Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für ... · 4.7 Komplementation von PA1587 in der Transposonmutante 25/C1 50 4.8 Untersuchung zur cupA1-Genexpression (PA2128) in den

Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für Infektionsmedizin

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene

der Medizinischen Hochschule Hannover

____________________________________________________________

Molekulare Charakterisierung von langsam wachsenden Subpopulationen

(small colony variants) von Pseudomonas aeruginosa isoliert aus dem

Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von

Verena Wild

aus Soltau

Hannover 2004

Wissenschaftliche Betreuung an der Tierärztlichen Hochschule:

Univ.-Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand

Wissenschaftliche Betreuung an der Medizinischen Hochschule:

Univ.-Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand

2. Gutachterin: Prof. Dr. Beatrice Grummer

Tag der mündlichen Prüfung: 16.11.2004

M E I N E R F A M I L I E

I INHALTSVERZEICHNIS

INHALTSVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V

1 EINLEITUNG 1

2 SCHRIFTTUM 3

2.1 Pseudomonas aeruginosa: Taxonomie und allgemeine Eigenschaften 3

2.2 Extrazelluläre Virulenzfaktoren von Pseudomonas aeruginosa 4

2.3 Pseudomonas aeruginosa als Erreger nosokomialer Infektionen 6

2.4 Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa beim Tier 7

2.5 Pseudomonas aeruginosa und Cystische Fibrose 8

2.6 Pseudomonas aeruginosa und seine Fähigkeit zur Biofilmbildung 11

2.7 Phänotypische Varianten von Pseudomonas aeruginosa

bei Cystischer Fibrose 14

2.8 Zielsetzung der Arbeit 19

3 MATERIALIEN UND METHODEN 20

3.1 Materialien 20

3.1.1 Bakterienstämme 20

3.1.2 Medien für die Bakterienanzucht 21

3.1.3 Puffer und Lösungen 21

3.1.4 Molekularbiologische Fertigprodukte 22

3.1.5 Enzyme und Molekulargewichtsstandards 22

3.1.6 Oligonukleotide 23

3.1.7 Vektoren 24

3.2 Methoden 24

3.2.1 Anzucht von Bakterien 24

3.2.2 Einfrieren und Entsorgen von Bakterien 24

3.2.3 Isolierung genomischer DNA aus Pseudomonas aeruginosa 24

II INHALTSVERZEICHNIS

3.2.4 Isolierung von Gesamt-RNA 25

3.2.5 Plasmidpräparationen 25

3.2.6 Elektrophoretische Auftrennung von DNA 26

3.2.7 Elektrophoretische Auftrennung von RNA 26

3.2.8 Reinigung von Nukleinsäuren 27

3.2.9 Restriktionsspaltung von Nukleinsäuren 27

3.2.10 Ligation von Nukleinsäuren 27

3.2.11 Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli DH5α-Zellen 27

3.2.12 Transformation von CaCl2-kompetenten E. coli DH5α-Zellen 28

3.2.13 Polymerasekettenreaktion (PCR) 28

3.2.14 Herstellung einer digoxigeninmarkierten DNA-Sonde 29

3.2.15 Sequenzierung von Nukleinsäuren 29

3.2.16 Isolierung des EZ::TN Transposon 29

3.2.17 Transposonmutagenese 30

3.2.18 Untersuchung der Transposonmutanten auf Autoaggregation 31

3.2.19 Untersuchung der Transposonmutanten auf Motilität 31

3.2.20 Southern Blot 31

3.2.21 Northern Blot 33

3.2.22 Identifizierung der Transposon flankierenden DNA-Sequenz mittels

eines Y-Linker 34

3.2.23 Identifizierung der Transposoninsertion 36

3.2.24 Komplementation der Transposonmutante 25/C1 36

3.2.25 Transformation des pvrR-Gens in die Transposonmutante 25/C1 37

3.2.26 Elektronenmikroskopische Darstellung von Fimbrienstrukturen

und Flagellen 37

4 ERGEBNISSE 38

4.1 Transposonmutagenese von Pseudomonas aeruginosa 38

4.2 Transposonmutagenese des WT 20265: Überprüfung auf langsam

wachsende Phänotypen 38

4.3 Transposonmutagenese der SCV 20265: Überprüfung auf schnell

wachsende Phänotypen 39

III INHALTSVERZEICHNIS

4.4 Charakterisierung der Transposonmutanten im Autoaggregations-

Assay 40

4.4.1 Wachstumsverhalten der Transposonmutanten des mutagenisierten

WT 20265 in Flüssigmedium 41

4.4.2 Wachstumsverhalten der Transposonmutanten der mutagenisierten

SCV 20265 in Flüssigmedium 42

4.5 Charakterisierung der Transposonmutanten im Twitching-Motilitäts-Assay 43

4.6 Molekularbiologische Charakterisierung der Transposonmutanten 45

4.7 Komplementation von PA1587 in der Transposonmutante 25/C1 50

4.8 Untersuchung zur cupA1-Genexpression (PA2128) in den Transposon-

mutanten des mutagenisierten WT 20265 51

4.9 Ausbildung von Fimbrienstrukturen und Flagellen in Transposonmutanten

des mutagenisierten WT 20265 53

4.10 Ausbildung von Fimbrienstrukturen und Flagellen in klinischen

autoaggregativen SCVs 56

4.11 Wachstumsverhalten der Transposonmutante 25/C1unter

pvrR-Genexpression in trans 58

4.12 Temperaturabhängiges Wachstum der mutagenisierten SCV 20265 mit

einer Transposoninsertion in PA1120 58

5 DISKUSSION 60

5.1 Molekulare Mechanismen beim phänotypischen Switch von

Pseudomonas aeruginosa 61

5.1.1 Regulation eines autoaggregativen SCV Phänotyps in Verbindung

mit einem phänotypischen Switch bei Pseudomonas aeruginosa 67

5.1.2 Mutationen in den Genen mutS und mutL führen zu einem schnell

wachsenden Phänotyp ähnlich der Revertante 20265 72

5.2 Ausblick 74

6 ZUSAMMENFASSUNG 75

IV INHALTSVERZEICHNIS

7 SUMMARY 77

8 LITERATURVERZEICHNIS 79

9 ANHANG 102

9.1 Chemikalien 102

9.2 Gebrauchsmaterialien 103

9.3 Geräte 104

9.4 Untersuchung der Transposonmutanten des WT 20265

auf langsames Wachstum und Autoaggregation 105

9.5 Untersuchung der Transposonmutanten der SCV 20265

auf schnelles Wachstum und Autoaggregation 113

9.6 Experimentell ermittelte Sequenzen: Transposonmutanten des WT 20265 115

9.7 Experimentell ermittelte Sequenzen: Transposonmutanten der SCV 20265 120

9.8 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis 125

V ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

• Abb. Abbildung

• AP Alkalische Phosphatase

• BHI brain-heart infusion Medium

• bidest. zweimal destilliert

• bp Basenpaare

• cDNA komplementäre DNA, die bei der

reversen Transkription von RNA entsteht

• CF Cystische Fibrose

• CFTR cystic fibrosis transmembrane conductance regulator

• cup chaperone/ usher pathway

• DEPC Diethylpyrocarbonat

• DIG Digoxigenin

• d. h. das heißt

• DNA Desoxyribonukleinsäure

• DNase Desoxyribonuklease

• dNTP Desoxynukleotidtriphosphat

• EDTA Ethylendiamintetraacetat

• GmR Gentamicin-Resistenz

• kb Kilobasen (paare)

• kV Kilovolt

• LB Luria Bertani (Medium)

• LBB Luria Bertani Bouillon

• M Molar

• m milli- (10-3); Masse

• min Minute(n)

• mol 6.022 x 1023 Teilchen

• µ mikro- (10-6)

• MOPS Morpholinopropansulfonsäure

• n nano- (109)

• OD Optische Dichte

• PCR Polymerasekettenreaktion

• REV Revertante, aus SCV in vitro generierter,

schnell wachsender Morphotyp

• RNA Ribonukleinsäure

VI ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

• RNase Ribonuklease

• s. siehe

• SCV(s) small colony variant(s)

• SDS Natriumdodecylsulfat

• spp. Subspezies

• SSC Natriumchlorid/ Trinatrium-Citrat

• Tab. Tabelle

• Taq Thermus aquaticus

• TBE Tris-Borsäure-EDTA

• TE Tris-EDTA

• Tn5 Transposon

• Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethan

• U Unit (Einheit der Enzymaktivität)

• ÜN Über Nacht

• UV Ultraviolett

• vergl. vergleiche

• WT Wildtyp, zur SCV klonales und schnell wachsendes Isolat

• z. B. zum Beispiel

• z. T. zum Teil

• Ω Ohm

1 EINLEITUNG

1. Einleitung

Pseudomonas aeruginosa, ein überall in der Umwelt vorkommender und opportunistisch

pathogener Keim für Pflanze, Tier und Mensch, trägt bei Patienten mit Cystischer Fibrose

(CF) (syn. Mukoviszidose) in Form einer chronischen Lungeninfektion maßgeblich zur

Morbidität und Mortalität bei. Die meisten Mukoviszidosepatienten werden im Schulalter

oder während der frühen Pubertät von P. aeruginosa kolonisiert (TÜMMLER u. KIEWITZ

1999) und obwohl die Mehrzahl der Patienten nur mit einem P. aeruginosa-Klon besiedelt

sind, der dort während des ganzen Lebens verbleibt (RÖMLING et al. 1994), können aus dem

Respirationstrakt eine Vielzahl von phänotypischen Varianten isoliert werden (Dissoziatives

Verhalten) (ZIERDT u. SCHMIDT 1964). Die größte Beachtung ist dabei in zahlreichen

Studien dem mukoiden P. aeruginosa-Phänotyp geschenkt worden, dessen exzessive

Exopolysaccharidbildung (Alginat) eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der chronischen

Lungeninfektion zugeschrieben wird. Neben dem mukoiden Phänotyp werden aus dem

Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten unter anderem auch langsam wachsende

Subpopulationen von P. aeruginosa, so genannte small colony variants (SCVs) isoliert. Dabei

konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von SCVs mit schlechten

Lungenfunktionsparametern und einer inhalativen Antibiotikatherapie korreliert und diese

nach mehreren Passagen in reichhaltigem Flüssigmedium zu einem schnell wachsenden

Phänotyp mit großen auslaufenden Kolonien revertieren (HÄUSSLER et al. 1999a). In

nachfolgenden Untersuchungen konnte eine Subgruppe von autoaggregativen und

hyperpilierten SCVs identifiziert werden, die scheinbar in der einzigartigen Umwelt der

CF-Lunge selektioniert werden (HÄUSSLER et al. 2003a). Diese Morphotypen zeigen ein

autoaggregatives Verhalten in Flüssigkultur sowie eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung

und Twitching-Motilität im Gegensatz zum klonalen Wildtyp. Das Auftauchen dieser

hyperpilierten SCVs in der CF-Lunge scheint eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der

chronischen Lungeninfektion mit P. aeruginosa einzunehmen und die Bakterien im Biofilm

zu einer Persistenz in der Lunge zu befähigen. In vorhergehenden Studien über

antibiotikaresistente SCVs von P. aeruginosa mit einer erhöhten Fähigkeit zur

Biofilmbildung wurde die Hypothese aufgestellt, dass phänotypische Differenzierung eine

Adaptation an gegebene Umweltbedingungen durch einen Phasenvariationsmechanismus sein

2 EINLEITUNG

könnte (DEZIEL et al. 2001; DRENKARD u. AUSUBEL 2002). OLIVER et al. (2000)

fanden wiederum in CF-Lungen mit zunehmender Frequenz so genannte Hypermutatoren von

P. aeruginosa und stellten die Hypothese auf, dass nicht nur eine Variation zwischen zwei

Phasen, sondern Mutation und Selektion zur Etablierung von so genannten

Nischenspezialisten verantwortlich sein kann und so eine Adaptation an die Bedingungen der

chronisch infizierten Lunge ermöglicht. Die chronisch infizierte CF-Lunge bietet ein Habitat,

in der P. aeruginosa in hoher Zelldichte einer Vielzahl von Umweltbedingungen gegenüber

steht und so zu morphologischer Differenzierung und Etablierung von Nischenspezialisten

führt. Solche Morphotypen könnten ebenso aufgrund von Mutation und Selektion, wie es für

Pseudomonas fluorescens in einer heterogenen Umwelt beschrieben wurde (RAINEY u.

TRAVISANO 1998), entstehen.

