Aus der Plastisch- und Handchirurgischen Klinik

der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Direktor: Prof. Dr. med. R.E. Horch

Die antiapoptotische und antiinflammatorische Wirku ng von

Insulin und Propranolol in LPS-stimulierten THP-1

Makrophagen

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde

der Medizinischen Fakultät

der

Friedrich-Alexander-Universität

Erlangen-Nürnberg

vorgelegt von

Thomas Hrach

aus

Ansbach

Gedruckt mit Erlaubnis der

Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Univ ersität

Erlangen-Nürnberg

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler

Referent: Prof. Dr. med. R. E. Horch

Koreferent: Priv.-Doz. Dr. med. J. Schmidt

Tag der mündlichen Prüfung: 18. Mai 2011

Diese Arbeit widme ich in großer Liebe

meinen Eltern, meiner Schwester Barbara und meiner Freundin Jana.

Ich bin unendlich froh und dankbar, dass es euch gibt.

Inhaltsverzeichnis

1. Zusammenfassung 1

2. Einleitung 5

3. Material und Methoden 12

3.1 Zellkultur 12

3.2 Stimulation der Zellen 12

3.3 Trypanblaufärbung 14

3.4 Zellproliferationsassay 14

3.5 Apoptose 14

3.5.1 TUNEL Färbung 14

3.5.2 JC-1 Färbung 15

3.6 Zytokinspiegelbestimmung 16

3.6.1 Interleukin-1β ELISA 16

3.6.2 Tumornekrosefaktor α ELISA 16

3.7 Statistische Auswertung 17

4. Ergebnisse 18

4.1 Zellvitalität 18

4.1.1 Reduktion der Zellvitalität von THP-1 Zellen durch Lipopoly-

saccharid 18

4.1.2 Einfluss von Insulin auf die Zellvitalität in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen 19

4.1.3 Einfluss von Propranolol auf die Zellvitalität in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen 22

4.2 Zellaktivität 25

4.2.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die Zellaktivität von THP-1

Zellen 25

4.2.2 Einfluss von Insulin auf die Zellaktivität in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen 25

4.2.3 Einfluss von Propranolol auf die Zellaktivität in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen 27

4.3 Apoptose 29

4.3.1 JC-1 Färbung 29

4.3.1.1 Induktion von Apoptose in THP-1 Zellen durch Lipopolysaccharid 29

4.3.1.2 Einfluss von Insulin auf den apoptotischen Effekt von LPS in

THP-1 Zellen 31

4.3.1.3 Einfluss von Propranolol auf den apoptotischen Effekt von LPS

in THP-1 Zellen 35

4.3.1.4 Einfluss des NF-κB Signalwegs auf die Apoptose in

LPS-stimulierten THP-1 Zellen 38

4.3.1.4.1 Einfluss des NF-κB Signalwegs auf die Reduktion der

LPS-induzierten Apoptose durch Insulin 39

4.3.1.4.2 Einfluss des NF-κB Signalwegs auf die Reduktion der

LPS-induzierten Apoptose durch Propranolol 40

4.3.1.5 Einfluss des PI3-K Signalwegs auf die Apoptoseinduktion in

LPS-stimulierten THP-1 Zellen 41

4.3.2 TUNEL Färbung 43

4.3.2.1 Induktion von Apoptose in THP-1 Zellen durch Lipopolysaccharid 43

4.3.2.2 Einfluss von Insulin auf den apoptotischen Effekt von LPS in

THP-1 Zellen 45

4.3.2.3 Einfluss von Propranolol auf den apoptotischen Effekt von LPS in

THP-1 Zellen 48

4.4 Inflammation 51

4.4.1 Interleukin-1β 51

4.4.1.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die IL-1β Expression in

THP-1 Zellen 51

4.4.1.2 Einfluss von Insulin auf die IL-1β Expression in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen 52

4.4.1.3 Einfluss von Propranolol auf die IL-1β Expression in

LPS-stimulierten THP-1 Zellen 53

4.4.2 Tumornekrosefaktor α 54

4.4.2.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die TNFα Expression in

THP-1 Zellen 54

4.4.2.2 Einfluss von Insulin auf die TNFα Expression in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen 55

4.4.2.3 Einfluss von Propranolol auf die TNFα Expression in

LPS-stimulierten THP-1 Zellen 56

5. Diskussion 57

5.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die Makrophagenkultur 58

5.2 Einfluss von Insulin auf LPS-stimulierte Makrophagen 58

5.3 Einfluss von Propranolol auf LPS-stimulierte Makrophagen 60

5.4 Rolle des NF-κB Signalwegs für die antiapoptotische Wirkung von

Insulin und Propranolol 61

5.5 Rolle des PI3-K Signalwegs für die antiapoptotische Wirkung von

Insulin 63

6. Ausblick 65

7. Literaturverzeichnis 66

8. Abkürzungsverzeichnis 74

9. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen 76

10. Anhang 76

11. Danksagung 90

12. Lebenslauf 91

- 1 -

1. Zusammenfassung

1A.1 Einleitung

Die Therapie septischer Patienten stellt für den Kliniker nach wie vor eine

Herausforderung dar. Neben der kausalen Therapie mit Antibiotika gibt es viel-

versprechende Ansätze mit verschiedenen Anabolika, wie Insulin und β-Blockern,

die sich in der klinischen Erprobung befinden. Über die Wirkmechanismen dieser

anabolen Substanzen auf das Immunsystem auf zellulärer und molekularer Ebene

ist bisher noch wenig bekannt. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Effekte von

Insulin und Propranolol auf das Zellüberleben, die Zellaktivität, die Apoptose und die

proinflammatorische Antwort in humanen Makrophagen zu bestimmen, die mit

Lipopolysaccharid (LPS) stimuliert wurden.

1A.2 Material und Methoden

Humane Makrophagen (THP-1) wurden mit LPS stimuliert und anschließend mit

Insulin oder Propranolol behandelt. Zudem wurde eine Negativkontrolle unter

alleiniger Gabe von Kulturmedium durchgeführt. Die Zellvitalität wurde anhand der

Trypanblaufärbung ermittelt. Um die Zellaktivität zu ermitteln, wurde der

Zellproliferationsassay (MTS) verwendet. Die Apoptoserate wurde mittels JC-1

Färbung sowie der TUNEL Färbung detektiert. Um festzustellen, ob die Effekte des

Insulins über den PI3-K Signalweg vermittelt werden, wurde der PI3-K Inhibitor

Wortmannin verwendet. Da bei der Apoptose auch der NF-κB Signalweg eine

zentrale Rolle spielt, wurde der NF-κB Blocker TPCK verwendet, um die Effekte von

Insulin und Propranolol auf zellulärer Ebene zu untersuchen. Die TNFα und

IL-1β Konzentrationen wurden in den Zellkulturüberständen gemessen, um die

Effekte von Insulin und Propranolol auf die Expression proinflammatorischer

Zytokine zu untersuchen.

1A.3 Ergebnisse

Die wichtigsten Ergebnisse werden im Folgenden zusammengefasst:

1. LPS reduzierte die Zellvitalität in THP-1 Zellen dosisabhängig. Dieser Effekt

konnte durch Gabe von Insulin oder Propranolol aufgehoben werden. Ideal

erscheinen hier Dosen von 5U/ml Insulin bzw. 10µM Propranolol.

2. LPS reduzierte die Zellaktivität dosisabhängig. Die Behandlung der LPS

stimulierten THP-1 Zellen mit Insulin bzw. Propranolol zeigte keine relevante

Änderung der Zellaktivität.

- 2 -

3. LPS induzierte dosisabhängig Apoptose in THP-1 Zellen. Insulin und

Propranolol wirkten in Kombination mit LPS antiapoptotisch. Unter

Verwendung des PI3-K Inhibitors Wortmannin konnte in der vorliegenden

Arbeit eine Vermittlung der zytoprotektiven und antiapoptotischen Effekte

von Insulin über den PI3-K Signalweg nachgewiesen werden. Für die

Wirkungen von Propranolol scheint der NF-κB Signalweg mitverantwortlich

zu sein. Dies konnte mit Hilfe des NF-κB Inhibitors TPCK nachgewiesen

werden.

4. LPS erhöhte die Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine IL-1β und

TNFα in THP-1 Zellen. Die Ausschüttung von IL-1β in endotoxämischen

THP-1 Zellen konnte durch die Gabe von Insulin zu Beginn der Inflammation

signifikant gemindert werden. Die Gabe von Propranolol zeigte auf die IL-1β

Sekretion keinen signifikanten antiinflammatorischen Effekt. Die

Ausschüttung von TNFα in endotoxämischen THP-1 Zellen konnte durch die

Applikation von Insulin signifikant gemindert werden. Die Ausschüttung von

TNFα konnte in der späten Inflammationsreaktion durch Applikation von

Propranolol signifikant gemindert werden.

1A.4 Praktische Schlussfolgerung

Die hier erarbeiteten Ergebnisse bieten insbesondere hinsichtlich der

antiapoptotischen und zytoprotektiven Wirkungsmechanismen von Insulin und

Propranolol einen erheblichen Erkenntnisgewinn. Es besteht allerdings noch

erheblicher Forschungsbedarf, um diese Effekte vollständig zu verstehen. Inwiefern

sich diese Erkenntnisse auf den klinischen Alltag und insbesondere auf die Therapie

septischer Patienten übertragen lässt, muss anhand weiterer klinischer Studien

belegt werden.

- 3 -

1B.1 Introduction

Insulin decreases the incidence of sepsis and improves mortality of critically ill

patients. In endotoxemic as well as in thermally injured rats, insulin attenuates

the systemic inflammatory response by decreasing the proinflammatory and

increasing the antiinflammatory cascade. The aim of the present study was to

determine the effects of insulin and propranolol on cell survival, cell activity,

apoptosis, and proinflammatory response in a human macrophage-like cell line

(THP-1 cells) stressed with lipopolysaccharide (LPS).

1B.2 Materials and methods

Human macrophages were stressed with LPS and received either saline, insulin

or propranolol. Cell viability was analyzed by MTS, apoptosis was detected using

JC-1 and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labeling-

staining. To elucidate on the insulin signaling pathway, wortmannin was used as

a phosphatidylinositol-3-kinase inhibitor. To elucidate on the propranolol

signaling pathway N-p-tosyl-L-phenylalaninchloromethylketon was used as a

NF-κB inhibitor. Tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-1beta (IL-1β) were

measured to determine the effect of insulin and propranolol on proinflammatory

cytokine expression.

1B.3 Results

The main results are displayed in the following:

1. LPS reduced the overall cell viability in THP-1 macrophage cell line. This

effect could be completely abolished by the addition of insulin or propranolol.

Ideal seemed to be the use of doses of 5U/ml insulin respectively 10µM

propranolol.

2. LPS reduced the cell activity in a dose-dependent-manner. The treatment of

endotoxemic THP-1 macrophages showed no effect on cell activity, when

doses of 5U/ml insulin respectively 10µM propranolol were administered.

3. LPS induced apoptosis in THP-1 macrophages. Insulin and propranolol

blocked these proapoptotic effects. Ideal seemed to be the use of doses of

5U/ml insulin respectively 10µM propranolol. Using the PI3-K inhibitor

wortmannin we could show that the cytoprotective and antiapoptotic effects

of insulin were partly mediated through the PI3-K signaling pathway.

Considering the effects of propranolol, the NF-κB signaling pathway might

play a crucial role. This could be demonstrated using the NF-κB inhibitor

TPCK.

- 4 -

4. LPS increased the expression of the proinflammatory cytokines IL-1β and

TNFα in the cell culture supernatants after 4, 8, 12, 24 hours. The addition of

insulin at early time points (4, 8 hrs) significantly attenuated the expression

of IL-1β. The addition of propranolol did not show any significant

antiinflammatory effect on the IL-1β expression. The release of TNFα in

endotoxemic THP-1 macrophages was significantly decreased by 15U/ml

insulin. The release of TNFα could be significantly decreased by the addition

of 1 or 10µM propranolol especially at later time points (12, 24 hrs).

1B.4 Conclusions

The acquired results indicate that insulin and propranolol exert antiapoptotic

effects and reduce the expression of proinflammatory cytokines in endotoxemic

human macrophages.

The antiapoptotic effects are mediated via the phospatidylinositol-3-kinase-

pathway and the NF-κB pathway.

- 5 -

2. Einleitung

Die Sepsis stellt die systemische Reaktion des Körpers auf eine Infektion dar.

Hierbei gibt es meist einen Sepsisherd, der die Symptome verursacht. Dieser kann

seinen Ursprung in den verschiedensten Organsystemen haben. Am häufigsten ist

jedoch die Urosepsis, das heißt, dass hier der Infektionsfokus im Urogenitalsystem

zu suchen ist.29,57 Von dort aus streuen die Mikroorganismen, meist Bakterien, in

seltenen Fällen auch Viren, Pilze oder Parasiten und gelangen somit in den

Blutkreislauf. Das Immunsystem antwortet darauf mit einer proinflammatorischen

Reaktion und schüttet Zytokine aus, die diese positive Immunantwort unterhalten.58

Für die Proinflammation sind hier unter anderem Tumornekrosefaktor (TNF) alpha

und Interleukin (IL-) 1 verantwortlich.3,14,42,52 Beide Polypeptide werden zu Beginn

der septischen Kaskade sezerniert. Das proinflammatorische Zytokin TNF alpha,

ebenfalls unter dem Namen Kachexin bekannt, wird von Monozyten und

Makrophagen produziert und in die Blutbahn abgegeben. Es ist dort z. B. in der

Lage neutrophile Granulozyten zu stimulieren. Außerdem führt TNF alpha zu einem

Verschluss tumorversorgender Blutgefässe, was zu einer Nekrose der Tumorzellen

führen kann. IL-1, auch endogenes Pyrogen genannt, existiert in zwei molekularen

Unterformen, IL-1 alpha und IL-1 beta.29 Beide haben annähernd die gleiche

proinflammatorische Potenz. Sie sind u. a. in der Lage die Synthese von „Akute-

Phase-Proteinen“ in den Hepatozyten zu stimulieren, wirken auf polymorphkernige

Zellen wie Leukozyten chemotaktisch und stimulieren die Freisetzung dieser Zellen

aus dem Blut und Knochenmark.

Es können aber auch nichtinfektiöse Ursachen, wie zum Beispiel ein schweres

Trauma oder eine Pankreatitis, ein der Sepsis klinisch ähnliches Bild hervorrufen.

Dies wird als SIRS (systemic inflammatory response syndrome) bezeichnet.21,57

Gelingt es dem Körper nicht, die proinflammatorische Immunreaktion mittels

gegenregulatorischer Mechanismen, der so genannten Antiinflammation,

einzudämmen, kommt es zur Hyperinflammation. Dies kann dann zum Vollbild der

Sepsis führen, dem so genannten Septischen Schock. Von einem septischen

Schock spricht man, wenn durch die Sepsis ein Blutdruckabfall um mindestens

40mmHg hervorgerufen wird, der auch durch adäquate Volumensubstitution nicht

mehr zu beheben ist. Dies führt in der Folge zu Mikrozirkulationsstörungen und

somit auch zu einer Perfusionseinschränkung der Organe. Die Organdysfunktion,

die zum Beispiel durch eine Laktatazidose oder eine Oligurie in Erscheinung tritt,

kann bei Fortschreiten der Erkrankung in einem Multiorganversagen resultieren.

- 6 -

Sind hierbei mehr als zwei Organe betroffen, beträgt die Letalität nahezu hundert

Prozent.36

Um klinisch die Diagnose einer Sepsis zu sichern, müssen mindestens zwei der

folgenden Kriterien erfüllt sein: Hypo- beziehungsweise Hyperthermie (>28°C bzw.

<36°C), Tachykardie (>90 Schläge pro Minute), Brady pnoe (<20 Atemzüge pro

Minute), zusätzlich kann eine Leukozytose oder Leukopenie bestehen. Blutkulturen

sind diagnostisch wegweisend und auch zur Verlaufskontrolle sehr gut geeignet.

Nach der Abnahme der Blutkulturen muss umgehend eine antibiotische Therapie

eingeleitet werden. 36,57

In den letzten Jahren hat die Inzidenz der Sepsis trotz modernster antibiotischer

Therapie und maximaler intensivstationärer Betreuung stetig zugenommen. Allein in

Deutschland beläuft sich die Zahl septischer Patienten auf geschätzte 44000 bis

95000 Fälle pro Jahr. Damit geht auch ein sehr hoher finanzieller Aufwand einher.

Nach Schätzungen belaufen sich die Kosten pro Patient im Mittel auf 23297 Euro.21

Die steigende Anzahl der Sepsisfälle kann zum Teil mit dem steigenden

Durchschnittsalter der Bevölkerung erklärt werden. Bei älteren, oft auch

bettlägerigen Menschen führt ein geschwächtes Immunsystem meist zu schwer

verlaufenden Erkrankungen wie zum Beispiel Pneumonien mit septischem Verlauf.

Ein besonders wichtiger Faktor ist die zunehmende Zahl an invasiven

diagnostischen und therapeutischen Maßnahmen. Dadurch erhöht sich die

Keimbelastung des Organismus drastisch. Besonders multiresistente Erreger stellen

hier ein Problem dar. Zudem finden immunsuppressive Therapieformen eine immer

weitere Verbreitung. Dies kann unter anderem mit den wachsenden Möglichkeiten in

der Transplantationschriurgie und der damit verbundenen Immunsuppression erklärt

werden. Immunsuppression hat aber auch in der Therapie von

Autoimmunerkrankungen einen hohen Stellenwert.

