Die beschleunigende Wirkung von Quecksilber und Kupfer auf die Indikatorentfgrbung

in gewissen Reduktions-Oxydationssystemen aus Pflanzensamen'.

Von T. Thunberg.

(Aus dem Physiologischen Institut in Lund.)

Diese Mitteilung schliebt sich an ein paar kleinere Schriften an, die ich im Jahre 1934 iiber den stimulierenden EinfluB veroffentlichte, den Zink und Kadmium auf die Oxydationsprozesse in gewissen Extrakten aus Pflanzensamen ausiiben, obgleich diese Metalle in den meisten der- artigen Extrakten hemmend wirken (Thunberg 1, 2). Seitdem habe ich die Entdeckung gemacht, daI3 noch zwei weitere Metalle die Fiihigkeit besitzen, eine analoge Wirkung auf die Oxydationsprozesse in gewissen Extrakten aus Pflanzensamen auszuiiben, namlich Quecksilber und Kupfer.

Bevor ich dazu iibergehe, die genannten Wirkungen des Quecksilbers bzw. Kupfers zu exemplifizieren, sei zunachst ganz kurz bemerkt, dal) die Metallionen der Metalle Na, K, NH,, Li, Rb, Cs, Ca, Ba, Sr, Mg und Be in milBigen Konzentrationen keinen Einfld auf die Schnelligkeit aus- uben, rnit der ein mit Methylenblau versetzter Phosphatextrakt von Corchorus capsularis (einer meiner am haufigsten verwendeten Versuchs- samen) den zugesetzten Farbstoff reduziert. Aucb wurde keine Ver- anderung der Schnelligkeit bemerkt, mit welcher der zugesetzte Redox- indikator in Corchorusextrakt entfiirbt wird, wenn das Methylenblau durch Indigodisulfonat bzw. l-Naphthol 1 : 2 Natrimaalfonat-indo 2 : 6 Dichlorphenol ersetzt wurde. Beiliiufig sei dsrauf 'hingewiesen, dal3 immer kontrolliert werden muB, ob die Entfubung des zugesetzten Redoxindikators enzymatischer Art ist oder nicht. Was z. B. die Ent-

1 Der Redaktion am 7. Oktober 1936 zugegmgen.

284 T. THUNBERG:

farbung des Indigosulfonats bei Zusatz von Ferriionen in Form von Eisenchlorid betrifft, so tritt eine solche auch dann ein, wenn keine Enzymlosung anwesend oder dieselbe inaktiviert worden ist.

A. Die stimulierende Einwirkung des Quecksilbers suf die Indikatorentfbbung in einem Extrakt aus Trifolium pratense.

Zunachst gebe ich eine Darstellung der Versuchsbedingungen, unter welchen sich der hier in Frage stehende Quecksilbereffekt geltend ge- macht hat. Derselbe wurde unter einer grol3en Zahl untersuchter Pflanzen- samen nur bei den Samen folgender Pflanzen scharf ausgepragt ent- deckt : Trifolium pratense, Corchorus capsularis, Galega officinalis, Melilotus leucantha, Melilotus altissimus und Prunus domestica. Am ausfiihrlichsten habe ich den Effekt hinsichtlich Corchorus capsularis studiert. Wenn ich jedoch hier fur meine Darstellung ein sich auf Tri- folium pratense beziehendes Versuchsprotokoll wahle, so geschieht dies deshalb, weil diese Samenart so leicht zuganglich ist und fur diese Frage interessierte Kollegen daher meine Beobachtungen mit Leichtigkeit wiederholen konnen.

Versuchsprotokoll. Das unten mitgeteilte Versuchsprotokoll verzeichnet die Ent-

farbungszeiten einer Anzahl mit Methylenblau versetzter Reaktions- mischungen, die durch Mischen geeigneter Mengen der unten angegebenen Losungen erhalten und in evakuierbaren Probierrohren, sog. Thunberg- rohren, beobachtet wurden.

