Doktorin der Biologie (Dr. rer. nat.) - elib.tiho-hannover.de · 2) Resistance to Phenobarbital extends to phenytoin in a rat model of temporal lobe epilepsy; Kerstin Bethmann, Claudia

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover und des Zentrums für

systemische Neurowissenschaften Hannover

Charakterisierung eines Rattenmodells für pharmakoresistente Epilepsie

These zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Biologie (Dr. rer. nat.)

im Fach Pharmakologie

durch die Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von Kerstin Bethmann

aus Hannover

Hannover 2007

Supervisor: Univ. Prof. Dr. W. Löscher

Wissenschaftliche Betreuung: Univ. Prof. Dr. W. Löscher Univ. Prof. Dr. Dr. h.c. H. Nau Prof. Dr. M. Stangel 1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. W. Löscher (Institut für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h.c. H. Nau (Institut für Lebensmitteltoxikologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)

3. Gutachter: Prof. Dr. M. Stangel (Klinik für Neurologie, Medizinische Hochschule Hannover)

4. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. H. Möhler (Institut für Pharmakologie und Toxikologie der Universität und Eidgenössischen Technischen Hochschule Zürich)

Datum der mündlichen Prüfung: 02.11.2007

Einige Daten der vorliegenden These sind in folgenden Publikationen veröffentlicht:

1) The multidrug transporter hypothesis of drug resistance: Proof-of-principle in a rat model of temporal lobe epilepsy; Claudia Brandt, Kerstin Bethmann, Alexandra Gastens, Wolfgang Löscher; Neurobiology of Disease 24 (2006), 202 – 211

2) Resistance to Phenobarbital extends to phenytoin in a rat model of temporal lobe epilepsy; Kerstin Bethmann, Claudia Brandt, Wolfgang Löscher; Epilepsia 48 (4) (2007), 816-826

gefördert durch ein Stipendium der National Institutes of Health (Bethesda, USA)

Meinen Eltern, meiner Großmutter und meinem Bruder

1 Einleitung ............................................................................................................... 1 2 Literaturübersicht.................................................................................................. 3 2.1 Epilepsien ............................................................................................................. 3

2.1.1 Temporallappenepilepsie........................................................................ 4

2.2 Epilepsiemodelle .................................................................................................. 5

2.3 Definition der Pharmakoresistenz bei Epilepsie.................................................... 8

2.4 Mögliche Ursachen der Pharmakoresistenz ....................................................... 10

2.4.1 Genetische Ursachen ........................................................................... 10

2.4.2 Veränderungen der Zielstruktur von Antiepileptika (Targetstruktur-

Hypothese) .................................................................................................... 11

2.4.3 Multidrug-Transporter………………………………………………………..12

2.4.4 Blut-Hirnschranke…………………………………………………………….20

2.4.5 Inhibitoren von Multidrug-Transportern [Tariquidar (XR 9576)]…….......21

2.5 Pharmakoresistenz im Tiermodell……………………………………………………22

2.5.1 Modellübersicht: Tiermodelle für pharmakoresistente Epilepsie……. …22

2.5.2 Elektrisches Post-Status epilepticus-Modell………………………………24

2.6 Antiepileptika………………………………………………………………………. ….25

2.6.1 Phenobarbital…………………………………………………………………26

2.6.2 Phenytoin……………………………………………………………………..26

2.7 GABAA-Rezeptoren bei Epilepsie…………………………………………………….27

3 Zusammenfassung und Zielsetzung………………………………………………...30

4 Material und Methoden…………………………………………………………….......33 4.1 Elektrische Epilepsiemodelle………………………………………………………….33

4.1.1 Versuchstiere…………………………………………………………………33

4.1.2 Elektrodenimplantation………………………………………………………33

4.1.3 Beurteilung der Krampfschwere während des sich selbst erhaltenden

Status epilepticus und während spontan wiederkehrender Anfälle…………...35

4.1.4 Modell der elektrischen Stimulation der basolateralen Amygdala……...37

4.2 Überwachung…………………………………………………………………………...38

4.2.1 Überwachung von spontanen Anfällen im elektrischen Epilepsie-

modell………………………………………………………………………………..38

4.2.1.1 Kontinuierliche Überwachung mittels EEG-Ableitung …………………38

4.2.1.2 Kontinuierliche Überwachung mittels Videoaufzeichnung…………….39

4.3 Pharmakologische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell…………40

4.3.1 Phenobarbital-Applikation für chronische Untersuchungen im Post-

Status epilepticus-Modell…………………………………………………………..42

4.3.2 Phenytoin-Applikation für chronische Untersuchungen im Post-Status

epilepticus-Modell…………………………………………………………………..42

4.3.3 Selektion von Respondern und Nonrespondern………………………….45

4.3.4 Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar (XR 9576) bei

Phenobarbital-Nonrespondern…………………………………………………….45

4.3.5 Blutentnahme…………………………………………………………………46

4.4 Histologie………………………………………………………………………………..46

4.4.1 Fixierung………………………………………………………………………46

4.4.2 Gefrierschnitte………………………………………………………………..47

4.4.3 Immunperoxidasefärbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten………...47

4.4.3.1 Antikörper…………………………………………………………………...47

4.4.3.2 Farbreaktion (DAB-ABC-Methode)……………………………………... 48

4.4.4 Standardprotokoll für die Färbung von GABAA-Rezeptoruntereinhei-

ten…………………………………………………………………………………….48

4.5 Auswertung……………………………………………………………………………..50

4.5.1 Optische Dichtemessung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten…………50

4.6 Statistik………………………………………………………………………………….51

4.7 Geräte- und Chemikalienlisten………………………………………………………..53

4.7.1 Geräte für die EEG- und Videoüberwachung……………………………..53

4.7.2 Chemikalienliste……………………………………………………………...55

5 Ergebnisse……………………………………………………………………………….57 5.1 elektrisches Post-Status epilepticus-Modell…………………………………………57

5.1.1 Status epilepticus während Dauerstimulation der basolateralen

Amygdala…………………………………………………………………………….57

5.1.2 Spontane Anfälle nach Status epilepticus…………………………………57

5.1.3 EEG-Muster der spontan wiederkehrenden Anfälle……………………...57

5.2 Pharmakologische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell…………59

5.2.1 Selektion von Respondern und Nonrespondern unter Phenobarbital….59

5.2.2 Selektion von Respondern und Nonrespondern unter Phenytoin………68

5.2.3 Gesamtergebnis Selektionsstudie………………………………………….77

5.2.4 Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar (XR 9576) bei

Phenobarbital-Nonrespondern im chronischen Post-Status epilepticus-Modell

………………………………………………………………………………………..78

5.2.5 GABAA-Rezeptoruntereinheiten……………………………………………85

6 Diskussion………………………….…………………………………………………..105 6.1 Selektion ……………………………………………………………………....105

6.2 Kombinationstherapie………………………………………………………..111

6.3 GABAA-Rezeptoruntereinheiten…………………………………………….122

7 Schlussfolgerungen und Ausblick…………………………………………………145

8 Zusammenfassung……………………………………………………………………147 9 Summary………………………………………………………………………………..150 10 Literaturverzeichnis…………………………………………………………………153

Abkürzungen ABC ATP-binding cassette proteins

BCRP Breast cancer related protein

Da Dalton

DAB 3,3´ Diaminobenzidin

DG Gyrus dentatus

DG GC Körnerzellen des Gyrus dentatus (granule cells)

EEG Elektroenzephalogramm

GABA γ-Aminobuttersäure

Hz Hertz

i.m. intramuskulär

i.p. intraperitoneal

kg Kilogramm

M Molar

μ Mikro- (gramm, - liter, -meter, etc.)

m Milli- (gramm, -meter, -liter, - ampere etc.)

MEZ Mitteleuropäische Zeit

Min. Minute

MRP Multidrug-Resistenz-assoziiertes Protein

PBS phosphatgepufferte Saline

P-gp Permeabilitäts-Glykoprotein

RNA Ribo-Nukleinsäure

S; Sek. Sekunde

SE Status epilepticus

SEM Mittelwertsfehler (standard error of the mean)

SSSE sich selbst-erhaltender Status epilepticus (self-sustained status

epilepticus)

Std. Stunde

Str. Stratum

Einleitung

1

1 Einleitung

Ein schwerwiegendes Gesundheitsproblem bei der Epilepsietherapie stellt die

Pharmakoresistenz gegenüber gängigen Antiepileptika dar, welche mit einer

erhöhten Morbidität und Mortalität einhergeht und nicht zuletzt auch mit einer

ökonomischen Belastung verbunden ist (REGESTA und TANGANELLI, 1999). Bei

der häufigsten Epilepsieform, der Temporallappenepilepsie werden zirka dreiviertel

der Patienten als pharmakoresistent angesehen (LEPPIK, 1992). Die Einführung

diverser neuer Antiepileptika hat das Problem der Therapie von refraktären oder

schwer zu behandelnden Anfällen nicht lösen können (REGESTA und TANGANELLI,

1999; LÖSCHER, 2002a): Eine chirurgische Resektion des epileptischen Gewebes

ist nur dann möglich, wenn der Fokus des Epilepsiegeschehens eindeutig

identifizierbar ist (FOLDVARY et al., 2001).

Ziel der vorliegenden Arbeit sollte es daher sein, ein bestehendes Tiermodell für

refraktäre Epilepsie, welches die Selektion von pharmakoresistenten und

pharmakosensitiven Tieren ermöglicht, dahingehend weiterzuentwickeln, dass der

klinischen Definition von Pharmakoresistenz entsprochen werden kann. Das

bedeutet, dass zwei Antiepileptika in ihrer maximal tolerierbaren Dosis über einen

angemessenen Zeitraum verabreicht werden, ohne zu einer Anfallsreduktion um

mindestens 50 % beizutragen (REGESTA und TANGANELLI, 1999). Da es sich bei

Pharmakoresistenz allem Anschein nach um einen multifaktoriellen Prozess handelt

(REGESTA und TANGANELLI, 1999; LÖSCHER und POTSCHKA, 2002; KWAN und

BRODIE, 2002), sollen zusätzlich gängige Theorien über die zugrunde liegenden

Mechanismen überprüft werden. Aus der Krebsforschung ist seit mittlerweile 30

Jahren bekannt, dass Pharmakoresistenz durch die Überexpression von Multidrug-

Transportern wie dem P-Glykoprotein vermittelt werden kann (JULIANO und LING,

1976). Inzwischen existieren Hinweise, dass eine Hochregulierung einiger dieser

Multidrug-Transporter in der Blut-Hirnschranke zu einer verminderten Konzentration

des Antiepileptikums im epileptischen Fokus führt und somit auch zur

Pharmakoresistenz beim Epilepsiegeschehen beitragen kann (LÖSCHER und

POTSCHKA, 2002). Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Studie eine

Kombinationstherapie eines etablierten Antiepileptikums mit einem hochselektiven P-

Einleitung

2

gp-Inhibitor durchgeführt, um die Hypothese zu testen, ob die Pharmakoresistenz

dadurch behoben werden kann.

Des weiteren wurde mittels einer immunhistochemischen Färbemethode und

spezifischen Antikörpern untersucht, ob bei epileptischen Ratten, speziell bei

pharmakoresistenten Tieren, die Zusammensetzung von GABAA-

Rezeptoruntereinheiten modifiziert ist. Es ist bekannt, dass chronische

Veränderungen der postsynaptischen GABAA-Rezeptorfunktion bei

Temporallappenepilepsie auftreten und deshalb als mutmaßliche epileptogene

Mechanismen in Frage kommen (BUHL et al., 1996; GIBBS et al., 1997; BROOKS-

KAYAL et al., 1998).

Literaturübersicht

3

2. Literaturübersicht

2.1 Epilepsien Epilepsie wird charakterisiert als Störung des Gehirns, welche gekennzeichnet ist

durch eine anhaltende Prädisposition für die Generation epileptischer Anfälle, sowie

durch die neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und sozialen

Konsequenzen, welche sich daraus ergeben (Definition der Internationalen Liga

gegen Epilepsie und dem Internationalen Epilepsiebüro, aus FISHER et al., 2005).

Ein epileptischer Anfall wird bedingt durch eine abnorme exzessive oder synchrone

neuronale Aktivität im Gehirn

Epilepsien gehören zu den häufigsten chronischen neurologischen Erkrankungen

des Zentralnervensystems und betreffen ungefähr 1 bis 2 % der Weltbevölkerung

(BROWNE and HOLMES, 2001). Die Prävalenz für Epilepsieerkrankungen liegt bei

schätzungsweise 1,4 bis 5,7 % der Weltbevölkerung (HAUSER, 1999). Hinter dem

Begriff Epilepsie verbirgt sich eine Vielzahl von Krankheiten und Symptomen, denen

das Auftreten von wiederholten, epileptischen Anfällen gemeinsam ist (FRÖSCHER

und VASELLA, 1994). Betroffen sind nicht nur Humanpatienten, sondern in der

Veterinärmedizin vor allem Hund und Katze (HAUSER, 1999; LÖSCHER, 1994 und

2003). Die verfügbaren Antiepileptika scheinen trotz eines frühen

Behandlungsbeginns und einer Anfallsunterdrückung keine Effekte auf die

Progression der Epilepsie oder deren Ursachen auszuüben (LÖSCHER, 1998). Die

postulierten Ursachen für Epilepsie sind mannigfaltig und beinhalten ein

Ungleichgewicht zwischen exzitatorischer und inhibitorischer Neurotransmission,

Veränderungen in der Expression und Funktion von Neurotransmitter-Rezeptoren,

die Entwicklung von „epileptischen“ Ionenkanälen, funktionale (intrinsische)

Neuronenveränderungen, die Entstehung von epileptischen Netzwerken

(Kreisläufen) in und zwischen Hirnregionen, morphologische Veränderungen wie

Hippocampalsklerose und das Aussprießen von Axonen (was zu aberranter

neuronaler Synchronisation führt) sowie genetische Ursachen (MCNAMARA, 1999;

OLSEN et al., 1999, COULTER, 2001; DALBY und MODY, 2001).

Literaturübersicht

4

2.1.1 Temporallappenepilepsie Die Temporallappenepilepsie stellt die häufigste Epilepsieform beim Menschen dar

und ist charakterisiert durch komplex-fokale Anfälle, bei denen die Patienten im

Gegensatz zum einfachen fokalen Anfall das Bewusstsein verlieren. Die Anfälle

können sekundär zu tonisch-klonischen Anfällen generalisieren (GASTAUT et al.,

1975; Hauser et al., 1993). In der Tiermedizin spielen partiale Epilepsien wie die

Temporallappenepilepsie ebenfalls eine wichtige Rolle, hier vor allem bei Hund und

Katze (LÖSCHER 1994 und 2003). Die Internationale Liga gegen Epilepsie ordnet

die Temporallappenepilepsie den symptomatischen Epilepsien zu, da sie

lokalisationsgebunden auftritt. Die komplex-fokalen Anfälle nehmen ihren Ursprung

wie der Name besagt, in Regionen des Temporallappens, vornehmlich im

Hippocampus und der Amygdala (WOLF et al., 1993). Temporallappenepilepsie ist

gekennzeichnet durch einen besonders hohen Prozentsatz an Patienten (70-80 %),

die unter Pharmakoresistenz leiden (LEPPIK, 1992). Ein häufig beobachtetes

Merkmal der Temporallappenepilepsie bei der Mehrheit der Patienten ist eine

charakteristische Schädigung des Hippocampus. Diese so genannte

Hippocampalsklerose besteht aus einem extensiven Zellverlust (typischerweise >

50%) in der CA3 und CA1 des Hippocampus und im Hilus des dentaten Gyrus

(ENGEL, 1996; FISHER et al., 1998). Neben dieser Hippocampalsklerose kommt es

auch in anderen anatomisch verbundenen, limbischen Strukturen des

Mesiotemporallappens, einschließlich der Amygdala und entorhinalen Region, zu

einer massiven Neurodegeneration (PITKÄNEN et al., 1998; YILMAZER-HANKE et

al., 2000). Es existiert eine anhaltende Debatte darüber, ob die mesiale

Temporalsklerose die Ursache oder die Konsequenz der Temporallappenepilepsie

darstellt (FISHER et al., 1998; MASUKAWA et al., 1999). Es ist jedoch zu beachten,

dass Temporallappenepilepsie sich auch in der Abwesenheit jeglicher hippocampaler

Schädigung entwickeln kann, und die Hippocampalsklerose für die Konsolidierung

dieses Epilepsietyps nicht unbedingt Voraussetzung ist (MARGERISON und

CORSELLIS, 1966; BLÜMCKE et al., 1999; BRANDT et al., 2004).

Temporallappenepilepsie wird allgemein als progressiver Epilepsietyp angesehen,

bei dem die Anfallsfrequenz steigt und die kognitiven Fähigkeiten nachlassen. Die

Literaturübersicht

5

Faktoren, welche zu diesen fortschreitenden Merkmalen führen sind nur

unzureichend bekannt (ENGEL, 1996; COLE, 2000; PITKÄNEN und SUTULA,

2002). Einhergehend mit den klinischen Charakteristika der Progression, wurden

fortschreitende Eigenschaften auch in Tiermodellen der Temporallappenepilepsie

gefunden, bei denen sich Anfälle nach einem Status epilepticus (SE) entwickeln

(GORTER et al., 2001). Einige dieser Modelle sollen im folgenden vorgestellt

werden.

2.2 Epilepsiemodelle Ein ideales Tiermodell für Epilepsie sollte die folgenden Bedingungen erfüllen: 1) es

sollten sich spontan wiederkehrende Anfälle entwickeln; 2) der Anfallstyp sollte der

klinischen Phänomenologie der Anfallstypen beim Humanpatienten entsprechen; 3)

paroxysmale EEG-Veränderungen sollten den EEG-Veränderungen der jeweiligen

Anfallstypen beim Menschen ähneln; 4) es sollte eine hohe Anfallsfrequenz

vorliegen, um eine akurate und chronische Bewertung der Effizienz von

Medikamenten zu gewährleisten; 5) die Pharmakokinetik (besonders die

Eliminationsrate) von Antiepileptika sollte die Aufrechterhaltung von effektiven

Plasmaspiegeln während chronischer Behandlung erlauben; 6) die effektiven

Plasma- und Gehirnkonzentrationen von Antiepileptika sollten denen entsprechen,

die auch für die Kontrolle relevanter Anfallstypen bei epileptischen Humanpatienten

gelten. Bis jetzt existiert noch kein Modell, welches alle Bedingungen erfüllt

(LÖSCHER und SCHMIDT, 1988; LÖSCHER, 1999).

Rattenmodelle für Temporallappenepilepsie, bei welchen sich spontan

wiederkehrende Anfälle nach einem chemisch oder elektrisch induziertem SE

entwickeln, sind weit verbreitet, um die zugrunde liegende Pathophysiologie der

Entwicklung von partialer Epilepsie zu studieren (COULTER et al., 2002; DUDEK et

al., 2002; LEITE et al., 2002). Das Modell der elektrischen Stimulation der

basolateralen Amygdala entwickelte sich aus dem Kindling-Modell (to kindle =

entflammen), welches erstmalig von Goddard beschrieben wurde (GODDARD et al.,

1969). Das Kindling-Modell wurde mit der Intention entwickelt, Lernverhalten durch

subkonvulsive elektrische Stimulation zu beeinflussen. Dabei stellte sich heraus,

Literaturübersicht

6

dass sich durch die wiederholte subkonvulsive elektrische Stimulation anhand einer

unilateralen Reiz- und Ableitelektrode in der Region des limbischen Systems

epileptische Anfälle entwickeln, die bei wiederholter Stimulation an Dauer und

Schweregrad zunehmen. Kindling umfasst zum einen den fortschreitenden Prozess

der Epileptogenese und zum anderen den permanenten Zustand einer erhöhten

Anfallsbereitschaft. Die Sensitivität des Gehirns gegenüber dem Stimulus steigt

kontinuierlich bis zu einem Punkt, an dem der Sensitivitätsgrad dauerhaft geworden

ist. An diesem Punkt spricht man von „vollgekindelten“ Tieren (MCNAMARA, 1984).

Die permanenten Gehirnveränderungen, welche beim Kindling zu beobachten sind,

lassen sich mit den pathophysiologischen und neurochemischen Modifikationen in

Resektionsgewebe von Humanpatienten mit komplex-fokaler Epilepsie vergleichen

(LÖSCHER et al., 1993; HEINEMANN et al., 1994). Der Nachteil des Kindlingmodells

besteht darin, dass die Anfälle nicht spontan auftreten, sondern induziert werden.

Beim Menschen treten epileptische Anfälle oft nach einer Latenzzeit in Folge

schwerwiegender Verletzungen wie einem Schädel-Hirn-Trauma zutage, weshalb es

optimal wäre, mit einem Tiermodell diese Situation simulieren zu können. Ein Modell,

welches die Temporallappenepilepsie beim Menschen imitiert und zu spontan

wiederkehrenden Anfällen führt, basiert auf der elektrischen Dauerstimulation der

Amygdala (MCINTYRE et al., 1982; HANDFORTH und ACKERMANN; 1988;

NISSINEN et al., 2000; BRANDT et al., 2003). Die Entwicklung des Modells nahm

ihren Ausgang in einer 60 minütigen Stimulation der basolateralen Amygdala bei

einer Frequenz von 60 Hz und einer Stromstärke von 50 μA (MCINTYRE et al.,

1982). Dadurch konnte bei gekindelten Ratten ein sich selbst erhaltender fokaler SE

(SSSE) induziert werden, der über die Stimulation hinaus andauerte. Es konnte

beobachtet werden, dass die fokalen Anfälle zum Teil sekundär generalisierten,

nachdem die Stimulation beendet wurde, jedoch hauptsächlich fokaler Natur waren.

Die Entwicklung von spontanen Anfällen wurde hierbei nicht berücksichtigt.

Ein SE wird definiert als kontinuierliche konvulsive motorische Aktivität oder

wiederholt auftretende Anfälle über einen Zeitraum von mindestens 30 Min., da eine

SE-Dauer von 30 Min. vermutlich den Übergangspunkt markiert, ab dem ein

anfallsinduzierter neuronaler Schaden entsteht, wofür der klinische Nachweis jedoch

Literaturübersicht

7

noch aussteht (LOWENSTEIN, 1999; FOUNTAIN; 2000). Die Mortalitätsrate beim SE

liegt für Erwachsene bei 15-20 % und bewegt sich bei Kindern zwischen 3 und 15 %

(FOUNTAIN, 2000).

Sechs Jahre nach dem von McIntyre beschriebenen Modell wurde erstmals die

Einteilung des SSSE in verschiedene Typen, wie im Methodenteil beschrieben,

dokumentiert (HANDFORTH und ACKERMANN, 1988). Bei diesem Versuch wurden

die Tiere ebenfalls für 60 Min. mit 60 Hz stimuliert, jedoch lag die Stromstärke bei

400 μA. Auch hier wurde das Auftreten von spontanen Anfällen nicht untersucht.

Zwölf Jahre darauf wurde ein Modell generiert, bei welchem der Zeitparameter der

Stimulation auf 20-30 Min. erhöht wurde (60 Hz, 400 μA) (NISSINEN et al., 2000).

Mittels der Stimulation der lateralen Amygdala entwickelten die Ratten einen SE, der

bis zu 20 Std. anhielt. Nach einigen Wochen konnten spontan wiederkehrende

Anfälle detektiert werden. Auf pathophysiologischer Ebene exprimierten die Ratten

eine Neurodegeneration im Hippocampus, in der Amygdala und im perikortikalen

Gewebe sowie ein Auswachsen von so genannten Moosfasern (Axone der

Körnerzellen) im Gyrus dentatus. Die Weiterentwicklung des Modells bestand

wiederum in einer Erhöhung der Stromstärke (700 μA) bei einer Stimulationsdauer

von 25 Min. und der Wahl der basolateralen Amygdala als Stimulationsort (BRANDT

et al., 2003). Der Typ des SSSE (fokal; fokal mit vereinzelten generalisierten

Anfällen; generalisiert) war dabei abhängig vom Rattenstamm, der

Elektrodenlokalisation sowie dem Geschlecht der Tiere. Weibliche Sprague-Dawley

Ratten zeigten dabei im Vergleich mit männlichen Sprague-Dawleys sowie

männlichen und weiblichen Wistar-Ratten am häufigsten einen rein generalisierten

SE und in Abhängigkeit davon, die meisten spontan wiederkehrenden epileptischen

Anfälle. Im Gegensatz zu männlichen Wistar-Ratten (56 % generalisierter SSSE) war

bei weiblichen Sprague-Dawleys die Mortalität während des SSSE deutlich geringer.

Bei einem rein generalisierten SE (Typ 3) und einem generalisierten SE mit einigen

fokalen Anfällen (Typ 2) entwickeln sich zu 90 % spontane Anfälle, bei einem rein

fokalen SE (Typ 1) sind es lediglich 33 %. Die optimale Dauer eines SE, um das

Auftreten von spontanen Anfällen zu gewährleisten, beträgt dabei vier Stunden

(BRANDT et al., 2003).

Literaturübersicht

8

Es soll der Vollständigkeit halber noch erwähnt werden, dass die Induktion eines SE

mit nachfolgenden spontanen Anfällen auch durch chemische Krampfgifte induziert

werden kann. Ein häufig verwendetes Modell für Temporallappenepilepsie ist dabei

die Induktion eines SE mit dem exzitotoxischen Glutamatanalogon Kainat. Die

Kainat-induzierten Anfälle führen zu einem großflächigen Gehirnschaden, welcher

bei anderen Modellen in dieser Form nicht anzutreffen ist (SPERK, 1994).

Anfälle, welche durch den cholinergen (muskarinergen) Agonisten Pilocarpin

ausgelöst werden, sind als experimentelles Modell für refraktäre Epilepsie mit

Anfällen, welche komplex-fokalen (limbischen) Anfällen ähneln, die sekundär

generalisieren können, etabliert (TURSKI et al., 1989).

Elektrische SE-Modelle bieten jedoch diverse Vorteile gegenüber den

Chemokonvulsiva. So gibt es bei den toxischen Chemikalien oft Komplikationen bei

der Interpretation (GOODMAN, 1998), welche bei den elektrischen Modellen nicht

auftreten. Außerdem können mittels elektrischer Stimulation mehrere SE-Stadien

ausgelöst werden (HANDFORTH und ACKERMANN, 1992; MCINTYRE et al., 1991;

MOHAPEL et al., 1996; WHITE und PRICE, 1993; BRANDT et al., 2003). Auch ist

die Mortalität bei chemischen Modellen deutlich höher (GOODMAN, 1998). Des

weiteren zeigen Ratten mit einem chemisch induziertem SE oft ein sehr aggressives

Verhalten und extreme Hypersensitivität beim Handling, was beim elektrischen SE

nicht derart ausgeprägt vorkommt (BRANDT et al., 2003).

2.3 Definition der Pharmakoresistenz bei Epilepsie Die genaue Definition der Pharmakoresistenz in der Humanmedizin ist umstritten,

jedoch wird ein Patient im Allgemeinen als refraktär angesehen, wenn zwei

nacheinander applizierte Antiepileptika in ihrer maximal tolerierbaren Dosis über

einen adäquaten Zeitraum zu keiner Anfallsfreiheit oder zumindest zu keiner

Anfallsreduktion um mindestens 50 % führen (REGESTA und TANGANELLI, 1999;

KWAN und BRODIE, 2002). Nimmt man diese Definition als Grundlage, können etwa

30 % der Epilepsiepatienten als pharmakoresistent eingestuft werden (REGESTA

und TANGANELLI, 1999; KWAN und BRODIE, 2000). In Bezug auf den adäquaten

Zeitraum der Behandlung bestehen unterschiedliche Ansichten. LEPPIK (1992)

Literaturübersicht

9

postuliert, dass von refraktärer Epilepsie gesprochen werden kann, wenn Anfälle

innerhalb eines Jahres unter Behandlung mit Antiepileptika nicht kontrolliert werden

können. Es existieren einige Faktoren, welche als Prognose für eine

Resistenzentwicklung fungieren können (REGESTA und TANGANELLI, 1999): Ein

früher Beginn der Anfälle im ersten Lebensjahr (ANNEGERS et al., 1979;

SOFIJANOV, 1982), ein langer Zeitraum mit Anfällen vor der Behandlung, eine hohe

Anfallsfrequenz vor Behandlungsbeginn, Fieberanfälle, der Anfallstyp (komplex-

fokal), die Persistenz der Anfälle unter Behandlung, das Epilepsiesyndrom,

Abnormalitäten im EEG und in Bezug auf den neurologischen Status sowie die

Familiengeschichte im Hinblick auf Epilepsie. Aller Wahrscheinlichkeit nach handelt

es sich bei dem Phänomen der Pharmakoresistenz um einen multifaktoriellen

Prozess (REGESTA und TANGANELLI, 1999; LÖSCHER und POTSCHKA, 2002;

KWAN und BRODIE, 2002). Die Konsequenzen von Pharmakoresistenz können sehr

schwerwiegend sein. So liegt die Mortalitätsrate bei refraktären Patienten vier bis

siebenmal höher als bei sensitiven Patienten (SPERLING, 2004). SISODIYA (2005)

postuliert, dass auch Patienten als refraktär eingestuft werden, deren Epilepsie

schlicht und einfach aus dem Grund als pharmakoresistent eingestuft wird, weil noch

keine adäquaten Antiepileptika für die Behandlung dieser Epilepsie bereitstehen.

HAUSER (1992) meint, dass auf gewisse Weise jede Art von Epilepsie refraktär ist,

da es keinen Hinweis darauf gibt, dass die Wirkweise von Antiepileptika nicht

lediglich palliativer Natur ist (Anfallsprävention) und keinen Einfluss auf die zugrunde

liegenden pathologischen Zustände nimmt. SCHACHTER (1993) beschreibt, dass

ein Patient mit refraktärer Epilepsie sich dadurch definiert, dass er aufgrund von

Anfällen, Nebenwirkungen von Antiepileptika und/oder psychosozialen Problemen

nicht in der Lage ist, einen Lebensstil zu führen, der seinen Fähigkeiten entspricht.

Literaturübersicht

10

2.4 Mögliche Ursachen der Pharmakoresistenz 2.4.1 Genetische Ursachen Drei generelle Kategorien von Mechanismen könnten für eine intrinsische oder

erworbene Pharmakoresistenz bei verschiedenen Hirnerkrankungen verantwortlich

sein (LÖSCHER und POTSCHKA 2005a):

1) genomische Variabilität: beispielsweise Polymorphismen die zu Veränderungen

im Metabolismus des Medikaments führen oder Zielstrukturen des Arzneimittels

sowie deren Transporter modifizieren. Diese Gendiversität könnte erklären, warum

zwei Patienten mit dem gleichen Krankheitsbild hinsichtlich ihrer initialen

Ansprechbarkeit auf ein Medikament differieren.

2) Krankheitsbezogene Mechanismen: Diese beinhalten die Ätiologie einer

Krankheit, die Progression der Krankheit unter Behandlung, strukturelle

Gehirnveränderungen und/oder Netzwerkmodifikationen, Modifikationen in den oder

der Zielstruktur(en) des Medikaments sowie Unterschiede in Bezug auf die

Arzneistoffaufnahme ins Gehirn.

3) Arzneimittelbezogene Mechanismen: Beispielsweise der Verlust der

therapeutischen Effizienz (funktionelle Toleranz), der Induktion von

metabolisierenden Enzymen (metabolische Toleranz) oder von Drug-Transportern

sowie ineffektive Wirkmechanismen des Arzneistoffes.

Zu Punkt 1) ist anzumerken, dass ein C3435T Polymorphismus in Exon 26 des MDR

1-Gens (ABCB1) mit einer erhöhten Expression und Funktionalität des Multidrug-

Transporters P-gp (Permeabilitäts-Glykoprotein) einhergeht (siehe auch 2.4.3) und

für Pharmakoresistenz bei Epilepsie mitverantwortlich gemacht wird (SIDDIQUI et al.,

2003; SORANZO et al., 2004; ZIMPRICH et al., 2004). Jedoch existieren auch

Studien, welche den Beitrag des C3435T Polymorphismus an der

Pharmakoresistenz nicht bestätigen konnten (TAN et al., 2004; SILLS et al., 2005).

Ebenso zeigte sich in einer Studie mit Phenytoin-sensitiven und pharmakoresistenten

Wistar-Ratten kein Unterschied der mdr1a kodierenden Sequenz (BAARS et al.,

2006). Es sind bis jetzt mehr als 50 Einzel-Nukleotid Polymorphismen (SNPs) im

humanen MDR1 Gen, welches für P-gp kodiert, identifiziert worden (ISHIKAWA et

Literaturübersicht

11

al., 2004). Somit herrscht noch Ungewissheit über die Beteiligung von genetischen

Modifikationen bei refraktärer Epilepsie und es besteht Klärungsbedarf für den

Beitrag der einzelnen Polymorphismen am Gesamtgeschehen der

Pharmakoresistenz.

2.4.2 Veränderungen der Zielstruktur von Antiepileptika (Targetstruktur-Hypothese) Antiepileptika der ersten Wahl für die Behandlung von Temporallappenepilepsie, wie

Phenytoin oder Carbamazepin wirken aller Wahrscheinlichkeit nach durch die

Modulation von spannungsabhängigen Natrium- und Kalziumkanälen (DELORENZO,

1995; MACDONALD, 1999). Es wurde gezeigt, dass sich die Eigenschaften dieser

Kanäle im Hippocampus von Patienten mit refraktärer Temporallappenepilepsie

verändern (BECK et al., 1997; BECK et al., 1998; RECKZIEGEL et al., 1998), was

den Verlust der therapeutischen Effizienz einiger wichtiger Antiepileptika erklären

könnte. In der Tat konnte belegt werden, dass bei Patienten mit pharmakoresistenter

Temporallappenepilepsie und Hippocampalsklerose die Modulation der Inaktivierung

von Natriumströmen durch das Antiepileptikum Carbamazepin in hippocampalen

Neuronen gestört ist (VREUGDENHIL et al., 1998). Auch REMY et al. (2003)

berichten, dass die Fähigkeit von Carbamazepin, die Natriumkanäle

spannungsabhängig zu blockieren, in hippocampalen Neuronen von Carbamazepin-

resistenten Epilepsiepatienten vollständig verloren geht. Ein ähnlicher Wirkverlust

von Carbamazepin wurde im Pilocarpin-Modell von Ratten detektiert (REMY et al.,

2003). Allerdings konnten JEUB et al. (2002) bei gekindelten Ratten keine

Unterschiede in der Sensitivität für Phenytoin bei Natrium- und Kalziumkanälen

zwischen Phenytoin-Respondern und Phenytoin-Nonrespondern feststellen, was

gegen eine Rolle beim Pharmakoresistenzgeschehen spricht.

Ein wichtiges Charakteristikum von pharmakoresistenter Epilepsie besteht wie

beschrieben darin, dass die Mehrzahl der Patienten mit refraktärer Epilepsie auf die

meisten, wenn nicht sogar alle Antiepileptika unzureichend ansprechen (REGESTA

und TANGANELLI, 1999). Als Konsequenz haben Patienten, welche während einer

Monotherapie mit einem ersten AED nicht hinreichend therapiert werden können, nur

Literaturübersicht

12

eine Chance von 10 % oder weniger, auf andere Antiepileptika anzusprechen auch

wenn diese andere Wirkmechanismen aufweisen. Laut der Targetstruktur-Hypothese

sollten Patienten, welche aufgrund einer Veränderung der Zielstruktur

(Natriumkanäle) nicht mehr auf Phenytoin ansprechen, mit einem GABA-

modifizierenden Antiepileptikum wie Phenobarbital erfolgreich therapiert werden

können, was jedoch meistens nicht der Fall ist. Diese Tatsache spricht gegen

Epilepsie-induzierte Veränderungen in speziellen Zielstrukturen der Antiepileptika als

Hauptursache für pharmakoresistente Epilepsie. Vielmehr scheinen unspezifische

und möglicherweise adaptive Mechansimen, wie eine verminderte Aufnahme von

Antiepileptika ins Gehirn durch eine anfallsinduzierte Überexpression von Multidrug-

Transportern in der Blut-Hirnschranke eine Rolle zu spielen (LÖSCHER und

POTSCHKA, 2002), wie im folgenden erläutert.

2.4.3 Multidrug-Transporter Die Effektivität der Therapie vieler Krankheiten, darunter Krebs, infektiöse

Erkrankungen, rheumatoide Arthritis und Hirnleiden wie Epilepsie, Depression,

Schizophrenie, sowie HIV-assoziierter neurologischer Dysfunktion, wird begrenzt

durch eine schlechte Ansprechbarkeit oder hartnäckige Resistenz gegenüber der

Behandlung (BALDINI, 1997; HELLEWELL, 1999; BART et al., 2000;

GOTTESMANN et al., 2002; GREDEN, 2002; LÖSCHER, 2002a; TAYLOR, 2002;

LAGE, 2003). So wurde beispielsweise bei einem Patienten mit refraktärer Epilepsie

trotz einer kontinuierlichen und verstärkten Gabe von Antiepileptika über

persistierende subtherapeutische Plasmakonzentrationen von Antiepileptika

(einschließlich Phenobarbital und Phenytoin) berichtet (LAZAROWSKI et al., 1999).

In diesem Zusammenhang ist es von speziellem Interesse, dass neben anderen

Geweben, wie dem Darm, in den Endothelzellen der Blut-Hirnschranke so genannte

Multidrug-Transporter vorkommen, die einen aktiven auswärts gerichteten Efflux-

Mechanismus ausüben, welcher als aktiver Verteidigungsmechanismus angesehen

werden kann, der die Akkumulation vieler lipophiler Substanzen im Gehirn begrenzt

(FROMM, 2000; SPECTOR, 2000; ABBOTT et al., 2002). Allen Zellen ist der Besitz

dieser Efflux-Transporter gemeinsam, welche sie vor endogenen oder exogenen

Literaturübersicht

13

toxischen Substanzen schützen (SCHINKEL und JONKER, 2003). Die Mehrheit

dieser Transporter gehört zur ABC-Superfamilie (ATP-binding cassette proteins),

welche die zelluläre Ausschleusung vieler therapeutischer Substanzen mit den

unterschiedlichsten Strukturen und klinischen Anwendungsgebieten vermittelt.

Neben dem Permeabilitäts-Glykoprotein (P-gp) sind auch die Familie der Multidrug-

assoziierten Resistenzproteine (MRPs) und das Brustkrebs-assoziierte

Resistenzprotein (BCRP) an der Regulation der Aufnahme und Ausschleusung von

Arzneimitteln und anderen Substanzen involviert (LÖSCHER und POTSCHKA,

2005b). Die MRPs, welche zur ABCC-Familie gehören, umfassen 12 Mitglieder und

wirken als Transporter von organischen konjugierten Anionen, aber auch von

neutralen organischen Substanzen, wohingegen P-gp hauptsächlich unkonjugierte,

kationische Substanzen transportiert (BORST et al., 2000; KRUH et al., 2001;

HAIMEUR et al., 2004). Da es im Rahmen dieser Arbeit zu weit führen würde, alle

MRPs zu charakterisieren, soll hier nur kurz auf MRP2 eingegangen werden,

welches mutmaßlich am Epilepsiegeschehen beteiligt ist. Durch den Vergleich der

Gehirngängigkeit des Antiepileptikums Phenytoin in MRP2-defizienten TR- - und

normalen Wistar-Ratten konnte mittels Mikrodialyse gezeigt werden, dass MRP2

substantiell an der Funktion der Blut-Hirnschranke in vivo beteiligt ist (POTSCHKA et

al., 2003). HOFFMANN et al. (2006) konnten nach einem Pilocarpin-induziertem

konvulsiven SE eine deutliche MRP2-Färbung in Endothelzellen von Gehirnkapillaren

und in geringerem Maße, in perivaskulären Astrogliazellen und Neuronen in diversen

Hirnregionen nachweisen. Die Relevanz anderer Multidrug-Transporter für die

Pharmakoresistenz ist beim Menschen jedoch nicht so gut charakterisiert wie bei P-

gp (FROMM, 2004). Des weiteren existieren für die MRP-Subfamilie keine selektiven

Inhibitoren, wie sie für P-gp verfügbar sind (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005c).

Außerdem ist der immunhistochemische Nachweis von beispielsweise MRP2 sensitiv

gegenüber der Fixierung und der Färbeparameter (VOLK et al., 2005). Obgleich die

diversen Transporter eine beachtliche Überlappung bezüglich ihrer Substratspezifität

zeigen (LÖSCHER und POTSCHKA 2005b), soll hier nur auf P-gp eingegangen

werden.

