Arch. exper. Path. u. Pharmakol., Bd. 207, S. 655--665 (1949).

Aus der Medizinischen Klinik Kiel.

Die Sauerstoffbindung partiell oxydierten Blutfarbstofis. Von

MANFRED I(IESE und CxEORG KLINGMt~LLER.

Mit 5 Textabbildungen. (Eingegangen am 14. Mai 1949.)

Der Blutfarbstoff hSherer Tiere enthi~lt, in einer Molekel 4 H~me, ist also ein Tetra-tIamo-Globin. Durch Sauerstoff und verschiedene andere Oxydationsmittel kann das zweiwertige Eisen der Hi, me zu dreiwertigem oxydiertl also H~miglobin (Meth~moglobin) gebildet wer- den. Diese Reaktionen kSnnen je nach der Konzentrat ion und Eigen- schaft der Reaktionspartner mit verschiedenen Geschwindigkeiten und zu jedem Verh~ltnis H~imiglobin/H~moglobin ablaufen. Ffir die Kinetik der I~eaktion ergibt sich aus der Konsti tut ion des Blutfarbstoffs als Tetra-H~mo-Globin die Frage, ob nach der Oxydation eines H~ims in der Blutfarbstoffmolekel die restlichen drei eine wesent]ich grSBere Wahrscheinlichkeit haben oxydiert zu werden, so dab im Grenzfalle nach Oxydation der tt~lfte des Blutfarbstoffs die tt~ilfte der Molekeln Tetra-H~mi-Globin und die a ndere tti~ffte Tetra-H~mo-Globin w~re; oder ob alle H~me immer die gleiche Wahrscheinlichkeit haben, oxydiert zu werden, so dab in diesem ]~'alle die weitaus meisten )Solekeln Di- H~mo-Di-H~mi-Globin w~ren. Die Messung des Gleichgewichtes zwi- schen Sauerstoff und partiell oxydiertem Blutfarbstoff erwies sich als ein Weg, diese Frage zu untersuchen. Die S~ttigung des Tetra-H~mo- globins mit Sauerstoff in Abh~ngigkeit vom Sauerstoffdruck entspricht nicht einem einfachen Massengleichgewicht, sondern ist eine Funktion, die durch die bekannte S.fSrmige , ,Sauerstoffbindungskurve" des tti~mo- globins dargestellt ist.

Diese Funktion hat ADAIR 1 durch die Annahme yon 4 verschiedenen Gleichgewichtskonstanten ftir die Reaktion der 4 t I~me der t t~mo- globinmolekel mit Sauerstoff formal gedeutet und PAVLI~G ~ durch die Annahme nur einer Gleichgewichtskonstanten und einer gegenseitigen Beeinflussung einzelner Hi,me (heme-heme-interaction), wodurch die Abh~ngigkeit der ~nderung der freien Energie durch Bindung des Sauerstoffs yon der S~ttigung des Hi~moglobins verst~indlicher wird.

1 ADAIR, G. S.: Proc. Roy. Soc., Lond. A 109, 292 (1925). - - J. biol. Chem. (Am.) 63, 529 (1925). -- ~PAvLI~G, L.: Proc. nat. Acad. Sci. (Am.) 21, 186 (1935).

656 MANFR:ED KIESE und GEORG KLINGMULLER"

Diese H~m-H~m-Beeinflussung ~ui]ert sich unter anderem dadurch, dab nach Bindung einer Molekel Sauerstoff an ein H~m ffir die an- deren H~me der gleichen Molekel die Wahrscheinlichkeit zunimmt, eben- falls mit Sauerstoff zu reagieren. Wfirden bei einer partiellen Oxydation einer Blutfarbstoffl5sung die einzelnen Molekeln partiell oxydiert, so miil3te mit zunehmender Menge der Ferri-Hi~me der S-fSrmige Charakter der Sauerstoffbindungskurve der Ferro-Hi~me der H~mo- globinmolekeln immer mehr schwinden. Anderte die Oxydation des Eisens aul~erdem auch noch die ~Virksamkeit eines H~ms in der H~im- H~m-Beeinflussung, so sollte sich dadurch das Gleichgewicht zwischen Blutfarbstoff und Sauerstoff ~ndern. Beides ist tats~chlich der Fall.

Diese Anderung des Gleichgewichtes zwischen Sauerstoff und H~moglobin durch die H~miglobinbildung ist iiberdies yon Interesse fiir das Verst~ndnis der Auswirkungen einer partiellen Oxydation des Blutfarbstoffs auf den lebenden Organismus.

Eine Untersuchung yon HITZENBERGER 3 aIn Blute yon Menschen mit famili~rer H~miglobin~mie ergab bereits eine hShere Affinit~t dieses Blutes ffir Sauerstoff. Doch konnte dieser Befund noch nicht als eine Wirkung des Hiimiglobins gedeutet werden. Nach Durchfiihrung unserer Messungen wurden uns noch neuere VerSffentlichungen bekannt, in denen ebenfalls eine st~rkere Sauerstoffaffhfit~t h~miglobinhaltigen Blutes beschrieben wird (DERwIZ und MESHCHE~INA 4, GIBSON und HARRISON5), und vor allem Untersuchungen yon DARLING und ROUGH- TON e, die den Einflui~ des Hamiglobins auf die Sauerstoffbindung des H~moglobins bereits genauer gemessen haben. Wir werden unten noch auf diese Arbeiten zuriickkommen.

