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Die Bedeutung der Aldehyd-Dismutation fur die Essiggarung ;

von Alfred Bertho und Kali Pada Basu.

[Aus dem Chemischen Laboratorium der Bayer. Akademie der Wissenschaften.]

(Eingelaufen am 18. November 1930).

In zwei fruheren Arbeitenl) wurde dargelegt, daD die Dismutierungsleistung der Essigbakterien gegenuber Bcet- aldehyd nur fur einen geringen Bruchteil der bei der Essiggarung auftretenden Essigsaure verantwortlich ge- macht werden kann und da5 ebenso wie gegenuber Alkohol auch gegenuber dem intermediar gebildeten Bldehyd in der Hauptsache Sauerstoff als Akzeptor wirkt und die Bildung der Essigsaure veranla5t. Diese durch zahlreiche experi- mentelle Belege gestutzte Auffassung war der von C. Neu- b e r g , F. W i n d i s c h und E. Mol ina r i2 ) vertretenen ent- gegengesetzt. Diese Antoren vertraten ursprunglich die Snsicht, da5 auch unter aeroben Bedingungen ausschlieplich die Dismutation des Aldehyds fur den Vorgang der Essig- bildung in Frage kommt. Mol ina r i3 ) betonte aber dem- gegenuber neuerdings, daD bei tadelloser Aeration Aldehy d und SauerstoflF in Wettbewerb urn den Aldehydwasserstoff treten. Als Hauptbeweisstiick fur ihre Auffassung fuhrten N e u b e r g und M o l i n a r i an, da5 es ihnen wiederholt ge- lungen sei, bei der Vergarung reinen Aldehyds unter aeroben Bedingungen in gro5eren Mengen Alkohol zu isolieren. Sie erklaren dies damit, daD die Mutasewirkung der Alkohol- dehydrasewirkung vorauseile und finden hierin auch eine Erklarung, warum sich im GarprozeS kein Aldehyd an-

I) H. W i e l s n d u. A. Bertho, A.467,98-157(1928); A. Bertho,

2, Bio. Z. 166, 454 (1925); Naturw. IS, 993 (1925); 14, 758 (1926). 3, Bio. Z. 216, 187 (1929).

A. 474, 1-64 (1929).

B e r t h o u. B a s u , Bedeutung d. Aldehyd-Dismutation usw. 27

sammle. Aus der Literatur sind bis vor kurzem keine Versuche N e u b e r g s und seiner Mitarbeiter bekannt ge- worden, wo unter oplimalen Bedingungen der Sauerstoff- versorgung, wie sie i n unseren Versuchen gewahlt worden waren, die Alkoholbildung gepruft wurde. Derartige Ver- suche sind neuerdings voh E. Simon') mi t Bacterium pasteurianum im N e u b e r g schen Institut durchgefuhrt worden.

I n Fortsetzung unserer fruheren ausfiihrliehen Unter- suchungen haben wir vor Jahresfrist unter den bisher ge- wahlten optimalen Bedingungen der Sauerstoffversorgung und in moglichster Anpassung an die Simonschen Ver- suche z, ebenfalls Versuche daru ber angestellt, ob nennens- werte Mengen Alkohol bei der Urnwandlung des Aldehyds in Essigsaure unter dem EinfluB des Essigferments ent- stehen. Fir erwarteten iiierbez epne Alkoholmenge, die nicht iiber den Betrag hinausging, loie er nach deer Dismutierungsleistung der BaRterien unter anaeroben Bedingungen, die ubereinstimmend von N e u b e r g und Windisch3) (bei Gegenwart oder Ab- wesenheit von Calciumcarbonat) und un.s4) (bei Gegenwart oder Abwesenheit von Acetatpuffer pH 5,6) destimmt worden war, zu erwarten ist. Diese Dismutierungsleistung war unter anaeroben Bedingungen ermittelt worden. Es wurde von uns fruher gezeigt, da5 sie bei Zugrundelegung der ermit- telten Werte fur den aeroben Versuch bei weitem nicht ausreicht, die entstandene Essigsauremenge zu erklaren. Da es sinnwidrig ware, dal3 eine fur den anaeroben Zell- stoffwechsel typische Reaktion, die Dismutierung, unter aeroben Bedingungen erheblich rascher verliefe, wird die Verwendung ihrer unter anaeroben Bedingungen ermittelten Reaktionsgeschwindigkeit fur eine Betrachtung unter aeroben

l) Bio. Z. 244, 253 (1930). Vgl. auch Nachschrift Bio. Z. 216, 215 (1929).

*) Herr Prof. Neuberg hatte die Liebenswiirdigkeit, uns eine Einsichtnahme in einen Teil des Versuchsmaterials von Herrn Dr. S i - mon zu gestatten. A. B.

a) Bio. Z. 166, 471ff. (1925). 4, A. 467, 144ff. (1928); 4i4, 57 (1929).

28 B e r t h o uiid B a s u ,

Verhaltnissen gerechtfertigt. Diese Uberlegungen sind ausschlaggebend gewesen, urn die geringe Redeutung der Mutasewirkung bei der Essiggarung zu erkennen. Durch- aus in Ubereinstimmung damit steht die Tatsache, daD, als Alkohol den Essigbakterien im aeroben Versuch als Donator dargeboten wurde, bisweilen groSere Mengen Aldehyd ge- funden wurden, die nicht auftreten durften, wenn die Uis- mutierung der Dehydrierung, die in diesem Fall allein den Alkohol betrafe, vorauseilt. Wenn andererseits diese An- sammlung von Aldehyd in anderen Fallen nicht in diesem hohen Mafie beobachtet wurde, manchmal praktisch uber- haupt ausblieb, dann kommt darin nur die grofie Affinitat des Sldehyds zur Dehydrasel) zum 9usdruck.