Literaturübersicht

14

P-gp wurde erstmals in den 1970ern als Prototyp eines Transporters bei multipler

Resistenz von Krebszellen beschrieben (JULIANO und LING, 1976). TISHLER et al.

(1995) waren dann die ersten, die zeigen konnten, dass das P-gp codierende Gen

MDR1 bei der Mehrzahl der Humanpatienten mit pharmakoresistenter Epilepsie im

Gehirn markant erhöht ist. ABC-Transporter wie P-gp sind integrale

Membranproteine mit mehreren Domänen, welche die Energie der ATP-Hydrolyse

dazu nutzen, Substanzen zwischen zellulären Membranen zu translozieren (JONES

und GEORGE, 2004). P-gp gehört dabei zu den atypischen ATP-abhängigen

Transportern, da die basale ATPase-Aktivität sehr hoch ist und nicht auf die Bindung

und den Transport von Substraten angewiesen zu sein scheint (SHAROM, 1997).

Zwei C-Terminale hydrophile Nukleotid-bindende Domänen binden und hydrolysieren

ATP und zwei N-Terminale hydrophobe Transmembran-Domänen, welche aus

multiplen (üblicherweise sechs) membran-durchspannenden α-Helices bestehen,

formen den Kanal, durch welchen die Substrate die Membran passieren (ISHIKAWA

et al., 2004; HIGGINS, 2007).

Es wird vermutet, dass ABC-Transporter bereits seit drei Milliarden Jahren existieren

und in allen drei Reichen lebender Organismen präsent sind (SAIER et al., 1998).

Bei prokaryotischen Organismen konnten annähernd 50 verschiedene Mitglieder der

ABC-Superfamilie identifiziert werden (FATH und KOLTER, 1993). Die

Demonstration von P-gp-Genhomologien zwischen phylogenetischen Linien weist

darauf hin, dass es sich bei P-gp um ein sehr ursprüngliches Protein mit

fundamentalen zellulären Aufgaben handelt (LEVEILLE-WEBSTER und ARIAS,

1995).

P-gp ist ein phosphoryliertes Glykoprotein, welches in seiner funktionellen Form ein

Molekulargewicht von 170 kDa aufweist. P-gp ist ein Produkt des Gens ABCB1 (auch

bekannt als Multidrug Resistence 1 [MDR1] Gen), welches beim Menschen auf

Chromosom 7 lokalisiert ist und 28 Exone aufweist (FROMM, 2004). Diejenigen P-gp

Isoformen, welche für Pharmakoresistenz verantwortlich sein können, werden beim

Menschen vom MDR1 Gen codiert und bei Rodentiern von den Genen mdr1a und

mdr1b, welche aufgrund ihrer Verteilung im Gewebe zusammen anscheinend die

gleiche Funktion erfüllen, wie das einzelne humane Gen (LEVEILLE-WEBSTER und

Literaturübersicht

15

ARIAS, 1995). Mäuse, die eine Deletion von mdr1a oder mdr1a und mdr1b

aufweisen, zeigen zwar keine offensichtlichen physiologischen Abnormalitäten, aber

einen deutlichen Anstieg der Aufnahme von diversen lipophilen Substanzen wie z. B.

dem Anthelminthikum Ivermectin ins Gehirn mit entsprechend resultierender

Neurotoxizität (SCHINKEL et al., 1996, 1997). Im Nagergehirn ist die mdr1a Isoform

des P-gps vorwiegend in endothelialen Mikrogefäßzellen der Blut-Hirnschranke

präsent, wohingegen die mdr1b Isoform in erster Linie in Astrozyten lokalisiert

(REGINA et al., 1998; DECLEVES et al., 2000). Im normalen menschlichen Gehirn,

wird P-gp in geringem Maße in kapillären Endothelzellen exprimiert (ABBOT und

ROMERO, 1996). In epileptischem Gewebe von pharmakoresistenten

Humanpatienten kommt es zu einer signifikanten Hochregulation von P-gp im

Vergleich zu Kontrollen (DOMBROWSKI et al., 2001). P-gp konnte mittels

immunhistochemischer Methoden bei nicht-epileptischen Patienten nicht im

Gehirnparenchym, also den Astrozyten oder Neuronen nachgewiesen werden

(TISHLER et al., 1995; SISODIYA et al., 2002). Eine potentielle Erklärung für diese

augenscheinliche Divergenz zwischen Nagern und Menschen bezüglich der P-gp

Expression in Astrozyten könnte darin bestehen, dass der Detektionslevel der

verwendeten Assays beim gesunden Menschen zu gering ist. Bei pathologischen

Zuständen wie der Epilepsie steigt der P-gp Gehalt in Gliazellen jedoch an und wird

detektierbar (DOMBROWSKI et al., 2001; SISODIYA et al., 2001, 2002; TISHLER et

al., 1995; LAZAROWSKI et al., 2004). Eine erhöhte P-gp-Expression konnte auch in

Neuronen von refraktären Humanpatienten mit Hippocampussklerose im mesialen

Temporallappen detektiert werden (D`GIANO et al., 1997). P-gp konnte ebenfalls in

Neuronen von Ratten nachgewiesen werden (LAZAROWSKI et al. 2004; VOLK et

al., 2004b). Da die Überexpression am deutlichsten in Astrozyten auftritt, welche

Blutgefäße umgeben, könnte die Präsenz von P-gp in perivaskulären Gliazellen eine

zweite Barriere darstellen, welche das Eintreten von Xenobiotika, aber auch

Medikamenten beschränken soll (SISODIYA et al., 2002), weil die Blut-Hirnschranke

während epileptischer Anfälle vorübergehend durchlässig wird (DUNCAN und TODD,

1991). P-gp wird außer in der Blut-Hirnschranke auch in weiteren Geweben mit

exkretorischen Funktionen wie Darm, Leber und Niere, aber auch in der Blut-

Literaturübersicht

16

Hodenschranke und der Plazenta exprimiert. Dadurch wird der Eintritt von

Arzneistoffen nach oraler Aufnahme in den Körper beschränkt und die Elimination

dieser Substanzen gefördert (FROMM, 2004; LIN, 2004).

Die meisten der verfügbaren Daten weisen darauf hin, dass P-gp bei Säugetieren,

einschließlich dem Menschen, vorwiegend in der luminalen (apikalen) Membran von

Endothelzellen der Gehirnkapillaren exprimiert wird (DEMEULE et al., 2002;

SCHINKEL und JONKER, 2003; SUN et al., 2003). Durch diese Lokalisation können

Substrate von P-gp, welche von den Blutgefäßen aus in die Endothelzellen eintreten,

zum Teil wieder ins Blut zurückgepumpt werden. Daneben ist P-gp auch in

zytoplasmatischen Vesikeln präsent, in denen der Multidrug-Transporter dergestalt

lokalisiert ist, dass die Substrate in das Innere der Vesikel transportiert und dort

konzentriert werden können, somit also eine Sequestrierung der Xenobiotika weg

von ihren subzellulären Zielstrukturen erfolgt (SHAPIRO et al., 1998; RAJAGOPAL

und SIMON, 2003). In Endothelzellen von Gehirnkapillaren sind zirka 70 % des P-

gps in so genannten Caveolen lokalisiert (JODOIN et al., 2003), flaschenförmigen

Invaginationen der Plasmamembran, welche an vielen zellulären Prozessen beteiligt

sind, darunter auch dem Transport von Makromolekülen zwischen Zellen durch

Transzytose (DEMEULE et al., 2000; JODOIN et al., 2003; SCHLACHETZKI und

PARDRIDGE, 2003). DEMEULE et al. (2000) konnten zeigen, dass P-gp mit

Caveolin-1, einem integralen Membranprotein von Caveolen kolokalisiert und

interagiert. Mutationen in einem Caveolin-1 bindenden Motiv, welches im P-gp-

Molekül exprimiert wird, reduzieren die Interaktionen von P-gp mit Caveolin-1 und

erhöhen die Transportaktivität von P-gp (JODOIN et al., 2003). BENDAYAN et

al.(2006) wiesen P-gp auch im endoplasmatischen Retikulum, in zytoplasmatischen

Vesikeln, im Golgi-Apparat und in der Kernmembran nach, also unter anderem

Regionen, die für die Proteinsynthese und Glykolisierung verantwortlich sind. P-gp

besitzt mindestens vier verschiedene Substratbindungsstellen, welche interagieren

und durch allosterische Kommunikation Konformationen mit hoher oder niedriger

Affinität einnehmen können (MARTIN et al., 2000). SHAPIRO et al. (1999) fanden

jedoch Hinweise darauf, dass P-gp nur zwei verschiedene, positiv interagierende

Bindungs- und Transportstellen (R und H) für die Substrate besitzt, und beschrieben

Literaturübersicht

17

eine mögliche dritte allosterische Bindungsstelle, welche selber keine Substanzen

transportiert. SHAROM (1997) postuliert hingegen, dass Medikamente und

Chemosensitizer mit verschiedenen überlappenden Regionen einer einzigen

flexiblen Bindungsstelle interagieren, welche groß genug ist, mehr als eine

Komponente gleichzeitig zu erfassen.

Da Anfälle zu einer transienten Hochregulierung von P-gp führen können, ist es

interessant, dass der exzitatorische Neurotransmitter Glutamat , welcher in der Blut-

Hirnschranke von P-gp transportiert wird (LIU und LIU, 2001), die P-gp Expression

steigert und die mdr1a/mdr1b mRNA-Level in Endothelzellen von Mikrogefäßen im

Rattengehirn erhöht (ZHU und LIU, 2004). Anfälle verursachen bekanntermaßen

eine exzessive Glutamatfreisetzung im Gehirn (HOLMES, 2002), was eine logische

Erklärung für die gesteigerte P-gp Expression nach Anfällen, wie sie bei Tieren und

Menschen beobachtet wird, sein könnte (LÖSCHER und POTSCHKA 2005c). Durch

die Aktivierung von NMDA-Rezeptoren kommt es zur Glutamat-induzierten

Freisetzung von Sauerstoffradikalen, welche die P-gp Expression in Endothelzellen

von Mikrogefäßen im Rattengehirn bei Ischämie nachgewiesenermaßen steigern

(FELIX und BARRAND, 2002) und während des Epilepsiegeschehens ebenso wirken

könnten.

Es ist immer noch nicht abschließend geklärt, ob die Überexpression von P-gp und

MRPs in epileptogenem Gewebe von Patienten mit refraktärer Epilepsie eine

Konsequenz der Epilepsie, eine Folge von unkontrollierten Anfällen, der chronischen

Behandlung mit Antiepileptika oder eine Kombination dieser Faktoren darstellt

(LÖSCHER und POTSCHKA, 2002). In Tiermodellen der Temporallappenepilepsie

wurde gezeigt, dass Anfälle zu einer transienten Überexpression von P-gp in

Endothelzellen von Gehirnkapillaren, Astroglia und Neuronen führen können, was

darauf hindeutet, dass die Anfälle bei der Hochregulierung von Transportern eine

größere Rolle spielen als die Epilepsie an sich (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b).

In einem Kainat-Modell für Mäuse konnte gezeigt werden, dass die Überexpression

von P-gp bereits innerhalb der ersten 3-24 Std. nach Anfallsbeginn im Hippocampus

detektierbar ist (RIZZI et al., 2002). Der beobachtete Effekt war jedoch nach 72 Std.

nicht mehr vorhanden. Ähnliches wurde in einer Studie von SEEGERS et al. (2002b)

Literaturübersicht

18

beobachtet, was dafür spricht, dass die anhaltende Anfallsaktivität, jedoch nicht die

Prozesse, welche der Entwicklung von Epilepsie zugrunde liegen, für die

Überexpresson verantwortlich ist. Das könnte auch erklären, warum eine hohe

Anfallsfrequenz vor Behandlungsbeginn einen wichtigen Indikator für

Pharmakoresistenz darstellt (REGESTA und TANGANGELLI, 1999). Bei Patienten

mit Malformationen der kortikalen Entwicklung scheint jedoch eine konstitutive

Überexpression von Multidrug-Transportern wichtiger zu sein als eine induzierte oder

erworbene Hochregulation (SISODIYA et al., 1999). Es konnte außerdem belegt

werden, dass eine Langzeitbehandlung mit Antiepileptika wie Phenytoin oder

Phenobarbital die Expression von P-gp im Gehirn nicht induziert (SEEGERS et al.,

2002a).

Die meisten Arzneistoffe, welche geeignete P-gp Substrate darstellen, besitzen ein

Molekulargewicht von 400 Da, was erklären könnte, weshalb diese Substanzen

weniger effizient ins Gehirn penetrieren, als von ihrer Lipidlöslichkeit zu erwarten

wäre (SCHINKEL, 1999). Antiepileptika sind im Gegensatz zu Chemotherapeutika

nur schwache P-gp Substrate. Das könnte den Grund dafür liefern, warum

Antiepileptika ihre Zielstrukturen im Gehirn erreichen, wenn P-gp normal exprimiert

wird, jedoch bei einer Überexpression von P-gp nur noch in so geringem Maße die

Blut-Hirnschranke passieren können, dass eine Pharmakoresistenz entsteht

(LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a). Da die behandlungsresistenten Patienten die

gleichen neurotoxischen Nebenwirkungen von Antiepileptika aufweisen, wie

pharmakosensitive Patienten, scheint die Überexpression von Multidrug-

Transportern bei refraktären Patienten auf den epileptischen Fokus beschränkt zu

sein (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a).

P-gp ist auch in sofern ein ungewöhnlicher Transporter, dass er eine hohe

Promiskuität aufweist und bisher schon Hunderte von Komponenten als Substrate

identifiziert werden konnten (SHAROM, 1997). Substanzklassen, die generell von P-

gp transportiert werden, beinhalten Opiode, Steroide, Antibiotika,

Kalziumkanalblocker, Chemotherapeutika, Immunsuppressiva und andere (BAUER

et al., 2005). Bislang wurde für sieben Haupt-Antiepileptika nachgewiesen, dass sie

Literaturübersicht

19

Substrate von P-gp darstellen: Phenytoin, Phenobarbital, Carbamazepin, Lamotrigin,

Gabapentin, Felbamat und Topiramat (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b).

In der Regel sind die typischen P-gp Substrate hydrophob, mit einem planaren

Ringsystem und oft positiver Ladung bei physiologischem pH (SHAROM, 1997). Die

transportierten Substrate sind jedoch sehr heterogen, können aromatische Gruppen

enthalten oder nicht, ungeladen oder schwach geladen sein und der einzige

gemeinsame Nenner aller Substanzen scheint ihre amphipathische Natur zu sein

(SCHINKEL und JONKER, 2003).

Die Funktionalität der membranassoziierten Effluxtransporter variiert mit

Polymorphismen und Schwankungen im Expressionslevel, post-translationalen

Prozessen sowie der Membrankomposition der Transporter. Zusätzlich kann der

Transport eines Substrates von der Präsenz anderer Substrate abhängig sein

(LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a). Die Expression von Drug-Transportern wie P-

gp oder den MRPs obliegt der strikten transkripitonalen Regulation durch Orphan-

Nuklear-Rezeptoren wie PXR (Pregnane X Rezeptor; bekannt als PXR in Nagetieren

und als Steroid- und Xenobiotika-Rezeptor [SXR] beim Menschen) (SCHUETZ und

STROM, 2001; SYNOLD et al., 2001; WANG und LECLUYSE, 2003; BAUER et al.,

2005). PXR wird von natürlich vorkommenden Steroiden wie Progesteron sowie

synthetischen Glukokortikoiden aktiviert, aber auch von einigen Medikamenten wie

z.B. Phenobarbital (SYNOLD et al., 2001). PXR reguliert nach seiner Aktivierung

auch eine Reihe von Genen, welche in Leber und Darm für den Metabolismus von

Xenobiotika verantwortlich zeichnen (BAUER et al., 2005). Viele Stoffe sind sowohl

Substrate von P-gp als auch von Cytochrom P450 3A4, welche beide von SXR/PXR

reguliert werden und in Leber und Darm kolokalisieren, um dort ein koordiniertes

System für die Absorption, den Metabolismus und die Disposition vieler Arzneistoffe

darzustellen (SCHUETZ und STROM, 2001).

Während oxidativer Stress die P-gp Expression im Rattengehirn erhöht, können

Entzündungsreaktionen zu einer verminderten Expression von Multidrug-

Transportern führen (BAUER et al., 2005).

Veränderungen der Aktivität von P-gp könnten resultieren aus 1) der direkten

Modifikation der Pumpenfunktion durch Inhibitoren und intrazelluläre Signale, 2) der

Literaturübersicht

20

Insertion und Freisetzung von vorgefertigten Transportern, welche in Vesikeln

gespeichert sind, 3) der veränderten Transportersynthese durch verstärkte oder

gehemmte Transkription oder Translation (BAUER et al., 2005).

P-gp könnte Substanzen entweder durch einen Proteinkanal aus dem Zytoplasma

ausschleusen (Porenmodell) oder Substanzen, welche in die Membran eingedrungen

sind, aus der Zelle befördern (HIGGINS und GOTTESMANN, 1992; SHAROM,

1997). Da die meisten P-gp Substrate lipophiler Natur sind, wäre die zweite

Hypothese zu favorisieren (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a). Dabei könnte P-gp

wie ein Flippase Substanzen aus der inneren Membran aufnehmen und zu der

äußeren Membran der Lipiddoppelschicht transferieren, von wo aus die Substrate

dann in die Extrazellulärflüssigkeit diffundieren. Experimentelle Daten sprechen

dafür, dass P-gp Substrate in der inneren Membranschicht erkennt, diese „ansaugt“

und durch einen Proteinkanal ins extrazelluläre Medium transportiert, ähnlich wie ein

Staubsauger (HOCHMAN et al., 2002). Substanzen mit einer hohen Polarität oder

Ladung könnten den Transporter von der wässrigen Phase aus erreichen,

wohingegen hydrophobe Substrate von der Lipiddoppelschicht aus mit dem Protein

interagieren könnten (SHAROM; 1997).

Es ist jedoch anzumerken, dass nicht alle Antiepileptika Substrate für Multidrug-

Transporter darstellen, so dass die Hypothese der Überexpression bestimmter

Transporter die Pharmakoresistenz gegenüber Antiepileptika nicht vollständig

erklären kann (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005c).

2.4.4 Blut-Hirnschranke In der Blut-Hirnschranke zeigen die Endothelzellen der Gehirnkapillaren nur eine

geringe Permeabilität. Transzellulare Passagemöglichkeiten wie Poren fehlen und es

sind nur wenige pinozytotische Vesikel vorhanden. Jedoch gibt es größere und mehr

Mitochondrien als bei den peripheren Kapillaren. Die Endothelzellen, welche die

Gehirnkapillaren und Perizyten begrenzen, werden von einer Basalmembran

umgeben. Ungefähr 90 % der Oberfläche der Endothelzellen ist von astrozytären

Fortsetzen bedeckt, welche die Eigenschaften der Blut-Hirnschranke unterstützen

(ABBOTT, 2002). Gehirnkapillaren sind zirka 50-100 Mal dichter als periphere

Literaturübersicht

21

Mikrogefäße, bedingt durch die Präsenz von komplexen „tight-junctions“ (Zonulae

occludens), welche den parazellulären Zutritt von hydrophilen Substanzen ins Gehirn

beschränken, so dass die Penetration ins Gehirnendothelium auf transzelluläre

Mechanismen begrenzt ist (ABBOTT, 2002).

Obwohl Substanzen auch durch die Blut-Liquorschranke ins Gehirn aufgenommen

werden können, ist die Oberfläche der Blut-Hirnschranke ungefähr 5000 Mal größer

als die der Blut-Liquorschranke, so dass die Blut-Hirnschranke als Hauptroute für die

Aufnahme von endogenen und exogenen Liganden ins Gehirnparenchyma

angesehen wird (PARDRIGE, 1995; TERASAKI und HOSOYA, 1999; SUZUKI et al.,

1997; TSUJI und TAMAI, 1999). VAN VLIET et al. (2007a) konnten zeigen, dass

durch eine artifizielle Öffnung der Blut-Hirnschranke mittels Mannitol bei chronisch

epileptischen Ratten ein anhaltender Anstieg der Anfallsfrequenz bei der Mehrzahl

der Tiere ausgelöst werden kann. Das spricht dafür, dass eine derartige

Durchlässigkeit der Blut-Hirnschranke während der Epileptogenese und der

chronisch epileptischen Phase auftritt und zur Progression der Epilepsie beitragen

könnte (VAN VLIET et al., 2007a).

2.4.5 Inhibitoren von Multidrug-Transportern [Tariquidar (XR 9576)] Der spezifische P-gp Modulator Tariquidar (XR 9576) ist ein hochpotentes

Anthranilamidderivat und gehört zur dritten Generation von P-gp Inhbitoren (ROE et

al., 1999). Die Agenzien der dritten Generation zeichnen sich gegenüber den ersten

beiden Generationen dadurch aus, dass sie bei relevanten Konzentrationen nicht mit

dem Cytochchrom P450 3A4 interagieren (DANTZIG et al., 1999; WANDEL et al.,

1999). Es konnte nachgewiesen werden, dass Tariquidar im Gegensatz zu

Cyclosporin A und Verapamil auch in hohen Konzentrationen die MRP-Funktion nicht

beeinflusst (STEWART et al., 2000).

Die genaue Bindungsstelle von XR 9576 ist noch unbekannt, aber es entfaltet seine

Wirkung, indem es die ATPase Aktivität von P-gp unterbindet, und wird selbst nicht

transportiert. Es ist jedoch bekannt, dass XR 9576 die P-gp Funktion hemmt, indem

es an eine Stelle bindet, die sich von der Bindungsstelle für den Substrattransport

unterscheidet (MARTIN et al., 1999, 2000). Tariquidar besitzt beim Menschen eine

Literaturübersicht

22

Halbwertszeit von ungefähr 24 Std. und muss daher nur einmal täglich appliziert

werden (LUM et al., 1993).

2.5 Pharmakoresistenz im Tiermodell 2.5.1 Modellübersicht: Tiermodelle für pharmakoresistente Epilepsie Die meisten der zur Verfügung stehenden Tiermodelle für Pharmakoresistenz sind

Modelle der Temporallappenepilepsie (LÖSCHER, 2006). In Analogie zur Epilepsie

bei Mensch und Tier wäre es ideal, wenn es möglich wäre, in Tiermodellen mit

Antiepileptika Responder und Nonresponder zu selektieren. Nonresponder, also

Tiere die gegenüber Antiepileptika resistent sind, könnten durch direkten Vergleich

mit Respondern zur Klärung der Mechanismen von Pharmakoresistenz verwendet

werden. Eine derartige Selektion refraktäre und sensitive Tiere ist in einigen

Epilepsiemodellen in Ratten-Auszuchtstämmen gelungen (LÖSCHER, 2006). Es

wäre optimal, Inzucht-Rattenstämme zur Verfügung zu haben, welche entweder

Responder oder Nonresponder gegenüber Antiepileptika sind und damit die

aufwendige Selektion und teilweise relativ geringe Ausbeute von Respondern und

Nonrespondern in Auszuchtstämmen zu vermeiden. Leider sind bislang alle

Versuche, einen Stamm zu finden, der zu 100 % Responder oder Nonresponder

beinhaltet, fehlgeschlagen (LÖSCHER, 2006). Als erstes Modell für die

Untersuchung von refraktärer Epilepsie wurde das bei den Epilepsiemodellen

beschriebene Amygdala-Kindling-Modell eingeführt (LÖSCHER, 1986; LÖSCHER et

al., 1986). Es stellte sich heraus, dass fokale Anfälle wesentlich weniger auf

Antiepileptika ansprechen als sekundär generalisierte Anfälle, was auch in der Klinik

häufig beobachtet wird. Es konnte gezeigt werden, dass vollgekindelte weibliche

Ratten eines Wistar-Auszuchtstammes bezüglich ihrer Ansprechbarkeit auf das

Antiepileptikum Phenytoin variieren, da einige Tiere mit einer kompletten

Anfallskontrolle auf Phenytoin reagierten, wohingegen andere überhaupt nicht darauf

ansprachen (RUNDFELDT et al., 1990). Als Parameter für Ansprechbarkeit wurde

dabei die Schwelle für die Induktion fokaler Anfallsaktivität angesehen, das heißt die

Schwelle für die Induktion von Nachentladungen. Die durchschnittlichen Daten von

insgesamt 200 Ratten ergaben, dass nur 16 % der Tiere auf Phenytoin reagierten,

Literaturübersicht

23

16% keinen antikonvulsiven Effekt erkennen ließen, und die verbleibenden 61 %

variabel auf Phenytoin ansprachen (LÖSCHER, 1997; LÖSCHER, 2002b). Die

Subgruppe der Nonresponder ähnelt dabei Patienten mit refraktärer

Temporallappenepilepsie, wohingegen Responder als Modell für Patienten dienen,

bei welchen eine komplette Anfallskontrolle durch Antiepileptika erreicht werden

kann. Variable Responder spiegeln Patienten wider, bei denen die Behandlung mit

Antiepileptika die Anfallsfrequenz reduziert, jedoch zu keiner vollständigen

Anfallskontrolle führt (LÖSCHER, 2006). Nach Phenytoin wurden im gleichen Modell

zahlreiche weitere Antiepileptika getestet, welche alle signifikant weniger oder

überhaupt nicht effizient bei Phenytoin-Nonrespondern wirkten, verglichen mit

Respondern, so dass sich die Resistenz einer Subgruppe von gekindelten Wistar-

Ratten gegenüber Phenytoin auf diverse alte und neue Antiepileptika ausdehnt. Die

einzige Ausnahme stellte dabei das Antiepileptikum Levetiracetam dar (LÖSCHER,

2006), welches kein P-gp Substrat ist (POTSCHKA et al., 2004b). Im Kindling-Modell

konnte weiterhin gezeigt werden, dass gekindelte Ratten geringere extrazelluläre

Gehirnkonzentrationen von Phenytoin aufweisen als gleichaltrige Kontrolltiere

(POTSCHKA und LÖSCHER, 2002) und dass Phenytoin-Nonresponder sich von

Respondern durch eine markante Überexpression von P-gp in der gekindelten

Amygdala unterscheiden (POTSCHKA et al., 2004a).

Ein weiteres interessantes Modell für pharmakoresistente Epilepsie ist das 6-Hz

psychomotorische Anfallsmodell bei Mäusen (BARTON et al., 2001). Das 6-Hz-

Modell basiert auf einer elektrischen Stimulation durch Rechteck-Impulse von 0,2

Millisekunden mit niedriger Frequenz, welche über Kornealelektroden für eine relativ

lange Dauer (3 Sekunden) appliziert werden. Die dadurch induzierten Anfälle sind

gekennzeichnet durch Immobilität, Klonus der Vorderextremitäten sowie

automatisierte, stereotype Verhaltensweisen, welche denen bei humaner limibischer

Epilepsie ähneln und nicht auf Phenytoin ansprechen (SWINYARD, 1972). Durch

eine Erhöhung der Stromstärke konnte beobachtet werden, dass bei 44 Milliampere

die meisten Antiepileptika ihre Effizienz verlieren und lediglich Valproat und

Levetiracetam noch zu einer kompletten Kontrolle der 6 Hz Anfälle führten, weshalb

dieses Modell als adäquat für Resistenzstudien angesehen wurde (BARTON et al.,

Literaturübersicht

24

2001). Das 6-Hz-Modell birgt gegenüber dem Kindling-Modell den Vorteil, dass es

sehr einfach ist und das Screening vieler Substanzen in relativ kurzer Zeit erlaubt

(LÖSCHER, 2006). Obwohl Kindling und das 6-Hz-Modell interessant sind für die

Testung von Antiepileptika, sind beide augenscheinlich nicht geeignet für die

Untersuchung von Mechanismen, die zu chronischer Epilepsie mit spontanen

Anfällen führen (LÖSCHER, 2006).

Eine Möglichkeit für die Untersuchung chronischer Epilepsie besteht zum Beispiel in

der Verwendung eines Pilocarpin-induzierten SE, nach dem sich spontan

wiederkehrende Anfälle entwickeln (siehe auch Kapitel Epilepsiemodelle). So wurden

in einem Versuch von GLIEN et al. (2002) bei Pilocarpin-behandelten Ratten

subkutan osmotische Minipumpen implantiert, welche zunächst für zwei Wochen mit

Natriumchlorid-Lösung gefüllt waren (Predrug-Kontrollphase), danach für zwei

Wochen mit Levetiracetam befüllt wurden, welches kontinuierlich freigesetzt wurde

(Drug-Phase) und anschließend für zwei Wochen durch substanzfreie Pumpen

ersetzt wurden (Postdrug-Kontrollphase). Es stellte sich heraus, dass bei 25 % der

Tiere durch Levetiracetam eine vollständige Anfallskontrolle erreicht werden konnte,

wohingegen weitere 25 % als Nonresponder definiert wurden. Die verbleibenden 50

% galten als variable Responder mit einer Senkung der Anfallsfrequenz (GLIEN et

al., 2002). LEITE und CAVALHEIRO (1995) bedienten sich ebenfalls des Pilocarpin-

Modells, um die Effizienz einiger Antiepileptika zu testen. Diese Studie wird im

Diskussionsteil des Selektionsmodells näher beschrieben. Wie bereits bei den

Epilepsiemodellen erläutert, weisen chemische Modelle einige Nachteile gegenüber

elektrischen Modellen auf, weshalb im folgenden Kapitel speziell auf das elektrische

Post-SE-Modell und seine besondere Relevanz für Pharmakoresistenzstudien

eingegangen werden soll.

2.5.2 Elektrisches Post-Status epilepticus-Modell für Pharmakoresistenzstu-dien Das für die vorliegende Arbeit verwendete elektrische Post-SE-Modell, welches bei

den Epilepsiemodellen ausführlich beschrieben wurde, konnte von BRANDT et al.

(2004) als Modell für Pharmakoresistenz etabliert werden. So sprachen in dieser

Literaturübersicht

25

vorhergehenden Studie sechs von insgesamt elf Ratten mit spontan

wiederkehrenden Anfällen mit einer kompletten Anfallskontrolle auf das

Antiepileptikum Phenobarbital an und ein weiteres Tier zeigte eine Senkung der

Anfallsfrequenz um mehr als 90 %, weshalb diese sieben Ratten als Responder

beschrieben wurden. Drei weitere Tiere zeigten während der Behandlung statt einer

antikonvulsiven Reaktion sogar einen Anstieg der Anfallsfrequenz. Das vierte Tier

zeigte nur eine moderate (< 50 %) Anfallskontrolle, so dass diese vier Tiere als

Nonresponder eingestuft wurden (BRANDT et al., 2004). Die Plasmakonzentrationen

von Phenobarbital unterschieden sich zwischen Respondern und Nonrespondern

nicht signifikant. Alle Tiere zeigten generalisierte konvulsive Anfälle (BRANDT et al.,

2004). VOLK und LÖSCHER (2005) konnten dann bei den gleichen Phenobarbital-

Nonrespondern eine signifikante Hochregulation von P-gp im piriformen Kortex, im

Gyrus dentatus und in der CA1-Region des Hippocampus gegenüber den

Respondern nachweisen. Histologische Untersuchungen ergaben außerdem einen

signifikanten Neuronenverlust in der CA1, CA3c/CA4 und im dentaten Hilus von

Nonrespondern, wohingegen sich die Responder diesbezüglich nicht von nicht-

epileptischen Kontrollen unterschieden (VOLK et al., 2005). Des weiteren wurde

anhand von Rezeptor-autoradiographischen Untersuchungen beobachtet, dass die

Nonresponder eine erhöhte Dichte von Diazepam-insensitiven GABA-Rezeptoren im

Gyrus dentatus, sowie eine reduzierte Dichte von Diazepam-sensitiven Rezeptoren

im Hilus aufwiesen (VOLK et al., 2005). Das Modell wird daher als geeignet

angesehen für Studien, welche sich mit der Untersuchung der multifaktoriellen

Ursachen von Pharmakoresistenz beschäftigen. Das elektrische Post-SE-Modell

sollte in der vorliegenden Arbeit zunächst dahingehend erweitert werden, dass neben

Phenobarbital ein zweites Antiepileptikum zum Einsatz kommt, welches im folgenden

beschrieben wird.

2.6 Antiepileptika Die zur Zeit zur Verfügung stehenden Antiepileptika wirken nach gegenwärtigem

Kenntnisstand rein symptomatisch (antikonvulsiv, anti-iktal) und sind weder in der

Lage eine Epilepsie noch ihre Progression zu verhindern (SCHACHTER, 2002). Die

Literaturübersicht

26

im folgenden beschriebenen, hier verwendeten Antiepileptika Phenobarbital und

Phenytoin haben sich als effektiv bei der Behandlung einfacher und komplex-fokaler

Anfälle, sekundär generalisierter Anfälle und primär generalisierter tonisch-klonischer

Anfälle erwiesen (LÖSCHER, 1997).

2.6.1 Phenobarbital Das Antiepileptikum Phenobarbital gehört zu den Barbituraten und wirkt 1) indem es

die GABA-Antwort bei geringen Konzentrationen potenziert, 2) über eine direkte

Aktivierung des GABA-Rezeptors und 3) über eine Blockade des Chloridkanals bei

hohen Konzentrationen (STUDY und BARKER, 1981; TWYMAN et al., 1989). Es

wurde beschrieben, dass Phenobarbital ein Substrat des Multidrug-Transportes P-gp

darstellt (SCHUETZ et al., 1996; POTSCHKA et al., 2002). Phenobarbital ist für

chronische Untersuchungen besonders geeignet, da es eine ausreichend lange

Halbwertszeit besitzt (17 Std. bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten), welche eine

Aufrechterhaltung eines „therapeutischen“ Plasmalevels über eine längere

Behandlungsdauer erlaubt (LÖSCHER und HÖNACK, 1989; LEITE und

CAVALHEIRO, 1995; BRANDT et al., 2004).

2.6.2 Phenytoin Phenytoin gilt als eines der wichtigsten nicht-sedativen Antiepileptika für die

Behandlung von generalisierten, tonisch-klonischen und fokalen Anfällen. Die

antiepileptische Wirkung scheint in erster Linie durch einen inhibitorischen Effekt auf

spannungsabhängige Natriumkanäle vermittelt zu werden (ROGAWSKI und

PORTER, 1990). Das Antiepileptikum Phenytoin wird als Stabilisator von erregbaren

Membranen angesehen, da es wiederholter elektrischer Aktivität vorbeugt oder diese

unterdrückt (JURNA, 1985; ROGAWSKI und PORTER, 1990) Es ist bekannt, dass

Phenytoin ein Substrat des Multidrug-Transporters P-gp darstellt (POTSCHKA und

LÖSCHER, 2001a) und allem Anschein nach wird es auch von MRP2 transportiert

(POTSCHKA und LÖSCHER, 2001b; LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b und c).

Die Metabolisierung von Phenytoin erfolgt durch Hydroxylierung mittels eines

Hydroxylasekomplexes im endoplasmatischen Retikulum der Leber (JONES und

Literaturübersicht

27

WIMBISH, 1985). Da die Rate, mit welcher Phenytoin hydroxyliert wird,

dosisabhängig ist (Kinetik 0. Ordnung), kann keine genaue Halbwertszeit kalkuliert

werden (JONES und WIMBISH, 1985; PERUCCA und RICHENS, 1984). Außerdem

inhibiert der Hauptmetabolit von Phenytoin, das 5-5-Phenylhydantoin die

Hydroxylierung des Phenytoins bei der Ratte (ASHLEY und LEVY, 1972). Durch

wiederholte Phenytoinapplikation werden die metabolisierenden Enzyme langfristig

gehemmt, was zu einer verminderten Elimination von nachfolgenden Dosen führt. Als

Konsequenz der resultierenden Akkumulation und Neurotoxizität der Substanz ist die

Entwicklung eines Behandlungsprotokolls für chronische Phenytoinapplikationen um

einiges komplizierter als für andere Antiepileptika. Ein Vorteil dieser speziellen

Sättigungskinetik ist jedoch, dass aktive Plasmakonzentrationen durch einmalige

Gabe am Tag aufrechterhalten werden können, wohingegen die meisten anderen

Antiepileptika bis zu dreimal täglich verabreicht werden müssen, bedingt durch die

schnellere Eliminationsrate bei Ratten im Vergleich zum Menschen (RUNDFELDT

und LÖSCHER, 1993; LÖSCHER und SCHWARK, 1985; HÖNACK und LÖSCHER,

1989; LÖSCHER und HÖNACK, 1989; LÖSCHER et al., 1989; LÖSCHER und

RUNDFELDT, 1991). LÖSCHER und RUNDFELDT beschrieben 1991, dass

Phenytoin sich im Kindling-Modell als geeignet erwies, pharmakoresistente von

pharmakosensitiven Tieren zu selektieren. So reagierten 20 % der weiblichen Wistar-

Ratten mit einem Anstieg der fokalen Anfallsschwelle (Phenytoin-Responder) und 20

% nicht (Phenytoin-Nonresponder). Die übrigen 60 % wurden als variable Responder

eingestuft (LÖSCHER und RUNDFELDT, 1991).

2.7 GABAA-Rezeptoren bei Epilepsie GABA (γ-Aminobuttersäure) stellt von den Säugetieren bis zu den Crustaceen den

wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Zentralnervensystem dar (BARNARD

et al., 1998). Neben metabotropen GABAB-Rezeptoren existieren ionotrope GABAA-

und GABAC-Rezeptoren, wobei letzterer insensitiv gegenüber klassischen

Modulatoren wie Benzodiazepinen und Barbituraten ist und ausschließlich in der

Retina exprimiert wird. Daneben gibt es möglicherweise ionotrope GABAD-

Rezeptoren, welche im embryonalen Hirnstamm exprimiert werden. Die genaue

Literaturübersicht

28

Klassifikation ist dabei nicht ganz unumstritten (BARNARD et al., 1998). Bei der

Temporallappenepilepsie treten chronische Modifikationen der Funktion von

postsynaptischen GABAA-Rezeptoren auf, welche potentielle Mechanismen für

Epileptogenese und Pharmakoresistenz darstellen (BUHL et al., 1996; GIBBS et al.,

1997; BROOKS-KAYAL et al., 1998). Aus diesem Grund soll im folgenden genauer

auf den GABAA-Rezeptor eingegangen werden.

Beim GABAA-Rezeptor handelt es sich um einen transmittergesteuerten Ionenkanal,

welcher aus einem Pentamer mit vier membrandurchspannenden Kanälen (M1-M4)

konstituiert wird, um einen intrinsischen Chloridkanal zu formen (ALEXANDER et al.,

2007). GABAA-Rezeptoren werden von einer Vielzahl positiver und negativer

allosterischer Modulatoren, einschließlich Barbituraten, Benzodiazepinen,

Neurosteroiden, Penizillinen, Picrotoxin, Bicucullin und Zink, reguliert (KAPUR und

MACDONALD, 1997). Die pharmakologischen Eigenschaften sind abhängig von der

Komposition der Untereinheiten (MACDONALD und OLSEN, 1994). Die Sensitivität

von GABAA-Rezeptoren gegenüber Benzodiazpinen erfordert beispielsweise die

Präsenz einer γ-Untereinheit und die relative Affinität für viele Benzodiazpinrezeptor-

Agonisten basiert auf der jeweiligen α-Untereinheit des Rezeptors (KAPUR und

MACDONALD, 1997). Um alle pharmakologischen Eigenschaften eines nativen

GABAA-Rezeptors zu erfüllen, müssen mindestens drei verschiedene Untereinheiten

exprimiert werden (ARAUJO et al., 1998).

Bei Säugetieren konnten insgesamt 19 Untereinheiten differenziert werden: sechs α,

drei β, drei ρ, drei γ, eine δ, eine ε, eine θ und eine π (BARNARD, 2000; KORPI et

al., 2002). Im Zentralnervensystem werden vornehmlich Rezeptoren bestehend aus

α1β2γ2 exprimiert, gefolgt von α2β3γ2 und α3β3γ2 -Isoformen. Die α- und die β-

Untereinheit tragen zur GABA-Bindungsstelle bei (ALEXANDER et al., 2007). Die

Benzodiazpinbindungsstelle ist höchstwahrscheinlich zwischen der α- und der γ-

Untereinheit lokalisiert (SIGEL und BUHR, 1997). Die einzelnen Isoformen der α- und

γ-Untereinheiten üben gravierende Effekte auf die Effizienz und das

Erkennungspotenzial der Benzodiazepin-Bindungsstelle aus. Es werden mehrere

Typen von Bindungsstellen unterschieden: Typ I umfasst Rezeptorkompositionen mit

α1β1γ2 und einer Sensitivität für Zolpidem und Diazepam. Die Zusammensetzung

Literaturübersicht

29

α2β1γ2, α3β1γ2 oder α5β1γ2 produziert die Benzodiazepin-Bindungsstelle Typ II mit

hoher Diazepam- und geringer Zolpidemsensitivität. Typ III enthält Rezeptoren mit

α4- oder α6-β1γ2-Untereinheiten, welche insensitiv gegenüber Benzodiazepinen sind

(MACDONALD und KELLY, 1995; MACDONALD und KAPUR, 1999).