Da unterschiedliche Ursachen einen septischen Zustand hervorrufen können, erhält

man ein heterogenes Patientengut. Kann ein Sepsisherd infektiösen Ursprungs

gefunden werden und der verantwortliche Keim in der Blutkultur verifiziert werden,

wird dieser gezielt antibiotisch therapiert und der Sepsisherd falls möglich saniert.

Dies steht als kausale Therapieoption an erster Stelle. Außerdem kann eine

zeitweilige Unterstützung der Vitalfunktionen mittels Beatmung und

Kreislaufstabilisation bei Verschlechterung des klinischen Erscheinungsbildes

notwendig werden. Bei Anzeichen von Organdysfunktion wie steigenden

Nierenretentionsparametern bei Nierenversagen oder steigendem

Blutglukosespiegel bei einer Dysfunktion des Pankreas, wird versucht, die Funktion

der Organe durch Hämofiltration und Insulintherapie zu ersetzen. Inzwischen haben

- 7 -

sich diese supportiven Maßnahmen wie frühe hämodynamische Unterstützung,

niedriges Atemvolumen und intensive Insulinbehandlung durch klinische Studien

etabliert.57

Die Behandlung der Hyperglykämie gehört seit Jahren zur etablierten klinischen

Therapie der Sepsis. Hyperglykämien kommen bei kritisch Kranken sehr häufig vor,

auch wenn noch kein manifester Diabetes mellitus vorbestand.22 Dies kann zum Teil

auf einen Funktionsausfall des endokrinen Pankreas zurückgeführt werden. Daher

ist es oft notwendig Insulin zu substituieren, um Blutzuckerspitzen abzufangen.48 In

den letzten Jahren hat sich jedoch zunehmend die intensivierte Insulintherapie im

Rahmen der Sepsisbehandlung etabliert. Dies geht auf eine klinische Studie von

G. Van den Berghe und Koautoren zurück.62 Sie konnten in einer prospektiven,

randomisierten, kontrollierten Studie zeigen, dass eine intensivierte Insulintherapie,

die den Blutglukosespiegel mittels Insulinperfusortherapie unter 110mg/dl hält, die

Morbidität und Mortalität kritisch Kranker auf einer chirurgischen Intensivstation

signifikant verbesserte. Sie bezogen insgesamt 1548 Patienten in ihre Studie mit ein

und verglichen die intensivierte Insulintherapie mit der konventionellen

Insulintherapie, bei der eine Insulingabe nur bei einem Blutglukosespiegel von über

215mg/dl indiziert ist und dann zwischen 180 und 200mg/dl eingestellt wird.

Während des Aufenthalts auf der Intensivstation zeigte sich eine deutlich

verminderte Mortalität bei Patienten im intensivierten Therapiearm von 4,6 Prozent

gegenüber 8,0 Prozent bei konventioneller Therapie (p<0,04). Am deutlichsten

wurde dieser Effekt bei Patienten, die länger als fünf Tage intensivtherapeutisch

behandelt wurden: 10,6 Prozent Mortalität bei intensivierter Insulintherapie

verglichen mit 20,2 Prozent bei konventionellem Therapieschema (p=0,005).62 In

weiteren Studien konnten diese Erfolg versprechenden Ergebnisse allerdings nur

zum Teil reproduziert werden.59-61,63 Zwar konnte kein Unterschied zwischen den

Patienten mit intensivierter und herkömmlicher Insulintherapie bezogen auf die

Mortalität während des Krankenhausaufenthalt gesehen werden, aber die Morbidität

wurde weiterhin signifikant reduziert. Dies zeigte sich vor allem in einer Prävention

von Nierenschäden, verkürzter Beatmungspflichtigkeit, und verkürztem

Intensivstations- bzw. Krankenhausaufenthalt.61 Diese Ergebnisse wurden auch

durch tierexperimentelle Studien an Ratten gestützt.38,42 D. Klein et al. untersuchten

die hepatische Funktion und Morphologie nach schwerem Trauma sowie die

Alteration der hepatischen inflammatorischen Signalkaskade im

Verbrennungsmodell an Ratten. Hierbei wurde den Versuchstieren eine 30-

prozentige transdermale Verbrennung appliziert, welche die Tiere in einen

septischen Zustand versetzt. Den Versuchstieren wurden nach Applikation der

- 8 -

Verbrennung 5IU/kg Insulin oder NaCl-Lösung als Kontrolle verabreicht. Dies hielt

den Blutzuckerspiegel bei den mit Insulin behandelten Versuchstieren um 120mg/dl.

Bei den Kontrolltieren variierte der Blutglukosespiegel zwischen 150 und 170mg/dl.

Sie legten mit ihrer Arbeit eine zytoprotektive Wirkung des Insulins nahe und

konnten eine Abmilderung der inflammatorischen Reaktion nachweisen, die durch

eine Verminderung der proinflammatorischen und eine Verstärkung der

antiinflammatorischen Kaskade vermittelt wurde. Dadurch wurden die hepatische

Morphologie und damit auch die Leberfunktion verbessert. Dies könnte für die

Organfunktion kritisch Kranker und damit für deren Überleben entscheidend sein.42

Zum Teil kann dies durch die Wirkung des Insulins als anaboles Hormon erklärt

werden. Im Fettgewebe und im Skelettmuskel wird die Glukoseaufnahme über den

Glukosetransporter GLUT4, sowie die Glykolyse gesteigert.48 Im Skelettmuskel wird

zudem die Glykogenbiosynthese gefördert. Im Fettgewebe wird die

Fettsäurebiosynthese gefördert, wohingegen die Lipolyse gehemmt wird. In der

Leber wird die Glukoneogenese gehemmt, die Glykolyse und Glykogensynthese

hingegen wird stimuliert. Somit findet eine effiziente Speicherung des

Substratangebotes in Form von Glykogen und Triacylglycerinen statt. Außerdem

werden die Proteinbiosynthese und das Zellwachstum angeregt. Es zeigt sich also

eine Förderung des anabolen und eine Hemmung des katabolen Stoffwechsels.

Einige Studien legen nahe, dass der Schlüssel zur Verbesserung der

Überlebensraten nicht in der Insulinapplikation zu suchen ist, sondern schreiben

dies der strikten Euglykämie zu.26,27 Andererseits gibt es auch Hinweise für eine

direkte antiinflammatorische Wirkung des Insulins.4,17,40 Ob jedoch die Verbesserung

der Morbidität kritisch Kranker durch die strikte Einstellung des Blutzuckers oder

durch eine direkte antiinflammatorische Wirkung des Insulins erreicht werden, ist

nach wie vor ungeklärt. Daher wurden in der vorliegenden Arbeit die

Wirkmechanismen von Insulin auf zellulärer Ebene näher untersucht.

Insbesondere die Vermittlung der Insulinwirkung über die PI3-K Signalkaskade

stand hier im Mittelpunkt. Eine Studie von Iida und Kollegen35 legte eine

antiapoptotische Wirkung von Insulin über den PI3-K Signalweg nahe. Sie konnten

bei durch Nährmediumsentzug ausgehungerten Makrophagen eine antiapoptotische

Wirkung von Insulin nachweisen.

β-Blocker stellen neben Insulin ein weiteres Medikament mit anabolem Potential

dar. Dies könnte ebenfalls in der klinischen Therapie der Sepsis von Bedeutung

sein.31-34,41 M. Kawakami und Kollegen41 verwendeten ebenfalls das

Verbrennungsmodell an Mäusen, um den Einfluss von Katecholaminen auf die

Sezernierung proinflammatorischer Zytokine zu untersuchen. Die Verbrennung

- 9 -

führte zu erhöhten Epinephrinspiegeln, welche die Ausschüttung

proinflammatorischer Zytokine stimulierte. Durch Propranolol konnte diese

proinflammatorische Reaktion unterdrückt werden. Die Forschungsgruppe um Haart

und Herndon33 führte eine Studie an 25 Kindern mit Verbrennungen von mehr als

40 Prozent der Körperoberfläche durch. Ausgehend von der Tatsache, dass

schwere Verbrennungen den Energieumsatz sowie den katabolen Muskelabbau

steigern, postulierten sie einen positiven Effekt durch die Blockade der

β-adrenergen Stimulation. Dies werde über eine Katecholamin induzierte

hypermetabolische Reaktion vermittelt. Die β-Blockade mittels Propranolol zeigte

sich in einer gesenkten Herzfrequenz und einem verminderten Grundumsatz

gegenüber der Kontrollgruppe. Die Nettomuskelproteinbalance konnte in der

Propranololgruppe um 82 Prozent gesteigert werden. In einer weiteren klinischen

Studie konnte in der Propranololgruppe eine Hochregulation der Gene gesehen

werden, die in den Muskelaufbau involviert sind (z.B.: Dynein).32 In dieser Studie

konnte weiterhin gezeigt werden, dass ein Schlüsselenzym für die Glukoneogenese

(Fructose-1,6-bisphosphatase) und die Insulinresistenz heruntergeregelt ist.

Außerdem wurde das Zinkfingerprotein-145 (A20) herunterreguliert, das in die

negative Feedbackschleife der NF-κB Aktivierung zur Regulation des

Apoptosevorgangs involviert ist.

In der Pathogenese der Sepsis spielt Apoptose eine bedeutende Rolle. Da

Apoptose durch die genetische Ausstattung der Zelle selbst reguliert und ausgelöst

wird, wird die Apoptose auch programmierter Zelltod genannt. Zuallererst

kondensiert das Zytoplasma der Zelle, wobei der Zellkern durch die Aktivierung

endogener Endonukleasen und spezifischer Proteasen verschiedenen

Veränderungen unterliegt. Die Mitochondrien bleiben dabei jedoch intakt. Chromatin

verklumpt entlang der Kernmembran und der Zellkern schrumpft. Man spricht von

Karyopyknose. Nun löst sich die betroffene Zelle aus dem Zellverband und

fragmentiert in mehrere Teile, Apoptosekörperchen genannt, die von einer intakten

Zellmembran umschlossen werden. Im Gegensatz dazu steht die Nekrose, der

provozierte Zelltod. Sie ist durch eine initiale Zellschwellung gekennzeichnet, die

zuerst noch reversibel ist. Die Zellschwellung wird durch eine erhöhte Permeabilität

der Zellmembran für Ionen hervorgerufen. Durch die osmotische Lyse der Zelle

rupturiert die Zellmembran. Die Apoptose jedoch kommt auch physiologisch beim

normalen Zellumsatz vor und spielt auch in der Embryogenese eine entscheidende

Rolle.8,10,20,24

In der vorliegenden Arbeit sollte das inflammatorische Geschehen auf zellulärer und

molekularer Ebene unter dem Einfluss von Insulin und Propranolol untersucht

- 10 -

werden. Dazu wurde die Monozytenzellinie THP-1 ausgewählt, die Zellen wurden zu

Makrophagen ausdifferenziert. Makrophagen spielen eine entscheidende Rolle für

das angeborene Immunsystem und die Fähigkeit des Organismus, auf pathogene

Noxen wie Bakterien, Viren oder Pilze angemessen zu reagieren. Sie gehören als

Polymorphkernige zu den antigenpräsentierenden Zellen, so genannten APCs und

können pro- und antiinflammatorische Zytokine sezernieren. Zudem stehen sie am

Anfang der septischen Kaskade, noch vor der B-Zell-vermittelten humoralen,

spezifischen Immunreaktion. Zunächst wurde die Sekretion proinflammatorischer

Zytokine nach Stimulation mit Lipopolysaccharid untersucht. LPS ist ein integraler

Bestandteil der Zellwände von gramnegativen Bakterien, ist aber auch in

grampositiven Bakterien enthalten. Makrophagen reagieren auf eine Stimulation mit

LPS mit der Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine. Des Weiteren wurden

sowohl Versuche zur Apoptoserate bei inflammatorischen Makrophagen als auch zu

den Wirkungen von Insulin und Propranolol auf die Apoptoseinduktion durchgeführt.

Abschließend wurden die beteiligten intrazellulären Signalwege untersucht, über die

sowohl Insulin als auch Propranolol ihre Wirkung in der Zelle entfalten. Hierzu

wurden folgende Hypothesen aufgestellt:

1. Hypothesen zur Zellvitalität

1.1 LPS reduziert dosisabhängig die Zellvitalität in THP-1 Makrophagen

1.2 Insulin erhöht die Zellvitalität in LPS-stimulierten THP-1 Makrophagen

1.3 Propranolol erhöht die Zellvitalität in LPS-stimulierten THP-1 Makrophagen

2. Hypothesen zur Zellaktivität

2.1 LPS reduziert dosisabhängig die Zellaktivität in THP-1 Makrophagen

2.2 Insulin erhöht die Zellaktivität in LPS-stimulierten THP-1 Makrophagen

2.3 Propranolol erhöht die Zellaktivität in LPS-stimulierten THP-1 Makrophagen

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3. Hypothesen zur Apoptose

3.1 LPS induziert Apoptose in THP-1 Makrophagen

3.2 Insulin reduziert dosisabhängig die LPS-induzierte Apoptose in THP-1

Makrophagen und wirkt über den PI3-K Signalweg antiapoptotisch

3.3 Propranolol reduziert dosisabhängig die LPS-induzierte Apoptose in THP-1

Makrophagen und wirkt über den NF-κB Signalweg antiapoptotisch

4. Hypothesen zum Inflammationsgeschehen

4.1 LPS erhöht die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine in THP-1

Makrophagen

4.2 Insulin wirkt in THP-1 Makrophagen antiinflammatorisch

4.3 Propranolol wirkt in THP-1 Makrophagen antiinflammatorisch

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3. Material und Methoden

3.1 Zellkultur

Die Monozytenzelllinie THP-1 Humansuspensionszellen (human acute monocytic

leukemia, ATCC, USA, Cat.-No.: TIB-202) wurde in 175cm2 Zellkulturflaschen

(Corning, Deutschland, Cat.-No.: 431080) in RPMI 1640 Zellkulturmedium mit

GlutaMAX (Gibco, GB, Cat.-No.: 61870-010) kultiviert, das mit 1%

Penicillin/Streptomycin (10.000U / 10.0000µg/ml) (Biochrom, Deutschland, Cat.-No.:

A2213) und 10% FBS (Fetal Bovine Serum) (Biochrom, Deutschland, Cat.-No.:

S0115) versetzt wurde, um optimales Wachstum zu gewährleisten. Die Zellen

wurden im Brutschrank bei 37°C in einer angefeuchte ten Atmosphäre kultiviert, die

5% CO2 enthielt. Alle drei bis fünf Tage wurde das Zellkulturmedium erneuert. Nach

mindestens drei Tagen Zellwachstum wurden die Zellen abzentrifugiert (5min,

900rpm, RT), mittels Trypanblaufärbung (Biochrom, Deutschland, Cat.-No.: L6323)

in einer Neubauer-Zählkammer gezählt und anschließend in Zellkulturplatten

ausgesät. Je nach Versuchsdesign wurden hierfür 6-well Platten (BD Falcon,

Deutschland, Cat.-No.: 353046) mit 1,5x106/2ml Zellen, 96-well Platten (BD Falcon,

Deutschland, Cat.-No.: 353918) mit 8x104/100µl oder Culture slides (BD Falcon,

Deutschland, Cat.-No.: 354118). mit 1,1x105/500µl Zellen je well verwendet. Um die

THP-1 Monozyten zu Makrophagen auszudifferenzieren, wurden sie über Nacht mit

PMA (phorbol 12-myrisate 13-acetate) (Sigma, USA, Cat.-No.: P1585) inkubiert, das

in einer Endkonzentration von 5x10-5g/ml vorlag. Die ausdifferenzierten

Makrophagen adhärierten an den Boden der wells, während die undifferenzierten

Monozyten in Suspension blieben und durch Waschen mit PBS (Phospate buffered

saline, pH 7,4) aus der Zellkultur entfernt wurden. Anschließend wurden die Zellen

über Nacht mit serumfreiem Medium kultiviert, um den Zellzyklus der einzelnen

Zellen auf die G0-Phase zu synchronisieren.

3.2 Stimulation der Zellen

Die Zellen wurden entweder in serumfreiem Medium als Negativkontrolle oder mit

aufsteigenden Dosen (100ng/ml, 1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100µg/ml)

Lipopolysaccharid (LPS E. coli 0111:B4, Sigma, Cat.-No.: L 2654, L4391, L 3516, L

4641, L 6529, L 7770, L 6143 und L 7895) inkubiert, um die optimale LPS –

Dosierung herauszufinden.