Benutzte Losungen: 1. Methylenblau medicinale, Wasserlosung 1 : 50000 (,,Mb"). 2. Quecksilberchloridlosung. 27 mg Quecksilberchlorid (HgCl, ,

Mo1.-Gew. 271.5) werden in 50ccm Aqua dest. gelost. Aus einer auf diese Weise erhaltenen 0.002 molaren Losung erhalt man durch Ver- diinnung 1 + 4 bzw. 1 + 24 Losungen von der S take 0.4 und 0.08 millimolar.

3. Phosphatextrakt aus Trifolium pratense. Der Samen wird fein- gemahlen. Durch Sieben des Mehles mit einem Sieb Nr. 20 (20 Faden per cm) wird moglichst vie1 Schalensubstanz entfernt. 5 g des auf diese Weise erhaltenen feinen Mehles werden rnit 25 ccm 0.87prozent. K,HPO,- Losung griindlich im Morser verarbeitet. Nach 30Minuten wird die Mischung in einer schnell rotierenden Zentrifuge zentrifugiert. Es wird so lange zentrifugiert, bis die Losung, scharf abgegrenzt, eine Boden- schicht; eine ziemlich klare Zwischenschicht und eine Oberflachenhaut aufweist. Dieses Resultat erhielt man mit der im hiesigen Laboratorium

DIE BESCHLEUNIGENDE WIRKUNG VON QUECKSILBER usw. 285

benutzten Cordazentrifuge bei 3500 Umdrehungen per Minute nach 20 Minuten. Die Zwischenschicht wird in ein Probierglas gegossen, das unmittelbar in Eiswasser gestellt wid. Diese Zwischenschicht wird im folgenden als Enzymlosung (,,Em.") oder Dehydrogenaselosung be- zeichnet.

4. Aqua dest. Benutzte Utensilien: 1. 11 Thunbergrohren. 2. Luftpumpe. 3. Wasserthermostat, der auf 35O C gehalten wird.

Versuchsverfahren. Die Thunbergrohren werden folgendermarjen beschickt. Jeder

Rohre wird 0.5 ccm Mb. und so vie1 dest. Wasser zugesetzt, darj der totale Flussigkeitsinhalt jeder Rohre 2 ccm betriigt. Die hierzu notige Menge Wasser wird in der Weise berechnet, darj man die zugesetzten Mengen Mb., Quecksilberchloridlosung und Enzymlosung addiert und diese Summe von 2 ccm subtrahiert. Ferner werden die Rohren 2, 3 und 4 mit 0.1, 0.2 und 0 .4 ccm 0.08 millimolarer Quecksilber- chloridlosung versetzt, und die Rohren 5, 6 und 7 sowie 8, 9 und 10 rnit den entsprechenden Mengen 0.4 millimolarer Quecksilberchlorid- losung. Als quecksilberchloridfreie Kontrollrohren dienen die Rohren 1 und 11.

Nun werden 0.5 ccm Enz. zu Rohre 1 zugesetzt, worauf sie evakuiert wird (wozu 2Minuten erforderlich sind). Die Rohre wird nun in ein Wasserbad mit der Temperatur 350 C gesetzt. Die Zeit fur das Einsetzen wird vermerkt. In gleicher Weise wird mit den Rohren 2 bis 11 ver- fahren. Die korrekte Ausfuhrung des Versuches fordert demnach, darj jede Rohre nach dem Zusatz der Enzymlosung unmittelbar evakuiert wird. Es ist also nicht statthaft, in unmittelbarer Folge samtliche Rohren mit Enzymlosung zu versetzen und rnit dem Evakuieren zu warten, bis alle in dieser Weise beschickt worden sind. - Fiir jede Rohre wird nun der Zeitpunkt der vollstiindigen Entfiirbung beobachtet und vermerkt.