Während Benzodiazepine vornehmlich extrazellulär binden, sind Bindungsstellen für

Barbiturate in der Transmembranregion lokalisiert (KORPI et al., 2002). Barbiturate

binden an eine allosterische regulatorische Bindungsstelle des GABAA-Rezeptors

(MACDONALD und KAPUR, 1999). Die Effekte von Barbituraten sind größtenteils

von der β-Untereinheit abhängig, und die Aktivität von Agonisten wird durch die

jeweilige α-Untereinheit substantiell beeinflusst (DRAFTS und FISHER, 2006).

Barbiturate wie das hier verwendete Phenobarbital wirken auf den GABAA-Rezeptor

durch eine Erhöhung der Dauer der Kanalöffnung (MACDONALD et al., 1989;

TWYMAN et al., 1989) wohingegen Benzodiazepine die Frequenz der

Rezeptoröffnung erhöhen (VICINI et al., 1987; ROGERS et al., 1994).

Barbiturate aktivieren in hohen Konzentrationen, ähnlich Neurosteroiden, den

Rezeptor direkt, d. h. auch in der Abwesenheit von GABA (PUIA et al., 1990). Der

Prototyp eines GABAA-Rezeptors wird selektiv von Muscimol aktiviert und kompetitiv

durch Bicucullin sowie nicht-kompetitiv mittels Picrotoxin antagonisiert (KORPI et al.,

2002).

Zusammenfassung und Zielsetzung

30

3 Zusammenfassung und Zielsetzung

Epilepsie beschreibt nicht nur ein einzelnes Krankheitsbild, sondern vielmehr eine

diverse Familie von Krankheiten, welcher die abnorme Anfallsprädisposition

gemeinsam ist (Internationale Liga gegen Epilepsie, aus FISHER et al., 2005). In der

Human- und Veterinärmedizin stellen Epilepsien die häufigsten chronischen

neurologischen Erkrankungen des zentralen Nervensystems dar, und die

Behandlung erfolgt in den meisten Fällen pharmakotherapeutisch. Ungefähr ein

Drittel der Patienten leidet unter Pharmakoresistenz (REGESTA und TANGANELLI,

1999; LÖSCHER, 2003) und den daraus resultierenden sozialen, neurobiologischen

und kognitiven Konsequenzen.

Bei der häufigsten Epilepsieform, der so genannten Temporallappenepilepsie,

welche gekennzeichnet ist durch komplex-fokale Anfälle, erweisen sich sogar

dreiviertel der Patienten als refraktär gegenüber gängigen Behandlungsstrategien

(LEPPIK, 1992). Tiermodelle, welche diese Situation beim Menschen widerspiegeln,

wären daher optimal, um Kausalitätsstudien durchzuführen und darauf basierend

neue Behandlungsmöglichkeiten zu entwickeln.

Die Frage, warum sich manche Epilepsien nicht oder nur unzureichend behandeln

lassen, ist noch nicht hinreichend geklärt. Es handelt sich jedoch aller

Wahrscheinlichkeit nach um einen multifaktoriellen Prozess (REGESTA und

TANGANELLI, 1999; KWAN und BRODIE, 2002; LÖSCHER und POTSCHKA,

2002). Neben genetischen Ursachen werden Veränderungen der Zielstruktur sowie

eine Überexpression von Multidrug-Transportern wie P-gp in der Blut-Hirnschranke

als mögliche Gründe für pharmakoresistente Epilepsie genannt (LÖSCHER und

POTSCHKA, 2002; LÖSCHER und POTSCHKA, 2005 a und b). Weiterhin treten bei

der Temporallappenepilepsie chronische Modifikationen der Funktion von

postsynaptischen GABAA-Rezeptoren auf, welche potentielle Mechanismen für

Epileptogenese und Pharmakoresistenz darstellen (BUHL et al., 1996; GIBBS et al.,

1997; BROOKS-KAYAL et al., 1998).

In der vorliegenden Arbeit sollten die zugrunde liegenden Mechanismen von

refraktärer Epilepsie anhand eines Tiermodells, basierend auf dem bisherigen


31

Wissensstand, weitergehend untersucht werden. Dafür wurden folgende

Fragestellungen und Arbeitshypothesen definiert:

1) Ist es möglich, ein bereits etabliertes elektrisches Post-SE-Rattenmodell für

die Selektion von pharmakoresistenten und pharmakosensitiven Tieren

dahingehend weiterzuentwickeln, dass es der oben beschriebenen Definition

von Pharmakoresistenz entspricht, nach welcher die pharmakoresistenten

Tiere sich als refraktär gegenüber der Behandlung mit mindestens zwei

Antiepileptika erweisen müssen?

2) Ist es möglich, die Überexpression des Multidrug-Transporters P-gp bei

pharmakoresistenten Ratten durch gleichzeitige Gabe eines hochspezifischen

P-gp-Inhibitors mit einem Antiepileptikum zu überwinden?

3) Inwieweit treten zwischen pharmakoresistenten und pharmakosensitiven

Ratten Modifikationen von GABAA-Rezeptoruntereinheiten in hippocampalen

Subregionen auf, im Vergleich untereinander und im Vergleich zu Kontrollen?

Zur Beantwortung dieser Fragen wurde bei weiblichen Sprague-Dawley Ratten

mittels elektrischer Stimulation der basolateralen Amygdala ein Status epilepticus

ausgelöst, welcher in den darauf folgenden Wochen zur Entwicklung von spontan

wiederkehrenden Anfällen führte. Die Behandlung dieser Anfälle erfolgte mittels der

beiden Standardantiepileptika Phenobarbital und Phenytoin, welche die Selektion

von pharmakoresistenten und pharmakosensitiven Subgruppen ermöglichten. Die

Definition eines Responders erforderte dabei eine Anfallsreduktion um > 50%. Tiere

mit einer Senkung der Anfallsfrequenz um weniger als 50 % wurden als

Nonresponder deklariert. Die Überwachung der Tiere erfolgte dabei mithilfe einer

kontinuierlichen EEG- und Videoaufzeichnung sowie einer chromatographischen

Detektion der Plasmalevel des jeweiligen Antiepileptikums. Nach Analyse der

Phenobarbitalphase wurde mit den Nonrespondern eine Kombinationstherapie,

bestehend aus dem Antiepileptikum Phenobarbital und dem hochspezifischen P-gp

Inhibitor Tariquidar, durchgeführt. Danach wurden die Tiere perfundiert und die

Gehirne immunhistochemisch mit monoklonalen Antikörpern für die GABAA-


32

Rezeptoruntereinheiten α1-5, β2/3, γ2 und δ gefärbt. Die Auswertung der

Gehirnschnitte erfolgte dann mittels optischer Dichtemessung in Bereichen des

Ammonshorns und des Gyrus dentatus in beiden Hirnhemisphären.

Material und Methoden

33

4. Material und Methoden

4.1 Elektrische Epilepsiemodelle 4.1.1 Versuchstiere Als Versuchstiere wurden 40 weibliche Sprague-Dawley Ratten verwendet, welche

von Harlan-Winkelmann, Borchen, bezogen wurden. Weibliche Sprague-Dawley

Ratten wurden deshalb verwendet, da sie verglichen mit weiblichen Wistar-Ratten

und männlichen Sprague-Dawleys den höchsten Prozentsatz (64 %) an Tieren

aufweisen die nach einer Stimulation der basolateralen Amygdala einen SSSE mit

rein generalisierten Konvulsionen entwickeln (BRANDT et al., 2003). In

Vorversuchen konnte gezeigt werden, dass der Östrus bei gekindelten weiblichen

Ratten keinen Einfluss auf die Anfallsempfindlichkeit oder den Effekt von

Antikonvulsiva ausübt (RUNDFELDT et al., 1990; WAHNSCHAFFE und LÖSCHER,

1992). Die Tiere wurden einzeln in Makrolonkäfigen vom Typ III gehalten, die

Weichholzgranulat als Einstreu enthielten (Altromin; Firma Altrogge, Lage). Als Futter

diente Altromin 1324 Standarddiät, welches einmal wöchentlich erneuert wurde.

Leitungswasser stand ad libitum zur Verfügung und wurde zweimal in der Woche

erneuert. Die Umsetzung der Ratten in frische Käfige erfolgte in einwöchigem

Abstand. Der Hell-Dunkel-Rhythmus bestand aus einem 12 Std. Zyklus (Sommerzeit:

6:00 Uhr Licht an; 18:00 Uhr Licht aus; Winterzeit: 05:00 Uhr Licht an; 17:00 Uhr

Licht aus). Die Raumtemperatur betrug zirka 22˚ Celsius und die Luftfeuchtigkeit 50-

60 %. Bis zum Versuchsbeginn vergingen 5-8 Tage, in denen sich die Tiere an die

neuen Haltungsbedingungen akklimatisieren konnten. Zum Zeitpunkt der Operation

wogen die Tiere 200-230 g. Die Tiere wurden regelmäßig gehandelt und gewogen,

um sie an diese Prozeduren zu gewöhnen.

4.1.2 Elektrodenimplantation Zu Beginn des Eingriffs wurden die Tiere mit Chloralhydrat (360 mg/kg in 10 ml/kg

Aqua dest.) in Narkose versetzt. Ein Tier (NIH 16) verstarb während der Narkose.

Die Implantation der bipolaren Elektrode, bestehend aus einer Ableit- und einer

Stimulationselektrode aus rostfreiem Stahl mit Teflon-Ummantelung, richtete sich

nach der stereotaktischen Operationstechnik. Um die Elektroden exakt zu

positionieren, wurden die Tiere in einen stereotaktischen Apparat eingespannt (Fa.


34

Kopf, Tujunga, Kalifornien, USA) und der stereotaktische Atlas von PAXINOS und

WATSON (1998) zur Hilfe genommen, welcher die Lokalisation der Hirnstrukturen

relativ zu Bregma (rostraler Kreuzungspunkt der Schädelknochennähte) darstellt. Die

Verwendung des Atlas bedingt, dass Bregma und Lambda (kaudaler

Kreuzungspunkt der Schädelknochennähte) sich auf gleicher Höhe befinden (siehe

Abb. 1). Dafür musste die Oberkieferhalterung des Stereotakten bei Sprague-

Dawley-Ratten auf -3,9 mm ventral der Interaurallinie eingestellt werden. Die

Koordinaten sowie die Einstellung der Oberkieferhalterung für die

Elektrodenpositionierung variiert zwischen den Rattenstämmen (siehe Tabelle 1).

Die angegebenen Koordinaten basieren auf Elektroden-Lokalisation-Versuchen von

U. Ebert und C. Brandt.

Tabelle 1: Koordinaten in mm relativ zu Bregma für die Implantation der Elektrode in

die rechte basolaterale Amygdala.

lateral rostrokaudal ventral

♀ Sprague-Dawley -4,7 -2,2 8,7

Kontralateral zur Elektrodenimplantation in der rechten basolateralen Amygdala

wurde eine indifferente Erdungselektrode, welche über einen Teflon-isolierten Draht

mit einer Messingbuchse verbunden war, mit Hilfe einer Schraube am

Schädelknochen der Tiere montiert. Außerdem wurden zwei zusätzliche Schrauben

am Schädelknochen der Ratten befestigt (Abb. 1), welche die Fixierung des

kaltpolymerisierenden Kunststoffes Paladur® (Kutzer, Weinheim) optimieren sollten.

Um einer möglichen Wundinfektion vorzubeugen, wurde die erste Schicht Paladur®,

welche in direktem Kontakt zum Schädelknochen stand, zusammen mit dem

Antibiotikum Gentamicinsulfat aufgetragen. Zur weitergehenden Prophylaxe einer

Wundinfektion bekamen die Ratten direkt nach der Implantation 20 mg/kg

Gentamicin intramuskulär (i. m.) injiziert. An den beiden darauf folgenden Tagen

wurde Gentamicin einmal täglich subkutan verabreicht. Anschließend wurde für

insgesamt fünf Tage zweimal am Tag je 100 mg/kg Chloramphenicol-Succinat i.m.


35

appliziert. Ein Tier (NIH 12) verstarb während der Antibiose. Nach der Operation

hatten die Tiere ungefähr vier Wochen Zeit, sich zu regenerieren, bevor die

elektrische Stimulation durchgeführt wurde. Neben den Tieren, die durch die

Stimulation einen SE bekommen sollten, wurde auch einer Sham-Gruppe Elektroden

implantiert. Die Tiere dieser Gruppe wurden jedoch nicht elektrisch stimuliert. Eine

weitere Kontrollgruppe wurde zwar in Narkose versetzt und in den Stereotakten

eingespannt, bekam jedoch keine Elektrode eingesetzt.

Abb. 1: Aufsicht auf den Rattenschädel mit Darstellung der Lokalisationen der Stimulations- und Ableitelektrode sowie der Fixationsschrauben (nach PAXINOS und WATSON, 1998; modifiziert von BRANDT, 2002). 4.1.3 Beurteilung der Krampfschwere während des sich selbst erhaltenden Status epilepticus und während spontan wiederkehrender Anfälle Die korrekte Beurteilung der konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfälle während des

SSSE sowie der spontan wiederkehrenden Anfälle erforderte eine standardisierte

Charakterisierung der Anfälle. Für die Bewertung der Krampfschwere kindling-

induzierter Anfälle wurde eine Skala mit den Stadien 0-V aufgestellt (RACINE, 1972).


36

Diese wurde nach LÖSCHER und SCHMIDT (1988) modifiziert. C. BRANDT (2002)

hat in ihrer Doktorarbeit ein weiteres Stadium (VI) definiert (siehe Tabelle 2).

Tabelle 2: Skala der Krampfstadien (RACINE 1972, modifiziert nach LÖSCHER und SCHMIDT 1988) Während des SSSE konnten drei verschiedene Statustypen differenziert werden: Typ

1: rein fokaler, nicht-konvulsiver SSSE, welcher gekennzeichnet ist durch Anfälle des

Stadiums I und II; Typ 2: fokaler SSSE mit ähnlichen Symptomen wie Typ 1, jedoch

unterbrochen von gelegentlichen Anfällen des Stadiums III sowie generalisierten

Anfällen (Stadium IV, V oder VI); Typ 3: rein generalisierte, konvulsive Anfallsaktivität

(Stadium IV, V oder VI) (nach BRANDT et al., 2003).


37

4.1.4 Modell der elektrischen Stimulation der basolateralen Amygdala Vier bis sechs Tage vor der elektrischen Stimulation wurde von 28 Tieren für jeweils

sechs Stunden ein Ruhe-EEG angefertigt um eventuelle Abweichungen vom

Normalzustand feststellen zu können. Die Stimulation der basolateralen Amygdala

zur Induktion eines SSSE begann 26 bis 30 Tage nach Implantation der Elektroden.

Die Tiere wogen initial 220 bis 260 g. Der Versuchsbeginn variierte von 08:30 bis

11:00 Uhr MEZ, da nur zwei Stimulatoren verfügbar waren, so dass lediglich zwei

Ratten zur gleichen Zeit stimuliert werden konnten.

Anfangs wurden die Tiere an ihrem Steckeraufsatz über ein abgeschirmtes,

zweiadriges Kabel mit der Aufzeichnungseinheit (siehe 4.2) verbunden.

Anschließend wurden die Ratten mit einem weiteren abgeschirmten, zweiadrigen

Kabel an die Stimulator-Einheit (Accupulser Modell A310C und Stimulus Isolator

A365, World Precision Instruments, Berlin) angeschlossen. Zur Induktion eines

SSSE wurde Reizstrom verwendet, welcher aus bipolaren Einzelpulsen von je 1 ms

Dauer bestand. In jeder Sekunde wurden zwei Einzelpulsserien mit einer Dauer von

100 ms generiert. Die Frequenz betrug 50 Hz und die Stromstärke 700 μA.

Insgesamt wurden die Tiere über 25 Min. kontinuierlich stimuliert und dabei auf die

Anfallsstärke hin beobachtet (Tab. 2). Die Definition eines Status epilepticus bedingte

eine andauernde motorische Krampfaktivität der Stadien 1-6 und entsprechende

Ausschläge im EEG (mind. 3 Spitzen/Sek. mit einer doppelt hohen Amplitude wie im

Ruhe-EEG). Die Beurteilung der Krampfschwere erfolgte wie in 4.1.3. erläutert. Nur

Ratten mit einem SSSE wurden in den weiteren Versuch integriert. Nach der

Induktion des SE wurden die Ratten für weitere 1 – 2 Std. kontinuierlich und dann nur

noch stündlich für ca. 5 Min beobachtet, um den weiteren Verlauf des SE

dokumentieren zu können. Nach insgesamt 240 Min. wurde der SSSE mit 10-20

mg/kg Diazepam i. p. unterbrochen. Eine SSSE-Dauer von vier Std. wurde als

adäquate Zeitspanne ermittelt, um das Auftreten von spontan wiederkehrenden

Anfällen während der Latenzphase zu gewährleisten (BRANDT et al., 2003). Nach

abgeschlossener Stimulation wurden die Tiere wieder an die Überwachungseinheit

angeschlossen, und die EEG- und Videoaufzeichnungen wurden bis zum nächsten

Morgen fortgeführt.


38

Da die Tiere nach dem SSSE sehr geschwächt waren, wurden die schwächsten

Tiere ab dem zweiten Tag nach der Stimulation für zwei bis drei Tage mit Babybrei

zugefüttert, bis sie wieder selbständig Nahrung aufnehmen konnten.

4.2 Überwachung 4.2.1. Überwachung von spontanen Anfällen im elektrischen Epilepsiemodell In der Latenzphase von der elektrischen Stimulation bis zum Beginn der Selektion

wurden die Tiere regelmäßig gewogen, gehandelt und spontane Anfälle notiert. Nach

ungefähr 3-4 Wochen wurden alle 28 stimulierten Ratten für jeweils acht Std. an das

EEG angeschlossen um zu verifizieren ob bereits paroxysmale Aktivität in Form von

iktalen oder interiktalen Spikes auftrat, welche ein Hinweis auf ein Anfallsgeschehen

darstellen können, und ob die EEGs der Tiere überhaupt verwertbar sind. Zirka 6-7

Wochen nach der Induktion des SSSE wurde mit 20 ausgewählten Tieren eine

längerfristige Frequenzanalyse durchgeführt. Für die Frequenzanalyse wurden die

Tiere für jeweils fünf Tage neun Std. in der Hellphase (08:00-17:00 Uhr MEZ) mittels

EEG und Video überwacht. In Abhängigkeit vom SSSE-Typ (möglichst Typ 3 oder

Typ 2 mit häufigen generalisierten Anfällen), dem Auftreten von spontanen Anfällen

in der Latenzphase sowie der Präsenz von interiktalen Spikes im EEG während der

Frequenzanalyse wurden 15 Tiere für die Selektionsphase ausgewählt.

Während der Behandlungs- und Kontrollphasen wurden die Ratten systematisch auf

spontan wiederkehrende Anfälle mittels einer kontinuierlichen (24 Std./Tag, 7

Tage/Woche) EEG- und Videoaufzeichung überwacht. Tiere, die ihren

Steckeraufsatz im chronischen Versuch verloren, konnten ausschließlich

videoüberwacht werden.

4.2.1.1 Kontinuierliche Überwachung mittels EEG-Ableitung Zur dauerhaften Ableitung eines EEG wurde eine Einheit, bestehend aus einem

Acht-Kanal-Verstärker (CyberAmp 380, Axon Instruments, Inc. Foster City, CA)

beziehungsweise einem acht Ein-Kanal-Verstärker (BioAmps, ADInstruments Ltd,

Hastings, UK), zwei Analog-Digitalwandlern (PowerLab/800s, ADInstruments Ltd.

Hastings, East Sussex, UK) und einem Personal Computer mit der Software Chart4


39

für Windows verwendet. Der Verstärker amplifizierte das EEG-Signal um das 100

fache. Insgesamt wurde ein Bereich von +/- 500 mV erfasst. Aufgezeichnet wurde mit

einer Abtastrate von 200 Hz. Sämtliche Frequenzen über 60 Hz wurden durch einen

„low pass Filter“, alle Frequenzen unter 0,1 Hz von einem „High pass filter“ eliminiert.

Unter zur Hilfenahme eines Notch-Filters wurde eine schmales Frequenzband um die

50 Hz (Netzstromfrequenz) herausgefiltert, damit die Aufnahme nach Möglichkeit

störungsfrei war. Die Kabel, welche zur Ableitung des EEG verwendet wurden,

mussten selbst angefertigt werden, da im Handel keine Kabel erhältlich sind, die den

Tieren einen optimalen Bewegungsfreiraum gewährleisten und zudem eine

störungsfreie Aufnahme ermöglichen. Deshalb wurden abgeschirmte, zweiadrige,

ummantelte Kabel benutzt, welche mit einem Telefonentzwirler verbunden wurden.

Die Kabelabschirmung wurde mittels einer Krokodilklemme am Verstärker montiert

um das Grundrauschen möglichst niedrig zu halten.

Die EEGs wurden visuell analysiert. Das System erlaubte eine parallele

Aufzeichnung von 16 Tieren.

4.2.1.2 Kontinuierliche Überwachung mittels Videoaufzeichnung Da die Ratten im chronischen Versuch Gefahr laufen, ihren Steckeraufsatz zu

verlieren, ist es notwendig, die EEG-Ableitungen durch Videoaufzeichnungen zu

ergänzen und notfalls zu kompensieren. Außerdem kann nur durch die

Videoüberwachung der genaue Anfallstyp detektiert werden, da sich fokale und

generalisierte Anfälle im EEG oft ähneln. Im vorliegenden Versuch kamen infrarot-

sensitive CCD-Kamera-Module für Schwarz-Weiß-Aufnahmen zum Einsatz (Conrad

Electronic GmbH, Hannover). Insgesamt standen vier Kameras zur Verfügung,

welche jeweils vier Tiere gleichzeitig erfassen konnten. Das erlaubte eine simultane

Überwachung von maximal 16 Tieren. Die Kameras waren mit einem Multiplexer

(Monacor TVMP-400, Menzel Electronic, Hannover), einem Langzeitvideorekorder

(Sanyo RS232C, Menzel Electronic, Hannover) und einem Fernsehapparat

verbunden. Für die Aufzeichnungen wurden Videobänder mit einer Lauflänge von

240 Min. verwendet. Die Aufnahmen erfolgten in vierfach erhöhter Geschwindigkeit,

so dass eine Zeitspanne von maximal 12 Std. aufgezeichnet werden konnte. Die


40

Tiere befanden sich in umgewandelten Aquarien (60 cm x 40 cm x 40 cm), die

rundherum transparent waren und Luftlöcher aufwiesen. Diese Aquarien wurden in

der Mitte mit einer Spanplatte geteilt und stellten so Platz für jeweils zwei Ratten zur

Verfügung. Für die Nachtaufnahmen befanden sich Infrarotlampen über den Käfigen

(Conrad Electronic GmbH, Hannover). Die im EEG ermittelten Anfälle wurden in der

entsprechenden Videosequenz ausgewertet. Bei Kabeldefekten und Verlust des

Steckeraufsatzes wurde das Video komplett analysiert. Die Auswertung der im

Langzeit-Modus aufgenommenen Kassetten am Videorekorder geschah in

Normalgeschwindigkeit. Dadurch ergab sich eine vierfach erhöhte

Abspielgeschwindigkeit. Für die genaue Klassifizierung der Anfallsparameter

Schweregrad, Dauer und Zeitpunkt wurde der Vorlauf manuell geregelt.

4.3 Pharmakologische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell Die pharmakologischen Untersuchungen begannen mit einer Selektionsphase. Dafür

wurden 15 Ratten mit spontan wiederkehrenden Anfällen in die

Überwachungsanlage verbracht. Ein Tier mit einer besonders hohen Anfallsfrequenz

(NIH 9) war aufgrund seiner hohen Aggression nicht zu handeln und musste noch

vor Versuchsbeginn euthanasiert werden. Für den genauen Versuchsablauf siehe

Abb. 2. Während der Substanzphasen (Phenobarbital und Phenytoin) wurde den

Sham-Tieren (n=7), den naiven Kontrollen (n=10) sowie den SE-Tieren, die nicht an

der Selektion teilnahmen (n=6), das äquivalente Volumen 0.9 % ige

Natriumchloridlösung injiziert. Während der Vehikelphase 1 wurde auch den

Selektionstieren 0.9 % ige Natriumchloridlösung als Vehikel appliziert. In den

anderen beiden Vehikelphasen wurde jedoch darauf verzichtet, da die Tiere durch

die kontinuierlichen Applikationen leichte Nekrosen in der Bauchregion aufwiesen.


41

Abb. 2: Versuchsplan A) Selektionsphase

Induktion Status

epilepticus spontan wieder-

kehrende Anfälle

Vehikel- phase 1

Vehikel- phase 2

Pheno- barbital

Pheny- toin

Vehikel- phase 3 Implantation

der Elektroden

4 Wochen 14.5 Tage 14.5 Tage 23 Tage 15.5 Tage 13.5 Tage 9 Wochen

EEG/Video-Überwachung 24 Std./Tag, 7 Tage/Woche

B) Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar in Phenobarbital-Nonrespondern

5.5 Tage 8 Tage 7.5 Tage 8 Tage 8 Tage 7 Tage 7 Tage 7 Tage

Video-Überwachung 24 Std./Tag, 7 Tage/Woche

Pheno-barbital + Tariquidar (20 mg/kg)

Kontroll- phase 1


Pheno-barbital

ohne Tariquidar

Kontroll- phase 2


Kontroll- phase 3

Tariquidar ohne

Pheno-barbital

X X X

X X X X X X

X = Blutentnahmen für Plasmaanalyse

X X X X


42

4.3.1 Phenobarbital-Applikation für chronische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell Die therapeutische Plasmakonzentration für Phenobarbital liegt bei epileptischen

Patienten im Bereich von 10-40 μg/ml (BAULAC, 2002). Aus diesem Grund wurde

ein Dosierungsschema gewählt, welches die Erhaltung eines Plasmaspiegels

innerhalb dieser Grenzen bei Ratten erlaubt (BRANDT et al., 2004). Phenobarbital

wurde in 0.9 % Natriumchlorid gelöst und in einem Volumen von 3 ml/kg appliziert.

Die Injektionen wurden in einem zeitlichen Abstand von 10 bzw. 14 Std. (08:00 Uhr

und 18:00 Uhr MEZ) gesetzt. Die Kontrollen erhielten 0.9 %ige Natriumchloridlösung.

Das Applikationsschema war folgendes:

1. Tag 08:00 Uhr: Bolus 25 mg/kg Phenobarbital i. p.

1. Tag 18:00 Uhr: 15 mg/kg Phenobarbital i. p.

2. – 14.5 Tag 08:00 Uhr und 18:00 Uhr: jeweils 15 mg/kg Phenobarbital i. p.

4.3.2 Phenytoin-Applikation für chronische Untersuchungen Post-Status epilepticus-Modell Für Phenytoin liegt die therapeutische Plasmakonzentration bei epileptischen

Patienten bei 10-20 μg/ml (HVIDBERG, 1985; KUTT und HARDEN, 1999). Phenytoin

wurde in 0.9 %igem Natriumchlorid gelöst und dabei auf dem Heizrührer bis maximal

50° C erwärmt. Unter langsamem Rühren wurde 1 M NaOH dazugeben bis der pH-

Wert bei ungefähr 11,5 lag. Dieser basische pH-Wert ist unerlässlich, damit die

Substanz gelöst bleibt. Die Lösung wurde schnellstmöglich injiziert, da beim

Abkühlen die Gefahr besteht, dass Phenytoin ausfällt. Phenytoin wurde i. p. in einem

Volumen von 3 ml/kg verabreicht. Die Injektionen erfolgten in einem Abstand von 12

Std. (07:00 Uhr und 19:00 Uhr MEZ). Die Kontrollen erhielten 0.9 % ige

Natriumchloridlösung. Zur Ermittlung des optimalen Dosierungsschemas für

Phenytoin wurden mehrere Vorversuche an nicht epileptischen Tieren unternommen:

1. Vorversuch (n=2): 1. Tag: 07:00 Uhr: Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab

2. Tag: 07:00 Uhr und 19:00 Uhr: je 50 mg/kg Phenytoin– toxisch nach 4 Tagen (Seitenlage der Tiere; Plasmakonzentration 50-80 μg/ml)


43

2. Vorversuch (n=2): kein Bolus; ab Tag 1: 07:00 Uhr und 19:00 Uhr je 50 mg/kg

Phenytoin – toxisch nach 4 Tagen (Seitenlage der Tiere, Plasmakonzentration bei 40 μg/ml) 3. Vorversuch (n=1): 1. Tag: 07:00 Uhr: Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab

2. Tag: 07:00 Uhr: 40 mg/kg Phenytoin; 19:00 Uhr: 20 mg/kg Phenytoin –

Plasmakonzentration nach 5 Tagen zu gering (< 10 μg/ml) 4. Vorversuch (n=2): 1. Tag: 07:00 Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab 2.

Tag: 07:00 Uhr und 19:00 Uhr: je 35 mg/kg Phenytoin – Plasmakonzentration bei einem Tier nach 8 Tagen zu gering (< 10 μg/ml) 5. Vorversuch (n=1): 1. Tag: 07:00 Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab 2.

Tag: 07:00 Uhr und 19:00 Uhr: je 25 mg/kg Phenytoin – Plasmakonzentration nach 5 Tagen zu gering (< 10 μg/ml) 6. Vorversuch (n=8): 1. Tag: 07:00 Uhr Bolusinjektion von 75 mg/kg Phenytoin; ab 2. Tag: 07:00 Uhr: 50 mg/kg Phenytoin; 19:00: 25 mg/kg Phenytoin – Plasmakonzentrationen auch nach 5-8 Tagen noch im gewünschten Bereich (10-20 μg/ml) Beim Übertragen des Dosierungsschemas aus dem 6. Vorversuch auf die

epileptischen Tiere zeigten sich ab dem 2. Behandlungstag unerwartet gravierende

Nebenwirkungen (starke Sedation und Ataxie, prokonvulsive Effekte). Deshalb

wurden die Ratten ab dem 2. Tag zirka 30 Min. vor der Applikation auf

Nebenwirkungen beobachtet und in Abhängigkeit vom jeweiligen Befinden individuell

dosiert (Tab. 3).


44

Tab. 3: Individuelle Tagesdosis Phenytoin für jedes epileptische Tier über 15 Behandlungstage in mg/kg Vor dem Schrägstrich ist die jeweilige Morgendosis angegeben und hinter dem Schrägstrich die jeweilige Abenddosis

Phenytoin-Responder Phenytoin-Nonresponder Tag NIH 4 NIH 7 NIH 10 NIH 18 NIH 21 NIH 25 NIH 6 NIH 8 NIH 13 NIH 14 NIH 17 NIH 23 NIH 24 NIH 31 NIH 11

1 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 75/0 2 50/0 50/0 50/0 50/25 50/0 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/0 50/25 50/0 50/25 3 25/25 12,5/12,5 25/12,5 50/25 25/25 50/12,5 50/12,5 50/25 50/12,5 50/12,5 50/25 50/25 50/25 12,5/25 50/25 4 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 25/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 5 50/25 25/25 50/25 50/25 25/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 25/25 50/25 25/25 50/25 6 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 7 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 50/25 8 50/35 50/35 50/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 9 50/35 50/35 50/35 50/50 50/0 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 10 50/35 50/35 50/35 50/50 50/25 50/25 50/0 50/35 50/25 50/35 50/35 50/12,5 50/35 50/12,5 50/35 11 50/35 50/35 50/35 50/50 50/35 50/35 50/50 50/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/0 50/35 12 50/35 50/35 35/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/25 50/35 0 50/35 13 50/35 50/35 50/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/25 50/35 25/35 50/35 14 50/35 35/35 50/35 50/50 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 50/35 15 50/35 50/25 50/35 50/50 50/35 50/25 50/25 50/35 50/35 50/35 50/35 50/25 50/35 50/35 50/25


45

4.3.3 Selektion von Respondern und Nonrespondern Für die anschließende Kombinationsstudie wurden die Versuchstiere anhand der

EEG- und Videoauswertungen in pharmakoresistente (Nonresponder) und

pharmakosensitive (Responder) Tiere unterteilt. Der Definition eines Responders

wurde dann entsprochen, wenn die Anfälle während der Behandlungsphase im

Vergleich mit der ersten Vehikelphase entweder komplett oder um mindestens 50 %

reduziert werden konnten. Nonresponder zeigten entsprechend überhaupt keine

Verminderung ihrer Anfallsfrequenz oder lediglich eine Reduktion um < 50 %

(BRANDT et al., 2004). Da die Auswertungen der EEG- und Videoaufzeichnungen

sehr zeitintensiv sind, wurden nur die Nonresponder aus der Phenobarbitalphase

(n=6) in die Kombinationsstudie übernommen. Die Analyse der Phenytoinphase

folgte später.

4.3.4 Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar (XR 9576) bei Phenobarbital-Nonrespondern Die Kombinationsstudie startete etwa zwei Monate nach Beendigung der

Selektionsphase. Diese Zeitspanne war nötig, um das Video- und EEG-Material

auszuwerten. Im Kombinationsmodell von Phenobarbital und dem P-gp-Inhibitor

Tariquidar wurde für Phenobarbital dieselbe Dosierung verwendet wie unter 4.3.3

beschrieben. Tariquidar wurde in 2,5 % Dextroselösung (mit Aqua dest.) unter

leichter Erwärmung auf dem Heizrührer gelöst. Aufgrund der besseren Verträglichkeit

wurde die Applikationsroute für Tariquidar nach 5 Behandlungstagen von i. p. auf

peroral mittels Metallsonden für eine intragastrale Applikation umgestellt. In

klinischen Studien wurden Probanden ebenfalls orale Kapseln verabreicht

(STEWART et al., 2000). Die orale Bioverfügbarkeit von XR 9576 liegt für Mäuse bei

80 % und ist bei Ratten bislang unbekannt (John Waterfall, Xenova Group,

persönliche Mitteilung). Das Dosierungsvolumen lag bei 3 ml/kg. Tariquidar wurde in

Dosierungen von 10, 15 und 20 mg/kg (siehe Versuchsplan B Abb. 2) 45 Min. vor

Phenobarbital verabreicht.

Die Behandlungsdauer betrug während der Gabe von 20 mg/kg Tariquidar und

Phenobarbital bei 5,5 Tage und während der darauf folgenden Versuche 7-8 Tage,


46

da die Verfügbarkeit von Tariquidar begrenzt war und möglichst viele

unterschiedliche Dosierungen getestet werden sollten. Weiterhin war die Frequenz

der spontan wiederkehrenden Anfälle bei den Phenobarbital-Nonrespondern hoch

genug, um eine Aussage über die Behandlungseffizienz während einwöchiger

Versuche zu treffen. Jeweils 10 Std. nach der ersten und nach der letzten Injektion

wurde Blut entnommen, um die Plasmakonzentration von Phenobarbital zu

bestimmen.

4.3.5 Blutentnahme Zur Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Phenobarbital und Phenytoin

wurde den Versuchstieren zu bestimmten Zeitpunkten (siehe Abb. 2) Blut aus dem

retrobulbären Venenplexus entnommen. Dazu wurden die Augen der Ratten kurz vor

der Entnahme mit 2 % iger Tetracainlösung lokal anästhesiert. Zum Blutabnehmen

wurden die Tiere fixiert und eine heparinisierte Hämatokritkapillare am

Augeninnenrand bis zum Venenplexus vorgeschoben. Der Plexus wurde punktiert

und ungefähr 0.5 ml Blut in Eppendorfgefäßen, welche jeweils 10 μl EDTA

(Ethylendiamintetraacetat) zur Hemmung der Blutgerinnung enthielten, aufgefangen.

Die Blutung wurde durch Kompression mit Eisbeuteln zum Stillstand gebracht. Das

gewonnene Blut wurde bei 12.000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert.

Anschließend wurde das Plasma im Überstand abpippetiert und bis zur Analyse bei

-20˚ Celsius aufbewahrt. Die Detektion der Plasmakonzentration erfolgte mittels

HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) mit Ultraviolett-Nachweis. Die HPLC-

Bestimmung von Phenobarbital und Phenytoin erfolgte nach der bei POTSCHKA et

al. (2002) beschriebenen Methode.

4. 4 Histologie 4.4.1 Fixierung Der Nachweis einer veränderten Expression von GABAA-Rezeptoruntereinheiten

erforderte eine Perfusion aller Tiergruppen aus dem Selektionsmodell. Zu Beginn der

Perfusionsfixierung wurden sämtliche Ratten mit 500 mg/kg Chloralhydrat in eine

tiefe Narkose versetzt. Die Perfusionmethode bedient sich des natürlichen


47

Gefäßsystems des Körpers. Zunächst wurde eine Knopfkanüle durch den linken

Herzventrikel bis in die Aorta vorgeschoben. Danach wurde der rechte Herzvorhof

eröffnet, um den Abfluss von Perfusionslösung und Blut zu ermöglichen. Der

konstante Perfusionsdruck wurde durch die Position der Flaschen mit der

Perfusionslösung gewährleistet und entsprach ungefähr dem Blutdruck des Tieres.

Zuerst wurde der Blutkreislauf der Tiere mit 0,01 M phosphatgepufferter 0,9 % iger

Kochsalzlösung (pH 7,6) gespült. Anschließend wurden die Ratten mit maximal 500

ml Fixans perfundiert. Die Fixationslösung bestand aus 4 % Paraformaldehyd sowie

15 % gesättigter Pikrinsäure-Lösung in 0,15 M Phosphatpuffer (pH 7,4) und besaß

eine Temperatur von 4˚ Celsius (SOMOGYI und TAGAKI, 1982). Die Fixierung mit

Paraformaldehyd denaturiert die Epitope der Proteine weniger stark als eine

Formalinfixierung. Die Verwendung von Pikrinsäure erleichtert die Penetration der

Antikörper. Die Gehirne wurden sofort nach der Perfusion entnommen und für 90

Min. in eiskalter Fixans nachfixiert. Um einen ausreichenden Gefrierschutz zu

erreichen, wurde das Gewebe über Nacht in 10 % Zuckerlösung gelagert und am

folgenden Tag in 30 % Zuckerlösung überführt, bis die Gehirne auf den Boden der

Gefäße sanken (24-48 Std.).

4.4.2 Gefrierschnitte

Nach der Perfusion wurden von den Gehirnen Gefrierschnitte am Gefriermikrotom

(Frigomobil CM1325, Leica) angefertigt. Die Schnittdicke betrug 40 μm, und es

wurden insgesamt sechs Serien erstellt, sodass die Schnitte innerhalb einer Serie

einen Abstand von 240 μm innehatten. Die Gehirne wurden in einem Bereich von 1,6

mm anterior bis -6,04 mm posterior relativ zu Bregma geschnitten und in 0,1 M

Phosphatbuffer überführt.

4.4.3 Immunperoxidasefärbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten 4.4.3.1 Antikörper Aus den 19 bekannten Untereinheiten des GABAA-Rezeptors (BARNARD, 2000;

KORPI et al., 2002) wurden folgende 6 Untereinheiten ausgewählt, für welche


48

Antikörper zur Verfügung standen und die beim Epilepsiegeschehen eine Rolle

spielen könnten: α1-5, β2/3, δ und γ2.

Zum Nachweis der verschiedenen Untereinheiten wurden monoklonale, identische

Antikörper aus Meerschweinchen, Kaninchen und Maus verwendet, welche aus B-

Zellklonen gewonnen werden und die sich gegenüber den aus B-Lymphozyten

generierten polyklonalen Antikörpern durch eine hohe Spezifität kennzeichnen. Der

Nachteil bei der Verwendung von monoklonalen Antikörpern besteht darin, dass kein

Nachweis mehr möglich ist, wenn das Epitop beispielsweise durch die Fixierung

beschädigt wurde, wohingegen polyklonale Antikörper an verschiedene

Bindungsstellen andocken können (BOENISCH, 2003).

