Histochemie 7, 291 296 (I966)

D I E D t J N N S C H I C H T C H R O M A T O G R A P H I E VON G E W E B S S C H N I T T E N

L. BREITENECKER und W. I-IoLcZABEK

Institut fiir Gerichtliche Medizin der Universit/~t Wien (Vorstand: Prof. Dr. L. BRV.ITENECKER)

Eingegangen am 1. Juni 1966

Summary. A method is reported which allows a rapid chromatographic determination of the lipid content of stained or unstained, fixed or unfixed tissue sections. Before and after chromatography the sections can be histologically investigated, which makes it possible to get some knowlegde of the histotopographical situation.

The test can be carried out within three hours time. They make a qualitative as well as quantitative determination of the various lipid frac-

tions possible. With the same method it is also possible to determine other substances or mixtures of substances.

Zusammen/assung. Es wird fiber eine Methode berichtet, die es gestattet, den Lipidgehalt ungefi~rbter oder gefiirbter, fixierter oder unfixierter Schnitte rasch direkt dfinnschicht- chromatographisch zu untersuchen. Die Schnitte kSnnen vor und nach der Chromatographie- rung histologisch untersucht werden, wodurch die Methode auch histotopographische Ein- blicke gestattet.

Die Untersuchungen k6nnen in drei Stunden vorgenommen werden. Sie gestatten eine qualitative und quantitative Erfassung der einzelnen Lipidfraktionen. Die MSglichkeit, auch andere Stoffe oder Stoffgemische aus Schnitten chromatographisch

zu erfassen, ist gegeben.

U m den q u a n t i t a t i v e n und qua l i t a t iven Gehal t eines Organes an Fe t t s to f fen und deren h i s to topographische Ver te i lung zu erfassen, h a t BREITENECKER in An lehnung an seine h i s to rSntgenographischen Un te r suchungen (1959, 1960) vorge- schlagen, Schni t te d i rek t zu chromatograph ie ren . Dadurch wurde der zeit- raubende E x t r a k t i o n s v o r g a n g umgangen und eine histologische Un te r suchung des Schni t tes vor und nach der Chromatograph ie rung mSglich.

Wi r f iberschichte ten ungefi i rbte oder gefis Gefr ierschni t te formal in- f ix ier ten Mater ia ls mi t dem Adsorp t ionsmi t t e l und konn ten auf diese Weise z. B. aus s tea to t i schen Lebern Chroma tog ramme gewinnen, die den C h r o m a t o g r a m m e n der E x t r a k t e qua l i t a t i v entsprachen.

HOLCZAB~]~ ber ich te te hierf iber e rs tmals 1964 und wies auch auf die Arbe i t yon CuRRI u. Mi tarb . (1964) fiber , ,H i s tochromatograph ie" hin.

CURRIS Deckg lasmethode ha l t e r der Nachtef l an, dal~ das Klebemi t t e l , mi t dem die Deckgl/s mi t dem Schni t t auf tier P l a t t e fes tgehal ten werden, bei der Erw/~rmung auf 1050 ve rkoh l t u n d sich dadurch s tSrende F lecke bilden. Vor diesen Unte r suchungen waren nur pap ie rch romatograph i sche Schn i t tun te r su- chungen yon LINDNER (1956) in i t i ie r t u n d yon seinem Arbei t skre i s auch wel ter ausgebau t worden.

Die Dfinnschicht als Tragersubs tanz is t aber dem Pap ie r bei wei tem fiberlegen (ZOLLN]~R u n d WOLFRAM, 1962), denn die Kiesels/iure e ignet sich besonders zur Auf t r ennung yon Lip idsubs tanzen , sie ge s t a t t e t die Auf t rennung grSl~erer Sub- s t anzmengen u n d sie bes i tz t vor a l lem eine wesent l ich gr61~ere Trennungsge- schwindigkei t . Darf iber h inaus h a t die Kiesels/ iure eine grSl~ere chemische Stabi- lit/~t, so dal~ sie aggressiven Sprf ihreagent ien und selbst Veraschung gegenfiber

20 Histochemie, Bd. 7

292 L. BREITENECKER und W. HOLCZABEK:

s ich i n d i f f e r e n t ve rh i i l t . I h r k l e i n e r N a c h t e i l i s t d a r i n zu e r b l i c k e n , dal3 die R]-

W e r t e n i c h t so k o n s t a n t s i n d wie be i d e r P a p i e r c h r o m a t o g r a p h i e , weft d e r W a s s e r - g e h a l t n i c h t k o n s t a n t z u h a l t e n is t .

