Pfliigers Arch. 326, 162--183 (1971) �9 by Springer-Verlag 1971

Die Freisetzung von Acetylcholin an der motorischen Nervenendigung unter dem EinfluB

von d-Tubocurarin

H. BAuEr*

Physiologisches Institut der Freien Universit~t Berlin

Eingegangen am 12. l ~ r z 1971

The Inf luence of d -Tubocura r i a on Release of Acetyleholine b y Motor Nerve-Endings

Summary. In order to study the influence of d-Tuboeurarine (d-TC) on the release of acetylcholine (2kCh) by motor nerve endings intracellular recordings of miniature end-plate potentials (mepp) and end-plate potentials (epp) were per- formed in vitro using the hemidiaphragma-phrenicus preparation of golden ham- sters.

The following results were obtained: 1. The spontaneous release of ACh is not influenced by d-TC ,as the rate of mepp

is the same in curare-free bathing solutions and in solutions containing d-TC (1--4 • 10-: g/ml).

2. The release of ACh following stimulation of the phrenicus nerve was examined in solutions containing different concentrations of d-TC (ranges: 2--8 • 10 -~ g/ml and 0.2--1 • 10 -6 g/ml). The following parameters proved to be independent of changes in concentration of d-TC:

a) the partial depletion of the reservoir of immediately releasable ACh (content: 960 • i70 quanta) by single stimuli.

b) The time constant of replenishment of the reservoir (v ----- 1.4 ~= 0.2 see) from the store.

c) The number of quanta released by one stimulus during repetitive stimulation in normal J~Trebs solution as well as in solutions with lower (Ca++)o and higher (Mg++)o.

d) The partial depletion of the stere of ACh-quanta (content: 340000 :~ 77000 quanta) by long-lasting repetitive stimulation.

e) The rate coefficient of the replenishment of the store of ACh-quanta (fl ~- 1.3 • 0.56 min -1) by synthesis.

:From these results it is concluded that--within the margin of accuracy of the measurements--d-tubocurarine does not effect the release of ACh by motor nerve- endings.

Key-Words: lY[otor Endplate -- d-Tubocurarine -- Acetyleholine -- Release -- Diaphragm -- Golden Hamster.

* ~ i t Unterstfitzung der Deutschen Forsehungsgemeinschaft.

Tubocurarin and Aee~yleholin 163

Zusammen/assung. Um die Wirkung yon Curare auf die Aeetylcholin (ACh)- Freisetzung an der motorischen Nervenendigung zu untersuchen, wurden bei unter- schiedlichen Konzentrationen yon d-Tubocurarin (d-TC) an Hemidiaphragma- Phrenicus-Praparaten des Goldhamsters in vitro inCracellular Minia~urendplar potentiale (1VIEPP) und Endpla~tenpotentiale (EPP) abgeleite~.

Folgende Ergebnisse wurden erzielt: 1. Die Spon~anfreisetzung yon ACh wird yon Curare niche beeinfluBt, da die

1VIEPP-Rate im Konzentra~ionsbereieh yon 1--4" 10 - : g/rot d-TC gegeniiber eurarefl'eier BadiSsung nich~ verandert war.

2. Weiterhin wurde die ACh-Freisetzung durch l~ervenreizung bei verschiedenen Curarekonzentrationen mit ~nterschiedliehen ReizmusteI~ untersuch~ (Konzen- tra~ionsbereiche 2--8 �9 10 -~ bzw. 0,2--1 �9 10 -6 g/ml d-TC). Folgende Parameter erwiesen sich als unabhangig yon der Curarekonzentra~ion:

a) die teilweise En~leerung des Reservoirs an freise~zbarem ACh dutch Einzel- reize (Inhalt: 960 • 170 Quan~en),

b) die Zeitkonstante der Wiederauffiillung des Reservoirs (~ = 1,4 =~ 0,2 sec) aus dem Speicher,

e) die pro Reiz freigese~zte Zahl der ACh-Quanten wabxend frequenter Reizung (Frequenzbereieh 0,2--100/see) sowohl in normaler Krebs-LSsung Ms auch bei erniedrigter (Ca++)o mid erkSh~er (1Vfg++)o,

d) die teilweise Entleerung des ACh-Speichers (Inhalt: 340000=~77000 Quanten) an ACh-Quanten bei langdauernder frequenter Reizung,

e) der Geschwindigkeitskoeffizien~ (fi ~ 1,3 • 0,56 rain -1) der Nachlieferung yon ACh-Quanten in den Speieher durch Syn~hese.

Aufgrund dieser Ergebnisse kann im Rahmen der 1VIe~genauigkei~ eine Wirkung des d-Tubocurarin auf die ~kCh-Freisetzung an der moterischen l~ervenendigung ausgesehlossen werden.

Svhliisselw6rter: lVIotorische Endplatte -- d-Tubocurarin -- Ace~ylcholinffeise~- zung -- Zwerehfell -- Goldhamster.

Kurze Zeit nach dem Naehweis yon Acetylcholin (ACh) als chemischem Transmit te r an der neuromuskularen Synapse (Dale, 1935a) stellten Dale, Feldberg u. Vogt (1936) lest, dal~ sich bei Nervenreizung diefrei- gesetzte Acetylcholinmenge bei einer Curaredosis, die die neuromuskulare Uberlei tung bloekiert, n icht veriindert.

Seitdem galt es als ~nbestri t ten, da]~ die postsynapt ische Membran der Wirkungsor t yon Curare ist (Brown et al., 1936), insbesondere, nach- dem der kompet i t ive Antagonismus zwischen Curare und Acetylcholin a m Receptor nachgewiesen war (Del Castillo u. Katz , 1957a; Fa t t , 1950; Goldsmith, 1963; Jenkinson, 1960; Nastuk, i953). Jedoch wurde immer wieder ein gleichzeitiger prasynapt ischer EinfluB gefordert (Abdon u. Bjarke, 1945; Riker et al., 1959a und b): Von mehreren Arbei tsgruppen wurde eine Veranderung der Erregbarkei t der motorischen Nervenendi- gung durch Curare nachgewiesen (vgl. S tandaer t u. Riker, 1967); ob dartiber hinaus ein Einitul~ au f die Acetylcholinfreisetzung an der moto- risehen Nervenendigung besteht, ist jedoch kon~rovers. Dale e~ al. ha t ten das dutch indirekte Reizung - - bei vollstandiger t t e m m u n g der Cholin-

164 H. Bauer:

esterasen -- in die Badfliissigkeit freigesetzte ACh im biologisehen Test bestimmt. Ihre Ergebnisse warden yon Naehuntersuehern, die dieselbe Methode w/ihlten, ~eilweise best~tigt (Chang et al., 1967; Cheymol et al., 1962; Krnjevic u. Miledi, 1959). Andererseits wurde yon Beani, Bianehi u. Ledda (1964) eine frequenz- und temperaturabh/~ngige Hemmung der ACh-Freisetzung dureh d-Tubocurarin besehrieben.