4.4.3.2 Farbreaktion (DAB-ABC-Methode) Bei der DAB-ABC (Avidin-Biotin-Complex)- Methode werden immunenzymatische

Enzym-Substratreaktion genutzt, um farblose Chromogene (DAB;

3,3´Diaminobenzidin) in gefärbte Endprodukte umzuwandeln. Die verwendete

Färbemethode basiert auf der hohen Affinität von Streptavidin (Streptomyces avidinii)

zu dem Hühnereiweiß Biotin (HSU et al., 1981). Dabei bindet ein spezifischer

Primärantikörper an einen biotinylierten Sekundärantikörper gegen Immunglobuline

derjenigen Art, aus welcher der Primärantikörper gewonnen wurde. Ein Komplex,

bestehend aus Streptavidin und Meerrettichperoxidase bindet dann an das Biotin.

Beim eigentlichen Färbevorgang transferiert die Meerrettichperoxidase

Wasserstoffionen aus dem DAB auf Wasserstoffperoxid unter der Bildung von

Wasser. Das DAB fällt dabei unter Bildung einer bräunlichen Färbung aus.

Eine Abschwächung der unerwünschten Hintergrundfärbung wurde durch die

Zugabe von Rattenserum zur Primärantikörperlösung erreicht, da das Rattenserum

unspezifische Bindungsstellen blockiert.

4.4.4 Standardprotokoll für die Färbung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten Zur Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten wurde ein in der Arbeitsgruppe von

Prof. J.M. Fritschy etabliertes Protokoll verwendet (FRITSCHY und MÖHLER, 1995).

Zur Analyse der regionalen Verteilung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten im


49

Hippocampus wurden je sechs Schnitte pro Tier und pro Antikörper aus

verschiedenen Hirnregionen verwendet. Um Artefakte zu vermeiden, wurden für

jeden Antikörper die zu untersuchenden Gruppen (Responder, Nonresponder, Sham,

Kontrollen) gemeinsam in einem Durchgang gefärbt und die einzelnen Gruppen

dabei in den verschiedenen Wellplatten so verteilt, dass sich in einer Wellplatte

immer mehrere Gruppen befanden. Die frei flotierenden Schnitte wurden über Nacht

bei 4˚ Celsius auf dem Rüttler mit dem Primärantikörper inkubiert (je zwei Schnitte

pro well). Der Primärantikörper wurde in Trisgepufferter Saline (pH 7.4), bestehend

aus 2 % des Serums, aus welchem der Sekundärantikörper stammt, 0,2 % Triton X-

100 und 2 % Rattenserum, versetzt. Die Antikörper wurden wie folgt verdünnt: α1:

1:20.000; α2: 1:750; α3: 1:4000; α4: 1:2000; α5: 1:3000; β2/3: 1:20.000; δ: 1: 2000;

γ2: 1:2000. Am zweiten Tag wurden die Schnitte dreimal in Tris-Triton gewaschen,

bevor sie mit dem biotinyliertem Sekundärantikörper (1:300 in Tris-Triton, pH 7.4 und

2 % normalem Serum aus der Ziege) inkubiert wurden. Alle Sekundärantikörper

stammten aus der Ziege (α1, α4, δ: Ziege-anti Kaninchen Antiserum; α2, α3, α5, γ2:

Ziege-anti Meerschweinchen Antiserum; β2/3: Ziege-anti Maus Antiserum).

Anschließend wurden die Schnitte für 30 Min. im Sekundärantikörper auf dem Rüttler

inkubiert bevor sie erneut dreimalig mit Tris-Triton gespült wurden. Danach wurden

die Schnitte für 30 Min. in Avidin-Peroxidase-Lösung (ABC-Lösung: Elite ABC kit,

Vector Laboratories: 1 % Reagenz A und 1 % Reagenz B in Tris-Triton, pH 7.4)

transferiert. Mittels eines weiteren Spülganges wurde überschüssige Lösung entfernt

und die Schnitte wurden vor dem eigentlichen Färbeschritt für 5-10 Min. in der Hälfte

der DAB-Lösung (verdünnt in Tris-Triton, pH 7.7: 1 ml DAB in 50 ml Triton)

vorinkubiert. Die Färbereaktion wurde gestartet, indem die andere Hälfte der DAB-

Lösung zusammen mit 0,03 % H202 dazupipettiert wurde. In Abhängigkeit von der

Färbeintensität wurde die Färbung der Schnitte nach 5-10 Min. durch einen Transfer

in eiskalte PBS (4˚ Celsius) beendet. Abschließend wurden die Schnitte gründlich

vom DAB gereinigt, auf Gelatine-bezogene Objektträger aufgezogen und über Nacht

an der Luft getrocknet. Am darauf folgenden Tag wurden die Schnitte in einer

aufsteigenden Ethanol- (70 %, 70 %, 96 %, 96 %, 100 %, 100 %, 100 % je 5 Min.)

und Xylolreihe (viermal je 5 Min.) dehydriert und mit Eukitt eingedeckt.


50

In Kontrollversuchen wurde keine spezifische Färbung bezüglich der Prä-Absorption

der primären Antikörper mit ihrem jeweiligen Antigen detektiert.

Bei Messungen der optischen Dichte wäre es optimal, für jede Untereinheit den

Hintergrund in der weißen Substanz zu messen, das heißt, in einer Region, in

welcher die jeweilige Untereinheit nicht oder kaum exprimiert wird. In

Sagittalschnitten ist dies relativ einfach durchzuführen. Bei Koronalschnitten, wie im

vorliegenden Versuch verwendet, im Bereich des Hippocampus, gibt es solche

Regionen jedoch kaum. Eine weitere Lösung wäre die Subtraktion des Hintergrunds

im Corpus Callosum, jedoch ergibt sich dadurch kein Unterschied bei den

Ergebnissen, da die weiße Substanz leicht angefärbt wird. Eine dritte Möglichkeit der

Normalisierung der Intensität bestünde in der Messung einer Region, welche durch

das Epilepsiegeschehen keine Änderungen aufweist. Wiederum existieren solche

Regionen in Koronalschnitten kaum (persönliche Kommunikation Prof. Fritschy,

Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Uni Zürich). Aus diesen Gründen wurde

kein Referenzwert von den ermittelten Dichtedaten abgezogen.

4.5 Auswertung 4.5.1 Optische Dichtemessung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten Die Analyse der optischen Dichte der GABAA-Rezeptoruntereinheiten erfolgte mittels

eines computerbasierten Bildanalysesystems bestehend aus einem Axioskop-

Mikroskop mit einer Plan-Neofluar Linse (Zeiss, Deutschland), einer digitalen

Farbkamera (CCD, Axiocam, Zeiss, Göttingen, Hallbergmoos, Deutschland) sowie

einem Computer mit einem Pentium III-Rechenprozessor, welcher mit einem

Bildgrabber ausgestattet war (V7-Mirage, Spea, USA). Als Bildanalysesoftware

diente das Programm KS400 (Windows Release 3.0, Carl Zeiss Vision). Die

Gehirnschnitte wurden bei 400 facher Vergrößerung ipsi- und contralateral zur

Elektrode ausgewertet. Es wurde lediglich eine Region untersucht, welche den

Bereich von Bregma -3.80 mm bis -5.60 mm) umfasste, da die Anzahl der Schnitte

begrenzt war. Die optische Dichtemessung erfolgte in verschiedenen hippocampalen

Subregionen: dentater Hilus, Gyrus dentatus (Körnerzellschicht und

Molekularschicht), CA1, CA2 (nur α5) und CA3 des Ammonshorns. Für die CA1,


51

CA2 und CA3 wurden das Stratum pyramidale und Teile des Str. oriens und Str.

radiatum ausgewertet. Die Messung wurde dabei in Feldern von je 38.321,06 μm2

vorgenommen. Die Anzahl der Felder war abhängig von der Größe der untersuchten

Region: CA1, CA3: je 5 Felder; CA2, Hilus: je 3 Felder; DG: 10 Felder). Die

Pixelgröße lag bei 1300x1030 Pixel. Die Auswertung ist dem System für die

Detektion des Proteins Fos in Gehirnschnitten (RIEUX et al., 2002) angelehnt, bei

welchem Grauwerte erfasst und in optische Dichte umgerechnet werden.

Die optische Dichte wurde im vorliegenden Fall jedoch direkt gemessen, indem das

System mit einem Standard kalibriert wurde (Calibration of Step Tablet No.

507ST101, Eastman Kodak Company, USA). Mittels diesen Standards war es

möglich, die Beleuchtungsstärke des Mikroskops zu überprüfen und konstant zu

halten. Durch eine sogenannte „Shading correction“ konnten die eingelesenen Bilder

auf optische Distorsion korrigiert und Unregelmäßigkeiten der Helligkeit ausgeglichen

werden. Für letzteres wurde ein Bild eines freien Bereiches des Objektträgers

(Hellfeld-Hintergrund) eingelesen und von den gemessenen Bildern subtrahiert. Die

Unterscheidung des positiven Signals der GABAA-Rezeptoruntereinheit vom

Hintergrundsignal erforderte die Festlegung einer Schwelle. Die Schwelle war immer

gleich und so festgelegt, dass sie den kompletten messbaren Bereich erfasste (L 0;

C 127; H 255). In die Auswertung wurden nur diejenigen Pixel einbezogen, welche

eine optische Dichte über dem Schwellenwert aufwiesen. Bildanalysesysteme mit

gleich bleibender Schwelle zeigen, dass sie objektiv sind und vergleichbare

Ergebnisse liefern, vorausgesetzt, das Hintergrundsignal schwankt um nicht mehr als

3 % (RIEUX et al., 2002; WILLEMSE et al., 1994). Die Variation des

Hintergrundsignals sollte möglichst gering gehalten werden, weshalb alle Schnitte

einer Messreihe gleichbehandelt wurden.

4.6 Statistik Die statistischen Auswertungen wurden mit dem Programm Graph Pad Prism 4

(Graph Pad Software, Inc.) vorgenommen. Detailliertere Angaben zu den

statistischen Verfahren sind bei den entsprechenden Stellen im Ergebnisteil zu

finden.


52

Zunächst wurde mit dem D´Agostino und Pearson omnibus Normalitätstest verifiziert,

ob eine Normalverteilung nach Gauß gegeben ist.

Die Daten wurden prinzipiell als Mittelwert und dazugehöriger SEM (standard error of

the mean, Mittelwertsfehler, Standardfehler) angegeben. Bei nicht normalverteilten

Daten wurde der Median berechnet. Bei parametrischen Daten wurde für den

Vergleich zweier Stichproben der Student`s t-Test verwendet. Waren die Stichproben

außerdem verbunden, wurde ein gepaarter t-Test angewendet.

Sollten drei oder mehr Stichproben verglichen werden, wurde mit einer einfaktoriellen

Varianzanalyse (One-way ANOVA) gerechnet. Bei Normalverteilung wurde ein post

hoc Bonferroni`s t-Test angeschlossen. Lagen nicht-parametrische Daten vor, z B bei

kleinen Gruppengrößen (n< 5), wurde für unverbundene Stichproben ein Mann-

Whitney U-Test durchgeführt. Bei mehr als zwei nicht-parametrischen Datensets

wurde für verbundene Stichproben eine ANOVA (Friedman-Test) mit einem

anschließenden Wilcoxon post hoc-Test durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde

auf p< 0,05 festgelegt. Die statistischen Tests wurden in der Regel zweiseitig

durchgeführt, außer wenn basierend auf der Arbeitshypothese und der gängigen

Literatur nur Datenveränderungen in eine Richtung anzunehmen waren.


53

4.7 Geräte- und Chemikalienlisten 4.7.1 Geräte für die EEG- und Videoüberwachung

Geräte Typ-Bezeichung Bezugsquelle

Stabilisierende

Netzgeräte

2224.0 Statron Gerätetechnik

GmbH, Fürstenwalde

8-Kanal Verstärker Cyper Amp 380

Bio Amp

Axon Instruments,

Inc. Foster City, CA,

USA

Digitalwandler PowerLab/800S

Programm: Chart4 for Windows

AD Instruments Ltd,

Hastings, East Sussex,

UK

Multiplexer Monacor TVMP-400 B/W Elektronik Menzel,

Hannover

Personal Computer Intel-Pentium IV-Prozessor mit 1000

MHz

256 MB Arbeitsspeicher

40 GB SCSI-Festplatte

Betriebssystem Windows XP

Dell, Deutschland

Kamera CCD-Kamera-Modul für Schwarz-

Weiß-Aufnahmen

Conrad Electronic

GmbH, Hannover

Infrarotstrahler Conrad Electronic

GmbH, Hannover

Langzeit-

videorekorder

SANYO RS232C/RS485 Control Elektronik Menzel

Hannover


54

Fernseher JVC AV14BM8ENS

Sharp TV 37EM-33S

Makro Markt Hannover

Videokassetten Kodak HS E-240 Aldi, Hannover

EEG-Kabel Kabelentzwirler einschließlich:

Anschlußkabel/

Westernbuchse

2adriges, abgeschirmtes,

ummanteltes Kabel

BNC-Stecker

Krokodilklemmen

Binder-Stecker

Elektronik Menzel,

Hannover


55

4.7.2 Chemikalienliste

Substanz Bezugsquelle

Chloralhydrat E. Merck AG, Darmstadt

Chloramphenicol Succinate Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

3`3 Diaminobenzidin Sigma, St Louis, MO

Diazepam (Diazepam-Ratiopharm®) Ratiopharm, Ulm

EDTA (Ethylendiamintetraacetat) E. Merck, Darmstadt

Ethacridinlactat (Rivanol®) Chinosol, Hannover

Ethanol (70%, 96%, 100%) Fluka, Seelze

Eukitt Erne Chemie, Dällikon, Schweiz

Gentamicin (Friseo-Gent®) Essex Tierarznei, München

Normales Ziegenserum Serotec, UK

Paraformaldehyd Riedel de Häen, Hannover

Phenobarbital Serva, Heidelberg

Phenytoin (Diphenylhydantoin) Aldrich-Chemie, Steinheim

Pikrinsäure Sigma-Aldrich Chemie GmbH, München

Kaninchen-Antikörper α1 Institut für Pharmakologie und

Toxikologie, Universität Zürich

Kaninchen-Antikörper α4 W. Sieghart, Wien

Kaninchen-Antikörper δ W. Sieghart, Wien

Maus-Antikörper β2/3 Chemikon, Hofheim


56

Meerschweinchen-Antikörper α2 Institut für Pharmakologie und






Meerschweinchen-Antikörper γ2 Institut für Pharmakologie und


Rattenserum Serotec, UK

Salzsäure (HCl) Fluka, Seelze

Sekundärantikörper (biotinyliert) aus der

Ziege (anti Kaninchen, Maus oder

Meerschweinchen)

Jackson Immunoresearch, West Grove,

PA

Tariquidar Xenova group, UK

Tetracain CAELO Caesar & Lorenz

Triton Fluka, Seelze

Vectastain Elite kit standard Vector Laboratories

Wasserstoffperoxid Fluka, Seelze

Xylene Fluka, Seelze

Ergebnisse

57

5 Ergebnisse

5.1 Elektrisches Post-Status epilepticus-Modell 5.1.1 Status epilepticus während Dauerstimulation der basolateralen Amygdala Von den insgesamt 22 stimulierten Tieren entwickelten 18 % (n=4) einen rein

generalisierten SSSE (Typ 3). 73 % (n=16) zeigten fokale und generalisierte Anfälle

(Typ 2) und 9 % (n=2) bekamen keinen SSSE. Rein fokale SSSE (Typ 1) wurden

nicht detektiert. Es konnte keine Mortalität verzeichnet werden.

5.1.2 Spontane Anfälle nach Status epilepticus Die beobachteten spontan wiederkehrenden Anfälle waren überwiegend komplex-

fokal, d. h. die Anfälle begannen fokal und generalisierten sekundär, einhergehend

mit einem Bewusstseinsverlust der Tiere. Fokale und generalisierte Anfälle

unterschieden sich nicht im EEG, weshalb die EEG-Aufzeichnungen in der

entsprechenden Videosequenz überprüft werden mussten. Ein Tier mit einer

besonders hohen Anfallsfrequenz (NIH 18) zeigte ein abweichendes EEG-Muster mit

geringerer Amplitude und Frequenz als bei den übrigen Ratten (siehe 5.1.3.). Von

den insgesamt fünfzehn überwachten Tieren zeigten fünf der überwachten Tiere rein

konvulsive Anfälle. Diese waren gekennzeichnet durch die Stadien IV und V und

selten durch das Stadium VI (siehe Tab.2). Die übrigen zehn Ratten exprimierten

sowohl konvulsive als auch nicht-konvulsive Anfälle. Letztere wurden definiert, wenn

die Tiere Immobilität zeigten (aus der Bewegung oder aus einer Ruheposition),

stereotyp mit dem Kopf wackelten (head weaving), den Kopf in den Nacken legten

(Opisthotonus) oder sich ohne Klonus der Vorderextremitäten aufrichteten.

Stereotypes Zirkeln wurde nur in Verbindung mit anderen nicht-konvulsiven

Anfallsmustern gewertet, da auch gesunde Ratten ein Drehverhalten zeigen können.

Es wurde kein Tier mit rein nicht-konvulsiven Anfällen detektiert.

5.1.3 EEG-Muster der spontan wiederkehrenden Anfälle Im folgenden sind einige im EEG beobachtete Anfallsmuster dargestellt. Es wurden

weder die Frequenz noch die Amplitude oder Dauer der Anfälle ausgewertet, da dies

für die vorliegende Fragestellung keine Rolle spielt, jedoch sollen einige typische und

Ergebnisse

58

atypische Anfallsmuster von konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfällen

veranschaulicht werden.

Abb. 3: EEG-Sequenz (NIH 18) während der 2. Vehikelphase; Stadium VI,

gekennzeichnet durch Rennen und Springen

Abb. 4: EEG-Sequenz (NIH 18) eines eher atypischen nicht-konvulsiven Anfalls

während der 2. Vehikelphase. Es fehlt der flache Beginn, und Amplitude und

Frequenz sind deutlich geringer, als bei typischen konvulsiven und nicht-konvulsiven

Anfällen.

Abb. 5: EEG-Sequenz eines eher typischen nicht-konvulsiven Anfalls (NIH 24),

einhergehend mit plötzlicher Immobilität aus einem Ruhezustand und head weaving.

Dieser Anfall ähnelt im EEG den konvulsiven Anfällen (siehe Abb.8) hinsichtlich der

hohen Amplitude und Frequenz. Der genaue Anfallstyp kann nur mittels der

entsprechenden Videosequenzen ermittelt werden.

C h a r t W i n d o w

NIH

24

(mV

)

- 0 , 5

0 , 0

0 , 5

9 : 1 2 : 2 0 1 9 : 1 2 : 3 0 1 9 : 1 2 : 4 0 1 9 : 1 2 : 5 0 1 9 : 1 3 : 0 0 1 9 : 1 3

1 5 . 0 3 . 2 0 0 5 1 9 : 1 2 : 1 8 , 3 6 1


NIH

18

(mV

)

- 0 , 4

- 0 , 3

- 0 , 2

- 0 , 1

0 , 0

0 , 1

0 , 2

8 : 4 2 : 2 4 8 : 4 2 : 2 6 8 : 4 2 : 2 8 8 : 4 2 : 3 0 8 : 4 2 : 3 2 8 : 4 2 : 3 4 8 : 4 2 : 3 6 8 : 4 2 : 3 8

3 0 . 0 3 . 2 0 0 5 8 : 4 2 : 2 3 , 2 8 4


NIH

18

(mV

)

- 0 , 2

- 0 , 1

0 , 0

0 , 1

0 , 2

0 , 3

1 4 : 1 8 : 2 5 1 4 : 1 8 : 3 0 1 4 : 1 8 : 3 5 1 4 : 1 8 : 4 0 1 4 : 1 8 : 4 5 1 4 : 1 8 : 5 0

0 1 . 0 4 . 2 0 0 5 1 4 : 1 8 : 2 1 , 5 5 2


NIH

18

(mV

)

- 0 , 6

- 0 , 4

- 0 , 2

0 , 0

0 , 2

0 , 4

0 , 6

0 : 0 4 : 5 2 0 : 0 4 : 5 4 0 : 0 4 : 5 6 0 : 0 4 : 5 8 0 : 0 5 : 0 0 0 : 0 5 : 0 2 0 : 0 5 : 0 4 0 : 0 5 : 0 6

1 7 . 0 3 . 2 0 0 5 0 : 0 4 : 5 0 , 5 1 1

Ergebnisse

59

Abb. 6: EEG-Sequenz (NIH 18) eines untypischen konvulsiven Anfalls (Stadium V)

während der Vehikelphase 2. Zwar ist die Abflachung des EEGs zu Beginn sowie die

regelmäßige Wellenform am Ende des Anfalls zu sehen, jedoch sind Amplitude und

Frequenz geringer, als beim typischen konvulsiven Anfall (siehe Abb. 8).

Abb. 7: Das Tier (NIH 18), welches untypische EEG-Muster zeigte (siehe Abb. 4 und

6), exprimierte auch typische konvulsive Anfälle, hier für die Phenobarbitalphase

dargestellt. Typische und untypische Anfälle kamen z. B. während der

Phenobarbitalphase gemischt vor.

Abb. 8: Typisches EEG-Muster eines konvulsiven Anfalls (NIH 21). Der Iktus beginnt

mit einem abgeflachten EEG, geht dann in eine Sequenz mit hoher Frequenz und

Amplitude über, und endet mit regelmäßigen Entladungen.

5.2 Pharmakologische Untersuchungen im Post-Status epilepticus-Modell 5.2.1 Selektion von Respondern und Nonrespondern unter Phenobarbital Die Behandlung mit dem Antiepileptikum Phenobarbital führte bei sechs Tieren zu

einer kompletten Anfallskontrolle und bei zwei weiteren zu einer Anfallsreduktion um

mehr als 75 % (siehe Abb. 11). Diese acht Tiere wurden als Phenobarbital-

Responder definiert. Bei sechs weiteren Tieren übte Phenobarbital keinen

antikonvulsiven Effekt aus, weshalb diese als Phenobarbital-Nonresponder

bezeichnet wurden (siehe Abb.12). Eine Ratte (NIH 10) zeigte während der

Vehikelphase 1 und unter Behandlung mit Phenobarbital jeweils nur einen Anfall, so


NIH

18

(mV

)

- 0 , 2

0 , 0

0 , 2

0 , 4

6 : 2 8 : 2 5 6 : 2 8 : 3 0 6 : 2 8 : 3 5 6 : 2 8 : 4 0 6 : 2 8 : 4 5 6 : 2 8 : 5 0

1 1 . 0 3 . 2 0 0 5 6 : 2 8 : 2 0 , 9 5 0


NIH

21

(mV

)

- 0 , 6

- 0 , 4

- 0 , 2

0 , 0

0 , 2

0 , 4

0 , 6

7 : 1 0 8 : 0 7 : 1 5 8 : 0 7 : 2 0 8 : 0 7 : 2 5 8 : 0 7 : 3 0 8 : 0 7 : 3 5 8 : 0 7 : 4 0 8 : 0 7 : 4 5 8 : 0 7 : 5 0

0 1 . 0 4 . 2 0 0 5 8 : 0 7 : 0 9 , 7 5 8

Ergebnisse

60

dass dieses Tier aus der Selektion ausgeschlossen wurde. Eine Ratte (NIH 20)

musste sechs Tage nach Beginn der Behandlung mit Phenobarbital wegen eines

Tumors euthanasiert werden und konnte deshalb nicht gewertet werden. Die

durchschnittliche Anfallsfrequenz während der zweiwöchigen Vehikelphase vor der

Phenobarbital-Behandlung lag für die 15 verwendeten Tiere bei 0,29 Anfällen pro

Tag. Die individuellen Daten wiesen dabei eine große Variation auf (0,07 – 9,5

Anfälle pro Tag). Unter der Gabe von Phenobarbital wurde diese Anfallsfrequenz

nicht signifikant geändert. Während der 2. Vehikelphase, welche sich der

Phenobarbitalphase anschloss, stieg die Anfallsfrequenz bei einigen Ratten

verglichen mit der 1. Vehikelphase deutlich, wenn auch nicht signifikant, an. Von der

dreiwöchigen Vehikelphase 2 wurden für die Phenobarbitalauswertung lediglich die

ersten beiden Wochen genommen. Zwei Nonresponder zeigten unter Behandlung

mit Phenobarbital nicht-konvulsive Anfälle. Ein Tier (NIH 18) exprimierte während der

Vehikelphase 1 ausschließlich konvulsive Anfälle und zeigte unter Behandlung mit

Phenobarbital zu 18 % und während der anschließenden Vehikelphase zu 14 %

nicht-konvulsive Anfälle. Bei einem weiteren Phenobarbital-Nonresponder (NIH 24)

waren während der ersten Vehikelphase ebenfalls keine nicht-konvulsiven Anfälle zu

beobachten. Unter Behandlung mit Phenobarbital erhöhte sich die Frequenz der

nicht-konvulsiven Anfälle auf 99,5 % und sank während der 2. Vehikelphase auf 66

%. Für die Definition der Pharmakoresistenz wurde keine Unterscheidung zwischen

konvulsiven und nicht-konvulsiven Anfällen vorgenommen, sondern die absolute

Anzahl der Anfälle gewertet.

Ergebnisse

61

Abb. 9: Anfallsfrequenz (Anfälle pro Tag) während Behandlung mit Phenobarbital bei

15 epileptischen Ratten (ohne Selektion in Responder und Nonresponder).

Abb. 10: Anfälle pro Tag bei 8 Phenobarbital-Respondern. Es ist eine signifikante

Reduktion der Anfallsfrequenz gegenüber beiden Vehikelphasen zu erkennen.

Vehikelphase 1 Phenobarbital Vehikelphase 20.00

0.25

0.50

0.75

1.005

10

15

20

Anf

älle

pro

Tag


0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

*

Anf

älle

pro

Tag

(n=15)

(n=8)

Ergebnisse

62

Abb. 11: Anfälle pro Tag bei sechs Phenobarbital-Nonrespondern. Diese Tiere

sprachen auf die Behandlung mit Phenobarbital nicht mit einer zufriedenstellenden

Reduktion ihrer Anfallsfrequenz (> 50 %) an.

Tab. 4: Statistische Auswertung der Phenobarbitalversuche. Der Vergleich der

Anfallsfrequenz erfolgte mittels eines nicht-parametrischen Friedman-Tests für

gepaarte Daten. Post hoc Analysen wurden mit einem Wilcoxon Rangsummentest

für gepaarte Daten durchgeführt.

Der statistische Vergleich ergab keinen signifikanten Unterschied zwischen der

Vehikelphase 1 (VH1) und der Vehikelphase 2 (VH2). Des weiteren unterschieden

sich die Anfallsfrequenzen während der Kontrollphasen nicht signifikant zwischen

Respondern und Nonrespondern (Mann-Whitney-U-Test für ungepaarte Daten)

(P>0.05).


0.25

0.50

0.75

1.005

10

15

20

Anf

älle

pro

Tag

(n=6)

Ergebnisse

63

Gruppe N Median der Anfalls-frequenz (Anfälle pro Tag)

ANOVA

(P)

Post hoc Vergleiche

VH

1

Phenobarbital VH 2 Phenobarbital

vs. VH 1

Phenobarbital

vs. VH 2

Gesamt 15 0,28 0,069 0,29 0,0024 0,1531 0,0007

Responder 8 0,28 0 0,29 0,0040 0,0078 0,0156

Nonresponder 6 0,41 0,31 0,465 0,2001 0,6875 0,1875

Einzelgraphen Phenobarbital-Responder

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789

10 NIH 4

konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789

10 NIH 7Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2

konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Ergebnisse

64

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789

10 NIH 20

Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789

10 NIH 21


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Ergebnisse

65

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Einzelgraph variabler Phenobarbital-Responder

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Einzelgraphen Phenobarbital-Nonresponder

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789

10NIH 8


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Ergebnisse

66

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789

10 NIH 13 Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2

konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789

10

Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2NIH 17

konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

10

20

30NIH 18 Vehikelphase 1 Phenobarbitalphase Vehikelphase 2

konvulsivnicht-konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

10

20

30

40



Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Ergebnisse

67

5.2.2. Plasmakonzentration unter Phenobarbital

Tag 1 Tag 7 Tag 140

10

20

30

40

50

Responder Nonresponder Gesamt

Plas

mal

evel

PB

( μg/

ml)

***

Abb. 12: Plasmakonzentrationen von Phenobarbital in μg/ml am 1., 7. und am 14.

Behandlungstag. Die durchschnittlichen Plasmawerte lagen bei den 15 verwendeten

Tieren 10 Std. nach der Applikation am 1. Tag bei 20,9 (im Bereich von 17,7-25,9),

am 7. Tag bei 39,2 (zwischen 13,9 und 48,1) und am 14. Tag bei 35,0 μg/ml (20,2 –

54,1). Die Konzentrationen von Phenobarbital im Plasma waren an den Tagen 7 und

14 signifikant höher als die Plasmalevel an Tag 1 (P< 0,001), was für eine

Akkumulation des Antiepileptikums im Behandlungsverlauf spricht.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

µg/ml


Abb. 13: Vergleich der gesamten Plasmakonzentrationen zwischen Respondern und

Nonrespondern. Der statistische Vergleich zwischen Respondern und

Nonrespondern erfolgte mittels eines zweiseitigen Mann-Whitney-U-Tests da

Ergebnisse

68

aufgrund der zu geringen n-Zahl der Nonresponder (n=6) keine Normalverteilung

angenommen werden konnte. Es bestanden keine signifikanten Unterschiede

(P>0,05). Die Plasmakonzentrationen lagen bei beiden Gruppen im optimalen

Bereich von 10-40 μg/ml (BAULAC, 2002).

5.2.2 Selektion von Respondern und Nonrespondern unter Phenytoin Dosierung Phenytoin Beim Übertragen des für Phenytoin ermittelten Dosierungsschemas auf die

epileptischen Tiere zeigte sich unerwarteterweise eine deutlich höhere

Nebenwirkungsrate als bei nicht-epileptischen Tieren. Während der ersten drei

Behandlungstage zeigten viele der untersuchten Ratten in hohem Maße Ataxie und

Sedation. Aus diesem Grund wurden die Dosierungen ab dem zweiten Tag abends

individuell eingestellt, je nach Befinden der Tiere, um für jede Ratte tolerierbare

Dosen festzulegen. Das Dosierungsintervall lag dabei zwischen 12,5 und 50 mg/kg

Phenytoin (siehe Tab. 3). Die durchschnittliche Phenytoindosis lag bei den

Respondern bei 81,0 +/- 2,79 mg/kg pro Tag und bei 78,9 +/- 1,89 mg/kg pro Tag in

der Gruppe der Nonresponder. Die Dosierung war nicht signifikant unterschiedlich.

Bei der morgendlichen Injektion wurden zwischen 12,5 und 50 mg/kg Phenytoin

injiziert und abends 0 bis 50 mg/kg. Die minimale Tagesdosis lag bei 50 mg/kg

(zweimal täglich 25 mg/kg) bei einem Tier (NIH 7), welches extrem sensitiv auf

Phenytoin reagierte. Die maximale Dosis lag bei 100 mg/kg bei einer Ratte (NIH 18),

die bei geringeren Dosierungen keine Nebenwirkungen zeigte. Die individuelle

Toleranz gegenüber Phenytoin variierte also deutlich. Des weiteren wurde innerhalb

der ersten drei Behandlungstage bei zehn von 15 Tieren eine erhöhte

Anfallsfrequenz detektiert (Phenobarbital-Responder und Phenobarbital-

Nonresponder waren dabei gleichermaßen betroffen). Bei diesen zehn Ratten lag die

Anfallsfrequenz in den drei Tagen vor der Phenytoin-Behandlung bei 0,40 +/- 0,22

und stieg innerhalb der ersten drei Tage unter Phenytoin-Gabe auf 28,7 +/- 16,9 an

(P= 0,0020). Da von Phenytoin bekannt ist, dass es prokonvulsive Effekte ausüben

kann (LÖSCHER et al., 1998; PERUCCA et al., 1998), wurde beschlossen, die

ersten drei Behandlungstage von den späteren Auswertungen auszuschließen und

Ergebnisse

69

nur die Phase mit der individuellen Dosierung zu integrieren. Diese Phase wurde um

1,5 Tage verlängert, so dass alle im folgenden beschriebenen Ergebnisse auf eine

Behandlungszeit von 12,5 Tagen bezogen sind (15,5 Tage minus die ersten drei

Tage). Sobald eine deutliche Ataxie beobachtet wurde, wurde die Dosis reduziert,

und wenn keine Ataxie zu beobachten war, wurde die nächste Dosis wieder erhöht.

Für den Predrug –Vergleich wurden nur die letzten zwei Wochen der Vehikelphase 2

verwendet, welche der Phenytoinphase unmittelbar vorausgingen.

01

23

410

15

20

25(n=15)

Vehikel-phase 2

Phenytoin Vehikel-phase 3

Anf

älle

pro

Tag

Abb. 14: Anfälle pro Tag bei allen mit Phenytoin behandelten Tieren. Ein Tier (NIH

11) zeigte während der Vehikelphasen 2 und 3 gar keine Anfälle und wurde deshalb

nicht in die Phenytoin-Selektion einbezogen.

Ergebnisse

70

0

1

2

3

410

15

20

25

Vehikel-phase 2


(n=9)

Anf

älle

pro

Tag

Abb. 15: Anfälle pro Tag bei Phenytoin-Nonrespondern. Bei neun Tieren zeigte sich

keine Reduktion der Anfallsfrequenz um > 50 % unter der Behandlung mit dem

Antiepileptikum Phenytoin. Statistische Analysen ergaben eine signifikante Erhöhung

der Anfallsfrequenz unter Phenytoin verglichen mit der Vehikelphase 3 (P< 0,05).

0.0

0.5

1.016

111621

*(n=5)

Vehikel-phase 2

Vehikel-phase 3

Phenytoin

Anf

älle

pro

Tag

Abb. 16: Anfälle pro Tag bei Phenytoin-Respondern. Zwei Ratten zeigten eine

komplette Anfallskontrolle und drei weitere Tiere exprimierten gegenüber den

Vehikelphasen 2 und 3 eine Reduktion der Anfallsfrequenz um > 50 % (72 % im

Durchschnitt, variierend von 57-94 %).

Ergebnisse

71

Anzahl der Tage mit Anfällen Ergänzend zum Vergleich der Anfallsfrequenz zwischen Behandlungs- und

Vehikelphasen wurde die Ansprechbarkeit auf Phenytoin mittels der Anzahl der Tage

mit Anfällen ausgewertet. Diese Analyse wurde deshalb durchgeführt, weil einige der

Ratten Anfallscluster an einem Tag aufwiesen, an den Tagen vor und nach einem

solchen Cluster jedoch anfallsfrei waren. Wenn lediglich die Anfallsfrequenz

berücksichtigt wird, könnte der Gruppenvergleich beeinflusst werden.

0

25

50

75

100

Vehikel-phase 2


(n=15)

Tage

mit

Anf

älle

n (%

)

Abb. 17: Anzahl der Tage mit Anfällen gesamt. Im Gesamtgruppenvergleich ergibt

sich kein signifikanter Behandlungseffekt (P> 0,05).

0

25

50

75

100

Vehikel-phase 2


(n=8)

Tage

mit

Anf

älle

n (%

)

Abb. 18: Phenytoin-Nonresponder bei der Anzahl der Tage mit Anfällen. Sieben der

neun Tiere, welche aufgrund ihrer Anfallsfrequenz als Nonresponder deklariert

wurden, erwiesen sich auch als Nonresponder bezüglich der Anzahl der Tage mit

Ergebnisse

72

Anfällen und zeigten während der Phenytoin-Applikation keine signifikanten

Unterschiede zu den Vehikelphasen.

0

25

50

75

100

Vehikel-phase 2


(n=6)

*Ta

ge m

it A

nfäl

len

(%)

Abb.19: Phenytoin-Responder bei der Anzahl der Tage mit Anfällen. Unter dem

Kriterium, dass ein Responder definiert wird, wenn die Anfallsfrequenz um

mindestens 50 % gesenkt wird, gelten vier der fünf Tiere, welche Responder in

Bezug auf die Anfallsfrequenz darstellen, auch als Responder hinsichtlich der Anzahl

der Tage mit Anfällen. Die Anzahl der Tage mit Anfällen war bei den Respondern

unter Behandlung mit Phenytoin im Vergleich mit der Vehikelphase 2 um

durchschnittlich 74 % gesunken (P= 0,0313).

Tab.5: Statistische Auswertung während der Phenytoinselektion. Die Datenanalyse

mittels Friedman-Test mit anschließendem Wilcoxon Rangsummentest ergab keine

Unterschiede hinsichtlich der Anfallsfrequenz zwischen den Vehikelphasen 2 und 3

(VH 2 und 3). Auch die Anfallsfrequenzen von Respondern und Nonrespondern

unterschieden sich während der Kontrollphasen nicht signifikant voneinander (P>

0,05).

Ergebnisse

73

Gruppe N Median der Anfalls-frequenz (Anfälle pro Tag)

ANOVA (P)

Post hoc Vergleiche

VH 2 Phenytoin VH 3 VH 2 vs.

Phenytoin

VH 3 vs.

Phenytoin

Gesamt 15 0,25 0,40 0,074 0,2139 0,3303 0,1354

Responder 5 0,31 0,064 0,074 0,0085 0,0313 0,0313

Nonresponder 9 0,25 1,6 0,15 0,0060 0,0742 0,0039

Einzelgraphen Phenytoin-Responder

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

1

2

3

4

5

6

Vehikelphase 2 PhenytoinphaseVehikelphase 3

konvulsiv

NIH 4

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

560

80

100

120

nicht-konvulsiv

NIH 7 konvulsiv

Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

1

2

Vehikelphase 2 Phenytoinphase

konvulsiv

NIH 21

Vehikelphase 3

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Ergebnisse

74

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

1

2 NIH 25konvulsiv


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

5

10

15

20

25nicht-konvulsivNIH 10


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1405

10152025303540455055 konvulsiv

nicht-konvulsivVehikelphase 2 Phenytoinphase

NIH 18

Vehikelphase 3

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Einzelgraphen Phenytoin-Nonresponder

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

5

10

Vehikelphase 2 Phenytoinphase

110130150170190

nicht-konvulsiv

Vehikelphase 3

konvulsiv

NIH 6

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

2

4

6

8

10

NIH 8Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3

konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Ergebnisse

75

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

5

10

15

20

nicht-konvulsivkonvulsiv

NIH 13Vehikelphase 2 Phenytoinphase Vehikelphase 3

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140123456789

101112 konvulsivNIH 17


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1405

10152025303540455055 konvulsiv

nicht-konvulsivNIH 24


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

5

10200

250

300

350

nicht-konvulsiv

NIH 31 konvulsiv


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

1

2

nicht-konvulsiv

NIH 14

konvulsiv


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Ergebnisse

76

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

5

1020

25

30

35nicht konvulsivNIH 23konvulsiv


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Einzelgraph variabler Phenytoin-Responder

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 140

1

2

3NIH 11


konvulsiv

Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Plasmakonzentration unter Phenytoin

Tag 1 Tag 8 Tag 150

5

10

15

20

25

30


Plas

mal

evel

PH

T ( μ

g/m

l)

Abb. 20: Plasmakonzentrationen von Phenytoin in μg/ml am 1., 7. und am 14.

Behandlungstag.

Die durchschnittliche Plasmakonzentration von Phenytoin lag 10 Std. nach der

Bolusinjektion am 1. Behandlungstag bei 20 μg/ml (zwischen 8,94 und 35,19 μg/ml)

und somit in dem Bereich, welcher in den Vorversuchen mit nicht-epileptischen

Tieren erreicht wurde. Am 7. Behandlungstag lag der durchschnittliche Plasmalevel

Ergebnisse

77

bei 9,7 μg/ml (0,49 bis 25,01 μg/ml) und am letzten Behandlungstag bei 12,7 μg/ml

(1,88 bis 39,22 μg/ml).

0

5

10

15

20

25

30

35

40


μg/

ml

Abb. 21: Durchschnittliche Plasmakonzentration von Phenytoin bei den

verschiedenen Gruppen gesamt. Es besteht kein signifikanter Unterschied, obwohl

eine Tendenz für niedrigere Plasmawerte in der Nonresponder-Gruppe vorhanden

ist, auch wenn alle Tiere mit maximal tolerierbaren Dosen behandelt wurden.