3 SCHRIFTTUM

2. Schrifttum

2.1 Pseudomonas aeruginosa: Taxonomie und allgemeine

Eigenschaften

Die Gattung Pseudomonas wurde erstmals 1894 von MIGULA beschrieben. Zur

Charakterisierung und Klassifizierung dieser Gattung wurden lange Zeit unspezifische

morphologische Merkmale (gramnegativ, stäbchenförmig, gerade, polar begeißelt)

herangezogen, sodass diese ein Auffangbecken für unvollständig charakterisierte Arten wurde

(STANIER et al. 1966). Erst mit der zunehmenden Entwicklung von molekularbiologischen

Techniken wurde die Gattung Pseudomonas mithilfe der DNA-rRNA-Hybridisierung

basierend auf rRNA-Homologien in 5 große Gruppen eingeteilt (PALLERONI et al. 1973;

DE VOS u. DE LEY 1983). Die Art Pseudomonas aeruginosa gehört bis heute mit z. B.

P. fluorescens, P. putida und P. syringae zu der Gruppe I, die im phylogenetischen Baum den

γ-Proteobakterien zugeordnet wird (ANZAI et al. 2000). Bezeichnet werden sie als

Pseudomonaden im engeren Sinne. Bei den Pseudomonaden im weiteren Sinne der Gruppen

II-V kam es nach und nach zu Umklassifizierungen in andere Gattungen. Die Arten der

Gruppe II wurden z. B. in die Gattung Burkholderia überführt (YABUUCHI et al.1992;

URAKAMI et al. 1994), während einige Arten der Gruppe IV zur Gattung Brevundimonas

gehören (SEGERS et al. 1994).

Pseudomonas aeruginosa ist ein 0.5-0.8 µm dickes und 1.5-3.0 µm langes gramnegatives und

polar begeißeltes Stäbchen. Dieser fakultativ pathogene Entzündungserreger besitzt die

Fähigkeit, die verschiedensten ökologischen Nischen zu besiedeln. So findet P. aeruginosa

sein Habitat nicht nur im Erdboden, im Wasser, im Abwasser und in diversen Feuchtzonen,

sondern auch in Pflanzen, Tieren und nicht zuletzt im Menschen, wo er als Erreger eitriger

und septikämischer Infektionen eine große Bedeutung besitzt. P. aeruginosa gehört zu dem

meist isolierten Erreger von nosokomialen Infektionen und trägt bei Patienten mit Cystischer

Fibrose (CF) in Form einer chronischen Lungeninfektion maßgeblich zur Morbidität und

Mortalität bei (TÜMMLER u. KIEWITZ 1999). Die hohe Anspruchslosigkeit und seine

Fähigkeit sich an verschiedene Umweltbedingungen anzupassen, spiegelt sich in der

Genomgröße von P. aeruginosa wider. So besitzt P. aeruginosa PAO1 mit rund 6.3 Millionen

4 SCHRIFTTUM

Basenpaaren (bp) ein deutlich größeres Genom als alle anderen bisher sequenzierten

bakteriellen Genome und erreicht die genetische Komplexität die vom einfachen

eukaryotischen Organismus z. B. Saccharomyces cerevisiae (STOVER et al. 2000).

Aufgrund dieser Vielseitigkeit ist das Bakterium im Labor auf einfach

zusammengesetzten Nährböden, wie z. B. MacConkey-Agar und flüssigen Nährmedien bei

37 °C und 42 °C ohne Probleme anzüchtbar. Bei 4 °C ist allerdings kein Wachstum mehr

möglich. Die meisten P. aeruginosa-Stämme bilden relativ große, meist grünlich metallisch

glänzende und eingesunkene Kolonien mit einem charakteristischen süßlich aromatisch, nach

Lindenblüten erinnernden Geruch, der durch o-Aminoacetophenon hervorgerufen wird. Diese

Koloniemorphologie ist besonders gut auf Blutagar sichtbar. Auf Schafblutagar zeigt der

Keim häufig eine Hämolyse, die durch die zwei Hämolysine Phospholipase C und

hitzestabiles Glykolipid verursacht wird. In flüssigen Nährmedien wächst P. aeruginosa

vorwiegend unter Bildung einer so genannten Kahmhaut an der Oberfläche. Von einigen

Stämmen wird unter bestimmten Wachstumsbedingungen das blaugrüne Pigment Pyocyanin

freigesetzt, welches dem Eiter seine charakteristische Farbe verleiht. Genau diesem Pigment

verdankt der Erreger seinen alten Namen Bacterium pyocyaneum. Als weiterer Farbstoff wird

das gelbgrüne Pyoverdin gebildet. Es ist ein im UV-Licht fluoreszierender Farbstoff, der

unlöslich in Chloroform und für P. aeruginosa nicht spezifisch ist. Weitere, aber selten

vorkommende Farbstoffe sind das rötliche Pyorubin und das bräunliche Pyomelanin. Als

zusätzlich kulturell-biochemische Eigenschaft verfügt P. aeruginosa über das Enzym

Katalase und, von besonderem diagnostischen Wert, die Oxidase.

2.2 Extrazelluläre Virulenzfaktoren von Pseudomonas aeruginosa

P. aeruginosa verfügt über ein großes Repertoire an extrazellulären Virulenzfaktoren, die

nach der Kolonisation an der Entstehung umfassender Gewebszerstörung und Verbreitung des

Erregers beteiligt sind (VAN DELDEN u. IGLEWSKI 1998). Der vermutlich wichtigste

Virulenzfaktor ist das Exotoxin A, welches ähnlich dem Diphterietoxin, eine Hemmung der

Proteinbiosynthese durch ADP-Ribosylierung des Elongationsfaktors 2 bewirkt (WICK et al.

1990; VOGT et al. 1999). Es ist für lokale Gewebszerstörung und bakterielle Invasion

verantwortlich und besitzt eine hohe Toxizität (WOODS u. IGLEWSKI 1983). In vitro

5 SCHRIFTTUM

inhibiert Exotoxin A die Proliferation von B-Zellen sowie die Produktion von Immunglobulin

IgG und IgM (VIDAL et al. 1993).

Die von P. aeruginosa gebildeten zwei Proteasen, die Elastase und die alkalische

Protease, sind möglicherweise von großer Bedeutung während der akuten Phase einer

P. aeruginosa-Infektion. Mit der Elastase besitzt der Erreger die Fähigkeit, das Protein Elastin

zu spalten. Elastin, ein wichtiger Bestandteil des Lungengewebes und der Blutgefäße, ist für

die Kontraktion und Ausdehnung der Lunge sowie für die Elastizität der Blutgefäße

erforderlich (VAN DELDEN u. IGLEWSKI 1998). Die elastolytische Aktivität wird durch

LasA und LasB vermittelt. Elastin wird von LasA so verändert, dass LasB Elastin effektiver

spalten kann (VOGT et al. 1999). LasB spaltet außer Elastin noch Fibrin und Kollagen

(HECK et al. 1986), inaktiviert die Immunglobuline IgG und IgA (HECK et al. 1990),

Lysozym (JACQUOT 1985), Komplementkomponenten (HONG u. GHEBREHIWET 1992)

sowie Substanzen, die am Schutz des Respirationstraktes vor Proteasen beteiligt sind, wie der

humane α-1-Proteinaseninhibitor (MORIHARA et al. 1979). Die alkalische Protease spielt

vermutlich eine zentrale Rolle bei der Infektion der Kornea (HOWE u. IGLEWSKI 1984;

KERNACKI et al. 1995).

Pyocyanin ist nicht nur für die blaugrüne Färbung des Eiters verantwortlich, sondern

wirkt als Virulenzfaktor z. B. toxisch auf den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

(MAHAJAN-MIKLOS et al. 1999) und neutrophile Granulozyten (USHER et al. 2002).

Neben den in die Umgebung abgegebenen Virulenzfaktoren besitzt P. aeruginosa ein so

genanntes Typ III Sekretionssystem. Mit diesem System besitzt das Bakterium die Fähigkeit,

Effektorproteine nach Kontakt direkt in die eukaryotische Zielzelle zu injizieren (FRANK

1997; HUECK 1998; GALAN u. COLLMER 1999; CORNELIS u. VAN GIJSEGEM 2000).

Zu den Effektorproteinen gehört das Exoenzym S, welches aus den zwei nicht-kovalent

gebundenen Polypeptiden ExoS und ExoT besteht (FINCK-BARBANCON et al. 1997) und

zusammen mit Exotoxin A zu den ADP-Ribosyltransferasen gehört (IGLEWSKI et al. 1978;

NICAS et al. 1985). Des Weiteren gehört das zytotoxische und Epithelläsionen verursachende

ExoU (FINCK-BARBANCON et al. 1997) zu den Effektorproteinen sowie das ExoY,

welches möglicherweise zu einer cAMP-Anreicherung in der Zielzelle führt (YAHR et al.

1998).

6 SCHRIFTTUM

2.3 Pseudomonas aeruginosa als Erreger nosokomialer

Infektionen

Für eine erfolgreiche Kolonisation seines Wirtes ist P. aeruginosa als opportunistischer

Erreger auf ein geschwächtes oder defektes Abwehrsystem angewiesen. Der Erreger gehört

nach Escherichia coli zu dem am zweit häufigsten vorkommenden gramnegativen

Verursacher nosokomialer Infektionen (DÖRING 1993). So infiziert P. aeruginosa

insbesondere Menschen mit einer Störung der Haut- oder Schleimhautbarriere oder einer

Immunsuppression. Als so genannter „Nass- oder Pfützenkeim" besiedelt P. aeruginosa im

Krankenhaus unter anderem Waschbecken, Luftbefeuchter, Schläuche von Beatmungs- und

Infusionsgeräten, Säuglingsinkubatoren, Desinfektionsmittel (quarternäre Ammonium-

verbindungen) und Blumenvasen. Selbst im destillierten Wasser kann der Erreger

vorkommen, sofern Spuren von organischen Substanzen vorhanden sind (VOGT et al. 1999).

Bei erfolgreicher Kolonisation des Wirtes mit dem Erreger entsteht eine folgenschwere

Infektion. So ist P. aeruginosa für 16% der nosokomialen Pneumonien (WIBLIN 1997), für

8% der Wundinfektionen nach chirurgischen Eingriffen (KLUYTMANS 1997) sowie für

10% der Sepsisfälle (GORDON et al. 1998) verantwortlich.

Künstlich beatmete Patienten, die an eine durch P. aeruginosa verursachte Pneumonie leiden,

zeigen eine höhere Mortalitätsrate als Patienten, deren Pneumonien durch andere Erreger

verursacht wurden (STEVENS et al. 1974; BRYAN u. REYNOLDS 1984; FAGON et al.

1989). Studien von CROUCH BREWER et al. (1996) zeigten mit einer Mortalitätsrate von

68% ähnliche Ergebnisse. Verletzungen des Tracheal- und Bronchialepithels, wie sie während

einer Intubation entstehen können, erhöhen die Empfänglichkeit für eine Infektion mit

P. aeruginosa (DERETIC 2000).

Durch P. aeruginosa verursachte Harnwegsinfektionen entstehen hauptsächlich bei Patienten,

an denen chirurgische Eingriffe am Urogenitaltrakt vorgenommen wurden oder Träger von

Dauerkathetern sind. Des Weiteren können anatomische oder funktionelle Abweichungen des

Urogenitaltraktes die Ursache für eine Infektion sein (VOGT et al. 1999; DERETIC 2000).

Die Urosepsis stellt eine gefürchtete Komplikation bei einer Harnwegsinfektion mit

P. aeruginosa dar.

7 SCHRIFTTUM

P. aeruginosa wird häufig mit Verbrennungswunden assoziiert. So bietet nicht nur die lokale

Zerstörung der Hautbarriere, sondern auch der begleitende immunsuppressive Effekt einer

Verbrennung dem Erreger ideale Bedingungen für eine zunächst lokale und später

systemische Ausbreitung im Körper (DERETIC 2000). Ausbrüche mit P. aeruginosa auf

Stationen mit Verbrennungsopfern sind mit einer hohen Mortalität (60%) verbunden

(RICHARD et al. 1994).

Verletzungen des Auges, die durch Trauma oder einfach nur durch das Tragen von

Kontaktlinsen entstanden sind, können zu einer P. aeruginosa-Infektion führen. Bereits feine

Abrasion des Oberflächenepithels der Kornea, wie sie durch Kontaktlinsen hervorgerufen

werden können, ermöglichen dem Erreger bereits ein erfolgreiches Anheften. Als Folge

entstehen häufig Ulzerationen der Kornea, eine Skleritis und Endophthalmitis. Die Infektion

bei Kontaktlinsenträgern geht meistens auf die Kontamination der Aufbewahrungsflüssigkeit

mit P. aeruginosa zurück sowie ungenügend gereinigte Linsen, die mit Protein und Mukus

bedeckt sind und dem Bakterium einen idealen Nährboden zum Wachstum bieten (VOGT et

al. 1999; DERETIC 2000).