Naess (1952, 1953) und IAllehefl u. Naess (1960, 1961) folgerten aus extracellul~ren Ableitungen der Endplattenpotentiale (EPP), da~ die sog. Wedensky-tIemmung, d.h. die Abnahme der EPP-Amplitude w/ihrend frequenter Reizung, durch Curare verursaeht wird. Intraeellu- 1/~re Ableitungen zur Frage einer derartigen pr/~synaptisehen Wirkung von Curare warden nut vereinzel~ unter speziellen experimentellen Be- dingungen im Rahmen allgemeinerer Problemstellungen durehgefiihrt (Ber~nek u. VyskoSfl, 1967; Goldsmith, 1963; Martin, 1955; Otsuka u. Nonomura, 1962).

In dieser Arbeit so]] dureh Verwendung versehiedener Reizmuster bei untersehiedlichem Ione~milieu ein Einflul~ yon d-Tuboeararin (d-TC) auf verschiedene Vorg/~nge in der pr/~synaptischen Nervenendigung syste- matiseh untersueht werden, die die ACh-Naehlieferung und den Frei- se~zungsprozeB bestimmen. Bei der Unterseheidung verschiedener Teil- funk~ionen des Freisetzungsmeehanismus wurde von experimentell iiber- priiften 1Vfodellvorstellungen ausgegangen, wie sie yon Liley u. North (1963), Birks u. Mac Intosh (1961), Elmqvist u. Quastel (1965) und Kruk- kenberg (1968a, et al., 1966, 1968b) entwiekelt worden sind.

Methodik

Von 60--80 g sehweren m~nnlichen Goldhamstern wurden Hemidiaphragma- Phrenicus-Pr~parate hergestellt und in einer Badkammer nach Dehnung um etwa ein Viertel der Ruhel~nge eingespannt.

Die Baditfissigkeit wurde mit Carbogen (950/0 02, 50/0 C02) durchperlt und bei einer Temperatur von 30~ konstant gehal~en. Die verwandte Krebs-LSsung hatte folgende Zusammensetzung (in raM/l) : l~aC1 118,5, I~aHCO 3 24,9, CaC12 2,54, MgS04 1,12, KH2PO ~ 1,12, KC1 4,74, Cholin 4,8 �9 10 .2 (Fa. ~erck) Glucose 1,0 g/l. In einigen Versuchen wurden die Konzentrationen von Ca ++ und ]Vfg++ ge~ndert (vgl. Ergebnisse). Curare wurde als d-Tubocurarin (Curarin-ASTA)1 in einem Konzen- trationsbereich von 0,1--8 �9 10 -e g/ml verwandt.

Der Phrenicus wurde fiber eine Saugelektrode supramaximal gereizt (Grass Stimulator S 4 mit Isoliereinheit, Impulsdauer 0,15--0,25 msec).

Die zur Ableitung verwandten Mikrocapillaren batten Widerst~nde yon 10 bis 30 M~. Das Membranpo~ential wurde in konventioneller Weise nach Impedanz- wandlung sowie DC- und AC-Vorverst~rkung (Grass P6, P5) auf einem Kathoden- strahloszillographen (Tektronix Type 502) verfolgt und meist photographisch registriert. In diesen Versuchen erfolgte die Auswertung der Amplituden der End- plattenpotentiale (EPP) und 1VIiniaturendplat~enpotentiale (MEPP) von Hand. In

1 Wir danken der Fa. ASTA fiir die ~J~berlassung yon Versuchsmengen.

Tubocurarin und Aeetylcholin 165

anderen Experimenten wurden die Potentialmessungen auf einem Magnetband (AMPEX) gespeiehert und mit I{ilfe eines Digitalreehners (Linc 8) ausgewertet (Kruekenberg u. Bauer, 1969).

Die ~embranpotentialableitungen an einer Endplatte (EP) differierten in ihrer Bauer zwischen 1 und 6 Std. Im Verlauf einiger l~ngerer Versuche erfolgte ein all- mahlieher Abfall des Membran-Ruhepotentials. Ausgewertet wurden nur Versuche, bei denen das Ruhepotential grSBer als 55 mV war und w~hrend der 1V[essungen bei einer Curarekonzentration um weniger als 10~ abfiel.

Berechnung der A Ch-Freisetzung Die Zahl mder einer mittleren EPP-Amplitude entspreehenden Quanten wurde

aus dem Variationskoeffizienten der Amplituden einer Potentialserie naeh der 1

Formel m = ~ bereehnet. Von einer Korrektur zur Berficksiehtigung der Streu-

ung der Einzelquanten bzw. des Rausehpegels wurde abgesehen (vgl. Martin, 1966), so dab die wirklichen Werte ffir m etwas h6her liegen diirften als die angegebenen. Bei den Computerauswertungen wurde der Rauschpegel gemessen. Die Werte lagen zwischen 20 und 50 ~V. Die Standardabweichungen der EPP-AmpIituden betrugen minimal 120 t~V, in den meisten Versuehen mehr als 150 ~V. Der durch die Vernach- l~ssigung des Rausehens verursachte Fehler hinsichtlich der Quantenzahlberechnung lag unter 15~ meist aueh unter 10~ . Die Depolarisationswirkung des Einzelquants (indirekt gemessene MEPP-Amplitude) wurde durch Division der mittleren EPP- Amplitude durch die mittlere Quantenzahl bestimmt, da im Bereieh der gemessenen EPP-Amplituden (bis zu 3 mV) eine praktiseh lineare Summation der Depolarisa- tionswirkung vorausgesetzt werden dart (Martin, 1955).

Ergebnisse Die Spontan]reisetzung von A Ch

Die Spontanfreisetzung yon ACh an den motorischen Nervenendigun- gen, gemessen an der Zahl der pro Zeiteinheit registrierten Miniaturend- plat tenpotent iale (MEPP) (Fat t u. Katz , 1952; Furukawa et al., 1957; Katz , 1962), wird dureh versehiedene experimentelle Bedingungen in ~hnlieher Weise beeinfluBt wie dig Freisetzung dureh ein Aktionspotent ial (AP) in der motorisehen Iqervenendigung. Deshalb haben wir zun~ehst den Einflul~ yon Curare auf die spontane Freisetzung yon ACh unter- sucht.

An 18 Endp la t t en wurden M E P P in curarefreier Badl6sung und bei Curarekonzentrat ionen yon 1 - -4 �9 10 -v g/ml d-TC abgeleitet. Die mittlere MEPP-t%ate pro Sekunde wurde fiir jede Curarekonzentrat ion ermit tel t und zur Spontanra te in eurarefreier Badl6sung in Beziehung gesetzt (Tab. 1),

Daraus ergibt sieh, dab eine signifikante Beeinflussung der Spontan- freisetzung in dem Bereich der angegebenen Curarekonzentrat ionen nicht vorliegt.