Uberdies haben wir bei einer groflen Reihe von Bar- croft-Versuchen verschiedener Dauer, in denen Aldehyd bei optimaler Sauerstoffversorgung den Bakterien zur Oxy- dation dargereicht wurde, niemals eine wesentliche Unter- bilanz an Sauerstoff im Vergleich zur gebildeten Essigsaure beobachtet, wie sie festzustellen sein muflte, wenn infolge des Vorauseilens der Mutasewirkung iiber die Dehydrase- wirkung auf dismutativem Weg gebildeter Alkohol nur einer teilweisen Dehydrierung anheimfiele und somit in grofierer Menge angesammelt wiirde.

I n bester Ubereinstinimung mit unseren bisherigen Be- funden ergab sich erwartungsgemafl, da13 i n den nachfol- genden Versuchen, in denen in grofleren Ansatzen in Al- koholbildung unter aeroben (und vereinzelt auch anaeroben) Bedingungen studiert wurde, Alkoholmengen gefunden wurden, wie sie nach der iibereinstimmend uort N e u b e r g und M i t - a ~ b e i t e r n und uns ermittezten Dismutierungsleistung der Essig- bakterien erwartet iuerden mussen. Diese Mengen diirfen im aeroben Versuch kleiner sein als im anaeroben, da im letzteren Fall eine Weiteroxydation des Alkohols nicht mog- lich ist. Die Versuchsdauer betrug stets etwa 15 Minuten, die Temperatur 28-30'. Nach dieser Zeit war ein groDer Teil des Sldehyds noch unverandert vorhanden. Unter

') A. 474, 40 (1929).

Die Bedeutung der Aldehyd-Bismutation fur die Essiggarung. 29

diesen Bedingungen besteht, wie auch E. S imon feststellte, am ehesten die Xoglichkeit, den auf dismutativem Weg gebildeten Slkohol zu fassen, ehe e r der Dehydrierung an- heimgefallen war. Unsere Versuche sind sowohl bei Gegen- wart von Calciumcarbonat, als auch i m saueren Bereich durchgefiihrt worden. Im letzteren Fall unterblieb in den meisten Versuchen ein Zusatz von Puffer; die sauere Re- aktion kam durch Eigensauerung der Bakterien zustande. Bei Versuchsende ergab sich in diesen Fallen ein pH von 3,5-4. Ein Versucli mit Acetatpuffer pH 5,6 wurde eben- falls durchgefiihrt. Aus allen diesen Versuchen geht hervor, da8 der in Frage kommende p,-Bereich in quantitativer Hinsicht keine Unterschiede bedingt, ganz i n Ubereinstim- mung mit fruheren Feststellungen, da13 Sauerstoffaufnahme') und Uismutierung (vgl. oben) in eben diesem Bereich nicht wesentlich variieren. Die aufgefundenen Alkoholmengen, die, wie erwahnt, die Grenze des anaeroben Dismutierungs- alkchols nicht iiberschritten, betrugen 2-10 Proc. der unter Zugrundelegung der Dismutierungsgleichung theoretisch zu erwartenden Menge.

E. S i m o n 2 ) hat die Alkoholbildung bei optimaler Sauer- stoffversorgung in Gegenwart von Calciumcarbonat und spater bei Gegenwart von Acetatpuffer pH 5 ,53 studiert. Dieses letztere pH entsprach nahezu demjenigen unserer friiheren Versuche. S imon findet in seinen Versuchen mit Calciumcarbo- not, also bei neutraler Reektion, Alkoholmengen, die zwischen 4 und 14 Proc. des umgesetzten Aldehyds betragen. Unter Zugrundelegung der Dismutierungsgleichung sind also rund 8-28 Proc. der theoretisch zu erzvarteden Alkoholmenge ent- standen. Andererseits ergaben seine Versuche bei Gegen- wart von Acetatpuffer, da8 die Ausbeuten an Alkohol zwischen 0,8 und 2,9 Proc. der Theorie (bei Annahme der Dismutierung) lagen. S imon schlieflt daraw, da13 i m sauren Milieu die Mutasewirkung schwacher ist. Sie mii8te dem- nach bei neutraler Reahtion gerade IOmaZ starker sein, als bei sauerer, sofern man die Annahme macht, da8 derjenige

*) A. 467, 106 (1928). 2, Bio. Z. 224, 278 (1930).

30 B e r t h a und B a s u ,

unter den Bedingungen des Versuchs zweifellos nicht allzu groDe Anteil des auf dismutativem Wege gebildeten Al- kohols, der bereits der Alkoholdehydrasewirkung verfallen ist, in beiden FBllen prozentual gleich ist. Eine derartige Peststellung steht in glattem Widerspruch zu der von N e u b e r g und Mitarbeitern und uns (S. 27, Anm. 3 und 4) in fruheren Versuchen festgestellten Dismutierungs1eistung.l) Sie findet keine Restatigung in den vorliegenden Ver- suchen.

Die erwahnten Prozentzahlen sind als Vergleichsbasis ungeeignet. Sie gestatten keine Aussage iiber die absolute Geschwindigkeit der Dismutierung. Wir wahlen daher, um einen Vergleich mi t unseren nachfolgenden Beobachtungen anstellen zu konnen, als Vergleichsbasis die pro Gramm Bakterien und Stunde auf dismutativem Nege gebildete Menge Alkohol, in gleicher Weise wie es von unserer Seite, allerdings unter Zugrundelegung der im gleichen Mol- verhaltnis wie Alkohol gebildeten Blenge Essigsanre bisher geschehen ist.

