234 Bericht: Spezielle analytisehe Methoden Bd. 208

(VorratslSsung) mit Eisessig auf 61,0 ml. Die LSsungen entsprechen einem Gesam$- cholesteringehalt yon 100--600 rag/100 ml Serum.

i Analyt. Chemistry 85, 1751--1753 (1963). Inst. Pharm. Sci., Fac. IVied., Kyushu Univ., Fukuoka (Japan). U~SULi :BAITlVfANN

Die Bestimmung yon gesamtcholesterin und Lipoidphosphor in einem Mikro- tropfen Blutserum naeh ~ . N. M~RKOVi and A. A. P o ~ o v s ~ I J i beruht auf der gleichzeitigen ]~xtr~ktion yon Serum-Mikromengen mit dem Gemisch nach W. R. BLOOR 2 und nachfolgender colorimetrischer Bestimmung yon Gesamteholesterin (GC) mit der Liebermann-Burch~rdschen Reaktion bzw. yon Lipoidphosphor (LP) nach C. FISKE und u SUBBi~OW a in gesonderten Extraktanteilen. -- Aus/i~hrung. Zur Bestimmung von GC und LP in einer Serumprobe werden 0,2--0,3 ml Blur aus der Fingerbeere entnommen und in einer Capillare yore Inhal~ 0,2 ml, Li~nge 5 em, Lumen 2 ram, Wandst i rke 1 mm aufgenommen; ihr engeres Ende wird mit Siegel[ack oder Mendelejeff-Kitt raseh verschlossen, vertikal bis zur Gerinnsel- bildung aufgesteUt und vorsichtig mit Gaze umwickelt. Man zentrifugiert 15 rain bei 1500--2000 U/rain, saugt entweder den ganzen Uberstand mit feiner Caloillare ab oder entnimmt sofort die nStige Menge mit tariertem Tropfer. Man bringt in ein 6 ml-Zentrifugenglas mittels halbautomatiseher Mikropipette mit MeBcal0illare oder mit tariertem Trolofer 0,06 ml (6 Mikrotropfen : #Tr) Serum, giefit 2 ml Bloorsches Gemisch (BG) (96~ dest.-~_thanol-~ther pro narcosi, 3:1) in die Achse des Probierglases, l i l ~ mit Kork verseMossen 1 Std stehen (n6tigenfalls fiber Nacht), mischt mit einem Glasstiibchen, das mit 2- -3 Tr. BG abgespfilt wird, zentrifugiert 10 min bei 1500--2000 U/rain, gieBt den Extrakt in ein 3 m1-Me~- k61bchen, ffillt mit Athanol zur Marke auf, mischt und nimmt sofort Proben zur Bes~immung yon GC H- LP. 0,5 ml Extrak~ : 0,01 ml Serum. -- Zur gesonderten Bestimmung yon GC und LP oder zur Bes~immung nur eines dieser Bestand~eile verf~hrt man wie folgt: Man bringt in 2 Zen~rifugengl~ser je 0,01 ml (1 #Tr) Serum, versetzt mit 1 ml BG, zentrifugiert nach 1 Std und gieg~ den Uberstand zur GC-Bestimmung in Glasbfichsen mit aufgesehliffenem Deckel (3--5 ml) oder zur LP-Bestimmung in 1 ml-MeI~k51bchen aus schwersehmelzbarem Glas. A. GC- Bestimmung. Man bringt in 2 Glasbfichsen je 0,5 ml Extrakt entsprechend 0,1 ml Serum, dampft zur Troekne tin, 16st den Rfickstand in 0,5 ml Chloroform, versetz~ mit 0,1 ml (5 #Tr) bei 135~ dest. Essigsi~ureanhydrid und 0,01 ml (1/~Tr) konz. Schwefelsiure (ch.r., D 1,84), mischt durch vorsichtiges Schwenken, versehliei~t mi~ dem Deckel and eolorimetriert naeh 20 rain Stehen im Dunkeln im FEK-l%57- Ger~t mit optischem Aufsatz nach A. A. POKROVSKIJ und totem Lichtfilter l~r. 8 (656 nm). Die Berechnung (auf rag-~ erfolgt mittels einer Eiehkurve oder Tabelle. Grundlage der Eichkurve ist ein Standard yon 100 mg Cholesterin in 100 ml Chloro- form. Man bereitet daraus eine Reihe yon 0,01--0,1 mg CholesSerin in je 0,5 ml Chloroform, versetzt mit je 0,1 ml Essigsiureanhydrid, 0,01 ml konz. Schwefel- s~ure un4 colorimetrier~ nach 20 rain. -- B. LP-Bestimmung. Man bringt in zwei 1 ml-K51bchen je 0,5 ml Extrakt und dampft zur Troekne ein. Gleichzeitig ver- arbeitet man Kontrollen, worin 0,5 ml Ex~rakt ( = 0,01 ml Serum) durch 0,5 ml BG ersetzt sind. Man versetz~ mit je 0,03 ml (3 #Tr) Schwefels~ure 1 : 1, verbrennt auf einer Asbestplatte, zuerst 1 Std bei niedriger, dann 1--2 Std bei hSherer Temperatur, bis zur Braunf~rbung. Nach Erkalten versetzt man Kontrolle und Probe aus einem ~arierten Tropfer oder einer halbautoma~isehen Mikropipette mit je 0,005 m] (1 #Tr) Perhydrol, erwarmt vorsichtig 1--2 min fiber die Entf~rbung hinaus, gib~ nach dem Erkalten in jedes KOlbchen je 1--2 Tr. dest. Wasser und erw~rmt vorsieh~ig fiber der Brennerflamme. Die Verbrennung ist beendet, wenn die L5sung nach Wasserzusatz sich nicht mehr br~unt. Naeh Erkalten ffigt man