Die A Ch-Freisetzung dutch Reizung Bei frequenter Reizung bleibt die dureh ein Aktionspotent ial (AP) in

der motor ischen Nervenendigung freigesetzte Menge an ACh, gemessen an

12 Pfli igers Arch., Bd. 326

166 H. Bauer:

Tabelle 1. Spontan/reisetzung- MEPP-Rate (in Prozent der Spontanrate in curare- ]reier L6sung) an 18 Endplatten

d-TC (g/ml) 1 �9 10 -7 2- 10 -7 4 . 10 -7

MW 4- a~ 94,6 ~= 6,1% 90,6 • 10,4% 109,2 • 15,9%

Mittlere Spontanrate in cur~refreier LSsung: 43/rain (29~ Ableitungszeit- raum: 5--10 rain.

der Zahl an ACh-Quanten nicht konstant, sondern sie veri~ndert sieh abh~ngig yon der initialen Freisetzung und der Reizfrequenz. Aus diesem Phi~nomen sind Modelle fiber den FreisetzungsprozeI3 entwickelt worden (Elmqvist u. Quastel, 1955; Kruckenberg, 1968a und b; Liley u. North, 1953), die verschiedene Teflfunktionen des Freisetzungsmeehanismus erkennen Iassen: Ein kleines Reservoir an sofort freisetzbaren ACh- Vesikeln wird aus einem ca. 100mal gr613eren Speieher nach jeder Frei- setzung aufgeffillt, die Menge im Speicher wird dureh Vesikelneubfldung ausreehterhalten. Der Freisetzungsprozel3 selbst wird - - wahrseheinlich fiber ~_nderungen der intraeellul~ren Calciumkonzentration - - yore extraeellul~ren Ionenmilieu, yon der Reizfrequenz und der Reizdauer beeinflu•t. Versehiedene Reizmuster bei untersehiedlichem Ionenmflieu erm6gliehen die gezielte Untersuchung der GrSi3e der einzelnen Reservoirs, der Naehlieferungsgeschwindigkeit sowie der Ver~nderungen des Frei- setzungsprozesses selbst, gemessen am Anteil des Reservoirs an freisetz- baren ACh-Vesikeln, der dureh ein AP freigesetzt wird. Diese Parameter kSnnen in einer curarefreien, dem Blur etwa isoionalen ErsatzlSsung nicht gemessen werden, da die E P P unter diesen Bedingungen fibersehwellig sind. Ein Einflul3 yon d-TC auf die Freisetzung yon ACh kann in einer solehen ErsatzlSsung also mlr anhand einer unterschiedlichen Wirkung versehiedener, die neuromuskuls Ubertragung bloekierender Curare- konzentrationen ( ~ 2 �9 10 -s g/ml d-TC) naehgewiesen werden. Da diese Konzentrat ionen sehon im Siittigungsbereich tines mSgliehen pr~synap- tisehen Curareeffektes liegen kSnnten, haben wir aueh Untersuchungen in einem niedrigeren Konzentrationsbereich ( 1 - - 1 2 . 1 0 -7 g/ml d-TC) nach ErhShung der (Mg++)o und Erniedrigung der (Ca++)o durchgeffihrt.

Doppelreize

Wenn man 2 l~eize mit kurzem Intervall auf den motorisehen Nerven appliziert, so ist in normaler Krebs-LSsung mit einer die Oberleitung bloekierenden Curarekonzentration die Amplitude des zweiten E P P in Abhiingigkeit vom Interval l meist vermindert (Eccles et al., 1941). Das Minimum lieg~ meist bei Reizintervallen zwischen 50--200 msee. Die Ursache der Abnahme des zweiten Potentials wird in einer Verminderung

Tubocurarin und Acetylcholin 167

Test- EPP Kontrol[- EPP

30- 20-

10-

5-

B

1 I t i.o 2.0 3.o

A

100'

8 0 -

50-

h 0 -

I 1 I I I ! ~ 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 sec

5eC

i " . i ./

J v'

Abb. 1. A EPP-Ampli tuden bei Doppelreizen in zeitlichen Intervallen yon 50 msec bis 3 sec (Einzelversuch). Die Amplitude des zweiten E P P (Test-EPP) ist in Prozen~ des ersten E P P (Kontroll-EPP) angegeben. Jeder ~ e l p u n k t ist Mittelwert aus 4- -8 EPP-Ampli tuden, Die verschiedenen Symbole stehen fiir folgende Curare- konzentrationen (g/ml d-TC): X = 2 , 5 . 1 0 -8 , . = 5 - 1 0 -8 , ~ = 7 , 5 - 1 0 -8 . B Zur Berechnung der Zeitkonstanten ~ (in Sekuaden) fiir die Wiederauffiillung des ACh-R, eservoirs an freisetzharem ACh. Bei ann~hernd exponentiell verlaufender Nachlieferung in das ~eserveir ergibt sich re]gender Ansatz:

D - - t In Do ~ - (vgl. Takeuchi, 1958).

D ~ Differenz der Amplir des ersten und zweiten E P P ; D o = extrapolierter Wert ffir t ~ 0. Aus der Steigung der resultierenden Geraden wurde ~ berechnet. Im unteren Teil Origmalregistrierungen (Display des Computer-Oscillographen). 1. Reihe d-TC 2,5 �9 10 -~ g/ml; 2. Reihe d-TC 5 �9 10 -8 g/ml. Links jewels Kontroll-

EPP, darauf folgend Tes~-EPP in zunehmendem Zeitabstand

12"

168 H. Bauer:

Tabelle 2. EntIeerung und Wiederau]]i~llung des Reservoirs an/reisetzbaren ACh bei Doppelreizen an 8 Endplatteu

d-TC 1 d-TC 2 d-TC 3

A MW• 29 • 26 ~=2,9 23 •

B NW • a~ 1,4 • 0,2 1,3 ~: 0,1 1,5 4- 0,3

Curarekonzentrationsverh~ltnis: d-TC 1 : d-TC 2: d-TC 3 = 1 : 2: 3 (Bereieh 2 bis 8- 10 -6 g/ml).

A Differenz der Amplitude des ersten und zweiten EPP (in Prozent bei dem Reizintervall 200 msec).

B Zeitkonstante ~ der Wiederauffiillung in Sekunden.

der pr/isynaptisch ffir die Freisetzung unmittelbar verffigbaren ACh- ~enge gesehen (Takeuehi, 1958, 1961). Bei weiterer Verliingerung des Intervalls gleicht sich die Amplitude des zweiten Potentials dem Kon- trollwert an, was der Wiederauff/illung des Reservoirs an freisetzbarem ACh entsprieht (vgl. Abb. 1 A).

Derartige Doppelreizversuche wurden an 8 Endplat ten mit Interval- len zwisehen 15 msec und 3 sec durchgeffihrt. Die ~essungen erstreckten sieh fiber einen Curarekonzentrationsbereich von2- -7 ,5 -10-6g /ml d-TC. Die maximale Verminderung der ACh-Freisetzung war an allen Endplat ten und in sgmtlichen Curarekonzentrationen bei einem Zeitintervall yon etwa 200 msec erreicht. Sie betrug im Mittel 27 ~ und war bei hSheren Curarekonzentrationen eher erniedrigt. Die ann/ihernd exponentiell ver- laufende Rfiekbfldung der Depression (Abb. lB) erfolgte mi~ einer durchschnittlichen Zeitkonstante ~ yon 1,4 sec bei allen Curarekonzen- trat ionen (Tab. 2).

