(Aus dem Hallerianum [Physiologisches Institut der Universitat] Bern.)

Die Wirkung yon Sehwermetallsalzen auf die Erythrocytenpermeabili6it fiir Glycerin 1.

Von W. Wilbrandt, Bern.

Mit 6 Textabbildungen.

(Einffegangen am 3. Januar 1941.)

Jacobs, Glassman und Parpart (1935) haben gefunden, dal~ die S~uge. tiere bezfiglich der Glycerinpermeabflitiit ihrer Erythrocyten in zwei scharf getrennte Gruppen zeffallen. Die eine (~r und Nagetiere) zeigt hohe, wenig temperatur~bhs Permeabflit/~t, bei der anderen (Katze, Hund, Pferd, Schwein, Rind, Schaf) ist die Permeabilit~t ge- ring und stark temperaturabhs Zwei weitere spezifische Eigen- tiimlichkeiten der ersten Gruppe sind eine starke Permeabflit~tsabnahme ffir Glycerin bei saurer Reaktion und bei Anwesenheit yon Kupfer- ionen. Diese beiden Besonderheiten bilden den Gegenstand der vor- liegenden Arbeit. Es wurde untersucht, ob und in welcher Weise zwischen den beiden Wirkungen ein Wesenszusammenhang besteht.

Methodik.

Es wurde die 1938 beschriebene photoelektrische Methode verwendet, zum Tell in Verbindung mit photographischer Registrierung. Einige der Versuche wurden mit einer einfachen Anordnnng ausgefiihrt, die eine befriedigend exakte Bestimmung der H~molysezeit' erlaubt: Durch- sieht durch die Blutsuspension auf ein in schwarzes Papier geschnittenes, aus zwei dicken und einem diinnen senkrechten Strich bestehendes Muster, das vor einer mattierten Gliihbirne angebracht ist. Bei Ver- wendung yon Reagensgls gleicher Dicke in konstantem Abstand vom Testmuster sind die Zeiten bis zum Deutlichwerden des diinnen Striches innerhalb einiger I)rozente reproduzierbar. Die Glycerin- 15sungen waren sehwach (m/150) mit Phosphat gepuffert. Es wurde bei den photoelektrisch aufgenommenen Kurven im allgemeinen 0,05 bis 0,1 ccm Blut in 4,5 ccm LSsung h~molysiert, bei direkter Beob- achtung meist 0,05 ccm in 20 ccm. Fast in allen Versuchen wurde Men- schen- oder Rattenblut verwendet, da diese beiden Blutarten die 0ben gesehflderten Eigentiimlichkeiten am ausgeprs zeigen, p~-Be- stimmungen wurden mit den einfarbigen Nitrophenolindikatoren colori- metrisch mit dem Stufenphotometer ausgefiihrt.

1 Herrn Professor W. R. Heft zum 60. Geburtstag.

638 W . W i l b r a n d t : D i e W i r k u n g y o n S c h w e r m e t a l l s a l z e n

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Schwermetall- und I)H- Wirlcung. Die Vermutung, dag die Kupfer- und die S~urewirkung eine gemein-

same Basis h~ben, wird nahegelegt durch ihre Gleiehartigkeit und ihre gemeinsame Spezifit/tt fiir Glycerin und fiir bestimmte Tierarten. Wet tere tIinweise braehten folgende, zum Teil schon 1936 kurz mitgeteflte Beobachtungen.

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Abb . l a . Abb . l b .

A b b . 1~. A b h ~ n g i g k e i t der G l y e e r i n p e r m e a b i l i t h t u n d d e r A g g l u t i n a t i o n yo re PIT" Menschen - b lu r . K ~ m o l y s e in i so ton i s eh Glyce r in , scILwach g e p u f f e r t . Die Ze iehen + ] m d - - bez i ehen

s ich a u f die A g g l u t i n a t i o n . A b b . l b . W i r k u n g y o n S u b l i m a t a u f die G lYcer inpe rmeab l l i t~ t u n d die A g g l n t i n a t i o n bei v e r s e h i e d e n e m PI-I- M e n s e h e n b l u t . t t ~ m o l y s e in i so ton i s ch Glycer in , s e h w a c h g e p u f f e r t .