In der unten mitgeteilten Tabelle wird zuerst die Menge des in jeder einzelnen Rohre vorhandenen Quecksilberchlorids teils in Mikro- gramm, teils in Mikromol angegeben. In den beiden letzten Kolumnen werden zunachst die Anzahl der bis zur vollstiisdigen Entfubung der Kontrollrohren vergehenden Minuten und dann, in der letzten Kolumne, die entsprechenden Zeiten fur die rnit Quecksilberchlorid versetzten Rohren angegeben.

286

-

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11

T. THUNBERC :

Tabelle 1. Trifolium pratense. HgCI, .

Rohre 1 Mikggrgnm Mikromol Nr.

_ _ _ _ - - ~ --__

-

2.16 4.32 8.64

10.8 21.6 43.2 54

108 216 -

HgCl, - -

-

0.008 0.016 0.032 0.04 0.08 0.16 0 - 2 0 . 4 0 .8 -

Diskussion des Versuchs.

Ein Studium der in der Tabelle angegibenen Zeiten zeigt, dal3 das Quecksilberchlorid in den schwachsten bei dem Versuch venvendeten Mengen die Methylenblauentfiirbung in dem hier in Frage stehenden enzymatischen Redoxsystem beschleunigt. Ganz ausgeprtigt ist dies schon bei einer so geringen Menge Quecksilberchlorid wie 4.32 Mikro- gramm der Fall. Bei einer Steigerung der zugesetzten Menge Queck- silberchlorid auf ungefahr 10 Mikrogramm ist die Entfubungszeit, die in der Kontrollrohre etwas uber 32 Minuten betrug, auf 12 Minuten gesunken. Wird die zugesetzte Quecksilbermenge weiter gesteigert, so wird der beschleunigende Effekt derselben auf die Entfikbungszeit geringer, und bei einem Zusatz von ungefahr 50 W o g r a m m schltigt der Effekt in eine ausgesprochene Hemmung um.

B. Die stimnlierende Wirknng von Knpfer anf einen Phosphatextrakt von Trifolium pratense.

Auch fur Kupferchlorid ist eine die Entfiirbung beschleunigende Wirkung beobachtet worden, wenn man dieses Salz einem mit Mb. ver- setzten Phosphatextrakt aus Samen von Trifolium pratense zusetzt.

Der Versuch wurde ebenso ausgefuhrt wie der oben beschriebene Quecksilberchloridversuch, jedoch mit dem Unterschied, da13 das Molekulargewicht des Kupferchlorids (170.52 fur CuCl, + 2 aq.) eine andere prozentuale Stiirke der benutzten Losungen erfordert. Die stikkste benutzte Losung wurde also durch Losung von 17 mg CuCl, in

D I E BESCHLEUWIGENDE WIRKUNG VON QUECKSILBER USW. 287

50 ccm Aqua erhalten, worauf man die schwacheren Losungen durch Verdunnung dieser Losung im Verhaltnis 1 + 4 und 1 + 24 erhielt.

In Tabelle 2 werden die Zeiten fur die Methylenblauentfarbung bei den in der Tabelle angegebenen benutzten Mengen Kupferchlorid mit- geteilt.

Tabelle 2. Trifolium pratense. CuCl, .

Rohre Nr. I

j

Mikrogramm C ~ C I , + 2aq.

Mikromol CuCI, + 2 aq.

- 0.008 0,016 0.032 0-04 0.08 0.16 0 . 2

1 0 . 4 ' 0.8 l -

~ ~~~

EntfiLrbungszeiten Minuten

CuCI, + 2 aq.

- 27 24 17 15 16 22 25 55

> 90 -

Diskussion des Versuchs. Ebenso wie das Quecksilberchlorid beschleunigt auch das Kupfer-

chlorid die Methylenblauentflirbung in dem hier untersuchten enzy- matischen System. Schon bei nicht ganz 3 Mikrogramm Kupferchlorid ist die beschleunigende Wirkung vorhanden. Bei einer Steigerung der zugesetzten Menge Kupferchlorid auf 6-8 Mikrogramm ist die Ent- farbungszeit, die in der Kontrollrohre etwas iiber 27 Minuten betrug, auf 15 Minuten gesunken. Steigert man die zugesetzte Menge Kupferchlorid auf uber 13.6 Mikrogramm, so wird die stimulierende Wirkung geringer, und bei einem Zusatz von 68Mikrogramm ist sie in eine ausgeprgte Hemmung umgeschlagen. * * *