Demzufolge haben Curarekonzentrations/inderungen auf den Antefl, der aus dem Reservoir an freisetzbarem ACh dureh einen Reiz freige- setzt wird, und auf die Nachlieferungsgesehwindigkeit keinen EinfluB.

Kurze Reizserien

Bei l~eizung mit konstanter Fr~quenz kSnnen im Verlauf der Reiz- serie unterschledliche ~nderungen der EPP-Ampli tuden, z.B. in Abh/in- gigkeit vom Ionenmilieu, beobaehtet werden. In Krebs-LSsung beobach- te t man anf~nglich eine Abnahme der Amplituden, bis sieh naeh etwa 6- -8 Impulsen ein Plateau einstellt. Dagegen erfahren bei niedriger (Ca++)o und/oder hoher (Mg++)o die Amplituden der E P P im Laufe der Reizserie eine zunehmende Bahnung, die naeh etwa 20--40 Reizen (abhs yon der Reizfrequenz) in ein Plateau einmiindet. Die post- synaptisehe Empfindliehkeit ffir ACh ~ndert sieh w/~hrend einer knrzen

Tubocurarin und Aeetyleholin 169

%

100'

50

% 100

50

j

-z~

5/sec

! ___2_t_ ~ . p ~ e ~- ~ - ~ ~ - , ~ ~ p -

I I I I

30/sec

I I I l

lO0/sec

5 0 - - - ~ - -

I I I I ~--- 5 10 15 Reiz Nr.

Abb. 2. Verlauf der EPP-Amplituden in normaler Krebs-LSsung mit verschiedenen Curarekonzentrationen bei kurzer frequenter Reizung (Einzelversuch). Die EPP- Amplituden sind in Prozent des ersten EPP fortlaufend fiber der l~eizzahl auf- getragen. Jeder Me~punkt ist der Mittelwer~ aus 4 Reizserien. Curarekonzentra-

tionen (g/ml d-TC) : • = 4 .10 -6, . = 6 .10 -~, A = 8 �9 10 -6

Reizserie nich~ (Otsuka u. Nonomura , 1962), so dal~ die ~ n d e r u n g e n der E P P - A m p l i t u d e n durch eine J~nderung der Fre i se tzung bed ing t sind.

P r i i synap t i sch wi rksame P h a r m a k a , z .B. T e t r a a t h y l a m m o n i u m (Stovner, 1957; Koke t su , 1958) und Guanid in (Otsuka u. Endo , 1960), beeinflussen ebenfal ls die re la t ive P la teauhShe , bezogen auf das erste E P P der Reizserie. Aus diesem Grunde haben wit den Einflul3 yon Curare au f den Ver lauf der E P P - A m p l i t u d e bei kurzen Reizserien untersehiedl ieher F requenz un te rsuch t .

170 H. Bauer:

Tabelle 3. Mittlere Amplitude (A) der EPP im Plateau (in Prozentdes ersteu EPP), bei kurzen Reizserien in normaler Krebs-L6sung

Frequenz/sec A 1 A 2 A 3

5 55,4 51,0 58,6 10 49,0 48,3 47,7 25 50,0 45,0 51,1 30 39,0 35,5 34,0 50 43,0 38,0 45,7

100 19,7 19,7 19,3

Cur~rekonzen~rationsverh~ltnis: A 1: A 2 : A 3 = 1 : 1,5: 2 (Bereich 2--8.10 -6 g/ml). Mittelwerte yon 10 Endplatten.

In blutisoionaler Ersatzl6sung wurde bei kurzen Reizserien (20 bis 40 Reize, Frequenzbereich 5--100/see) stets eine initiale Abnahme der EPP-Ampli tuden im Verlauf einer Reizserie beobachtet (Konzentrations- bereieh yon d-TC zwischen 2- -8 �9 10 -6 g/ml, 10 Endplatten).

Mit steigender Reizfrequenz nahm die PlateauhShe ab. In dem Ver- such in Abb. 2 betrug bei allen verwendeten Curarekonzentrationen in gteieher Weise die durehsehnittliehe EPP-Ampli tude im Plateau bei 5/sec ca. 50~ des ersten EPP, bei 30/see ca. 350/o und bei 100/see ca. 200/o . Die Nachlieferung yon ACh in das Reservoir an freisetzbaren Vesikeln ist bei hSherer t~eizfrequenz gegeniiber der Nachlieferung bei Doppelreizen stark besehleurdgt (Elmqvist n. Quastel, 1965), was als Mobilisation gedeutet wurde (Kruckenberg, 1968 a). An allen 10 Endplat- ten war bei s~mtlichen Reizfrequenzen die Mobflisation yon ACh- Vesikeln unabh/~ngig yon der Curarekonzentration (Tab. 3).

I m Bereieh niedriger (Ca++)o bzw. hoher (Mg++)o (d.h. bei pr~- synaptiseher Hemmung) nehmen die Amplituden der E P P im Laufe einer Reizserie zu, wobei vorwiegend der Freisetzungspr0zel~ selbst gebahnt ist (Del Castillo u. Katz, 1954). Bei (Ca++)o zwisehen 0,8 und 2 mM/1 und (Mg++)o zwischen 2 und 3 raM/1 konnte der EinfluB yon d-TC-Konzentra- tions~nderungen im Bereieh niedrigerer Konzentrat ionen (0,1--1,2 �9 10 -6 g/ml) untersueht werden.

Bei Frequenzen unterhalb yon 10/sec blieb die mittlere EPP-Ampli tude im Verlauf einer Reizserie konstant. Bei Frequenzen yon 50/sec und 100/see war stets eine mi t der l~eizfrequenz zunehmende Bahnung der EPP-Ampli tuden erkennbar. Das Ausmal~ der Bahnung, gemessen an der EPP-Ampli tude im Plateau in Prozent des Ausgangswertes, war nnab- h~ngig yon der Curarekonzentration (6 Endp]atten, Einzelversueh in Abb. 3).

Tubocurarin und Acetyleholin 171

%

400-

300 -

200 -

�9 �9

6 X �9 It �9 �9 X �9 J �9 X X

X �9 -I

Ioo I I I I [ 10 50 100 150 200 Potentiate

Abb. 3. Verlauf der EPP-Amplituden bei pr~synaptischer Hemmung durch (Ca++)o 1,2 raM/l, (Mg++)o = 2,4 raM/l, w~hrend kurzer frequenter Reimmg bei einer

Frequenz yon 100/see. Die EPP-Amplituden sind in Prozent des ersten EPP (Mittelwert aus 8--15 Einzelreizen) fiber der Reizzahl aufgetragen. Der erste MeB- punkt ist der Mittelwert aus der 2.--4. EPP-Amplitude, der zweite der Mittelwert aus der 5 . - 10. EPP-Amplitude, die darauffolgenden Mel~punkte stellen den Mittel- wert aus jeweils 20 EPP-Amplituden dar. Die verschiedenen Symbole stehen fiir folgende Curarekonzentrationen: �9 = 6 �9 10 -v, , = 10.10 -~, • = 12 �9 10 -7

g/ml d-TC

Die Amplitude des unit potential bei verschiedenen t~eiz/requenzen

Die du tch ein A P freigesetzte ACh-Menge h~ngt sowohl yon der Zahl der ACh-Quan ten a]s aueh yon der e inem ACh-Quant en t sprechenden Zahl yon ACh-Molekfi len ab. Nach E l m q v i s t u. Qu~stel (1965) i s t bei f requenter Reizung der motor i schen Nerven die ACh-~C[enge pro Quan t unabhs yon der l%izfrequenz. W i r haben diese Befunde nachgeprf i f t : Aus der S t reuung der E P P - A m p l i t u d e n im Bereich des P la t eaus bei kurzen Reizser ien unterschiedl icher F requenz wurde die Quantenzah l und die mi t t l e re Depo la r i sa t ionsampl i tude des E inze lquan t s (unit poten- t ia l q) berechnet .