5.2.3 Gesamtergebnis Selektionsstudie Als Gesamtergebnis der Selektionsstudie sollte ermittelt werden, ob sich die

Resistenz der Nonresponder gegenüber Phenobarbital auf eine Resistenz

gegenüber Phenytoin ausdehnt und ob einige der Tiere der Definition von

Pharmakoresistenz entsprechen. Laut dieser Definition dürften die Tiere auf beide

Antiepileptika gar nicht oder nur unzureichend ansprechen. Ein Phenobarbital-

Responder (NIH 11) konnte für diesen Vergleich nicht herangezogen werden, da er

während der dreiwöchigen Vehikelphase 2 (die Periode zwischen der Phenobarbital-

und der Phenytoinphase) sowie der Vehikelphase 3 keinen einzigen Anfall aufwies.

Von den sieben verbleibenden Phenobarbital-Respondern sprachen drei (43 %)

ebenfalls auf Phenytoin an, sowohl in Bezug auf die Anfallsfrequenz als auch auf die

Anzahl der Tage mit Anfällen (> 50 %). Von den sechs Phenobarbital-Nonresponder

besserte sich die Anfallssituation bei fünf Tieren (83 %) auch unter Behandlung mit

Ergebnisse

78

Phenytoin nicht wesentlich. Eine Ausnahme bildete ein Tier (NIH 18) mit einer

besonders hohen Anfallsfrequenz während der Vehikelphasen, welches zwar nicht

auf Phenobarbital ansprach, dafür aber auf die Gabe von Phenytoin mit einer 90 %

igen Reduktion der Anfallsfrequenz und einer ungefähr 70 % igen Senkung der

Anzahl der Tage mit Anfällen reagierte.

5.2.4 Kombinationstherapie von Phenobarbital und Tariquidar (XR 9576) bei Phenobarbital-Nonrespondern im chronischen Post-Status epilepticus-Modell Diejenigen Ratten, welche auf die Behandlung mit Phenobarbital während der

Selektionsphase nicht mit einer Reduktion der Anfallsfrequenz um mindestens 50 %

ansprachen, wurden für eine Kombinationstherapie von Phenobarbital mit dem

selektiven P-gp Inhibitor Tariquidar ausgewählt.

Nach der i. p.-Applikation von Tariquidar entwickelten alle Ratten Anzeichen von

abdominalen Schmerzen, so dass der Versuch nach 5,5 Tagen unterbrochen wurde.

Für die Folgeversuche wurde Tariquidar daher mit einer Schlundsonde peroral

verabreicht. Die Schwere der typischen adversen Effekte von Phenobarbital, wie

Ataxie und Sedation, wurde durch die Kombinationstherapie nicht beeinflusst.

0

1

2

310

20

30

Vehikel-phase 2(Predrug)

20 mg/kgTQ + PB

Kontroll-phase 1(Postdrug)

*Anf

älle

pro

Tag

Abb. 22: Anfälle pro Tag unter 20 mg/kg Tariquidar und Phenobarbital. Die Daten

sind nicht normalverteilt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels eines

zweiseitigen Wilcoxon-Rangsummentests für gepaarte Daten. Bei vier

Ergebnisse

79

Nonrespondern konnte eine komplette Anfallsfreiheit erreicht werden und zwei

weitere Tiere zeigten eine Reduktion ihrer Anfallsfrequenz um mehr als 90 % was in

einem signifikanten Unterschied im Vergleich zur Vehikelphase 2 und zur

Kontrollphase 1 zu erkennen ist. Im anschließenden Versuch sollte verifiziert werden,

ob eine Dosis von 10 mg/kg Tariquidar die Anfallsfrequenz ebenfalls effektiv senken

kann.

0

1

2

310

20

30

Kontroll-phase 1(Predrug)

10 mg/kgTQ + PB


*

Anf

älle

pro

Tag

Abb. 23: Anfälle pro Tag unter 10 mg/kg Tariquidar und Phenobarbital. Ein Tier (NIH

24) verstarb 3,5 Tage nach Beginn der Behandlung mit 10 mg/kg Tariquidar +

Phenobarbital. Dieser Nonresponder exprimierte die höchste Anfallsrate von allen

Tieren (183 Anfälle in 7,5 Tagen in der Kontrollphase 1), was letztendlich zur

Mortalität beigetragen haben könnte. In den entsprechenden Videoaufnahmen zeigte

die Ratte kurz von ihrem Tod ein verlängertes konvulsives Verhalten. Die genaue

Todesursache konnte jedoch auch durch Autopsie nicht geklärt werden.

Die Kombinationstherapie von Phenobarbital mit 10 mg/kg Tariquidar führte ebenfalls

zu einer Senkung der Anfallsfrequenz, jedoch nicht in dem Maße wie 20 mg/kg

Tariquidar. Ein Tier verstarb während der Behandlung. Es wurde nur bei zwei

Nonrespondern völlige Anfallsfreiheit erreicht, und drei weitere Tiere zeigten eine

Anfallsreduktion um > 50 % (87 % im Durchschnitt). Deshalb sollte in einem

Ergebnisse

80

Folgeversuch die Effizienz der intermediären Dosis von 15 mg/kg Tariquidar getestet

werden.

0

1

2

310

20

30

40

50


15 mg/kgTQ + PB


*

Anf

älle

pro

Tag

Abb. 24: Anfallsfrequenz (Anfälle pro Tag) unter 15 mg/kg Tariquidar und

Phenobarbital. Bei dieser Dosierung erlangten drei Tiere eine vollständige

Anfallsfreiheit und ein weiterer Nonresponder zeigte eine Senkung der

Anfallsfrequenz um 90 %, was zu einem signifikanten Unterschied gegenüber der

Kontrollphase 2 führte. Eine Ratte (NIH 8) hatte weder unter der

Kombinationstherapie noch während der Kontrollphase 3 Anfälle, so dass keine

Signifikanz zur Postdrugphase festgestellt werden konnte.

0

1

2

31020304050

Kontrollphase 3 (Predrug)

10 mg TQ/kg ohne PB

Anf

älle

pro

Tag

Abb. 25: Anfallsfrequenz unter 10 mg/kg Tariquidar ohne gleichzeitige

Phenobarbitalbehandlung.

Ergebnisse

81

Es erscheint zwar unwahrscheinlich, dass Tariquidar ohne gleichzeitige Gabe von

Phenobarbital einen Effekt auf die Anfallsfrequenz ausübt, jedoch sollte dies mittels

einer Applikation von 10 mg/kg Tariquidar zweimal täglich überprüft werden (Abb.26).

Die alleinige Gabe von Tariquidar führte zu keiner signifikanten Reduktion der

Anfallsfrequenz (P= 0,4375 vs. Kontrollphase). Es war im Gegenteil sogar eine

Tendenz zum Anstieg der Anfallsfrequenz bei den Nonrespondern vorhanden. Zum

Beispiel stieg die Anfallsfrequenz bei einem Tier (NIH 13) von 13,1 Anfällen pro Tag

während der Kontrollphase auf 23,6 Anfälle pro Tag unter der Behandlung mit 10

mg/kg Tariquidar ohne Phenobarbital. Während der Gabe von 10 mg/kg Tariquidar +

Phenobarbital war dieses Tier anfallsfrei. Ein einziges Tier (NIH 18) zeigte eine

tendenzielle Senkung der Anfallsfrequenz unter 10 mg/kg Tariquidar ohne

Phenobarbital verglichen mit der Kontrollphase.

0

1

2

310

20

30


Pheno-barbitalohne TQ


Anf

älle

pro

Tag

Abb. 26: Anfallsfrequenz unter Phenobarbital ohne Kombination mit Tariquidar. Die

statistische Analyse mit dem gepaarten, nicht-parametrischen Wilcoxon-

Rangsummentest ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den einzelnen

Phasen, obgleich eine tendenzielle Reduktion der Anfallsfrequenz vorhanden war

(P= 0,0625 für den Vergleich Predrug zu Phenobarbital sowie Postdrug zu

Phenobarbital). Mit diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass die Phenobarbital-

Nonresponder zirka vier Monate nach Ende der Selektionsphase immer noch der

Definition eines Nonresponders entsprachen.

Ergebnisse

82

Plasmakonzentration von Phenobarbital unter Tariquidar

1. Entnahme 2. Entnahme0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

20 mg/kg TQ10 mg/kg TQPB ohne TQ15 mg/kg TQ

Plas

mal

evel

PB

( μg/

ml)

Abb. 27: Durchschnittliche Plasmakonzentration für Phenobarbital während der

Kombination mit Tariquidar. Die erste Entnahme erfolgte 10 Std. nach der ersten

Injektion, die zweite Entnahme 10 Std. nach der letzten Injektion. Eine Ausnahme

bildet diejenige Phase, in der Phenobarbital ohne Tariquidar gegeben wurde, da hier

lediglich nach der ersten Applikation Blut entnommen wurde. Die

Plasmakonzentration von Phenobarbital stieg über die Dauer der Behandlung an,

was für eine Akkumulation des Antiepileptikums spricht. Statistische Analysen

ergaben keinen Unterschied zwischen den verschiedenen Behandlungsphasen mit

Tariquidar und der Periode, in welcher Phenobarbital ohne Tariquidar verabreicht

wurde. Die Auswertung erfolgte mittels des nicht-parametrischen Wilcoxon-

Rangsummentests für gepaarte Daten (P> 0,05).

Ergebnisse

83

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

20 mg/kg TQ + PB 10 mg/kg TQ + PB 15 mg/kg TQ + PB PB ohne TQ

µg/m

l

Abb. 28: Die Plasmaspiegel von Phenobarbital unterscheiden sich nicht signifikant

zwischen den diversen Kombinationstherapien mit Tariquidar und der alleinigen

Gabe von Phenobarbital ohne Tariquidar. Das deutet darauf hin, dass Tariquidar den

Metabolismus von Phenobarbital nicht beeinflusst. Der durchschnittliche Plasmalevel

von Phenobarbital lag bei dem Versuch mit 20 mg/kg Tariquidar bei 27,03 μg/ml

(13,22 – 55,62 μg/ml), bei dem Experiment mit 10 mg/kg Tariquidar bei 23,06 μg/ml

(13,1 – 47,97 μg/ml). Bei dem Versuch mit 15 mg/kg Tariquidar betrug die

durchschnittliche Plasmakonzentration 23,74 μg/ml (14,2 – 37,67 μg/ml) und bei der

Gabe von Phenobarbital ohne Tariquidar 24,01 μg/ml (17,19 – 37,45 μg/ml).

Tabelle 6: Die Analyse erfolgte mittels eines nicht-parametrischen Friedman-Tests

für gepaarte Daten. Der Post hoc Test bestand aus einem Wilcoxon

Rangsummentest für gepaarte Daten. Durch den Tod eines Nonresponders gingen

ab dem Versuch mit 15 mg/kg Tariquidar + Phenobarbital nur noch fünf Tiere in die

Versuche ein. Nach dem Versuch mit 10 mg/kg Tariquidar ohne Phenobarbital wurde

keine Postdrug-Phase angeschlossen. Als Pre- bzw. Postdrug-Phasen wurden

diejenigen Kontrollphasen verwendet, welche der jeweiligen Behandlungsphase

vorausgingen bzw. dieser folgten. Für den Versuch mit 20 mg/kg Tariquidar +

Ergebnisse

84

Phenobarbital wurde die Vehikelphase 3 aus der Selektionsphase als Predrug

verwendet.

N Behandlung Median der Anfalls- frequenz (Anfälle pro

Tag)

Anova (P)

Post hoc Vergleiche

Pre-

drug

Drug Post-

drug

Drug vs.

Predrug

Drug vs.

Post-

drug

6 Phenobarbital

+ Tariquidar 20

0,465 0 1,8 0,0017 0,0313 0,0313

6 Phenobarbital

+ Tariquidar 10

1,8 0,188 1,0 0,0085 0,0313 0,0313

5 Phenobarbital

+ Tariquidar 15

1,0 0 0,42 0,1040 0,0313 0,1250

5 Tariquidar 10 0,42 0,710 0,4375

Einzelgraph Kombinationsstudie Tariquidar und Phenobarbital Dargestellt ist ein Beispieltier aus der Kombinationsstudie, welche insgesamt sechs

Tiere umfasste.

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 70

10

20

30

40

50

60

70

80NIH 18

Kontroll-phase 1

Kontroll-phase 2

20 mg/kgTQ+ PB

10 mg/kgTQ + PB

15 mg/kgTQ + PB

PB ohne TQ 10 mg/kgTQ ohne PB

Kontroll-phase 3


Tage

Anz

ahl d

er A

nfäl

le

Ergebnisse

85

5.2.5 GABAA- Rezeptoruntereinheiten Das Hauptziel dieser Studie war die Evaluierung, ob die Expression von GABAA-

Rezeptoruntereinheiten in der hippocampalen Formation zwischen

pharmakoresistenten und pharmakosensitiven Ratten differiert, was mit einer semi-

quantitativen Bildanalyse der relativen optischen Dichte untersucht wurde.

Bei nicht-epileptischen Kontrollen war die Verteilung der GABAA-

Rezeptoruntereinheiten α1, α2, α3, α4, α5 und γ2 im Hippocampus ähnlich zu der

bereits vorher beschriebenen (FRITSCHY und MÖHLER, 1995; SCHWARZER et al.,

1997). Zwischen Kontrollen und Shams waren keine Unterschiede vorhanden.

Im Gegensatz zu Respondern kam es bei den Phenobarbital-Nonrespondern zu

einer deutlicheren und ausgedehnteren Reduktion der Immunreaktivität von GABAA-

Rezeptoruntereinheiten. Alle GABAA-Rezeptoruntereinheiten waren in den meisten

hippokampalen Regionen bei den pharmakoresistenten Tieren im Vergleich zur

Kontrolle runterreguliert. Die Runterregulation war am größten für die α5–

Untereinheit (CA1: ipsilateral: 60,81 % und kontralateral 63,45 % Verlust in Relation

zur Kontrollgruppe) und am schwächsten für die α4–Untereinheit. Da bei den

Nonrespondern eine signifikante Neurodegeneration in der CA1, CA3 und im Hilus

detektierbar war, ist vor allem der relativ gut erhaltene Gyrus dentatus von

speziellem Interesse beim Gruppenvergleich. Es zeigte sich, dass bei den

pharmakoresistenten Tieren eine signifikante Reduktion der Untereinheiten α1, α2,

α5 und γ2 im Gyrus dentatus auftrat. In der Pyramidenzellschicht der CA1 bestand

bei den Nonrespondern eine Tendenz zur Hochregulation der α4-Immunreaktivität.

Die Differenz der Inzidenz von Neurodegeneration zwischen Respondern (einer von

acht) und Nonrespondern (fünf von sechs) war signifikant (p= 0,0256).

Die Phenobarbital-sensitiven Tiere zeigten ebenfalls eine leicht verminderte

Expression der GABAA-Rezeptor-Immunaktivität, vor allem in der CA1 und der CA3

Region. So kam es bei den Respondern zu Runterregulationen von α2 in CA3 und

Hilus (CA2 kontralateral), α3 in CA1 und Hilus, α4 in CA3, α5 und γ2 in CA1, CA3

und Hilus. Die Färbung für α1 war in keiner Subregion von Phenobarbital-

Respondern signifikant verändert. Weiterhin waren keine Veränderungen in der

Körnerzellschicht und dem Str. molekulare des Gyrus dentatus zu beobachten. Beim

Ergebnisse

86

Vergleich von Phenobarbital-Respondern und Phenobarbital-Nonrespondern zeigt

sich, dass bei den Nonrespondern in der CA1 Region die Untereinheiten α1, α4 und

α5 signifikant geringer exprimiert sind (siehe Tab.7). Die δ-Untereinheiten konnte

nicht ausgewertet werden, da die Färbeintensität aus unbekannten Gründen zu

schwach ausfiel und sich für die optische Dichtemessung nicht eignete. Die

Untereinheiten β2/3 konnte ebenfalls nicht analysiert werden, da die Färbung zu

stark und unspezifisch ausfiel. Eine mögliche Ursache könnte darin bestehen, dass

nahezu alle Rezeptoren entweder die Untereinheiten β2 und/oder β3 exprimieren, so

dass die Färbung sehr intensiv und relativ unspezifisch ausfällt, da fast alle

Rezeptoren gefärbt werden.

Die folgenden Ergebnisse beziehen sich daher nur auf die Untereinheiten α1-5 und

γ2.

Ergebnisse

87

Hilus und DG

Hilus CA3

Str. molekulare

Körnerzellen CA1

DG

Hippocampus gesamt

100x

Alpha1

25x

CA1A) B)

D) E) F)

G) H) I)

J) K) L)

Str. oriens

Str. pyramidale

100xStr. lacunosum

C)

Str. radiatum

Ergebnisse

88

Abb. 29: Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheit α1 bei A-C) Kontrolle

(NIH44), D-F) Sham (NIH 27), G-I) Responder (NIH 25) und J-L) Nonresponder

(NIH 13). In den Abb. A-J ist der ipsilaterale Hippocampus gesamt dargestellt.

Die Abb. B-K zeigen eine Ausschnittvergrößerung des Gyrus dentatus. Abb. C-

L wiederum stellt eine Vergrößerung der CA1-Region dar.

Vor allem die dendritischen Schichten des Hippocampus waren deutlich für α1

gefärbt. Am prägnantesten fiel die Färbung für α1 in Str. oriens aus. Aber auch

Str. radiatum, Str. lacunosum und Str. molekulare waren deutlich gefärbt. Das

Str. oriens war stärker gefärbt als das Str. radiatum und dieses war wiederum

markanter gefärbt als Str. lacunosum und Str. molekulare. Im Hilus und in der

CA3 waren Perikaryen und Fasern von mutmaßlichen Interneuronen,

einschließlich Korbzellen, detektierbar. Die Daten entsprechen denen von

SCHWARZER et al. (1997). Die Pyramidenzellschicht in der CA1 und CA3

sowie die Körnerzellen waren nicht angefärbt. Im gesamten Hippocampus

waren Fasern erkennbar. Kontrollen und Shams unterschieden sich nicht. Die

prinzipielle Färbung war auch bei Respondern und Nonrespondern zu

erkennen. In epileptischen Ratten war eine generelle Reduktion der α1-

Immunreaktivität detektierbar, welche bei den Nonrespondern am deutlichsten

auftrat. Bei dem hier abgebildeten Nonresponder sind kaum Interneurone und

Korbzellen im Hilus detektierbar.

Die Kalibrationsbalken sind bei der 25fachen Vergrößerung 500 μm und bei der

100fachen Vergrößerung 200 μm lang.

Ergebnisse

89

Alpha2

DG

CA1 CA3

25x 100x 100x

Körnerzellen

Hilus

Str. molekulare

Str. oriens

Str. pyramidale

Str. radiatum

Str. lacunosum

Abb. 30: Färbung für die GABAA-Rezeptoruntereinheit α2 im Hippocampus von A-C)

Sham (NIH 36), D-F) Responder (NIH 21) und G-I) Nonresponder (NIH 18). In Abb.

A-G ist der Hippocampus gesamt dargestellt. Abb. B-H zeigt eine

Ausschnittvergrößerung des Gyrus dentatus und Abb. C-I stellt die CA1-Region im

Detail dar. Die Untereinheit α2 war in allen hippocampalen Subregionen

nachweisbar, am deutlichsten war die Färbung jedoch für die Molekularschicht des

Gyrus dentatus, wie auch bei SCHWARZER et al. (1997) nachgewiesen. Der Hilus

und das Str. lacunosum waren nur schwach angefärbt. Die Schichten Str. oriens und

Str. radiatum waren in der CA3 deutlicher gefärbt als in der CA1. Die Färbeintensität

war bei epileptischen Ratten reduziert, vor allem bei den Phenobarbital-

Nonrespondern. Kalibrationsbalken: 25 fache Vergrößerung: 500 μm und 100 fache

Vergrößerung: 200 μm.

D)

Hippocampus gesamt Hilus und DG CA1

B) C) A)

E) F)

G) H) I)

Ergebnisse

90

Alpha3

Hippocampus gesamt

Abb. 31: Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheit α3 bei A-C) Sham (NIH 1), D-F)

Responder (NIH 25) und G-I) Nonresponder (NIH 17). In Abb. A-G ist der ipsilaterale

Hippocampus gesamt dargestellt. Die Abb. B-H zeigt den Gyrus dentatus und Abb. C-

I eine Ausschnittvergrößerung der CA1. Die Färbung für die Untereinheit α3 fiel

insgesamt schwach aus, wie bereits bei SCHWARZER et al. (1997) beobachtet. Zwar

waren im Hilus Perikaryen und teilweise Fasern erkennbar, im Gegensatz zu den

Ergebnissen von SCHWARZER et al. (1997) waren hier jedoch keine dunklen Cluster

von Perikaryen zu sehen. Die Pyramidenzellen der CA1 und CA3, die Körnerzellen

des Gyrus dentatus und das Str. molekulare waren am stärksten gefärbt. Die Färbung

für α3 war für die Responder und Nonresponder nicht wesentlich schwächer als für

die Kontrollen und Shams. Kalibrationsbalken: 25 fache Vergrößerung: 500 μm; 100

fache Vergrößerung: 200 μm.

A)

Hilus und DG CA1

CA1

DG CA3

Körnerzellen

25x

100x Hilus

Str. molekulare 100x

Str. oriens

Str. pyramidale

Str. radiatum

Str. lacunosum

B) C)

D) E) F)

G) H) I)

Ergebnisse

91

Alpha4Hippocampus gesamt

A)Hilus und DG CA1

25x

CA1

DG CA3

100x

Körnerzellen

Hilus

Str. molekulare 100x

Str. oriens Str. pyramidale

Str. radiatum

Str. lacunosum

Abb. 32: Färbung für die GABAA-Rezeptoruntereinheit α4 bei A-C) Kontrolle (NIH39),

D-F) Responder (NIH 21) und G-I) Nonresponder (NIH 13). Die Abb. A-G zeigen den

ipsilateralen Hippocampus gesamt. In Abb. B-H ist eine Ausschnittvergrößerung des

Gyrus dentatus zu sehen und Abb. C-I stellt die CA1 Region vergrößert dar. Die

Molekularschicht des Gyrus dentatus war am prägnantesten und Str. oriens sowie Str.

radiatum der CA1 waren schwach gefärbt, was die Resultate von SCHWARZER et al.

(1997) bestätigt. Die übrigen hippocampalen Bereiche wiesen nur eine schwache

Färbung auf. Responder und Nonresponder unterschieden sich nicht deutlich von

Kontrollen und Shams. Allerdings war bei zwei Nonrespondern (NIH13 und NIH17)

eine deutliche Anfärbung der Pyramidenzellschicht erkennbar (Pfeil), welche bei den

Kontrollen, Shams und Respondern fehlte. Kalibrationsbalken: 25 fache

Vergrößerung: 500 μm; 100 fache Vergrößerung: 200 μm.

B) C)

D) E) F)

G) H) I)

Ergebnisse

92

Alpha5

Hippocampus gesamt

A)

Hilus und DG CA2

25x

CA1

DG CA3

100x 200x

Körnerzellen

Hilus

Str. oriens

Str. pyramidale

Str. radiatum

Abb. 33: Färbung für die GABAA-Rezeptor-Untereinheit α5 bei A-C) Sham (NIH

36), D-F) Responder (NIH 23) und G-I) Nonresponder (NIH 18). Abb. A-G zeigt

den ipsilateralen Hippocampus gesamt. In den Abb. B-H ist der Hilus vergrößert

dargestellt und Abb. C-I stellt eine Ausschnittvergrößerung der CA2 dar. Wie bei

SCHWARZER et al. (1997) waren auch im vorliegenden Versuch vor allem die

dendritischen Schichten des Str. oriens und Str. radiatum intensiv für die

Untereinheit α5 gefärbt. Epileptische Ratten wiesen das gleiche Färbeschema auf,

waren jedoch schwächer gefärbt. Nonresponder waren gegenüber den Kontrollen

deutlich weniger gefärbt. Bei dem hier abgebildeten Nonresponder fällt der

deutliche Verlust von α5 in der CA2 auf (Abb.I). Kalibrationsbalken: 25x

Vergrößerung: 500 μm; 100x Vergrößerung: 200 μm; 200x Vergrößerung:100 μm.

B) C)

D) E) F)

G) H) I)

Ergebnisse

93

Gamma2

200x

A)

Hippocampus gesamt Hilus und DG CA1

25x

CA1

DG

CA3

100x

Körnerzellen

Hilus

Str. molekulare

Str. oriens

Str. pyramidale

Str. radiatum

Abb. 34: Färbung für die GABAA-Rezeptoruntereinheit γ2 bei A-C) Sham (NIH3), D-

F) Responder (NIH 31) und G-I) Nonresponder (NIH 6). Abb. A-G zeigt den

ipsilateralen Hippocampus gesamt. Die Abb. B-H zeigt den Gyrus dentatus und Abb.

C-I stellt die CA3-Region vergrößert dar. Die Ergebnisse für die γ2-Färbung

entsprechen denen von SCHWARZER et al. (1997). Die γ2-Immunreaktivität

konzentrierte sich in den Dendriten des Str. radiatum von der CA1 zur CA3, dem Str.

lacunosum und der Molekularschicht. Der Hilus wies kaum Färbung auf, jedoch

waren einzelne Perikaryen sichtbar. Epileptische Ratten zeigten eine generelle

Reduktion der Färbeintensität, welche bei den Phenobarbital-Nonrespondern am

ausgeprägtesten war. Kalibrationsbalken: 25 fache Vergrößerung: 500 μm; 100 fache

Vergrößerung: 200 μm; 200 fache Vergrößerung: 100 μm.

B) C)

D) E) F)

G) H) I)

Ergebnisse

94

Einzelgraphen GABAA-Rezeptoruntereinheiten Resultate der optischen Dichtemessung in CA1, (CA2), CA3, Hilus und Gyrus

dentatus für die GABAA-Rezeptoruntereinheiten α1-5 und γ2 im Gruppen- und

Seitenvergleich. Die Auswertung zwischen den Gruppen erfolgte mittels einer One-

way-ANOVA, gefolgt von einem Bonferroni-Post hoc Test. (P< 0,05). Der

Seitenvergleich erfolgte mittels eines paarigen, zweiseitigen t-Tests (P< 0,05).

Signifikanzsterne zwischen der kontra- und der ipsilateralen Seite bedeuten

Unterschiede zwischen den Hirnhemisphären für die darunter angegebenen

Gruppen.

Ergebnisse

95

GABAA-Rezeptor-Untereinheit Alpha 1

kontralateral ipsilateral

0

10

20

30

40

50

60

ResponderNonresponderKontrolle

Sham

CA1 ****

*****

***O

ptis

che

Dic

hte


0

5

10

15

20

25

30

35 ResponderNonresponder

KontrolleSham

CA3

Opt

isch

e D

icht

e

*


0

10

20

30

40

ResponderNonresponderKontrolleSham

Hilus

***

***

**Sham

Opt

isch

e D

icht

e


05

1015202530354045

ResponderNonresponder

KontrolleSham

Gyrus dentatus

Opt

isch

e D

icht

e

**** *

Ergebnisse

96


kontralateral ipsilateral05

1015202530354045

Responder NonresponderKontrolle ShamCA1** **

*O

ptis

che

Dic

hte


10

20

30

40

50


KontrolleSham

*

*****

*CA3

Nonres-ponder

Opt

isch

e D

icht

e


10

20

30

40


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

*****

***Hilus


10152025303540455055

ResponderNonresponder Kontrolle

Sham

Opt

isch

e D

icht

e

* **Gyrus dentatus

Ergebnisse

97



5

10

15

20

25

Responder Nonresponder KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

CA1 ***

*********


0

5

10

15

20

25ResponderNonresponder

KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

*CA3


5

10

15

20


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

*

*** Hilus

*Kon-trolle


5

10

15

20

25


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

Gyrus dentatus

Ergebnisse

98



5

10

15

20


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

***

****

***

***

CA1


5

10

15


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

CA3


5

10


KontrolleSham

Hilus

Opt

isch

e D

icht

e

**Kon-trolle


0

5

10

15

20

25


KontrolleSham

*ShamO

ptis

che

Dic

hte

Gyrus dentatus

Ergebnisse

99



10

20

30

40

50

60

ResponderNonresponder Kontrolle

Sham

Opt

isch

e D

icht

e***

*

***

*****

*

*CA1


0

10

20

30


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

*****

**** CA2


1015202530354045


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e *******

***

CA3

Ergebnisse

100



5

10


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e**

**Hilus


5

10

15


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

* Gyrus dentatus

Ergebnisse

101

GABAA-Rezeptor-Untereinheit Gamma 2


1015202530354045


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

***

*******

CA1


25

30

35

40


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

***

**

****

CA3


5

10

15

20

25

30

35 ResponderNonresponder Kontrolle

Sham

Opt

isch

e D

icht

e ****

**

Hilus


10

20

30

40


KontrolleSham

Opt

isch

e D

icht

e

*Gyrus dentatus

Ergebnisse

102

Tab. 7: Die Auswertung erfolgte mittels einer One-way-ANOVA, gefolgt von einem

Bonferroni-Post hoc Test. Die Pfeile bedeuten eine signifikante Runterregulierung

beziehungsweise Hochregulation gegenüber den dahinter in Kürzeln angegebenen

Gruppen (P<0,05). Die Prozentangaben zeigen den Verlust der jeweiligen

Untereinheit gegenüber der Kontrollgruppe an. Die CA2 Region wurde nur bei der

Untereinheit α5 ausgewertet, da die Modulation dieser Untereinheit in der CA2 beim

Epilepsiegeschehen eine Rolle innehaben könnte (HOUSER und ESCLAPEZ, 2003).

Die CA2 Region ist mikroskopisch gegenüber der CA1 und der CA3 teilweise nur

schwer abgrenzbar, weshalb die Analyse dieses Bereiches auf die α5-Untereinheit

beschränkt wurde. Die Regionen des Ammonshorn sind mehr oder weniger stark von

Neurodegeneration betroffen (siehe auch Diskussion), wie C. Fuest anhand eines

Score-Systems zeigen konnte. Da der Gyrus dentatus keinen solchen extremen

Neuronenverlust aufweist und daher von besonderem Interesse ist, ist diese Region

in der Tabelle grau hinterlegt.

links GABA-A Rezeptor Untereinheiten

Gruppe Hippocampale

Region α 1 α 2 α 3 α 4 α 5 γ 2

Responder CA1 ↑ N

18,75 %19,74

%

↓ K, ↑ N 16,79

%

↑ N 22,58

% ↓K, ↑ N 33,48 %

↓ S 22,56 %

CA2 33,77 % ↓ K

CA3 25,16

%

↓ K 28,50

% 20,52

% 17,81

% ↓ K

35,80 % ↓ K

25,57 %

Hilus 25,80

% 21,83

%

↓ K, S 28,70

% 12,05

% ↓ K

31,29 % ↓ S

24,56 %

Gyrus dentatus 16,51

% 17,92

% 16,49

% 15,87

% 28,10 % 20,52 %

Non- CA1

↓ K, S, R 55,30 %

↓ K, S 37,20

%

↓ K, S, R 35,06

%

↓ K, S, R 49,54

% ↓ K, S, R 63,45 %

↓ K, S 42,81 %

responder CA2 ↓ K, S

54,55 %

CA3 ↓ S

35,12 %

↓ K 29,79

% 22,12

% 24,12

% ↓ K, S

59,02% ↓ K, S

34,42 %

Ergebnisse

103

Hilus ↓ K, S

42,82 %

↓ K, S 41,73

%

↓ K, S 26,96

% 15,85

% ↓ K

35,64 % ↓ K, S

34,71 %

Gyrus dentatus ↓ K, S

35,09 %

↓ K 27,62

% 11,82

% 23,70

% ↓ K

39,00 % ↓ K

24,37 %rechts GABA-A Rezeptor Untereinheiten

Gruppe Hippocampale

Region α 1 α 2 α 3 α 4 α 5 γ 2

Responder CA1 15,71

% 10,81

% 7,65 %24,81

% ↑ N ↓ K 29,15 % 20,26 %

CA2 31,62 %

CA3 4,55 %

↓ K 25,74

% 16,81

%

↓ K 14,53

% 28,92 % ↓ S

25,57 %

Hilus 17,17

%

↓K 28,11

% 21,00

% 9,66 % 20,19 % 19,62 %

Gyrus dentatus 12,01

% 18,74

% 9,07 % 24,70

% 15,44 % 17,03 %

Non- CA1 ↓ K, S

46,66 %

↓ K 33,50

%

↓ K, S 22,69

% 47,08

% ↓ K, S, R 60,81 %

↓ K, S 42,86 %

responder CA2 ↓K

41,99 %

CA3 15,89

%

↓K 39,45

%

↓ K 23,11

%

↓ K, S 21,51

% ↓K, S

56,17 % ↓ K, S

34,42 %

Hilus ↓ K, S

34,50 %

↓K 39,29

% 19,31

% 5,01 % 28,61 % ↓ K

27,47 %

Gyrus dentatus ↓ S

33,13 %

↓ K 30,93

% 8,62 % 27,71

% 29,79 % 20,33 % Legende: K=Kontrolle, S=Sham, R=Responder, N=Nonresponder

Ergebnisse

104

Tab. 8: Vergleich der ipsi- und kontralateralen Hirnhemisphären hinsichtlich der

GABAA-Rezeptoruntereinheiten. Ipislateral bezieht sich auf die rechte Hemisphäre, in

welcher die Elektrode lokalisiert ist. Kontralateral beschreibt entsprechend die linke

Hirnhälfte. Der Seitenvergleich erfolgte mittels eines paarigen, zweiseitigen t-Tests

(P< 0,05): Es sind keine besonderen Unterschiede zwischen den Hirnhemisphären

erkennbar.

GABA-A Rezeptor-Untereinheiten

Gruppe Hippocampale

Region α 1 α 2 α 3 α 4 α 5 γ 2Responder CA1

CA2 CA3 Hilus Dentater Gyrus

Nonresponder CA1 CA2 CA3 * l > r Hilus Dentater Gyrus

Sham CA1 CA2 CA3 Hilus ** l > r Dentater Gyrus * l > r

Kontrolle CA1 CA2 CA3 Hilus * l > r ** l > r Dentater Gyrus

Diskussion

105

6 Diskussion

6.1 Selektion In einer vorhergehenden Studie, bei welcher in dem gleichen post-SE Rattenmodell

für Temporallappenepilepsie Phenobarbital verabreicht wurde, konnten von

insgesamt elf Ratten vier Phenobarbital-Nonresponder selektiert werden (36 %)

(BRANDT et al., 2004). Dieses Resultat konnte in der vorliegenden Arbeit

reproduziert werden, da hier sechs von 15 Tieren (40 %) als Phenobarbital-

Nonresponder eingestuft wurden. Diese Resistenz konnte auf ein weiteres

Antiepileptikum mit differierendem Wirkmechanismus ausgedehnt werden, da 83 %

der Phenobarbital-Nonresponder sich auch als resistent gegenüber der Behandlung

mit Phenytoin erwiesen und damit der Situation bei Humanpatienten entsprechen,

bei welchen 86-90 % der Epilepsiekranken mit persistierenden Anfällen sich trotz

Behandlung mit einem adäquaten Antiepileptikum auch als resistent gegenüber

alternativen Medikamenten zeigen (ZUMSTEG et al., 2006).

Verglichen mit Phenobarbital gestaltete sich die Entwicklung eines geeigneten

Dosierungsschemas für Phenytoin ungleich schwieriger, da Phenytoin nur eine

relativ enge therapeutische Konzentrationsspanne aufweist. Bei leicht erhöhten

Plasmaspiegeln kann es zu toxischen Effekten wie Ataxie und Somnolenz kommen

(KUTT und HARDEN, 1999). Des weiteren kann Phenytoin bei toxischen

Konzentrationen sowohl bei Humanpatienten als auch bei Labortieren prokonvulsive

Effekte ausüben, was zu einer Anfallsverschlechterung führen kann (LÖSCHER et

al., 1998; PERUCCA et al., 1998). Ob Phenytoin pro- oder antikonvulsive Effekte

ausübt, scheint vom jeweiligen Status der Neurone abzuhängen. So ist anzunehmen,

dass die exzitatorischen Effekte, welche Phenytoin auf eine Subgruppe von

normalen Neuronen ausübt, durch Prozesse wie Kindling verstärkt werden, und

dadurch Phenytoin-Konzentrationen, die normalerweise antikonvulsiv wirken, zu

prokonvulsiver Aktivität führen (JURNA, 1985). Verglichen mit Vorversuchen zur

Dosisfindung bei nicht-epileptischen Tieren, reagierten die epileptischen Tiere mit

verstärkten neurotoxischen Nebenwirkungen (Ataxie, Sedation) und einer Erhöhung

der Anfallsfrequenz bei hohen Phenytoin-Dosen, welche mit Plasmaspiegeln > 20

μg/ml einhergingen und eine individuelle Phenytoin-Dosierung unumgänglich

Diskussion

106

machten. Nach Anpassung der Dosierung führte Phenytoin bei 40 % der Tiere zu

einer Anfallsreduktion. Die durchschnittliche Plasmakonzentration, bei welcher

Phenytoin antikonvulsive Effekte aufwies, lag bei 12 μg/ml (im Bereich von 6-23

μg/ml), das heißt nahe bei der therapeutischen Plasmakonzentration von 10-20

μg/ml, welche für Humanpatienten gilt (HVIDBERG, 1985; KUTT und HARDEN,

1999). Bei der Mehrheit der Patienten wird eine verbesserte Anfallskontrolle

beobachtet, wenn die Plasmaspiegel von Phenytoin 10 μg/ml erreichen (KUTT und

HARDEN, 1999). Der vorliegende Versuch zeigt, dass durch eine individuelle

adäquate Adjustierung der Phenytoin-Dosierung eine komplette Kontrolle der

spontan wiederkehrenden Anfälle bei einigen Tieren erzielt werden kann

(BETHMANN et al., 2007).

Zwei weitere Studien haben den Effekt von Phenytoin auf spontan wiederkehrende

Anfälle in post-SE-Modellen für Temporallappenepilepsie charakterisiert (LEITE und

CAVALHEIRO, 1995; VAN VLIET et al., 2006). Die Studie von VAN VLIET (2006)

wird bei der Kombinationstherapie diskutiert. In der Studie von LEITE und

CAVALHEIRO (1995) wurden in einem Pilocarpin-Modell männliche Wistar-Ratten

zweimal täglich mit je 50 mg/kg Phenytoin i. p. über einen Zeitraum von zwei

Wochen behandelt. Von insgesamt acht untersuchten Tieren wurde bei zweien eine

komplette Anfallskontrolle observiert und fünf weitere zeigten einen deutlichen

Anfallsrückgang. Während der Phenytoin-Gabe beobachteten LEITE und

CAVALHEIRO (1995) Sedation und leichte Muskelrelaxierung. Während der

zweiwöchigen Kontrollphasen vor und nach der Behandlung sowie der

Behandlungsphase, wurden die Anfälle lediglich für 10 Std./Tag, 5 Tage/Woche

aufgezeichnet, und nur zwei der acht Tiere besaßen EEG-Elektroden, mittels derer

für 2 Std./Tag, 3 Tage/Woche ein EEG abgeleitet wurde. Es erfolgte also keine

kontinuierliche EEG- und Videoüberwachung, welche für die Evaluierung von

Effekten von Antiepileptika bei Ratten mit spontan wiederkehrenden Anfällen eine

Grundvoraussetzung darstellt (STABLES et al., 2003; BERTRAM, 2006).

Ein generelles Problem bei der Testung von Antiepileptika auf ihre Effizienz im

Rattenmodell mit spontanen Anfällen liegt in der Bestimmung der optimalen Dauer

des Behandlungszeitraums, welcher verlässliche Einschätzungen der Effizienz

Diskussion

107

erlauben muss, besonders im Hinblick auf beachtliche inter-individuelle Variabilitäten

bei der Anfallsfrequenz. Deshalb wurde bei dem Selektionsmodell ein Testschema

mit Kontrollphasen vor und nach der Behandlungsphase verwendet, welches die

Möglichkeit bot, dass jedes Tier als seine eigene Kontrolle fungierte. Vorhergehende

Versuche mit dem vorliegenden Post-SE-Modell für Temporallappenepilepsie

konnten bestätigen, dass die Mehrheit der epileptischen Ratten spontan

wiederkehrende Anfälle während zweiwöchiger Perioden zeigte, und dass sich die

Frequenz dieser Anfälle zwischen Pre- und Postrdrug-Phasen nicht signifikant

unterschied (BRANDT et al., 2004). Für präzisere Aussagen bezüglich der Effizienz

von Antiepileptika wäre es sicherlich von Vorteil, die Dauer der Kontroll- und

Behandlungsphasen noch auszudehnen. Es würde jedoch einen enormen Aufwand

hinsichtlich der visuellen Analyse von EEGs und Videobändern bedeuten, wenn

große Tiergruppen über mehrere Wochen mit einer kontinuierlichen Überwachung

(24 Std./Tag, 7 Tage/Woche) aufgenommen werden würden (BERTRAM, 2006). Die

momentan auf dem Markt erhältlichen automatischen Programme zur

Anfallsdetektion sind nicht akkurat genug, um für die Verwendung bei der EEG-

Analyse der Effizienz von Antiepileptika in Rattenmodellen in Frage zu kommen.