A. T e c h n i s c h e V o r b e m e r k u n g e n

Formalinfixierte Gewebsbl6cke werden vor dem Einfrieren in Zylinder oder Quader yon 4 mm Durchmesser bzw. 4 mm Seitenl~nge mit einem Hohlbohrer gestanzt oder zurecht- gesehnitten, um ein konstantes Vergleiehsma~ zu haben. Von diesen Gewebsstficken werden mit dem Gefriermikrotom 10--15 ~ dicke Schnit te hergestellt. Diese Schnitte werden auf die Chromatographierungsplat ten (20 • 20 cm, 20 • 10 cm) 1 1,5 cm oberhalb vom unteren Plat ten- rand aufgezogen. Nach kurzem Antrocknen der Schnitte (1--2 min) wird die Plat te samt den Schni t ten mit dem Adsorptionsmittel fiberschichtet. Als Streichger~t verwenden wir das zuerst von STAHL (1956) angegebene Modell oder das yon BREITE~ECKER adaptierte Ger~t der F i rma Desaga. Die P la t ten werden durch 10 min langes Luft trocknen und 30 min langes Erhi tzen auf 105 o im Trockenschrank aktiviert .

Adsorptionsmittel. Kieselgel-G (Firma E. Merck, Darmstadt) . Schichtdicke: 250 tz. Chromatographierungstechnik. Meistens wenden wir die sog. , ,Sandwichmethode" an, weil

diese eine optimale Sattigung des Kammerraumes garantiert . Der eigentlichen Chromatogra- phieplat te wird - - nur durch einen schmalen, dreiteiligen Pappendeckelrahmen getrennt - - eine zweite P la t te gegenfibergestellt, die der Kieselgelsehichte zugewendet mit Zellulose i iberschichtet ist. Die Zelluloseschichte wird mit dem Flie~mittel getr~nkt 2, so da~ auch von hier das Flieflmittel in den schmalen Kammerraum abdunsten kann. W~thrend firmenm~i3ig die P la t ten in einen schmalen Trog gestellt werden sollen, stellen wir die P la t ten in eine groBe Trennkammer und ffillen in diese das Laufmittel ein.

Wir chromatographieren aber auch in Trennkammern, die in fiblicher Weise mit Filter- papier ausgeschlagen sind.

Flieflmittel. Fiir die Lipide im engeren Sinn verwenden wir Petrolather-Di~thyl~ther- Eisessig (90 ~ 10 -~ 1), fiir die Phosphat ide Chloroform-Methanol-Ammoniak-Wasser (65 30 + 2 + 4).

Lau/strecke. Als SteighShe w~hlten wir eine Laufstrecke von 16 cm. Bei dieser Steigh6he dauert der Chromatographierungsvorgang in der Sandwichkammer 25 rain.

Entwicklung der Platten. Nach kurzem Luft t rocknen bespriihen wir die P la t ten aus etwa 3/4 m Entfernung mit Ammoniummolybdat-Perchlors~ure, einem Reagens, das urspriinglich zur Darstellung der Phospholipide angegeben worden ist, das sich uns aber schon bei friiheren Untersuchungen (HoLCZABEK, 1964) auch zur Sichtbarmachung der Lipide als geeignet erwies. Nach dem Besprfihen wird die Pla t te im Trockensehrank 15 rain auf 1050 erhitzt. Die Frak- t ionen erscheinen als griinlichblaue Flecke.

Man kann auch Jodd~mpfe auf einem Wasserbad in einer Trennkammer auf die Plat te einwirken lassen, wodurch die Lipidfraktionen als braune Flecke erscheinen. Sie kSnnen um- randet und nach Verschwinden durch Abdampfen des Jod unver~ndert eluiert werden. Man kann sie aber aueh durch Wiederholen dieses Vorganges beliebig oft s iehtbar machen.

