6392-1701, www.scienion.de

keit  der  Proteine  auf  einem  Microarray zu erhalten, müssen zahlreiche Parame-ter wie Markierung, Pufferauswahl oder Waschprozeduren individuell angepasst werden. Neben der notwendigen Proto-kolletablierung und Laborautomatisierung sind schließlich für die angestrebte Zulas-sung eines diagnostischen Tests Präzision, Reproduzierbarkeit und Qualitätskontrolle entscheidende  Kriterien,  um  eine  gleich-bleibend hohe statistische Sicherheit der diagnostischen Aussage zu gewährleisten. Die Scienion AG hat sich als Experte in die-sem Bereich etabliert und bietet ein Tech-nologieportfolio, das über ein Jahrzehnt konsequent ausgebaut wurde.

Protein-Arrays, insbesondere Hoch-dichte-Protein-Arrays,  werden  in  der  Re-gel mit „Kontaktverfahren“ produziert. Dabei taucht ein Stahlstift, der entweder massiv ausgeformt ist („solid pin“) oder als geschlitzter  und  nach  dem  Prinzip  einer Füllerspitze arbeitender Stift („split pin“ oder „quill pin“) in die zu übertragende Lösung ein, und durch Adhäsion oder Ka-pillarkraft wird ein schlecht definiertes Volumen am Stift gehalten, was dann mit einem Nadeldruck auf die Oberfläche der Wahl übertragen wird (Eickhoff H, Konthur Z, Lueking A, Lehrach H, Walter G, Nord-hoff E, Nyarsik L, Büssow K: Protein array technology: the tool to bridge genomics and proteomics. Adv Biochem Eng Bio-technol; 2002;77:103-12). Bei den hier beschriebenen und verwendeten, rekom-binant hergestellten Proteinen wird in einem 4...8 M Harnstoffpuffer gearbeitet, der in der Routineproduktion von Arrays einige Schwierigkeiten bereiten kann. Da sehr schnell kristallisierend, können sich bei den verwendeten Nadeldruckverfah-ren während des Druckvorgangs Kristalle an den Nadelspitzen anlagern und so für ein unschönes Druckbild sorgen, was den Produktionsprozess und die Ausbeuten an Microarrays massiv beeinträchtigen kann.

Diese Kristallisationseffekte sind bei kontaktfreien Druckverfahren genauso präsent, können aber wesentlich besser kontrolliert  werden.  Dies  ist  durch  zwei wesentliche Faktoren bedingt: So sind die radialen Öffnungen der Dispenserdü-sen zwischen 50 und 100 µm klein, was bedeutet, dass die für eine Kristallisation notwendige  Verdunstung  nur  in  einem sehr  marginalen  Maße  eintreten  kann. Und  zweitens:  Kommt  es  trotzdem  zu Ablagerungen, beispielsweise nach ei-ner Probenaufnahme an der Außenseite der  Dispenser,  kann  dies  durch  spezielle Beschichtungen an den Dispensern mas-siv eingeschränkt bis ausgeschlossen werden.  Speziell  zu  diesem  Zweck  hat Scienion spezifische Beschichtungen ent-wickelt, die eine Ablagerung der Kristal-le an der Dispenseroberfläche aus Glas erschweren bzw. unmöglich machen und

somit die Grundlage für eine Produktion von diagnostischen Arrays auch in Fließ-bandverfahren schaffen.

Für die hier beschriebene Anwendung wurde  ein  Dispensiersystem  der  sci- FLEXARRAYER-Produktfamilie verwendet, die mittlerweile weltweit führend bei der Produktion von planaren Multipara-

meter-Tests ist. Je nach Anwendung und Durchsatz stehen sechs Größenversionen mit diversen Optionen zur Auswahl. Allen Geräten liegt dieselbe Technologie – das kontaktfreie und hochpräzise Dispen-sieren von Volumina im Piko- bis Nano-liter-Bereich  –  zu  Grunde,  wodurch  ein schneller und einfacher Transfer von der Entwicklung in die Produktion garantiert ist. Mit den Systemen können biologische Substanzen, z.B. DNA, Oligonukleotide, Peptide, Proteine, Antikörper oder Gly-kane auf alle Formate von Glasträgern, Filterpads,  Biosensoren,  Siliziumwafern, Polymeren, MALDI-Targets bis zu Mikro-titerplatten gespottet werden. Die Abga-be der zu dispensierenden Substanzen erfolgt  als  einzelner  Tropfen  oder  als Summe von Tropfen in Millisekunden von höchster Präzision und weist einen online gemessenen Dispensierfehler von weni-ger als 2,5 % auf. Die hochentwickelten

optischen Systeme für die Tropfen- und Target-Erkennung ermöglichen eine Kon-trolle der produzierten Arrays und garan-tieren damit eine gleichbleibend hohe reproduzierbare Qualität, die sich unter anderem durch hohe Sensitivität und ex-zellente  Morphologie  der  Spots  messen lässt.

Für die Durchführung der oben er-wähnten multizentrischen Validierungs-studien von Protagen stellt Scienion Protein  Microarray  Batches  mit  jeweils über 3500 Einzelproteinen ISO-9001-2008-konform her. Höchste Qualität und Reproduzierbarkeit zeichnen die Microar-ray-Chargen in Stückzahlen von jeweils mehr als 1000 Arrays aus. Durch Nutzung der sciFLEXARRAYER-Technologie lässt sich die notwendige Konstanz in Qualität und Eigenschaften in drei Stufen realisie-ren: von Spot zu Spot, von Array zu Array und von Batch zu Batch.