Wir finden in einem Versnch mit Calciumcarbonat unter aeroben Bedingungen eine Blkoholbilduug Ton 5,25 my pro Gramm Bakterien und Stunde, in einem zweiten mi t einer anderen Kultur 13,05 mg pro Gramm Bakterien und Stunde, wahrend der dem letzteren entsprechende, auch im Bak-

l) Weitere einwandfreie Bclege sind au8 einer Arbeit von C. N e u - b e r g u. M. K o b e l , Ph. Ch. 139, 631 (1928) (Haberband) zu entnebmen. Aus den an dieser Stelle (S. 637-639) aufgeftuhrten Daten und Kurven- bildern die Acetaldehyddismutierung von Bacterium pestearianum uuter auaeroben Bedingungen betreffend, ergibt sich, dab in neutralern und i n saurem Milieu h i t und ohne Carbonat) die Dismzltierungsgeschwin- digkeiten, numal ini ersten Reaktionsintervall, nicht versohieden sind. Aus Tab. 1 und Figg. 4-6 lassen sich folgende Werte erinitteln: mit Carbonat 32,3, 25,6, 36,3; ohne Carbonat 36, 29, 27 mg Alkobol pro Gramm Bakterien und Stunde. Die betreflenden Versucbe sind bei 37O C durcbgefubrt. Da der Temperaturkoeffiaient der Disrnutie- rungsreaktion rund 2 ist [A. 4 i 4 , 60 (1929)], erniedrigen sich diese Werte fur Temperatwen von 28-30° C urn nicht ganz die Halfte. Die Mengenverhaltnisse und Konzentrationen liegen i m selben Bereich wie in unseren nacbfolgenden Versuchen. Deren Ergebnisse und ebenso uusere friiberen Befunde sind somit durch diese Arbeit bestiitigt.

Die Bedeuturig der Bldehyd-&mutation f u r die Essigggarung, 31

terienmaterial durchaus identische anaerobe Ansatz eine Alkoholbildung von 25,G5 mg pro Gramm und Stunde aufweist.

Drei aerobe Versuche ohne jeglichen (Carbonot- oder Pufler)-Zusatz lieferten 10,5, 3,9, 23,8 7n9 pro Gramm Bak- terien und Stunde, ein aerober Versuch bei Gegenwart von Acetatpuffer (p, 5,6) 24,8 nig pro Gramm und Stunde.

Die angrfiilirten Disinutierungsleistun!lelz sind sowohl bei neu- traler, als auch 6ei saufer Xeaktion von der Grope, iuie wir sie friiher fanden. Ein grundsatzliclter Unterschied in der Alkohol- bildung bei neutralem oder sauerem p H ist aicht erkennbar. Der Fert der anaeroben Dismutierung wird bei der Dismutie- rung unter aeroben Ferhaltni.wen offenbar nicht iiberschritten.

Da6 mehrere Werte an der obersten Grenze der Dismutierungs- leistung liegen, hangt damit zusammen, daB im allerersten Reaktions- interval1 (etwa 15 Minuten) die Dismutierungsleistung am hochsten ist, wahrend die friiher von uns ermittelten Werte Durchschnittswerte aus mehreren Stunden darstellen und daher im allgemeinen niederer sind.')

Wir haben uns durch Kontrollversuche, in denen die anreichernde Destilltttion mit ahnlichen Mengen Alkohol und Aldehyd durchgefiihrt wurde, wie wir sie in unseren Versuchen auffanden, vergewissert, da6 unsere Bestimmungsmethoden euverlassig sind. Unser Bakterienmaterial entstammte ein und derselben Stammkultur von Bacterium pasteuri- awum, die auch schon in unseren fruheren Versuchen benutzt worden war (Materialbereitung vgl. dort). Die einzelnen Zuchtungen wurden sorgfaltig durch Differemfarbung nach G r a m kontrolliert. Da, wie wir fanden, die Bakterien unter den Bedingungen unserer Versuche doch ohne Gegenwart von Aldehyd eine kleine Menge einer Sub- stanz liefern, die durch die Z e i s e l bestimmung festgestellt werden kann (S. 32), ist an unseren direkt ermittelten Alkoholwerten eine kleine Korrektur angebracht.

Bus den Versuchen S imons bei Gegenwart von Car- bonat (II-XV auf S. 280/281 a. a. 0.) ergeben sich folgende, mit unseren obigen direkt vergleichbaren Werte: 84, 97, 34, 63, 33, 116, 134, 86, 140, 122, 91, 133, 66, 79 mg Alkohol pro Gramm Bakterien und Stunde. Diese Werte sind im Durchschnitt wesentlich hoher als die entsprechenden unserer Versuche (vgl. oben). F u r die Versuche bei Gegen-

1) Vgl. Kurvenbilder in der zitierten Arbeit von C. N e u h e r g und M. Kobel .

32 B e r t h o m d B a s u ,

wart von Acetatpuffer pH 5,53 lassen sich aus der S imon- schen Arbeit (S. 283/284 a. a. 0.) folgende Werte ermitteln: 12, 14, 4, 6, 8, 8, 11, 11, 11, 12 mg Alkohol pro Gramm Bakterien und Stunde. Dieses letztere Resultat stimmt m i t den von uns in der vorliegenden Arbeit und in fruheren Untersuchungen ermittelten, ebenfalls direkt vergleichbaren Werten genugend uberein. Es bildet eine vollkommene Be- statigung unserer wiederholt dargelegten Auffassung vom Wesen der Essiggarung. Die Beobachtung Simons , da8 unter aeroben Bedingnngen bei neutraler Reaktion eine rund 10mal groDere Uismutierung auftritt als in sauerer, vermogen wir an unserem Bakterienstamm nicht za be- statigen.

Die eineelnen Bakterienkulturen sind durch romische Ziffern be- zeichnet.