Methoden. Alle Messungen wurden am Blutfarbstoff yon Rindern durchgefiihrt

und zwar sowohl am Blutfarbstoff innerhalb der roten Zellen wie vor allem an Blutfarbstoffl6sungen. Die roten Zellen wurden zun~chst in der Zentrifuge mit isotoner Natriumchloridl6sung gewaschen. In einem Teil der Zellen wurde durch Zusatz yon Natriumnitrit bei 370 ein Teil des H~tmoglobins zu H~migl0bin oxydiert. War der gewiinschte Umsatz erreicht, so wurden die Zellen abermals auf der Zentrffuge 7mal gewa- schen. Durch 30 mg Natriumnitrit je 10 g Hamoglobin wurde in etwa 35 rain die H~lfte des Hamoglobins oxydiert und durch 40 mg je 10 g H~moglobin in 50--60 rain drei Viertel. Die Zellen wurden fiir die Messungen in der gleichen Menge eines Gemisches von 3 Teilen 0,9 % iger

3HITzENBERGER, K.: Wien. Arch. inn. IVied. 23, 85 (1932). -- 4 D~:RwIz, G. V., u. G. N. M~SHCH~INA: Farmakol. i. Toxikol. 9, 32 (1946). Chem. Abstr. 41, 3220 (1947). -- 5 GIBsoN, Q. H., u. D. C. HARRISON: Lancet 1947, 941. -- 6 DARLING, R. C., u. F. J. W. ROUGHTO~: Amer. J. Physiol. 137, 56 (1942).

:Die Sauerstoffbindung partiell oxydierten Blutfarbstoffs. 657

Natriumchloridl5sung und einem Teil isotoner PhosphatlSsung sus- pendiert.

Konzentrierte Blutfarbstoffl5sungen wurden hergestellt durch H~mo. lyse yon gewaschenen normalen bzw. mit Nitri t behandelten Zellen durch dreimaliges Frieren und Auftauen. Die Stromata der Zellen wurden danach durch Zentrifugieren abgetrennt und die Wasserstoffio- nenkonzentration der L6sung durch Zusatz yon Phosphat oder Phos- phors~ure auf einen gewiinschten Wert eingestellt.

Zur Messung des Gleichgewichtes yon Zellsuspensionen und LS- sungen mit Sauerstoff wurden diese in Mengen yon 15 ml in Kolben yon 500 ml Inhal t gegeben und im Wasserbad yon 370 unter Schfitteln mit durchgeleiteten Gemischen aus Sauerstoff und Stickstoff, die in gro~en Stahfflaschen vorbereitet waren und bei 37 ° mit Wasser ge- s~ttigt wurden, ins Gleichgewicht gebracht. Nach einer halben Stunde wurden Proben zur Analyse entnommen. I m einzelnen Versuch wurde jeweils ein Ansatz mit normalem Blutfarbstoff und ein anderer mit partiell oxydiertem Blutfarbstoff bei gleicher Wasserstoffionenkonzen- trat ion mit verschiedenen Sauerstoffdrucken ins Gleichgewicht gebracht. Die M essungen des EinfluBes der Wasserstoffionen auf das Gleichgewicht wurden ausschlie~lich an BlutfarbstofflSsungen, nicht g n Zellsuspen- sionen durchgefiihrt.

Die aus den Messungen errechneten S~ttigungsgrade des Blutfarb- stoffs mit Sauerstoff beziehen sich auf die allein zur Sauerstoffbindung i'ahigen Ferro-H~ime, nicht auf die gesamten Hgme (Ferro-Hgme d- Ferri-H~me).

Die Konzentration des Hgmiglobins wurde photometrisch nach der Methode yon EV~L¥~ und MALLOY ~ sowie I~AVEMAN~, JUNS und. V. ISSEKUTZ 8 bestimmt, Gesamtblutfarbstoff nach Oxydation mit Ferricyanid ebenfalls als Hgmiglobin. Die Methode wurde durch Eisenbestimmungen mit Titantrichlorid nach KLUMSP 9 standardisiert. Der Sauerstoffgehalt der Zellsuspensionen wurde manometrisch nach VAN SLYKE und NS.ILL ~) gemessen. Wasserstoffionen wurden potentio- metrisch mit der Glaselektrode bestimmt.

Ergebnisse. 1. Der Hgmiglobin-E//ekt bei konstanter Wassersto//ionenkonzentration.

Es braucht kaum erw~hnt zu werden, dab durch die partielle Oxy- dation des Blutfarbstoffs zu tt~miglobin sein maximales Sauerstoff- bindungsvermSgen um einen dem tt~miglobin entsprechenden Betrag

7 EVELYN, K. A., u. I4. T. MALLOY: J. biol. Chem. (Am.) 126, 655 (1934). -- s 14AVE~A~N, R., F. Jtr~G u. B. v. ISSlSKUTZ jr.: Biochem. Z. 801, 116 (1939). - aKLu~xPP, T. G.: J. biol. Chem. (Am.) 107, 213 (1934). - - l° PETERS, J . P . u . D.D. VAN SLYKE: Quantitative Clinical Chemistry. Baltimore 1931.