1965 4. Analyse von biologischem Material 235

ins KSlbchen mit dem Mineralisat 0,1 ml (5 #Tr) wgl]rige 2,5~ Ammonium- molybdatlSsung und 0,04ml (2#Tr) 0,25~ EikonogenlSsung (siehe unten) hinzu, fiillt mit dest. Wasser zur Marke auf, schiittelt und colorimetriert im FEK- N-57-Ger/~t mit optischem Aufsatz uud rotem Lichtfilter bei 656 nm. LP (in mg-~ wird nach einer Eichkurve oder Tabelle berechnet. -- Zur Herstellung der Eich- lcurve dient ein Monoka]iumphosphatstandard. Man bringt in eine l~eihe yon 1 ml- MeBkSlbchen 0,01 . . . his 0,1 ml Standard ( = 0 ,0004. . . - - 0,004 mg Phosphor), versetzt mit je 0,1 ml (5 #Tr) saurer AmmoninmmolybdatlSsung und 0,04 mI (2 #Tr) EikonogenlSsung, bringt mit dest. Wasser zur Marke, mischt und colorimetriert nach 5 rain wie die Probe. -- Die Methode hat an sich ffir A. eine Fehlerbreite yon 4,3 :k 1,1~ fiir B. yon 4,1 • 1,0~ . Die Diskrepanz gegeniiber entsprechender Makromethoden betr/~gt ffir A. 2,7 • 0,20/0, fiir B. 2,1 • 0,3O/o . -- EilconogenlSsung. 0,12g umkristallisiertes Eikonogen wird in 45 ml 15~ Na- triumbisulfit- oder -metabisulfitl5sung gelSst; nach AuflSsung (langsam, untcr Umriihren) setzt man ges/~tt. NatrinmsulfitlSsung hinzu, bis die LSsung klar wird, bringt mit dest. Wasser zur 50 ml-Marke und filtriert in ein dunkles Glas. An ktihlem Ort nur 3- -4 Tage haltbar. -- Monol~aliumphosphatstandard. 0,0351 g werden quanti tat iv in einen 200 ml-Kolben gebracht, worauf 1 ml 10 n Schwefelsi~ure zugesetzt, zur 3~arke aufgefiillt und gemischt wird. -- Saure Ammoniummolybdat- 15suug. 1,25 g Ammoniummolybdat wird in 10 ml dest. ~u gelSst, in ein 50 ml-KSlbchen ffltriert, das 25 ml 10 n Sehwefels/iure enth~lt, die LSsung mit dest. Wasser zur Marke aufgeffillt und gemischt.

1 Lab. Delo 10, Nr. 3, 145--150 (1964) [Russisch]. Ern/~hrungsinst. d. Akgd. Med. Wiss., Mosk~u (UdSSR). -- 2 j . biol. Chemistry 24, 227 (1916). -- s j . biol. Chemistry 66, 375 (1925); vgl. diese Z. 85, 110 (1931). P. H~As

Die Anwendung yon Tomatin (To) oder Digitonin (Di) als F~illungs- Reagens zur Bes t immung yon Cholesterin (Cho) in t ier ischem Gewebe besctn'eiben C. H. EDWARDS, G. A. EDW~I~DS und E . L . GADSDEN 1. - - Arbeits- weise. Man homogenisiert je i g Lebergewebe oder Faeces, extrahiert das )/[aterial mit einem Gemisch aus Aceton, Alkohol und Ather und gibt zu 9--10 ml des filtrierten Auszuges je 5 mg To nach dem Verfahren yon J. J. KABA~t, J . T . McLAvG~LIN und C. A. I:~IEGEL 2, oder 14 mg Di nach der yon R. SCHOElgtIEII~IEI~, und W. M. S~ER~Y a verSffentlichten Methode. Nach dem Abtrennen der aus- gefi/llten Derivate des To bzw. Di mit dem im Untersuchungsmaterial vorhandenen freien Cho verseift man das Fi t ra t durch Behandlung mit Kaliumhydroxid, um die Cho-Ester zu spalten, und wiederholt die Fiillungsreaktion nach der gleichen Technik, wodurch der Anteil des gebundenen Cho erfaflt wird. Die auf Mikrofilter gesammelten Pri~cipitate wiischt man, wenn To als Fi~llungsreagens Verwendet wurde, mit Aceton-_~ther (1:2), wenn Di eingesetzt ~urde, nur mit Ather. Im Original ist die Bestimmung yon mit 14C-markiertem Cho beschrieben.

Analyt. Chemistry 36, 420--421 (1964). Dept. Home Economics and Chem., Agric. and Tectm. Coll., Greensboro, N.C. (USA). -- 2 Analyt. Chemistry 33, 305 (1961); vgl. diese Z. 187, 80 (1962). -- ~ J. biol. Chemistry 106, 745 (1934).

K. SOLLNE~ t~ber die si iulenchromatographisehe Trennung yon Cholesterylestern und

freiem Cholesterin aus dem Blut berichtet D. WEBSTE~L Die aus dem Serum durch Extrakt ion mit 1)etrol~ther (KP 40--60~ erhaltenen LSsungen werden auf eine kleine S~ule mit aktiviertem Aluminiumoxid gegeben. Die Ester werden mit Petrol~ther, freies Cholesterin nachfolgend mit einer Mischung aus 30o/0 Di~thyl~ther in Petrol~ther eluiert. Die in 2 ml-Fraktionen in RShrchen auf- gef~ngenen Eluate werden zur Trockne eingedampft und mit Eisenchloridreagens 2