Ve r suche u n t e r Z u s a t z v o n C a l c i u m c a r b o n a t . Nit dem Bakterienmaterial I wurden zwei Schuttel-

versuche angestellt: bei Gegenwart von Calcium- I carbonat

1. mit Bakterien allein, 2. mit Bakterien und Aldehyd

und jeweils nach anreichender Destillation und event. Entfernnng des Aldehyds im leteten Destillat nach Z e i s e l - F a n t o der Alkohol be- stimmt.

3. Ein weiterer Destillationsversuch wurde nur mit entsprechenden Mengen Aldehyd allein angestellt, uni auch in diesem Fall das Er- gebnis der Zeiselbestimmung zu ermitteln.

12. 11. 29. 1. 5 gewohnliche Fliissigkeitsflaschen von je500ccm Inhalt wurden jeweils folgendermaBen beschickt : 8 ccm Bakteriensus- pension (= 157,6 mg, Bact. pasteurianum I, 17 Tage alte Hultur, geerntet am 11. 11. 29., 19,7 mg/ccm), 0,5 g CaCO,, 82 ccm W-asuer, insgesamt etwa 90 ccm. Die Flaschen wurden im Wasserthermostaten (‘rem- peratur 28,OO) krlftig bewegt, 120-140 Hin- und Hergange in der Minute. Die Luft hatte ungehindert Zutritt. Nach 15 minutigem Schutteln wurden alle Funf Inhalte anreichernd destillicrt. Gute Kiih- lung. Gefunden wurde eine Jodsilbermenge, die 2,l mg Alkohol ent- sprach, die demnach aus 0,788 g Bakteriensubstanz herriihrten.

Bei der Annahme, da8 der Alkohol aus zelleigener Substanz der Bakterien gebildet wird, ergabe sich pro Gramm Bakterien eine Alkoholmenge von 2,67 mg. Dieser

Die Bedeutung der Aldehyd-Disrnutation f iir die Zssiggiirung 33

Wert wird im folgenden stets zur Ermittlung eines Xor- rekturgliedes benutzt.

14. 11. 29. 2. Bakt. I. 5 Flaschen waren jeweils fdgendermalen beschickt: 1 0 ccm Bakteriensuspension (= 197 mg), 6 ccm Aldehyd- losung (enthaltend 110 mg Aldehyd), 0,5 g CaCO,, 74 ccm Wasser, insgesamt 90 ccm. Aldehydkonz. m/se. Temperatur 28,0°. Bis auf die Aldehydlosung befand sich das Reaktionsgemisch zum Temperaturaus- gleich etwa 10 Minuten vor Versuchsbeginn im Thermostaten. Dann wurde die Aldehydlosung zugegeben. Nach 15minutigem Schiitteln wurden die funf Iuhalte vereinigt und sofort anreichernd destilliert. Das letzte Destillat, in dem sich der gesamte Alkohol und auberdem Aldehyd befand, wurde zur Entfernung des Aldehyds mit Silberoxyd geschuttelt und dann der Zeiselbestimmung unterworfen. Gefunden wurden 3,92 mg Alkohol.

Die eingesetzten 0,985 g Bakterien hatten somit 3,92 - 2,63 = 1,29 mg Alkohol (vgl. oben) nach 15minuti- gem Schutteln gebildet. Dementsprechend erzeugt 1 g Bakterien in der Stunde 5,25 mg Alkohol unter aeroben Be- dingungen, ein MTert, der der ublichen Dismutierungsleistung nahek0mmt.l)

werte Menge Jodsilber. 3. Die Zeiselbestimmung mit Aldehyd ergab keine nennens-

3 Barcroft - GefiiBe , 1 Thermometer-KontrollgefiiB. Temperatur 30,O". Die Ansatze betrugen der Ansatze vom Versuch 2 am 14. 12. 29, bestanden also aus 1 ccm Bakteriensuspension (= 19,7 me), 0,6 ccm Aldehydlosung (= 11 mg), 7,4 ccm Wasser, insgesaml 9 ccm. Aldehydkonz. m/3a. Vor der Ablesung liefen die GefiiBe 15 Minuten blind. Die Abnahme der Ausschlage riihrt von der Verarmung an Aldehyd her. 1 g Bakterien verbraucht pro Stunde gegeniiber Aldehyd als Donator eben 100 ccm 0,. Diese Leistung entspricht der Leistung des Bakterienmaterials aus friiheren Versuchen.s)

5 10 15 20

165 159 170 169 152 161 146 135 147 106 102 108

I) Vgl. A. 474, 57 u. 17 (1929). z, A. 474, 57 (1929).

Annalen der Chemie 486. Band. 3

34 B e r t h o und Basu,

Aus dem Sauerstoffverbrauch und der ermittelten Dis- mutiernngsleistung laat sich der Aldehydumsatz in den groaen Versuchsansgtzen bestimmen.

0,985 g Bakterien verbrauchen in 15 Minuten 24,6 ecm Sauerstoff. Dies entspricht 97 mg Aldehyd. Durch Dismutierung verschwinden in 15 Minuten 2,5 mg Aldebyd; dieser Wert la6t sich aus der gebildeten Alkoholmenge allerdings ohne Beriicksichtigung der Weiteroxydation des Alkohols ermitteln. In 15 Minuten waren somit von den ein- gesetzten 550 mg Aldehyd rund 100 mg verbraucht worden.

Unter Zugrundelegung der Dismutierungsgleichung er- gibt sich, da8 52 mg Alkohol bei ausschliefilicher Dismutie- rung im Versuch hatten entstanden sein mussen. Ge- funden wurden naeh Abzug der Korrektur 1,29 m g Alkohol, das sind 2,5 Proc. der nach der Uismutierungsgleichung theoretisch moglichen Menge.