Arch. expcr . P a t h . u. P h a r m a k o l . , Bd. 207, 44

658 MANFRED ]~IESE u n d GEORG KLINGMi)LLER:

2O

vermindert wird. Aber durch diese VerKnderung des Blutfarbstoffs wird das Gleichgewicht der noch unver~nderten H~me mit Sauerstoff, H b - ~ O2 @ HbO,, ebenfalls ver/£ndert. Die Ergebnisse unserer Mes- sungen sind am kiirzesten und anschaulichsten in ,,Sauerstoffbindungs- kurven" darzustellen, die den Grad der S~ttigung des H~moglobins in Abhiingigkeit vom Sauerstoffdruck angeben. In Abb. 1 sind Messungs- ergebnisse an unver/~ndertem H~moglobin und solchem, das zu 50 bzw. 75% zu H~imiglobin oxydiert war, in LSsungen vom Plz 7,4 wieder- 1~ gegeben. Durch die partielle

C A J

f /

0 10 20 30 qO 50 6'0 Tonr 0 2

Abb. 1. Saue r s to f fb indung yon R inde rb lu t f a rb s to f f m i t v e r s c h i e d e n e n Ante i l en H~tmiglobin. K u r v e A: H ~ m i g l o b i n 2 % des Gesara tb l l l t farbs toffs ; i~:urve B : H ~ m i g l o b i n 54 % des Gesarn tb lu t fa rbs to f f s ; K u r v e C : Hfi, m ig lob in 79% des Geuamtb lu t f a rbs to f f s . Ge- s a m t b l u t f a r b s t o f f k o n z e n t r a t i o n 25g/100 m], PH 7,4,

T e m p e r a t u r 370 C.

H/£miglobinbildung wird die Sauerstoffs~ittigung des H~moglobins in den Bereich niederer Sauerstoffdrucke verschoben, und zwar um so mehr je grSBer der An- teil an H/imiglobin ist. W~hrend HalbsKttigung des unver~nderten H/~mo- globins bei 34 Torr Sauer- stoff erreicht wird, ist Blut- farbstoff der zu 50 oder 75% zu H~imiglobin oxy- diert ist, schon bei 20 Torr bzw. ] 2 Torr Sauerstoff zur H~ffte ges~ittigt. Durch das H/imiglobin wird nicht mlr die Neigung der Gleich- gewichtskurven ver/indert,

sondern auch ihre Form. Die S-Form geht mit zunehmendem H/~mi- globinanteil immer mehr verloren und bei 75% H~imiglobin hat sich die Kurve einer Hyperbel schon weitgehend gen~ihert. Die genaue Messung gerade dieses Gleichgewichtes ist schwierig wegen der geringen Sauerstoffkapazit~t auch sehr konzentrierter Blutfarbstoffl6sungen (30 g/100 ml) und der hochgradigen S~ittigung bereits bei sehr niedrigen Sauerstoffdrucken. Aber auch bei Beriicksichtigung dieser Einschr~n- kungen ist mit grSl~ter Wahrscheinlichkeit anzunehmen, da$ eine rein hyperbolische Gleichgewichtskurve nicht erreicht wird.

Messungen an Zellsuspensionen ergaben eine ganz entsprechende Wirkung des H/imiglobins und brauchen darum nicht wiedergegeben zu werden.

2. Der Ein]lufl der Wassersto]]ionen au] den H~imiglobin.E]/ekt. Wasserstoffionen beeinflussen das Gleichgewicht zwischen H~mo-

globin und Sauerstoff in dem Sinne, dal3 der zur Halbs~ttigung des

Die Sauerstoffbindung partielt oxydiert~n Blutf~rbstoffs. ({59

Hiimoglobins erforderliche Sauerstoffdruck mit der Wasserstoffionen- konzentration bis zu einen I%1 zwischen 6,5 und 6,0 zunimmt. Durch die loartielle H/imiglobinbildung wird diese Wirkung der Wasserstoff- ionen nicht aufgehoben. In Abb. 2 ist die Sauerstoffs/~ttigung yon H/~mo- globin und Blutfarbstoff, der zu 75% zu Hiimiglobin oxydiert ist, in Abh/ingigkeit vom Sauerstoffdruck bei pg 7,4 und p~ 6,2 wiedergegeben. Die Halbsi~ttigungsdrucke werden bei beiden Proteinen durch die Er- hShung der Wasserstoffionenkonzentration erhSht. Die Wirlcung der Wasserstoffionen auf beide ix Proteine ist jedoch nieht gleich stark. Mit ErhShung der Wasser-

s0 C A stoffionenkonzentration yon J / ,~/~/1.~i .~ B PH 7,4 auf p~ 6,2 nimmt der I / . Halbsiittigungsdruck des Blur- ~ s0 i , farbst°ffs mit ~5 % H~i~mJgl°bin ~l ~ f ' yon 12,5 auf 27,5 Torr, also ~ auf den 2,2fachen Wert zu, der ~v / g Halbsi~ttigungsdruck des Hi~mo- / globins yon 34 auf 57 Torr, also 20 2 / den 1,7fachen Wert. . /