Außerdem ist eine Kombination von EEG- und Videomonitoring unerlässlich, um

EEG-Artefakte auszumerzen (BERTRAM, 2006). Die EEG- und Videoaufzeichnung

von Nagetieren ist technisch aufwendig, teuer und verbunden mit einem enormen

personellen Zeitaufwand, was erklärt, dass nur wenige Arbeitsgruppen die Effizienz

von Antiepileptika in Rattenmodellen mit spontanen Anfällen evaluieren (STABLES et

al., 2003; BERTRAM, 2006). Die Entwicklung neuer Technologien, welche die

Genauigkeit von automatischer Anfallsdetektion verbessern und somit die Testung

von Antiepileptika in einem kleineren Zeitrahmen ermöglichen, wäre daher

wünschenswert (STABLES et al., 2003).

In Bezug auf die Beobachtung, dass epileptische Ratten mit spontanen Anfällen

sensitiver auf die zentralen Nebenwirkungen von Phenytoin ansprechen als nicht-

epileptische Kontrollen, ist es interessant zu bemerken, dass in früheren Versuchen

gekindelte Ratten sensitiver als nicht-gekindelte Ratten auf neurotoxische

Nebenwirkungen einschließlich prokonvulsiver Effekte von mehreren klinisch

Diskussion

108

etablierten Antiepileptika, darunter auch Phenytoin, reagierten (LÖSCHER et al.,

1989; LÖSCHER und HÖNACK, 1990; LÖSCHER und HÖNACK, 1991;

RUNDFELDT et al., 1994; WLAZ et al., 1994; HÖNACK und LÖSCHER, 1995;

LÖSCHER et al., 1998; POTSCHKA et al., 2000). Das könnte darauf hindeuten, dass

die Epileptogenese, wie sie durch Kindling oder einen SE induziert wird, das Gehirn

empfindlicher gegenüber neurotoxischen Effekten bestimmter Medikamente werden

lässt und damit den therapeutischen Index dieser Substanzen einschränkt. Die

Gründe einer erhöhten Sensitivität für prokonvulsive Effekte sind nicht hinreichend

klar, beinhalten aber mutmaßlich eine verminderte Anfallsschwelle korreliert mit einer

erhöhten Erregbarkeit des Gehirns und/oder Veränderung in Zielstrukturen des

Antiepileptikums, wie sie beim Epilepsiegeschehen vorkommen (LÖSCHER, 1999;

REMY und BECK, 2006).

Durch die vorliegende Beobachtung, dass die Mehrheit derjenigen Tiere, welche sich

als resistent gegenüber Phenobarbital erwiesen, ebenfalls nicht auf Phenytoin

ansprach, erfüllt das Epilepsiemodell die wichtigste Bedingung eines Tiermodells für

pharmakoresistente Epilepsie, die besagt, dass die anhaltende Anfallsaktivität nicht

oder nur schwach auf mindestens zwei Antiepileptika, welche in ihrer maximal

tolerierbaren Dosis verabreicht werden, anspricht (STABLES et al., 2003). Diese

Definition von Pharmakoresistenz für Epilepsiemodelle wurde von einem Modell-

Workshop empfohlen, welcher von den National Institutes of Health (NIH) 2002

organisiert wurde (STABLES et al., 2003).

Die Frequenz von spontan wiederkehrenden Anfällen kann bekanntermaßen in Post-

SE-Modellen für Temporallappenepilepsie stark variieren (NISSINEN et al., 2000;

CAVALHEIRO et al., 2006; DUDEK et al., 2006). Das konnte auch für das

vorliegende Modell (BRANDT et al., 2003; BRANDT et al., 2004) bestätigt werden.

Vor allem Ratten mit einer besonders hohen Anfallsfrequenz scheinen resistent

gegenüber Phenobarbital zu sein (BRANDT et al., 2004), was auf einen schwereren

Krankheitsgrad hindeutet. Allerdings sprach im vorliegenden Versuch ein

Phenobarbital-Nonresponder mit einer besonders hohen Anfallsfrequenz auf

Phenytoin an. Die Ursache hierfür ist nicht klar, jedoch passt diese Beobachtung zu

klinischen Erfahrungen, bei den Patienten mit anhaltenden Anfällen trotz der

Diskussion

109

Behandlung mit geeigneten Antiepileptika in maximal tolerierbaren Dosierungen

immerhin eine geringe Chance haben, auf alternative Antiepileptika anzusprechen

(ZUMSTEG et al., 2006).

Ein möglicher Erklärungsansatz für die beobachtete, simultane Resistenz gegenüber

Phenytoin und Phenobarbital könnte die Überexpression des Efflux-Transporters P-

glykoprotein (P-gp) in kapillären Endothelzellen von Nonrespondern in limbischen

Hirnregionen (Hippocampus, piriformer Kortex) darstellen, welche kürzlich

nachgewiesen wurde (VOLK und LÖSCHER, 2005). Sowohl Phenytoin als auch

Phenobarbital stellen P-gp-Substrate dar, so dass die erhöhte Expression dieses

Multidrug-Transporters in Endothelzellen von Gehirnkapillaren, welche die Blut-

Hirnschranke formen, die Aufnahme dieser Antiepileptika ins Gehirn reduzieren

könnte (LÖSCHER und POTSCHKA 2005 a und b). VAN VLIET et al. (2007b)

konnten in einem ähnlichen Post-SE-Modell für Temporallappenepilepsie zeigen,

dass die Überexpression von P-gp im Hippocampus sowie im entorhinalen Kortex zu

verminderten Phenytoin-Konzentrationen in diesen Hirnregionen führt.

Durch die Verwendung von Phenytoin für die Selektion von Phenytoin-resistenten

Ratten im Amygdala-Kindling-Modell für Temporallappenepilepsie konnte in früheren

Untersuchungen gezeigt werden, dass sich die Resistenz gegenüber Phenytoin bei

diesen Tieren auch auf Phenobarbital und diverse andere Antiepileptika ausdehnt

(LÖSCHER, 1997). Phenytoin-resistente gekindelte Ratten wurden intensiv

charakterisiert, und es scheinen sowohl genetische Faktoren als auch kindling-

assoziierte Gehirnveränderungen, einschließlich einer P-gp-Überexpression in der

gekindelten Amygdala, in die Mechanismen, welche Pharmakoresistenz zugrunde

liegen, involviert zu sein (LÖSCHER, 1997; POTSCHKA et al., 2004a; LÖSCHER,

2006). Interessanterweise war das neue Antiepileptikum Levetiracetam das einzige

Antiepileptikum, welches sich bei Phenytoin-Nonrespondern als effektiv herausstellte

(LÖSCHER et al., 2000). In einer Folgestudie mit einem Pilocarpinmodell für

Temporallappenepilepsie konnten Ratten mit spontanen Anfällen selektiert werden,

die entweder auf Levetiracetam ansprachen oder nicht (GLIEN et al., 2002), was

darauf hinweist, dass Post-SE-Modelle der Temporallappenepilepsie die klinische

Effizienz von Antiepileptika eventuell korrekter vorhersagen als Kindlingstudien. Beim

Diskussion

110

Modell-Workshop des NIH 2002 wurde beschieden, dass basierend auf dem

heutigen Wissensstand und den verfügbaren Modellen, Modelle für symptomatische

Epilepsie, basierend auf elektrisch oder chemisch induziertem SE, die meisten

Parallelen mit einer häufigen Form der humanen pharmakoresistenten Epilepsie, der

mesialen Temporallappenepilepsie aufweisen (STABLES et al., 2003). Während des

Workshops wurde weiterhin beschlossen, dass Post-SE-Modelle für chronische

limbische Epilepsie für Studien zur Pharmakosensitivität und Resistenz empfohlen

werden für die Entwicklung neuartiger Therapiestrategien für pharmakoresistente

Epilepsie (STABLES et al., 2003). Mit den vorliegenden Versuchen anhand eines

Post-SE-Modells für Temporallappenepilepsie, in welchem spontan wiederkehrende

Anfälle mittels andauernder elektrischer Stimulation der basolateralen Amygdala

induziert wurden, werden einige dieser Empfehlungen berücksichtigt.

Die vorliegende Arbeit basiert auf mehreren vorhergehenden Versuchen zur

Pharmakoresistenz in unterschiedlichen Epilepsiemodellen. So untersuchten LEITE

und CAVALHEIRO (1995) den antikonvulsiven Effekt von konventionellen

Antiepileptika wie Phenobarbital, Phenytoin, Carbamazepin, Valproat und

Ethosuximid auf spontan wiederkehrende Anfälle im Pilocarpin-Modell bei Ratten.

Dabei stellte sich heraus, dass Phenobarbital (40 mg/kg/Tag), Carbamazepin (120

mg/kg/Tag), Phenytoin (100 mg/kg/Tag) sowie Valproat (600 mg/kg/Tag) die Anfälle

effektiv verhindern, wenn sie über einen Zeitraum von zwei Wochen appliziert

werden. Daraus wurde geschlussfolgert, dass die spontan wiederkehrenden Anfälle,

welche sich nach einem Pilocarpin-induzierten Status epilepticus entwickeln, ein

adäquates Modell für die Entdeckung neuer Antiepileptika mit einer höheren Effizienz

gegenüber komplex-fokalen Anfällen darstellen könnten. Da bei dem Versuch sehr

hohen Dosen von Phenobarbital, Phenytoin, Carbamazepin und Valproat verabreicht

wurden, konnten die spontanen Anfälle bei allen Ratten unterdrückt werden. Dies

entspricht jedoch nicht der klinischen Situation der Temporallappenepilepsie, bei

welcher mindestens 50 % der Patienten als pharmakoresistent eingestuft werden

(LEPPIK, 1992). Da in der Studie von LEITE und CAVALHEIRO (1995) keine

Plasmalevel ermittelt wurden, ist es nicht möglich, direkte Vergleiche zwischen den

Daten von Ratten und Humanpatienten zu ziehen, da die Pharmakokinetik von

Diskussion

111

Antiepileptika sich bei diesen beiden Spezies stark unterscheidet (LÖSCHER und

SCHMIDT, 1988). Die meisten Antiepileptika werden bei Ratten schneller eliminiert

als beim Menschen (LÖSCHER und SCHMIDT, 1988), was die Aufrechterhaltung

eines aktiven Medikamentenspiegels durch herkömmliche Applikationsrouten fast

unmöglich gestaltet. Um zu vermeiden, dass die Arzneistoffe zu rasch eliminiert

wurden, waren LEITE und CAVALHEIRO (1995) gezwungen, alle Antiepileptika

außer Phenobarbital zwei- bis dreimal täglich intraperitoneal zu injizieren. Dadurch

kann es zu starken Fluktuationen des Plasmaspiegels zwischen den Injektionen und

zu Peaks der Plasmakonzentration kommen, welche die therapeutischen

Plasmalevel beim Menschen weit übersteigen. LEITE und CAVALHEIRO

beobachteten gravierende Nebenwirkungen, wie Sedation und Muskelrelaxation. Da

die Definition der Pharmakoresistenz jedoch besagt, dass keine klinisch relevante

Verbesserung der Anfälle bei maximal tolerierbaren Dosierungen von

Standardantiepileptika zu beobachten ist (REGESTA und TANGANELLI, 1999), wäre

der antikonvulsive Effekt einer Substanz bei toxischer Dosierung für die Klinik

irrelevant (BETHMANN et al., 2007).

6.2 Kombinationstherapie Die vorliegenden Versuche basieren auf einer Reihe von Vorkenntnissen. So ist

bekannt, dass Phenobarbital-Nonresponder, welche mittels des Post-SE-Modells für

Temporallappenepilepsie selektiert werden, eine markante Überexpression des

Multidrug-Transporters P-gp in Endothelzellen der Gehirnkapillaren in limbischen

Hirnregionen, einschließlich des Hippocampus, aufweisen (VOLK und LÖSCHER,

2005). Da Phenobarbital ein bekanntes Substrat von P-gp darstellt (SCHUETZ et al.,

1996; POTSCHKA et al., 2002), könnten aus der erhöhten P-gp Expression

subtherapeutische Phenobarbital-Konzentrationen in den Zielstrukturen des Gehirns

resultieren (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a). Die P-gp Expression konnte im

vorliegenden Versuch nicht verifiziert werden, da die immunhistologische

Aufarbeitung der Gehirne auf die Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten hin

optimiert wurde, welche sich dadurch nicht mehr für P-gp-Analysen eigneten. So

betrug die Schnittdicke der Gehirne 40 μm, welche nicht geeignet ist, einzelne

Diskussion

112

Gefäße zu erfassen, da sich verschiedene Gehirnebenen überlagern können. Des

weiteren wurde die Regulation von P-gp im gleichen Selektionsmodell wie dem hier

verwendeten bereits in einer früheren Studie untersucht (VOLK und LÖSCHER,

2005). Dabei konnte gezeigt werden, dass P-gp bei Phenobarbital-resistenten Tieren

verglichen mit Phenobarbital-sensitiven Ratten in limbischen Hirnregionen (CA1,

Gyrus dentatus, piriformer Kortex) signifikant hochreguliert war.

Da die vorliegende Arbeit in genau der gleichen Art und Weise durchgeführt wurde,

wie die frühere Untersuchung zur P-gp Expression bei Nonrespondern (VOLK und

LÖSCHER, 2005), wurde vorausgesetzt, dass die Pharmakoresistenz hier ebenfalls

an eine erhöhte Expression von P-gp gekoppelt ist. Es war weiterhin bekannt, dass

die Hemmung von P-gp in der Blut-Hirnschranke die Penetration von systemisch

appliziertem Phenobarbital im Gehirn von normalen, nicht-epileptischen Ratten

erhöht (POTSCHKA et al., 2002). Deshalb wurde die Kombinationstherapie mit

einem selektiven P-gp Inhibitor bei Phenobarbital-resistenten epileptischen Ratten

mit einer Überexpression von P-gp in limbischen Hirnregionen als plausible Strategie

angesehen, um die Rolle von P-gp bei der Resistenz dieser Ratten zu erforschen. In

einem Mausmodell konnte die gleichzeitige Gabe des P-gp Inhibitors Tariquidar (6-

12 mg/kg i. p.) die antitumorale Aktivität einer Reihe von chemotherapeutischen

Agenzien, welche gegen zwei hochgradig chemotherapieresistente, P-gp

überexprimierende, humane Xenograft-Tumore gerichtet waren, vollständig

aufheben, ohne die Plasma-Pharmakokinetik oder die Toxizität der

Chemotherapeutika zu modifizieren (MISTRY et al., 2001). Tariquidar ist einer der

potentesten und selektivsten P-gp Inhibitoren, die derzeit zur Verfügung stehen

(MARTIN et al., 1999; MISTRY et al., 2001; BATES et al., 2002; THOMAS und

COLEY, 2003), und wurde darum als ideale Substanz für die vorliegenden

Experimente angesehen.

Bei der Mehrheit der Phenobarbital-Nonresponder konnte die Kombination mit

Tariquidar die Resistenz gegenüber Phenobarbital aufheben. Das Ausmaß dieses

dosisabhängigen Effektes war unerwartet, da die meisten Ratten, welche auf die

alleinige Behandlung mit Phenobarbital nicht ansprachen, unter der gleichzeitigen

Gabe von Tariquidar in Dosierungen von 15-20 mg/kg komplett anfallsfrei wurden.

Diskussion

113

Dieser erstaunliche Effekt des Tariquidars war weder mit einer erhöhten Toxizität

noch mit einem veränderten Plasmalevel von Phenobarbital verknüpft. Obwohl eine

epileptische Ratte während der Behandlung mit Tariquidar verstarb, wird dies nicht

als eine Konsequenz der Therapie mit dem P-gp Inhibitor (oder Phenobarbital)

angesehen, da eine andere Arbeitsgruppe gezeigt hat, dass Ratten eine Dosis bis zu

500 mg/kg Tariquidar ohne toxische Nebeneffekte tolerieren (Dr. John F. Waterfall;

Xenova Group, unveröffentlichte Daten). Es wird daher angenommen, dass der Tod

des Tieres eher eine Folge der schweren Epilepsie darstellte und nicht aus der

Behandlung resultiert, obgleich solche Schlussfolgerungen mittels zusätzlicher

Experimente in therapieresistenten, chronisch epileptischen Ratten überprüft werden

sollten. Die Tatsache, dass die Kombination mit Tariquidar die Resistenz gegenüber

den antikonvulsiven Effekten von Phenobarbital aufhob ohne gleichzeitige Erhöhung

der Toxizität, könnte durch die regional begrenzte Überexpression von P-gp im

Gehirn von Phenobarbital-Nonrespondern erklärt werden (VOLK und LÖSCHER,

2005). In dem verwendeten Modell wurde eine Hochregulation von P-gp in den

Kapillarendothelien im Hippocampus und im piriformen Kortex gefunden, also in

Hirnregionen die aller Wahrscheinlichkeit nach in das epileptische Netzwerk, welches

der Temporallappenepilepsie zugrunde liegt, involviert sind, jedoch nicht in extra-

limbischen Gehirnbereichen wie dem zerebralen Kortex (VOLK und LÖSCHER,

2005). Bei normalen Ratten wurde ein moderater, wenngleich statistisch

signifikanter, Anstieg der Phenobarbital-Gehirnlevel lediglich nach intrazerebraler

Perfusion einer hohen Konzentration des P-gp Inhibitors Verapamil (POTSCHKA et

al., 2002) und nicht nach systemischer Gabe von 15 mg/kg des selektiveren P-gp

Inhibitors Tariquidar beobachtet (C. Brandt, unveröffentlichte Daten).

Basierend auf diesen Daten könnte angenommen werden, dass bei normaler P-gp

Expression in der Blut-Hirnschranke ein zu vernachlässigender Effekt von P-gp auf

die Durchlässigkeit von lipophilen Antiepileptika wie Phenobarbital ausgeübt wird,

welche die Blut-Hirnschranke einfach durch passive Diffusion durchqueren

(LÖSCHER und POTSCHKA, 2005b). In diesem Fall würde die Inhibition von P-gp

durch Tariquidar den Gehirnzugang von Antiepileptika nur dann wesentlich

beeinflussen, wenn P-gp in limbischen Hirnregionen überexprimiert wird, jedoch nicht

Diskussion

114

in anderen Hirnregionen oder in peripherem Gewebe mit normaler P-gp Expression.

Die gleichzeitige Gabe von Tariquidar würde dann zwar die therapeutischen

Konzentrationen von Phenobarbital in limbischen Hirnregionen gewährleisten, jedoch

nicht die Neurotoxizität steigern (BRANDT et al., 2006). Wie bereits erwähnt, erwies

sich derselbe Dosierungsbereich von Tariquidar, welcher in der vorliegenden Arbeit

verwendet wurde, auch als geeignet, um die antitumorale Aktivität von

Chemotherapeutika gegen P-gp überexprimierende Tumoren wiederherzustellen,

ohne die Toxizität dieser Agenzien zu erhöhen (MISTRY et al., 2001). In diesem

Zusammenhang ist es auch wichtig zu erwähnen, dass im Gegensatz zu den

deutlichen Unterschieden bezüglich des antikonvulsiven Effekts von Phenobarbital

die neurotoxischen Nebenwirkungen von Phenobarbital bei Respondern und

Nonrespondern die gleichen waren. Das deutet daraufhin, dass Nebenwirkungen von

anderen Hirnregionen vermittelt werden, als die antikonvulsiven Effekte von

Phenobarbital. Das gleiche trifft auch für Humanpatienten mit refraktärer Epilepsie

zu, bei denen Antiepileptika zwar die Anfälle nicht beeinflussen, aber dennoch

neurotoxische Nebeneffekte ausüben (KWAN und BRODIE, 2000).

Obwohl die ermittelten Daten deutlich für eine funktionelle Beteiligung von P-gp bei

Pharmakoresistenz sprechen, kann auch mit dem für diese Studie verwendeten

Modell nicht ausgeschlossen werden, dass andere Mechanismen zum

Resistenzgeschehen beitragen. Wie beispielsweise in der Literaturübersicht erwähnt,

könnten intrinsische oder erworbene Veränderungen der Zielstrukturen (Targets) der

Antiepileptika im Gehirn bei pharmakoresistenter Epilepsie eine Rolle spielen (REMY

und BECK, 2006). Einhergehend mit der Hypothese der Targetveränderung wurde

berichtet, dass Phenobarbital-Nonresponder, welche mit dem gleichen Modell wie

dem vorliegenden selektiert wurden, sich von Respondern hinsichtlich der

Pharmakologie der GABAA-Rezeptorbindung im Gyrus dentatus des Hippocampus

unterscheiden (VOLK et al., 2006; siehe auch Diskussion GABAA). Des weiteren

wiesen Phenobarbital-Nonresponder eine gravierende Neurodegeneration in der

hippocampalen Formation auf, was bei Respondern nicht der Fall war (VOLK et al.,

2006). Diese Befunde lassen darauf schließen, dass bei der Resistenz von Anfällen

gegenüber Antiepileptika im Rattenmodell für Temporallappenepilepsie die

Diskussion

115

veränderten Netzwerkeigenschaften aus einem Verlust von Neuronen im dentaten

Hilus und den assoziierten Modifikationen der GABAA-Rezeptoren resultieren. Unter

Berücksichtigung der vorhergehenden (VOLK und LÖSCHER, 2005) und der

aktuellen Daten zur Multidrug-Transporter-Hypothese, ist es wichtig zu bemerken,

dass die Hypothesen zur Targetveränderungen und zu den Transportern sich nicht

ausschließen, sondern gemeinsam im gleichen Gewebe vorkommen oder sogar

interagieren könnten. Das wird auch durch diese und vorherige Daten zu den

Phenobarbital-Nonrespondern demonstriert, bei denen eine gesteigerte P-gp

Expression, Zellverluste und Veränderungen von GABAA-Rezeptoren zusammen in

der hippocampalen Formation auftreten und gemeinsam agieren könnten, um die

Effizienz der Antiepileptika bei diesen Tieren zu reduzieren (VOLK und LÖSCHER,

2005; VOLK et al., 2006). Wie durch die aktuellen Daten gezeigt wird, welche

belegen, dass die Hemmung von P-gp die Phenobarbital-Resistenz bei den meisten

Nonrespondern umkehren kann, scheint die Überexpression von P-gp doch in

diesem Modell eine Hauptrolle bei der Pharmakoresistenz zu spielen. Da die

unterschiedlichen Antiepileptika verschiedenartige Wirkmechanismen aufweisen,

kann der Anteil des jeweiligen Resistenzmechanismus von der entsprechenden

Zielstruktur des Antiepileptikums abhängen und von Antiepileptikum zu

Antiepileptikum variieren. Eine Möglichkeit, zu testen, inwieweit Veränderungen von

GABAA-Rezeptoruntereinheiten oder Überexpression von P-gp eine Rolle spielen,

könnte der Einsatz von Tariquidar und Diazepam sein, wobei letzteres kein Substrat

von P-gp darstellt und durch Modulation des GABAA-Rezeptors wirkt.

Eine Studie, welche die vorliegenden Ergebnisse der Kombinationstherapie

unterstützt, wurde von VAN VLIET et al. (2006) für ein elektrisches Rattenmodell

beschrieben, bei welchem männlichen Sprague-Dawley Ratten eine Kombination von

Tariquidar und Phenytoin verabreicht wurde. Der SE wurde hierbei über eine

kontinuierliche Stimulation des Hippocampus induziert. Die EEG- und

Videoauswertung erfolgte lediglich für acht Std. täglich, da acht Stunden als das

therapeutische Fenster von Phenytoin angesehen wurden. Bei sechs Tieren wurde

Tariquidar in zwei verschiedenen Dosierungen (12 mg/kg und 24 mg/kg) für jeweils

sieben Tage, eine Stunde vor Phenytoin per os verabreicht. Phenytoin wurde in

Diskussion

116

Dosierungen von 50 mg/kg (Bolus: 75 mg/kg) einmal täglich unter

Isoflurananästhesie i.p. injiziert. Tariquidar erhöhte die antikonvulsive Wirkung von

Phenytoin. Der antikonvulsive Effekt von Phenytoin während der Kombination mit

Tariquidar war jedoch transient und konnte bei beiden Tariquidar-Dosierungen nur

während der ersten drei bis vier Behandlungstage beobachtet werden und nicht wie

bei der vorliegenden Studie über den gesamten Behandlungszeitraum (VAN VLIET

et al., 2006). Die beiden Studien lassen sich jedoch auch nur schwerlich vergleichen,

da die Ratten bei VAN VLIET et al. (2006) vor der Tariquidar-Behandlung nicht in

Phenytoin-Responder und Phenytoin-Nonresponder unterteilt wurden. Des weiteren

wurde Phenytoin bei der VAN VLIET-Studie (2006) nicht in maximal tolerierbaren

Dosen verabreicht, so dass hier kaum geschlussfolgert werden kann, dass

Pharmakoresistenz durch Inhibition von P-gp beigelegt werden kann.

Neben der P-gp Inhibition könnte eine alternative Erklärungsmöglichkeit für den

Effekt der Kombination mit Tariquidar darin bestehen, dass Tariquidar seinerseits

antikonvulsive Effekte ausübt und somit die Effizienz von Antiepileptika wie

Phenobarbital oder Phenytoin potenziert. Leider war im vorliegenden Versuch die

Verfügbarkeit des Tariquidars beschränkt, so dass nur eine relativ kleine Dosis

dieser Substanz (10 mg/kg zweimal täglich) alleine getestet werden konnte.

Tariquidar ohne Phenobarbital übte keinen signifikanten antikonvulsiven Effekt aus.

VAN VLIET et al. (2006) überprüften ebenfalls den Effekt einer längeren Behandlung

mit einer Dosis von 24 mg/kg Tariquidar ohne Phenytoin und beobachteten keine

Veränderung bezüglich der Anfallsfrequenz, der Anfallsdauer oder dem Verhalten im

Vergleich zur Predrug-Kontrollphase. Während der präklinischen Entwicklung von

Tariquidar wurden wesentlich höhere Dosierungen auf ihre antikonvulsiven Effekte in

Standard-Nagermodellen für Epilepsie geprüft und kein antikonvulsiver Effekt von

Tariquidar festgestellt (Dr. John F. Waterfall, Xenova Group; unveröffentlichte

Daten). Tariquidar wurde auch in vitro mit einer großen Anzahl von Rezeptorassays

untersucht und als negativ befunden, was die hohe Selektivität von Tariquidar für P-

gp unterstreicht (Dr. John F. Waterfall, Xenova Group; unveröffentlichte Daten). Es

scheint also sehr unwahrscheinlich, dass andere Mechanismen, als die P-gp

Inhibition dem Effekt der Kombination von Tariquidar mit Antiepileptika in

Diskussion

117

Epilepsiemodellen zugrunde liegen, wie in der Studie von VAN VLIET et al. (2006)

und der vorliegenden beobachtet.

Natürlich ist nicht auszuschließen, dass bei einer Inhibition von P-gp andere

Multidrug-Transporter die Rolle von P-gp übernehmen könnten. So konnten

beispielsweise VAN VLIET et al. (2005) einen erhöhten Proteinlevel für MRP1, MRP2

und BCRP in Astrozyten und Blutgefäßen des limbischen Systems einschließlich des

Hippocampus nach einem SE bei Ratten nachweisen. Problematisch gestaltet sich

jedoch, dass nicht für alle Multidrug-Transporter adäquate Inhibitoren zur Verfügung

stehen, um deren genaue Funktion zu analysieren. Zum Beispiel existieren keine

spezifischen Inhibitoren für BCRP (VAN VLIET et al., 2005). Da im vorliegenden

Versuch die spezifische Hemmung von P-gp jedoch sehr effizient wirkte, scheint eine

kompensatorische Hochregulation der anderen Multidrug-Transporter hier keine

Rolle zu spielen, könnte jedoch möglicherweise für den beobachteten Wirkverlust bei

VAN VLIET et al. (2006) verantwortlich sein. So verwendeten VAN VLIET et al.

(2006) Phenytoin als Antiepileptikum, welches nachgewiesermaßen von P-gp und

MRP2 transportiert wird (POTSCHKA et al., 2003). Umgekehrt konnte bestätigt

werden, dass Phenobarbital wohl kein Substrat von MRP`s darstellt, da die

gleichzeitige Gabe von Phenobarbital und dem MRP1/MRP2 Inhibitor Probenecid die

extrazelluläre Konzentration von Phenobarbital, im Gegensatz zu Phenytoin, nicht

erhöht (POTSCHKA et al., 2003). So könnte der transiente Effekt in der Studie von

VAN VLIET et al. (2005) evtl. damit erklärt werden, dass MRP2 nach einigen Tagen

als Antwort auf die P-gp Inhibition vermehrt exprimiert wurde und die Funktion von P-

gp übernommen hat, was letztendlich den Transport von Phenytoin blockiert haben

könnte. Im Gegensatz zu Phenobarbital (POTSCHKA et al., 2002) wirkt Phenytoin

nicht nur als P-gp Substrat, sondern auch als Inhibitor von P-gp (POTSCHKA et al.,

2001, 2002; POTSCHKA und LÖSCHER, 2001b; WEISS et al., 2003), was

Interpretationen erschweren könnte, wenn Phenytoin und Tariquidar gleichzeitig

verabreicht werden. Außerdem wurde erst kürzlich nachgewiesen, dass Phenytoin

auch von dem nicht-ABC-Transporter Ra1A Bindungsprotein 1 (RLIP76) in

Endothelzellen der humanen Blut-Hirnschranke transportiert wird, was zeigt, dass

dieser Transporter ebenfalls eine signifikante Funktion bei der Vermittlung von

Diskussion

118

Medikamentenresistenz bei Epilepsie haben könnte bzw. synergistisch mit P-gp

kooperiert (AWASTHI et al., 2005).

In einer Folgearbeit konnten VAN VLIET et al. (2007a) dann bei epileptischen Ratten

zeigen, dass die Phenytoin-Konzentration um 20-30 % in denjenigen Hirnregionen

reduziert war, in welchen P-gp überexprimiert wurde. Eine gleichzeitige Erhöhung

der P-gp Expression in der Leber führte akut nicht zu einer signifikanten Änderung

der Phenytoin-Clearance, jedoch wurden keine chronischen Veränderungen

untersucht. Die Überexpression von P-gp scheint mit der Anfallsaktivität

einherzugehen, da alle Hirnregionen, in denen eine Überexpression beobachtet

wurde, in die Anfallsgenerierung oder Anfallsausbreitung involviert sind (VAN VLIET

et al., 2007a). Passend dazu konnten auch KWAN et al. (2002) eine erhöhte

Expression von MDR-Genen nur in Regionen nachweisen, welche bei audiogener

Anfallsaktivität (Zwischenhirn und Kortex) in einem genetischen Rattenmodell (GEPR

= genetically epilepsy-prone rats) eine Rolle spielen.

MARCHI et al. (2006) zeigten, dass die P-gp Funktion bei

Methylazoxymethanolazetat (MAM) - behandelten Ratten mit Anfällen, einem Modell

für humane Gehirn-Malformationen, mittels Tariquidar selektiv blockiert werden

konnte.

Die vorliegende Arbeit beschreibt unseres Wissens nach zum ersten Mal einen

proof-of-principle für die Multidrug-Transporter-Hypothese bei der Resistenz

gegenüber Antiepileptika (BRANDT et al., 2006). SISODIYA (2003) postuliert, dass

die Arbeit an der Transporter-Hypothese rational erfolgen sollte. Ein Zugang besteht

in der Beachtung einer Reihe von Kriterien (adaptiert an die Postulate von Koch),

welche erfüllt werden müssen, um einen bestimmten Transportmechanismus als

relevant für Resistenz bei Epilepsie anzusehen (SISODIYA, 2003): 1) die

Mechanismen müssen im epileptogenen Hirngewebe nachweisbar sein; 2) die

Mechanismen müssen eine angemessene Funktionalität innehaben; 3) die

Mechanismen müssen bei der Pharmakoresistenz aktiv sein und 4) Überwindung der

Mechanismen sollte die Pharmakoresistenz beeinflussen.

Beachtliche experimentelle Arbeiten beschäftigen sich mit den ersten drei Kriterien

(SISODIYA, 2003; SCHMIDT und LÖSCHER, 2005; LÖSCHER und POTSCHKA

Diskussion

119

2005a und b). Das vierte Kriterium ist wohl das wichtigste, was den Grund für die

Durchführung der vorliegenden Experimente liefert. Die Daten weisen daraufhin,

dass die Kombination mit einem hochselektiven P-gp Inhibitor wie Tariquidar,

welches in Phase III-Studien bei Patienten mit chemotherapieresistentem Krebs

evaluiert wurde, eine neue Behandlungsoption darstellen könnte, um Resistenz

gegenüber Antiepileptika bei Epilepsie vorzubeugen oder beizulegen. Es wäre wohl

verfrüht, vorzuschlagen, dass die vielversprechenden Ergebnisse einen klinischen

Versuch mit Tariquidar bei Patienten mit refraktärer humaner Epilepsie rechtfertigen

würden, um den potenziellen therapeutischen Nutzen dieser neuartigen Strategie

auszutarieren, da nur zwei Antiepileptika (Phenytoin bei VAN VLIET et al., 2006) in

einem einzigen Rattenmodell für resistente Epilepsie getestet wurden. Da neben

Phenobarbital anscheinend auch zahlreiche andere Antiepileptika Substrate für P-gp

sind (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005 a und b), könnte sich das proof-of-principle-

Konzept der vorliegenden Arbeit auch auf andere Antiepileptika anwenden lassen,

die heutzutage bei der Behandlung von refraktärer humaner Epilepsie häufiger

genutzt werden. Ein Beispiel unter diesem Aspekt ist die Studie von MARCHI et al.

(2005), bei der bei Epilepsiepatienten, die sich einer Operation unterzogen, gezeigt

werden konnte, dass P-gp wohl auch für die Vermittlung der Pharmakoresistenz

gegenüber dem neuen Antiepileptikum Oxcarbazepin verantwortlich ist. MARCHI et

al. (2005) schlagen deshalb vor, dass die Hemmung der P-gp Funktion durch

selektive Blocker eine neue Strategie für die Aufhebung der Pharmakoresistenz

gegenüber Antiepileptika liefern könnte, und somit die Notwendigkeit einer

Resektionsoperation gemindert werden könnte.

Es existieren zwei Studien, welche den Erfolg einer Kombinationstherapie von

Antiepileptika und P-gp-Inhibitoren bei pharmakoresistenten Epilepsiepatienten

belegen. So beschreiben IANETTI et al. (2005) die Behandlung eines elfjährigen

Jungen mit refraktärem SE, welcher auf die üblichen Antiepileptika, die im

Algorhythmus der SE-Behandlung verabreicht wurden (Diazepam, Phenytoin,

Pentobarbital etc.), nicht ansprach. Am 37. Behandlungstag wurde der Kalzium-

Kanal-Blocker und P-gp Inhibitor Verapamil intravenös (0,034 mg/min) simultan mit

Valproat und Phenobarbital verabreicht. Anderthalb Stunden nach Infusionbeginn,

Diskussion

120

bei einer kumulativen Verapamildosis von 3,125 mg, erlangte der Patient das

Bewusstsein wieder, atmete spontan und der SE verschwand. In den sechs Monaten

nach dem SE wurden zwei fokale motorische Anfälle mit sekundärer Generalisierung

beobachtet. Die Verapamil-Behandlung wurde sechs Monate nach dem SE aufgrund

von möglichen synkopalen Episoden abgebrochen und die Anfälle erschienen erneut

mit einer täglichen bis wöchentlichen Frequenz und zeigten sich weiterhin resistent

gegen eine Vielzahl von Antiepileptika. Die Autoren erklären die dramatische Antwort

auf die intravenöse Gabe von Verapamil mit dessen direkter antikonvulsiver Wirkung

basierend auf der Beteilung von Kalzium-Kanälen am Epilepsiegeschehen und mit

der erleichterten Hirnpenetration von Valproat und Phenobarbital, da Verapamil den

Multidrug-Transporter P-gp im zerebrovaskulären Endothelium des epileptischen

Fokus inhibiert haben könnte. Auch im Tiermodell wurde gezeigt, dass die Inhibition

von P-gp durch Verapamil (5 mM) die Konzentration von Phenobarbital in der

Extrazellulärflüssigkeit des zerebralen Kortex signifikant erhöht (POTSCHKA et al.,

2002). Ähnliche Ergebnisse erhielten auch SUMMERS et al. (2004), welche

Verapamil zusammen mit Antiepileptika bei einer 24jährigen Frau mit refraktärer

Epilepsie verabreichten. Die allgemeine Anfallskontrolle besserte sich, die subjektive

Lebensqualität stieg und das durchschnittliche Intervall zwischen

Krankenhausaufenthalten verdoppelte sich.

POTSCHKA und LÖSCHER (2001b) beschreiben ein weiteres Tiermodell, bei

welchem weiblichen Wistar-Ratten via Mikrodialyse drei verschiedene P-gp-

Inhibitoren (Sodium Cyanid, Verapamil und PSC 833) in den rechten frontalen Kortex

appliziert wurden. Die Perfusion mit dem Inhibitor startete 15-60 Min. vor der

systemischen (i. p.) Gabe von 50 mg/kg Phenytoin. Es stellte sich heraus, dass alle

drei P-gp Inhibitoren (Sodium Cyanid > Verapamil > PSC 833) die Konzentration von

Phenytoin in der extrazellulären Flüssigkeit nach lokaler Administration signifikant

erhöhten, was dafür spricht, dass Phenytoin ein Substrat von P-gp darstellt, und dass

P-gp in der Blut-Hirnschranke die Penetration von Phenytoin ins Gehirnparenchym

normalerweise limitiert.

Antiepileptika sind anscheinend nur relativ schwache Substrate von Multidrug-

Transportern, da Substanzen, welche von P-gp effizient transportiert werden, kaum

Diskussion

121

Gehirngängigkeit zeigen (SCHINKEL, 1999). Da die Molekülgröße von Antiepileptika

unter 400 Da liegt, stellen sie keine idealen P-gp-Substrate dar. Es wird daher

angenommen, dass es erst zu einer funktionell relevanten Reduktion der AED-

Konzentration im Gehirnparenchym kommen kann, wenn die Multidrug-Transporter

im epileptischen Fokus überexprimiert sind (LÖSCHER und POTSCHKA, 2005a).

Tariquidar wurde fünf Jahre lang relativ erfolgreich in klinischen Studien getestet, um

zu ermitteln, ob durch die selektive P-gp Inhibition die Effizienz von zytotoxischen

Agenzien bei der Krebsbehandlung gesteigert werden kann. Im Jahr 2003 wurden

die Versuche mit Tariquidar in der dritten klinischen Phase III bei Patienten mit non-

small-cell Lungenkrebs (NSCLC) vorerst abgebrochen, da die toxischen Level der

Zytostatika bei Patienten, die Tariquidar in Kombination mit den Zytotoxika erhielten,

erhöht waren gegenüber denjenigen, die nur ein Placebo und Zytotoxika verabreicht

bekamen. Weitere Phase I und II Studien wurden jedoch von den National Cancer

Institutes (NCI) in den USA empfohlen (www.xenova.co.uk./dc_xr9576.html). Es

existieren kaum Daten über mögliche pharmakokokinetische Interaktionen mit

Tariquidar (MODOK et al., 2006). In der vorliegenden Kombinationsstudie wurden bei

Gabe von Tariquidar und dem Antiepileptikum Phenobarbital keine signifikant

erhöhten Nebenwirkungen festgestellt. Natürlich muss dabei beachtet werden, dass

diese Resultate nicht ohne weiteres auf Humanpatienten extrapoliert werden können.

Dennoch wäre es möglich, dass Tariquidar im Gegensatz zu der Studie mit den

Zytostatika die Nebenwirkungen von Antiepileptika beim Humanpatienten nicht

erhöht, da sich beide Arzneistoffklassen natürlich in ihrer Wirkweise unterscheiden.