F i i r j ede K o n z e n t r a t i o n yon d-TC wurde d a n n der W e f t yon q bei einer b e s t i m m t e n Frequenz durch den Mi t t e lwer t s~mtl icher q bei den verschiedenen F requenzen d iv id ie r t und so ein re la t ives Mal~ gewonnen, m i t dessen t t i f fe die Ergebnisse hinsicht l ich eines Einflusses der l%iz-

172

Tabelle 4. AbMingigI~eit der

H. Bauer:

Amplitude des unit potential q (in relativen Einheiten)

yon der ~requenz

Frequenz i (i/sec) 0,2 1 5 10 25 30 50 100

A ~(i) -- -- 1,00 1,03 0,97 1,00 1,01 1,14

B ~(i) 0,98 1,03 0,99 -- -- -- 1,04 0,99

A Etwa blutisoionale Ersatzl6sung: (Ca++)o = 2,54 raM/l, (Mg++)o = 1,1 raM/1 (d-TC: 2--8 �9 10 -6 g/ml, 8 Endpl.).

B Beipri~synaptiseher Hemmung: (Ca++)o=0,S--2mM/1, (Mg++)o=2--3mM/]. (d-TC: 0,8--1,2- 10 -n g/ml, 3 Endpl.).

Zur Berechnung der absoluten Werte der Amplitude des unit potential q(i) bei der Frequenz i wurden aus mehreren kurzen Reizserien jeweils die Amplituden des 10.--40. EPP (bei A), bzw. des 40.--100. EPP (bei B) benutzt. Die Werte ffir q(i) lagen zwischen 4 und 21 ~V (A), bzw. zwischen 26 und 78 [zV (B). Danach wurde bei jeder d-TC-Konzentration der Mittelwertq~ aller q(i) gebildet and q(i)rea = q(i)/q~ berechnet. Die so an mehreren Endplatten jeweils ffir verschiedene d-TC-Konzentra$ionen erho~ltenen relativen Werteq(i)rel wurden nochmals ge- mittel$, der MW als q(i) bezeichnet.

frequenzen auf die Amplitude des unit potential bei verschiedenen Curare- konzentrationen und mehreren Endplatten zusammengefaBt werden konnten (Tab. 4).

Danaeh besteht eine Abh~ngigkeit des unit potential yon der Reiz- frequenz weder in normaler Krebs-L5sung (A) noch bei erniedrigter (Ca++)o und erhShter (Mg++)o (B). Die geringe ErhShuug der Amplitude bei 100/sec in normaler (Ca++)o und (Mg++)o dfirfte darauf beruhen, dab wegen der niedrigen EPP-Amplituden im Bereich des ersten Plateaus die Streuung nicht nur durch die Quantelung des Freisetzungsprozesses, sondern z.T. aueh dureh das Rauschen in der Registrieranordnung be- dingt ist.

Wenn bei Reizserien unterschiedlieher Frequenz die Amplitude des unit potential im Bereieh des Plateau konstant ist, miissen ~nderungen der EPP-Amplitude auf Jtmderungen der Zahl der freigesetzten Quanten zuriickgeffihrt werden.

Die Quantenzahl bei verschiedenen Curarelconzentrationen

In Tab. 5 sind die mittleren Quantenzahlen pro EPP bei Einzelreizen und im Bereich des Plateaus you kurzen Reizserien unterschiedlieher Frequenz fiir versehiedene Curarekonzentrationen an 6 Endplatten auf- geffihrt. Bei normaler (Ca++)o und (Mg++)o (Tab. 5A) lag die initiale ACh- Freisetzung zwisehen 260 und 412 Quanten pro EPP. Die Quantenzahl im Bereieh des Plateaus nahm mit Erh5hung der Reizfrequenz ab (Brooks u. Thies, 1962; Elmqvist et al., 1964).

Tubocurarin und Acetylcholin 173

Tabelle 5. Die Zahl der /reigesetzten Quanten pro Einzelreiz (m,) und im Plateau kur- zer Reizserien (m)

A ms m

Endpla t t en (Freq./sec) Nr.

5 10 25 30 50 100

d.TC 1 269 120 117 93 d-TC 2 319 154 145 115 d-TC 3 276 132 126 91

d-TC 1 244 113 123 110 87 51 d-TC 2 262 124 121 104 87 51 d-TC 3 248 113 102 86 65 35

3 d-TC 1 391 281 288 257 d-TC 2 412 276 275 237

4 d-TC 1 260 133 128 111 d-TC 2 262 137 126 127

B m

Endp la t t en (Freq./see) ~Nr.

0,2 1 5 50 100

5 d-TC 1 85 68 70 100 d-TC 2 85 67 53 104

d-TC 1 6,1 5,8 6,8 22,1 18,2 d-TC 2 6,2 6,5 7,0 20,4 18,2 d-TC 3 4,2 4,8 5,2 18,4 21,3 d-TC 4 5,7 6,3 7,2 23,4 19,5 d-TC 5 8,0 7,1 6,3 14,8

A Normale (Ca++)o, (Mg++)o. B Pri~synaptisohe Hemmung durch (Mg++)o 3 raM/1 und Ca++)o 2 mM/l

(Endpl. 5) bzw. 1,5 raM/1 (Endpl. 6). m~ wurde ermit te l t durch Division der mit t leren EPP-Ampli tude yon Einzelreizen dureh die mit t lere Ampli tude des un i t potential ~, m durch Division der mit t leren EPP-Ampl i tude (30 EPP) im Plateau einer Reizserie durch ~ fiir jede Cnrarekonzentration. Die Quantenzahl ~ stell t ein Mittel yon m aus mindestens 4 Reizserien dar.

Die Curarekonzentrationsverh~ltnisse betrugen: Endpl. 1 u. 2: T C I : T C 2 : T C 3 = 1: 1 , 5 : 2 ; Endpl. 3 - -5 : T C I : T C 2 : I : 2 ; Endpl . 6: TC 1 : T C 2 : TC 3: TC 4: TC 5 ~ 1 : 1,5: 2: 2,5: 3.