Die Ze i ehen § u n d - - b e z i e h e n s ich a u f die A g g l u t i n a t i o n .

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Zun~chst lieg sieh naehweisen, dab eine Reihe anderer Sehwer- met~lle dieselbe Wirkung auf die G!yeerinpermeabilit/tt h~ben wie das Kupfer: Queeksilber, Nickel, Zink und Kobalt. Die Grenzkonzen- tration, die bei p~ 7 die Glyeerinpermeabflitgt eben herabsetzte, betrug z.B. bei Rattenblut in einer Versuchsreihe fiir CuCls m/64000, ZnSO~ m/200, tIgC12 m/96000 Ni(NO3)2m/2000 und Co (NO3) 2 (bei pg 8,5) m/700. Kaninehenblut ist fiir Mle Sehwermetalle weniger empfindlich Ms Rattenblut, fiir HgC12 ist die Grenzkonzentration etw~ 4mal h6her.

Dieselben Sehwermetalle tiben nun noeh eine ~ndere Wirkung auf die Erythroeytenmembr~n aus, die wiederum in gleicher Weise such dutch Versehiebung des' p~ ins Saute erzielt werden kann: die Zellen

auf die Erythrocytenpermeabilit~t fiir Glycerin. 639

werden agglutiniert. Diese Agglutination, die nur bei Elektrolytabwesen- heir erfolgt, geht der Permeabilit~ts~nderung weitgehcnd parallel. Die agglutinierenden Grenzkonzentrationen stufen sich fast genau gleich ab wie die oben aufgeftihrten Grenzkonzentrationen ffir die Permeabflits s HgC12 m/96000, CuCI~ m/4000, Ni(No3) 2 m/500, ZnSO 4 m/125. Auch hier ben6tigt Kaninchenblut h6here Konzentrationen (yon HgC12 2--4real mehr). Ebenso gehen Permeabilitgtsgnderung nnd Aggluti- nation bei p~t-Verschiebung parallel. Abb. 1 a zeigt dieses Verhalten. SehlieBlich sind die Wirkungen yon Sehwermetall- und pg-Versehiebung additiv: eine pE-Verschiebung bis 7,2 oder 6,8, die ohne Sehwermetall die H~molyse noeh nicht verz6gert (vgl. Abb. l a), erh6ht die Wirk- samkeit yon zugesetztem HgCl~ betr~ehtlich (Abb. 1 b). Aueh hier geht die Wirkung auf die Permeabilit/~t und die agglutinierende Wirkung genau parallel.

Diese Korrelation zwischen Agglutination und Permeabflit/~t be- ruht nicht etwa darauf, da6 das Glycerin in die Agglutinate langsamer eindringt. Auch einzeln liegende Zellen zeigen bei mikroskopischer Be- trachtung die gleiche Hgmolyseverz6gerung wie die Agglutinate. Ferner kann man mit Ricin oder Isoagglutinin zwar eine starke Agglutination ausl6sen, aber nicht die Glycerinh~molyse verz6gern und schlieglich tritt bei NaC1-Zusatz die Agglutination dureh 8ub]imat nicht mehr auf, woht aber die Permeabilits Die Parallelit~t muB also vielmehr auf eine Anderung der Zellmembran zu beziehen sein, die sich sowohl in Agglutination als auch in Permeabilit~tsgnderung /~uBert.

DaB Schwermetallsalzzusatz ebenso wirkt wie Ss ist nieht auf Hydrolyse der sauren Schwermetallsalze zuriiekzufiihren. Die Salze wurden in den mitgeteilten Versuchen in gepufferten L6sungen ver- wendet, deren PE vor dem Blutzusatz kontrolliert wurde. Trotzdem ist es wahrscheinlich, dat~ die Sehwermetallwirl~ung eine p~-Wh'kung ist. Schwermetalle bilden mit versehiedenen schwachen Ss un- dissoziierte Komplexe, was zur Folge hat, dab (bei maximaler Komplex- bildung) eine bestimmte zugesetzte )Senge Salz im Enderfolg ebenso wirken kann wie eine gleiehe Menge starker Sgure. Dazu kommt bei Sehwermetallsalzbildung an der Carboxylgruppe einer ~-Oxys/~ure, dab die Hydroxylgruppe dureh die N/~he des Sehwermetalls starken Ss charakter erh/ilt, was eine weitere S/~uerung bewirkt. Beides ist dureh sorg~51tig aufgenommene Titrationskurven yon Smythe (1931) belegt worden, bei dem sieh aueh (1930) eine Zusammenstellung der ausge- dehnten Literatur fiber organisehe Sehwermetallkonlplexe finder.