Weitere Beispiele für durch P. aeruginosa verursachte lokale Infektionen sind Otitiden und

Endokarditiden. Bei der Endokarditis spielen prädisponierende Faktoren wie künstliche

Herzklappen und intravenöser Konsum von Drogen eine Rolle (DERETIC 2000). Sehr selten

verursacht P. aeruginosa Meningitiden und Gehirnabszesse, wobei Gehirnabszesse aufgrund

von penetrierenden Schädelverletzungen entstehen können.

Bis zu 24% der Menschen können P. aeruginosa im Stuhl beinhalten (MORRISON u.

WENZEL 1984). Wird der Darm allerdings massiv mit dem Erreger besiedelt, kann eine

nekrotisierende Enterokolitis entstehen, die bei Neugeborenen tödlich verläuft und bei

Erwachsenen mit einer hohen Mortalität einhergeht (STONE et al. 1979).

2.4 Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa beim Tier

P. aeruginosa ist bei Tieren an verschiedenen lokalen, häufig chronischen Infektions-

krankheiten beteiligt, während septikämische Allgemeininfektionen seltener sind. Das Wirts-

8 SCHRIFTTUM

spektrum des Erregers ist sehr breit. So sind neben den Haustierarten ebenso Heim- und

Zootiere betroffen, insbesondere Reptilien, bei denen sich eine Infektion mit P. aeruginosa in

Form von Stomatitiden, Abszessen und Allgemeininfektionen äußert. Eine Herabsetzung des

Abwehrsystems sowie einer Störung der Haut- oder Schleimhautbarriere ist wie beim

Menschen die Voraussetzung für klinisch manifeste Infektionen. Häufig sind Infektionen bei

Jungtieren sowie im Rahmen von Mischinfektionen anzutreffen (SELBITZ 1992, 2002).

Beispiele für lokale Infektionen mit P. aeruginosa sind Wundinfektionen, die chronisch

eitrige Otitis externa des Hundes, ulzerative Keratitiden bei Hunden und Pferden, eine selten

auftretende Infektion des Uterus mit möglichem Abort bei der Stute, Infektionen des

Urogenitaltraktes bei Hund und Katze aufgrund mechanischer Manipulation wie z. B. bei der

Katheterisierung sowie die so genannte Vliesfäule bei Schafen, einer exsudativen Dermatitis

(GYLES 1993; KOWALSKI 1998; PLANT 2000).

Von P. aeruginosa verursachte Mastitiden beim Wiederkäuer sind selten, jedoch können

sie im Rinderbestand enzootisch auftreten. Häufig werden sie in den Beständen beobachtet, in

denen quarternäre Ammoniumsalze als Desinfektionsmittel für Melkgeräte benutzt wurden.

Eine P. aeruginosa-Mastitis kann sowohl systemisch oder als auch lokal, akut, chronisch oder

subklinisch verlaufen. Schwere akute Fälle können zum Tod des Tieres führen (KLASTRUP

1994).

Von P. aeruginosa verursachte septikämische Allgemeininfektionen, die schnell zum Tode

führen können, sind insbesondere beim Geflügel, Nerz und Chinchilla vorzufinden (GYLES

1993). Beim Geflügel sind besonders Küken, die sich über Brutschränke, Tränkesysteme oder

kontaminierte Injektionsspritzen mit dem Erreger infizieren, von einer Septikämie bedroht.

Die Gesamtmortalität in der Herde kann dabei zwischen 1-90% schwanken (SIEGMANN

1993).

2.5 Pseudomonas aeruginosa und Cystische Fibrose

Die Cystische Fibrose (CF) ist die zweithäufigste autosomal rezessive Erbkrankheit der

weißen Bevölkerung und wird durch einen Gendefekt im cystic fibrosis transmembrane

conductance regulator (CFTR)-Gen verursacht (GALLATI 2001). Bisher sind mehr als 1200

9 SCHRIFTTUM

Mutationen bekannt (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr). Die häufigste Mutation (~ 70%)

ist die (inframe) 3-Basenpaar-Deletion im CFTR-Gen (F508), welche zum Verlust der

Aminosäure Phenylalanin an Position 508 führt (TÜMMLER u. KIEWITZ 1999; PIER

2000). Das CFTR-Gen kodiert für einen cAMP-regulierten Chlorid-Kanal, der ATP bindet

und aktiv am Ionen-Transport durch die Zellmembran beteiligt ist (STUTTS et al. 1995;

GALLATI 2001). Des Weiteren besitzt das CFTR-Protein Regulatorfunktionen für andere

Ionenkanäle (RANDAK u. TÜMMLER 2001).

Klinisch manifestiert sich die CF hauptsächlich in den Organen wie Lunge, Pankreas, Darm,

Leber und Gallenwege sowie Schweißdrüsen und Nebenhoden, wobei die Lunge das am

schwersten betroffene Organ darstellt und die häufigste Ursache für Morbidität und

Mortalität in der CF-Erkrankung ist (GOVAN u. DERETIC 1996; TÜMMLER u. KIEWITZ

1999; RAJAN u. SAIMAN 2002).

Die gestörte Funktionsfähigkeit des CFTR führt zu einer Dysregulation des

Ionentransportes in den epithelialen Zellen. Dadurch kommt es zur Bildung eines hoch

viskösen Bronchialsekretes und in Folge zu einem eingeschränkten Vermögen, den

Bronchialtrakt von Sekreten zu befreien, d. h. zu einer abnormen mukoziliären Clearance.

Die gestörte mukoziliäre Clearance gilt als die Hauptursache für die chronische bakterielle

Besiedelung des Bronchialtraktes, bei der insbesondere P. aeruginosa eine bedeutende Rolle

zu kommt. Während in den ersten Stadien der Erkrankung vor allem Hämophilus influenzae

und Staphylococcus aureus aus den Respirationstraktmaterialien isoliert werden, dominiert in

späteren Stadien P. aeruginosa. Heute ist P. aeruginosa der am häufigsten vorkommende

Erreger bei der CF und wird als der CF-Leitkeim bezeichnet (KRAEMER 2001; GOVAN u.

DERETIC 1996; TÜMMLER u. KIEWITZ 1999; LYCZAK et al. 2002). 75-90% der

CF-Patienten sind mit diesem Bakterium infiziert (PIER 2000).

Die Kolonisation der CF-Lunge mit P. aeruginosa findet meistens während der Schulzeit

oder frühen Pubertät statt (TÜMMLER u. KIEWITZ 1999), wobei Studien zeigen konnten,

dass die CF-Patienten mit Umweltisolaten von P. aeruginosa infiziert werden (RÖMLING et

al. 1994). Dabei beginnt P. aeruginosa mit der Besiedlung des Respirationstraktes im Naso-

und Oropharynx (KUBESCH et al. 1988). Die höchste Anzahl der an bukkale Epithelzellen

gehefteten Bakterien wurde bei den Patienten vorgefunden, die eine akute virale Infektion in

den oberen Atemwegen aufwiesen. Das führte zu der Vermutung, dass die Zerstörung der

10 SCHRIFTTUM

intakten Epithelzellschicht und die Produktion von Zelltrümmern während einer viralen

Infektion die Kolonisation des Respirationstraktes von CF-Patienten triggert. Weitere Studien

zeigten, dass intakte Epithelzellen sich an der Beseitigung von P. aeruginosa aus dem

Respirationstrakt sogar aktiv beteiligen, indem sie den CFTR als Rezeptor für die

Internalisierung des Erregers durch Endozytose benutzen. Fehlt der CFTR in der

Plasmamembran der Epithelzelle oder ist die Epithelzellschicht durch virale Infektionen

zerstört, kommt es zu einer Erhöhung der Bakterienanzahl in der Lunge (PIER 1998, 2000).

Auch wird davon ausgegangen, dass insbesondere Erreger wie Staphylococcus aureus und

Hämophilus influenzae mit einer ersten erfolgreichen Infektion der CF-Lunge den Weg für

P. aeruginosa vorbereiten (DERETIC 2000).

Ist es P. aeruginosa gelungen, die CF-Lunge chronisch zu infizieren, so können die

meisten Chemotherapeutika den Erreger nicht mehr eliminieren (DERETIC 2000). Im

Gegenteil, P. aeruginosa scheint besondere Selektionsvorteile in der CF-Lunge zu besitzen

und bildet phänotypische Varianten bzw. genetisch stabile CF-P. aeruginosa-Stämme aus

(s. 2.7). So ist z. B. der Wechsel zum mukoiden Morphotyp von P. aeruginosa und dessen

exzessive Produktion des Exopolysaccharides Alginat mit einer fortschreitenden Abnahme

der Lungenfunktion assoziiert (GOVAN u. DERETIC 1996). Des Weiteren korrelierte der

Nachweis von langsam wachsenden Subpopulationen, so genannten small colony variants

(SCVs) mit schlechten Lungenfunktionsparametern und inhalativer Antibiotikatherpie

(HÄUSSLER et al. 1999a). Der Fähigkeit von P. aeruginosa, einen Biofilm zu bilden,

kommt eine besondere Bedeutung zu, da durch diese Wachstumsform der Erreger z. B. vor

dem Immunsystem des CF-Patienten und Chemotherapeutika geschützt wird (s. 2.6). Somit

ist eine frühe antibiotische Therapie sehr wichtig, da eine Suppression von P. aeruginosa die

Prognose für den CF-Patienten insgesamt deutlich verbessern kann.

Andere Bakterien wie Streptococcus pneumonie, Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus

spp., Serratia spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp. und Streptokokken der Gruppe A

erreichen nicht die Prävalenz wie P. aeruginosa. Es kommt im Allgemeinen zu keiner

Persistenz dieser Erreger in der CF-Lunge. Aspergillus spp., Candida albicans und atypische

Mykobakterien können die CF-Lunge infizieren, allerdings weniger häufig und im späteren

Lebensabschnitt eines CF-Patienten (RENDERS et al. 2001).

11 SCHRIFTTUM

Durch die chronische Infektion in der CF-Lunge wird die mukoziliäre Clearance zusätzlich

gestört. Es entsteht eine Bronchiolitis und obstruktive Bronchitis. In späteren Stadien wird

eine obliterierende Bronchiolitis, eine massive pulmonale Überblähung mit regionalen

Obstruktionsemphysemen, eine interstitielle Pneumonitis, organisierte pneumonische

Infiltrate und eine diffuse Alveolardestruktion gefunden (KRAEMER 2001). Als

Langzeitfolge entwickelt sich bei den meisten CF-Patienten ein Lungenemphysem. Weitere

Spätkomplikationen sind eine pulmonale Hypertonie mit Ausbildung eines Cor pulmonale

sowie der Pneumothorax und die entzündliche Arrosionsblutung von Bronchialarterien

(HELBICH 2001).

2.6 Pseudomonas aeruginosa und seine Fähigkeit zur

Biofilmbildung

Der Biofilm ist eine Gemeinschaft von Mikroorganismen, die umschlossen von einer

Exopolysaccharidmatrix an eine abiotische oder biotische Oberfläche fest angeheftet ist

(COSTERTON et al. 1995; O'TOOLE et al. 2000). Als komplexe, hoch differenzierte

Gemeinschaft wird der Biofilm in beinahe allen nährstoffreichen Ökosystemen vorgefunden

und ermöglicht es den Bakterien, in hoher Rate ihr genetisches Material zu teilen und

verschiedenste Nischen zu besiedeln (WATNICK u. KOLTER 2000). Es können beinahe alle

Oberflächen wie Glas, Metall, Stein und Plastik bis hin zu eukaryotischem Gewebe in Form

eines Biofilms kolonisiert werden. Für P. aeruginosa z. B. wurde gezeigt, dass der Erreger in

der chronisch infizierten CF-Lunge in Form eines Biofilms persistiert (SINGH et al. 2000).

Damit besitzt der Biofilm eine große medizinische Bedeutung. Des Weiteren stellt der

Biofilm für die Bakterien insbesondere eine Wachstumsform des Schutzes dar, d. h. nicht nur

vor ungünstigen Umweltbedingungen, sondern auch vor biologischen und chemischen

antibakteriellen Wirkstoffen. Denn Bakterienzellen gelten im Biofilm als 500-mal höher

resistent gegen antibakterielle Therapeutika als planktonische Zellen (COSTERTON et al.