Der ganze Vorgang yon der Herstellung des Schnittes bis zur Entwicklung des Chromato- grammes beansprucht nur drei Stunden/

ldenti/izierung der einzelnen Fraktionen. Bei frfiheren Untersuchungen ha t HOLCZABEK (1964) durch Mitlaufenlassen yon Testsubstanzen die einzelnen Frakt ionen identifiziert. Bei Verwendung von Petrol~ther-Di~thyl~ther-Eisessig als Fliel]mittel ist die erste deutlich sichtbare Frakt ion yon un ten Cholesterin, die n~chste die freien Fettsauren, dann folgen die Triglyceride und zuletzt erscheinen die Cholesterinester. Wir wuBten aus eigenen Versuchen, dal3 am S ta r tpunk t die Phospholipide liegenbleiben, und aus der Li teratur (WOOD u. a., 1964), dal3 zwischen S ta r tpunk t und Cholesterin die Mono- und Diglyceride zu sehen sind.

Histologische Untersuchung der Schnitte. Vor und nach der Chromatographierung kann der gef~rbte Sehni t t histologisch untersucht werden. Meist gelingt es, den Schni t t nach der Chromatographie v o n d e r Pla t te abzulSsen. Um aber das miihevolle AblSsen und eine Be- sch~digung des Schnittes zu vermeiden, ha t BREITENECK~R in die Plat te eine Aussparung

1 Grundausrfistung der Firma Desaga, Heidelberg. 2 Angabe und Einrichtung der Firma Camag, Ziirieh.

Diinnschichtchrom~tographie von Gewebsschnitten 293

in Objekttr~gerbreite einschleifen lassen, in die der mit den Schnitten beschickte Objekttr~ger yon der Seite her eingeschoben werden kann.

B. Zur KHirung einiger grundsiitzlicher Fragen

1. Wirlct sich das Formalin/iir die histochromatographische Untersuchung nachteilig aus ?

S~Aeius (1962--1964) beschrieb an Leberschnitten aus forma]infixiertem Material schon wenige Stunden nach der Formalinfixierung eine Basophilie, Quellung und Aufl6sung yon Fetttropfen, die er auf die Lipaseaktiviti~t zuriick- ffihrte. Diese besteht bis zu 10 Tagen Aufenthaltes des Gewebsstfickes in Formalin und kann (lurch salzsaures Formalin (pH yon 2,5) oder durch Fermentblocker verhindert werden.

Wit entnahmen Meerschweinchen Lebergewebsstfickchen, stellten einerseits Kryostatschnitte her, andererseits fixierten wir die Stfickchen verschieden lang in Formalin, um davon Gefrierschnitte zu Vergleichszwecken zu gewinnen. Im Kryostatschnitt lebensfrischen Gewebes waren schon Fettss zu erkennen. Die Fettsi~ureffaktionen der auch l~ngere Zeit im Formalin gelegenen Schnitte waren nicht auffallend erh6ht.

Wit ffihlten uns daher bereehtigt, auch weiterhin formalinfixierte Schnitte zu untersuchen.

2. Besteht ein Unterschied zwischen einem Extraktchromatogramm und einem Schnittchromatogramm ?

Die Extraktionen der Gewebe nahmen wir nach der Folchschen Methode, die etwa 2 Tage in Anspruch nimmt, vor.

Im Schnittchromatogramm waren gleichviele und gleichgelagerte Fraktionen zu sehen wie im Chromatogramm des Extraktes. Durch die Konzentration des Extraktes war nur die Intensit~t erhSht.

3. Spielt die Form oder die Gr6fie des Schnittes eine Rolle ?

Aus verschicden geformten Leberstiicken - - dreieckigen, quadratischen und runden Schnitten - - erh~lt man gleichartige Chromatogramme. Aus rechteckigen Gewebsschnitten (20:4 mm, 7--15 ~ dick) gewinnt man - - sofern die Schnitte quer aufgelegt werden - - quergestelltc, streifcnfSrmige Fraktionen, die notwen- digen/alls einzeln eluiert und weiteren Untersuchungen zugeffihrt werden k6nnen.

4. Kann man ge/grbte Schnitte chromatographieren ?

Auch aus gef~rbten Schnitten erh~lt man chromatographisch alle Lipidfrak- tionen. Das H~malaun bleibt am Startpunkt liegen, das Sudan I I I teilt sich in zwei Fraktionen, die man durch Mitchromatographieren dieses Farbstoffes lokalisieren muff.