Man darf also annehmen, dab das Sehwermetall im Erythrocyten bzw. an der Erythrocytenmembran eine S~uerung ausl6st, die die quali- tative Gleiehheit der beiden Wirkungen begriindet. Eine n~here Analyse des zeitlichen Hitmolyseverlaufs zeigt jedoeh, dab in dieser Beziehung

640 W. Wilbrandt: Die Wirkung yon Schwermetallsalzen

groBe Differenzen zwischen Sublimat- und pg-Wirkung bestehen. Davon handelt der n/ichste Abschnitt.

Der zeitliche Verlau/.

Nimmt man als Ma$ der Permeabilitiit die Hiimolysezeit in iso- tonischer LSsung, so besteht die Gefahr einer falschen Deutung der Versuchsergebnisse, wenn das osmotische Gleichgewicht, dem die Hiimo- lyse zustrebt, sich w/ihrend des Versuchs verschiebt. Auf diese wichtige

A b b . 2~. I t ~ m o l y s e k u r v e n m i t v e r s c h i e d e n e r Gesehwind igke i t . t t / i m o l y s e y o n Menschen - b l u r in i so ton i s ch Glyce r in bei v e r s c h i e d e n e n T e m p e r a t u r e n . Absz isse : Ze i t (:[Vfarkierung

10 Sek.) . O r d i n a t e : P h o t o s t r o m .

A b b . 2b. H ~ m o l y s e k u r v e n m i t v e r s c h i e d e n e m Gle i chgewleh t . H ~ m o l y s e y o n ~ [enschenb lu t in i so ton i seh Glyce r in ( e ind r ingend ) m i t s t e i g e n d e n Z u s a t z e n y o n S a c c h a r o s e (n ich t ein-

d r i n g e n d ) . Die Z a h l e n b e d e u t e n die S a e c h a r o s e k o n z e n t r a t i o n e n . Absz i s se : Ze i t (1Yfarkiernng 10 Sek.) . O r d i n a t e : P h o t o s t r o m .

Unterscheidung hat M. H. Jacobs hingewiesen. Abb. 2 zeigt ein Bei- spiel. In Abb. 2a sind H/s in isotonischer GlycerinI6sung (photoelektriseh aufgenommen) bei verschiedener Temperatur wieder- gegeben. Oer EinfluB der Temperaturerh6hung besteht in einer Zu- nahme der Permeationsgesehwindigkeit, w/~hrend das osmotische Gleich- gewicht (in dem in der Abbildung gew/~hlten Temperaturbereich) von der Temperatur kaum beeinflul~t wird. Abb. 2b zeigt dagegen H~mo- lysekurven in Glyeerinl6sungen, denen steigende Anteile yon Saccharose zugesetzt sind, die nicht in die Erythrocyten eindringt. Dadurch ver- schiebt sich das schlieBlich erreichte Gleichgewicht und die Folge davon ist, da6 ein bestimmter als Test beniitzter H/imolysegrad hier ebenfalls erst naeh l/~ngerer Zeit erreicht wird als ohne Saccharosezusatz. Bei Nichtbeaehtung der Gleichgewichtsverschiebung wiirde man daraus f/ilschlicherweise eine Verminderung der Glycerinpermeabilit/it ableiten.