1995). So trägt der Biofilm zum großen Teil zur Virulenz eines Erregers bei und Infektionen

mit im Biofilm organisierten Mikroorganismen sind von chronischer oder rekurrierender

Natur (WATNICK u. KOLTER 2000; HENTZER et al. 2001).

12 SCHRIFTTUM

Die Biofilmbildung ist ein biologischer Zyklus, der aus den vier Stufen Initiierung, Reifung,

Erhaltung und Auflösung (Abb. 1) besteht (O'TOOLE et al. 2000) und wird im Folgenden für

P. aeruginosa beschrieben.

Abbildung 1: Modell einer Biofilmentwicklung (O’TOOLE et al. 2000).

Mit dem Erhalt von Umweltsignalen beginnen einzelne planktonische Bakterienzellen mit der

Initiierung der Biofilmentwicklung. Die einzelnen Zellen adhärieren an die Oberfläche und bilden mit

anderen Bakterienzellen Mikrokolonien. Durch weitere Signale kommt es zur Bildung eines reifen

Biofilms. Das Kennzeichen des reifen Biofilms sind pilzartig geformte Mikrokolonien, die von einer

Exopolysaccharidmatrix umgeben sind. Die Bakterienzellen können sich zu jeder Zeit wieder vom

Biofilm lösen und als planktonische Zellen weitere Habitate in Form erneuter Biofilmentwicklung

besiedeln. Damit schließt sich der Zyklus der Biofilmentwicklung.

Mit der Initiierung der Biofilmentwicklung beginnen Bakterien, wenn sie aus der Umwelt

Signale erhalten (O'TOOLE et al. 2000). Die Adhäsion an die Oberfläche bildet dabei

vermutlich den entscheidenden Schritt. Vor der Adhäsion führt P. aeruginosa eine

flagellenabhängige Schwimmbewegung entlang der Oberfläche aus und bildet verteilte

Einzelschichten. Eine so genannte Twitching-Motilität befähigt die Bakterien sich entlang der

Oberfläche zu bewegen, und Zellhaufen oder Mikrokolonien zu formen. Diese Form der

Bewegung wird über Typ IV Pili vermittelt, welche am Bakterium polar lokalisiert sind

13 SCHRIFTTUM

(O'TOOLE u. KOLTER 1998; WALL u. KAISER 1999; O'TOOLE et al. 2000). Es konnte

gezeigt werden, dass P. aeruginosa mit einer defekten Typ IV Pili-Biogenese zwar an eine

abiotische Oberfläche binden kann, jedoch weder zur Twitching-Motilität noch zur Bildung

von Mikrokolonien fähig ist (O'TOOLE u. KOLTER 1998). So vermitteln die Typ IV Pili bei

P. aeruginosa den Übergang von der reversiblen zur irreversiblen Adhäsion (STOODLEY et

al. 2002).

Ist ein fester Halt auf der Oberfläche erfolgt, beginnt P. aeruginosa mit der Bildung von

pilzartig geformten Mikrokolonien. Diese sind von einer extrazellulären Matrix umgeben und

in ein Netzwerk von offenen, mit Flüssigkeit gefüllten Kanäle eingefügt, welche die

Gemeinschaft mit Nährstoffen versorgt (O’TOOLE et al. 2000; STOODLEY et al. 2002). Die

extrazelluläre Matrix besteht aus mehreren Komponenten, wie extrazellulären

Polysacchariden, Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Substanzen (DAVEY u. O’TOOLE

2000).

Der häufig aus der chronisch infizierten CF-Lunge isolierte mukoide Morphotyp von

P. aeruginosa besitzt die Eigenschaft, das extrazelluläre Polysaccharid Alginat exessiv zu

produzieren (HENTZER et al. 2001). Alginat ist ein Polymer aus Mannuron- und

Guluronsäure und seine Produktion ist weit verbreitet unter den Pseudomonaden der

rRNA-Homologiegruppe I (GACESA 1998; VOGT et al. 1999). Es wird vermutet, dass

Alginat diesen mukoiden P. aeruginosa-Phänotyp vor dem heterogenen Habitat der

CF-Lunge schützt und somit das Haupt-Exopolysaccharid im Biofilm bei P. aeruginosa bildet

(WOZNIACK et al. 2003). Studien mit diesem Phänotyp haben gezeigt, dass das algC-Gen in

kurzer Zeit hochreguliert wird, sobald die Zellen an eine abiotische Oberfläche angeheftet

sind. Dieses Gen kodiert ein essenzielles Enzym der Alginat-Synthese und bildet einen

Schlüsselpunkt in der Regulation des Alginat-Stoffwechselweges (DAVIES u. GEESEY

1995). Andere Studien gehen von einer Verbindung zwischen der herunterregulierten

Flagellum-Synthese und der hochregulierten Alginat-Synthese aus, da die mukoiden

P. aeruginosa-Isolate aus der CF-Lunge ihre Motilität verloren haben (GARRET et al. 1999).

Es scheint, dass die Bakterien sich an das immobile Leben im Biofilm anpassen, indem sie die

Flagellen verlieren und die extrazelluläre Polysaccharidproduktion erhöhen (DAVEY u.

O'TOOLE 2000). Für nicht-mukoide P. aeruginosa-Stämme, wie sie in der natürlichen

Umwelt vorkommen, scheint Alginat nicht zur Biofilmbildung erforderlich zu sein

(WOZNIAK et al. 2003).

14 SCHRIFTTUM

Die Existenz im Biofilm erfordert von den Bakterien nicht nur die Fähigkeit,

Informationen aus ihrer Umwelt zu empfangen, zu verarbeiten und auf Umweltveränderungen

zu reagieren, sondern auch die Zelldichte ihrer Population wahrzunehmen und über

Signalmoleküle (so genannte Autoinducer) zu kommunizieren. Dieses Phänomen wird

Quorum Sensing genannt und ermöglicht es den Bakterien, als Gemeinschaft zu agieren

(FUQUA et al. 1996; GRAY 1997). DAVIES et al. (1998) konnten zeigen, dass Quorum

Sensing in der Entwicklung des P. aeruginosa-Biofilms notwendig ist. Eine Mutante, die

nicht mehr die Fähigkeit besitzt den Autoinducer N-(3-Oxododecanoyl)-L-Homoserin-Lakton

zu synthetisieren, bildet nur flache, undifferenzierte Biofilme aus. Außerdem reagierten die

von der Mutante gebildeten Biofilme, anders als beim Wildtyp, sensitiv auf das Biozid

Sodium Dodecyl Sulfat (SDS).

Sind die Nährstoffe im Biofilm und seiner Umgebung verbraucht oder werden sie den Zellen

entzogen, lösen sich einzelne Bakterienzellen wieder vom Biofilm (O'TOOLE et al. 2000).

Als planktonische Zellen sind sie in der Lage, neue Habitate in Form eines Biofilms zu

besiedeln und der Zyklus kann von neuem beginnen.

2.7 Phänotypische Varianten von Pseudomonas aeruginosa bei

Cystischer Fibrose

Die Besonderheit einer Infektion der CF-Lunge mit P. aeruginosa ist, dass klonale Isolate

eine unterschiedliche Koloniemorphologie aufweisen. Dieses Auftreten verschiedener

phänotypischer Varianten bei P. aeruginosa wurde als dissoziatives Verhalten beschrieben

(ZIERDT u. SCHMIDT 1964).

Die größte Beachtung wurde in zahlreichen Studien dem mukoiden Phänotyp von

P. aeruginosa geschenkt. Da er selten bei anderen Infektionen als CF vorgefunden wird,

scheint dieser Phänotyp von P. aeruginosa besondere Selektionsvorteile in der CF-Lunge zu

besitzen (DERETIC 2000). Verursacht wird der Wechsel von der nicht-mukoiden zur

mukoiden Form durch Punktmutationen, die zu einer Inaktivierung des mucA-Gens führen

(MARTIN et al. 1993; GOVAN u. DERETIC 1996; BOUCHER et al. 1997). MucA

funktioniert als ein Negativregulator des alternativen Sigmafaktors algU, der die

15 SCHRIFTTUM

Transkription der Alginatbiosynthese steuert. Ist mucA inaktiviert, wird algU nicht mehr

länger inhibiert. Es folgt eine Überproduktion des Exopolysaccharides Alginat und ein

mukoider Phänotyp entsteht (DERETIC 2000). Dieser charakteristischen exzessiven

Alginatproduktion und -sekretion wird eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der

chronischen Lungeninfektion zugeschrieben. Vermutlich wird mit der Konversion vom

nicht-mukoiden zum mukoiden P. aeruginosa-Phänotyp die chronische Infektionsphase für

die CF-Patienten eingeleitet (KOCH u. HØIBY 1993; LYCZAK et al. 2002). Aufgrund des

häufigen Verlustes von Pili und Flagellen weist dieser Phänotyp keine Motilität mehr auf

(PIER 1998; GARRET et al. 1999). Des Weiteren ist für diese Form der Verlust der

O-Seitenketten ihres Lipopolysaccharides in der äußeren Zellwand charakteristisch. Ein

Wechsel, der das Bakterium hoch empfänglich für die opsionierende und bakteriostatische

Wirkung des Komplementsystems werden lässt (PIER 1998).

Neben dem mukoiden wurden weiterere Morphotypen von P. aeruginosa aus dem

Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten isoliert, unter anderem die in sehr kleinen

Kolonien wachsenden (1-3 mm Durchmesser nach 48 Stunden Inkubation auf Columbia

Blutagar und MacConkeyagar bei 37 °C), so genannten small colony variants (SCVs)

(Abb. 2) (HÄUSSLER et al. 1999a).

WT SCV

Abbildung 2: Wachstum der zwei Morphotypen Wildtyp und SCV des P. aeruginosa-Stammes

20265 auf Agar-Platten.

Koloniemorphologie des Wildtyps (WT) und der klonalen SCV 20265 auf Columbia-Blutagar nach 48

Stunden Inkubation bei 37 °C.

16 SCHRIFTTUM

Langsam wachsende bakterielle Subpopulationen sind seit langem bekannt und wurden bei

einer Reihe von grampositiven und gramnegativen Erregern beschrieben, z. B. für

Staphylococcus aureus (LACEY 1969; BULGER 1969), Salmonella typhimurium

(SASARMAN et al. 1970), Enterobacter aerogenes (RUSTHOVEN et al. 1979), Klebsiella

pneumoniae (MURRAY u. MOELLERING 1982), Escherichia coli (ROGGENKAMP et al.

1998), Burkholderia pseudomallei (HÄUSSLER et al. 1999b) und beim Burkholderia

cepacia-Komplex (HÄUSSLER et al. 2003b). Da die SCVs zunehmend mit persistierenden

und rekurrierenden Infektionen in einen ursächlichen Zusammenhang gebracht werden,

gewinnen sie immer mehr an Bedeutung (HÄUSSLER 2003c). Die Infektion der Lunge mit

P. aeruginosa bei Mukoviszidose ist ein klassisches Beispiel für eine chronisch persistierende

bakterielle Infektion.

In einer Studie von HÄUSSLER et al. (1999a) wurden Isolate von CF-Patienten in einem

Zeitraum von zwei Jahren untersucht. Von 346 CF-Patienten waren 86 mit P. aeruginosa

chronisch infiziert und 33 davon mit SCVs kolonisiert. Nach mehreren Passagen der SCVs in

brain-heart infusion (BHI) Medium konnte ein schnell wachsender Phänotyp mit großen

auslaufenden Kolonien isoliert werden, so genannte Revertanten (REV). Mit einer

elektronenmikroskopischen Untersuchung konnte kein signifikanter Unterschied zwischen

SCVs und Revertanten in Bezug auf Zellgröße oder Morphologie festgestellt werden.

Allerdings wiesen die Einzelkolonien der SCVs nach 48 Stunden Inkubation 2.5 bis 16fach

weniger Bakterien auf als die Einzelkolonien der Revertanten, welches ein Zeichen für ein

langsameres Wachstum der SCVs ist. SCVs wurden häufiger aus den CF-Patienten isoliert,

die täglich eine inhalative Therapie mit dem Antibiotikum Tobramycin oder Colistin erhalten

haben. Außerdem waren Träger von SCVs im Durchschnitt stärker in ihrer Lungenfunktion

beeinträchtigt. Untersuchungen mit Aminoglykosiden, Quinolonen, Colistin und ß-Lactam-

Antibiotika in Bezug auf die minimale Hemmkonzentration (MHK) zeigten, dass die SCVs

für ihre Hemmung eine 2- bis 8-fach höhere Antibiotikakonzentration benötigten als die

Revertanten (HÄUSSLER et al. 1999a).