Aus einer Reihe von Mes- - - " sungen der Sauerstoffs~ttigung 0 z0 ~ so 8a lao

Tort O~ bei W a s s e r s t o f f i o n e n k o n z e z l t r a - k b b . 2. Saue r s to f fb indung yon Ht tmoglob in tionen zwisehen PH 5 und 9, und Blutfarbstoff, der zu 75% H~miglobin

oxyd ie r t i s t bei PH 7,4 u n d 6,2. K u r v e A : haben wir die Halbs~ttigungs- H a m o g l o b i n PH 7,4; ICurve B: H~tmoglobin

P~I 6,2; K u r v e C: B lu t f a rbs to f f m i t 79% drucke bei den betreffenden HAmig lob in PH 7,4; K u r v e D: B lu t f a rbs to f f

W a s s e r s t o f f i o n e n k o n z e n t r a t i o n m i t 76% H a m i g l o b i n plt 6,2. G e s a m t b l u t - f a r b s t o f f k o n z e n t r a t i o n 25--29 g/100ml,

interpoliert. Messungenbeinahe T e m P e r a t u r 37,0 ° C.

zusammenliegenden Wasser- stoffionenkonzentrationen wurden zu Gruppen zusammengefal~t, z .B. p~ 5,1--5,2, 5,7--5,8 usw. Ebenso wurden die BlutfarbstofflSsungen nach ihren Hiimiglobinanteil gruppiert in solche mit weniger als 15% I-I~mi- globin, die als,,reine H~moglobinlSsungen" betrachtet wurden, solehe mit 40--60 % tI~miglobin, die in der Gruppe ,,50 % Hi~miglobin" zusammen- gefaBt wurden, und schlieBlich solche mit mehr als 60% H~miglobin, die die Gruppe ,75% H~imiglobin" ausmaehen. Die Mittel dieser Grup- pen sind in der Abb. 3 verwertet, die die Abh~Lngigkeit der Halbs~tti- gungsdrucke der drei verschiedenen BlutfarbstofflSsungen vom PK an- gibt. Fiir alle 3 Blutfarbstoffe steigt der Halbsi~ttigungsdruck mit Zunahme der Wasserstoffionenkonzentration yon PH 8,5 bis 6,5 stark an, erreicht in der :N~Lhe von p~ 6 ein Maximum und fifllt mit weiterer ErhShung der Wasserstoffionenkonzentration wieder ab. Bei Wasser- stoffionenkonzentrationen fiber PH 5,5 haben wir die Sauerstoffbindung

44*

660 MANFRED KIESE und GEORG Y~LINGMOLL;ER:

Torr O~

5~-----

~ 2o

1o

,,reiner H/~moglobinl(isungen" nicht mehr einwandfrei messen k6nnen, da in den sauren LSsungen bei den niederen Sauerstoffdrucken immer mehr als 15% des Blutfarbstoffs durch Sauerstoff zu H~imiglobin oxydiert wurden. Nach den Messungsergebnissen zwischen PH 6,5 und 5,5 ist es jedoch wahrscheinlich, dab sich die Halbs~ttigungsdrucke in ~hnlicher Weise wie die der anderen beiden BlutfarbstofflSsungen mit dem PH/~ndern. In BlutfarbstofflSsungen mit 50 bzw. 75 % H/~miglobin sinkt der Halbs/£ttigungsdruck mit Zunahme der Wasserstoffionenkon-

zentration fiber PH 5,5

\ \

a~a" s,s s,a s,s ,7o 7,5 8,o g,s s,o pM----~

Abb . 3. Abh/~ngigkei t der Halbs/i, t t i g u n g s d r u c k e ~on H ~ m o g l o b i n ( K u r v e A), B lu t f a rbs to f f m i t 50% H~imi- g lob in ( K u r v e B) u n d B lu t f a rbs to f f m i t 75% H a m i - g lobin ( K u r v e C) yon der Wasse r s t o f f i onenkonzen t r a - t ion. G e s a m t b l u t f a r b s t o f f k o n z e n t r a t i o n 24--30g/100 ml,

T e m p e r a t u r 37,0 ° C.

ffir L6sungen mit 50% H/imiglobin aber 7mal so L6sungen mit 75% H~miglobin etwa 15mal so hoch.

weiter ab. Die in Abb. 3 ge-

zeichneten Kurven ]au- fen ann/ihernd parallel. Daraus ergibt sich, dab der EinfluB der Was- serstoffionen auf die verschiedenen Formen des Blutfarbstoffs nicht gleich ist. Wenn ~dr den Halbs/ittigungsdruck als MaB fiir die Affiniti~t zwischen tt/£moglobin und Sauerstoff w/~hlen, so ist dieser ffir ,,reine H~moglobinlSsungen"

bei PH 6,1 nur 4,5real so hoch wie bei p~ 8,5,

hoch und flit

Bespreehung.

Unsere Messungen der Sauerstoffbindung von BlutfarbstofflSsungen vom p~ 7,4 stimmen gut fiberein mit den Ergebnissen yon D ~ I ~ G und ROUGHTON a an LSsungen yon Rinderblutfarbstoff mit gleichem p rt. l~ber den EinfluB der Wasserstoffionen geben die Autoren lediglich an, daB bei PH 6,8 die gleiche relative Verlagerung der Sauerstoffbindungs- kurven beobachtet wurde wie bei p• 7,4.