Neben der beschriebenen Inhibition von P-gp existieren noch weitere Strategien,

Pharmakoresistenz zu umgehen, beispielsweise durch Vermeidung eines direkten

Kontaktes zwischen Antiepileptika und P-gp. Eine Möglichkeit besteht darin,

Antiepileptika in Immunoliposome zu verpacken, welche mit einem monoklonalen

Antikörper gekoppelt sind und an der Blut-Hirnschranke durch Endozytose

internalisiert werden, damit die P-gp Substrate effizient ins Gehirngewebe freigesetzt

werden können, ohne dass diese direkt mit P-gp oder anderen Transportern in der

Blut-Hirnschranke interagieren (HUWYLER et al., 2002). Eine ähnliche Strategie wird

Diskussion

122

mit dem Einsatz von Nanopartikeln, welche Antiepileptika enthalten, verfolgt

(FRICKER und MILLER, 2004).

Eine weitere Möglichkeit wäre der Einsatz von kurzer interferierender

doppelsträngiger RNA (siRNAs), welche sich sequenzspezifisch an die Ziel-mRNA

anlagert und zu dessen Degradation führt (IZQUIERDO, 2005). Diese Strategie der

„Gen-Stilllegung“ ist jedoch problematisch, da die siRNA nur eine kurze Lebensdauer

aufweist und außerdem ein ausreichender Ausschaltungsgrad erreicht werden muss

um einen therapeutischen Effekt zu erzielen (MODOK et al., 2006). SHAPIRO et al.

(1998) zeigen, dass eine Chemosensitizer-induzierte Freisetzung von

Medikamenten, die von P-gp in zytoplasmatischen Vesikeln gespeichert werden, bei

der Überwindung von Pharmakoresistenz eingesetzt werden könnte.

Versuche, existierende Arzneimittel chemisch dahingehend zu modifizieren, dass sie

nicht länger Substrate von Multidrug-Transportern darstellen, sind daran gescheitert,

dass zum einen die Struktur von Multidrug-Bindungsstellen noch nicht hinreichend

bekannt ist, zum anderen können Veränderungen eines Medikaments, die zu einer

verringerten Affinität gegenüber Transportern führen, dessen Fähigkeit, die

Zellmembran zu durchqueren und an das Ziel zu binden, drastisch vermindern

(HIGGINS, 2007).

Der Vollständigkeit halber soll erwähnt werden, dass neben genetischen mdr1a/b(-/-)

Knockout-Mäusen auch ein chemisches Knockout-Modell entwickelt wurde, in dem

bei Ratten, Mäusen und Meerschweinchen mittels Titration die optimale

Plasmakonzentration für den hochspezifischen P-gp Inhibitor Elacridar ermittelt

wurde (CUTLER et al., 2006).

6.3 GABAA-Rezeptoruntereinheiten Die Expression verschiedener GABAA-Rezeptoruntereinheiten wurde in diversen

Modellen untersucht und ergab teils kontroverse, teils konforme Resultate. Da es den

Rahmen dieser Arbeit sprengen würde, alle Ergebnisse einzeln aufzuführen, ist eine

Auswahl an Modellen in der untenstehenden Tabelle aufgeführt.

Diskussion

122

Tab. 9: Literaturübersicht zu Modifikationen von GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei

Epilepsiemodellen. Die grau markierten Untereinheiten kennzeichnen diejenigen

Untereinheiten, die auch in der vorliegenden Arbeit untersucht wurden. Legende: DG

GC steht für die Körnerzellen im Gyrus dentatus (dentate gyrus granule cells).

Diskussion

123

Modell Region GABAA-Rezeptor-Untereinheiten Anmerkung Referenzen α1 α2 α3 α4 α5 α6 β1 β2 β3 δ ε γ1 γ2

Pilocarpin chronisch, Kindling DG GC ↓ ↑ ↓ ↑ ↑ ↑ 0

vor spontan wiederkeh-

renden Anfällen

Schwartzkroin 1998, nach

Nusser, Brooks-Kayal, Review

Pilocarpin 1-4 Monate und nach SE DG GC ↓ 0 0e,↑l ↑ 0 0 ↓ ↑ ↑ ↑

Latenzphase (l) und

epileptische (e) Ratten; mRNA und

Patch-clamp Brooks-Kayal et

al., 1998

Pilocarpin CA1,

CA2,CA3 0 ↓ ↓ 0 0 mRNA Rice et al., 1996 1-2 Monate DG 0 0 (↑) 0 0 Pilocarpin CA1 0 ↓! Peptid und Houser und

2-3 Monate CA2 0 ↓!! mRNA Esclapez CA3 (↓) 2003 DG ↓ Hilus ↓

Pilocarpin CA1 ↓ Houser und

Esclapez 2-4 Monate CA2 ↓ 1996 Pilocarpin CA1 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Immunhisto- Fritschy et al., 6 Wochen CA3 0 ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ chemie 1999

spontan wiederkehrende Hilus ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ Anfälle DG (↑) ↑? ↑! ↑! ↓ ↓ ↑! Kainat CA1 ↓ ↓ ? ↓ ↓!! ↓ ↓ ↓ ? 0 ↓ mRNA Tsunashima et

CA3c 0 ↓ ? ↓ ↓! ↓ 0 ↓ ? ↓ ↓ Autoradio- al., 1997 7-30 Tage DG GC 0 0 ↑ 0 ↓! ↑ ↑ 0 ↓ 0 0 graphie

Diskussion

124

Modell Region α1 α2 α3 α4 α5 α6 β1 β2 β3 δ ε γ1 γ2 Anmerkung Referenzen Kainat CA3/CA4 ↓ Autoradio- Friedman et al.,

12+24 Std. DG 0 graphie 1994

24 Std.

langsam kindelnde

Ratten ↑ ↓ Hippocampus Kainat CA1 (↑) (↑) (↑) (↑) (↑) Immunzyto- Schwarzer et al.,

7-30 Tage CA3 ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ chemie 1997 DG ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ ↑

Kainat CA1 ↓ ↓ ↓ Immunhisto- Bouilleret et al.,

2000 4 Monate CA3 0 0 ↓ ↓ chemie

DG ↑ 0 ↑ ↑ ↑ Genetically inferiorer 0 0 ↓!! 3 audiogene Evans et al., 2006 epilepsy- Colliculus Anfälle prone rats Western blot (GEPRs)

laterale Amygdala CA3c ↓ 0 ↑ 0 In-situ- Laurèn et al., chronisch CA3a/b 0 0 ↑ 0 Hybridisierung 2003

12 Wochen CA1 0 ↓ ↑ 0 DG 0 0 ↑! 0 Hilus 0 0 ↑ 0

Humane Temporallappenepilepsie CA1 ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ Immunhisto- Loup et al., 2000

Hippocampal- CA2 ↓! ↑ ↓! 0 0 0 chemie sklerose CA3 ↓! ↑ ↓ ↓ ↓ ↓

Hilus ↓ ↑ ↓ ↓ ↓ ↓ DG GC ↑ ↑! 0 ↑! ↑! ↑

Kindling

schnell-kindelnde

Ratten ↓ ↓ QPCR Gilby et al., 2005

Diskussion

125

Modell Region α1 α2 α3 α4 α5 α6 β1 β2 β3 δ ε γ1 γ2 Anmerkung Referenzen Kindling DG GC ? ↑ ↑ 0 ↑ ↑ ↑ ↓! (↑) mRNA Nishimura et al.,

CA1 ↓ ↑ ↓

24 Std.: CA3: alle Unterein-

heiten ↓ 2005

24 Std.+ 30 Tage CA3 ↓ Hippocampus

Kindling

schnell kindelnde

Ratten ↓! ↑ ↑ ↑ mRNA Poulter et al.,

langsam kindelnde

Ratten ↑! 0 0 0 Hippocampus 1999 Kindling DG ↑ ↑ ↑ ↑ ↑ Immunzyto- Nusser et al.,

chemie 1998 SE DG GC 0 ↑ ↓ ↑ ↑ ↑ ↓! (↑) außer α1! Nishimura et al.,

Hippocampus CA1 ↓ ↑ ↓ ↓ 2005

24 Std + 30 Tage CA3 ↓ Review DG GC ↓ ↑ ↑ Coulter; 2000

Diskussion

126

Der GABAA-Rezeptor ist der dominierende liganden-gesteuerte Chlorid-Ionenkanal,

welcher die schnelle inhibitorische synaptische Transmission im

Zentralnervensystem vermittelt und deshalb einen geeigneten Kandidaten für die

Beteiligung an der Epileptogenese darstellt (BROWSER et al., 2002). Eine enorme

Diversität von GABAA-Rezeptoren wurde im Zentralnervensystem nachgewiesen. In

jedem Rezeptor werden mindestens drei verschiedene Untereinheiten exprimiert,

welche einer von insgesamt acht strukturell und genetisch verschiedenen Familien

angehören (COSTA, 1998; SPERK et al., 2004). Zwischen den einzelnen

Untereinheiten bestehen deutliche Unterschiede bezüglich der Bindungsprofile. So

korrespondiert beispielsweise die Untereinheit α1 mit Antikörpern für die

Benzodiazepinbindungsstelle I, die Untereinheiten α2 und α3 jedoch mit Antikörpern

für die Benzodiazepinbindungsstelle II (MCKERNAN et al., 1991; ZEZULA und

SIEGHART, 1991).

FRITSCHY und MÖHLER (1995) konnten zwölf verschieden Kombinationen von

Untereinheiten in definierten Neuronen nachweisen. Die vorherrschende

Kombination besteht dabei aus α1/β2,3/γ2, welche in zahlreichen Zelltypen im

gesamten Gehirn detektiert wurde und teilweise mit einer zusätzlichen Untereinheit

(α2, α3, δ) assoziiert ist (FRITSCHY und MÖHLER, 1995). Die häufigsten

Untereinheiten sind α1, β2 und γ2, welche in 60-90% der GABAA-Rezeptoren im

adulten Gehirn vorkommen (BENKE et al., 1991a, 1994; DUGGAN et al., 1992;

RUANO et al., 1994). Die Untereinheiten α2, α3, α5, β3 und δ kommen in moderaten

Anteilen von 15-30% vor (BENKE et al., 1991b, 1994; MCKERNAN et al., 1991;

ENDO und OLSEN, 1993; MARKSITZER et al., 1993; MERTENS et al., 1993). Die

verbleibenden Untereinheiten (α4, α6, β3, γ1, γ3) sind nur geringfügig vertreten und

repräsentieren weniger als 10 % der GABAA-Rezeptoren (QUIRK et al., 1994;

TOGEL et al., 1994). Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit darauf

verzichtet, die Untereinheiten α6, β3, γ1 und γ3 zu charakterisieren. Die Untereinheit

α4 kommt im Thalamus und Hippocampus verbreitet vor (WISDEN et al., 1992),

weshalb die hippocampale Expression dieser Untereinheit in der vorliegenden Arbeit

ebenfalls untersucht werden sollte.

Diskussion

127

Die hippocampale Formation stellt eine derjenigen Regionen dar, die im Gehirn am

deutlichsten gefärbt sind, und zeigt hierbei eine besonders starke Färbung für die

Untereinheiten α2, α5, β2/3 und γ2, eine moderate Färbung für α1 und nur eine

schwache Färbeintensität für α3 und δ (FRITSCHY und MÖHLER, 1995). Diese

Ergebnisse stimmen mit den vorliegenden Resultaten überein, obgleich die

Untereinheit α1 hier auch relativ intensiv gefärbt war.

Als wichtigstes Ergebnis der vorliegenden Arbeit lässt sich sagen, dass sich die

Phenobarbital-Nonresponder in 36 von insgesamt 50 Datensets signifikant von den

Respondern unterschieden, welche nur in 15 von 50 Sets Unterschiede zeigten

(p<0.0001), was die bemerkenswerte Differenz zwischen pharmakoresistenten und

pharmakosensitiven Tieren bezüglich der Expression von GABAA-

Rezeptoruntereinheiten zum Ausdruck bringt. Einer der deutlichsten Unterschiede

war die Expression der α1-Untereinheit, welche in allen untersuchten Regionen von

Nonrespondern runterreguliert war, sich bei den Respondern jedoch nicht von den

Kontrollen unterschied. Weitgehende Reduktionen wurden bei den

pharmakoresistenten Tieren auch für Untereinheiten α2 und γ2 gefunden. Im Gyrus

dentatus (Körnerzellschicht, Str. molekulare) wurden signifikante Unterschiede zu

Kontrollen nur bei den Nonrespondern beobachtet. Allgemein handelte es sich bei

allen Veränderungen der Expression von GABAA-Rezeptoruntereinheiten um

Reduktionen der Immunreaktivität. Es wurde keine erhöhte Immunreaktivität

festgestellt, bis auf einen tendenziellen Anstieg der Färbung für α4 in der

Pyramidenzellschicht der CA1 von Nonrespondern, welcher jedoch bei der

verwendeten Messmethode nicht signifikant war.

Meines Wissens nach ist dies die erste Studie, welche die Expression von GABAA-

Rezeptoruntereinheiten bei resistenten und nicht-resistenten Tieren in einem

elektrischen Rattenmodell für chronische Epilepsie untersucht hat. Ein ähnlicher

Versuch wurde von VOLK et al. (2006) durchgeführt, indem bei Phenobarbital-

Respondern und Phenobarbital-Nonrespondern desselben Post-SE-Modells mittels

Autoradiographie Diazepam-insensitive von Diazepam-sensitiven Bindungsstellen

unterschieden wurden. Dabei zeigte sich, dass die Diazepam-Insensitivität bei

Phenobarbital-Nonrespondern in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus

Diskussion

128

gegenüber Respondern und Kontrollen signifikant erhöht war. Die Diazepam-

Sensitivität nahm dagegen im Hilus der Phenobarbital-Nonresponder signifikant ab.

Die Hochregulation der Diazepam-Insensitivität ist wahrscheinlich dadurch bedingt,

dass die Rezeptoren die Untereinheiten α4 und δ enthalten (WHITING et al., 2000),

welche zu der Haupteinheit gehören, die tonische Inhibition im Gyrus dentatus

vermittelt (PENG et al., 2004; STELL und MODY, 2002; WEI et al., 2003) und

frequent, wenn nicht gar obligatorisch, zusammen exprimiert werden (SUR et al.,

1999). Ein Anstieg von Diazepam-insensitiven GABAA-Rezeptoren wurde bereits für

epileptische Ratten im Pilocarpin-Modell der Temporallappenepilepsie beschrieben

(BROOKS-KAYAL et al., 1998; COULTER, 2000). Die Diazepam-Insensitivität dieser

Rezeptoren, scheint auch mit einer erhöhten Zink-Sensitivität einherzugehen (BUHL

et al., 1996; BROOKS-KAYAL et al., 1998). Insensitivität gegenüber toxischen

Zinkkonzentrationen erfordert die Präsenz einer γ2-Untereinheit, da rekombinante

Rezeptoren ohne die γ2-Untereinheit hochsensitiv auf Zink reagieren (DRAGUHN et

al., 1990; SMART et al., 1991). Die Expression der δ-Untereinheit erhöht jedoch die

Sensitivität der Rezeptoren gegenüber der Blockade durch Zink (SAXENA und

MACDONALD, 1994). Die Untereinheiten γ2 und δ scheinen komplementär

exprimiert zu werden, und die Präsenz eines Rezeptors kann zum Ausschluss der

jeweils anderen Untereinheit führen (SHIVERS et al., 1989; QUIRK et al., 1995;

ARAUJO et al., 1998).

Diese Veränderungen könnten zur Pharmakoresistenz bei der

Temporallappenepilepsie beitragen. Es wäre daher anzunehmen, dass der starke

Anstieg an Diazepam-insensitiven GABAA-Rezeptoren, welcher in der

Körnerzellschicht des Gyrus dentatus von Phenobarbital-resistenten, jedoch nicht bei

Phenobarbital-sensitiven Tieren vorhanden war, in den fehlenden antikonvulsiven

Effekt von Phenobarbital bei den Nonrespondern involviert ist (VOLK et al., 2006). Es

wurde berichtet, dass Phenobarbital sich bei den Nonrespondern nicht nur als

uneffektiv erwies, die Anfälle zu unterdrücken, sondern die Anfälle bei der Mehrzahl

der Tiere sogar noch steigerte (BRANDT et al., 2004). Das deutet darauf hin, dass

die Pharmakologie dieses Antiepileptikums als Antwort auf die beobachteten

Veränderungen der GABAA-Rezeptoren stark modifiziert ist (VOLK et al., 2006). Da

Diskussion

129

es sich beim Phänomen der Pharmakoresistenz aller Wahrscheinlichkeit nach um

einen multifaktoriellen Prozess handelt, schließen sich die Multidrug-Transporter-

Hypothese und die Veränderung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten wie oben

beschrieben nicht gegenseitig aus und können gegebenenfalls gemeinsam

vorkommen. Es konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von P-gp,

Zellverlust und Modifikationen der GABAA-Rezeptoren gemeinsam in der

hippcoampalen Formation auftreten und zusammen die Effizienz von Antiepileptika

bei Nonrespondern senken (VOLK und LÖSCHER, 2005; VOLK et al., 2006). Es ist

bislang noch nicht bekannt, welche GABAA-Rezeptoruntereinheit den antikonvulsiven

Effekt von Phenobarbital vermittelt und ob der Gyrus dentatus dabei eine Rolle spielt

(VOLK et al., 2006). Die Tatsache, dass die Responder und Nonresponder sich

bezüglich der Schwere oder der Dauer des SE sowie in Typ oder Frequenz der

spontan wiederkehrenden Anfälle nicht signifikant unterscheiden, deutet darauf hin,

dass die genomische Variabilität darüber entscheidet, ob ein Tier hippocampale

Neurodegeneration und Veränderungen der GABAA-Rezeptorcharakteristik als

Antwort auf den SE zeigt oder nicht (VOLK et al., 2006). So konnte anhand von

Zuchtstudien mit Respondern und Nonrespondern gezeigt werden, dass die

Fähigkeit gekindelter Ratten, auf ein Antiepileptikum anzusprechen oder nicht,

genetisch determiniert ist, obwohl es keinem einfachen Vererbungsschema folgt

(LÖSCHER, 2002). Bei gekindelten Ratten weitet sich die Resistenz gegenüber

einem Standard-Antiepileptikum (Phenytoin) auf alle anderen Antiepileptika,

einschließlich Phenobarbital aus, was darauf hinweist, dass die genetischen

Faktoren, die dieser Pharmakoresistenz zugrunde liegen, eine Multidrug-Resistenz

vermitteln (LÖSCHER, 2002). Es ist daher anzunehmen, dass die Tatsache, dass

zwei Patienten mit einem identischen Epilepsietyp mit gleicher Anfallsfrequenz sich

in ihrer Ansprechbarkeit auf Antiepileptika unterscheiden, auf genetischen Faktoren

beruht (VOLK et al., 2006).

Alpha1 ist die primäre adulte Untereinheit des GABAA-Rezeptors und die

Expressionslevel für die Transkripte sowohl von α1 als auch von α4 scheinen die

pharmakologische Ansprechbarkeit gegenüber vielen aktuell verwendeten

Antiepileptika zu bestimmen (WISDEN et al., 1991). Die Transkripte von α1 und α4

Diskussion

130

werden bei Nagetieren und Humanpatienten mit Temporallappenepilepsie

nachgewiesenermaßen durch den Prozess der Epileptogenese verändert (BROOKS-

KAYAL et al., 1998). Die verminderten Expressionen von α1 und die erhöhten

Expressionen von α4 im Gyrus dentatus von adulten Ratten mit

Temporallappenepilepsie beginnen innerhalb von 24 Std. nach einem Pilocarpin-

induzierten SE und dauern für Monate an, wenn die Tiere epileptisch werden

(BROOKS-KAYAL et al., 1998, 1999)

GABAA-Rezeptoren, welche eine γ2-Untereinheit enthalten, bilden zusammen mit

bestimmten α-Untereinheiten die Benzodiazepin-Bindungsstelle (WHITING et al.,

2000). Alpha-Untereinheiten beeinflussen die Affinität des GABAA-Rezeptors zu

Benzodiazepin-Liganden dahingehend, dass Rezeptoren, welche die Untereinheiten

α1,2,3 und 5 enthalten, alle eine hohe Affinität für eine Reihe von Benzodiazpinen,

einschließlich Diazepam, Flunitrazepam und Clonazepam, aufweisen (PRITCHETT

et al., 1989; LUDDENS und WISDEN, 1991). Rezeptoren, welche die Untereinheit α4

enthalten, besitzen dagegen keine Affinität für Agonisten der

Benzodiazepinbindungsstelle (WISDEN et al., 1991). Diese Erkenntnisse werden

gestützt von einem Versuch, bei dem ein adenoassoziierter Virus Typ 2, welcher

dem Transfer eines α1-Transgens, gesteuert von einem α4-Promotor, diente, als

Vektor bei männlichen Sprague-Dawley-Ratten eingeschleust wurde (RAOL et al.,

2006). Diese Tiere hatten zuvor mittels Pilocarpin einen SE entwickelt. Durch den

Gentransfer des α1-Gens in den Gyrus dentatus erhöhte sich die anfallsfreie Zeit

nach dem SE um das dreifache und die Anzahl der Epilepsie-entwickelnden Ratten

sank um 60 % (RAOL et al., 2006). Diese Studie liefert auch den ersten direkten

Hinweis darauf, dass Veränderungen von GABAA-Rezeptoruntereinheiten, welche

sich nach einem SE entwickeln, in den Prozess der Epileptogenese involviert sind

und nicht nur ein Epiphänomen darstellen. Der antikonvulsive Effekt der

erfolgreichen Expression von mRNA und Protein der α1-Untereinheit im Gyrus

dentatus war jedoch leider nur transient und nach zwei bis vier Wochen nicht mehr

nachzuweisen, da der Promotor des verwendeten Vektors entweder transkriptionell

herunterreguliert oder „stillgelegt wurde“ (RAOL et a., 2006).

Diskussion

131

Es konnte nicht bestimmt werden, ob die erhöhte Expression von α1 die Anfälle

schlichtweg unterdrückt, also einen antikonvulsiven Effekt ausübt, oder ob der

Entwicklung von Epilepsie vorgebeugt werden kann, d. h. ob ein antiepileptogener

Effekt vorliegt (RAOL et a., 2006).

GILBY et al. (2005) beschreiben ein Modell, bei dem mittels der Kreuzung von Long

Evans Hooded- und Wistar-Ratten anfallsempfindliche (schnell kindelnde) und

anfallsresistente (langsam kindelnde) Tiere herausgezüchtet wurden. Bei diesen

Tieren wurde durch Kainat ein SE ausgelöst, und 24 Std. nach dem SE wurden die

Ratten getötet, um die Expression von α1 und α4 mittels mRNA-Analyse im

Hippocampus und in der Amygdala zu verifizieren. Die langsam kindelnden Ratten

zeigten eine längere Latenzphase bis zum SE-Beginn und weniger generalisierte

Anfälle als die schnell-kindelnden Tiere. Es stellte sich heraus, dass sich die

Expression von α1 und α4 im Hippocampus und der Amygdala zwischen den

Stämmen nicht unterschied und die Expression von α4 24 Std. nach dem SE

gleichermaßen reduziert war. Jedoch war bei den schnell kindelnden Ratten eine

Kainat-induzierte Reduktion der α1-Untereinheit in beiden untersuchten Strukturen zu

beobachten, wohingegen langsam kindelnde Tiere eine signifikante Erhöhung der

α1-Untereinheit zeigten. Dieses Ergebnis steht jedoch in Kontrast zu der Studie von

BROOKS-KAYAL et al. (1998), bei welcher der SE durch Pilocarpin induziert wurde.

Hierbei wurde mittels Einzelzelluntersuchungen gezeigt, dass die mRNA von α4 24

Std. post-SE vermehrt und die α1-Untereinheit reduziert exprimiert wurde.

Unterschiede zwischen den Studien sind jedoch nicht verwunderlich, da zahlreiche

Differenzen bezüglich der verwendeten Methoden, einschließlich der

unterschiedlichen konvulsiven Agenzien, des Rattenstamms, der Examinierung des

gesamten Hippocampus versus einzelne Körnerzellen und den molekularen

Techniken bestehen.

Bei dem Versuch, die Ergebnisse in die vorliegende Arbeit zu integrieren, fällt auf,

dass die α4-Untereinheit hier zwar nicht hochreguliert wird wie bei vielen anderen

Studien, jedoch diejenige Untereinheit darstellt, die am wenigsten oder gar nicht in

ihrer Expression herabgesetzt ist. Bei zwei Nonrespondern war die

Pyramidenzellschicht gegenüber den Kontrollen, Shams und Respondern sogar

Diskussion

132

deutlich für α4 angefärbt. Leider war es bei der Auswertung aus technischen

Gründen nicht möglich, nur die Pyramidenzellschicht zu analysieren, daher könnte

eine eventuelle Hochregulation der Untereinheit α4 in der Pyramidenzellschicht

durch die simultane Messung der umgebenden Schichten (Str. oriens, Str. radiatum)

verschleiert worden sein.

Die Veränderungen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei Tieren mit

wiederkehrenden Anfällen sind komplex und beinhalten sowohl die Hoch- als auch

die Runterregulierung von verschiedenen Untereinheiten sowie regionale

Unterschiede bezüglich der Veränderungen der Untereinheiten zwischen Gyrus

dentatus und Hippocampus (KAMPHUIS et al., 1995; OLSEN et al., 1999; COULTER

und DELORENZO, 1999).

Eine Hochregulation von einigen GABAA-Rezeptor-Untereinheiten im Gyrus dentatus

wurde in verschiedenen Tiermodellen für Epilepsie beschrieben. Die Untereinheiten

mit den meisten beobachteten Hochregulationen des Proteins oder der mRNA sind:

α2, α3, α4, α5, β3 und γ2 (SCHWARZER et al., 1997; TSUNASHIMA et al., 1997;

NUSSER et a., 1998; BROOKS-KAYAL et al., 1998; FRITSCHY et al., 1999). Diese

erhöhte Expression der GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in den Epilepsiemodellen

wird im Allgemeinen als kompensatorisch angesehen (BROOKS-KAYAL et al., 1998;

FRITSCHY et al., 1999), obwohl bekannt ist, dass weitere simultane Effekte den

kompensatorischen Effekt einschränken können (BUHL et al., 1996; NUSSER et al.,

1998). Im vorliegenden Versuch wurden keine kompensatorischen Hochregulationen,

wie in anderen chronischen Modellen häufig beobachtet, detektiert.

Herunterregulationen von GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in Neuronen sind von

besonderem Interesse, da diese zu einer verringerten funktionellen Inhibition und

somit zur Anfallsaktivität beitragen können (Houser und Esclapez, 2003).

Die höchste Herunterregulierung von GABAA-Untereinheiten wurde in der CA1

Region des Hippocampus nachgewiesen, was auch bei der vorliegenden Studie

zutrifft, und vor allem die α2 und die α5 oder deren mRNA wurde vermindert

exprimiert (RICE et al., 1996; SCHWARZER et a., 1997; FRITSCHY et al., 1999). Im

vorliegenden Versuch war, bezogen auf den gesamten Hippocampus, auf der Seite

kontralateral zur Elektrode die α5-Untereinheit bei Respondern

Diskussion

133

(α5>γ2>α3>α1=α2=α4) und Nonrespondern (α5>γ2=α1=α2>α3>α4) am stärksten

herunterreguliert und auf der ipsilateralen Seite sowohl bei pharmakoresistenten

(α2>α1=α5=γ2>α3>α4) als auch bei pharmakosensitiven (α2>α1=α5=γ2>α3>α4)

Tieren die Untereinheit α2. Die deutliche Runterregulation von α5 passt zu einer

Studie von HOUSER und ESCLAPEZ (2003), welche beschreibt, dass bei chronisch

epileptischen, Pilocarpin-behandelten Ratten mit wiederholten Anfällen die α5-

Untereinheit in der CA1 substantiell vermindert und in der CA2 nahezu vollständig

eliminiert ist (HOUSER und ESCLAPEZ, 2003).

Da die α5-Untereinheit bei der vorliegenden Arbeit über alle Regionen gesehen am

signifikantesten herunterreguliert war, soll die Bedeutung dieser Untereinheit hier

genauer diskutiert werden. Eine Verminderung der Expression der α5-Untereinheit

wurde bereits für das Kainat- und das Pilocarpinmodell der Temporallappenepilepsie

für die chronische Phase beschrieben, jedoch wurde diese Runterregulation dem

Zellverlust in der CA1-Region zugeschrieben (SCHWARZER et al., 1997; FRITSCHY

et al., 1999). Da die α5-Untereinheit vornehmlich von Pyramidenzellen des

Hippocampus exprimiert wird (FRITSCHY und MOHLER, 1995) würde ein Verlust

dieser Neurone unweigerlich mit einer verminderten α5-Expression in dieser Region

verknüpft sein. Die α5-Untereinheit könnte jedoch auch in den Pyramidenzellen, die

noch im Hippocampus verbleiben, herunterreguliert werden (HOUSER und

ESCLAPEZ, 2003). Im Gegensatz zu einigen anderen GABAA-Rezeptor-

Untereinheiten kennzeichnet sich die α5-Untereinheit dadurch, dass sie bei adulten

Tieren auf die Region des Hippocampus beschränkt ist und hier besonders in den

dendritischen Regionen der CA1 und CA2 zu finden ist (KHRESTCHATISKY et al.,

1989; MALHERBE et al, 1990; WISDEN et al., 1992; FRITSCHY und MOHLER,

1995; SPERK et al., 1997; PIRKER et al., 2000). Alpha5 ist eine der am höchsten

exprimierten α-Untereinheiten im Hippocampus (SPERK et al., 1997).

Pharmakologisch ist α5 im Vergleich mit anderen Untereinheiten charakterisiert

durch eine starke Insensitivität gegenüber Zolpidem (PRITCHETT und SEEBURG,

1990; MCKERNAN et al., 1991; MERTENS et al., 1993), zeigt jedoch eine hohe

Affinität für Diazepam und Flunitrazepam (WHITING et al., 2000). Des Weiteren

scheint die α5-Untereinheit primär extrasynaptisch lokalisiert zu sein (FRITSCHY et

Diskussion

134

al., 1998; BRÜNIG et al., 2002; CRESTANI et al., 2002) und könnte bei der

tonischen Inhibition im Hippocampus involviert sein (MODY, 2001). Obwohl eine

Hochregulation von diversen GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in chronischen

Epilepsiemodellen beschrieben wurde, finden sich viele dieser Untereinheiten,

einschließlich α2, β2/3 und γ2 vorwiegend in den Synapsen der hippocampalen

Formation (SOMOGYI et al., 1996; BRÜNIG et al., 2002) und werden dort für eine

phasische Inhibierung verantwortlich gemacht (MODY, 2001; BRÜNIG et al., 2002).

Die δ-Untereinheit spielt wie α5 eine große Rolle bei der tonischen Inhibition im

Gyrus dentatus (MODY, 2001) und kommt hier hauptsächlich perisynaptisch in den

Dendriten der Körnerzellen vor, wo sie durch einen GABA-Überschuss aus dem

synaptischen Spalt aktiviert wird (WEI et al., 2002). Außerdem weisen Rezeptoren

mit einer δ-Untereinheit eine 50-fach höhere Affinität für GABA auf als Rezeptoren

mit der γ-Untereinheit (SAXENA und MACDONALD, 1996). Die Untereinheiten α5

und δ weisen also einige Gemeinsamkeiten auf, darunter eine extrasynaptische

Lokalisation und Beteiligung bei tonischer Inhibition. Außerdem unterliegen beide

Untereinheiten im Hippocampus und Gyrus dentatus bei manchen Modellen für

Temporallappenepilepsie einer Herunterregulation. OLSEN et al. (1997)

beschrieben, dass δ-knockout-Mäuse epileptische Anfälle exprimieren. Für weitere

Erkenntnisse diesbezüglich müsste die Rolle der tonischen GABAA-Rezeptor

vermittelten Inhibition bei chronischen Epilepsiestadien weitergehend untersucht

werden (HOUSER und ESCLAPEZ; 2003). Es bestehen jedoch auch Unterschiede

zwischen α5 und δ: Substitutionen der Untereinheiten γ mit der δ-Untereinheiten

produzieren Rezeptoren, welche eine hohe Affinität für den GABA-Agonisten

Muscimol, aber keine Benzodiazepinbindungsstellen aufweisen (SHIVERS et al.,

1989; SAXENA und MACDONALD, 1994, 1996). Demgegenüber erweisen sich

GABAA-Rezeptoren mit der α5-Untereinheit als sensitiv gegenüber klassischen

Benzodiazepinen (MERTENS et al., 1993).

Die im vorliegenden Versuch beobachtete, sehr schwache Färbung der Untereinheit

δ, welche eine Auswertung mittels optischer Dichtemessung ausschloss, passt zu

Ergebnissen von FRITSCHY und MÖHLER (1995), welche beschreiben, dass die δ-

Untereinheit im Hippocampus nahezu fehlt, ausgenommen einer blassen und

Diskussion

135

diffusen Färbung der Molekularschicht des Gyrus dentatus und isolierten

Interneuronen.

Da in der vorliegenden Arbeit der relative Vergleich der GABAA-Rezeptor-

Untereinheiten zwischen Respondern, Nonrespondern und Kontrollen im

Vordergrund stand, soll hier nicht weiter darauf eingegangen werden, in welcher

hippocampalen Subregion welche Untereinheiten mit welcher Intensität gefärbt

wurden. Für Details siehe Ergebnisse. Des weiteren wurde bei der Auswertung nicht

zwischen Subtypen wie Neuronen oder Astrozyten und einzelnen

Neuronenbereichen wie Axon, Soma oder Dendriten unterschieden, sondern die

Gesamtheit aller Zellen einer Region bei der optischen Dichtemessung erfasst. Es

konnte jedoch in vorgehenden Studien gezeigt werden, dass GABAA-Rezeptoren in

somatodendritischen Abschnitten (α1, α2, α3, α5) und initialen Axonsegmenten (α2,

α3) exprimiert werden (BRÜNIG et al., 2002). Weiterhin wurde die Expression von

Untereinheiten unter anderem in Glutaminsäure-Decarboxylase (GAD – GABA-

synthetisierendes Protein) - positiven Interneuronen (α1), in Pyramidenzellen (α2, α5)

und hilären Zellen (α3) nachgewiesen (BRÜNIG et al., 2002).

FRITSCHY und MÖHLER (1995) beobachteten eine kontinuierliche und

hervortretende Färbung der Membranen, welche mit synaptischen und

extrasynaptischen Rezeptoren korrespondieren könnte. Extrasynaptische

Rezeptoren sind dabei diffus verteilt, während synaptische Rezeptoren als intensiv

gelabelte Punkte erscheinen (BRÜNIG et al., 2002).

Eine ebenfalls detektierte, intrazelluläre Färbung wird mit Rezeptorbiosynthese oder

Degradation oder schlicht einer verfügbaren Reserve, welche für schnelle

Veränderungen der Rezeptoranzahl, die in die Membran eingefügt wird, in

Verbindung gebracht (FRITSCHY und MÖHLER, 1995). Die Tatsache, dass GABAA-

Rezeptoren auch in Astrozyten exprimiert werden, konnte erstmals im visuellen

Kortex von Katzen nachgewiesen werden (ROSIER et al., 1993).

Bei der Auswertung der vorliegenden Ergebnisse muss berücksichtigt werden, dass

die verwendeten Phenobarbital-Nonresponder eine signifikante Neurodegeneration

in verschiedenen Regionen aufwiesen. So detektierte Christina Fuest bei den hier

untersuchten Phenobarbital-Nonrespondern einen signifikanten Neuronenverlust im

Diskussion

136

ipsi- und kontralateralen Hilus. Außerdem wurden von Frau Fuest anhand eines

Score-Systems bei den Phenobarbital-Nonrespondern auf beiden Seiten

geringgradige bis schwerwiegende Läsionen in der CA1, CA3a/c, Amygdala sowie im

piriformen und entorhinalen Kortex festgestellt. Die Phenobarbital-Responder zeigten

bis auf ein Tier keine Läsionen in den oben genannten Regionen. Bei den Sham- und

Kontrolltieren waren ebenfalls keine Läsionen zu sehen. Diese Befunde sprechen

dafür, dass die Anzahl der GABAA-Rezeptor-Untereinheiten bei Nonrespondern

alleine deshalb reduziert ist, weil aller Wahrscheinlichkeit nach GABAerge Neurone

absterben. In der CA1, der CA3 und dem Hilus waren die Modifikationen der GABAA-

Rezeptoren jedoch nicht nur durch einen Zellverlust bedingt, da Veränderungen der

Zusammensetzung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten auch bei dem Nonresponder

NIH13 detektiert wurden, welcher keine offensichtliche Neurodegeneration in der

hippocampalen Formation aufwies. LAURÉN et al. (2003) beschreiben passend dazu

in dem gleichen Post-SE-Modell wie dem hier verwendeten, dass der

Neuronenverlust zumindest teilweise die verminderte Expression der Untereinheiten

α2 und α4 erklären kann. Die von LAURÉN et al. (2003) gefundene simultane

Hochregulation der β3-Untereinheit in der CA1 und CA3, also Regionen mit einem

hohen Neuronenverlust, spricht jedoch dafür, dass die verminderte Expression von

GABAA-Rezeptoruntereinheiten in epileptischem Gewebe nicht nur einen Indikator

für Neuronenverlust darstellt, sondern reale Veränderungen der überlebenden

Neurone reflektiert. Die langfristige Hoch- beziehungsweise Runterregulation der

GABAA-Rezeptoren könnte eine kompensatorische Antwort auf die Anfallsaktivität in

den verbleibenden Zellen widerspiegeln (LAURÈN et al., 2003). So beschreiben

einige Gruppen eine kompensatorische Hochregulation der Untereinheiten β2/3 im

Gyrus dentatus bei unterschiedlichen Modellen (LOUP et al., 2000; NISHIMURA et

al., 2005; TSUNASHIMA et al., 1997). Leider funktionierte die Färbung für die β2/3-

Untereinheiten im vorliegenden Versuch nicht.

Ein Hinweis darauf, dass die verminderte Expression der Untereinheiten nicht nur

schlichtweg auf den Neuronenverlust zurückzuführen ist, könnte darin liegen, dass

die α4-Untereinheit im vorliegenden Versuch auch bei den Phenobarbital-

Nonrespondern kaum herunterreguliert wurde bzw. in der Pyramidenzellschicht bei

Diskussion

137

zwei Nonrespondern sogar hochexprimiert wurde. Weiterhin traten Veränderungen

von GABAA-Rezeptoruntereinheiten auch bei Phenobarbital-Respondern auf, welche

keine Neurodegeneration aufwiesen, was darauf hindeutet, dass die verminderte

Expression einiger Untereinheiten im epileptischen Gewebe nicht lediglich ein

Hinweis für Neuronenverlust darstellt, sondern eine Runterregulation von

Untereinheiten in unbeschädigten Strukturen beschreibt. Die Unterschiede bei der

Modifikation von Untereinheiten zwischen Respondern und Nonrespondern sind

wahrscheinlich, zumindest teilweise, die Konsequenz einer Neurodegeneration im

Hippocampus, welche bei Nonrespondern gefunden wurde, bei den Respondern

jedoch nicht auftrat.

Die Veränderungen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei den hier verwendeten

resistenten Ratten zeigen ebenso wie Humanpatienten mit Hippocampalsklerose

(LOUP et al., 2000) eine verminderte Färbung für einige Untereinheiten, was den

Zellverlust in der CA1, CA3 und im Hilus reflektiert. Im Gyrus dentatus von Patienten

mit refraktärer Temporallappenepilepsie war eine erhöhte Färbung für die

Untereinheiten α2 und teilweise α1 und γ2 in der Körnerzellschicht und in der

Molekularschicht detektierbar, welche bei dem vorliegenden Rattenmodell nicht zu

beobachten war.

TSUNASHIMA et al. (1997) beschreiben, dass der mRNA-Level der α1-Untereinheit

in der CA3 sieben bis 30 Tage nach einem Kainat-induziertem SE sich gegenüber

der Kontrollgruppe nicht signifikant unterscheidet. Das könnte darauf hindeuten, dass

die überlebenden Pyramidalneurone eine kompensatorische Hochregulation der α1-

mRNA im chronischen Stadium der Kainat-induzierten Temporallappenepilepsie

zeigen. Im gleichen Modell wird beschrieben, dass ein extremer Verlust an α2- und

α4-mRNA in der CA1 das Ausmaß der Neurodegeneration in pyramidalen Neuronen

zu übersteigen scheint und eine Herunterregulierung auch in unbeschädigten Zellen

auftritt (TSUNASHIMA et al., 1997).