- 13 -

Um die Effekte von Insulin (Insuman rapid Optiset, Aventis, Deutschland) auf das

Zellüberleben, die Induktion von Apoptose, sowie die Ausschüttung

proinflammatorischer Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellen alleinig mit LPS

stimuliert oder in Kombination mit Insulin in verschiedenen Dosierungen (1, 5, 10,

15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 und 50 U/ml) über 24 Stunden inkubiert. Insulin wurde

hierbei 30 Minuten nach der Stimulation mit LPS appliziert. Um festzustellen, ob die

Effekte des Insulins über den Phosphatidylinsoitol-3-Kinase (PI3K) Signalweg

vermittelt werden, wurde der PI3K Inhibitor Wortmannin (Sigma, Deutschland,

Cat.-No.: W 1628-1MG) verwendet. Die Zellen wurden in Culture slides kultiviert und

wie oben beschrieben mit 10µg/ml LPS und 5U/ml Insulin behandelt. Wortmannin

wurde in verschiedenen Konzentrationen zugegeben (1, 10, 50, 100, 200nM). Als

Kontrollgruppen dienten Zellen, die mit Wortmannin allein oder mit LPS und

Wortmannin behandelt wurden. Da im Apoptosesignalweg unter anderem auch der

Nukleäre Transkriptionsfaktor (NF) - κB eine Rolle spielt, wurde der Einfluss von

Insulin auf den NF-κB Signalweg mittels des NF-κB Blockers N-p-Tosyl-L-

Phenylalaninchloromethylketon (TPCK, Sigma, Deutschland, Cat.-No.:

T 4376-100MG) untersucht. Hierzu wurden die Zellen in Culture slides kultiviert und

wie oben beschrieben mit 10µg/ml LPS und 5U/ml Insulin behandelt. TPCK wurde in

verschiedenen Konzentrationen zugegeben (1, 10, 50, 100, 200µM). Als

Negativkontrollen dienten Zellen, die mit TPCK allein oder einer Kombination aus

LPS und TPCK behandelt wurden. Es wurden Negativkontrollen sowohl mit

serumfreien Medium als auch mit Insulin ohne LPS durchgeführt.

Um die Effekte von Propranolol (Dociton, Astra Zeneca, Deutschland) auf das

Zellüberleben, die Induktion von Apoptose, sowie die Ausschüttung

proinflammatorischer Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellen alleinig mit LPS

stimuliert oder in Kombination mit Propranolol in verschiedenen Dosierungen (0,1; 1;

10; 100; 500 und 1000µmol/ml) über 24 Stunden inkubiert. Propranolol wurde

hierbei 30 Minuten nach der Stimulation mit LPS appliziert. Da im

Apoptosesignalweg unter anderem auch der Nukleäre Transkriptionsfaktor (NF) - κB

eine Rolle spielt, wurde der Einfluss von Propranolol auf den NF-κB Signalweg

mittels des NF-κB – Blockers N-p-Tosyl-L-Phenylalaninchloromethylketon (TPCK,

Sigma, Deutschland, Cat.-No.: T 4376-100MG) untersucht. Hierzu wurden die

Zellen in Culture slides kultiviert und wie oben beschrieben mit 10µg/ml LPS und

10µM Propranolol therapiert. TPCK wurde in verschiedenen Konzentrationen

zugegeben (1, 10, 50, 100, 200µM).

- 14 -

Als Negativkontrollen dienten Zellen, die mit TPCK allein oder einer Kombination

aus LPS und TPCK behandelt wurden. Es wurden ebenfalls Negativkontrollen mit

serumfreien Medium und nur mit Propranolol ohne LPS durchgeführt.

3.3 Trypanblaufärbung

24 Stunden nach der Stimulation der Zellen mit LPS wurden die Zellüberstände

abpipettiert. Die Zellen wurden mit zwei bis drei Tropfen Trypanblau (0,5%ig in

physiologischer Kochsalzlösung, Biochrom) je well gefärbt, so dass der Boden des

wells mit Färbelösung bedeckt war, um ein Austrocknen der Zellen zu verhindern.

Nach fünf Minuten Einwirkzeit wurden unter Durchlichtmikroskopie im

Zellkulturmikroskop (Leica DMRBE, Deutschland) bei 100x Vergrößerung je zwei

Gesichtsfelder ausgezählt und eine Lebend-Tot-Ratio erstellt. Als eindeutig tote

Zellen wurden diejenigen gezählt, die lila bis dunkelblau gefärbt, deren Zellkern

fragmentiert und deren Zellmembran sich aufgelöst hatte.

3.4 Zellproliferationsassay

Um die Zellaktivität zu ermitteln, wurde der CellTiter 96 Aqueous non-radioactive

cell proliferation assay (Promega, USA, Cat.-No.: G5421) verwendet. Nachdem die

Zellen wie oben beschrieben mit serumfreien Medium beziehungsweise mit LPS

allein oder in Kombination mit Insulin oder Propranolol inkubiert wurden, wurde 24

Stunden nach der Stimulation mit LPS die Umwandlung der Tetrazolimverbindung

(3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-

tetrazolium, inner salt, MTS) in wasserlösliches Fromazan durch metabolisch aktive

Zellen gemessen. Die Absorption des Fromazans bei 490nm verhält sich zu der

Zahl der lebenden Zellen direkt proportional. Das Ansetzen des

Zellproliferationsassays geschah nach Angaben des Herstellers. Für die Messung

der Fromazan-Absorption wurde ein ELISA Reader (Tecan Sunrise, Österreich) bei

490nm verwendet. Die Experimente wurden in je zwei Tripletts (n=6) aus einer

Zellpassage durchgeführt.

- 15 -

3.5 Apoptose

3.5.1 TUNEL Färbung

Die TUNEL Färbung (In situ Cell Death Detection Kit, TMR red, Roche,

Deutschland, Cat.-No.: 2156792) ist spezifisch für die Detektion von Apoptose.

TUNEL steht für terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end

labeling. Während des Apoptosevorgangs entstehen durch die DNAse nicht nur

doppelsträngige niedermolekulare DNA Fragmente (Mono- und Oligonukleosomen),

sondern auch Einzelstrangbrüche in DNA-Abschnitten mit hohem Molekulargewicht.

Diese sogenannten Nicks sind apoptosespezifisch. An diese 3‘(OH)- Enden können

sich nun durch die terminale Transferase mit Fluoreszenzfarbstoff gelabelte

Nucleotide anlagern.24,25 Daher leuchten apoptotische Zellen unter Fluoreszenz

hellrot, nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Vor dem Färben wurden

die Zellen in Culture slides kultiviert und dann mit Medium als Kontrollgruppe, mit

LPS, Insulin oder Propranolol allein, oder mit einer Kombination aus LPS und Insulin

beziehungsweise Propranolol behandelt. Die Färbung erfolgte nach Angaben des

Herstellers. Im Anschluß erfolgte die sofortige Auswertung am

Fluoreszenzmikroskop (Leica Fluvert FU, Deutschland) bei 400x Vergrößerung. Es

wurden je zwei Gesichtsfelder unter Durchlicht (Gesamtzellzahl) und unter roter

Fluoreszenz bei 590nm (apoptotische Zellen) ausgezählt und der Prozentsatz

apoptotischer Zellen ermittelt.

3.5.2 JC-1 Färbung

Zusätzlich zur TUNEL Färbung wurde die JC-1 Färbung (JC-1 Mitochondrial

Potential Sensors) verwendet. Sie beruht auf dem Prinzip der Änderung des

Membranpotentials der Mitochondrien, wenn die Zellen beginnen, sich apoptotisch

zu verändern. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials steht daher am

Anfang des Apoptosezyklus und ist somit ein sehr frühes Zeichen von Apoptose.

Die Mitochondrien nehmen den kationischen JC-1 Farbstoff (5,5‘,6,6‘-tetrachloro-

1,1‘,3,3‘-tetraethylbenzimidazolylcarbocyamine iodide, JC-1, CBIC(3), MoBiTec,

Deutschland, Cat.-No.: T-3168) auf. Unter Fluoreszenz zeigen dann lebende Zellen

ein grünes Cytosol und rote Aggregate an den mitochondrialen Membranen.

Apoptotischen Zellen fehlen diese Aggregate.50,55 Die Zellen wurden ebenfalls in

Culture slides kultiviert und dann mit Medium als Kontrollgruppe, mit LPS, Insulin

oder Propranolol allein, oder mit einer Kombination aus LPS und Insulin

beziehungsweise Propranolol behandelt. 24 Stunden nach der Stimulation mit LPS

- 16 -

wurde zunächst einmal mit PBS gewaschen und anschließend die JC-1

Färbelösung, 10µg/ml in phenolrotfreiem RPMI gelöst, objektträgerdeckend

aufgetragen. Dann wurden die Zellen 10 Minuten in einer feuchten Kammer bei

37°C im Brutschrank in der Färbelösung inkubiert. D anach wurde dreimal mit PBS

gewaschen, der Objektträger in Glycerol eingebettet und mit einem Deckgläschen

abgedeckt. Anschließend erfolgte umgehend die Auswertung am

Fluoreszenzmikroskop (Leica Fluvert FU, Deutschland) bei 400x Vergrößerung. Es

wurden jeweils zwei Gesichtsfelder in zwei verschiedenen Wellenlängen ausgezählt.

Unter grüner Fluoreszenz (520nm) wurde die Gesamtzellzahl ermittelt, unter roter

Fluoreszenz (590nm) die Anzahl nicht apoptotischer Zellen. Daraus wurde dann der

Prozentsatz apoptotischer Zellen berechnet.

3.6 Zytokinspiegelbestimmung

4,8,12 und 24 Stunden nach der Stimulation der Zellen mit LPS wurden die

Zellüberstände gewonnen, bei 4°C und 900rpm fünf Mi nuten lang abzentrifugiert,

um mögliche Zellrückstände zu entfernen, aliquotiert und bei -20°C eingefroren.

3.6.1 Interleukin 1 ββββ ELISA

Das proinflammatorische Zytokin Interleukin (IL)-1, auch endogenes Pyrogen

genannt, existiert in zwei molekularen Unterformen, IL-1 alpha und IL-1 beta. Die

Zytokinspiegel von IL-1β in den Zellkulturüberständen wurden nun quantitativ mittels

human IL-1β ELISA (Bender MedSystems, USA, Cat.-No.: BMS224/2TEN) nach

dem sandwich-enzyme-immunoassay Prinzip bestimmt. Das Ansetzen der ELISA

geschah nach Angaben des Herstellers. Hierbei ist vor allem zu beachten, dass die

Standards sowie die Proben während des Ansetzens der ELISA ständig bei 2 – 8°C

gelagert wurden. Die Zellkulturüberstände wurden wie oben beschrieben gewonnen.

Alle Assays wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.

Die Absorption wurde unverzüglich am ELISA Reader (Tecan Sunrise, Österreich)

bei einer Wellenlänge von 450nm gegen die Referenzwellenlänge von 629nm

gemessen. Mittels Computer Software (Tecan Reader PC Package magellan

version 3.0) wurde eine Standardkurve erstellt und die IL-1β Konzentrationen der

Proben berechnet und in pg/ml angegeben. Bei jedem ELISA wurde zudem eine

Positivkontrolle durchgeführt.

- 17 -

3.6.2 Tumornekrosefaktor αααα ELISA

Tumornekrosefaktorα (TNFα), ebenfalls unter dem Namen Kachektin bekannt, ist

ein weiteres proinflammatorisches Zytokin. Es wird spezifisch nur von Monozyten

und Makrophagen sezerniert und ist sowohl in der Lage, entscheidend die

Immunantwort zu modulieren als auch als potentes Pyrogen zu fungieren. Die

Zytokinspiegel von TNFα wurden durch den human TNFα ELISA Kit (Bender

MedSystems, USA, Cat.-No.: BMS223/3TENCE) ermittelt. Da ungebundenes TNFα

bei Raumtemperatur zerfällt, wurden die Zellkulturüberstände aliquotiert und bei

jeder neuen Bestimmung einer Probe ein neues Aliquot aufgetaut. Daher ist es von

besonderer Wichtigkeit, dass die Standards sowie die Proben während des

Ansetzens der ELISA ständig bei 2–8°C auf Eis gelag ert werden, um die

ursprüngliche Konzentration von TNFα zu erhalten. Das Ansetzen der ELISA

geschah nach Angaben des Herstellers. Die Zellkulturüberstände wurden wie oben

beschrieben gewonnen. Alle Assays wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.

Die Absorption wurde unverzüglich am ELISA Reader bei einer Wellenlänge von

450nm gegen die Referenzwellenlänge von 629nm gemessen. Mittels Computer

Software wurde eine Standardkurve erstellt und die TNF-α Konzentrationen der

Proben berechnet und in pg/ml angegeben. Bei jedem ELISA wurde eine

Positivkontrolle mitgeführt.

3.7 Statistische Auswertung

Die Daten wurden für die verschiedenen Therapieoptionen und Kontrollen gemittelt

und die Standardabweichung sowie der mittlere statistische Fehler berechnet.

Anschließend wurden die Daten einem Student´schen t-Test für ungepaarte

Datensätze unterzogen. Als statistisch signifikant wurde ein p<0,05 angesehen, ein

p<0,01 wurde als statistisch hochsignifikant angesehen.

- 18 -

4. Ergebnisse

4.1 Zellvitalität

Die Zellvitalität wurde 24 Stunden nach der Stimulation der Makrophagen mit LPS

durch Färbung mit Trypanblau ermittelt.

4.1.1 Reduktion der Zellvitalität von THP-1 Zellen durch Lipopolysaccharid

Wir führten zunächst eine Dosisfindungsstudie durch, in der die Makrophagen mit

aufsteigenden Dosen von LPS (5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90µg/ml) stimuliert

wurden. Ab 5µg/ml zeigte sich ein signifikanter Anstieg avitaler Zellen (Abb. 1).

Dieser stieg gegenüber der Kontrolle mit durchschnittlich 7,87±3,59% bis 80µg/ml

LPS stetig an. Bei 80µg/ml LPS betrug der Anteil avitaler Zellen 63,51±8,10%. Ab

60µg/ml zeigte sich erstmals ein hochsignifikanter Zuwachs an avitalen Zellen.

Somit konnte ein dosisabhängiger zytotoxischer Effekt von LPS auf die

Makrophagenkultur beobachtet werden.

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90

LPS-Konzentration [µg/ml]

% a

vita

ler

Zel

len

**

**

*

****

** **

Abb. 1: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen in der Trypanblaufärbung 24h nach der Stimulation mit aufsteigenden LPS – Konzentrationen (n=3) im Vergleich zur Kontrolle (*p<0,05; **p<0,01).

- 19 -

4.1.2 Einfluss von Insulin auf die Zellvitalität in LPS-stimulierten THP-1

Zellen

Als Negativkontrollen wurden zunächst Trypanblaufärbungen an Zellen

durchgeführt, die mit Insulin alleine behandelt wurden (Tab. 1). Hier zeigte sich bei

der Zellbehandlung mit 1, 5, 10 und 15U/ml Insulin keine signifikante Veränderung

des Anteils avitaler Zellen gegenüber der Kontrolle. Erst bei der Applikation von 20

und 25U/ml Insulin konnte ein hochsignifikanter Anstieg des Anteils avitaler Zellen

beobachtet werden (p<0,01). Daher wurden diese Dosierungen nicht mehr in den

weiteren Experimenten verwendet.

Behandlung der THP-1 Zellen % avitaler Zellen

Kontrolle 6,00±5,8310µg LPS 28,54±7,391U/ml Insulin 10,29±6,895U/ml Insulin 12,61±5,7210U/ml Insulin 10,50±7,4915U/ml Insulin 10,32±6,6320U/ml Insulin 51,31±10,5225U/ml Insulin 85,27±8,36

Tab.1: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Applikation von Insulin [U/ml] (n=4) verglichen mit der Kontrollgruppe ohne Behandlung (Negativkontrolle).

Nach Stimulation mit 5µg/ml LPS betrug der Anteil avitaler Zellen 24,42±2,32%.

Durch Behandlung mit Insulin konnte bei allen verwendeten Insulinkonzentrationen

ein hochsignifikanter Rückgang (p<0,01) des Zellsterbens beobachtet werden

(Abb. 2).

Bei 10µg/ml LPS betrug der Prozentsatz avitaler Zellen 44,53±0,15% (Abb. 3). Auch

hier zeigte sich ein hochsignifikanter Abfall der Anzahl avitaler Zellen (p<0,01) bei

allen Insulinkonzentrationen.

Die Stimulation der Makrophagen mit 20µg/ml LPS lieferte ein ähnliches Ergebnis

(Anhang Abb.41). Zunächst betrug der Anteil avitaler Zellen durch die alleinige

Stimulation mit LPS 37,76±2,49%. Durch Therapie mit 1U/ml Insulin konnte ein

hochsignifikanter Rückgang (p<0,01) auf 11,3±0,30% erreicht werden. Bei 5, 10 und

15U/m war der Rückgang avitaler Zellen geringer als bei der Behandlung der Zellen

mit 1U/ml, der Abfall war allerdings immer noch signifikant (p<0,05).

Diese Ergebnisse bestätigten sich auch bei 30µg/ml LPS (Anhang Abb. 42). Hier

betrug der Anteil avitaler Zellen 60,67±6,18%. Durch den Einsatz von Insulin konnte

die Zahl avitaler Zellen bei allen Konzentrationen nahezu halbiert werden. Bei 1, 10

und 15U/ml war die Verminderung der Anzahl avitaler Zellen signifikant (p<0,05),

bei 5U/ml hochsignifikant (p<0,01).

- 20 -

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 5µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

** ** ****

Abb. 2: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 5µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 5µg/ml LPS (**p<0,01), Kontrolle = ohne Behandlung.

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 10µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

**** ** **

Abb. 3: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 10µg/ml LPS (**p<0,01).

- 21 -

Anders stellte sich der Verlauf der Therapie bei der Stimulation der Makrophagen

mit 40µg/ml LPS dar (Anhang Abb. 43). Bei 40µg/ml LPS betrug die Anzahl avitaler

Zellen 79,12±3,40%. Mit 1 beziehungsweise 5U/ml Insulin konnte noch ein leichter

Rückgang an toten Zellen erreicht werden, dieser war allerdings nicht mehr

signifikant. Durch die Applikation von 10 beziehungsweise 15U/ml stieg die Zahl

avitaler Zellen über die Rate der Positivkontrolle mit 40µg/ml LPS auf 83,14±3,95%

beziehungsweise 84,39±1,26% an.