5. Werden aUe sudanophilen Substanzen vollst~indig herausgel6st ?

Nach der Chromatographierung eines mit Sudan I I I gef~rbten Leberschnittes sind alle sudanophflen Substanzen bei der histologischen Kontrolluntersuehung aus dem Schnitt geschwunden. Bei der Nebenniere k6nnen nach einer einmaligen Chromatographierung nur br~unlich angef~rbte KSrnchen noeh festgestellt werden.

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294 L , B R E I T E N E C K E R und W. HOLeZABEI(:

6. Nachweisbar]ceitsgrenze

Nach Herstellung einer Triglycerid-Verdfinnungsreihe und densitometriseher '~ Auswertung konnte noch 1 7 nachgewiesen werden.

C. Einige Anwendungen der Methode I. Ein Chromatogramm einer normalen Leber, einer Fettleber, eines Sehnittes

aus dem Unterhautfettgewebe und aus einem atheromatSsen Plaque der Aorta

Abb. 1. D i innseh ieh tch romatogramm der Lipide yon Gewebssehni t ten: 1 normale Leber, 2 Fett leber, 3 Unter- h~utfet tgewebc, 4 Athcromatose der Aorta. Schnittgr6t3e: 4 ram. Schni t td icke: ca. t5 ~t. Kieselge] G: 250~z.

F l i egmi t te l : :Petrol~ther-Di~tthyl~ther-Eisessig (90:10:1) . Laufzei t : ca. 30 min. S ich tba rmachung: Amnmniummolybdat- l )erchlors / iure

zeigt die versehiedene Verteilung der Lipidfraktionen. Man k6nnte die beiden letztgenannten Pr/~parate als nat/irliche Vergleichspr/~parate bezeichnen (Abb. 1).

Die Gr6ge der Triglyceridfraktion gibt ein Ma[] fiir den Grad der Verfettung, der histologisch nur gesch~tzt werden kann. Man kann densitometrisch die quanti tat ive Verteilung der Fraktionen bestimmen.

Diese Untersuehungen kann man auch mit bioptisehem Material anstellen: Das Leberpunktat kann vorher und nachher histologisch untersucht werden (Abb. 2).

I I . Da der geriehtliche Mediziner h/~ufig in die Lage kommt, faule oder zumin- dest nicht mehr frische Organe zu untersuchen, war zu priifen, ob dureh die

a Chromosean der Firma Joyee-Loebl.

Diinnschichtchromatographie yon Gewebsschnitten 295

F~ulnis wesentliche Unterschiede im Untersuchungsergebnis hervorgerufen wer- den k6nnen. Wir haben Faulversuche vorgenommen und feststellen k6nnen, dab die Triglyceride schwinden k6nnen und die Fetts/s zunehmen (Abb. 3). In anderen F/~llen bleibt die Triglyceridmenge gleich, die Fettsituren nehmen aber zu, was offenbar auf den Zerfall der Strukturlipide zurfickgeht.

Abb. 2. Dfinnschichtchromatogramm yon Gewebsschnitten aus Leberbiopsien. t t istologische Diagnose: Steatosis hepatis. Formalinfixierte, ungefarbte Schnitte. Schnit tgr6~e: 4 ram. Schni t tdicke: ca. 15 ~. Kieselgel G: 250 U.

Fliel~mittel: Petrol~ther-Di~tthylltther-Eisessig (90:10:1). Laufzei t : ca. 30 min. Sichtbarmachung: Ammoniummolybda t -Perchlors~iure

Abb. 3. D(innschichtchromatogramm der Lipide aus Lebergewebsschnitten. 1 Ungefftrbter Gefrierschnitt . Schnitt- grSi3e: 4 mm. Schnit tdieke: ca. 15 ~. Gewebsstfiek wurde 30 rain nach dem Tod entnommen. Formal inf ix icr t : Nach 24 Std geschnitten. 2 Dasselbe Gewebsstiiek wurde 4 Tage faulen gelassen. Naeh 24 Std Formalinf ixierung geschnit ten. Ungefarbter Gefrierschnitt. SchnittgrSBe: 4 ram. Schnit tdicke: ca. 15 ~z. Kieselgel G: 250~. F]ieG-

mi t te l : Petrolather-Diathyl~ither-Eisessig (90:10:1). Laufzei t : ca. 30 rain. Sichtbarmachung: Ammoniummolybda t -Perchlorstiure