SCHWARTZKROIN (1998) beschreibt, dass bei chronisch epileptischen Tieren eine

veränderte Komposition der Untereinheiten beibehalten wird, und die Anzahl der

GABAA-Rezeptoren pro Synapse erhöht wird. Dabei ist sowohl die Dichte der

Rezeptoren erhöht als auch die Fläche der synaptischen Verbindung. Diese

Diskussion

138

Veränderung trägt wahrscheinlich zu einer gesteigerten Effizienz von GABA in den

Neuronen bei (BROOKS-KAYAL et al., 1998; NUSSER et al., 1998). Die

Abwesenheit einer solchen Hochregulation in der vorliegenden Studie weist

daraufhin, dass die GABA-Synapsen in den dentaten Körnerzellen in dem

verwendeten Rattenmodell nicht hyperaktiv sind, wie bei SCHWARTZKROIN (1998)

beschrieben. Mögliche neurophysiologische Studien bei Phenobarbital-Respondern

und –Nonrespondern könnten Aufschluß über diesen Aspekt liefern.

Die ausgeprägte Runterregulierung der Färbeintensität für GABAA-Rezeptor-

Untereinheiten in der CA1 und CA3 sowie im dentaten Hilus, sprich Regionen, in

denen der Neuronenverlust am gravierendsten ist, stimmt mit den Ergebnissen

anderer Studien überein (OLSEN et al., 1992; WOLF et al., 1994; KOEPP et al.,

1996; HAND et al., 1997; LOUP et al., 2000). NISHIMURA et al. (2005) postulieren,

dass, bedingt durch die variablen Neurodegenerationsgrade im Ammonshorn, bei

verschiedenen Tiermodellen die Resultate wesentlich schwerer zu interpretieren sind

als in den Körnerzellen des Gyrus dentatus, welche in experimentellen Tiermodellen

relativ gut erhalten bleiben. Die GABAerge Innervierung der Körnerzellen des Gyrus

dentatus spielt eine wichtige Rolle bei der Vermittlung des Informationsflusses

zwischen dem entorhinalen Kortex und dem Hippocampus (BROOKS-KAYAL et al.,

2001), weshalb dieser Region ohnehin eine Schlüsselrolle beim Epilepsiegeschehen

zukommt.

Wenn man darauf basierend im vorliegenden Versuch lediglich den Bereich des

Gyrus dentatus betrachtet, ergibt sich folgendes Bild: Bei den Respondern ist weder

auf der ipsi- noch auf der kontralateralen Seite eine Herunterregulierung der GABAA-

Rezeptor-Untereinheiten zu erkennen. Bei den Nonrespondern sind auf der

ipsilateralen Seite Verluste der α1 und α2-Untereinheiten zu erkennen und auf der

kontralateralen Seite sind die Untereinheiten α1, α2, α5 und γ2 signifikant vermindert.

Die Untereinheiten α3 und α4 ändern sich nicht. Dieser Befund entspricht der oben

beschriebenen Theorie, nach der die Benzodiazepin-sensitive α1-Untereinheit beim

epileptischen Geschehen herunterreguliert und die Benzodiazepin-insensitive

Untereinheit α4 hochreguliert wird (beziehungsweise im vorliegenden Fall gleich

bleibt). Die Untereinheit α3 wird in erster Linie im zerebralen Kortex und im

Diskussion

139

Riechzentrum exprimiert (PERSOHN et al., 1992) und scheint im Hippocampus und

beim Epilepsiegeschehen keine große Rolle zu spielen.

Es gilt zu bedenken, dass im aktuellen Versuch das Barbiturat Phenobarbital als

selektierendes Antiepileptikum verwendet wurde und kein Benzodiazepin. Es wurde

zwar nicht gezeigt, ob die Tiere sich auch als resistent gegenüber Benzodiazepinen

zeigen, jedoch gibt es zwischen pharmakosensitiven und pharmakoresistenten

Tieren signifikante Unterschiede bezüglich der Runterregulation von GABAA-

Rezeptoruntereinheiten, welche auch bei der Resistenz gegenüber dem Barbiturat

Phenobarbital eine Rolle zu spielen könnten. Da jedoch die Pharmakoresistenz der

hier verwendeten Phenobarbital-Nonresponder durch die oben beschriebene

Kombinationstherapie behoben werden konnte, scheint dieser Mechanismus bei der

Phenobarbital-Resistenz eine größere Rolle zu spielen als die Runterregulierung von

GABAA-Rezeptoruntereinheiten. Es wäre daher interessant gewesen, die Expression

der Untereinheiten β2/3 zu untersuchen, da gerade die beta-Untereinheiten eine

Schlüsselrolle bei der Wirkung von Barbituraten zu haben scheinen (DRAFTS und

FISHER, 2006). So beschreiben einige Gruppen Hochregulationen der Untereinheit

β3 im Kainat- und elektrischen Modell (SCHWARZER et al., 1997; LAURÉN et al.,

2003), wohingegen beim Pilocarpinmodell eine Runterregulierung der Untereinheiten

β2/3 zu beobachten war (FRITSCHY et al., 1999; siehe auch Tab. 9). Hier besteht

noch weiterer Klärungsbedarf. Da die signifikante Runterregulierung, gerade der

Benzodiazepin-sensitiven Untereinheit α1 bei den hier verwendeten Nonrespondern,

jedoch bei der Resistenz gegenüber Benzodiazpinen eine wichtige Rolle spielen

könnte, wäre es interessant, in dem gleichen Modell in einer Folgestudie ein

Benzodiazepin statt Phenobarbital einzusetzen und bei gleichzeitiger P-gp Inhibition

zu verifizieren, welcher Mechanismus einen größeren Einfluss bei der

Pharmakoresistenz innehat.

Die Tatsache, dass bei den Respondern im aktuellen Versuch keine

Runterregulierung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten im Gyrus dentatus vorliegt,

spricht dafür, dass bei diesen Tieren im Gegensatz zu den Nonrespondern eine

kompensatorische Hochregulation bzw. ein Erhalt der vorhandenen GABAA-

Rezeptor-Untereinheiten als Antwort auf die Anfallsaktivität stattgefunden hat.

Diskussion

140

Möglicherweise sind die Mechanismen, welche die kompensatorische

Hochregulation bzw. den Erhalt von GABAA-Rezeptoren steuern, bei den

Nonrespondern nicht in ausreichendem Maße vorhanden oder in ihrer Funktionalität

gestört.

So beschreiben auch FRITSCHY et al. (1999), dass der Verlust einer kritischen

Anzahl von Interneuronen im Gyrus dentatus eine mögliche Ursache für die

Anfallsinitiation darstellen könnte, wohingegen die langfristige Hochregulation der

GABAA-Rezeptoren in den Körnerzellen eine kompensatorische Antwort auf die

Anfallsaktivität bedeuten könnte.

Die möglichen Implikationen der veränderten GABAA-Rezeptorzusammensetzung für

die Pathophysiologie der Temporallappenepilepsie basiert auf der im folgenden

beschriebenen „dormant basket cell„-Hypothese von SLOVITER et al. (1991): der

Verlust der hilären Interneurone und Korbzellen führt zu einer verminderten Inhibition

im Gyrus dentatus, was durch den Verlust von hilären Mooszellen noch verstärkt

wird. Diese Modifikationen scheinen ausreichend, um spontan wiederkehrende

Anfälle zu generieren. Das Auswachsen von Moosfasern zu einem späteren

Zeitpunkt erzeugt eine Schleife wiederkehrender Erregung, welche die anhaltende

Anfallsaktivität angesichts der graduellen Degeneration von Pyramidenzellen noch

fördert. Die insgesamt gesteigerte Aktivität resultiert in einer kompensatorischen

Hochregulation von GABAA-Rezeptoren in den Körnerzellen des Gyrus dentatus.

Damit verbunden ist eine veränderte Zusammensetzung der GABAA-Untereinheiten.

Trotz dieses kompensatorischen Mechanismus könnte das Auftreten von Rezeptor-

untereinheiten die empfindlich auf Zink reagieren, welches von aberranten

Moosfasern, die in die Körnerzellschicht aussproßen, freigesetzt wird, den

epileptischen Zustand weiter konsolidieren (FRITSCHY et al., 1999). Eine erhöhte

Zink-Sensitivität von GABAA-Rezeptoren konnte in Körnerzellen von epileptischem

Gewebe nachgewiesen werden (BUHL et al., 1996; BROOKS-KAYAL et al., 1998).

GABAA-Rezeptoren, welche die Untereinheit α1 enthalten (sowie γ2), neigen dazu,

eine geringe Zink-Sensitivität zu zeigen (COULTER, 2000). Im umgekehrten Fall

resultieren geringe Expressionen von α1 und γ2 enthaltenden GABAA-Rezeptoren in

einer hohen Zink-Sensitivität (WHITE und GURLEY, 1995; BURGARD et al., 1996;

Diskussion

141

FISHER und MACDONALD, 1998), wie in Körnerzellen des Gyrus dentatus von

epileptischem Gewebe beobachtet wurde. Da diese beiden Untereinheiten auch im

vorliegenden Versuch bei den Phenobarbital-Nonrespondern im Gyrus dentatus

signifikant runterreguliert waren, ist anzunehmen, dass die Zinksensitivität auch bei

den hier verwendeten Tieren gesteigert war.

Beim Seitenvergleich (siehe Tabelle 8) fällt auf, dass keine deutlichen Unterschiede

zwischen der ipsi- und der kontralateralen Seite bestehen. Jedoch ist die

Herunterregulation der GABAA-Rezeptoruntereinheiten auf der kontralateralen Seite

insgesamt deutlich ausgeprägter als auf der ipsilateralen Seite. Möglicherweise

greifen auf der ipsilateralen Seite, bedingt durch den Insult der

Elektrodenimplantation und die Lokalisation des epileptischen Fokus in der

ipsilateralen basolateralen Amygdala, bereits früher und/oder verstärkt

kompensatorische Mechanismen wie Hochregulationen von bestimmten GABAA-

Rezeptor-Untereinheiten. Diese Annahme ist jedoch spekulativ und müsste genauer

untersucht werden.

LOUP et al. (2000) weisen darauf hin, dass bei der Extrapolation der Befunde von

Tiermodellen auf den Menschen Vorsicht geboten ist, da hinsichtlich der GABAA-

Rezeptor-Untereinheiten folgende Unterschiede nachgewiesen wurden und

möglicherweise noch andere bestehen können: 1) Die α3-Untereinheit ist im

Hippocampus von Nagetieren kaum nachweisbar, wird beim Menschen jedoch in der

CA1 und mit variablen Graden auch in den Körnerzellen des Gyrus dentatus

exprimiert. 2) Beim Menschen ist in den Pyramidenzellen der CA3 die α1-

Untereinheit nur gering oder gar nicht detektierbar, kommt jedoch bei Nagetieren in

moderatem Maße vor. 3) Die hilären Mooszellen exprimieren beim Menschen in

hohem Maße α1 und α2-Untereinheiten, beim Nager jedoch nicht (LOUP et al., 2000)

4) Die basalen Dendriten der dentaten Körnerzellen sind beim Menschen intensiv

gefärbt, wohingegen normale Körnerzellen von Ratten gar keine basalen Dendriten

aufweisen (SERESS und MRZLJAK, 1987; LIM et al., 1997).

Die Expression der GABAA-Rezeptor-Untereinheiten scheint chronologischen

Schwankungen zu unterliegen und sich im Lauf der Epileptogenese zu verändern. So

beschreiben beispielsweise KOKAIA et al. (1994) biphasische Veränderungen der

Diskussion

142

mRNA-Level von GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in den Körnerzellen des Gyrus

dentatus nach 1, 10 und 40 Kindling-induzierten Anfällen. Die schnellen und

transienten, biphasischen Modifikationen der Untereinheiten nach wiederholten

Anfällen könnten eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung der Erregbarkeit von

Körnerzellen spielen und dadurch die Anfallsempfindlichkeit senken (KOKAIA et al.,

1994). Übereinstimmend berichten auch SCHWARZER et al., (1997) nach einem

Kainat-induzierten SE innerhalb von 12-24 Std. nach dem SE Runterregulationen

von α2 und δ sowie leichte Anstiege der Expression von α1, β2 und β3 im Gyrus

dentatus. Diese Veränderungen wurden sieben bis 30 Tage nach dem Kainat-SE

gefolgt von einer deutlich erhöhten Expression an α1, α2, α4, α5, β1, β3, γ2 und δ in

der gleichen Region (SCHWARZER et al., 1997).

Da im vorliegenden Versuch die Untereinheiten lediglich zu einem einzigen Zeitpunkt

detektiert wurden, können hier keine Vergleiche gezogen werden. Es ist jedoch

vorstellbar, dass die Zusammensetzung der GABAA-Rezeptoren zu einem früheren

Zeitpunkt ganz anders gestaltet war. Die akuten Veränderungen scheinen dabei

ganz anderer Natur zu sein als die chronischen. So beschreiben NAYLOR et al.

(2005), dass es innerhalb einer Stunde nach einem SE zu einem funktionellen

Verlust von postsynaptischen GABAA-Rezeptoren und einer markanten

Internalisierung von GABAA-Rezeptor-Untereinheiten in der Körnerzellschicht des

Gyrus dentatus kommt, verbunden mit einem deutlichen Verlust von GABAerger

synaptischer Inhibierung. Es wird angenommen, dass die Synapsen von mindestens

zwei Untereinheiten (β2/3, γ2) während des SE in das Zellinnere transloziert werden,

einschließlich einer Untereinheit, welche Benzodiazepinsensitivität vermittelt

(mutmaßlich γ2), und damit zur Resistenz gegenüber Benzodiazepinen beiträgt

(NAYLOR et al., 2005). Die Internalisierung erfolgt dabei entweder über Endozytose

oder ein vermindertes Recycling zur Oberfläche hin. Es konnte gezeigt werden, dass

bereits ein kleiner Anstieg der extrazellulären GABA-Konzentration (um 5-10 μM)

während des SE ausreicht, um eine Erhöhung der extrasynaptischen tonischen

Inhibition (wahrscheinlich vermittelt durch die δ-Untereinheit) herbeizuführen. Eine

erhöhte GABA-Konzentration an Synapsen kann dann eine Desensitivierung und

Diskussion

143

Internalisierung von postsynaptischen GABAA-Rezeptoren zur Folge haben

(NAYLOR et al., 2005).

BROOKS-KAYAL et al. (1998) sowie COHEN et al. (2002) fanden eine Veränderung

der GABAA-Rezeptoren nach SE lange vor Beginn der spontanen Anfälle und

postulieren daher, dass die modifizierte Rezeptorzusammensetzung einen

fundamentalen epileptogenen Mechanismus darstellt. Es wurde gezeigt, dass bereits

während eines Pilocarpin-induzierten SE ein substantieller Verlust der

antikonvulsiven Wirkung von Antiepileptika, welche die GABAA-vermittelte Inhibition

verstärken, wie Benzodiazepine und Phenobarbital, besteht, was für eine rasche

Veränderung der funktionellen Eigenschaften von GABAA-Rezeptoren in den

Körnerzellen des Gyrus dentatus spricht (JONES et al., 2002).

Anfälle können die Funktion von GABAA-Rezeptoren auch durch Mechanismen wie

postranslationale Modifikationen, z. B. Phosphorylierung oder die Ausschüttung

endogener Benzodiazepin-ähnlicher Substanzen modifizieren (LIN et al., 1994;

MACDONALD und OLSEN, 1994; MACDONALD, 1995).

Es ist bekannt, dass GABA im sich entwickelnden Gehirn mittels einer veränderten

Chlorid-Homeostase durchaus als exzitatorischer Neurotransmitter wirken kann, und

es wird vermutet, dass depolarisierende GABA-Antworten auch eine Eigenschaft

einiger Neurone im epileptischen Gehirn darstellen (COHEN et al., 2002; WOZNY et

al., 2003). Da während der frühen postnatalen Entwicklung nur geringe Mengen an

vesikulärem Zink im Gyrus dentatus vorhanden sind, führt die beobachtete

Zinksensitivität von GABAA-Rezeptoren in postnatalen Körnerzellen jedoch nicht zu

einer pathologischen Hyperexzitabilität, wie sie bei adulten Tieren mit

Temporallappenepilepsie beobachtet wird (BROOKS-KAYAL et al., 1998). Dieser

interessante Aspekt wurde in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht, könnte aber

möglicherweise auch eine Rolle beim Pharmakoresistenzgeschehen spielen.

Ein Nachteil bei der hier verwendeten Auswertung könnte darin liegen, dass bei der

optischen Dichtemessung keine Schwelle festgelegt wurde. Eine Schwelle konnte bei

dem verwendeten Programm nicht definiert werden, da es sich bei der Färbung der

GABAA-Rezeptoruntereinheiten um eine kontinuierliche Färbung handelt, im

Gegensatz beispielsweise zur P-gp Färbung, bei welcher sich die markierten Gefäße

Diskussion

144

deutlich vom hellen Hintergrund abzeichnen und Schwellen relativ einfach festgelegt

werden können. Dadurch, dass im vorliegenden Versuch keine Schwelle definiert

wurde, ist mutmaßlich bei der optischen Dichtemessung auch viel Hintergrundsignal

detektiert worden. Der Gesamtaussage des Gruppenvergleichs sollte dadurch jedoch

nicht beeinflusst worden sein, da für alle Tiere der gleiche Messbereich erfasst

wurde.

Schlussfolgerungen und Ausblick

145

7 Schlussfolgerungen und Ausblick

Das hier verwendete Tiermodell liefert einen proof-of-principle dafür, dass die

Überexpression von P-gp im epileptischen Fokus durch hochselektive Inhibitoren

gehemmt werden kann, was in der Folge zu höheren Konzentrationen von

Antiepileptika im Gehirn führt und zu einer Überwindung der Pharmakoresistenz

beiträgt. Ein möglicher nächster Schritt wäre der Einsatz weiterer Antiepileptika,

welche wie Phenytoin und Phenobarbital P-gp Substrate darstellen (z. B. Lamotrigin,

Carbamazepin), in Kombination mit Tariquidar oder einem anderen hochselektiven

P-gp-Inhibitor, um die Hypothese zu untermauern und ihre Gültigkeit für andere

Antiepileptika zu zeigen. Die zeitaufwendige EEG- und Videoanalyse könnte dabei

eventuell durch den Einsatz von Telemetrie optimiert werden. Nach weiterer

Konsolidierung der Multidrug-Transporter-Hypothese könnten dann möglicherweise

klinische Untersuchungen bei epileptischen, pharmakoresistenten Humanpatienten

iniitiert werden. Eine Relevanz für die Veterinärmedizin, hier vor allem für die

Epilepsietherapie bei Hund und Katze, scheint dabei auch gegeben.

Das von mir verwendete Tiermodell ist aller Wahrscheinlichkeit nach ebenfalls

geeignet für die Untersuchung weiterer Mechanismen, die an Pharmakoresistenz

beteiligt sein könnten.

Außer der hier durchgeführten Behandlung mit Phenytoin und Phenobarbital könnten

weitere Antiepileptika getestet werden. Auch könnten neue Antiepileptika mit

unterschiedlichen Wirkmechanismen bei den Nonrespondern getestet werden. Viele

Antiepileptika weisen eine Halbwertszeit auf, die zu kurz ist, um ausreichende

Plasmakonzentrationen mit zweimal täglicher Applikation aufrecht zu erhalten. Hier

könnten möglicherweise osmotische Minipumpen mit definierter Freisetzungsrate

Verwendung finden.

Weiterhin konnten bei Phenobarbital-resistenten Tieren deutliche Runterregulationen

einiger GABAA-Rezeptoruntereinheiten im Gyrus dentatus nachgewiesen werden,

welche bei Phenobarbital-sensitiven Tieren nicht präsent waren. Da die Resistenz

der Phenobarbital-resistenten Ratten durch Inhibition von P-gp fast vollständig

aufgehoben werden konnte, scheint die Überexpression von P-gp im vorliegenden

Modell für die Wirkung von Phenobarbital wichtiger zu sein, als die veränderte

Schlussfolgerungen und Ausblick

146

Expression von GABAA-Rezeptoruntereinheiten. Möglicherweise kommt der

veränderten Zusammensetzung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei

Pharmakoresistenz gegenüber Benzodiazepinen jedoch eine wichtigere Rolle zu, als

die Hochregulation von Multidrug-Transportern.

In einem folgenden Versuch könnten daher Benzodiazpine zum Einsatz kommen, da

die Herunterregulierung der Untereinheit α1, welche auch in vorliegender Arbeit bei

Phenobarbital-Nonrespondern beobachtet werden konnte, mit einer erhöhten

Benzodiazepin-Insensitivität einhergeht, wie aus anderen Studien bekannt ist.

Da die Immunzytochemie allenfalls ein semiquantitatives Bild liefern kann, sollten

deshalb in möglichen Folgeversuchen gleichzeitig Modifikationen der mRNA-

Expression untersucht werden.

Eine Möglichkeit zur Überwindung der GABA-Rezeptor-vermittelten Resistenz könnte

in dem vektorbasierten Gentransfer von Benzodiazepin-Sensitivität-vermittelnden

Untereinheiten wie α1 bestehen, welcher in einer anderen Studie erfolgreich

durchgeführt wurde (RAOL et al., 2006).

Eine weitere Möglichkeit zur Verbesserung der Auswertung könnte darin bestehen,

die einzelnen Schichten (z. B. die Pyramidenzellschicht, Körnerzellschicht) gesondert

zu umfahren und einzeln auszuwerten, was mit dem vorliegenden Programm nicht

möglich war. Anhand der Analyse einzelner Bereich anstelle von Feldern, welche

mehrere Schichten (z. B. Körnerzellschicht und Molekularschicht gemeinsam)

umfassen, könnten detailliertere Aussagen über die Modifikationen in bestimmten

Subregionen getroffen werden. Nichtsdestotrotz sollten im vorliegenden Versuch

tendenzielle Gruppenunterschiede im Vordergrund stehen, welche in einem zweiten

Schritt in weitergehenden Studien noch genauer untersucht werden könnten.

Die Vielzahl der Veränderungen in pharmakoresistenten Ratten gestaltet es

prinzipiell schwierig, die funktionelle Signifikanz jeder dieser Modifikationen zu

determinieren. Dennoch könnte die Betrachtung der individuellen Unterschiede den

Schlüssel zu der zellulären Basis von refraktärer Epilepsie liefern und zu neuen

Therapieansätzen führen.

Zusammenfassung

147

Zusammenfassung

Kerstin Bethmann Ein enormes Gesundheitsproblem bei der Therapie vieler Krankheiten, darunter auch

Epilepsie, stellt die Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Medikamenten dar.

Besonders gravierend gestaltet sich die Situation bei der häufigsten Epilepsieform,

der Temporallappenepilepsie, da sich hier bis zu 80 % der Patienten refraktär

gegenüber Antiepileptika zeigen. Es ist daher vorteilhaft, dass für die vorliegende

Studie ein elektrisches Post-Status epilepticus-Modell an Ratten zur Verfügung

stand, welches die Entwicklung von spontan wiederkehrenden Anfällen nach einem

initialen Insult ermöglicht und damit die Situation beim Menschen widerspiegelt, wo

eine Temporallappenepilepsie beispielsweise nach einem Schädel-Hirn-Trauma

auftreten kann.

Nur zirka 10 % der Patienten, die auf eine Therapie mit einem ersten Antiepileptikum

nicht ansprechen, antworten auf die Gabe eines zweiten antikonvulsiven

Medikaments, auch wenn beide Substanzen sich in ihrer Wirkweise komplett

unterscheiden. Ein Patient wird dann als pharmakoresistent eingestuft, wenn die

Anfälle nach Gabe von zwei oder mehr Antiepileptika nicht um mindestens 50 %

gesenkt werden können. Die vorliegende Studie ist meines Wissens nach die erste,

welche im Tiermodell dieser klinischen Definition von Pharmakoresistenz gerecht

wird, da durch die subsequente Gabe der Antiepileptika Phenobarbital und Phenytoin

pharmakosensitive von pharmakoresisteten Tieren selektiert werden konnten. Das

Modell wird daher als adäquat für Pharmakoresistenzstudien angesehen und für die

weitere Untersuchung der kausalen Mechanismen der Resistenz und möglicher

Behandlungsstragien empfohlen.

Die zugrunde liegenden Ursachen der Pharmakoresistenz sind multifaktoriell. Eine

favorisierte Hypothese ist die Überexpression von Multidrug-Transportern, wie dem

P-glykoprotein (P-gp), in der Blut-Hirnschranke, welche nachgewiesenermaßen den

Zutritt vieler gängiger Antiepileptika ins Gehirn, und somit zum epileptischen Fokus,

limitieren. Dieser Theorie zufolge sollte durch die Hemmung der Transporter die

Zusammenfassung

148

Konzentration von Antiepileptika im epileptischen Gewebe erhöht werden können.

Diese Hypothese konnte durch die Gabe des selektiven P-gp-Inhibitors Tariquidar in

verschiedenen Dosierungen kurz vor der Applikation des Antiepileptikums

Phenobarbital bestätigt werden, da die Phenobarbital-Resistenz der Ratten dadurch

behoben werden konnte. Die vorliegende Arbeit liefert somit einen wichtigen Beleg

dafür, dass wie auch von Krebspatienten bekannt, die Hochregulierung von

Multidrug-Transportern in der Blut-Hirnschranke eine Hauptrolle beim

Resistenzgeschehen spielt, und dass durch die Hemmung dieser Mechanismen die

Konzentration der Medikamente im Gehirn steigt, und diese somit effizienter wirken

können.

Eine weiterer häufiger Befund beim Epilepsiegeschehen ist die veränderte

Zusammensetzung von GABAA-Rezeptoruntereinheiten hin zu Benzodiazepin-

insensitiven Rezeptoren. Die Ergebnisse aus vorhergehenden Studien sind dabei

nicht immer konform. Meines Wissens nach, ist dies die erste Arbeit, welche

Modifikationen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten bei pharmakoresistenten und

pharmakosensitiven Tieren mit immunhistochemischen Methoden verglichen hat.

Dabei zeigte sich bei den refraktären Tieren im Gyrus dentatus eine deutliche

Herunterregulierung der Untereinheiten α1, α2, α5 und γ2, wohingegen bei den

Respondern keine solche Veränderung zu detektieren war. Da der Gyrus dentatus

eine wichtige Rolle bei der Weiterleitung von exzitatorischem Input aus anderen

limbischen Regionen in den Hippocampus, innehat, könnte gerade die veränderte

Zusammensetzung der Untereinheiten beziehungsweise deren Runterregulierung in

dieser Region zur Pharmakoresistenz beitragen. Der Gyrus dentatus ist für

Aussagen über Modifikationen von GABAA-Rezeptoruntereinheiten besonders

geeignet, da er nicht, wie CA1, CA3 und Hilus von starker Neurodegeneration bei

Temporallappenepilepsie betroffen ist. Letzteres kann die Bewertung von

veränderten Kompositionen der Untereinheiten erschweren, da die Untereinheiten

schlichtweg durch einen Neuronenverlust reduziert sein können und somit die

Resultate mit Vorsicht interpretiert werden müssen.

Da es sich bei der Pharmakoresistenz aller Wahrscheinlichkeit nach um einen

multifaktoriellen Prozess handelt, schließen sich die Hypothesen zur Überexpression

Zusammenfassung

149

der Multidrug-Transporter in der Blut-Hirnschranke und die Veränderung der GABAA-

Rezeptor-Untereinheiten nicht gegenseitig aus und können zusammen am

Resistenzgeschehen mitwirken bzw. die Behandlungsprognose verschlechtern. Bei

der Vermittlung der Resistenz von Barbituraten wie dem hier verwendeten

Phenobarbital scheint die Überexpression von P-gp eine wichtigere Rolle zu spielen

als Veränderungen der GABAA-Rezeptoruntereinheiten, da die Resistenz durch die

Inhibition von P-gp komplett behoben werden konnte. Bei Benzodiazpinen könnte

das umgekehrte Szenario der Fall sein, was durch weitere Untersuchungen geklärt

werden müsste.

Summary

150

9 Summary

Kerstin Bethmann Pharmacoresistance against a variety of drugs constitutes a major health problem for

the therapy of a plethora of diseases, e. g. epilepsy. The situation is worst in the most

frequent type of epilepsy, the temporal lobe epilepsy because up to 80 % of the

patients are refractory to treatment with antiepileptic drugs. Therefore it was

advantageous, that for the recent study we had an electric model for post-status

epilepticus in rats which allowed the development of spontaneous recurrent seizures

after an initial insult and therefore resembles the situation in humans where epilepsy

could appear e.g. after an head trauma.

Only about 10 % of the patients which do not respond to a therapy with the first

antiepileptic drug, can be successfully treated with a second anticonvulsive drug,

even if both substances differ markedly in their mechanism of action. A patient is

defined to be pharmacoresistent when the seizures can not be reduced for at least

50 % after application of two or more antiepileptic drugs. To my knowledge this is the

first study which fulfils this clinical definition of pharmacoresistance, because it was

possible, due to the subsequent application of the antiepileptic drugs phenobarbital

and phenytoin, to select pharmacoresistent and pharmacosensitive animals. This

model is therefore proposed to be adequate for studies of refractoriness and for the

further investigation of the causal mechanisms of pharmacoresistance as well as for

new treatment opportunities.

The basal reasons for pharmacoresistance are most likely multifactorial. One

favoured hypothesis is the overexpression of multidrug transporters like P-

glycoprotein (P-gp) in the blood brain barrier which limits, as is well known, the

entrance of many main antiepileptic drugs into the brain and therefore to the epileptic

focus.

In accordance with this theory, the inhibition of this transporter should increase the

concentration of antiepileptic drugs in the epileptic tissue. This assumption was

confirmed by the application of the selective P-gp inhibitor tariquidar in different

Summary

151

dosages shortly before the injection of phenobarbital because it was possible to

abolish the refractoriness against phenobarbital of the rats.

Like it is known from cancer patients, the recent study provides a proof of principle

that the upregulation of multidrug transporters in the blood brain barrier plays a major

role in the event of epilepsy and that through the inhibition of this mechanism, the

concentration of drugs in the brain increases, so that they can act more efficiently.

Another frequent finding in epilepsy is the changed composition of GABAA-receptor

subunits towards receptors which are insensitive against benzodiazepines. The

results from former studies are not always concurring.

To my knowledge this is the first study which compares modifications of GABAA-

receptor subunits between pharmacoresistant and pharmacosensitive animals with

immunhistochemical methods. It could be shown that the refractory animals express

a significant downregulation of the subunits α1, α2, α5 and γ2 in the dentate gyrus,

whereas such a loss could not be detected in responders. As the dentate gyrus plays

a major role in the passing of excitatory inputs from other limbic regions into the

hippocampus, the modified composition of subunits respectively their downregulation

in this area could contribute to pharmacoresistance. The dentate gyrus is especially

suited for studies on changes in GABAA-receptor subunits because this region is not

concerned from neurodegeneration in temporal lobe epilepsy like the CA1, CA3 or

the hilus. Neurodegeneration can complicate the estimation of changed compositions

of subunits because subunits could be plainly and simply reduced due to a loss of

neurons, so that the results have to be interpreted with caution.

Due to the fact that pharmacoresistance is probably a multifactorial process, the

hypotheses of the overexpression of multidrug transporters in the blood brain barrier

and the changed composition of GABAA-receptor subunits did not exclude each other

but may act in concert to mediate resistance respectively to worsen the prognosis of

treatment.

The overexpression of P-gp seems to play a major role in the mediation of resistance

against barbiturates compared to changes in the subunits of the GABAA-receptor,

because the resistance could be overcome completely by inhibition of P-gp. The

Summary

152

contrary scenario could be the case for benzodiazepines, which should be verified in

further studies.

Literaturverzeichnis

153

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Publikationsliste Kerstin Bethmann Institut für Pharmakologie, Toxikologe und Pharmazie Publikationen in Zeitschriften/Originalarbeiten: 1. Antonio P. Silva, Kerstin Bethmann, Friedrich Raulf & Herbert A. Schmid Regulation of ghrelin secretion by somatostatin analogs in rats European Journal of Endocrinology (2005) 152: 887-894 2. Holger A. Volk, Dimitrula Arabadzisz, Jean-Marc Fritschy, Claudia Brandt, Kerstin Bethmann & Wolfgang Löscher Antiepileptic drug-resistant rats differ from drug-responsive rats in hippocampal neurodegeneration and GABAA receptor ligand binding in a model of temporal lobe epilepsy Neurobiology of Disease 21 (2006): 633 – 646 3. Claudia Brandt, Kerstin Bethmann, Alexandra Gastens & Wolfgang Löscher The multidrug transporter hypothesis of drug resistance: Proof-of-principle in a rat model of temporal lobe epilepsy Neurobiology of Disease 24 (2006): 202 – 211 4. Kerstin Bethmann, Claudia Brandt & Wolfgang Löscher Resistance to phenobarbital extends to phenytoin in a rat model of temporal lobe epilepsy Epilepsia 48 (4) (2007): 816-826 5. Claudia Brandt, Maike Glien, Alexandra Gastens, Maren Fedrowitz, Kerstin Bethmann, Holger A. Volk, Heidrun Potschka & Wolfgang Löscher Treatment with levetiracetam after status epilepticus: effect on epileptogenesis, neuronal damage, and behavioural alterations in rats Neuropharmacology (angenommen) 6. Kerstin Bethmann, Jean-Marc Fritschy, Claudia Brandt & Wolfgang Löscher Antiepileptic drug resistant rats differ from drug responsive rats in GABAA-receptor subunit expression in a model of temporal lobe epilepsy (eingereicht bei Neurobiology of Disease) Kongressberichte: Kerstin Bethmann „Brainstorming II – Internationaler neurowissenschaftlicher Kongress in Hannover“ TiHo-Anzeiger 4/September 2006

Abstracts/Poster: 1. Marc W. Nolte, Wolfgang Löscher, Kerstin Bethmann & Manuela Gernert High frequency stimulation in epilepsy – a therapeutic alternative for pharmacoresistant epilepsy? 46. Frühjahrstagung der DGPT in Mainz, März 2005 Veröffentlicht in: Naunyn-Schmiedeberg`s Arch. Pharmacol. 371 (Suppl.1): R78 2. Kerstin Bethmann, Claudia Brandt & Wolfgang Löscher Resistance to antiepileptic drug treatment can be counteracted by inhibition of P-glycoprotein in a rat model of temporal lobe epilepsy Special platform session for late breaking data of the 26th International Epilepsy Kongress in Paris Aug./Sep. 2005 3. Marc W. Nolte, Wolfgang Löscher, Kerstin Bethmann & Manuela Gernert Subthalamic nucleus – a feasible target for high frequency stimulation in epilepsy? American Epilepsy Society, Washington DC, Dezember 2005 Veröffentlicht in: Epilepsia 46 (Suppl.8): 332 4. Kerstin Bethmann, Claudia Brandt, Alexandra Gastens & Wolfgang Löscher Combination therapy with the selective P-glycoprotein inhibitor tariquidar in phenobarbital-resistant epileptic rats FENS, Wien, 8.-12.07. 2006 5. Kerstin Bethmann, Jean-Marc Fritschy, Claudia Brandt & Wolfgang Löscher Änderungen der Expression von GABAA-Rezeptor-Untereinheiten im Hippocampus von epileptischen Ratten, welche sensitive oder resistent auf die Behandlung mit Phenobarbital reagieren 48. Frühjahrstagung der DGPT in Mainz, März 2007

Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Charakterisierung eines elektrischen

Rattenmodells für pharmakoresistente Epilepsie“ selbständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

Claudia Brandt, Ph.D. (Wissenschaftliche Angestellte am Institut für Pharmakologie,

Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) etablierte das

System zur EEG- und Videoüberwachung und implantierte die Elektroden.

Christina Fuest (ehemalige Ph.D.-Studentin des Instituts für Pharmakologie,

Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover) führte das

Scoring und die Zählungen zur Erfassung der Neurodegeneration durch.

Das Protokoll für die immunhistochemischen Untersuchungen der GABAA-

Rezeptoruntereinheiten wurde von Prof. J.M. Fritschy vom Institut für

Humanpharmakologie in Zürich etabliert.

Die Methodik der optischen Dichtemessung wurde von Holger Volk, Ph.D.

(ehemaliger Doktorand des Instituts für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie

der Tierärztlichen Hochschule Hannover) und Jens Peter Bankstahl (Doktorand)

etabliert.

Nicole Ernst (technische Mitarbeiterin) half mir bei der Auswertung der Video- und

EEG-Auswertungen.

Martina Gramer und Maria Hausknecht (technische Mitarbeiterinnen) führten für mich

die Analyse der Plasmakonzentrationen mittels HPLC durch.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat

von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die

im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institutionen angefertigt: 1) Institut für

Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule Hannover;

2) Gastaufenthalt am Institut für Humanpharmakologie der Universität Zürich.

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen

ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig

und der Wahrheit entsprechend gemacht habe.

Danksagung

Herrn Prof. Dr. W. Löscher gilt mein größter Dank für die Bereitstellung des Themas,

die jederzeitige wissenschaftliche Diskussionsbereitschaft, die Anleitung zur

experimentellen pharmakologischen Forschung und der Abfassung dieser

Dissertation sowie die fortwährende konstruktive Unterstützung meines beruflichen

Werdegangs.

Meinen Co-Supervisoren Prof. Dr. Dr. hc. H. Nau und Prof. Dr. M. Stangel danke ich

für die kompetente Betreuung während meiner Doktorarbeit sowie dem Interesse und

den konstruktiven Diskussionen zu dieser Arbeit.

Besonderer Dank gilt C. Brandt, PhD, für ihre kompetente Anleitung bei der

Durchführung der Versuche, ihre Motivation und ihre Geduld bei der Beantwortung

unzähliger Fragen.

Dr. A. Gastens möchte ich für ihre engagierte Unterstützung während der

Überwachungsphase danken.

N. Ernst danke ich für die unermüdliche und unschätzbare Hilfe beim Analysieren der

EEG- und Videoaufzeichnungen.

M. Gramer und M. Hausknecht danke ich herzlich für die Durchführung der

Plasmaanalyse mittels HPLC.

Ein großes Dankeschön gebührt Prof. Dr. J. M. Fritschy von der Universität Zürich für

die Möglichkeit, die Färbung der GABAA-Rezeptoruntereinheiten in seinem Labor

durchführen zu können. Vielen Dank für die hilfreichen und kompetenten

Diskussionen. C. Sidler, ebenfalls von der Uni Zürich, danke ich für die engagierte

und freundliche Hilfe bei der praktischen Durchführung der Immunhistochemie.

M. Weissing, E. Meier, N. Thonig, D. Pieper-Matriciani sowie allen anderen

Institutsmitgliedern danke ich für vielfältige Unterstützung und ein nettes

Arbeitsklima.

Besonders danken möchte ich auch dem Doktorandenteam (Ina, Jens, Marion,

Saskia, Kathrin, Anton, Marc, Marko, Carlos, Kamilla) für die unterhaltsame und

freundliche Arbeitsatmosphäre, in der ich mich sehr wohl gefühlt habe, und die

Beantwortung jedweder Fragen.

Dank gilt auch meinen Kommilitonen aus dem Ph.D.-Studiengang des ZSN (Gunnar,

Robert, Rainer, Yohannes, Susann, Ina, Kirsten, Maren und vor allem Jirawat „Bo“

Kumnok, der uns sehr fehlt und den wir nie vergessen werden) für den

Zusammenhalt während des Studiums und die großartige Zusammenarbeit beim

Kongress „Brainstorming II“.

Herzlicher Dank gebührt den National Institutes of Health (NIH, Bethesda, USA) für

die finanzielle Unterstützung während der gesamten Arbeit.

Insbesondere danke ich Ina Gröticke, Saskia Kücker, Gunnar Hargus, Mona

Gwendolyn Behrendt und Katharina Laubstein für ihre unschätzbare Freundschaft

und die Motivation die mir so vieles erleichtert hat.

Ganz besonderer Dank gilt den wichtigsten Menschen in meinem Leben: meiner

Mutter Christa Bethmann und meinem viel zu früh verstorbenen Vater Holger Uwe

Bethmann, meiner Großmutter, meinem Bruder und meinem Freund für ihre Liebe,

ihr Vertrauen und die großartige Unterstützung, ohne die ich nicht dort wäre, wo ich

heute bin. Ihr seid die beste Familie die man sich wünschen kann. Danke für alles.

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Doktorin der Biologie (Dr. rer. nat.) - elib.tiho-hannover.de · 2) Resistance to Phenobarbital extends to phenytoin in a rat model of temporal lobe epilepsy; Kerstin Bethmann, Claudia