Konzentrat ionsbereich yon d-TC: Endpl . 1 - -4 : 2 - -8 �9 10 -6g/ml ; Endpl . 5 u. 6: 0,4--1,2 �9 10 -6 g/ml.

174 ill. Bauer:

O/o

100.

50-

x

2Xxi2 6o ilte It ~ x

@a e ~

- - - 4 - - - ~ -~- I I I I 1 I J" 5 10 100 1000 2000 Reiz Hr.

Abb. 4. Verlauf der EPP-Amplituden w/~hrend langer Reizserien in normaler Krebs- LSsung (Ca++)0. Die l~eizfrequenz betrug 25/see. Die EPP-Amplituden sind in Prozent des ersten EPP (Mittelwert aus mindes~ens 50 Kontrollwerten) fortlaufend fiber der l~eizzahl aufgetragen. Dabei wurden naeh dem 10. Reiz einmal 40, ein- real 50 und im weiteren Verlauf jeweils 100 Amplituden gemittelt. Bei den Kon- zentrationen 2,5 �9 10 -~ (• und bei 5 �9 10 -6 (.) g/ml d-TC entsprechen die MeB- punkte den Mi%elwerten yon 2 Reizserien, bei 7,5.10 -6 g/ml d-TC (,) einer

l~eizserie. Die Pausen zwisehen den Serien betrugen 30 rain

Bei erniedrigter (Ca++)o und erhShter (Mg++)o (Tab.5B) betrug die initiale Freisetzung 8 - -92 Quanten pro E P P . ]=[Shere Frequenzen bewirk- t en eine erhebliehe Bahnung (Del Castillo u. Katz , 1954; Braun et al., 1966). Daraus geht hervor, da~ J~nderungen der Curarekonzentrat ion fiber die Bereiche yon 0 , 4 - - 1 , 2 . 1 0 -6 und 2 - - 8 . 1 0 - 6 g / m l d-TC die Zahl der freigesetzten Quanten bei Einzelreizung und kurzen Reizserien n icht beeinflussen.

Aus der pro Einzelreiz freigesetzten Zahl yon ACh-Quanten und dem maximalen Wer t fiir die prozentuale Differenz zwisehen der Ampli tude des ersten und zweiten E P P (Do, vg]. Abb. 2) l~l~t sich die im Reservoir an freisetzbarem ACh enthal tene Quantenzahl ermitteln. An 4 Endp la t t en enthielt das l~eservoir 960 =~ 170 Quanten.

Lange Reizserien Bei l~nger dauernder frequenter l~eizung (2000--6000 Reize) in e twa

blutisoionaler Badflfissigkeit bleibt das sich prims ausbildende Pla teau

Tubocurarin and Acetylcholin 175

Tabelle 6. HShe des zweiten Plateaus der EPP-Amplituden bei liingerer /requenter Reizung (25~see in normaler Krebs-LSsung), angegebeu in Prozent des ersten E P P (Mittelwert aus 50--100 Einzelreizeu). Der angegebene Weft ist das Mittel aus

500 EPP-Amplituden zwischen dem 750. und 1250. Reiz

Endplatten Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8

A 1 20,5 23,5 34,1 50,3 30,4 28,3 36,4 55,0

A 2 24,1 28,2

A 3 17,7 22,4 28,8 56,5 30,1 31,6 39,6

A 4 35,0 61,8

Curarekonzentrationsverhgltnisse: A1 : A2 : A8 : A4 = 1 : 1,5:2:3 (Bereieh 2--8 �9 10 -~ g/ml d-TC).

der EPP-Ampli tuden nieht konstant, sondern es zeigt sich ein weiterer sehr langsamer Abfall, der meist in ein zweites Plateau einmilndet. Dieses zweite Plateau diirfte dutch eine Gleiehgewiehtseinstellung zwisehen der Entleerung des ACh-Speiehers und der Naehlieferung dutch Synthese zustande kommen (Elmqvist u. Quastel, 1965; Kuekenberg, 1968a).

An 8 Endplat ten wurden t~eizserien yon ca. 3000 Reizen (Frequenz 25/see) bei versehiedenen Curarekonzentrationen gegeben. Die I t6he des Plateaus der EPP-Ampli tuden beim 1000. Reiz (d.h. naeh 40 see) an versehiedenen Endplat ten lag im Mittel bei etwa 34~ des ersten E P P (Abb. 4, Tab. 6).

Die Auswertung hinsichtlieh Quantenzahl und Amplitude des unit potential ergab, da6 aueh bei langen lgeizserien die Verminderung der EPP-Ampli tuden auf eine Abnahme der Quantenzahl pro Reiz zuriiek- gef/ihrt werden mug (Abb. 5). Bei 3 Endplat ten lag die Quantenzahl beim ersten l~eiz im Mittel bei 380 :t: 103, naeh 1000 Reizen bei 175 -b 38 und naeh 3000 t~eizen bei 178 :~ 40.

Bei Experimenten mit erh6hter (Mg++)o und verminderter (Ca++)o bleibt das sieh naeh anf/~nglieher Bahnung der EPP-Ampli tuden ein- stellende Plateau aueh bei l~ngerer Reizung (25/see, 5000 geize) meist konstant. In einem Tell der Experimente nahm die Amplitude im weite- run Verlauf noeh allm~hlieh zu oder geringftigig ab, doeh stellt sich auch bier naeh mehr Ms ca. 1000 Reizen ein stabiles zweites Plateau ein.

Bei 2 Versuehen kam es naeh untersehiedlieher l~eizdauer (mehr als 2000 geize) innerhalb weniger Sekunden zu einer starken Abnahme der EPP-Amplitude, die auf eine Verminderung der Zahl der freigesetzten Quanten zurtiekzufiihren ist (Abb.6). Der Zeitpunkt des Abfalls der Quantenzahl war weder yon der Curarekonzentration noeh yon der Versuehsdauer abhgngig. In dem Experiment der Abb. 6 wnrde bei den

176 H. Bauer:

- - ~ ~ . ~ . t . ~ ~ ~ . 1 ~ ~ .. ~ _ ~ , ~ ~ ~ ~ , ~ : , ~ ........ . . . . . �9

300 -

2 0 0 -

100-

- 1,2

, 0 , 8

.0,6

- 0,.',

-0,2

II I I I I I I 1 1 I ~" 050 500 1000 2000 3000 4000 Reiz N~

Abb.5. Abh~ngigkeit der mittleren Quantenzahl ~ vonder Curarekonzentration wghrend l~ngerer frequenter Reizung (25/see), normale Krebs-L6sung. Die ersten MeBpunkte wurden durch Division der mittleren Amplitude von 50 Kontroll-EPP durch die mittlere Amplitude des unit potential q ermittelt. Die weiteren Wel~e wurden aus der Berechnung des Variationskoeffizienten yon 2 .25 Amplituden (mso), bzw. 5. I00 Amplituden (fibrige MeBpunkte) gewonnen, der mittlere Fehler