Bei 50µg/ml LPS betrug der Anteil avitaler Zellen 91,57±1,20% (Anhang Abb. 44)

Durch diese hohe Rate an avitalen Zellen, konnte bei der Therapie mit 1, 5 und

10U/ml Insulin ein hochsignifikanter Abfall des Anteils avitaler Zellen erzielt werden

(p<0,01), bei 15U/ml war ein signifikanter Rückgang zu verzeichnen.

Somit konnte bei Stimulation der Zellen mit 5 bis 30µg/ml LPS durch die

Behandlung mit 1 bis 15U/ml Insulin ein deutlicher Rückgang des Anteils avitaler

Zellen erreicht werden.

- 22 -

4.1.3 Einfluss von Propranolol auf die Zellvitalitä t in LPS-stimulierten THP-1

Zellen

Als Negativkontrollen wurden zunächst Trypanblaufärbungen an Zellen

durchgeführt, die mit Propranolol alleine behandelt wurden (Tab. 2). Hier zeigte sich

bei einer Zellbehandlung mit 1, 10 und 100µM Propranolol keine signifikante

Veränderung des Anteils avitaler Zellen gegenüber der Kontrolle. Erst bei der

Applikation von 500µM Propranolol konnte ein hochsignifikanter Anstieg des Anteils

avitaler Zellen beobachtet werden (p<0,01). Daher wurde diese Dosierung nicht für

die weiteren Experimente verwendet.

Behandlung der THP-1 Zellen % avitaler Zellen

Kontrolle 6,00±5,8310µg LPS 28,54±7,390,1µM Propranolol 6,00±5,001µM Propranolol 7,71±4,6310µM Propranolol 9,34±6,33100µM Propranolol 12,46±5,14500µM Propranolol 100,00±0,00

Tab. 2: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Applikation von Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit der Kontrollgruppe ohne Behandlung. Die Kombination von 10µg/ml LPS mit 1 und 10µM Propranolol führte zu einem

hochsignifikanten Absinken der Zahl avitaler Zellen auf 2,77±1,07% bzw.

4,68±1,27%. Die Behandlung mit Propranolol nach Stimulation mit 5µg/ml LPS

zeigte bei hohen Dosen (100µM) nahezu keinen Rückgang des Anteils avitaler

Zellen (Abb. 4).

Bei Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS zeigte sich nach Gabe von 1µM

Propranolol ein hochsignifikantes Absinken der Zahl avitaler Zellen auf 7,63±0,99%

(Abb. 5, p<0,01). Ein ähnlicher Effekt konnte für die Behandlung der Zellen mit 10

und 100µM Propranolol nachgewiesen werden. Bei beiden Dosierungen war ein

hochsignifikanter Abfall der Zahl avitaler Zellen auf 8,02±1,10% bzw. 19,35±0,68%

zu verzeichnen (p<0,01).

Bei 20µg/ml LPS wurde der Effekt noch deutlicher sichtbar (Anhang Abb. 45). Im

Vergleich zum Stimulationswert von 20µg/ml LPS mit 37,76±2,49% fiel der

Prozentsatz avitaler Zellen bei allen Propranololdosierungen auf Werte unter 9%

(1µM: 3,87±0,81%, 10µM: 4,05±2,17%, 100µM: 8,43±2,73%). Daher war bei allen

getesteten Propranololdosierungen ein hochsignifikanter Rückgang des Anteils

avitaler Zellen zu verzeichnen (p<0,01).

- 23 -

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 5µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

** ** **

Abb. 4: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 5µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 5µg/ml LPS (**p<0,01).

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 10µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

**

** **

**

Abb. 5: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 10µg/ml LPS (**p<0,01).

- 24 -

Für 30µg/ml LPS konnte ebenfalls ein deutliches Absinken der Rate avitaler Zellen

durch die Propranololgabe erreicht werden (Anhang Abb. 46) Im Vergleich zur

Stimulation mit 30µg/ml LPS mit einem Anteil von 60,67±6,18% avitaler Zellen war

ein hochsignifikanter Rückgang des Anteils avitaler Zellen (<22%) bei allen

Dosierungen zu beobachten (p<0,01). Dieser Trend konnte auch für höhere LPS-

Dosierungen gezeigt werden (Anhang Abb. 47, 48).

Somit ergab sich bei allen verwendeten LPS-Dosierungen bei Behandlung der

Zellen mit 1 bis 100µM Propranolol ein signifikanter Rückgang des Anteils avitaler

Zellen. Bei geringen LPS-Dosierungen war der Behandlungserfolg mit der höchsten

Propranololdosierung mit 100µM am wenigsten ausgeprägt.

- 25 -

4.2 Zellaktivität

Die Zellaktivität wurde 24 Stunden nach der Stimulation mit LPS mit dem

Zellproliferationsassay gemessen. Die optische Dichte (OD) ist direkt proportional

zur Zahl lebender Zellen.

4.2.1 Einfluss von LPS auf die Zellaktivität von T HP-1 Zellen

Eine Stimulation der Makrophagen mit 1, 5, 10, 20 und 30µg/ml LPS zeigte keine

signifikante Veränderung der Zellaktivität verglichen mit der Kontrollpopulation ohne

LPS mit 2,326±0,016 (Abb. 6). Ab einer Stimulation mit 40µg/ml LPS zeigte sich ein

hochsignifikanter Abfall der Zellaktivität (p<0,01). Bei 100µg/ml LPS betrug die

Zellaktivität 0,789±0,036. Somit zeigt sich eine dosisabhängige Reduktion der

Zellaktivität durch LPS in der Makrophagenkultur.

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

Kontrolle 1 5 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

LPS-Konzentration [µg/m l]

OD

**

****

** ****

**

Abb. 6: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit aufsteigenden LPS – Konzentrationen (n=6) im Vergleich zur Kontrolle (**p<0,01).

4.2.2 Einfluss von Insulin auf die Zellaktivität in LPS-stimulierten THP-1

Zellen

Verglichen mit der Stimulation der Makrophagen mit 10 µg/ml LPS

(OD 2,583±0,044) zeigte sich keine signifikante Veränderung der Zellaktivität bei

Behandlung mit 1 und 5U/ml Insulin (Abb. 7).

Ab der Zugabe von 10U/ml Insulin konnte eine hochsignifikante Verringerung der

Zellaktivität gezeigt werden. Die OD betrug 0,825±0,112 bei Zugabe von 25U/ml

Insulin (p<0,01).

Sehr ähnlich verhielt sich die Zellaktivität bei der Stimulation mit 20 und 30µg/ml

LPS (Abb. 8). Hier zeigte sich ein hochsignifikanter Abfall der Zellaktivität gegenüber

der Stimulation mit LPS bei einer Applikation von 20 und 25U/ml Insulin (p<0,01).

- 26 -

Die Stimulation mit 30, 40 und 50µg/ml LPS zeigte ein ähnliches Bild (Anhang

Abb. 49 - 51).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Kontrolle 10µgLPS

+1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

+20UInsulin

+25UInsulin

Zellbehandlung

OD

**

**

****

Abb. 7: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

Kontrolle 20µgLPS

+1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

+20UInsulin

+25UInsulin

Zellbehandlung

OD

*

**

**

Abb. 8: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 20µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01). Somit konnte bei allen verwendeten LPS-Dosierungen (10, 20, 30, 40 und 50µg/ml

LPS) ein hochsignifikanter Abfall der Zellaktivität für die Gabe von 20 und 25U/ml

Insulin beobachtet werden. Daher wurden diese hohen Insulindosierungen nicht für

weiterführende Experimente verwendet.

- 27 -

4.2.3 Einfluss von Propranolol auf die Zellaktivitä t in LPS-stimulierten THP-1

Zellen

Bei Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS betrug die Zellaktivität

2,583±0,044 (Abb. 9). Bis zur Applikation von 100µM Propranolol zeigte sich keine

signifikante Veränderung der Zellaktivität. Erst bei einer Applikation von 500µM

Propranolol konnte ein deutlicher hochsignifikanter Abfall in der Zellaktivität auf

0,239±0,006 (p<0,01) festgestellt werden.

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Kontrolle 10µg LPS +0,1µMPropranolol

+1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

+500µMPropranolol

Zellbehandlung

OD

**

Abb. 9: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

Kontrolle 20µg LPS +0,1µMPropranolol

+1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

+500µMPropranolol

Zellbehandlung

OD

**

Abb. 10: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 20µg/ml LPS (**p<0,01). Bei Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zugabe von Propranolol

zeigte sich ein nahezu identisches Bild wie schon bei 10µg/ml LPS. Bei Stimulation

mit 20µg/ml LPS betrug die Zellaktivität 2,222±0,043 (Abb. 10). Bis zur Applikation

von 100µM Propranolol zeigte sich keine signifikante Veränderung der Zellaktivität.

Bei Zugabe von 500µM Propranolol konnte ein hochsignifikanter Rückgang der

Zellaktivität auf 0,309±0,003 beobachtet werden (p<0,01).

- 28 -

Die Stimulation mit 30, 40 und 50µg/ml LPS zeigte ein ähnliches Bild (Anhang

Abb. 52-54).

Somit konnte bei allen verwendeten LPS-Dosierungen (10, 20, 30, 40 und 50µg/ml

LPS) ein hochsignifikanter Abfall der Zellaktivität für die Gabe von 500µM

Propranolol beobachtet werden. Daher wurde diese hohe Propranololdosierung

nicht für weiterführende Experimente verwendet.

- 29 -

4.3 Apoptose

4.3.1 JC-1 Färbung

Die Apoptoserate wurde 24 Stunden nach Stimulation der Makrophagen mit LPS

mittels JC-1 Färbung ermittelt.

4.3.1.1 Induktion von Apoptose in THP-1 Zellen durc h Lipopolysaccharid

Gegenüber der Kontrollpopulation mit einer Apoptoserate von 4,23±0,48% konnte

bei Stimulation der Makrophagen mit aufsteigenden Dosen von LPS eine stetige

Erhöhung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen beobachtet werden (Abb. 11, 12).

Bei Stimulation mit 5µg/ml LPS zeigte sich erstmals eine signifikante Erhöhung der

Apoptoserate auf 17,46±3,30% gegenüber der Kontrolle ohne LPS (p<0,05). Ab

10µg/ml LPS wurde die Steigerung des prozentualen Anteils apoptotischer Zellen

hochsignifikant (p<0,01). Bei Stimulation mit 20µg/ml LPS deutete sich nochmals ein

Anstieg der Apoptoserate auf 67,82±5,29% an. Eine Behandlung mit 30, 40 und

50µg/ml LPS führte zu einer Apoptoserate von 72,49±2,35%; 76,61±1,51% und

88,70±4,79%. Insgesamt zeigte sich ein dosisabhängiger Anstieg der Zahl

apoptotischer Zellen durch die Stimulation mit aufsteigenden Dosen von LPS.

0

25

50

75

100

Kontrolle 1 5 10 20 30 40 50

LPS-Konzentration [µg/ml]

% a

popt

otis

cher

Zel

len

*

******

**

**

Abb. 11: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit aufsteigenden LPS – Konzentrationen (n=5) im Vergleich zur Kontrolle (*p<0,05; **p<0,01).

- 30 -

. Abb. 12: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach JC-1 Färbung. Nahezu alle unbehandelten Zellen (Kontrollgruppe) zeigen eine punktierte grüne (A) bzw. rote (A’) Fluoreszenz als Zeichen für eine polarisierte Mitochondrienmembran (=nicht apoptotische Zellen); Ca. ein Drittel der mit 10µ/ml LPS behandelten Zellen zeigen nur eine diffuse grüne (B) bzw. rote (B’) Fluoreszenz ohne Punktierung (apoptotische Zellen), bei Stimulation mit 30µg/ml LPS sind ca. drei Viertel apoptotische Zellen zu sehen (C) und (C’), bei Stimuation mit 50µg/ml zeigen nahezu alle Zellen die diffuse grüne (D) bzw. rote (D’) Fluoreszenz ohne Punktierung, die für apoptotische Zellen charakteristisch ist (weißer Pfeil markiert Apoptosekörperchen).

- 31 -

4.3.1.2 Einfluss von Insulin auf den apoptotischen Effekt von LPS in THP-1

Zellen

Um negative Effekte der Behandlung mit Insulin allein auf die LPS-stimulierten

Zellen auszuschließen, führten wir zuerst eine Negativkontrolle mit Insulin in

aufsteigenden Konzentrationen durch (Tab. 3, Anhang Abb. 55). Es wurden keine

statistisch relevanten Änderungen der Apoptoserate verglichen mit der

Kontrollpopulation beobachtet.

Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 7,88±2,0910µg LPS 36,43±0,511U/ml Insulin 7,75±1,105U/ml Insulin 5,18±1,3110U/ml Insulin 7,61±2,5615U/ml Insulin 11,17±0,54

Tab. 3: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit Insulin [U/ml] (n=4).

Durch die Stimulation der Makrophagen mit 5µg/ml LPS erhöhte sich die Zahl

apoptotischer Zellen von 7,81±1,94% bei der Kontrolle auf 23,19±1,71%

(Abb. 13, 14). Durch Behandlung mit niedrigen Dosen Insulin (1 und 5U/ml) konnte

der Prozentsatz apoptotischer Makrophagen wieder auf das Niveau der

Kontrollpopulation gesenkt werden (1U/ml Insulin: 8,50±1,24% bzw. 5U/ml Insulin:

7,59±1,37%). Dies stellt gegenüber der Positivkontrolle mit LPS eine

hochsignifikante Absenkung der Apoptoserate dar (p<0,01). Die Therapie mit

höheren Dosen Insulin (10 und 15U/ml) erhöhte die Apoptoserate gegenüber der

Kontrolle geringfügig auf 12,85±1,19% beziehungsweise 11,10±2,77%. Verglichen

mit der Stimulation mit LPS war ein hochsignifikanter Rückgang der Apoptoserate

zu verzeichnen (p<0,01).

Bei Stimulation mit 10µg/ml LPS betrug die Zahl apoptotischer Zellen 36,01±1,22%

(Abb. 15). Hier senkte die Therapie mit allen verwendeten Dosierungen an Insulin

die Apoptoserate nahezu um die Hälfte verglichen zur Stimulation mit 10µg/ml LPS

(1U/ml Insulin: 20,13±3,42%; 5U/ml Insulin: 17,90±0,62%; 10U/ml Insulin:

18,44±2,84% bzw. 15U/ml Insulin: 19,76±2,94%). Dieser Abfall der Apoptoserate

war für alle Dosen Insulin hochsignifikant (p<0,01).

- 32 -

Abb. 13: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach JC-1 Färbung. Ca. ein Viertel der mit 5µ/ml LPS behandelten Zellen zeigen eine diffuse grüne (A) bzw. rote (A’) Fluoreszenz ohne Punktierung (=apoptotische Zellen; mit weißem Pfeil markiert). Im Gegensatz dazu zeigen nicht apoptotische Zellen eine punktierte grüne bzw. rote Fluoreszenz, welche die polarisierte Mitochondrialmembran repräsentiert. Wurden die mit LPS-stimulierten Zellen mit 1U/ml Insulin behandelt, reduziert sich der Anteil apoptotischer Zellen um mehr als die Hälfte (B bzw. B’). Nach Stimulation der Makrophagen mit 20 µg/ml LPS betrug die Apoptoserate

71,05±1,63% (Anhang Abb. 56). Hier konnte eine Behandlung mit niedrigen

Dosierungen an Insulin (1 und 5U/ml) die Apoptoserate signifikant auf Werte von

60,06±4,22% beziehungswiese 61,39±4,13% senken (p<0,05). Der Rückgang der

Apoptoserate war jedoch nicht so deutlich wie bei 5 und 10µg/ml LPS (p<0,05).

Behandlung mit hohen Dosen (10 und 15 U/ml) Insulin steigerte sogar die

Apoptoserate mit 86,20±5,44% beziehungsweise 81,35±2,72% signifikant über das

Niveau von 20µg/ml LPS (p<0,05).

- 33 -

0,00

10,00

20,00

30,00

Kontrolle 5µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

**

****

**

Abb. 14: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 5µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=4) im Vergleich zu 5µg/ml LPS (**p<0,01).

0,00

25,00

50,00

75,00

Kontrolle 10µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

******

**

Abb. 15: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=4) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).

- 34 -

Ein ähnliches Bild zeigte sich bei Stimulation der Zellen mit 30 µg/ml LPS (Anhang

Abb. 57). Hier betrug die Apoptoserate bei Stimulation mit 30µg/ml LPS

82,37±2,21%. Durch die Therapie mit 1U/ml Insulin konnte noch eine signifikante

Verringerung der Apoptoserate auf 73,35±2,31% erreicht werden (p<0,05). Bei

Applikation von 5 und 10U/ml Insulin kehrte sie auf das Niveau der Stimulation mit

30 µg/ml LPS zurück und erhöhte sich bei einer Behandlung mit 15U/ml Insulin

signifikant auf 95,07±4,27% (p<0,05).

Bei Stimulation der Makrophagen mit 40 µg/ml LPS betrug die Anzahl apoptotischer

Zellen 93,96±0,50% (Anhang, Abb. 58). Die Therapie mit 1 U/ml Insulin erbrachte

einen signifikanten Rückgang der Apoptoserate auf 89,54±1,84% (p<0,05) und fiel

damit wesentlich geringer aus als bei den vorherigen Dosierungen von LPS. Danach

stieg der Prozentsatz apoptotischer Zellen jedoch kontinuierlich an. Bei der

Behandlung mit hohen Dosen Insulin von 10 und 15U/ml zeigte sich im Vergleich

zur Stimulation mit 40 µg/ml LPS eine signifikante Erhöhung der Apoptoserate auf

98,25±1,75% beziehungsweise 100,00±0,00% (p<0,05).