I I I . Besonders interessierte uns, ob man chromatographisch einen Unterschied zwischen der degenerativen und steatotischen Verfettung der Leber feststellen kSnne. Wir dachten dabei an die von KIEF (1964) ge~uBerte Ansicht, dab bei Fehlen der Phosphatide eine grobtropfige, bei ihrem Vorhandensein jedoch eine feintropfige Verfettung auftrete. Wir mul~ten uns daher bemfihen, auch die Phosphatide chromatographisch zu erfassen bzw. aufzutrennen. Wir chromato- graphierten zuerst mit Petrol~ther-Diiithyliither-Eisessig als Fliel~mittel - - dabei bleiben die Phosphatide am Startpunkt liegen - - und entfernten auf diese Weise

296 L. :BREITENECKER und W. HOLCZABEK: Diinnschichtchromatographie

die Glyceride, das freie und gebundene Cholesterin bzw. die Fetts/~uren. Sodann chromatographier ten wir dieselben Schnit te - - nach Abwaschen und Erneuern der Kieselgelschichte ein zweites Mal mi t Chloroform-Methanol-Ammoniak- Wasser, also einem ffir Phosphatide geeigneten Fliel~mittel. I n FKllen von grol~- tropfiger Verfe t tung sieht man eine nur schwach angedeutete Phospholipidfrak- t ion, bei feintropfiger Verfet tung war diese F rak t ion deut]ich zu sehen - - ein Test -Leci thin lag in gleicher HShe.

Unsere Unte r suchungen stfitzen daher die Ansicht, dab die Anwesenheit der Phospholipide auf die TropfengrSl~e des Fet tes einen EinfluI~ haben kann.

Weitere M6glichkeiten der Methode. SelbstverstKndlich kSnnen auf die gleiche Art u n d Weise auch andere Stoffgemische bzw. Stoffe aus dem Schni t t chromato- graphier t werden.

Literatur

BREITENECKER, L.: HistorSntgenographische Untersuchungen bei Silikose. Dtsch. Z. ges. gerichtl. Med. 49, 194--205 (1959).

- -His torSntgenographische Untersuchungen bei Schwermetallvergiftung. Dtsch. Z. ges. gerichtl. Med. 49, 654--663 (1960).

CuR•I, S.B., M. RAso u. C. R. RossI: Die Anwendung der Dfinnschichtchromatographie zum Nachweis von Fett und Lipoidsubstanzen in Gewebsschnitten. Histochemie 4, 113-- 119 (1964).

HOLCZABEK, W.: Zur Frage der Entstehung der Lungenfettembolie auf Grund dfinnschicht- chromatographischer Untersuchungen. Klin. Med. (Wien) l l , 4 8 3 4 9 6 (1964).

- - Diinnschichtchromatographische Untersuchungen von Gewebsschnitten. Tagsber. Dtsch. Z. ges. gerichtl. Med. 1964 (im Druck).

KIEF, H.: Studien zur Morphologie des Neutralstoffwechsels. Stuttgart: Georg Thieme 1964. LINDNER, J. : Eine einfache Methode zur Analyse von Gewebsschnitten. Naturwissenschaften

48, 201 (1956). Si~r D. : Autofermentative Basophilie, Quellung und AuflSsung yon Fetttropfen der

fixierten Leber. Z. Zellforsch., Abt. Histochem. 8, 150--169 (1962--1964). STALL, E.: Dfinnschicht-Chromatographie. Pharmazie 11, 633--637 (1956). WooD, P., K. IMAICI~I, J. KNOWLES, G. MICItAELS, and L. KINSELL: The lipid composition

of human plasma chylomikrons. J. Lipid Res. 2, 225--231 (1964). ZOLL~ER, N., u. G. WOLFRAm: Untersuchungen fiber die Diinnschichtchromatographie yon

Lipoiden. Klin. Wschr. 40, 1098--1101 (1962).

Prof. Dr. L. BREITENECKER, Prof. Dr. W. HOLCZABEK Institut ffir Gerichtliche Medizin der Universit~tt Wien Wien IX, Sensengasse 2