~n wurde gem~B a~ = ~ - ]/4-(c-V7 + 2 (vgl. Martin, 1966) bereehnet. Im oberen

Teil der Abbildung wird gezeigt, dab das unit potential q (angegeben in Relativ- werten) wghrend l~ngerer Reizung ann~hernd konstan~ bleibt. Die verschiedenen Symbole habenfolgende Bedeutung: • A ~ 2,5 �9 10 -6, ., = = 5 �9 10 -6 g/ml d-TC Einzelversuch); I = Mittelwert =~ a~ fiir q/q yon 11 Endplatten (31 Reizserien)

Curarekonzent ra t ionen 4, 6, 8 und 10 �9 10 -7 g/ml d-TC an einer Endp l a t t e abgeleitet. Die Pausen zwisehen den Reizserien be t rugen 30 rain. Bei den Curarekonzent ra t ionen 6 bzw. 8 �9 10 -7 g/ml t r a t der Abfall der Quanten- zahl je 1 mal vor Ende der Reizserie ein, w/~hrend das andere Mal nach 5- -6000 Reizen das P la teau noeh v6llig erhal ten war. Wei te rh in f/~llt auf, dab die Fre ise tzung w/~hrend der ersten 1000 Reize yon dem Verhal ten w~hrend der vorangegangenen Serie n icht beeinfluBt wurde (vgl. 3., 4. u n d 5. Reizserie).

3 0 -

20 -

I 0 -

Tubocurarin nnd Acetylcholin

x

I I I I �9

x

u | | i o o ,o o o

�9 A

[] [] [] El [] [] []

o []

[] [] x

[] �9

177

q

�9 f ,O

. O f f

�9 0~6

�9 O Z,

-0,2 0

11 I I [ 1 t 1 I ~" O SO 500 1000 2000 3000 ~000 5000 Reiz Nr

Abb.6. Verlauf der Quantenzahl pro Reiz w/ihrend langdauernder frequenter Reizung (20/see), bei pr/isynaptiseher Hemmung (Ca++)o = 1,5mM/l, (Mg++)o = 3 raM/1. Die Quangenzahl wurde mittels Division der EPP-Amplitude (Mittel- weft yon 40--500 Potentialen) dutch ~ berechnet. Reihenfolge der Reizserien und Bedeutung der Symbole: I. n = 8"10 -~ 2. o = 6 " 1 0 -~ 3. , = 8 " 1 0 -~ 4. ~ =10"10 -7 5. . = 6 " 1 0 -7 6. x = 4 - 1 0 -Tg/mld-TC. Beach%e die plStzliche Abnahme der Quanteuzahl bei der 3., 5. und 6. t~eizserie. Das unit potential q (ira oberen Teil der Abbildung in relativen Eiuheiten ange- geben) bleibt jedoeh in diesem Bereich (entsprechende Symbole) konstant

Die Ursache ftir die vortibergehende Bloekierung der ACh-Freisetzung kann nu t mit gleiehzeitiger Ableitung des Aktionspotentials der moto- rischen Nervenendigung gekl/irt werden. Das ziemlich p16tzliehe Ein- t re ten spricht gegen eine Ent leernng des ACh-Speichers und eher ffir einen Leitungsbloek in den terminalen Aufzweigungen des Axons. Die entspreehenden Quantenzahlen naeh J~nderung der Curarekonzentrat ion lagen im Streubereieh.

Die Abnahme der Quantenzahl yore ersten auf das zweite Pla teau verl/~uft ann/ihernd exponentiell. Mit den Annahmen, dag erstens die Freisetzung pro Reiz zwisehen dem ersten und zweiten Plateau proport ional dem jeweiligen Speieherinhalt ist und zweitens die Syntheserate proport ional der Verminderung des Vesikelinhalts im Spei-

10 �84

H. Bauer:

tg ( F - F 2 ) [g( F-F 2 )

1 - �9 t i I L

20 40 60 80 100 120

178

�9 x

00 �9

l

20 40 6 0 80 100

J,

10- �9

2 x �9 ~ A

1 , i

20 40 60

Abb.7. Bereehnuug des

t (sec) i

8'0 ' 1;0 120' "

SpeicherinhMts

10

2

t (sec) I- , , , , , , , , - r

20 40 60 BO 100

yon ACh und des Geschwindigkeits- koeffizienten fiir die ACh-Nachlieferung in den Speicher (4 Einzelversuche). Aus dem Ansatz dc dt -- - - ~ ' c + f l ' ( c 1 - c ) und F = c o n s t . . c .

(c = ,,VesikelinhMt" im Speicher, c~ = Inhalt zur Zeit des 1. Plateaus; a, fl Geschwindigkeitskoeffizienten; F = Freisetzung in Quanten/min) folgt:

F~ F 1 ln (F -- F~) = In (F x - ~ 2 ) - ( ~ + 8 ) t = ~ - (~+8);c1=-- (81, F 2 = Freisetzung in Quanten/min zum Zeitpunkt des 1. bzw. 2. Plateuas.) Aufgetragen wurde E -- ~2 (relative Einheiten) im semilogary~hmisehen l~aster fiber die Zeit. Aus der Steigung der resultierenden Geraden wurden dann a, 8, cl und schlieBlich F 1 berechnet. Die Symbole entsprechen jeweils verschiedenen

Curarekonzentrationen im Konzentrationsbereich 2--8 �9 10 -6 g/ml d-TC

cher (vgl. E lmqv i s t u. Quastel, 1965; Kruckenberg , 1968a), ergeben sich fiir den Speicherinhalt bei Reizbeginn 340000 4- 77000 Quan ten (4 End- pla t ten) , ffir den Geschwindigkeitskoeffizienten der Nachlieferung fi 1,3 4- 0,56 rain -1 (Abb. 7, Berechnung s. Legende). Aus der Abbf ldung wird deutlich, dab sowohl der Speicherinhalt wie auch der Geschwindigkeits-

Tubocurarin and Acetylcholin 179

koeffizient fl bei teilweise fiber 2 Std dauernden Versuchen und bei ver- schiedenen Curarekonzentrationen konstant bleiben.

Diskussion

Von den meisten Autoren wurde bisher die Frage eines Einflusses yon Curare auf die ACh-Freisetzung mit Modiilkationen der schon yon Dale, Feldberg u. Vogt (1936) angcwandten Methode -- biologischer Nachweis des in die Badflfissigkeit freigesetzten ACh -- untersueht. Diese Methode erlaubt zwar eine absolute Messung der pro Zeiteinheit freigesetzten ACh- Menge und kann auch ohne neuromuskul~ren Block angewandt werden; sie hat jedoch eine Reihe yon FehlermSglichkeiten. Zun~chst ist eine voll- stKndigc Hemmung der Cho]inesterasen notwendig. So wird yon Chang, Cheng u. Chen (1967) angenommen, dab in den Versuchen yon Beani, Bianchi u. Ledda (1961 a und b; 1964), die als einzige mit dieser Methode eine Hemmung der ACh-Freisetzung durch Curare gefunden haben, eine teflweise Reaktivierung der Cholinesterasen yon wesentlicher Bedeutung war. Die Hemmung der Cholinesterasen kSnnte, bcsonders im curare- freien Medium, einen direkten odor indirekten EinfluB auf die ACh- Freisetzung haben. Unter diesen Bedingungen kann ns nach ortho- dromer Reizung des motorischen 57erven hKufig ein antidromes Aktions- potential abgeleitet werden, d.h. ein Reiz kann 2 oder mehrere Aktions- potentiale in der ~qervenendigung bewirken (vgl. Riker et al., 1959 a und b; Standaert u. Riker, 1967; Katz, 1962). Weiterhin fiihrt eine ausgepr~gte postsynaptische Depolarisation, wie sie in curarefreier LSsung bei Hemmung der ACh-Hydrolyse auftritt , zu einem verstKrkten K+-Aus- strom aus den Muskelfasern. Eine erhShte extracellul~re K+-Konzentra- tion steiger~ jedoch die ACh-Freisetzung (Takeuehi, 1961).