Somit konnte vor allem in den Stimulationsgruppen mit 5 und 10µg/ml LPS bei allen

verwendeten Insulindosierungen (1, 5, 10 und 15U/ml) ein hochsignifikanter

Rückgang der Apoptoserate beobachtet werden (p<0,01). Bei höheren LPS-

Dosierungen konnten nur noch kleine Insulindosen, vor allem 1U/ml, einen

signifikanten Rückgang der Apoptoserate erreichen. Hohe Insulindosierungen

erhöhten die Apoptoserate noch über das Niveau der LPS-Stimulation.

- 35 -

4.3.1.3 Einfluss von Propranolol auf den apoptotisc hen Effekt von LPS

in THP-1 Zellen

Um negative Effekte der Behandlung mit Propranolol allein auf die LPS-stimulierten

Zellen auszuschließen, führten wir zuerst eine Negativkontrolle mit Propranolol

allein in aufsteigenden Konzentrationen durch (Tab. 4, Anhang Abb. 55). Es wurden

keine statistisch relevanten Änderungen der Apoptoserate für die Zellbehandlung

mit Propranolol verglichen mit der Kontrollpopulation beobachtet.

Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 7,88±2,0910µg LPS 36,43±0,511µM Propranolol 5,83±3,1010µM Propranolol 3,07±0,69

Tab. 4: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Propranolol [µM] verglichen mit der Kontrolle ohne LPS (n=4).

Für die Stimulation der Makrophagen mit 5µg/ml LPS ließ sich für die Behandlung

der Zellen mit Propranolol ein deutlicher antiapoptotischer Effekt nachweisen

(Abb. 16, 17). Bei Stimulation mit 5µg/ml LPS betrug die Apoptoserate 23,19±1,71%

verglichen mit der Kontrollpopulation ohne LPS mit 7,81±1,49%. Sowohl bei der

Therapiegruppe mit 1, als auch mit 10µM Propranolol wurde die Apoptoserate auf

7,34±1,49% beziehungsweise 3,53±0,86% gesenkt. Dieser hochsignifikante

Rückgang der Apoptoserate lag sogar noch unter der Apoptoserate der

Kontrollpopulation ohne LPS (p<0,01).

Auf etwas höherem Apoptoseniveau konnten wir dies auch für die Stimulation mit

10µg/ml LPS zeigen (Abb. 18). Bei Stimulation mit 10µg/ml LPS betrug die

Apoptoserate 36,01±1,22%. Bei Therapie mit 1 und 10 µM Propranolol sank die

Apoptoserate hochsignifikant auf 10,26±2,22% beziehungsweise 4,70±1,30%

(p<0,01). Somit hatte die Zahl apoptotischer Zellen bei 10 µM Propranolol wieder

das Niveau der Kontrollgruppe erreicht.

Bei Stimulation mit 20 µg/ml LPS betrug die Apoptoserate 71,05±1,63% (Anhang

Abb. 60). Nach anschließender Therapie mit Propranolol konnte sowohl bei

Therapie mit 1µM Propranolol ein signifikanter (p<0,05), als auch bei Therapie mit

10µM Propranolol ein hochsignifikanter Abfall der Apoptoserate auf 58,16±1,12%

beziehungsweise 60,95±2,54% beobachtet werden (p<0,01).

Bei Stimulation mit 30µg/ml LPS betrug der Anteil apoptotischer Zellen

82,37±2,21% (Anhang Abb. 61). So fiel zwar der Prozentsatz apoptotischer Zellen

durch die Behandlung mit 1µM Propranolol auf 78,58±2,49%. Dies wurde aber erst

bei 10µM Propranolol mit einer Apoptoserate von 74,71±1,69% signifikant (p<0,05).

- 36 -

Abb. 16: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach JC-1 Färbung. Ca. ein Viertel der mit 5µ/ml LPS behandelten Zellen zeigen eine diffuse grüne (A) bzw. rote (A’) Fluoreszenz ohne Punktierung (=apoptotische Zellen; mit weißem Pfeil markiert). Im Gegensatz dazu zeigen nicht apoptotische Zellen eine punktierte grüne bzw. rote Fluoreszenz, welche die polarisierte Mitochondrialmembran repräsentiert. Wurden die mit LPS-stimulierten Zellen mit 10µM Propranolol behandelt, betrug der Anteil apoptotischer Zellen 3,5% (B bzw. B’). Bei einer Stimulation der Makrophagen mit 40µg/ml LPS und nachfolgender

Applikation von Propranolol zeigte sich keine Änderungen der Apoptoserate im

Vergleich zur alleinigen LPS-Gabe (Anhang Abb. 62).

Somit konnte vor allem in den Stimulationsgruppen mit 5 und 10µg/ml LPS bei allen

verwendeten Propranololdosierungen (1 und 10µM) ein hochsignifikanter Rückgang

der Apoptoserate beobachtet werden (p<0,01). Bei höheren LPS-Dosierungen

konnte bei einer hohen Propranololdosierung von 10µM ein signifikanter Rückgang

der Apoptoserate erreicht werden (p<0,05).

- 37 -

0,00

10,00

20,00

30,00

Kontrolle 5µg LPS +1µM Propranolol +10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

**

**

Abb. 17: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 5µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Propranolol [µM] (n=4) im Vergleich zu 5µg/ml LPS (**p<0,01).

0,00

25,00

50,00

75,00

Kontrolle 10µg LPS +1µM Propranolol +10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

**

**

Abb. 18: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färubng) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=4) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).

- 38 -

4.3.1.4 Einfluss des NF- κB Signalwegs auf die Apoptose in LPS-stimulierten THP-1 Zellen

Um zu untersuchen, ob der NF-κB Signalweg für die LPS-induzierte Apoptose von

Bedeutung ist, wurde der nicht selektive Serinproteaseinhibitor TPCK eingesetzt,

der in Makrophagen eine Blockade des Apoptoseinduktors NF-κB herbeiführt.

Zunächst wurden einige Kontrollversuche durchgeführt, um die Effekte von TPCK

allein und in Kombination mit LPS auf die Makrophagenpopulation nach JC-1

Färbung zu untersuchen (Anhang Abb. 64). Zur Dosisfindung wurde dann ein

Titrationsversuch mit aufsteigenden TPCK-Konzentrationen (1, 10, 50µM)

durchgeführt (Tab. 5). Die Apotoserate wurde anhand der JC-1 Färbung ermittelt.

Bei 1µM TPCK konnte keine signifikante Veränderung der Apoptoserate im

Vergleich zur Kontrolle ohne LPS festgestellt werden. Bei höheren Dosierungen (10,

50µM TPCK) zeigte sich ein signifikant höherer Anteil an apoptotischen Zellen im

Vergleich zur Kontrollgruppe ohne LPS (p<0,01). Daher wurden diese hohen

Dosierungen nicht für weitergehende Versuchsreihen verwendet.

Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 2,85±0,6710µg/ml LPS 32,06±0,641µM TPCK 3,06±0,2910µM TPCK 35,82±3,9450µM TPCK 100,00±0,00

Tab. 5: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen nur mit TPCK [µM] (n=3). Bei Stimulation der Zellen mit 10 µg/ml LPS betrug der Anteil apoptotischer Zellen

32,06±0,64% (Anhang Abb. 64). Die zusätzliche Gabe von 1µM TPCK führte zu

einem hochsignifikanten Rückgang der Apoptose auf 13,22±0,21% (p<0,01). Somit

konnte der Serinproteaseinhibitor TPCK über den NF-κB Signalweg in einer

Dosierung von 1µM die LPS-vermittelte Apoptose deutlich reduzieren.

- 39 -

4.3.1.4.1 Einfluss des NF- κB Signalwegs auf die Reduktion der LPS-

induzierten Apoptose durch Insulin

Im nächsten Versuchsabschnitt wurden die Zellen mit 10 µg/ml LPS stimuliert und

anschließend 5U/ml Insulin hinzugegeben (Abb. 19). Zusätzlich zum Insulin wurde

TPCK hinzugegeben, um zu untersuchen, ob der NF-κB Signalweg an der

insulinvermittelten Apoptosereduktion beteiligt ist. Bei Stimulation der Zellen mit

10µg/ml LPS betrug der Anteil apoptotischer Zellen 22,04±1,51%. Die Behandlung

mit 5U/ml Insulin führte zu einem Rückgang der Apoptoserate auf 11,19±0,92%.

Nach der zusätzlichen Applikation von 1µM TPCK konnte eine Steigerung der

Apoptoserate auf das Niveau der Stimulation mit LPS beobachtet werden (5U/ml

Insulin + 1µM TPCK: 25,95±0,54%). Dieser Rückgang der Apoptoserate war im

Vergleich zur Therapie mit 5U/ml Insulin hochsignifikant (p<0,01).

0

25

50

Kontrolle 10µg LPS +5U Insulin +5U Insulin+1µM TPCK

% a

popt

otis

cher

Zel

len

**

Abb. 19: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit 5U/ml Insulin, sowie der Applikation von TPCK [µM] (n=3) im Vergleich zur Therapie mit 5U/ml Insulin (**p<0,01).

- 40 -

4.3.1.4.2 Einfluss des NF- κB Signalwegs auf die Reduktion der LPS-

induzierten Apoptose durch Propranolol

In diesem Versuchsabschnitt wurden die Zellen mit 10 µg/ml LPS stimuliert und

anschließend 10µM Propranolol hinzugegeben (Abb. 20). Zusätzlich zum

Propranolol wurde TPCK hinzugegeben, um zu untersuchen, ob der NF-κB

Signalweg an der propranololvermittelten Apoptosereduktion beteiligt ist. Die

Apoptoserate wurde mittels JC-1 Färbung ermittelt. Bei Stimulation der Zellen mit

10µg/ml LPS betrug die Apoptoserate 31,25±1,11% (Abb. 20). Die Behandlung mit

10µM Propranolol verringerte die Apoptoserate auf 7,60±0,42%. Bei gleichzeitiger

Applikation von 1µM TPCK zeigte sich ebenso eine hochsignifikante Steigerung der

Apoptoserate verglichen mit der Therapie mit 10µM Propranolol (p<0,01). Jedoch

kehrte die Zahl apoptotischer Zellen mit 20,31±1,37% nicht vollständig auf den

Stimulationswert von 10µg/ml LPS zurück.

0

25

50

Kontrolle 10µg/ml LPS +10µMPropranolol

+10µMPropranolol+1µM TPCK

% a

popt

otis

cher

Zel

len

**

Abb. 20: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit 10µM Propranolol sowie der Applikation von TPCK [µM] (n=3) im Vergleich zur Therapie mit 10µM Propranolol (**p<0,01).

- 41 -

4.3.1.5 Einfluss des PI3-K Signalwegs auf die Apopt oseinduktion in LPS-

stimulierten THP-1 Zellen

Um zu untersuchen, ob der PI3-K Signalweg für die zytoprotektive Wirkung von

Insulin in LPS-stimulierten Makrophagen bedeutsam ist, wurde der selektive PI3-K

Inhibitor Wortmannin eingesetzt. Zunächst wurden einige Kontrollversuche

durchgeführt, um die Effekte von Wortmannin allein und in Kombination mit LPS auf

die Makrophagenpopulation zu untersuchen. Die Apoptoserate wurde mittels JC-1

Färbung ermittelt (Anhang Abb. 65). Zur Dosisfindung wurde dann ein

Titrationsversuch mit aufsteigenden Wortmannin-Konzentrationen (1, 10, 50, 100,

200nM) durchgeführt (Tab. 6). Hier zeigte sich, dass Wortmannin in allen

verwendeten Dosierungen keine signifikante Änderung der Apoptoserate bewirkte,

wenn es allein oder in Kombination mit LPS appliziert wurde. Bei Applikation von

Wortmannin allein bewegte sich die Apoptoserate auf dem Niveau der

Kontrollgruppe ohne LPS, bei Kombination von LPS mit Wortmannin auf dem

Niveau der Positivkontrolle mit LPS.

Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 1,05±0,5410µ/ml LPS 26,79±1,22LPS + 1nM Wortmannin 27,73±1,11LPS + 10nM Wortmannin 24,84±1,29LPS + 50nM Wortmannin 27,87±0,90LPS + 100nM Wortmannin 26,93±1,31LPS + 200nM Wortmannin 27,28±0,481nM Wortmannin 2,65±1,3410nM Wortmannin 1,86±1,2250nM Wortmannin 2,15±0,42100nM Wortmannin 1,19±1,19200nM Wortmannin 0,94±0,47

Tab. 5: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Wortmannin [nM] sowie LPS kombiniert mit Wortmannin (n=3). Bei Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS betrug der Anteil apoptotischer Zellen

26,45±0,55%. Die Behandlung mit 5U/ml Insulin verringerte die Zahl apoptotischer

Zellen auf 13,06±1,99%. Durch die zusätzliche Applikation von 1nM Wortmannin

wurde die Apoptoserate wieder auf das Niveau der Stimulation mit LPS erhöht

(Abb. 21). Dieser Anstieg war hochsignifikant (p<0,01). Dies konnte auch bei den

anderen verwendeten Dosierungen beobachtet werden (Anhang Abb. 66).

- 42 -

0

25

50

Kontrolle 10µg LPS +5U Insulin +5U Insulin +1nMWortmannin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

**

Abb. 21: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit 5U/ml Insulin, sowie der Applikation von aufsteigenden Dosen Wortmannin [nM] (n=3) im Vergleich zur Therapie mit 5U/ml Insulin (**p<0,01).

- 43 -

4.3.2 TUNEL Färbung

Die Apoptoserate wurde 24 Stunden nach der Stimulation der Makrophagen mit

LPS mittels TUNEL Färbung ermittelt, um die Ergebnisse der JC-1 Färbungen zu

verifizieren.

4.3.2.1 Induktion von Apoptose in THP-1 Zellen durc h Lipopolysaccharid

Gegenüber der Kontrollpopulation mit einer Apoptoserate von 8,24±1,09% konnte

bei Stimulation der Makrophagen mit aufsteigenden Dosen von LPS eine stetige

Erhöhung des Prozentsatzes apoptotischer Zellen beobachtet werden (Abb. 22, 23).

Bei Stimulation mit 1µg/ml LPS zeigte sich erstmals eine signifikante Erhöhung der

Apoptoserate auf 12,89±1,96% gegenüber der Kontrolle ohne LPS (p<0,05). Ab

5µg/ml LPS (16,34±1,91%) wurde die Steigerung der Apoptoserate hochsignifikant

(p<0,01). Insgesamt zeigte sich ein dosisabhängiger Anstieg der Zahl apoptotischer

Zellen durch die Stimulation mit aufsteigenden Dosen von LPS.

0

25

50

75

100

Kontrolle 1 5 10 20 30 40 50

LPS-Konzentration [µg/ml]

% a

popt

otis

cher

Zel

len

*

**

**

**

**

**

**

Abb. 22: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit aufsteigenden LPS – Konzentrationen (n=4) im Vergleich zur Kontrolle (*p<0,05; **p<0,01).

- 44 -

Abb. 23: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-D). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Die unbehandelten Zellen (Kontrollgruppe) zeigen nahezu keine apoptotischen Zellen (A’). Nach Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS steigt der Anteil apoptotischer Zellen auf ca. ein Drittel (B’), nach Stimulation mit 30µg/ml sind ca. drei Viertel der Zellen apoptotisch (C’), bei Stimulation der Zellen mit 50µg/ml LPS steigt die Apoptoserate auf ca. 85% (D’).

- 45 -

4.3.2.2 Einfluss von Insulin auf den apoptotischen Effekt von LPS in THP-1

Zellen

Um negative Effekte der Behandlung mit Insulin allein auf die LPS-stimulierten

Zellen auszuschließen, führten wir zuerst eine Negativkontrolle mit nur Insulin in

aufsteigenden Konzentrationen durch (Tab. 6, Anhang Abb. 67). Es wurden keine

statistisch relevanten Änderungen der Apoptoserate für die verwendeten

Insulindosierungen verglichen mit der Kontrollpopulation beobachtet.

Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 7,24±2,1410µg LPS 28,98±0,211U Insulin 5,38±0,235U Insulin 5,96±0,5810U Insulin 9,37±1,4615U Insulin 10,72±0,48

Tab. 6: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (TUNEL-Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Insulin [U/ml] verglichen mit der Kontrolle ohne LPS (n=3).

Durch die Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS erhöhte sich die Zahl

apoptotischer Zellen von 7,24±2,14% bei der Kontrolle auf 36,52±1,13%

(Abb. 24, 25). Durch die Gabe niedriger Dosen Insulin (1 und 5U/ml) konnte der

Prozentsatz apoptotischer Makrophagen wieder auf das Niveau der

Kontrollpopulation gesenkt werden (1U/ml Insulin: 12,03±2,33% bzw. 5U/ml Insulin:

9,30±0,56%). Dies stellt gegenüber der Positivkontrolle mit LPS eine

hochsignifikante Absenkung der Apoptoserate dar (p<0,01). Die Gabe von höheren

Dosen Insulin (10 und 15U/ml) erhöhte die Apoptoserate gegenüber der Kontrolle

geringfügig auf 14,63±1,45% beziehungsweise 13,92±2,78%. Verglichen mit der

Stimulation mit LPS war ein hochsignifikanter Rückgang der Apoptoserate zu

verzeichnen (p<0,01).