Mit den Rakterien I1 wurde in der gleichen Versuchs- anordnung wie oben die Alkoholbildung urder reinstem Stick- stoff (1) und wie bisher beschrieben unler Juft ( 2 ) verfolgt.

Die Bakterien I1 waren am 25. 11. 29 geeimtet, eine vier und eine sieben Tage alte Kultur wurden dabei vereinigt. 10,7 mg/ccm. Es waren in beiden Versucben je 5 Flaschen, die jeweils 20 ccm Suspen- sion (214 mg), 6 ccm Aldehydlomug (110 mg), 0,5 g CaCO, und 64 CCLU

Wasser enthielten, Gesamtvolumen etwa 90 ccm. 26. 11. 29. 1. Untev SLickstoff. Die 5 Flaschen wurden mit

doppelt durchbohrten Gummistopfen versehen, deren eine Bohrung einen Hshntrichter und deren andere ein bis auf den Boden des Ge- fdEes reichendes Einleitungsrohr mit Hahn aufiiahm. Mit Ausnahme der Aldehydlosung wurden die Reaktionsgemische zunachst eingefiillt, die Flasehen in den Thermostaten, Temperatur 28,0°, verbracht und bei gleichzeitigem Schiittcln durch jede Flasche 12 Minuten lang ein kriftiger Strom reinsten Stickstoffs geleitet. Durch die Hahntricbter wurde hierauf die AldrhydlGsung zugelassen (Versuchsbeginn) und das Sehiitteln 15 Minuten fortgesetzt. Die Inhalte wurden dann vereinigt und schleunigst mreichernd destilliert. Bis zum Sieden verstrieben etwa 8 Minuten. Gefuuden wurden 9,72 mg Alkohol.

Die insgesamt eingesetzten 1,07 g Bakterien lieferten demnach in 15 Minuten 9,72 - 2,86 = 6.86mg Alkohol. 1 g Bakterien erzeugt pro Sticnde 25,65 my Alkohol unter anaeroben Bedingungen. Dieser Wert kommt dem fruher beobachteten hochsten Dismutationswert') sehr nahe.

l) A. 474, 17 (1929).

Die Bedeutuny der Aldehyd-&mutation f ur die Essiggarung. 35

27. 11. 29. 2. Unter Luft. Der Versnch war in allen Einzelheiten dem obigen analog. Der Zeitpunkt der Al- dehgdzugabe entsprach dem Versuchsbeginn. Vorher be- fanden sich die Flaschen einige Zeit im Thermostaten. Die Zeiselbestimmung ergab 6,35 my Alkohol. Pro Gramm und Stunde wurden demnach 13,05 my Alkohol unter aeroben Bedingungen gebildet. Dieser Wert ist offensichtlich etwas kleiuer als im vorhergehenden anaeroben Versuch.

Die nachfolgenden drei Versache bezwecken die Auf- stellung einer Gesamtbilanz fur den Aldehydumsatz. Es wurden besonders grofie Barcroft - GefaSe b enutzt. Anf diese Weise wurde es moglich, die verbrauchten Sauerstoff- volumina einerseits, noch vorhandenen Aldehyd, den gebil- deten Alkohol und neugebildete Essigsaure andererseits zu ermitteln.

Ver suche i n B a r c r o f t a p p a r a t e n m i t Brod ie - L o s u n g a l s Manometer f l i i s s igke i t .

Ohne CaTbonatzusatz und ohne Puffer. Bakt. I11 vom 6. 12. 29. 9,4 mg/ccm, 9 Tage alte Kultur.

9. 12. 29. 1. Versuch. 5 groSe Barcroftapparate, ein weiterer als Temperaturkontrolle. Die GefaBvolumina betrugen zwischen 106 und 167,5 ccm.

Ansatz pro GefiiS: 20 ccm Bakt. Susp. (0,188 g), 25 ccm Waaser, 3 ccm Aldebydlosung (66,77 mg Aldehyd. Conc. m/& insgesamt 48 ccm, Temp. 28,l O Die GefaBe waren gut austemperiert und wurden kraftig bewegt. Der Zeitpunkt der Aldehydzugabe entsprach dem Versuchs- beginn. Der Versuch selbst dauerte 13 Minuten. WBhrend dieser Zeit wurden die Manometerausschlige mehrmals abgelesen. Hierbei ist sehr rasches Arbeiten erforderlicb. Durchschnittlicher Sauerstoff- verbrauch pro Rohre 4,45 ccm. In einem Barcroftgefa8 wurde sofort nach Versuchsende die gebildete Essigsiiure mit "/,,-Essigsaure und Phenolphtalein aus der Mikroburette titriert. Nach Abeug des Blind- wertes ergab sich ein Wert von 4,113 ccm "/,,-Essigsiiure. Die Inhalte der vier anderen R6hren wurden vereinigt, sofort anreichernd destilliert und nach der Entfernung des Aldehyds zur Alkoholbestimmung ver- wendet. In einem GefaB waren dem- nach 0,933 mg Alkohol entstanden.

Sie erhielten 3,73 mg Alkohol.