Der wesentliehe Nachtefl dieser Methode liegt jedoch darin, dab groge Reizzahlen notwendig sind, um eine ffir den biologischen Test ausreichen- de ACh-Konzentration zu erreichen. Besonders bei Reizfrequenzen yon mehr als 10/sec kommt es jm Verlauf lgngerer Rcizserien zu Leitungs- stSrangen in den muskelnahen Nervenabschnitten (Krnjevi5 u. Miledi, 1959), die einen wesentlichen Einflug auf die in die BadlSsung freigesetzte ACh-Menge haben kSnntcn. Dabci ist zu beaehten, dag ACh sowie einige Antieholinesterasen eine Schwellenerniedrigung der motorischen Nerven- endigung bewirken, die durch Curare beeinfluBt wird (Hubbard et al., 1965).

~l~nderungen der ACh-Freisetzung im Verlauf einer Reizserie kSnnen mit der Methode yon Dale et al. nicht erfaBt werden, ein Nachteil, der besonders yon Lilleheil u. Naess hervorgehoben wurde, die nach Experi- menten mit extracellul~ren Massenableituugen die sog. Wedensky- Hemmung a]s Curareeffekt besehrieben (Lfllehefl u. Naess, 1960, 1961; Naess, 1952, 1953).

180 If. :Bauer:

Tabelle 7

R S ~ fi Pr/~parat Literatur (Quanten) (Quanten) (sec) (rain -1)

4,4--5,8 Frosch Takeuehi Sartorius (1958)

375 23000 Yfensch Thies (1965) Intercostal- muskel

ca. 1000 ca. 2--3 Mee r - Elmqvist u. schweinchen Quastel Sartorius (1965)

960 • 170 340000 1,4 • 0,2 1,3 • 0,56 Gold- dieseArbeit • 77000 hamster

Zwerchfell

Sie stfitzen sich dabei vor allem auf Ableitungen bei allm/~hlich zunehmender Curarisierung und beim Auswaschen yon Curare mit Ringer- LSsung. Gerade unter diesen Versuehsbedingungen ist die Anwendung extraeellul/~rer Massenableitungen sehr problematisch, da das Summen- endplattenpotential dutch Aktionspotentiale in einem kleinen Tell der Fasern erheblich ver/~ndert wird.

Wir haben bei/~hnliehen Auswasehexperimenten mit intraeellul/~ren Ableitungen niemals eine signifikante J~nderung der Quantenzahl pro Reiz gefunden (unverSffentlichte Beobaehtung). Die in dieser Arbeit angewandte Methode der intraeellul/~ren Ableitung yon Endplatten- potentialen erlaubt hingegen einen schnellen und genauen Naehweis des freigesetzten ACh. Sie ermSglieht vor allem die Bestimmung sowohl der pro Reiz freigesetzten Zahl der ACh-Quanten als auch der Depolarisa- tionswirkung des Einzelquants (unit potential).

W~r konnten in Ubereinstimmung mit Elmqvist u. Quastel (1965) nachweisen, dal~ die Amplitude des unit potential bei versehiedenen Reizfrequenzen und aueh bei hohen Reizzahlen konstant bleibt. Die ACh-Menge pro Quant wird nieht yon Curare beeinfluSt, da die Depolari- sationswirkung yon in sog. ,,bursts" freigesetzten Quanten dureh Curare in gleichem Ma{~e vermindert wird, +vie die durch Mikroelektro- phorese bewirkten ACh-Potentiale (Del Castillo u. Katz, 1957b).

Tab. 7 gibt eine vergleiehende Ubersieht fiber einige fiir die ACh- Freisetzung hinsiehtlieh der Quantenzahl wichtige Parameter: Die Zahlen der Quanten (Vesikel) im Reversoir (R) an freisetzbarem ACh und im Speieher S, die Zeitkonstante ~ der ACh-Nachlieferung in das Reservoir aus dem Speieher (bei Doppelreizversuehen) und den Geschwin- digkeitskoeffizienten # fiir die Naehlieferung in den Speicher.

Tubocurarin und Acetylcholin 181

Alle diese GrSl~en wurden ebenso wie die Freisetzung pro Einzelreiz und die bei frequenter Reizung auftretende Depression dutch Curare- konzentrations~nderungen im Bereich yon 2--8 �9 10 -6 g/ml nieht beein- flu]t. Aueh bei niedrigeren d-TC-Konzentrationen (0,2--1,2 �9 10 -6 g/ml) war naeh Erniedrigung der (Ca++)o und ErhShung der (Mg++)o die Frei- setzung pro Einzelreiz, wie die un t e r diesen Bedingungen auf t re tende Bahnung der Freisetzung bei frequenter Reizung, unabhangig yon der d-TC-Konzentration.

Die Anwendung noeh niedrigerer Curarekonzentrationen sowie ein Vergleieh mit curarefreien BadlSsungen wurde in dieser Arbeit nur bei Untersuchungen der Rate der N[EPP durchgefiihrt. Der hier ebenfalls negative Befund stimmt mit den Ergebnissen am Froschmuskel (Del Castillo u. Katz, 1957 a) iiberein und wird erganzt dutch Untersuehungen yon Bers u. VyskoSfl (1967), die im starken Mg++-Block keine t~nde- rung der Zahl der pro EPP freigesetzten Quanten im Bereich yon 1--6- 10 -s g/ml d-TC gegeniiber eurarefreier LSsung beobaehten konn- ten.

Ich spreehe meinen besonderen Dank Herrn Prof. Dr. O. H. Gauer Fdr die groBziigige F6rderung dieser Arbeit aus.

Mein Dank gilt auch lerl. J. lg6ring fiir die sorgfi~ltige s Assistenz, Herrn Dr. R. Sandweg und Herrn Dr. P. Kruckenberg fiir die l~ithilfe bei einigen Versuchen und fiir die kritisehe Beurteilung sowie Herrn Prof. Dr. O. J. Griisser f'ur die Rechenzeit am Line 8 (mit Hilfe der Deutschen Forschungsgemeinschaft).

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Dr. reed. H. Bauer Nfedizinische Akademie Liibeck Kinderklinik BRD-2400 Liibeck Kronsdorfer Allee 71-- 73 Deutschland

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