Bei der Stimulation der Zellen mit 50µg/ml LPS betrug die Apoptoserate

84,35±0,65% (Abb. 26, 27). Durch die Gabe von Insulin konnte bei allen

verwendeten Dosierungen (1, 5, 10 und 15U/ml) eine hochsignifikante Absenkung

der Apoptoserate verglichen mit der Stimulation mit 50µg/ml LPS erreicht werden

(p<0,01). Innerhalb der Insulinbehandlung zeigte sich eine leicht ansteigende

Tendenz der Apoptoserate (1U/ml Insulin: 43,11±3,48%; 5U/ml Insulin:

50,35±1,55%; 10U/ml Insulin: 59,45±2,11% bzw. 15U/ml Insulin: 69,03±1,47%).

- 46 -

0

25

50

Kontrolle 10µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

*

****

**

Abb. 24: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).

Abb. 25: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-B). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Nach Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS zeigen ca. 35% der Zellen Zeichen von Apoptose (A’), nach Behandlung der mit LPS stimulierten Zellen mit 5U/ml Insulin betrug der Anteil apoptotischer Zellen ca. 10% (B’).

- 47 -

0

25

50

75

100

Kontrolle 50µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

**

**

**

**

Abb. 26: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (**p<0,01).

Abb. 27: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-B). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Nach Stimulation der Zellen mit 50µg/ml LPS zeigen ca. 85% der Zellen Zeichen von Apoptose (A’), nach Behandlung der mit LPS stimulierten Zellen mit 5U/ml Insulin betrug der Anteil apoptotischer Zellen ca. 50% (B’).

- 48 -

4.3.2.3 Einfluss von Propranolol auf den apoptotisc hen Effekt von LPS in

THP-1 Zellen

Um negative Effekte der Behandlung mit Propranolol allein auf die LPS-stimulierten

Zellen auszuschließen, führten wir zuerst eine Negativkontrolle mit nur Propranolol

in aufsteigenden Konzentrationen durch (Tab. 7, Anhang Abb. 67). Die

Apoptoserate wurde nach der TUNEL Färbung ermittelt. Es wurden keine statistisch

relevanten Änderungen der Apoptoserate für die Gabe von Propranolol verglichen

mit der Kontrollpopulation beobachtet.

Behandlung der THP-1 Zellen % apoptotischer ZellenKontrolle 7,24±2,1410µg LPS 28,98±0,211µM Propranolol 5,23±0,7910µM Propranolol 3,46±0,56

Tab. 7: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (TUNEL Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Propranolol [µM] verglichen mit der Kontrolle ohne LPS (n=3).

Unter dem Einsatz von Propranolol konnte die Zahl apoptotischer Zellen von

36,52±1,13% bei Stimulation mit 10µg/ml LPS deutlich auf 12,66±0,28% bei

Applikation von 1µM Propranolol gesenkt werden (Abb. 28, 29). Im Falle der

Behandlung mit 10µM Propranolol konnte die Apoptoserate auf das Niveau der

Kontrollgruppe verringert werden (8,40±0,44%). In beiden Fällen war dieser

Rückgang der Apoptoserate hochsignifikant (p<0,01).

Die Behandlung mit Propranolol bei einer Stimulation der Makrophagen mit 50µg/ml

LPS erbrachte ähnliche Ergebnisse (Abb. 30, 31). Bei Stimulation mit 50µg/ml LPS

betrug die Apoptoserate 84,35±0,49%. Die Behandlung mit Propranolol reduzierte

die Apoptoserate deutlich (1µM Propranolol: 53,57±2,15%, 10µM Propranolol:

45,16±6,43%). Bei beiden Dosierungen war der Rückgang der Apoptoserate

hochsignifikant (p<0,01). So konnte durch die Gabe von 10µM Propranolol nahezu

eine Halbierung der Apoptoserate im Vergleich zur Stimulation mit 50µg/ml LPS

erreicht werden.

- 49 -

0

25

50

Kontrolle 10µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

****

Abb. 28: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 10µg/ml LPS (**p<0,01).

Abb. 29: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-B). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Nach Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS zeigen ca. 35% der Zellen Zeichen von Apoptose (A’), nach Behandlung der mit LPS stimulierten Zellen mit 1µM Propranolol betrug der Anteil apoptotischer Zellen ca. 10% (B’).

- 50 -

0

25

50

75

100

Kontrolle 50µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

****

Abb. 30: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (TUNEL Färbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (**p<0,01).

Abb. 31: Repräsentative mikroskopische Aufnahme von THP-1 Makrophagen (400x) nach TUNEL Färbung. In der Durchlichtaufnahme zeigt sich die Gesamtzellzahl (A-B). Apoptotische Zellen zeigen eine rote Fluoreszenz (typische apoptotische Zelle mit weißem Pfeil markiert). Nicht apoptotische Zellen zeigen keine Fluoreszenz. Nach Stimulation der Zellen mit 50µg/ml LPS zeigen ca. 85% der Zellen Zeichen von Apoptose (A’), nach Behandlung der mit LPS stimulierten Zellen mit 1µM Propranolol betrug der Anteil apoptotischer Zellen ca. 50% (B’).

- 51 -

4.4 Inflammation

4.4.1 Interleukin-1 β

Die Konzentration von IL-1β im Zellkulturüberstand wurden 4, 8, 12 und 24 Stunden

nach der Stimulation der Zellen mit LPS mittels ELISA bestimmt.

4.4.1.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die IL-1 β Expression in THP-1

Zellen

4 Stunden nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS betrug die IL-1β Expression

3107±92pg/ml (Abb. 32). Verglichen mit der Kontrollpopulation mit 18±7pg/ml war

die Erhöhung der IL-1β Expression statistisch hochsignifikant (p<0,01). Nach 8

Stunden erhöhte sich die IL-1β Expression bei Stimulation der Zellen nochmals auf

3743±389pg/ml verglichen mit der Kontrolle mit 78±25pg/ml. Nach 12 und

24 Stunden wurde eine ähnliche IL-1β Expression gemessen. Zu allen gemessenen

Zeitpunkten (4, 8, 12 und 24h) war die Erhöhung der IL-1β Expression bei

Stimulation der Zellen mit 1µg/ml LPS verglichen mit der Kontrolle hochsignifikant

(p<0,01).

0

1000

2000

3000

4000

5000

4h 8h 12h 24h

Therapiedauer

IL-1

ß [p

g/m

l]

Kontrolle 1 µg/ml LPS

**

******

Abb. 32: IL-1β Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS im Vergleich zur Kontrolle ohne LPS (**p<0,01).

- 52 -

4.4.1.2 Einfluss von Insulin auf die IL-1 β Expression in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen

Die Spiegel des proinflammatorischen Zytokins IL-1β waren bei Stimulation mit

1µg/ml LPS im Vergleich zur Kontrollpopulation zu allen gemessenen Zeitpunkten

um mehr als das 35-fache erhöht (Abb. 33). Hierbei stieg im zeitlichen Verlauf die

IL-1β Expression bei Stimulation mit 1µg/ml LPS in 8 Stunden von 3107±92pg/ml

auf 3743±389pg/ml. Bei 12 und 24 Stunden wurde eine ähnliche IL-1β Expression

gemessen. Für die Zellbehandlung mit 1U/ml Insulin konnte im gesamten zeitlichen

Verlauf keine signifikante Senkung der Zytokinexpression erreicht werden. Nach

4 Stunden Behandlungsdauer mit höheren Dosen Insulin (5 bis 15 U/ml) fiel die

IL-1β Expression signifikant auf Werte unter 2096±411pg/ml ab. Im Fall von 5 und

15U/ml zeigte sich eine hochsignifikante Absenkung (p<0,01). Diese Absenkung

wurde auf einem etwas höheren Niveau auch bei 8 Stunden Behandlungsdauer

beibehalten (p<0,05). Nach 12 und 24 Stunden konnte zwar noch eine Verringerung

der IL-1β Expression erzielt werden, diese war jedoch nicht mehr statistisch

signifikant.

0

1000

2000

3000

4000

5000

4h 8h 12h 24h

Therapiedauer

IL-1

ß [p

g/m

l]

Kontrolle 1 µg/ml LPS + 1 U/ml Insulin + 5 U/ml Insulin + 10 U/ml Insulin + 15 U/ml Insulin

***

** *

**

Abb. 33: IL-1β Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Insulin [U/ml] im Vergleich zur Stimulation mit 1µg/ml LPS (*p<0,05, **p<0,01).

- 53 -

4.4.1.3 Einfluss von Propranolol auf die IL-1 β Expression in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen

Die IL-1β Expression stieg nach Stimulation mit 1µg/ml LPS zu allen Zeitpunkten im

Vergleich zur Kontrollpopulation stark an (Abb. 34). Obwohl für niedrige

Propranololkonzentrationen bis 10µM gegenüber der Stimulation mit 1µg/ml LPS zu

allen Zeitpunkten eine leichte Senkung der Zytokinexpression erreicht wurde, war

diese nicht signifikant. Bei Applikation von 100µM Propranolol stiegen die IL-1β

Spiegel weit über das Niveau der Stimulation mit 1µg/ml LPS auf Spitzenwerte bis

zu 10103±3591pg/ml nach 12 Stunden Therapiedauer an, um nach 24 Stunden

wieder auf 5685±2579pg/ml abzufallen.

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

4h 8h 12h 24h

Therapiedauer

IL-1

ß [p

g/m

l]

Kontrolle1 µg/ml LPS + 0,1 µM Propranolol + 1 µM Propranolol + 10 µM Propranolol + 100 µM Propranolol

Abb. 34: IL-1β Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Propranolol [µM] im Vergleich zur Stimulation mit 1µg/ml LPS (n.s. = nicht signifikant).

- 54 -

4.4.2 Tumornekrosefaktor α

Die Konzentration von TNFα im Zellkulturüberstand wurde 4, 8, 12 und 24 Stunden

nach der Stimulation der Zellen mit LPS mittels ELISA bestimmt.

4.4.2.1 Einfluss von LPS auf die TNF α Expression in THP-1 Zellen

4 Stunden nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS betrug die TNFα Expression

7147±944pg/ml (Abb. 35). Verglichen mit der Kontrollpopulation mit 27±16pg/ml war

die Erhöhung der TNFα Expression statistisch hochsignifikant (p<0,01). Nach

8 Stunden erhöhte sich die TNFα Expression bei Stimulation der Zellen auf

13959±3200pg/ml verglichen mit der Kontrolle mit 45±24pg/ml. Nach 12 Stunden

stieg die TNFα Expression nochmals leicht auf 14889±3472pg/ml bei Stimulation mit

1µg/ml LPS verglichen mit der Kontrolle mit 136±50pg/ml. Nach 24 Stunden

erreichte die TNFα Expression eine Endkonzentration von 19288±3563pg/ml

verglichen mit der Kontrolle mit 230±51pg/ml.

0

10000

20000

30000

4h 8h 12h 24h

Therapiedauer

TN

F a

lpha

[pg/

ml]

Kontrolle 1 µg/ml LPS

**

****

**

Abb. 35: TNFα Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS im Vergleich zur Kontrolle ohne LPS (**p<0,01).

- 55 -

4.4.2.2 Einfluss von Insulin auf die TNF α Expression in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen

Im Vergleich zur Negativkontrolle ohne LPS waren bei Stimulation der Zellen mit

1µg/ml LPS die Spiegel des proinflammatorischen Zytokins TNFα anfangs um mehr

als das 3000-fache von durchschnittlich 27±16pg/ml auf 7147±944pg/ml erhöht

(Abb. 36). Sie stiegen im Verlauf von 24 Stunden stetig bis auf einen Endwert von

19288±3563pg/ml an. Unter der Insulintherapie fiel auf, dass nur für 15U/ml ein

signifikanter Abfall von TNFα erreicht wurde (8h: p<0,05; 4, 12, 24h: p<0,01). Für 1

bis 10U/ml ergaben sich Werte auf dem Niveau von LPS oder noch über diesem

Niveau.

0

10000

20000

30000

40000

4h 8h 12h 24h

Therapiedauer

TN

F a

lpha

[pg/

ml]

Kontrolle 1 µg/ml LPS+ 1 U/ml Insulin + 5 U/ml Insulin+ 10 U/ml Insulin + 15 U/ml Insulin

*** **

**

Abb. 36: TNFα Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Insulin [U/ml] im Vergleich zur Stimulation mit 1µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

- 56 -

4.4.2.3 Einfluss von Propranolol auf die TNF α Expression in LPS-stimulierten

THP-1 Zellen

Bei der Zellbehandlung mit Propranolol konnte schon für 100µM bei der Messung

nach 4 Stunden ein signifikanter Rückgang der TNFα Konzentration im Vergleich

zur Stimulation mit 1 µg/ml LPS auf 2658±699pg/ml erreicht werden (p<0,05).

Dieser Abfall blieb auch bis zum Ende der Behandlungsdauer erhalten, stieg jedoch

im zeitlichen Verlauf leicht auf einen Endwert von 5194±1489pg/ml TNFα an und

wurde ab einer Dauer von 8 Stunden hochsignifikant (p<0,01; Abb. 37). Bei 1µM

Propranololapplikation begann der Abfall nach 8 Stunden Behandlungsdauer auf

eine TNFα Konzentration von 12559±2720pg/ml, bei 10µM nach 12 Stunden auf

einen Wert von 16191±2825pg/ml. Nach 24 Stunden Behandlungsdauer war bei

allen verwendeten Propranololkonzentrationen eine signifikante Suppression der

TNFα Spiegel auf Werte unter 16086±4561pg/ml messbar.

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

4h 8h 12h 24h

Therapiedauer

TN

F a

lpha

[pg/

ml]

Kontrolle 1 µg/ml LPS

+ 0,1 µM Propranolol + 1 µM Propranolol

+ 10 µM Propranolol + 100 µM Propranolol

*** *

****

* *

*

***

Abb. 37: TNFα Expression [pg/ml] 4, 8, 12 und 24h nach der Stimulation mit 1µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Propranolol [µM] im Vergleich zur Stimulation mit 1µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

- 57 -

5. Diskussion

Die Therapie einer Sepsis und eines systemic inflammatory response syndrome

(SIRS) gestaltet sich nach wie vor äußerst schwierig. Für eine optimale Therapie

gibt es verschiedene Ansätze. Neben der konservativen antibiotischen Therapie,

sowie den supportiven und lebenserhaltenden Maßnahmen befinden sich ebenfalls

immunmodulatorische Therapien der Sepsis in der klinischen Erprobung.57 Sie

fristen bis jetzt ein Nischendasein und sind in ihrer mortalitätssenkenden Wirkung

umstritten. Es gibt jedoch auch Verfahren, für die eine mortalitätssenkende Wirkung

anhand klinischer Studien nachgewiesen ist. Hierzu zählt die intensivierte

Insulinbehandlung, die von der Arbeitsgruppe um Van den Berghe entwickelt

wurde.59-63 Die mortalitätssenkenden Wirkungen des Insulin sind jedoch auf

zellulärer Ebene noch nicht vollständig geklärt. Makrophagen spielen eine zentrale

Rolle in der zellulär vermittelten Immunität. Sie nehmen aber auch auf die humorale

Immunität Einfluss (Abb. 38). Zudem stehen Makrophagen am Anfang der

Sepsiskaskade. Dies bedeutet, dass sie in die Sepsiskaskade noch vor Beginn der

durch B-Zellen vermittelten humoralen Immunantwort eingreifen.

Abb. 38: Ablauf der Sepsiskaskade.

Systemische inflammatorische

Reaktion

Hyper -metabolismus

Proteinabbau (Katabolie)

Multiorgan -versagen

Infektion (Bakteriämie)

LPS (Endotoxin)

AAAkkk ttt iii vvv iii eeerrruuunnnggg vvvooonnn MMMaaakkkrrroooppphhhaaagggeeennn

Ausschüttung proinflammatorischer

Zytokine

Endothel -dysfunktion

Gerinnungs -störungen

- 58 -

5.1 Einfluss von Lipopolysaccharid auf die Makropha genkultur

LPS stimuliert Makrophagen dosisabhängig und wirkt hierbei über den LPS-

Rezeptorkomplex, der sich aus CD 14 Toll-like receptor 4 (TLR4) und dem myeoloid

differentiation protein-2 (MD-2) zusammensetzt.23 Wie in der Literatur beschrieben

erhöht LPS die Ausschüttung proinflammatorischer Zytokine, wie IL-1, IL-6 oder

TNFα und ruft dabei einen sepsisähnlichen Zustand hervor.9 Dies konnten wir

anhand der Stimulationsversuche bestätigen. Zudem wird für LPS eine Apoptose

induzierende Wirkung postuliert.5,13 Aliprantis und Kollegen konnten in einer Studie

mit THP-1 Makrophagen zeigen, dass bakterielle Lipoproteine über den Toll-like

Receptor-2 Apoptose auslösen.5 Für die Makrophagenlinie RAW 264.7 konnte

durch Castrillo et alteri eine Apoptoseinduktion durch LPS nachgewiesen werden.13

Diese apoptoseinduzierende Wirkung konnte im THP-1 Modell ebenfalls sowohl

anhand der TUNEL als auch mit Hilfe der JC-1 Färbung nachvollzogen werden.