Die Prfifung der Frage, ob Sublimatzusatz und saure Reaktion die Geschwindigkeit des Glycerineintritts oder das osmotische Gleichgewicht beeinflui~t, Ifihrte zu einem iiberraschenden Ergebnis. Die Wirkung

auf die Erythrocytenpermeabilitg~ fiir Glycerin. 641

einer p~-Scnkung besteht deutlich in einer Herabsetzung der Geschwin- digkeit (Abb. 3a). Die Kurven bei Sublimatanwesenheit dagegen (Abb. 3b)

Abb. 3 a. I t~molyseknrven yon Mensehenblut in isotonisch Glycerin bei verschiedenem P/I" Abszisse : Zeit (l~arkierung 10 Sek.). Ordinate : Photos t rom.

Abb. 3b. t t~molysekurven yon N[enschenblut in isotonisch Glycerin mi t steigenden Zushtzen yon ttgCl~. Die Zahlen bezeichnen die tIgCl2-Konzentrationen. Abszisse: Zeit

(Markierung 10 Sek.). Ordinate: Photos t rom.

entsprechen weder einer Xnderung der Geschwindigkeit, noch des Gleich- gewichts. Die H/~molyse setzt vielmehr zuniichst lgngere Zeit gar nicht �9 dann aber ziemlich plStzlich mit etwa normMer Geschwindigkeit. D.h . die Zellen sind zun~chst praktisch undurch- 1/~ssig ffir Glycerin und werden dann in sehr raschem l:?bergang normal per- re�9 Dem entsprich~, dM3 die H/~- molysezeiten his zu einem bestimmten H/imolysegrad (Galvanometerausschlag 0 ~0) mit steigendem Quecksilberzu- satz steil ansteigen, w/ihrend die Zeiten zwischen zwei nahe benachbarten Sta- dien im sp/s Verlauf der H/imolyse (Galvanometerausschlag 35 bis 40) yon der zugesetzten Quecksflbermenge fast unabh/~ngig sind (Abb. 4).

Deutung. Zur Deutung dieser merkwiirdigen

Beobachtung wurde die Bindung des Quecksilbers an die Erythrocyten. ge-

Sek. ZSC

gO0 ~ ~

150

50

0 i t i -8,0 -5,O - ~,0 -gO

log mot ~gC~

Abb. 4. Einflug vola ltgC12 allf ver- schiedene Pbasen der ltf, molyse van Menschenblut in isotonisch Glycerin. Die Zahlen an den Kurven bedenten Galvanometeransschl~ge, d . h . die obere Kurve zeigt die Zciten bis zu einem mit t leren H~molysegrad, die untere die Zeitcn yon diesem his zu einem etwas hSheren tIamolysegrad.

nauer untersucht. DaB eine solche Bindung statffindet, wird schon aus den l~berlegungen des Vorigen Abschnittes wahrscheinlich. Sie 1/~Bt sich

642 W. Wilbrandt: Die Wirkung yon Schwermet~llsalzen

direkt n~chweisen, wenn man in einer GlycerinlSsung, in der ein Tropfen Blur normalerweise in 28 Sek. h~molysiert, nuch Zusatz yon Sublimut ftir mehrere Tropfen Blut n~cheinander die H~molysezeit be- stimmt. Die H~molyse des ersten Tropfens ist auf etwa das 5fache

#ek.

200r"1 ~ ~ '

~ ~oo V ~ss~"

W'--" ~ r -r , o 50 qgo qsg 200Sek.

Zusa/zze# Abb. 5. ~eversibili t~& der Subl imas H~ mo- lysezei ten yon iV~enschenblut in isotonisch Glyce- r in + Sub l ima t , bei Z u s a t z y o n N a C N zu versehie- denen Z e i t p u n k t e n der ~ m o l y s e . Die 2kbszisse g ib t an , w i e v i e l e S e k u n d e n - n a c h Versuchsbeg inn

das Cyani4 z uge s e t z t wurde .

gegenfiber der Kontrolle verz6gert (147 Sek.), der zweite Tropfen h~molysiert sehr viel rascher. (37 Sek.) und die Hfiznolysezeit des drittcn Tropfens ist schon fast normal (29 Sek.). Auch die Konzentrations~bhi~n- gigkeit der Sublim~t~r- kung deutet ~uf eine Bin- dung des Quecksflbers. Die verz6gernde Grenzkonzen- tration ist abhi~ngig vonder