Die Bilanz einer Rohre stellt sich daher wie folgt: 3*

36 Berth0 und B a s u ,

Angewendete Menge Aldehyd . . . . 151,75 ccm Cefundene Menge Essigsaure , . . . 41,OO ), ,)

,l ,, Alkohol . . . . . 2,03 1 , 77

Der unveranderte Aldehyd wurde in diesem und dem

Der Verbrauch an 0, in einer Rohre betrug im Mittel 4,45 ccm, 41,O ccm "/,,,-Essigslure entsprechen 4 4 9 ccm. Sauerfitoff, so daB also hinsichtlich der Sauerstoff-Essigsiiurebilanz Ubereinstimmung erzielt ist. Uberdies miiBte noch eine der Alkoholbildung iiquivalente Menge Essigsaure als Dismutierungsessigsaure in Abzug gebracht werden. Demnach produziert 1 g Bakt. in der Stunde 0,60 g Eseigsaure, was einem Sauerstoffverbrauch von 112 ccrn entspricht. Diese Leistung ist die ubliche. *) Nach Abzug der Korrektur (Alkoholwert der Bakterien), ergibt sich eine tatsgchliche Alkoholbildung von 0,426 mg pro Barcroft- gefaB entsprechend 0,93 ccm Alkohol.

ES werden somit pro Gramm Bakteyien und Stvnde 10,5 n y dZkoAoZ gebildet. Die entstandeiie Menge Alkohol entspricht 4,3 PFUC. der nach der Dismatiefungsgleicliung a m dem verschwundenen Aldehyd theoretisch zu erwartenden.

folgenden Versuch nicht bestimmt.

11. 12. 29. 2. Persuch. Ansltze und Bedingungen andog 1.

Bakt. 111. Versuchsdauer 15 Min. Temp. 28,2 ,. Bilanz pro BarcroftgefiiB:

Angewendete Menge Aldehyd . , . . 151,75 ccm m/loo

Gefundene Menge Essigsaure . . . . 42,l ,, ,) 9 , ,, Alkohol . . . . . 1,50 ,, ,)

Durchschnittssauerstoffverbrauch einer Rohre: 5 3 ccm. 42,l ccm m/l,-Essigsaure entsprechen 4,71 ecm Sauerstoff. 1 g Bakt. erzeugt pro Stunde 0,54 g EssigsPure, was einem Sauerstoffverbrauch von 101 ccm entspricht.2) Alkohol. 3,9 mg Alkohol uerdeia pro g Bakterien und Stzlnde ge- bildet.

Pruc. der nach der Diamutierungsgleichung theoretisch zu erwartenden.

In den beiden vorausgehenden und in dem nachfolgendem Versuch wurde bei Versuchsende ein p~ ermittelt, das zwisclien 3,5 und 4 lag.

Alkoholbildung (korr.) pro BarcroftgefaB 0,40 ccm

Die entstandene Allioholmenge entspricht

Ver sneh i n Barc ro f tge fHBen m i t Q u e c k s i l b e r als Manomete r f l i i s s igke i t .

Im nachfolgenden Versuch und in den weiteren wurde die Destil

l) A. a. 0. lationsvorrichtung, wie sie N e u b e r g zur Acetaldehydbestimmung be-

A. a. 0.

Die Bedeutung der Aldehyd-Dismutation fur die Essiggarung. 37

nutzt, verwendet. Acetaldehydbestimmung nach R i p p er. Rlindtitra- tionen ergaben nahezu theoretische Wcrte.')

Bakt. IV vom 18. 2. 29. 4 Tage alte Kultur, 7,25 mglccm. 19. 12. 29. BarcroftgefaBe, ein IiontrollgefaB. Temp. 27,95O C.

A n s a t z : 3 ccm AcetaldehydlSsung, enthaltend 62,51 mg (=142,08 ccm m/loo), 25 ccm Bakterionsuspension (= 0,181 g), 20 ccm Wasser, insgesamt 48 ccm. Dauer des Schuttelns 15 Min. Die Ansiitae warm etwa m/Q4 an Aldehyd. O h m Carbonntxusatz.

Die Inhalte von 2 GefkBen wurden sofort naeh Versucheende mit n/lo-Lauge titriert. Die Inhalte der 3 anderen GefiBc wurden zur Alde- hyd- und Alkoholbestimmung verwendet.

Die Gesamtbilanz einer Rohre stellt sich wie folgt: Angewandter Acetaldehyd 142,08 ccrn

Wiedergefundener Aldehyd 88,83 ,, ,, Eesigsaurehestimmung . . 47,80 ,, ,, Alkoholbestimmnng. . . 3.fi0 ,, ,.

irisgeaamt 140,23 ccm

Der Durchschnittssauerstoffverbrauch einer Rohre be- trug 5,s ccm. 47,s ccmm/,,,-Essigsanre entsprechen 5,36 ccm 0,.

Demnach erzengt 1 g Bakt. pro Stunde 0,695 g Essig- saure (8. o.), was einem normalen Sauerstoffverbrauch von 119 ccm entsprikhe.

Die Alkoholbildung pro BarcroftgefaS betragt in 15 Min. unter Berucksichtigung der Korrektur 3,60 - 1,05 ccm = 2,55 ccm m/lOO oder 1,17 m g Alkohol. 1 g Bakt. erzeugt demnach pro 8twnde 25,8 mg Alkohol. Aus den verschwun- denen 50,35 ccm m/,,,-Aldehyd sind 2,55 ccm m/,,,-Alkohol entstanden, das sind 10,2 Proc. der nach der Dismutierungs- gleichung zu erwartenden Menge.

Yersucfi mit Acetatpuffer pII 5,6. 23. 7. 30. Bakt. VII vom 23. 7. 30. 8 Tage alte Kultur. Temp. 29,O".

5 Fliissigkeitsflaschen von 500 ccm Inhalt, die jeweils folgender- maBen beschickt waren: 20 ccm Bakteriensuspension (= 184 mg); 10 ccm "/,-Acetatpuffer PH 5,6; 40 ccm Waaser; 2Occm hldehydlasung (= 192mg Aldehyd, insgesamt 90 ccm.