5.2 Einfluss von Insulin auf LPS-stimulierte Makrop hagen

Für Insulin wird in der Literatur eine zytoprotektive und antiapoptotische Wirkung

beschrieben.1,35,37-40,42 Es konnte bereits von verschiedenen Arbeitsgruppen gezeigt

werden, dass Insulin in der Lage ist, den Zelltod in Oligodendrozyten, epithelialen

Zellen oder Karzinomzelllinien zu verhindern.10,49,66 Im Verbrennungsmodell konnten

diese Insulineffekte von der Arbeitsgruppe um Jeschke bestätigt werden, indem sie

nachwiesen, dass Insulin in endotoxämischen Ratten einen Leberschaden

abwenden und die Leberfunktion aufrechterhalten konnte.40,42 Die Proliferation der

Hepatozyten konnte zusammen mit der Konzentration von Bcl-2, einem pro-

mitogenen Signalprotein gesteigert werden. Des Weiteren konnte Insulin die

Apoptose in Hepatozyten verringern. Dies spiegelte sich in einer verringerten

Konzentration der proapoptotischen Signalproteine Caspase-3 und -9 wider. Somit

zeigte sich eine deutliche Verbesserung der Lebermorphologie.42 Außerdem wurde

die hepatische Proteinsynthese durch Gabe von Insulin gesteigert. Die Produktion

von Albumin war erhöht, während niedrigere Spiegel von CRP gemessen wurden.

Die Freisetzung der Leberenzyme AST und ALT als Indikatoren für einen

Leberschaden wurde signifikant durch Insulin verringert.40 Iida und Kollegen konnten

im Zellmodell mit THP-1 Makrophagen Apoptose induzieren, indem sie den Zellen

Serum als Nährmittel entzogen und sie damit „aushungerten“.35 Mittels eines DNA-

Fragmentationsassays wurde die Apoptoserate bestimmt. Wurden diese Zellen mit

Insulin behandelt, verringerte sich die Apoptoserate signifikant. Zudem war die DNA

der THP-1 Makrophagen weniger fragmentiert. Diese zytoprotektiven und

antiapoptotischen Insulineffekte zeigten sich auch im vorliegenden

- 59 -

LPS-Zellstimulationsmodell mit THP-1 Makrophagen für niedrige Insulindosierungen

(1 bis 15U/ml). Durch Insulingabe konnte in LPS-stimulierten Zellen die Zellviabilität

signifikant gesteigert werden. Die Gabe von Insulin führte des Weiteren zu einer

Senkung der Apoptoserate in LPS-stimulierten Makrophagen. Folglich konnte für

niedrige Dosen Insulin in der mit LPS-stimulierten THP-1 Zelllinie eine eindeutige

Zytoprotektion und antiapoptotische Wirkung aufgezeigt werden.

Weiterhin konnte in LPS-stimulierten Makrophagen zusätzlich zu den

antiapoptotischen und zytoprotektiven Insulineffekten auch ein antiinflammatorischer

Effekt durch die Gabe von Insulin nachgewiesen werden. Dies zeigte sich in einer

verringerten Ausschüttung der proinflammatorischen Zytokine TNFα und IL-1β in

LPS stimulierten THP-1 Zellen nach einer Behandlung mit Insulin. Der

antiinflammatorische Effekt des Insulin war jedoch weit geringer ausgeprägt als er in

einem Verbrennungsmodell in Ratten von Dagmar Klein und Kollegen gezeigt

werden konnte.42 In ihrem Modell wurden Ratten mittels eines

Verbrennungstraumas in einen endotoxämischen Zustand versetzt. Nach

24 Stunden zeigte sich bereits eine signifikante Erhöhung der hepatischen IL-1β

mRNA Expression in der reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-

PCR). Diese erhöhte sich noch in den nachfolgenden sieben Tagen. Insulin

verringerte die Expression von IL-1β mRNA. Für die Expression der hepatischen

TNF mRNA konnte ebenfalls eine ähnliche Kinetik nachgewiesen werden. Auf

Proteinebene konnte diese antiinflammatorische Wirkung von Insulin im

Rattenmodell bestätigt werden. Diese Ergebnisse konnten von der Gruppe um

Jeschke auch im Verbrennungsmodell bestätigt werden. Insulin verminderte in

ihrem Verbrennungsmodell die systemische inflammatorische Reaktion und zeigte

somit antiinflammatorische Wirkung.37-39 In einer Studie an endotoxämischen Ratten

wurden die Serumelektrolytwerte sowie die Blutglukosespiegel der Ratten der

Kontrollgruppe sowie im Therapiearm mit Insulin untersucht. Hier zeigten sich keine

signifikanten Unterschiede38. Daher postulierten sie, dass diese Effekte eher nicht

durch eine indirekte Insulinwirkung mittels Modulation des Glukose- oder

Elektrolytmetabolimus vermittelt, sondern durch direkte antiinflammatorische

Mechanismen des Insulins induziert wurden.

- 60 -

5.3 Einfluss von Propranolol auf LPS-stimulierte Ma krophagen

Bis dato gibt es noch keinen eindeutigen Beleg für eine zytoprotektive oder

antiapoptotische Wirkung von Propranolol. Es existieren jedoch klinische Studien,

die eine positiven anabolen Einfluss von Propranolol auf den Metabolismus nach

einem schweren Verbrennungstrauma nahe legen.31-34 Die Arbeitsgruppe um

Herndon konnte beispielsweise in einer klinischen Studie an Kindern mit akuten

Verbrennungen zeigen, dass die Herzfrequenz und der Ruheenergieumsatz durch

die β-Blockade verringert wurden und die Nettomuskelproteinbalance gesteigert

werden konnte.33 In einer weiteren klinischen Studie an Verbrennungsopfern

konnten sie einen positiven Langzeiteffekt von Propranolol darlegen. Wurde die

Propranololdosierung so titriert, dass die Herzfrequenz um 20 Prozent verringert

wurde, konnte eine Senkung der Herzlast sowie eine fettige Degeneration der Leber

verhindert werden.34 Über die genauen Wirkmechanismen auf zellulärer Ebene ist

jedoch noch wenig bekannt. Für die Therapie mit Propranolol konnten wir eine

signifikante Erhöhung der Zellviabilität in LPS-stimulierten Makrophagen

nachweisen. Dieser zytoprotektive Effekt könnte mit der antiinflammatorischen

Wirkung von Propranolol erklärt werden.

Bei Stimulation der Zellen mit LPS und anschließender Therapie mit Propranolol

konnte ein signifikanter Rückgang der Expression des proinflammatorischen

Zytokins TNFα beobachtet werden. Für die Sekretion von IL-1β ließen sich keine

statistisch relevanten Änderungen der Zytokinexpression bei der Gabe von

Propranolol feststellen. Dies bestätigt auch die Ergebnisse einer tierexperimentellen

Studie von Kawakami und Kollegen.41 Sie konnten in einem Verbrennungsmodell an

Mäusen einen erhöhten Plasmaspiegel von Adrenalin nachweisen. Eine

transdermale Verbrennung von 20 Prozent der gesamten Hautoberfläche der Mäuse

führte zu einem Anstieg der IL-1α Konzentration. IL-1α stellt ebenso wie IL-1β eine

Isoform der Interleukin 1 – Familie dar. Dies konnte durch eine Vorbehandlung mit

Propranolol nicht verhindert werden. Anders verhielt es sich bei dem ebenfalls

proinflammatorisch wirkenden Zytokin IL-6. Nach Applikation einer 20-prozentigen

Verbrennung erhöhte sich die Expression von IL-6. Eine Vorbehandlung mit

Propranolol reduzierte diesen Effekt.44

In der JC-1 Färbung beobachteten wir bei Stimulation mit LPS nach Therapie mit

niedrigen Propranololdosierungen einen hochsignifikanten Rückgang der

Apoptoserate. Zum Teil ging dieser antiapoptotische Effekt sogar so weit, dass die

Apoptoserate unter das Niveau der Kontrolle gesenkt werden konnte. Diese

Ergebnisse bestätigten sich auch in der TUNEL Färbung. Infolgedessen konnte bei

- 61 -

Stimulation mit LPS ein zytoprotektiver, antiapoptotischer und antiinflammatorischer

Effekt des nicht selektiven β-Blockers Propranolol nachgewiesen werden.

5.4 Rolle des NF- κB Signalwegs für die antiapoptotische Wirkung von

Insulin und Propranolol

Nuclear transcription factor κB (NF-κB) spielt sowohl bei der Stimulation der

Makrophagen mit LPS als auch beim Apoptosevorgang eine entscheidende

Rolle.1,13,18 Aida und Schröder konnten in einem LPS-Stimulationsmodell an der

J774.1A Makrophagenzelllinie zeigen, dass an der LPS-vermittelten Zytotoxizität

NF-κB als Signalprotein beteiligt ist.1 Der Serinprotease – Inhibitor N-α-tosyl-L-

phenylalanin-chloromethyl-ketone (TPCK) ist in der Lage, NF-κB indirekt zu

blockieren, indem es die Iκ-Bα Protease inhibiert. Das Protein IκBα hält in

unstimulierten, nicht apoptotischen Zellen NF-κB im Zytoplasma und verhindert eine

Transduktion in den Kern. Proinflammatorische Mediatoren wie TNFα oder LPS

vermitteln über Ihre Bindung an Zelloberflächenrezeptoren eine Dissoziation des

IκBα vom NF-κB Komplex. Dies führt zu einer Phosphorylierung und proteolytischen

Degradation des Inhibitors IκBα durch die IκBα Protease (vgl. Abb. 39). 10µM TPCK

konnten in Ihrem Zellmodell die Zytotoxizität im MTS-assay von 1µg/ml LPS

komplett aufheben.1 In unseren Versuchsreihen war TPCK in der Lage, den

zytoprotektiven Effekt von 5U/ml Insulin nach Stimulation der Makrophagen mit

10µg/ml LPS gänzlich aufzuheben. Nach Stimulation der Zellen mit LPS zeigte sich

eine erhöhte Apoptoserate in der JC-1 Färbung. Nach Behandlung der Zellen mit

Insulin konnte ein antiapoptotischer Effekt nachgewiesen werden. Die Inhibition des

antiapoptotischen Effekts von Insulin durch TPCK zeigte sich darin, dass nach

Zugabe von 1µM TPCK zur Behandlung mit 5U/ml Insulin die Apoptoserate wieder

auf das Niveau der Stimulation der Zellen mit 10µg/ml LPS anstieg. In unserem

Zellmodell reichte daher schon eine geringere Menge TPCK aus, um die

zytoprotektiven und anitapoptotischen Effekte von Insulin aufzuheben. Dandona und

Kollegen postulierten ebenfalls einen antiinflammatorischen Effekt des Insulins, der

in monozytären Zellen unter anderem durch den NF-κB Signalweg vermittelt

wurde.18 In einer klinischen Studie an adipösen Patienten wurde einer

Insulintherapie (2,0 - 2,5 IU/h in 5%-iger Glukoselösung intravenös) eine alleinige

Applikation von 5-prozentiger Glukoselösung gegenübergestellt. Es zeigte sich ein

signifikanter Abfall der NF-κB Konzentration in den Monozyten im

Insulintherapiearm. Zudem konnte ein Absinken der freien Sauerstoffradikale (ROS)

beobachtet werden, welche ebenfalls proinflammatorische Effekte vermitteln.18 Die

Arbeitsgruppe um Dandona assoziierte in einer weiteren klinischen Studie an

- 62 -

Myokardinfarktpatienten damit auch einen möglichen antiatherogenen

Langzeiteffekt des Insulins.17 Ein ähnlicher antiapoptotischer Effekt konnte in

unserem Zellversuchsmodell bei der Propranololtherapie beobachtet werden. Bis

dato gibt es noch keine Studien zur Rolle des NF-κB Signalwegs bei der

antiapoptotischen Wirkung von Propranolol. Der antiapoptotische Effekt von 10µM

Propranolol in der JC-1 Färbung konnte jedoch nicht komplett aufgehoben werden.

Dennoch wurde die Zytoprotektion von Propranolol stark reduziert. Wurde TPCK

zusammen mit LPS verabreicht, kam es in der Makrophagenpopulation zu einem

signifikanten Rückgang der Apoptoserate im Vergleich zur Kontrolle. Hieraus kann

man schlussfolgern, dass LPS über den NF-κB Signalweg apoptotisch wirkt. Auch

Insulin und Propranolol wirken über den NF-κB Signalweg antiapoptotisch. Dies

bedeutet, dass NF-κB in unserem Zellmodell sowohl proapoptotische als auch

antiapoptotische Effekte vermittelt. Aus diesen Ergebnissen kann man somit

schließen, dass sowohl die Wirkung von LPS als auch die zytoprotektiven und

antiapoptotischen Wirkungen von Insulin und Propranolol in THP-1 Makrophagen

unter anderem über den NF-κB Signalweg vermittelt werden.

Abb. 39: Die NF-κB Signalkaskade und deren Inhibition durch TPCK.

NF-κB: Nuclear transcription factor κB TPCK: Serinprotease – Inhibitor N- α-tosyl-L-phenylalanin-chloromethyl-ketone

Iκ-Bα-Protease

NF-κB

NF-κB Komplex

Iκ-Bα

Transkription

TPCK

LPS

- 63 -

5.5 Rolle des PI3-K Signalwegs für die antiapoptoti sche Wirkung von Insulin

Über die Insulinsignalkette ist in der Literatur schon einiges bekannt.23 Insulin bindet

an die zelloberflächenständigen Insulinrezeptoren, wodurch nun Insulin-Rezeptor-

Substrat 1 (IRS-1) an den Rezeptor binden kann. IRS-1 wird dann durch die

Posphatidylinositol-3-Kinase (PI3-K) zu IRS-1-P phosphoryliert. IRS-1-P vermittelt

nun verschiedene Effekte, zum Beispiel die Translokation des Glukosetransporter

GLUT4 aus dem Zytosol in die Zellmembran (vgl. Abb. 39). Zudem vermittelt

IRS-1-P verschiedene metabolische Effekte von Insulin.23 Die PI3-Ks gehören zu

einer Familie von Signaltransduktionsenzymen, die für die Regulierung von

Zellproliferation und Zellüberleben mitverantwortlich sind. Sie scheinen eine große

Rolle während der Inflammation und Sepsis zu spielen.64 Eine von Williams und

Kollegen durchgeführte Tierstudie legt nahe, dass eine erhöhte PI3-K Expression

das Zellüberleben begünstigt.65 Im CLP Mausmodell fanden die Autoren heraus,

dass eine teilweise Inhibition des PI3-K Signalwegs durch Wortmannin und

LY294002 das Überleben der Mäuse minderte. Wortmannin inhibiert spezifisch die

PI3-K und unterbricht damit die Signalkaskade. In unserer Versuchsanordnung

konnte Wortmannin die Zytoprotektion von Insulin vollständig aufheben. Die

Inhibition des antiapoptotischen Effekts von Insulin zeigte sich darin, dass nach

Zugabe von Wortmannin in Dosen von 1 bis 200nM zur Behandlung mit 5U/ml

Insulin die Apoptoserate wieder auf das Niveau der Stimulation der Makrophagen

mit 10µg/ml LPS anstieg. Zusätzlich führten wir einige Kontrollversuchsreihen durch,

um negative Effekte von Wortmannin auf die Zellkultur auszuschließen. Weder bei

der Kultur mit LPS und Wortmannin noch bei der Kontrollgruppe mit Wortmannin

allein, zeigten sich statistisch relevante Veränderungen der Apoptoserate verglichen

mit der Kontrollpopulation mit beziehungsweise ohne LPS-Stimulation. Aus diesen

Daten lässt sich ableiten, dass die Zytoprotektion und der antiapoptotische Effekt

von Insulin unter anderem über den PI3-K Signalweg vermittelt werden. Dies

bestätigte auch eine Studie von Iida und Kollegen, in der die Autoren einen

antiapoptotischen Effekt von Insulin in durch Serum- und somit Nährmittelentzug

ausgehungerten Makrophagen nachweisen konnten.35 Sie assoziierten den

zytoprotektiven Effekt von Insulin mit einer erhöhten mRNA Expression und

Proteinproduktion des antiapoptotischen Bcl-XL Gens. Zudem bestimmten sie die

PI3-K Aktivität, indem sie die Aktivität von radioaktiv markiertem Phosphatidylinositol

bestimmten, das mit 32P gelabeltem ATP phosphoryliert wurde. Insulin stimulierte

die PI3-K Aktivität deutlich und konnte mittels Wortmannin aufgehoben werden.

Allerdings muss man in Betracht ziehen, dass Wortmannin auch teilweise den MAP-

Kinase Signalweg blockiert und dass somit einige der zytoprotektiven und

- 64 -

antiapoptotischen Effekte des Insulins auch über den MAP-K Signalweg vermittelt

werden könnten (Abb. 40).

Abb. 40: PI3-K Signalkaskade und dessen Wirkung am Insulinrezeptor.

Die hier erarbeiteten Ergebnisse bieten insbesondere hinsichtlich der zellulären

antiapoptotischen und zytoprotektiven Wirkungsmechanismen von Insulin und

Propranolol einen erheblichen Erkenntnisgewinn. Es besteht allerdings noch

erheblicher Forschungsbedarf, um diese Effekte vollständig zu verstehen. Inwiefern

sich diese Erkenntnisse auf den klinischen Alltag und insbesondere auf die Therapie

septischer Patienten übertragen lässt, muss anhand weiterer klinischer Studien

belegt werden.

GLUT4 Insulinrezeptor

IRS-1

PI3K GLUT4

IRS-1-P

PI3K

MAP-K

Mitogenes Signal

Andere Signalvermittler

Transkription

PI3K: Phosphatidylinositol -3-Kinase GLUT4: Glukosetransportprotein 4 IRS-1: Insulin-Rezeptor-Substrate 1 MAP-K: mitogen-acivated-protein-kinase

Wortmannin

- 65 -

6. Ausblick

In der vorliegenden Arbeit wurden die antiapoptotischen und antiinflammatorischen

Effekte von Insulin und Propranolol auf LPS-stimulierte THP-1 Zellen untersucht.