Menge des zugesetzten Blurs, ihr sogar ~nn~hernd proportional, was bei einer Wirkung durch blol]e Anwesenheit ohne Bindung nicht m6glich ws

Sek. f06

so! ~-~.'--'*--'-"~;

Hg C1,2 zum #lu/ z~,]esprz~ i i I I [ I 0 o, gq 0,02 0~0? ~gft 0,05 0,06"

Zu~#tz ccaHgC1, z

~bb. 6. 'Wirknng' yon ~11bllm~f~ auf die H~molyseze i t y o n ~ e n s c h e n - b lu r in i sotonisch Glycer in bei Zusa~z des Sub l ima t s zur Glycerin- 16sung oder z ~ m Blur einige Mi- n u t e n v o r d e m ~ m o l y s e v e r s u c h .

Diese Bindung an den Erythrocyten ist nun reversibel, wie sich durch Zusatz yon Natriumcyanid zeigen li~Bt. Gibt man einen Tropfen Cyanidl6sung zu einer sub- limathaltigen Blutsuspension in Glycerin- 15sung, die ohne Sublimat in 15 Sek. h~molysieren wiirde, so erfolgt die H~mo-

lyse jeweils etwa 15 Sek. nach dem Zusatz des Cyanids, gleichgtiltig, in welchem Augenblick der Zusatz erfolgte (Abb. 5). Das bedeutet, dab das stark komplex- bfldende Cyanid zu jedem Zeitpunkt das Quecksflber aus der Bindung zu 15sen und damit die normale Glycerinpermeabilit~t wieder herzustellen vermag.

Diese l~eversibilit~t der Quecksilber- bindung ffihrt zusammen mit der be- kannten Tatsache, dab Quecksilbersalze verhs leicht in lebende Zellen eindringen , zu folgender Deutung des

merkwiirdigen zeitlichen Verlaufs der tti~molyse. Im Augenblick des Blutzusatzes bindet sich das Quecksilber an die Membran in reversibler Weise und 15st dort eine hochgradige Impermeabilits ftir Glycerin aus, vermutlieh durch Si~uerung im Sinne der lJberlegung des ersten Ab- schnitts. Im weiteren Verlauf dringt das Sublimat in die Zellen ein,

auf die Erythrocytenpermeabilit/~t ffir Glycerin. 643

wo es yon dem stark komplexbfldenden Hgmoglobin aufgenommen wird. Im Augenbliek, wo das Sublimat auBen erschSpft ist, verl/~Bt das letzte Quecksflber die M~mbran und geht auf das H/~moglobin f iber, wodureh es wieder zur 'normale n Glycerinpermeabfliti~t kommt.

Die Richtigkeit dieser Deutung 1/~l]t sich priifen, indem man das Sublimat dem Blut zusetzt start der Glyeerinl6sung, einige Minuten wartet, bis es in die Zellen eingedrungen ist, und dann erst den tt/~mo- lyseversuch ansetzt. Entsprechend der Erwartung bleibt dann die Ver- z6gerung aus (Abb. 6).

Auf die Beziehung dieses Wirkungsverlaufs zum Mechanismus der sog. Potentialgiftwirkung, bei der nicht die Absolutkonzentration, son- dern der Konzentrationsgradient die Wirkung bestimmt, sei hier nur kurz hingewiesen.

Zusammenfassung. Die yon Jacobs beschriebene tIemmung der Glyeerinpermeabilit~t

der Erythroeyten gewisser Tierarten durch Kupferionen wird auch durch andere Schwermetalls~lze bewirkt. Sie beruht wahrscheinlieh auf Anderung des p~ an der Zellmembran dureh Bildung undissoziierter Schwermeta]lkQmplexe. Sublimat dringt in die Zellen ein und bewirkt eine reversible Permeabflit~tss nur wi~hrend des Eindringens.

Literatur. Jacobs, M.H., H.N. Glassman and A. K. Parpart: J. cell. comp. Physiol.

7, ]97 (1935). ~ Smythe, C. V.: J. Biol. Chem. 88, 241 (1930); 92, 233 (1931). - - Wilbrandt, W.: Verh. Schweiz. Physiol. 1936 (Jan.). - - Pfliigers Arch. 24] (1938).