Auf die Frage, ob bei einer partiellen Oxydation yon Hiimoglobin ein Teil der Tetra-H/~mo-Globinmolekeln in Tetra-H/~mi-Globin-Molekeln verwandelt wird und der Rest als Tetra-H/£mo-Globin-lV[olekeln be- stehen bleibt oder je nach dem Grade der Oxydation Tri-H~mo- Hi~mi-Globin-, Di-H~mo-Di-H/~mi-Globin- bzw. Hi~mo-Tri-H~mi-Glo- bin-Molekeln gebildet werden, geben unsere Messungsergebnisse eine

Die Sauerstoffbindung partiell oxydierten Blutfarbstoffs. 661

e indeut ige A n t w o r t in dem Sinne, dab bei par t ieUer Oxyda t ion einer Hi~moglobinlSsung par t i e l l oxyd ie r t e Molekeln, also Tri-H~mo-Hi~mi- Globin usw., gebi lde t werden.

Fiir das Auftreten partiell oxydierter Blutfarbstoffmolekeln sprachen sehon die kinetischen Untersuchungen vom BRooxs n, nach denen die Oxydation des I-Ii~mo- globins zu H~miglobin dureh Sauerstoff bei konstantem Sauerstoffdruck nach der ~nderung der H~moglobinkonzentration als Reaktion erster Ordnung verli~uft. AUe freien Hame miiBten dann die gleiche Wahrscheinlichkeit haben oxydiert zu werden, und somit auch Tri-Hamo-Hami-Globin-, Di-H~mo-Di-H~mi-Globin und HSmo-Tri-H~mi-Globin-Molekeln auftreten. Allerdings erscheinen BROOKS n Annahmen nach unseren Ergebnissen nicht ganz zutreffend, denn in seine Glei-

d x , P chung fiir die Oxydationsgeschwindigkeit ~ - = K m (a - - x) ~ (K'

und b sind Konstanten, m der Antefl des freien Hamoglobins beim Sauerstoffdruck p und (a--x) der Anteil noch nicht oxydierten H/imoglobins) geht m, der Anteil des freien Hamoglobins, als eine nur vom Sauerstoffdruck sowie Temperatur und Wasserstoffionenkonzentration abh/~ngige Grille ein, w~thrend sie sich in Wirklich- keit mit Zunahme des H~miglobins erheblich andert. Der Anteil an freiem Hamoglobin wird n~mlich kleiner. Wenn trotzdem der Umsatz weiterhin dieser Gleichung folgt, so bedeutet das, da~ partiell oxydierte Molekeln eine grfBere Wahrseheinliehkeit haben ein weiteres Hlektron yon einem Eisen abzugeben.

Die ¥ e r l a g e r u n g und Vefformung der Sauers to f fb indungskurve der n ich t oxyd ie r t en H~me wird nu r verst/~ndlich durch die A n n a h m e pa r t i e l l oxyd i e r t e r Nfolekeln. Zwar is t das Gleichgewicht zwischen H~moglob in und Sauers tof f auch yon der Hi~moglobinkonzent ra t ion abh~ngig 12 und die O x y d a t i o n eines Teiles der H/~moglobinmolekel be- deu t e t eine Verdf innung der H~moglobinlSsungen, doch is t dieser Ver- df innungseffekt zu gering u m die beobach te t e W i r k u n g der par t i e l l en H~mig lob inb i ldung au f die Sauers to f fb indung zu erkli~ren. Die W i r k u n g der O x y d a t i o n einzelner H~me auf die Sauers to f fb indung ist gleich- sinnig der e iner B indung yon Sauers tof f oder K o h l e n o x y d an die be- t ref fenden H~me: Die Aff ini t / i t der noch unver/£nderten H/~me fiir Sauers tof f wi rd erhSht. Doch is t die W i r k u n g der O x y d a t i o n eines H~ms geringer als die seiner B indung an Koh lenoxyd . J . B . S . HAL- DAI~E 13 h&~5 aUS den Messungen yon DOUGLAS, HALDANE und HALDANE 14 an Menschenblut bei einem PH yon etwa 7,3--7,4 die Wirkung der Kohlenoxydbindung auf die Sauerstoffbindung der noch freien H~me des H~moglobins berechnet und gefunden, dab bei Besetzung der H~Ifte der H~me mit Kohlenoxyd der Druck fiir Halbs£ttigung der fibrigen H~me mit Sauerstoff unter die H~Ifte des Druckes absinkt, der zur Halbs~ttigung kohlenoxydfreien Blutes erforderlich ist. Demgegenfiber

nBRooKs, J . : Proc. roy. Soc., Lond. B 109, 35 (1931); 118, 560 (1935). - - J. Physiol. (Brit.) 107, 332 (1948). - - 1~ BoE~I, E., u. A. V~scxA: Arch. internat. Physiol. 55, 153 ( 1 9 4 7 ) . - laHALDANE, J. B. S.: J. Physiol. (Brit.) 45 XXI I {1912). - - la DOUGLAS, C. G., J. S. HALDANI~ U. J. B. S. H~LDAN~: J. Physiol. (Brit.) 44 275 (1912).