Die SCVs von Staphylococcus aureus sind die am besten untersuchten langsam

wachsenden bakteriellen Subpopulationen. Neben dem langsamen Wachstum zeigen die

SCVs von S. aureus ebenso wie die SCVs von P. aeruginosa eine erhöhte Resistenz

gegenüber Antibiotika und zusätzlich die Fähigkeit zur Persistenz in Endothelzellen

(BALWIT et al. 1994). Die Ursache für diesen SCV-Morphotyp scheint ein Auxotrophismus

17 SCHRIFTTUM

zu sein, da exogenes Hämin oder Menadion den Wildphänotyp wieder herstellen konnte

(BALWIT et al. 1994; PROCTOR et al. 1995). Die SCVs von P. aeruginosa scheinen

allerdings keine auxotrophen Mutanten zu sein. Denn weder eine Supplementation mit

Hämin, Menadion oder Aminosäuren führte zu einem Phänotypwechsel (HÄUSSLER et al.

1999a).

In den nachfolgenden Untersuchungen von HÄUSSLER et al. (2003a) konnte eine

autoaggregative und hyperpilierte Subgruppe von P. aeruginosa SCVs aus dem

Respirationstrakt von CF-Patienten identifiziert werden. Es scheint, als werden sie in der

einzigartigen Umwelt der CF-Lunge selektioniert. Diese Morphotypen zeigten im Gegensatz

zum klonalen Wildtyp ein autoaggregatives Wachstumsverhalten in Flüssigkultur sowie eine

erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung und Twitching-Motilität. Elektronenmikroskopische

Aufnahmen dieser hoch adhärenten SCVs im Vergleich zum klonalen Wildtyp und der

Revertante zeigten eine vermehrte Expression von Pili. Während bei den Wildtypen keine

oder nur sehr wenige Pili vorgefunden wurden, wiesen die Revertanten eine noch höhere

Pili-Expression auf als die SCVs. Mit dem Northern Blot konnte eine erhöhte Expression des

pilA-Gens bei der SCV und der Revertante des P. aeruginosa Stammes 20265 festgestellt

werden. Das pilA-Gen kodiert die strukturelle Untereinheit der Typ IV Pili. Zusätzlich zeigten

die SCVs ihre höhere Fitness und vermutlich einen selektiven Vorteil in der späten

stationären Phase des Wachstums in Flüssigkultur, während der Wildtyp und die Revertante

in der exponentiellen Phase dominierten. HÄUSSLER et al. (2003a) vermuten, dass das

Wachstum der SCVs durch begrenzte Nährstoffbedingungen in der CF-Lunge begünstigt

wird.

RAINEY u. TRAVISANO (1998) konnten mit in vitro Studien das Auftreten phänotypischer

Varianten in einer heterogenen Umwelt für P. fluorescens belegen. Dabei stellten die Autoren

Mutation und Selektion als Ursache für die Entstehung der verschiedenen Phänotypen in den

Vordergrund. So brachte ein einzelner Genotyp von P. fluorescens in einer heterogenen

Umwelt verschiedene und morphologisch eindeutig voneinander getrennte Phänotypen

hervor. Es entstand eine große Vielfalt, die allein durch Selektion aufrecht erhalten wird und

die bakterielle Population befähigt, Nischen zu besetzen.

18 SCHRIFTTUM

Untersuchungen bei P. aeruginosa von OLIVER et al. (2000) konnten die Studien von

RAINEY u. TRAVISANO (1998) unterstützen. Mutation und Selektion scheinen als

treibende Kräfte für die Etablierung von so genannten Nischenspezialisten in der chronisch

infizierten CF-Lunge verantwortlich zu sein und so eine Adaptation an die Bedingungen in

diesem besonderen Habitat zu ermöglichen. Denn in 36% der untersuchten Lungen von

CF-Patienten wurden so genannte Hypermutatoren von P. aeruginosa gefunden, die für Jahre

in den meisten Patienten persistieren. Diese Hypermutatoren zeigten eine Deletion in der

mutS-Genregion.

Während als Ursache für den mukoiden Phänotyp von P. aeruginosa Punktmutationen

gefunden wurden, wurde für die Entstehung des SCV-Phänotyps ein Phasenvariations-

mechanismus vermutet. Phasenvariationen sind Ereignisse, die über Umwelteinflüsse

reguliert werden (HENDERSON et al. 1999). Ein Beispiel für eine Phasenvariation ist die

jeweilige Expression von zwei möglichen Flagellintypen: H1 oder H2 bei Salmonella

typhimurium. In einer Zelle wird immer nur ein Flagellintyp exprimiert. Es entsteht eine

Phasenvariation, die in diesem Fall durch eine Inversion der DNA verursacht wird (VON

BERG 2001). Weitere Strukturen bei gramnegativen Bakterien, deren Expression durch eine

Phasenvariation reguliert wird, sind z. B. Fimbrien, Außenmembranproteine und

Lipopolysaccharide (HENDERSON et al. 1999). Somit tragen Phasenvariationen bei

pathogenen Bakterien zur Adhärenz und Virulenz bei.

DÉZIEL et al. (2001) konnten aus dem Biofilm des P. aeruginosa Stammes 57RP einen

hyperpilierten und hoch adhärenten SCV-Phänotyp in vitro isolieren. Interessanterweise

zeigten die 57RP SCVs trotz einer Typ IV Hyperpilierung eine verminderte Twitching-

Motilität. Zudem waren die flagellenabhängigen Schwimm- und Schwärmbewegungen sowie

die Chemotaxis beeinträchtigt. Die 57RP SCVs wiesen eine erhöhte Fähigkeit zur

Biofilmbildung auf, die mit einer starken Adhärenz zu abiotischen Oberflächen, erhöhter

Hydrophobizität und Autoaggregation einherging. Die Autoren vermuten, dass das

Vorkommen dieser Varianten in der ökologischen Nische des Biofilms durch einen

Phasenvariationsmechanismus reguliert wird.

Beim Phänotypwechsel von einer antibiotikaresistenten und autoaggregativen rauen SCV

des P. aeruginosa-Stammes PA14 zur Wildtyp-Revertante wurde ebenfalls ein Phasen-

19 SCHRIFTTUM

variationsmechanismus vermutet (DRENKARD u. AUSUBEL 2002). Die SCVs entstanden,

indem der Wildtyp von PA14 auf Kanamycin-haltigen LB-Platten kultiviert wurde. Auch

diese SCVs besaßen im Gegensatz zum Wildtyp eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung.

Zudem wurden Resistenzen gegen Antibiotika, wie Amikacin, Carbenicillin, Gentamicin,

Tobramycin und Tetrazyklin festgestellt. Dies führte zu der Vermutung, dass die erhöhte

Fähigkeit zur Biofilmbildung und die Antibiotikaresistenz der PA14 SCVs koreguliert

werden. Ohne die Zugabe von Antibiotikum waren diese SCVs allerdings nicht stabil und

revertierten zu großen, glatten Kolonien. In dieser Studie wurde das Regulatorgen pvrR

identifiziert, welches für den phänotypischen Variant-Regulator (PvrR) kodiert. Die Autoren

vermuten, dass dieses Protein den phänotypischen Switch über weitere Faktoren reguliert.

Eine Überexpression des pvrR-Gens verlieh der rauen SCV wieder die Eigenschaften des

Wildtyps. Jedoch wurde durch ein Knockout des pvrR-Gens kein phänotypischer Switch vom

Wildtyp zur rauen SCV erreicht. Weitere Untersuchungen konnten das pvrR-Gen in der

Mehrzahl der getesteten CF- und Klinikisolate sowie in Laborstämmen von P. aeruginosa

nachweisen.

2.8 Zielsetzung der Arbeit

Thema der Arbeit ist die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die zu dem Phänotyp der

so genannten small colony variants (SCVs) bei P. aeruginosa in der chronisch infizierten

CF-Lunge führen. Für P. fluorescens konnten in vitro Studien das Auftreten phänotypischer

Varianten in einer heterogenen Umwelt belegen. Es wurde bewiesen, dass diese

Differenzierung durch Mutation entsteht und durch natürliche Selektion aufrecht erhalten

wird (RAINEY u. TRAVISANO 1998). Vor diesem Hintergrund entstand die Hypothese,

dass Mutation und natürliche Selektion die treibenden Kräfte für die Entstehung der

phänotypischen Varianten in dem heterologen und sich ständig wechselndem Habitat der

CF-Lunge sind.

Um einzelne Gene zu identifizieren, deren Mutationen zu einem phänotypischen Switch

bei P. aeruginosa führen, wurde eine Transposonmutagenese durchgeführt, für die ein schnell

wachsender Phänotyp (Wildtyp) von P. aeruginosa und seine klonale autoaggregative SCV

verwendet wurden. Bei beiden Morphotypen handelt es sich um Isolate aus der CF-Lunge.

20 MATERIALIEN UND METHODEN

3. Materialien und Methoden

3.1 Materialien

3.1.1 Bakterienstämme

In dieser Arbeit wurden drei Phänotypen des klinischen Stammes 20265 von Pseudomonas

aeruginosa verwendet (Abb. 3). Die small colony variant (SCV) und ihr schnell wachsender

klonaler Wildtyp (WT) wurden aus dem Respirationstrakt (Sputum) eines chronisch

infizierten CF-Patienten, der sich regelmäßig in der Pädiatrischen Pneumologie der MHH

vorgestellt hat, isoliert und im Institut für Medizinische Mikrobiologie und

Krankenhaushygiene der MHH identifiziert. Die schnell wachsende Revertante (REV) wurde

in vitro durch Passagieren in BHI-Medium aus der SCV generiert. In der Pulsfeld-

Gelelektrophorese konnte kein Unterschied der SpeI geschnittenen genomischen DNA

festgestellt werden, was auf den klonalen Ursprung der drei Phänotypen hinweist

(HÄUSSLER et al. 1999a). Die SCV 20265 gehört zu einer Subgruppe von autoaggregativen

und hyperpilierten SCVs, die in der Arbeitsgruppe Steinmetz über Proteom- und

Transkriptomanalysen (WEHMHÖNER et al. 2003; VON GÖTZ et al. 2004) sowie mit einer

Untersuchung auf Biofilmbildung (HÄUSSLER et al. 2003a) sehr gut charakterisiert wurde.

Weitere verwendete klinische Isolate von P. aeruginosa sind die Stämme 10, 13, 32, 65,

8226, 74861 und 75962 mit dem Morphotyp der SCV, isoliert aus dem Respirationstrakt von

CF-Patienten (HÄUSSLER et al. 1999a).


WT SCV REV

Abbildung 3: Wachstum der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des P. aeruginosa-

Stammes 20265 auf Agar-Platten.

Koloniemorphologie des Wildtyps (WT) und der klonalen SCV und Revertante (REV) auf Columbia-

Blutagar nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C.