Die beobachtete beschleunigende Wirkung des Quecksilbers und Kupfers auf die Indikatorentfiirbung eines enzymatisohen Redoxsystems war ganzlich unerwartet. Es lie& sich nun die Moglichkeit denken, daI3 hier nur ein ProzeS vorliige, der durch die speziellen Eigentiimlichkeiten des benutzten Indikators bedingt wiirde und nicht a d ein Eingreifen der Metalle in ein biologisches Geschehen zuriickzufiihren wiire. Unter diesen Umstanden wurden die Versuche auch auf andere Indikatoren ausgedehnt.

288 T. THUNBERG:

Hinsichtlich eines Extraktes aus Trifolium pratense wurde so bei Verwendung von Indigodisulfonat als Indikator eine kraftige be- schleunigende Wirkung von Kupferchlorid in einer Konzentration von 0.04 Mikromol festgestellt. Es sei hervorgehoben, da5 das Indigo- disulfonat ein wesentlich starker negativer Indikator als Mb. ist, und dazu kommt noch, da5 das Farbion negativ geladen’ ist, wahrend das RIb.-Parbion positiv geladen ist. Zwecks Feststellung der Wirkung von Quecksilberchlorid wurden die Versuche mit verschiedenen In- dikatoren an Extrakt von Corchorus capsularis ausgefuhrt. Sowohl fur Mb. als fur Indigodisulfonat und den sehr positiven Redoxindikator l-Naphthol l : 2 Natriumsulfonat-indo 2 : 6 Dichlorphenol wurde eine die Entfarbung kraftig beschleunigende Wirkung festgestellt.

Es durfte auch hervorzuheben sein, da5 Quecksilber und Kupfer sich hinsichtlich ihres hier behandelten beschleunigenden Effektes nicht gleich verhalten. Zwar wird ein Extrakt aus Trifolium pratense von Hg und Cu in gleicher Weise beeinflat, dagegen ist dies nicht der Fall bei einem Extrakt aus Corchorus capsularis, der zwar in der oben be- schriebenen Weise auf Hg reagiert, dagegen keine Reaktion auf Cu auf- weist. Aus den Ergebnissen mit den bisher untersuchten Pflanzensamen scheint hervorzugehen, da5 das Quecksilber haufiger stimulierend wirkt als Cu. Eine Wirkung des Kupfers wurde, auSer bei Trifolium pratense, uberhaupt nur bei Melilotus leucantha, Melilotus altissimus und Ama- ranthus caud. atrop. erhalten, doch war die Wirkung bei den letzt- genannten Pflanzensamen wesentlich schwacher als bei Trifolium pratense. Was das Quecksilber betrifft, so wurde der stimulierende Effekt, au5er bei Trifolium pratense und Corchorus capsularis, auch bei den soeben genannten Melilotusarten, Galega officinalis und Prunus domestica, sowie, wenn auch nicht ganz so sicher, bei Spartium junceum und der oben- genannten Amaranthusform festgestellt.

Betreffs des Einflusses der Wasserstoffionkonzentration auf dieses Phanomen sei folgendes mitgeteilt :

Die beschleunigende Wirkung von sowohl Quecksilber wie Kupfer auf die Entfiirbung eines mit Indikator versetzten Extraktes aus Trifolium pratense ist fur den Bereich PH 6.6 bis PH 8.5 festgestellt worden. Im allgemeinen scheint die Verschiebung der Reaktion in alkalischer Rich- tung sowohl bei den Kontrollversuchen als auch bei den Versuchen mit quecksilber- und kupferversetzten Extrakten eine Abkurzung der Ent- fiirbungszeit zu bewirken. Zeichnet man uber der pa-Serie als Abszisse eine Kurve der Entfarbungszeiten, so weist diese jedoch keinen regel- miilligen Verlauf auf, sondern sie hat eine Knickung abwarts, entsprechend dem pH-Wert 7 - 1 oder 7.2.