662 MAn'FRED KIESE u n d GEORG KLINGMLrLLER:

wird durch Oxyda t ion der H~lfte der H a m e der Druck fiir die Halb- s~ittigung der rest l ichen mi t Sauers toff nur um e twa ein Dr i t t e l ve rminde r t (Abb. 1). Mit dieser Fes t s te l lung s t immen Messungen von DARLII~G .und R o c GHTO~ ~ iiberein, durch die gezeigt wurde, dal~ in Blut farbs toff l5sungen mi t 56% Hamig lob in der Halbs~tt t igungsdruck fiir die Sauerstoffsi~tti- gung der Fe r ro -H~me etwa glcich s ta rk erniedrigt is t wie in Blut farb- stofflSsungen, in denen 32% der H~me an Koh lenoxyd gebunden sind.

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Abb. 4. E r m i t t l u n g des S igmo idexponen t en ~ler S a u e r s t o f f b i n d u n g s k u r v e yon Blu t fa rbs tof f , der zu 76% zu H h m i g l o b i n oxyd ie r t is t , aus der

Ne igung der G e r a d e n " ~ I~b I Io~ gegen log P O • to~ ]~bi I

B lu t f a rbs to f f ¥ o m Rinde bei PH 6,7 u n d 37,00 C.

Obwohl die Exis tenz par- t iell oxyd ie r t e r Blutfarbstoff- molekeln sicher anzunehmen ist, verh~l t sich Blutfarbstoff , yon dem 75% der Ferro-HK- me zu Fe r r i -H~men oxyd ie r t sind, gegeniiber Sauers tof f n ich t so wie man es yon Molekeln, die nur ein H~m haben, wie die des Muskel- h~moglobins, e rwar ten sollte. W~hrend die Sauerstoffbin- dung des Muskelh~i,moglo- bins 15 der Gleichung H b 4- O3 ~ t tbO~ folgt, is t das beim Blutfarbstoff , der zu 75% zu H~tmiglobin oxyd ie r t ist, n icht der Fal l . Vielmehr h a t die Sauers toffbindungs- kurve dieses Blut farbs toffs

noch einen S igmoidexponenten 16, der dem n in HILLS 17 Gleichung ffir das Gleichgewicht zwischen Sauers tof f und Tetra-H~imoglobin en tspr ich t

K pn y - - ~ / ~ , ~ (y = Antei l der an Sauers tof f gebundenen H~me, p =

Sauers toffdruck) , und f o l ~ einer Gleichung H b n ~- n 0 2 ----- H b n (O~) n. W a h r e n d ffir das Gleichgewicht zwischen Sauers toff und Te t ra -H~mo- Globin n ~ 2,6 betrKgt, ist n fiir das Gleichgewicht zwischen Sauers tof f und Blutfarbstoff , der zu 75% zu H~miglobin oxyd ie r t ist, nur wenig verschieden von 1, n~mlich nach Abb. 4 e twa n = 1,3. Es miissen also noch Molekeln vorhanden sein, an denen eine mi t der SauerstoffsKtt igung var iab le H~m-H~m-Beeinf lussung der Sauers tof fb indung mSglich ist, d . h . solche mi t mindes tens zwei Fer ro -H~men. Nehmen wir an, da6 die H~m-Ham-Beeinf lussungsenerg ie zweier Fe r ro -H~me fiir die Sauer- s to f fb indung durch die Anwesenhei t zweier Ferri-H~ime in der Molekel n icht verKndert ist, so di i rf te in einer Blutfarbstoff lSsung, die zu 75%

15 T~ORELL, H. : Biochem. Z. ~68, 73 (1934). - - 16 CORY~LL, C. D.: J. physic. Chem. 48, 841 (1939). - - iTHILL, A. V.: Biochem. J. (Brit.) 7, 471 (1931).

Die Sauerstoffbindung partiell oxydierten Blutfarbstoffs. 663

0xyd ie r t ist, der Ante i l der Molekeln mi t mehr als e inem Ferro-Hi~m yon der GrSi~enordnung 5% sein und e in en tsprechender Ante i l als Te t rah i imig lob in vorl iegen.

A u f eine dera r t ige Ver te i lung der Fe r ro -H ~me und F e r r i . H ~ m e weisen auch die Messungen des Oxyda t ions -Reduk t ionspo ten t i a l s des Sys tems Hi imig lob in-H~moglobin hin. Nach diesem bes teh t auch fiir Ab- gabe yon E l ek t ronen vom H~moglobin , H b II ~ ~Ib III, ~ e - eine H~m- H~m-Beeinf lussung. CORYELL 16 errechnete aus Messungen yon CobAlT und Mi ta rbe i t e rn ls-~1 und HAVE~AN~ und WOLF~ ~2 fiir das E l e k t r o . denpo ten t i a l einen mi t t l e r en Sigmoidkoeff iz ienten yon n ~ 1,6. Auch aus den Messungen von TAYLOR und HASTINGS ~a ergibt sich n ~> 1. Naeh neueren Messungen yon H A V E ~ A ~ 24 be t r~g t n ~ 1,12. Diesen W e r t e n is t der S igmoidexponent der Sauers to f fb indung yon B lu t f a rbs to f f mi t 75% Hi imiglobin ~hnlich, und es is t sehr wahrscheinl ich, dal~ er dureh die H~m-H~m-Bee inf lussung auf die E l e k t r o n e n a b g a b e des H~imo- globins bed ing t wird. D a die H~m-Hi~m-Beeinflussungsenergie eines Oxy-Fer ro -Hi ims au f die R e a k t i o n H b II -4- 0~ --> HbI I02 und eines Fe r r i -H~ms auf die R e a k t i o n H b H --> H b m ~ e- sehr versehieden ist , n~mlieh 1500 ca l /~qu iva len t fiir jene und 600 ca l /~qu iva len t fiir diese, is t die E r rechnung der Beeinf lussungsenergie eines Fe r r i -H~ms auf die R e a k t i o n H b H -~ 0 2 -~ H b Ix 0~ kompl iz ier t , und unsere D a t e n re ichen fiir genauere Angaben noch n ich t aus. Die Energie is t < 1500 cal/ '~qui- va lent , wahrscheinl ich e twa 1000 cal. W i r werden in einer spi i teren Un te r suchung diese GrSi~e noch ausft ihrl icher behandeln .