3.1.2 Medien für die Bakterienanzucht

• Luria Bertani Bouillon (LBB): 1% Bacto-Trypton, 0.5% Bacto-Hefeextrakt, 0.5% NaCl,

pH 7.5

• Luria Bertani (LB)-Agar: LBB mit 1.5% Bacto-Agar

• Columbia-Agar mit 5% Schafblut

• Müller-Hinton-Agar: 30% Rinderinfusion, 1.75% Casaminosäuren, 0.15% Stärke, 1.7%

Agar, pH 7.3

• Vogel-Bonner-Medium: 0.3 mM MgSO4 × 7 H2O, 5 mM Zitronensäure × H2O, 14 mM

H5NNaO4P × 4 H2O, 18 mM K2HPO4 × 3 H2O, 213 mM Zitronensäure

• Twitching-Agar: LBB mit 1% Bitek-Agar

3.1.3 Puffer und Lösungen

• 6 × Farbmarker für DNA-Agarosegele: 0.25% Bromphenolblau, 0.25% Xylencyanol, 40%

Saccharose

• 5 × Laufpuffer für RNA-Agarosegele: 50 mM Na-acetat, 0.1 M Morpholinopropan-

sulfonsäure (MOPS), 5 mM Ethylendiamintetraacetat (EDTA), pH 7.0 mit NaOH

eingestellt


• Probenauftragspuffer für RNA-Agarosegele: 2.2 M 37% Formaldehyd, 10 mM EDTA,

20% Glycerol absolut, 50% Formamid, 50 µg/ml Ethidiumbromid, 0.2% Bromphenolblau

• Puffer A: 10 mM Kaliumphosphatpuffer, 140 mM NaCl, pH 7.4

• 10 × Tris-Borsäure-EDTA (TBE)-Puffer: 890 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan

(Tris), 890 mM H3BO3, 20 mM EDTA, pH 8.0

3.1.4 Molekularbiologische Fertigprodukte

• DIG DNA Labeling and Detection Kit, Roche Diagnostics

• DIG Easy Hyb Granules, Roche Molecular Biochemicals

• DNA and Gel Band Purification Kit, Amersham Biosciences

• DNeasy Tissue Kit, Qiagen

• Plasmid Midi Kit, Qiagen

• Qiaprep Spin Miniprep Kit, Qiagen

• RNAprotect Bacteria Reagent, Qiagen

• RNeasy Mini Kit, Qiagen

• Ultrapure dNTP Set, Amersham Biosciences

3.1.5 Enzyme und Molekulargewichtsstandards

• ApaI, T4-DNA-Ligase, HindIII, NlaIII, NsiI, PvuII, SacI, XbaI,

New England Biolabs

• Thermus aquaticus (Taq) Polymerase, Sigma

• EZ::TN Transposase, Epicentre

• Phosphatase, alkaline (AP), Roche Diagnostics

• RNase A, Qiagen

• 1 kb DNA-Leiter, RNA-Leiter, New England Biolabs

• Digoxigenin (DIG)-markierter DNA-Längenstandard III, DIG-markierter RNA-

Längenstandard III, Roche Diagnostics


3.1.6 Oligonukleotide

Alle Oligonukleotide wurden soweit nicht anders erwähnt von der Firma MWG Biotech im

Auftrag hergestellt.

• Linker 1: (Annealing-Temperatur: 58 °C)

5′-TTT CTG CTC GAA TTC AAG CTT CTA ACG ATG TAC GGG GAC ACA TG-3′

• Linker 2: (Annealing-Temperatur: 58 °C)

5′-TGT CCC CGT ACA TCG TTA GAA CTA CTC GTA CCA TCC ACA T-3′

Modifikation: 5′ Phosphat

• Y-Linker Primer: (Annealing-Temperatur: 58 °C)

5′-CTG CTC GAA TTC AAG CTT CT-3′

• SqFP: (Annealing-Temperatur: 58 °C)

5′-GCC AAC GAC TAC GCA CTA GCC AAC-3′

Epicentre, MWG Biotech

• SqRP: (Annealing-Temperatur: 58 °C)

5′-GAG CCA ATA TGC GAG AAC ACC CGA GAA-3′

Epicentre, MWG Biotech

• SqFP-i: (Annealing-Temperatur: 60 °C)

5′-GTT GGC TAG TGC GTA GTC GTT GGC-3′

• SqRP-i: (Annealing-Temperatur: 60 °C)

5′-TTC TCG GGT GTT CTC GCA TAT TGG CTC-3′

• PA1587FP1XbaI: (Annealing-Temperatur: 64 °C)

5′-ATA TTC TAG AAT GAG CCA GAA ATT CGA CGT GGT AGT GAT TGG-3′

• PA1587RP1HindIII: (Annealing-Temperatur: 64 °C)

5′-TAT AAA GCT TTC AGC GCT TCT TGC GGT TGG CGA T-3′

• PA2128FP: (Annealing-Temperatur: 59 °C)

5′-TGG CGG CAA ACA CTA TCA CAT TCA-3′

• PA2128RP: (Annealing-Temperatur: 59 °C)

5′-GGG TTG CCG CCG ACG CTA TC-3′


3.1.7 Vektoren

• EZ::TN pMOD-3<R6Kγori/MCS> Transposon Construction Vector (Gentamicin-

Resistenz (GmR) auf dem Transposon), Epicentre

• pBBR1MCS-5 (GmR) (KOVACH et al. 1994; KOVACH et al. 1995)

• pUCP20 (OLSEN et al. 1982; West et al. 1994)

• pED202 (pUCP19::pvrR, 3.5 kb PstI Fragment aus P. aeruginosa PA14)

von Frederick M. Ausubel der Arbeitsgruppe Häußler (Material, Transfer, Agreement

liegt vor) zur Verfügung gestellt (DRENKARD u. AUSUBEL 2002)

3.2 Methoden

3.2.1 Anzucht von Bakterien

Die Anzucht der verwendeten Bakterienstämme wurde soweit nicht anders angegeben, auf

Columbia-Blutagarplatten und LB-Platten gegebenfalls mit Antibiotikazusätzen bei 37 °C

durchgeführt.

3.2.2 Einfrieren und Entsorgen von Bakterien

Bakterien wurden als Suspension in steriler LBB mit 10% Glyzerin bei –80 °C eingefroren.

Nicht mehr benötigte Platten, Suspensionen sowie verunreinigtes Gebrauchsmaterial wurde

grundsätzlich autoklaviert.

3.2.3 Isolierung genomischer DNA aus Pseudomonas aeruginosa

Die Präparation genomischer DNA wurde nach Anweisung des Herstellers (Qiagen, DNeasy

Tissue Handbook) durchgeführt. Als Ausgangsmaterial wurde eine Bakterien-ÜN-Kultur in

einem Volumen von 5 ml in LBB verwendet. Modifiziert wurden die Anweisungen des

Herstellers insoweit, dass zwischen dem ersten Zentrifugationsschritt und der Zugabe des


Lysispuffer ATL ein zusätzlicher Arbeitsschritt für die Entfernung des von P. aeruginosa

produzierten Exopolysaccharides Alginat vorgenommen wurde, um den ungehinderten

Durchfluss durch die Säule zu gewährleisten. Dazu wurden die Bakterien nach der ersten

Zentrifugation in 500 µl Wasser bidest. überführt und so lange resuspendiert, bis eine

homogene Bakteriensuspension entsteht. Nach einer Zentrifugation von 1 min bei 14926 x g

konnte der Überstand abgenommen und verworfen werden. Dieser Schritt wurde mindestens

dreimal wiederholt, bis kein Alginat auf dem Bakterienpellet mehr sichtbar ist. Anschließend

konnte der Lysispuffer ATL zugegeben werden.

3.2.4 Isolierung von Gesamt-RNA

Sämtliche Lösungen wurden mit autoklavierten Diethylpyrocarbonat (DEPC)-behandeltem

Wasser bidest. in ebenfalls autoklavierten Glasbehältnissen angesetzt und aufbewahrt.

Hitzelabile Geräte, wie die Pufferkammer und Metallgerätschaften wurden in absolutem

Ethanol getaucht oder gespült. Genauso wurde mit der Gelkammer verfahren.

Für die Isolierung der Gesamt-RNA aus den Bakterien wurde als Ausgangsmaterial eine 5 ml

Vorkultur auf eine OD600 von 0.1 in LBB eingestellt und bei 37 °C unter Schütteln über Nacht

(ÜN) inkubiert. Die Bakterienzellen wurden anschließend bei einer OD600 von 0.8 in einem

Volumen von 1.5 bis 2 ml geerntet und nach Anweisung des Herstellers (Qiagen, RNeasy

Mini Handbook und RNAprotect Bacteria Reagent Handbook) präpariert. Die RNA wurde bei

–80 °C aufbewahrt.

3.2.5 Plasmidpräparationen

a) Midi-Plasmidpräparation: Die Midi-Plasmidpräparation wurde nach Anweisung des

Herstellers (Qiagen, Plasmid Purification Handbook) mit Qiagen-tip 100 durchgeführt.

Als Ausgangsmaterial wurde eine LBB ÜN-Kultur von 100 ml verwendet.

b) Mini-Plasmidpräparation: Die Mini-Plamidpräparation wurde nach Anweisung des

Herstellers (Qiagen, Qiaprep Miniprep Handbook) durchgeführt. Dazu wurden 5 ml einer

LBB ÜN-Kultur als Ausgangsmaterial verwendet.


c) Quick & Dirty-Plasmidpräparation: 1.5 ml einer 4 ml ÜN-Kultur wurde für 1 min bei

14926 x g zentrifugiert und das Pellet in 100 µl Puffer P1 (Qiagen) resuspendiert. Nach

Zugabe von jeweils 100 µl Puffer P2 (Qiagen) und Puffer P3 (Qiagen) wurde erneut für 4

min bei 14926 x g zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde in ein neues Gefäß

überführt und mit 250 µl Isopropanol 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 7 min

Zentrifugation (14926 x g) wurde die DNA mit 500 µl 70%igem Ethanol gewaschen

(Zentrifugation: 4 min bei 14926 x g), getrocknet und in 20 µl Ampuwa unter Schütteln

für 1-2 Stunden gelöst.

3.2.6 Elektrophoretische Auftrennung von DNA

Die elektrophoretische Auftrennung von DNA zu analytischen Zwecken erfolgte in 1%igen

Agarosegelen in 1 × TBE-Puffer bei einer Spannung von 80-120 Volt. Vor dem Auftragen

wurde die DNA mit einem Sechstel des Gesamtvolumens glyzerinhaltigen Laufpuffers

versetzt. Nach elektrophoretischer Auftrennung wurden die Agarosegele für 10-15 min in

einer Ethidiumbromidlösung (2 mg/l) inkubiert, um die DNA unter ultraviolettes (UV)-Licht

sichtbar machen zu können. Die Größe von DNA-Fragmenten wurde mit einem

Größenstandard von 500 bis 104 Basenpaaren ermittelt.

3.2.7 Elektrophoretische Auftrennung von RNA

Die elektrophoretische Auftrennung der Gesamt-RNA erfolgte in 1%igen Agarosegelen in 1 ×

Laufpuffer und 0.5 M 37% Formaldehydlösung, welches beides erst nach dem Aufkochen

und anschließendem Abkühlen auf 60 °C im Wasserbad der Agarose zugegeben wurde, bei

einer Spannung von 120 Volt. Vor dem Auftragen wurde der Gesamt-RNA ein

Probenauftragspuffer in einem Verhältnis von 1:2 zugesetzt und zur Denaturierung für

10-15 min bei 65 °C aufgekocht und auf Eis abgekühlt. Ebenso wurde mit dem

RNA-Längensstandard und dem DIG-markierten RNA-Längenstandard verfahren. Die

Auftrennung erfolgte aufgrund des toxischen Formaldehyds unter einem Abzug. Durch die im

Probenauftragspuffer enthaltene Ethidiumbromidlösung (50 µg/ml) wurde die RNA sofort

nach der Auftrennung unter UV-Licht sichtbar gemacht.


3.2.8 Reinigung von Nukleinsäuren

Die Reinigung von Nukleinsäuren wurde nach Anweisung des Herstellers (Amersham

Biosciences) mit dem PCR DNA and Gel Band Purification Kit durchgeführt.

3.2.9 Restriktionsspaltung von Nukleinsäuren

DNA wurde mit Restriktionsenzymen in einem Volumen von 10-50 µl in dem vom Hersteller

mitgelieferten Puffer für 1 bis 2 Stunden (kurze DNA-Fragmente) oder ÜN (genomische

DNA) bei der empfohlenen Temperatur verdaut. Die Enzymtätigkeit wurde je nach

Anwendung durch hohe Temperatureinwirkung oder Aufreinigung (3.2.8) abgestoppt. Die

Vollständigkeit des Verdaus wurde durch Agarose-Gelelektrophorese (3.2.6) überprüft.

Pro µg DNA wurden etwa 2-10 Unit (U) Enzym eingesetzt.

3.2.10 Ligation von Nukleinsäuren

Die Ligation von DNA-Fragmenten wurde in einem Volumen von 20-50 µl mit der T4-DNA-

Ligase in dem vom Hersteller mitgelieferten Puffer über Nacht bei 16 °C im Wasserbad

durchgeführt. Es wurden 100-200 ng DNA mit 400-800 U Enzym umgesetzt.

3.2.11 Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli DH5α-Zellen

100 ml LBB wurden 1:100 mit einer ÜN-Kultur beimpft und bei 37 °C unter Schütteln bis zu

einer OD650 von 0.3 bebrütet. Die Zellen wurden für 15 min auf Eis abgekühlt und

anschließend für 10 min bei 4 °C und 2600 × g zentrifugiert. Nach dreimaligem Waschen mit

10 ml eiskaltem 0.1 M CaCl2 und folgender Zentrifugation (10 min, 800 × g, 4 °C) wurde das

Pellet in 10 ml eiskaltem 0.1 M CaCl2 resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Die

Bakterien wurden ein letztes Mal zentrifugiert (10 min, 800 × g, 4 °C), in 2 ml eiskaltem

CaCl2 aufgenommen, mit 1 ml 60% Glyzerin in H2O versetzt und in Aliquots von 200 µl

zunächst in flüssigem Stickstoff und schließlich bei –80 °C eingefroren.