Die Flaschen wurden irn Thermostaten heftig bewegt. Aldehyd- zugabe: Verauchsbeginn. Versuchsdauer 16 Min. Nach anreichernder

I) Vgl. J o a c h i m W a g n e r , Bio. 194, 441 (1928).

38 B e r t h o und B a s u ,

Destillation unter Zusatz von Calciumcarbonat und Entfernung des Aldehyds mit Silberoxyd wurde im letzten Destillat der Alkohol bestimmt.

Samtliche 5 Inhalte lieferten 8,53 mg Alkohol. Nach Abzug des Alkoholwertes fur die Bakterien bleiben 6,07 mg -4lkohol. 1 y Bakterien erzeugt somit pro Stunde 24,8 mg 82kohol.

Versuche m i t A lkoho l und Aldehyd . Wir haben auSerdem in grol3eren Ansatzen auch Alko-

hol als Donator benutzt, und zwar teilweise bei gleichzeitiger Gegenwart von Aldehyd und teilweise allein. Auch in diesen Fallen wurde bei Versuchsende Alkohol, Aldehyd, Essigsanre sowie durch Barcroftmessung der verbrauchte Sauerstoff ermittelt. Es ergaben sich keinerlei Befunde, die im Wider- spruch mit friiheren und den obigen Feststellungen stehen.

A. Alkohol und Aldehyd ohne Carbonat oder Pufferzusatz. 11.1.30. Bakt. IV vom 18.12.29. 4 Tage alte Kultur. Drei 500ccm-

Flussigkeitsflaschen erhielten jeweils folgenden Ansatz: 20 ccm Bakt. Susp. (= 145 mg), 43 ccm Wasser, 7ccm Alkohollosung

(33,2 mg = 72,l ccm Alkohol. Conc. m/llo), 10 ccm AldehydlGsung (32,O mg = 72,7 ccm Aldehyd. Conc. m/Llo); insgesamt 80 ccm.

Die Flaschen samt Tnhalt waren einige Zeit vor Versuchsbeginn in den Thermostaten gebracht worden. Temp. 28,4O. Aldehyd- und Alkohollosung wurden gemeinsam zugegeben: Zeitpunkt des Versuchs- beginns. Der Versuch dauerte 15 Minuten. Hiernach wurde eiu Inhalt sofort mit n/lo-Lauge titriert. Die beiden anderen Ansatze wurden unter den von N e u b e r g angegebenen Vorsichtsma6regeln destilliert, wobei zur augenblicklichen Stoppung der Bakterientatigkeit so ver- fahren wurde, da6 die beiden Flascheninhalte durch eioen Tropftrichter in das DestillationsgefaB hineingelassen wurden, das bereits 200 ccm siedendes Wasser enthielt. Ein aliquoter Anteil des ersten Destillats diente zur Aldehydbestimmung nach R i p p e r , der Hauptteil wurde anreichernd destilliert und als das notwendige kleine Volumen erreicht war, der Ze ise l bestimmung unterworfen.

Die Umsatze in einer Flasche ergeben sich mie folgt: Ursprunglich vorhanden : 72,l corn m/loo Alkohol

72,7 ccm Aldehyd

insgesamt 144,s ccm

Nach l&minutiger Versuchsdauer gefunden:

Die Bedeutung der Aldehyd-&mutation f ur die Xssiggarung. 39

24,2 ccrn m/loo Alkohol

108,s ,, Essigsiiure (Blindverbrauch berucksichtigt)

142,4 ccm m/loo

9,4 miioo Aldehyd

Die Ubereinstimmung ist sehr gut; die Moglichkeit, in den gleichen Ansatzen den Sauerstoffverbrauch kennen zu lernen, ist hier nicht gegeben, jedoch wurde mit demselben Substrat in kleineren Mengenverhaltnissen eine Barcroft- messung durchgefuhrt (s. naehster Versuch Ansatz I). AuOer- dem wurde gleichzeitig der Sauerstoffverbrauch derselbenBak- terienmenge gegeniiber m/, ,,-Aldehyd (2) und m/,,,-Alkohol (3) ermittelt. Da die QefaSe 10 Minuten fur den Temperatur- ausgleich blind liefen, ging das erste fur einen Vergleich maSgebliche Reaktionsintervall verloren.

Die GefiiBinhalte betrugen 8 ccm 13. 1. 30. Bakt. IV. 3 BarcroftgefaBe, eine Temperaturkontrolle.

des obigen Ansatzes):

In voller Ubereinstimmung mit fruheren Versuchen zeigt sich, dab, da weder Alkohol- noch Aldehydkonzentration optimal ist, im Ansatz 1, wo beide Donatoren vorhanden sind, der Sanerstoffverbrauch am grol3ten ist.

Es ergibt sich, daB 14,5 mg Bakterieu in 1 in 15 Minuten 1,12 ccm Sauerstoff verbrauchen. Hierbei ist der erste, wie am dem Gang er- sichtlich, bestimmt bedeutend zu niedere Wert der Berechnung zu- grunde gelegt. I n den vorhergchenden Versuchen, wo die 10fache Menge pro Flasche eingesetzt iat (= 145 mg), werden demnach 11,2 ccni Sauerstoff in 15 Minutcn verbmucht.

40 Bertho und B a s u ,

Uer Sanerstoffverbrauch miiBte den gebildeten Oxy- dationsprodukten Acetaldehyd und Essigsaure entsprechen.