Wir wählten hierfür Makrophagen, da sie eine zentrale Rolle im Abwehrgeschehen

im menschlichen Körper übernehmen und oft den ersten Kontakt zu einem

pathogenen Agens herstellen. Jedoch sind die Möglichkeiten in der Zellkultur

beschränkt und lassen sich selten eins zu eins auf den Menschen übertragen, der

ein wesentlich komplexeres Gefüge an Interaktionen darstellt, als man es in-vitro

nachstellen könnte. Hierzu gab es auch schon tierexperimentelle Ansätze, wie zum

Beispiel das Verbrennungsmodell oder das Endotoxämiemodell an Ratten oder

Mäusen. Ebenfalls denkbar wäre das „second hit“ Modell. Daher wäre der nächste

logische Schritt die Ergebnisse der Insulin- und Propranololstudien anhand

klinischer Studien bei septischen Patienten zu überprüfen. Es gibt bereits einige viel

versprechende klinische Versuche hierzu. Die Gruppe um Van den Berghe

postuliert eine Blutzuckereinstellung für kritisch Kranke unter 110mg/dl durch eine

intensivierte Insulintherapie, wodurch sich die Mortalität erheblich senken ließe.59-63

Propranolol solle laut der Forschungsgruppe um Herndon in der Lage sein, durch

eine Senkung der Herzfrequenz um 20 Prozent, die katabole Stoffwechsellage bei

Verbrennungspatienten umzukehren, sowie die Nettoskelettmuskelmasse positiv zu

beeinflussen.31-34 Aber all diese Studien untersuchten nur ein sehr beschränktes

Patientengut und sind in ihrer Aussagekraft folglich eingeschränkt. In wie weit sich

diese Ergebnisse auf septische Patienten übertragen ließen, müsste anhand einer

groß angelegten Multicenterstudie geprüft werden. Hier besteht noch erheblicher

Forschungsbedarf. Auch eine Kombination von Insulin und Propranolol wäre

denkbar. In wiefern sich die antinflammatorischen und antiapoptotischen Effekte

potenzieren würden oder synergetisch wirkten, ist nicht abzusehen. Es bleibt aber

für die Zukunft zu hoffen, dass sich die positiven antiapoptotischen und

antiinflammatorischen Eigenschaften von Insulin und Propranolol im klinischen

Alltag bestätigen und dadurch die Mortalität bei Sepsispatienten gesenkt werden

kann. Es gibt auch erste Ansätze, selektivere PI3-K Inhibitoren, die nur die δ-

Isoform des Enzyms inhibieren, als Therapieoption bei inflammatorischen wie auch

autoimmunen Erkrankungen einzusetzen.64 In wie weit sich diese neuen

Therapieansätze im klinischen Alltag etablieren können, ist noch offen.

- 66 -

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Cornerstone 5: 56 - 63 (2003)

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patients, Endocr Pract 10: 17 -20 (2004)

- 73 -

61. Van den Berghe G., Wilmer A., Hermans G., Meersseman W., Wouters P. J.,

Milants I., Van Wijngaerden E., Bobbaers H., Bouillon R., Intensive insulin

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62. Van den Berghe G., MD, PhD, Wouters P., MSc, Weekers F., MD, Verwaest

C., MD, Bruyninckx F., MD, Schetz M., MD, PhD, Vlasselaers D., MD,

Ferdinande P., MD, PhD, Lauwers P., MD, Bouillion R., MD, PhD, Intensive

insulin therapy in critically ill patients, N Engl J Med 345: 1359 – 1367 (2001)

63. Van den Berghe G., Wouters P. J., Bouillon R., Weekers F., Verwaest C.,

Schetz M., Viasselaers D., Ferdinande P., Lauwers P., Outcome benefit of

intensive insulin therapy in the critically ill: Insulin dose versus glycemic

control, Crit Care Med 31: 359 - 366 (2003)

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phosphoinositositide 3-kinase inhibitors, Chem Biol 10: 207 - 213 (2003)

65. Williams D. L., Li C., Ha T., Ozment-Skelton T., Kalbfleisch J. H., Brooks L.,

Breuel K., Schweitzer J. B., Modulation of the phosphatiside 3-kinase

pathway alters innate resistance to polymicrobial sepsis, J Immunol 172: 449

- 456 (2004)

66. Wu X., Fan Z., Masui H., Rosen N., Mendelsohn J., Apoptosis induced by an

anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human

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67. Yano M., Hasegawa G., Ishii M., Yamasaki M., Fukui M., Nakamura N.,

Yoshikawa T., Short-term exposure of high glucose concentration induces

generation of reactive oxygen species in endothelial cells: implication for the

oxidative stress associated with postprandial hyperglycemia, Redox Rep 9:

111 - 116 (2004)

- 74 -

8. Abkürzungsverzeichnis

α alpha

β beta

κ kappa

% Prozent

°C Grad Celsius

µg/ml Mikrogramm pro Milliliter

µl Mikroliter

µM Mikromolar

Abb. Abbildung

ALT Alanin-Aminotransferase

APC anigen presenting cells

AST Aspartat-Aminotransferase

ATP Adenosintriphosphat

Bcl B-cell lymphoma

ca. circa

Cat.-No. Katalognummer

CRP C-reaktives Protein

CO2 Kohlendioxid

DNA Deoxyribonucleic acid

E. coli Escherichia coli

ELISA enzyme-linked immunosorbent assay

et al. et alteri

FBS fetal bovine serum

GLUT Glukosetransporter

h hora

IL-1β Interleukin-1 beta

IU/kg International Units pro Kilogramm

IRS-1 Insulin-Rezeptor-Substrat 1

JC-1 5,5‘,6,6‘-tetrachloro-1,1‘,3,3‘-teraethylbenzimidazolyl-

carbocyamine iodide

LPS Lipopolysaccharid

MAP-Kinase mitogen-activated-protein-kinase

MD-2 myeoloid differentiation protein-2

mg/dl Milligramm pro Deziliter

- 75 -

min Minute

ml Milliliter

mmHg Millimeter Quecksilbersäule

mRNA messenger ribonucleic acid

MTS (3-(4,5-dimethyldiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-

phenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium

nM Nanomolar

NF-κB nuclear factor kappa B

nm Nanometer

n Numerus

RT-PCR reverse transcription-polymerase chain reaction

ROS reactive oxygen species

OD optische Dichte

p Irrtumswahrscheinlichkeit

P Phosphat

PBS phosphate buffered saline

PMA phorbol 12-myrisate 13-acetate

pg/ml Picogramm pro Milliliter

pH Potentia hydrogenii

PI3-K Phosphatidylinositol3-Kinase

rpm rounds per minute

RPMI Roswell Park Memorial Institute

RT Raumtemperatur

SIRS systemic inflammatory response syndrome

Tab. Tabelle

THP-1 Human acute monocytic leukemia cell line

TLR4 Toll-like receptor 4

TNFα Tumornekrosefaktor alpha

TPCK N-p-Tosyl-L-Phenylalaninchloromethylketon

TUNEL terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP

nick end labeling

U Units

U/ml Units pro Milliliter

USA United States of America

vgl. vergleiche

z.B. zum Beispiel

z.T. zum Teil

- 76 -

9. Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

Publikation:

Leffler M, Hrach T, Stuerzl M, Horch RE, Herndon DN, Jeschke MG: Insulin

Attenuates Apoptosis and Exerts Anti-Inflammatory Effects in Endotoxemic Human

Macrophages, J Surg Res 2007

- 77 -

10. Anhang

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 20µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

**

* * *

Abb. 41: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 20µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 30µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

* *** *

Abb. 42: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 30µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

- 78 -

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 40µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

Abb. 43: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 40µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 50µg LPS +1U Insulin +5U Insulin +10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

*

**

**** **

Abb. 44: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Insulin [U/ml] (n=3) verglichen mit 50µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

- 79 -

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 20µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

**** **

**

Abb. 45: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 20µg/ml LPS (**p<0,01).

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 30µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

** ** **

Abb. 46: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 30µg/ml LPS (**p<0,01).

- 80 -

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 40µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len

**

** **

Abb. 47: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 40µg/ml LPS (**p<0,01).

0

20

40

60

80

100

Kontrolle 50µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

vita

ler

Zel

len **

** **

Abb. 48: Prozentualer Anteil an avitalen THP-1 Zellen (Trypanblaufärbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Therapie mit Propranolol [µM] (n=3) verglichen mit 50µg/ml LPS (**p<0,01).

- 81 -

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Kontrolle 30µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

+20UInsulin

+25UInsulin

Zellbehandlung

OD

**

**

***

Abb. 49: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 30µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Kontrolle 40µgLPS

+1UInsulin

+5U Insulin

+10U Insulin

+15U Insulin

+20U Insulin

+25U Insulin

Zellbehandlung

OD

*

**

**

Abb. 50: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 40µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Kontrolle 50µgLPS

+1UInsulin

+5U Insulin

+10UInsulin

+15UInsulin

+20UInsulin

+25UInsulin

Zellbehandlung

OD

**

**

Abb. 51: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=6) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

- 82 -

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Kontrolle 30µg LPS +0,1µMPropranolol

+1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

+500µMPropranolol

Zellbehandlung

OD

*

**

Abb. 52: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 30µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Kontrolle 40µg LPS +0,1µMPropranolol

+1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

+500µMPropranolol

Zellbehandlung

OD

**

Abb. 53: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 40µg/ml LPS (**p<0,01).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

Kontrolle 50µg LPS +0,1µMPropranolol

+1µMPropranolol

+10µMPropranolol

+100µMPropranolol

+500µMPropranolol

Zellbehandlung

OD

*

**

Abb. 54: Zellaktivität der THP-1 Zellen, repräsentiert durch die optische Dichte (OD) im Zellproliferationsassay, 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=6) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

- 83 -

0

10

20

30

40

Kontrolle 10µg LPS 1U Insulin 5U Insulin 10U Insulin 15U Insulin 1µMPropranolol

10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

*

Abb. 55: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Insulin [U/ml] und Propranolol [µM] (*p<0,05, n=4).

0,0

25,0

50,0

75,0

100,0

Kontrolle 20µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

Therapieoption

% a

popt

otis

cher

Zel

len

* *

* *

Abb. 56: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 20µg/ml LPS (*p<0,05).

- 84 -

0,00

25,00

50,00

75,00

100,00

Kontrolle 30µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len *

*

Abb. 57: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 30µg/ml LPS (*p<0,05).

0,0

25,0

50,0

75,0

100,0

Kontrolle 40µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

** *

Abb. 58: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 40µg/ml LPS (*p<0,05).

- 85 -

0

25

50

75

100

Kontrolle 50µg LPS +1UInsulin

+5UInsulin

+10UInsulin

+15UInsulin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

Abb. 59: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Therapieoption mit Insulin [U/ml] (n=3) im Vergleich zu 50µg/ml LPS (*p<0,05; **p<0,01).

0,0

25,0

50,0

75,0

100,0

Kontrolle 20µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

Therapieoption

% a

popt

otis

cher

Zel

len

* **

Abb. 60: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 20µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 20µg/ml LPS (*p<0,05, **p<0,01).

- 86 -

0,00

25,00

50,00

75,00

100,00

Kontrolle 30µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len *

Abb. 61: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 30µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 30µg/ml LPS (*p<0,05).

0,0

25,0

50,0

75,0

100,0

Kontrolle 40µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

Abb. 62: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 40µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 40µg/ml LPS.

- 87 -

0

25

50

75

100

Kontrolle 50µg LPS +1µMPropranolol

+10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

Abb. 63: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 50µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit Propranolol [µM] (n=3) im Vergleich zu 50µg/ml LPS.

Zellbehandlung

0

25

50

Kontrolle 10µg/ml LPS LPS + 1µMTPCK

1µM TPCK

% a

popt

otis

cher

Zel

len

**

Abb. 64: Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Behandlung mit LPS und TPCK [µM] und nur TPCK [µM] (n=3); (**p<0,01).

- 88 -

0

25

50

Kontrolle 10µg/ml LPS LPS + 1nMWortmannin

1nM Wortmannin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

Abb. 65: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (JC-1 Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit LPS und Wortmannin [nM] und nur Wortmannin [nM] (n=3).

0

25

50

Kontrolle 10µg LPS +5U Insulin +5U Insulin+1nM

Wortmannin

+5U Insulin+10nM

Wortmannin

+5U Insulin+50nM

Wortmannin

+5U Insulin+100nM

Wortmannin

+5U Insulin+200nM

Wortmannin

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

****

******

Abb. 66: Prozentualer Anteil apoptotischer THP-1 Zellen (JC-1 Färbung) 24h nach der Stimulation mit 10µg/ml LPS und der entsprechenden Zellbehandlung mit 5U/ml Insulin, sowie der Applikation von aufsteigenden Dosen Wortmannin [nM] (n=3) im Vergleich zur Behandlung mit 5U/ml Insulin (**p<0,01).

- 89 -

0

25

50

Kontrolle 10µg LPS 1U Insulin 5U Insulin 10U Insulin 15U Insulin 1µMPropranolol

10µMPropranolol

Zellbehandlung

% a

popt

otis

cher

Zel

len

Abb. 67: Kontrollen zur Apoptose in Makrophagen (TUNEL Färbung) nach 24h mit Negativkontrolle ohne LPS, Positivkontrolle mit Stimulation der Makrophagen mit 10µg/ml LPS, sowie Kontrollen mit nur Insulin [U/ml] und Propranolol [µM] verglichen mit der Kontrolle ohne LPS (n=3).

- 90 -

11. Danksagung

Die vorliegende Arbeit wurde in der Plastisch- und Handchirurgischen Klinik der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg unter der Leitung von Herrn

Prof. Dr. med. R. E. Horch (Direktor) angefertigt.

Für die Bereitstellung des Arbeitsplatzes und die großzügige finanzielle

Unterstützung möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr. med. R. E. Horch

bedanken.

Für die Vergabe des Themas, die konstruktive Betreuung und Unterstützung sowie

die aus zahlreichen Diskussionen hervorgegangenen Anregungen bedanke ich mich

sehr herzlich bei Dr. med. Mareike Leffler.

Mein besonderer Dank gilt Frau Simone Beck, MTA für die hervorragende

technische und sehr freundschaftliche Zusammenarbeit, ohne die das Gelingen

dieser Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

Im Übrigen möchte ich allen Kolleginnen und Kollegen der Arbeitsgruppe des

Zellbiologischen Labors und des klinischen Genanalyselabors danken, die mir

jederzeit mit ihrer Hilfe unterstützend zur Seite standen.

- 91 -

12. Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Thomas, Herbert H r a c h

Wohnort: Bergstraße 12

91623 Sachsen b. Ansbach

Tel.: 09827 / 6750

Geboren: 18.03.1981 in Ansbach

Staatsangehörigkeit: deutsch

Familienstand: ledig

Eltern: Hermann Hrach, Bundesbahnhauptsekretär a.D.

Inge Hrach, Steuerfachgehilfin

Schulbildung:

09/1987 - 07/1991: Rusam - Volksschule Sachsen

09/1991 - 06/2000: Platen - Gymnasium Ansbach

Abschluss: Abitur (Note: gut)

Wehrdienst:

07/2000 - 04/2001: JaBoG 32, Lagerlechfeld

Hochschulbildung:

04/2001 - 07/2007: Friedrich - Alexander - Universität Erlangen

03/2003: Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung

(Note: befriedigend)

06/2007: Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung

(Note: befriedigend)

Praktische Erfahrungen:

09/2003: Famulatur: Innere Medizin, Gemeinschaftspraxis für

Hämatologie und internistische Onkologie /

Nephrologie, Dres. M. Hahn, S. Müller, K. Bittner,

Ansbach

- 92 -

09/2004: Famulatur: Chirurgie, Chirurgische Klinik mit Poliklinik

der Friedrich - Alexander - Universität, Abteilung für

Plastische und Handchirurgie,

Prof. Dr. med. R. E. Horch, Erlangen

07/2004 - 08/2004: Famulatur: Chirurgie, Klinikum Ansbach,

Unfallchirurgie, Priv.-Doz. Dr. med. V. Hendrich

09/2005 - 10/2005: Famulatur: Innere Medizin: Internistische

Hausarztpraxis, Dr. med C. Ott, Lichtenau

02/2006 - 06/2006: 1. Tertial des Praktischen Jahres: Frauenheilkunde

und Geburtshilfe, Universitäts-Frauenklinik, Erlangen

06/2006 - 10/2006: 2. Tertial des Praktischen Jahres: Klinikum Neumarkt,

Chirurgische Klinik, Neumarkt i.d.OPf.

10/2006 - 01/2007: 3. Tertial des Praktischen Jahres: Klinikum Neumarkt,

Medizinische Klinik II, Neumarkt i.d.OPf.

Seit 09/2007 Tätigkeit als Assistenzarzt der Abteilung Innere

Medizin der Kreisklinik Weißenburg

Publikation:

Leffler M, Hrach T, Stuerzl M, Horch RE, Herndon DN, Jeschke MG: Insulin

Attenuates Apoptosis and Exerts Anti-Inflammatory Effects in Endotoxemic Human

Macrophages, J Surg Res 2007

Weißenburg, den 15. Mai 2011 ____________________

Thomas Hrach