BoERI und V~scIA ~5 ziehen aus einer Un te r suchung der D a t e n von D ~ R L I ~ und ROUCHTO~ ~ den Schlu~, da~ in einer par t i e l l oxyd ie r t en Blut farbs toff ]Ssung nur T e t r a - H i ~ m o - G l o b i n - u n d Tetra-H~imi-Globin- molekeln vo rhanden w~ren. Dann miil~ten die Gle ichgewiehtskurven solcher LSsungen m i t Sauers tof f den gleichen S igmoidexponen ten haben wir die reiner Te t ra -H~mo-Globin lSsungen , n~mlich n ~ 2,6. Nach unseren Messungen betri~gt ffir LSsungen mi t 75% Hi~miglobin jedoch n ~ 1,3, und aus den K u r v e n von D A ~ L I ~ und I~OV~H~ON ~ ergeben sich W e r t e yon n ~ 1,4--1,5.

~ b e r den E inf lu~ der Wassers to f f ionen au f die Sauers to f fb indung des Blu t fa rbs tof fs sei zun~chst bemerk t , dal~ unsere Messungen a n , ,reinen t t~imoglobinlSsungen" die Ergebnisse yon R o ~ und Y~PP5 ~

18 CONANT, J.B.-- J . biol. Chem. (Am.) ~7, 401 (1923). - - ~s CONANT, J . B . , u. A. M. P A P P ~ A ~ E R : J. biol. Chem. {Am.) 98, 57 (1932). - - so CObAlT, J .B . , u. L. S. F~ES~R: J. biol. Chem. (Am.) 62, 595 (1925). - - S~Co~A~T, J. B., u. N.D. ScoTT: J. biol. Chem. (Am.) 79, 207 (1928). - - S ~ H A v ~ A ~ , R., u. K. WOL~: Biochem. Z. 298, 399 (1937). - - ~ TAYLOR, J. F., u. A. B. HASTingS: J. biol. Chem. (Am.) 131, 649 (1939). - - ~ a H A v ~ A ~ , R.: Biochem. Z. 81~, 118 (1943). - - ~ BO~RI, E., u. A. V~sc~A: Experientia ~, 155 (1947). - - ~s RosA, P., u. A. YLP~'5: Biochem. Z. 76, 187 (1916).

664 MANFRED KIESE und Ggo~G I~LINGMULLER;

und FERRY und GREEN 27 insofern best~tigen, als der Halbs~ttigungsdruck des Sauerstoffs zwischen p~ 6,0 und 6,5 ein Maximum erreicht und mit weiterer Zunahme der Wasserstoffionenkonzentration wieder ab- nimmt. Im iibrigen sind die Messungsergebnisse nicht vergleichbar, da FERRY und GREEN bei 200 gemessen haben und wh" bei 370 C. Fiir PH ~ 5,7 k5nnen wir gemessene Halbs~ttigungsdrucke nicht angeben, da in saueren LSsungen w~ihrend der Einstelhmg des Gleichgewichtes zwiscben Sauerstoff und H~moglobin zuviel H~tmiglobin gebildet wird.

~0 . . . .

l

= zo

gO ) 'err O~

Abb. 5. Differonz der Saucrstoffs~tti- gung bei pH 7,4 und pg 6,2,

(-- ~-bIIO'i i~-. 100 / Hb ÷ Hb O~ /PH7,4

- - ( HbIIo" • 1O0) Hb II ÷ HbIIo~ p~[ 6,2,

yon H~tmoglobin (Kurve A) und Blut- farbstoff, der zu 76--79 % zu H~miglobin oxydiert ist (Kurve B) in Abhangigkeit

vom Sauerstoffdruck.

Durch die Hiimiglobinbildung wer- den die Halbs~ttigungsdrucke er- niedrigt und entsprechen daher nicht mehr denen reiner H~i.moglobin- 16sungen. FERRY und G~EES 2v hatten die Bildung grSl]erer Mengen ,,inaktiven HSmoglobins" in saueren L6sungen bereits beobachtet, konn- ten jedoch dessen Einflui~ auf die Sauerstoffbindung des,,aktiven H~- moglobins" noch nicht beurteilen.