Bei der nachfolgenden Berechnung soll an Stelle des ermittelten Aldehydwertes (9,40 ccm m/lOO) der aus der eingesetzten Aldehydmenge errechnete (11,s ccrn benutet wcrden; d. h. der kleine Differenz- betrag von 2 . 4 ccm soll auf Rechnung des Aldehyds gesetzt werden. Es ergibt sich d a m : Eingesetzt: Aldehyd 72,7 ccm m/loo Alkohol 72,l ccm m/luo

Wiedergefunden : ,, 11,s ,, ,, ), 2472 ,, 7)

Dehydriert: Aldehyd 60,9 ccm m/loo Alkohol 47,s ccm d, h. 60,9 ccm Alkohol sind in Essig- saure verwandelt worden. Dazu sind notwendig: 6,82 ccm + 10,73 ccm = 17,55 ccm Sauerstoff. Die Gesamtbildung von Sauerstoff ist naturlich unabhiingig davon, iiber welche Reaktionsstufen und durch welche Reaktionsfolgen die Oxydation zuwege kam.

Aldehyd und 47,9 ccm

Daher ist es auch nicht moglich, aus diesem Versuch etwas uber den F e r t des Dismutierungsalkohols auszusagen.

B. Alkohol allein, ohne Carbonat- oder Yufirzusatz. 25. 1. 30. 1. Ye,such. Bakt. VI. 5,4 mg/ccm. Eine drei- und eine

sieben Tage alte Kultur vereinigt. Geerntet am 23. 1. 30. 3 Flaschen von je 500 ccm Inhalt.

Ansatz pro Flaeche: 20 ccm Bakt. (0,108 g), 10 ccm "/,-Alko- hol(460 mg cone.

Temperatur 30,Oo. Versuchsdauer 20 Minuten. Der Inhalt riner Flasche wurde mit "/,,-NaOH titriert, die beiden anderen Inhalte wuiden aufgearbeitet.

70 ccm Wasser, insgesamt 100 ccm.

Bilanz pro GefaS: Urspriinglich vorhanden . 1000,O ccm Alkohol Wiedergafunden . . . . 922.6 ,, ,, Alkohol Gebildet. . . . . . . 54,6 ,, ,, Essigsaure

insgesamt 987,2 ccm 17 10.0 ,, ,, Aldehyd -

31. 1. 30. 2. Vevsuch. 3 Flascben Ansatz pro Flasche: 28 ccm Bakt. (0,151 g), 7 ocm Alkohollosung

(33,17 mg Cone. m/llo), 45 ccm Wasser, insgesamt 100 ccm. Temperatnr 28,OO. Versuchsdauer 11 Minuten.

Bilanz pro GefiB: Urspriinglich vorhanden Wiedergefunden . . . 41,O ,, ,, ,, Gebildet . . . . . . 21,s ,, ,, Essigsaure

72,l ccm m/loo Alkohol

9 1 . . . * a . 10,2 ,, ,, Aldehyd insgesamt 73,O ccm

Tt

Bemerkenswert ist in diesen Versuchen die auftretende betrachtliehe Aldehydmenge (vgl. S. 28).

0, - A u f n a hm e b e i v er s ch i e d e n e n A1 k o h o 1- k o nz e n t r a t i on en.

31. 1. 30. Bakt. V I vom 23. 1. 30. Temperatur 30,2O. J e 2 ccm (10,s mg) Bakt. Suspension. 6 Rohre, eine Kontrolle.

Gesamtvol. 10 cem. Die GefiiBe liefen 5 Minuten mit offenen Hahnen.

Von m/20 ab ist die Alkoholkonzentration bereits optimal. Danach ergibt sich hinsichtlich des vorigen Versuches fol- gende Bilanz. I n 11 Minuten waren aus dem eingesetzten Alkohol gebildet worden:

10,2 ccm m/loo Aldehyd entsprechend 1,18 ccm Sauerstoff

insgesamt 6,06 ccm Sauerstoff 21,8 ,, ,, Essigsaure ,, 4988 7 1 9 7

151 mg Bakt. benotigen also in m/l10 Alkohol in 11 Minuten 6,06 ccm Sauerstoff. Aus dem obigen Versuch ergibt sich, daS 10,s mg Bakt. in 11 Minuten 0,427 ccm oder 151 mg in der gleichen Zeit 5,98 ccm Sauerstoff tat- s&chlich verbrauchen. Hierbei ist die erste Bblesung der Berechnung zugrunde gelegt.

0 , -Aufnahme b e i o p t i m a l e r Alkohol - u n d Aldehyd- k o nze n t r a t i o n.

Der Versuch dient nur dem Nachweis, daS bei optimalen Konzentrationen beider Donatoren kein Szirnmationseffekt anftritt.

42 B e r t h o u. Basu, Bedeutung d. Aldehyd-Uismutation usw.

Bakt. VI (je 2,s ccrn), die gegeniiber dem 31. 1. etwas an Wirk- samkeit verloren hatten. 3 Rohre, 1 Kontrolle. Gesamtvol. 10 ccm.

5

10 15

20

Minuten /I 1 I 2 I 3

162 180 171 153 189 162 149 175 169 133 1 80 139

Es zeigt sich, daI3 der Sauerstoffverbrauch des Substrdt- gemischs etwa in der Mitte zwischen dem der einzelnen Donatoren liegt. Das wurde in gleicher Weise auch friiher beobachtet. Von Bedeutung ist hier wieder, da8 von Aldehyd mehr Sauerstoff verbraucht wird als von Alkohol. Dies wurde ebenftllls bei B. past auch schon fruher gefunden. Uberhaupt hat sich bei den vorliegenden Versuchen nichts ergeben, was irgendwie im Widerspruch m i t fruheren Beob- achtungen stiinde.

Herr H. Gli ick hat uns bei der Durchfiihrung einzelner Versuche in dankenswerter Weise unterstutzt.

Der Deutachen Akademie, die es dem einen von uns (Basu) durch Verieihung eines Stipendiums ermoglicht hat, an den Untersuchungen teilzunehmen, sprechen wir unseren ehrerbietigsten Dank aus.