3.2.12 Transformation von CaCl2-kompetenten E. coli DH5α-Zellen

Ein Aliquot der kompetenten Zellen wurde auf Eis aufgetaut und die zu transformierende

DNA wurde in einer Menge von maximal 100 ng zu den Zellen gegeben. Nach 20 min

Inkubation auf Eis wurde die Mischung einem Hitzepuls von 42 °C für 90 Sekunden im

Wasserbad ausgesetzt. Es folgten weitere 2 min auf Eis, bevor 1 ml LBB zu den Zellen

gegeben wurde. Nach 1 Stunde Inkubationszeit bei 37 °C unter Schütteln wurden die

Bakterien pelletiert und auf LB-Antibiotikaplatten ausplattiert. Die Inkubation erfolgte für 24

Stunden bei 37 °C.

3.2.13 Polymerasekettenreaktion (PCR)

Zur Amplifikation von DNA mithilfe der PCR (SAIKI et al. 1988) wurden als Primer Oligo-

nukleotide (3.1.6) mit einer Annealing-Temperatur zwischen 58 °C und 64 °C eingesetzt und

die Template-DNA mithilfe der Taq-Polymerase vervielfältigt. Der 50 µl Standard-Reaktions-

ansatz hatte folgende Zusammensetzung:

36.0 µl Ampuwa

5.0 µl Desoxynukleotidtriphosphat (dNTPs) (c = 2mM)

5.0 µl 10 × PCR-Puffer

1.0 µl Primer a (c = 100 pmol/µl)

1.0 µl Primer b (c = 100 pmol/µl)

1.0 µl Template-DNA

1.0 µl Taq-Polymerase

Erfolgte die Amplifikation im Thermocycler Landgraf, wurden dem Reaktionsansatz 1-2

Tropfen Mineralöl hinzugegeben.


Die PCR lief unter folgenden Bedingungen ab:

1. initiale Denaturierung 180 s, 95 °C

2. Amplifikation a) Denaturierung 60 s, 95 °C

(30 Zyklen) b) Annealing 60 s, Temperaturen s. 3.1.6

c) Elongation 60 s, 72 °C

3. finale Elongation 300 s, 72 °C

3.2.14 Herstellung einer digoxigeninmarkierten DNA-Sonde

Zur Herstellung einer DIG-markierten DNA-Sonde wurde eine 50 µl PCR-Reaktion (3.2.13)

mit dem ca. 1.3 kb langem Produkt des EZ::TN Transposon aufgereinigt (3.2.8) und nach

elektrophoretischer Kontrolle im Agarosegel nach Anweisung des Herstellers (Roche

Diagnostics) präpariert.

3.2.15 Sequenzierung von Nukleinsäuren

1-5 µg der zu sequenzierenden DNA wurden von GATC Biotech AG im Auftrag sequenziert.

3.2.16 Isolierung des EZ::TN Transposon

Für die Klonierung einer Gentamicin-Resistenz in die multiple cloning site des EZ::TN

Transposon Construction Vectors wurde der Vektor mit dem Restriktionsenzym SacI in

einem Volumen von 10 µl verdaut (3.2.9) und aufgereinigt (3.2.8). Anschließend wurde das

mit Enzym behandelte DNA-Fragment mit einer Gentamicin-Resistenz codierenden DNA

(835 bp) aus dem Plasposon pTnMod-Ogm (AF061920) in einem Volumen von 20 µl ligiert

(3.2.10) und transfomiert (3.2.12).

Die Isolierung des EZ::TN Transposon aus dem EZ::TN Transposon Construction Vector

wurde nach Anweisung des Herstellers (Epicentre) mit dem Restriktionsenzym PvuII in

einem Volumen von 20 µl durchgeführt (3.2.9). Anschließend wurde der Ansatz ohne

Hitzeinaktivierung im Agarosegel auf 2 Geltaschen verteilt aufgetragen und nach der


elektrophoretischen Auftrennung (3.2.6) bei einem Molekulargewicht von 1,276 kb das

EZ::TN Transposon aus dem Agarosegel mit dem Skalpell heraus geschnitten, aufgereinigt

(3.2.8), in Ampuwa aufgenommen und im SpeedVac-Concentrator auf etwa 5-10 µl Volumen

ankonzentriert (100 µg/ml).

3.2.17 Transposonmutagenese

Zur Erhaltung einer Mutantenbank mit dem EZ::TN Transposon wurde eine Transposon-

Reaktionslösung nach Anweisung des Herstellers (Epicentre) erstellt. Dazu wurden 0.25 µl

der EZ::TN Transposon-DNA-Lösung (100µg/ml) mit 0.5 µl EZ::TN Transposase (0.5 U)

und 0.25 µl Glyzerin in dieser Reihenfolge gut vermischt und für 30 min bei Raumtemperatur

inkubiert. Während dieser Inkubationszeit wurde zur Erstellung elektrokompetenter Zellen

das Exopolysaccharid Alginat von P. aeruginosa, welches die Effizienz der Elektroporation

deutlich senkt, entfernt. Dazu wurden die Bakterienzellen auf LB-Agar ÜN jeweils bei 37 °C

und 42 °C kultiviert. Anschließend wurde das gesamte Bakterienmaterial von den LB-Platten,

ohne dabei den Agar zu beschädigen, mit einer Öse abgenommen, in Wasser bidest.

resuspendiert und zentrifugiert (3.2.3). Nach der Entfernung des Alginats wurden die

Bakterienzellen mit einem Endvolumen von 40 µl in Wasser bidest. aufgenommen, mit dem

1 µl der Transposon-Reaktionslösung vermischt und für 2-3 min auf Eis inkubiert. Nach

Überführen in eine trockene und auf Eis gekühlte Elektroporationsküvette wurde die

Spannung mit den Einstellungen 2.5 kV und 200 Ω am Elektroporationsgerät angelegt. Die

Bakterien wurden in 1 ml auf Eis vorgekühlter LBB aufgenommen und 1 Stunde bei 37 °C

unter Schütteln inkubiert. Schließlich wurden die Bakterien auf Antibiotikaplatten (SCV

20265: 40 µg/ml Gentamicin, WT 20265: 200 µg/ml) ausplattiert und bei 37 °C für 48

Stunden inkubiert. Zum Nachweis des EZ::TN Transposons in einer Transposonmutante

wurde eine PCR (3.2.13) mit Oligonukleotiden (3.1.6) durchgeführt, die von den Sequenzier-

Primern des Herstellers (Epicentre) abgeleitet wurden und das EZ::TN Transposon

amplifizieren. Als Template diente die genomische DNA einer Transposonmutante.


3.2.18 Untersuchung der Transposonmutanten auf Autoaggregation

Das Vermögen von Autoaggregation der einzelnen Transposonmutanten wurde in flüssigem

Vogel-Bonner-Medium, modifiziert nach VOGEL u. BONNER (1956) untersucht. Die

Mutanten wurden nach 24 bis 48 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C auf Blutagar mit einem

sterilen Wattetupfer entnommen und in 10 ml Vogel-Bonner-Medium überführt. Nach 24 bis

48 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C im Inkubationsschüttler erfolgte eine visuelle

Überprüfung auf Autoaggregation.

3.2.19 Untersuchung der Transposonmutanten auf Motilität

Zur Untersuchung der einzelnen Transposonmutanten auf Twitching-Motilität wurden die

Mutanten nach 24 bis 48 Stunden bei 37 °C auf Blutagar mit einem sterilen Zahnstocher

entnommen und durch den Twitching-Agar bis auf dem Petrischalenboden verbracht

(DÉZIEL et al. 2001; HÄUSSLER et al. 2003a). Die Ausdehnung der Bakterien zwischen

Agar und Boden der Petrischale wurde im Vergleich mit WT, SCV und REV 20265 durch

Messung des Durchmessers nach 48 Stunden Inkubationszeit bei 37 °C ermittelt.

3.2.20 Southern Blot

Vor dem Transfer auf eine Nylonmembran wurde die genomische DNA jeweils mit den

Restriktionsenzymen ApaI und NsiI in einem Volumen von 20 µl verdaut (3.2.9) und

elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.6). Zur Depurinisierung von DNA-Molekülen über einer

Länge von 5 kb wurde das Gel für 20 min in 0.25 M HCl inkubiert und anschließend

nacheinander je zweimal 30 min mit 0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl denaturiert und mit 1 M Tris-

HCl, 3 M NaCl, pH 7.0 neutralisiert. Die Übertragung der DNA auf die Nylonmembran

erfolgte unter Ausnutzung der Kapillarkräfte mit 10 × Natriumchlorid/ Trinatrium-Citrat

(SSC) als Transferpuffer ÜN in einer Transferpyramide mit einer Pufferkammer. Für die

Transferpyramide wurde von unten nach oben in einer Sandwich-Anordnung zwei Lagen

puffergetränktes Filterpapier, Gel, Membran, zwei Lagen Filterpapier sowie ein Stapel

Papierhandtücher fest übereinander gelegt und schließlich mit einem Gewicht beschwert. Die

Geltaschen wurden auf der noch feuchten Nylonmembran markiert und die DNA durch

UV-cross-linking kovalent an die Membran gebunden. Als Vorbereitung für die


Hybridisierung wurde die Membran 30 min mit Hybridisierungspuffer bei 42 °C

prähybridisiert. Zu 5-10 ml frischer Hybridisierungslösung wurde 5 µl Sonde (3.2.14)

gegeben, die zuvor durch Aufkochen für 5 min und anschließendes rasches Abkühlen auf Eis

denaturiert wurde. Die Hybridisierung erfolgte bei 42 °C ÜN im Hybridisierungsofen. Am

nächsten Tag wurde die Membran 2 × 5 min in 2 × SSC, 0.1% Natriumdodecylsulfat (SDS)

bei Raumtemperatur und weitere 2 × 15 min in 0.1 × SSC, 0.1% SDS bei 68 °C im

Hybridisierungsofen gewaschen. Die Hybridisierungsereignisse wurden durch ein Antikörper-

Konjugat und dem Chemilumineszenzsubstrat CSPD nachgewiesen. Das CSPD ist ein

Substrat, welches durch die am Antikörper gebundene alkalische Phosphatase

dephosphoryliert wird und beim anschließenden Zerfall ein Lichtsignal produziert. Dieses

Licht wird auf einem Röntgenfilm nachgewiesen. Folgende Schritte sind für die Detektion bei

Raumtemperatur notwendig:

• 5 min waschen in Waschpuffer (Maleinsäurepuffer mit 0.3 % Tween-20)

• 30 min inkubieren in 1 × Blocking Reagenz (10 × Blocking Reagenz 1:10 verdünnt in

Maleinsäurepuffer)

• 30 min inkubieren in 1 × Blocking Reagenz mit 1:10000 verdünntem anti-DIG-AP-

Konjugat

• 2 × 15 min waschen in Waschpuffer

• 2-5 min äquilibrieren in Detektionspuffer

• 5 min CSPD 1:100 verdünnt in Detektionspuffer

• Einschweißen der Membran in Plastikfolie und Inkubation für 15 min bei 37 °C

• Exposition eines Röntgenfilms für 5 min bis 1 Stunde je nach Alter des CSPD

20 × SSC Maleinsäurepuffer 10 × Blocking Reagenz

3 M NaCl 0.1 M Maleinsäure Maleinsäurepuffer

0.3 M NaCitrat 0.15 M NaCl 10 % Blocking Reagenz

pH 7.0 pH 7.5


Detektionspuffer

0.1 M Tris-HCl

0.1 M NaCl

pH 9.5

3.2.21 Northern Blot

Die zu analysierende Gesamt-RNA wurde in einer Menge von etwa 9-11 µg in einem

denaturierenden Formaldehyd-Agarose-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (3.2.7) und unter

Ausnutzung von Kapillarkräften mit 20 × SSC (3.2.20) als Transferpuffer für mindestens 20

Stunden in einer Transferpyramide (3.2.20) auf eine positiv geladene Nylonmembran

übertragen. Das zu blottende Gel wurde vor dem Transfer in 20 × SSC für 2 × 15 min unter

Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, um das Formaldehyd zu entfernen. Die

Pufferkammer wurde vor dem Aufbau der Transferpyramide mit absolutem Ethanol gespült.