Nach unseren iessungen er- scheint der Einflul] der Wasserstoff- ionen auf die Sauerstoffbindung yon BlutfarbstofflSsungen mit 75% Hi~miglobin starker als auf die yon ,,reinen H~moglobinlSsungen". Ob die Ionisierung des Eisens des Hi~- miglobins (pK ---- 8,2) diesen Unter-

schied erkliiren kann, ist noch nicht zu entscheiden. Die Zunahme der Sauerstoffaffinit~t des H~imoglobins in LSsung mit Wasserstoffionen- konzentrationen fiber p~ 6 steht wahrscheinlieh mit der Ladung des zweiten Imidazol-Stickstoffs im Histidin in Zusammenhang. W~hrend n~mlieh die freie Energie der Wasserstoffionenbindung der ersten Imida. zolgruppe (pK ~ 7,81) durch Sauerstoffbindung an das zugeordnete Hi~m zunimmt (pK ~ 6,80) nimmt die freie Energie der zweiten Imidazolgruppe (pK = 5,25} durch Sauerstoffbindung ab (pK = 5,72} (WYMAN 2s' 29).

Einer kurzen ErSrterung bedarf noch die Bedeutung der partiellen H~miglobinbildung ffir die Atmungsfunktion des Blutes. Es ist aus der Abb. 1 leicht zu erkennen, dab durch die H~miglobinbildung auch die Atmungsfunktion der restlichen Ferro-H~me beeintr~chtigt wird. Bei niedrigen Sauerstoffdrucken zerfallt die Sauerstoffverbindung der Ferro- H~me schwieriger, wenn gleichzeitig Ferri-H~me vorhanden sind; der

e~FERRr, R.M., u. A.A. GRE~: J. biol. Chem. (Am.) 81, 175 (1929). - - ~s GERMAN, B., u. J. WYMAN: J. biol. Chem. (Am.) 117, 533 (1937). - - ~z WYMAN, J. : J . biol. Chem. (Am.) 127, 581 (1939).

Die Sauerstoffbindung partiell oxydierten Blutfarbstoffs. 665

an den Blutfarbstoff gebundene Sauerstoff ist den Geweben schwieriger verffigbar. Dadurch wird die Sauerstoffversorgung der Gewebe noch fiber die Verminderung der Sauerst~)ffkapazit~t des Blutes hinaus ver- schlechtert in ~hnlicher Weise wie es durch Besetzung eines Teiles des Hi~moglobins mit Kohlenoxyd der Fall ist. Diese Wirkung der Ferri- H~me ~drd im Atmungszyklus des Blutfarbstoffs jedoch dutch die Wasserstoffionen gehemmt. Am Blntfarbstoff mit Ferri-H~men ist n~mlich die Wirkung der Wasserstoffionen auf den S~ttigungsgrad der Ferro-tt~me mit Sauerstoff gerade bei nledrigen Sauerstoffdrucken sehr stark, wie aus Abb. 2 zu ersehen ist, und wesentlich starker als am Tetra-H~mo-Globin. ]:)as ist noch anschaulicher, wenn aus den Daten der Abb. 2 die Differenz der Sauerstoffs~ttigung zwischen p~ 6,2 und p~ 7,4 in Abh~ngigkeit vom Sauerstoffdruck ffir die beiden Blu%farb- stoffe dargestellt wird (Abb. 5). Wenn Tiere nach Oxydation yon 70% ihres Blutfarbstoffs zu H~miglobin trotz Hiimiglobineffekt auf die Sauerstoffbindung des restliehen H~moglobins stundenlang leben kSnnen, so ist das sicher zum guten Tell dem gfinstigen EinfluB der Wasserstoffionen auf den H~miglobineffekt zuzuschreiben.

Zusammen/assung. Durch partielle Oxydation des Hi~moglobins zu H~miglobin wird

die Sauerstoffbindung der noch vorhandenen Ferro-H~me in zweffacher Weise ver~ndert. Erstens wird der Sigmoidcharakter der Sauerstoff- bindnngskurve mit wachsendem Anteil der Ferri-H~me schw~cher; ffir BlutfarbstofflSsungen, in denen 75% der H~me oxydiert sind, ist der Sigmoidexponent der Sauerstoffbindung nur mehr n----1,3. Zweitens nimmt die Affinit~t zwischen den restlichen Ferro-H~men und Sauerstoff zu. Daraus wird geschlossen, daB bei der Oxydation des Blutfarbstoffs (Tetra-H~mo-Globin) partiell oxydierte Molekeln, also H~mi-Tri- H~mo-Globin, Di-ttiimi-Di-H~mo-Globin und Tri-tI~mi-H~mo-Globin, auftreten, und dab die Oxydation eines I tems im Tetra-H~m0globin auf die Sauerstoffbindung der anderen H~me eine ~hnliche Wirkung hat wie seine Bindung an Sauerstoff oder Kohlenoxyd.

Wasserstoffionen hemmen die Sauerstoffbindung des Di-H~mi-Di- H~mo-Globins und Tri-H~mi-H~mo-Globins starker als die des Tetra- H~mo-Globins. Die Wirkung der Wasserstoffionen nimmt mit ihrer Konzentration bis PE 6 zu und darfiber wieder ab.

Durch den H~miglobineffekt auf die Sauerstoffbindung des H~mo- globins wird die Atmungsfunktion des Blutfarbstoffs noch fiber denVer- lust an Sauerstoffkapazit~t hinaus beeintr~chtigt. Durch die Wirkung der Wasserstoffionen im Atmungszyklus des Blutfarbstoffs werden die physiologiseh nachteiligen Auswirkungen des Hiimiglobineffektes jedoch eingeschr~nkt.

Prof. Dr. MA~F~ED Kt~SE," Kiel, Feldstr. 12.