DIE BESCKLEUNIGENDE WIRKUNG VON QUECKSILBER usw. 289

Die oben beschriebene stimulierende Wirkung auf die Aktivierung des Wasserstoffs in einem Phosphatextrakt aus gewissen Pflanzensamen hat offenbar irgend etwas mit dem Enzym des Samens zu schaffen. Es ist sicher, daB bei dem hier studierten ProzeB ein thermolabiles System eine Rolle spielt. Erwarmt man namlich einen Phosphatextrakt aus Corchorus 30 Minuten lang auf 65O, so verschwindet nicht nur die Spontan- entfarbung des Extraktes gegeniiber Rfi., sondern auch die Wirkung des Quecksilbers.

Zur Erklkung der hier mitgeteilten stimulierenden Wirkung von Quecksilber und Kupfer sind weitere Versuche notig. Wahrend sich- die entsprechende Wirkung von Zink moglicherweise dadurch erklaren last, daB Zink ein im Organismus normalenveise vorhandener, die Oxydation stimulierender Stoff oder vielleicht sogar eine notwendige Voraussetzung fur gewisse biologische Oxydationsprozesse ist, und wahrend sich die ent- sprechende Wirkung des Kadmiums moglicherweise durch die enge Ver- wandtschaft dieses Metalls mit dem ,,Bioelement" Zink erklken la& fehlt jeder Anhaltspunkt dafiir, dal3 Quecksilber ein Bioelement sein konnte. Es sei hervorgehoben, daB Quecksilber und Kupfer ebenso wie Zink und Kadmium zweiwertige Ionen abgeben. Man kann sich fragen, ob Ionen dieser Art, indem sie in dem zusammengesetzten Oxydationssystem zwei Bestandteile an sich binden, vielleicht zu besseren Bedingungen fur eine Reaktion zwischen diesen beitragen konnen. In diesem Fall wiirden die Metalle die Rolle von ,,Konnek- toren" spielen.

Eine andere ErklZirungsmoglichkeit der aktivierenden Wirkung dieser schweren Metalle konnte man vielleicht in der eiweiBkoagulierenden Wirkung derselben erblicken. Es lieBe sich denken, da13 die betreffenden Metallsalze durch Bindung von EiweiB an das EiweiB adsorbiertes Enzym freimachen. uberhaupt ist die Moglichkeit dessen in Betracht zu ziehen, daB diese Metallsalze nur indirekt, durch Elimination eines hemmenden oder inaktivierenden Agens, stimulierend wirken.

Znssmmenfassnng. Verfasser hat friiher die Beobachtung mitgeteilt, dal3 die Metalle

Zink und Kadmium, die im allgemeinen eine hemmende Wirkung auf die Indikatorentf%rbung eines dehydrogenasehaltigen Phosphatextraktes aus Pflanzensamen ausiiben, bei einigen Samen unter scharf definierten Versuchsbedingungen diese Entfiirbung kraftig beschleunigen. In der hier vorgelegten Schrift teilt Verfasser nun mit, daLi auch die Metalle Quecksilber und Kupfer, die bei den meisten Samenextrakten stark

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hemmend auf die Indikatorentfarbung einwirken, bei einigen Samen- arten den entgegengesetzten Effekt haben. Es werden verschiedene Erklarungsmoglichkeiten dieses Phanomens erortert.

* * * Johan och Therese Anderssons Minnesfond sage ich fur die Bereit-

stellung von Mitteln fur die Durchfuhrung von Untersuchungen, zu denen auch die hier mitgeteilten Versuche gehoren, herzlichen Dank.

Literatur.

1. Thunberg, T., Kungl. Fysiografiska Sallsk. i Lund Forh. 1934. 3. 17. 2. Thunberg, T., Dies Archiv. 1934. 69. 247.