Nach dem Blotvorgang wurde die Membran markiert, die RNA auf ihr kovalent fixiert und

schließlich eine RNA-DNA-Hybridisierung (3.2.20) durchgeführt. Das PCR-Produkt (3.2.13)

für die DIG-markierte DNA-Sonde (3.2.14) wurde mit spezifischen Primern (3.1.6)

amplifiziert. Um unspezifisch gebundene Sonde von der Membran zu entfernen, wurde die

Membran 5 min bei Raumtemperatur mit 6 × SSC, 0.3% SDS, 20 min bei 42 °C mit 2 × SSC,

0.3% SDS und 20 min bei 42 °C mit 0.2 × SSC, 0.3% SDS gewaschen. Die

Hybridisierungsereignisse wurden mit der Verbindung CDP-Star nachgewiesen.

• 5 min waschen in Puffer 1

• 30 min inkubieren in Puffer 1 mit 0.5% Blocking Reagenz

• 30 min inkubieren mit 1:10000 verdünntem anti-DIG-AP-Konjugat in Puffer 1 mit 0.5%

Blocking Reagenz

• 3 × 15 min waschen in Puffer 1

• 2 min äquilibrieren in Puffer 3 (Puffer aufgrund Präzipitat 2 × filtrieren)

• 5 min CDP-Star 1:500 verdünnt in Puffer 3

Die Membran wurde wiederum in eine Plastikfolie eingeschweißt und eine Exposition für 15

min bis 1 Stunde durchgeführt.


Puffer 1 Puffer 3

3 M NaCl 0.1 M NaCl

0.1 M Tris 0.1 M Tris

0.3 % Tween-20 0.05 M MgCl2

pH 8.0 pH 9.5

3.2.22 Identifizierung der Transposon flankierenden DNA-Sequenz mittels

eines Y-Linker

Um die Transposon flankierende DNA-Sequenz effizient zu amplifizieren (KWON u. RICKE

2000) und zu sequenzieren, wurde als erster Schritt die genomische DNA einer Transposon-

mutante mit dem Restriktionsenzym NlaIII in einem Volumen von 50 µl ÜN verdaut (3.2.9)

und anschließend bei 65 °C für 20 min inaktiviert. Es wurden etwa 1-5 µg DNA mit 5 U

Enzym umgesetzt. Durch das Restriktionsenzym NlaIII entsteht an den Schnittstellen ein aus

den 4 bp CATG bestehender Überhang. Zur Herstellung des Y-Linker, der als bekannte

DNA-Sequenz an die unbekannte Transposon flankierende DNA-Sequenz ligiert wird,

wurden 9 µl Linker 2 (350 ng/µl) und 9 µl Linker 1 (350 ng/µl) (3.1.6) in einem Volumen von

29 µl bei 95 °C für 4 min erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Der Y-Linker

besitzt am 3‘-Ende einen 4 bp großen Überhang, der komplementär zu den durch NlaIII

erzeugten Enden ist. Am 5‘-Ende des Y-Linkers ist die Sequenz über einer Länge von 19 bp

nicht zueinander komplementär und mit dieser Region ist die Sequenz des Y-Linker identisch.

Somit kann er nicht direkt an den Linker binden. Die Ligation der mit NlaIII behandelten

Fragmente genomischer DNA mit dem Y-Linker wurde in einem Volumen von 20 µl bei

Raumtemperatur ÜN durchgeführt (3.2.10). Dabei verbinden sich die Enden der DNA-

Fragmente mit denen am 3‘-Ende des Y-Linkers. Es wurden 5 µl fragmentierte genomische

DNA und 5 µl des Y-Linker mit 40 U Enzym umgesetzt. Der Ligationsansatz wurde

anschließend auf 200 µl mit Ampuwa aufgefüllt, bei 65 °C für 12 min inaktiviert und für

folgende Amplifizierungen bei –20 °C aufbewahrt.

Die PCR zur Amplifizierung der unbekannten DNA-Sequenz zwischen dem Y-Linker und

Transposon wurde mit den zur Sequenzierung bestimmten Primer SqFP oder SqRP (3.1.6) in

einem Volumen von 50 µl durchgeführt (Abb. 4).


Reaktionsansatz: 34.8 µl Ampuwa

3.0 µl dNTPs (c = 2 mM)

5.0 µl 10 × PCR-Puffer

1.0 µl Primer Y-Linker (c = 100 pmol/µl)

1.0 µl Primer SqFP/ SqRP (c = 100 pmol/µl)

5.0 µl Ligationsansatz

0.2 µl Taq Polymerase (1 U)

Die PCR lief unter den Bedingungen wie unter (3.2.13) beschrieben ab.

1.5 kb__

1.0 kb__

0.5 kb__

Abbildung 4: Agarosegel mit aufgereinigten PCR-Produkten.

In dieser Abbildung ist die elektrophoretische Trennung aufgereinigter PCR-Produkte von einigen

Transposonmutanten für die Squenzierung und Identifzierung der Transposon flankierenden

DNA-Sequenz mittels eines Y-Linkers im Agarosegel dargestellt. Als Marker wurde ein

Größenstandard mit DNA-Fragmenten von 0.5 bis 10 kb aufgetragen.

DNA-Lei

ter

Negat

iv-K

ontro

lle

SCV-Tn5

-M R

6

SCV-Tn5

-M R

7

SCV-Tn5

-M 1

C

SCV-Tn5

-M 1

D

SCV-Tn5

-M 1

L

SCV-Tn5

-M 2

E

SCV-Tn5

-M 2

L

SCV-Tn5

-M 3

D

SCV-Tn5

-M 3

E

SCV-Tn5

-M 3

F


3.2.23 Identifizierung der Transposoninsertion

Zur Identifizierung des zerstörten Gens wurde zuerst die NlaIII-Schnittstelle, die sich

zwischen dem Transposon und dem Y-Linker genau einmal befinden sollte, mithilfe des

Computerprogramms Clone Manager 6 (Version 6.00, Scientific & Educational Software) auf

ihre Position innerhalb der sequenzierten DNA überprüft. Anschließend wurde die Sequenz

mit dem Pseudomonas Genom-Projekt (http://www.pseudomonas.com) auf der Aminosäure-

und Nukleotidebene mit den Sequenzen des Pseudomonas aeruginosa-Stammes PAO1

verglichen. Blieb die Datenbanksuche auf diese Weise erfolglos, wurde eine weitere Analyse

des Gens mit GenomeNet, Blast (http://www.genome.jp) durchgeführt.

3.2.24 Komplementation der Transposonmutante 25/C1

Für die Komplementation wurde das lpdG-Gen (PA1587) des WT 20265 mittels PCR mit

spezifischen Primern (3.1.6), auf den sich Restriktionsschnittstellen für HindIII und XbaI

befinden, amplifiziert (3.2.13) und aufgereinigt (3.2.8). Als Template diente die genomische

DNA des WT 20265. Das PCR-Produkt und der Klonierungsvektor pUCP20 mit einer

Ampicillin-Resistenz wurden jeweils mit den genannten Restriktionsenzymen in einem

Volumen von 50 µl verdaut (3.2.9). Nach der Reinigung (3.2.8) wurde der geschnittene

Vektor mit 4 U alkaliner Phosphatase in einem Volumen von 50 µl für 1 Stunde bei 37 °C im

Wasserbad umgesetzt, um die Phosphatreste am Vektor zu entfernen und eine Ligation mit

sich selbst zu verhindern. Auch hier erfolgte anschließend eine Aufreinigung. Die folgende

Ligation wurde in einem Volumen von 50 µl durchgeführt (3.2.10). 10 µl des aufgereinigten

Ligationsansatzes wurde darauf folgend in E. coli DH5α-Zellen transformiert (3.2.12). Das

Plasmid der auf Antibiotikaplatten gewachsenen Transformanten wurde präpariert (3.2.5b)

und zur Kontrolle erneut mit XbaI und HindIII geschnitten (3.2.9). Das erfolgreich in den

Vektor pUCP20 klonierte Gen wurde in die Transposonmutante 25/C1 elektroporiert (3.2.17)

und auf LB-Agar mit 300 µg/ml Carbenicillin ausplattiert. Nach 48 Stunden Inkubationszeit

bei 37 °C wurde die komplementierte Mutante zur Überprüfung des Phänotyps und

Koloniewachstums auf Blutagar mit entsprechendem Antibiotikum ausgestrichen und zur

eindeutigen Identifizierung 48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Als Kontrolle wurde der Vektor

pUCP20 ohne lpdG-Gen in die 25/C1 transformiert.

http://www.pseudomonas.com/

http://www.genome.jp/


3.2.25 Transformation des pvrR-Gens in die Transposonmutante 25/C1

Zur in trans Expression des von DRENKARD u. AUSUBEL (2002) beschriebenen Phänotyp-

Variant-Regulator (pvrR) in der Transposonmutante 25/C1 wurde das pvrR-Gen auf dem

Vektor pED202 mit einer Ampicllin-Resistenz jeweils in die Bakterienzellen elektroporiert

(3.2.17) und auf LB-Agar mit 300 µg/ml Carbenicillin ausplattiert. Nach 72 Stunden

Inkubationszeit bei 37 °C wurde die 25/C1 zur Überprüfung des Phänotyps und

Koloniewachstums auf Blutagar mit entsprechendem Antibiotikum ausgestrichen und für 48

Stunden bei 37 °C inkubiert. Als Kontrolle wurde der Vektor pUCP20 ohne dem pvrR-Gen

mit demselben Verfahren in die 25/C1 transformiert.

3.2.26 Elektronenmikroskopische Darstellung von Fimbrienstrukturen und

Flagellen

Zur elektronenmikroskopischen Untersuchung auf Fimbrienstrukturen und Flagellen durch M.

Rhode in der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung (GBF) in Braunschweig

durchgeführt, wurden klinische CF-Isolate (3.1.1) mit dem Morphotyp der autoaggregativen

SCV (3.2.18) sowie sequenzierte Transposonmutanten aus der Transposon-Bank des WT

20265 verwendet. Für die Untersuchung wurden die Bakterien auf Twitching-Agarplatten für

3 Tage bei 28 °C inkubiert (3.2.19). Die sich in der Schnittstelle zwischen Agar und

Petrischalenboden befindlichen Bakterien wurden für 1 min in TE-Puffer (10mM Tris-HCl,

2mM EDTA, pH 6.9) resuspendiert und auf ein mit Kohlenstoff beschichtetes Formvar

Kupfergrid (Maschenweite: 300) in Form eines Tropfens verbracht. Anschließend wurde das

Grid mit TE-Puffer gespült und mit einer 2%igen Uranylacetat-Lösung (pH 4.5) versehen.

Die Proben wurden mit einem Zeiss Transmissions-Elektronenmikroskop EM910 bei einer

Beschleinigungsspannung von 80 kV untersucht.

38 ERGEBNISSE

4. Ergebnisse

4.1 Transposonmutagenese von Pseudomonas aeruginosa

Die Transposonmutagenese der Morphotypen WT und SCV des P. aeruginosa-Stammes

20265 wurde mit dem käuflichen EZ::TN Transposon (3.1.7) durchgeführt, welches auf

einem Tn5-Transposon basiert (GORYSHIN u. REZNIKOFF 1998; GORYSHIN et al. 2000).

Mit dieser Technologie werden Mutationen mit zufälliger Verteilung im Genom des

Bakteriums erzeugt. Gene, deren Mutation zu einem phänotypischen Switch bei dem WT

bzw. bei der SCV 20265 führen, sollten durch die Transposonmutagenese identifiziert

werden. Aufgrund der Eigenschaft von P. aeruginosa, auf Aminoglykoside empfindlich zu

reagieren, wurde zunächst zur späteren Selektion der Mutanten eine Gentamicin-

Resistenzkassette in die multiple cloning site des Transposons kloniert. Auf diese Weise

wurde ein effiziente Überprüfung der Mutanten ermöglicht.

Zur Optimierung der Transformationseffizienz wurden Transformationen des WT und der

SCV 20265 mit dem Vektor pBBR1MCS-5 (KOVACH et al. 1994; KOVACH et al. 1995)

mit einer Gentamicin-Resistenz durchgeführt. Dabei wurden zur Herstellung der

elektrokompetenten Bakterienzellen die gängigen Methoden ausprobiert. Eine besonders hohe

Menge an Bakterienmaterial von der Agarplatte zur Transposonmutagenese zu verwenden,

zeigte sich als die beste Methode (ENDERLE u. FARWELL 1998). Durch die Umsetzung des

gesamten Materials mindestens einer Agarplatte konnte die Mutantenausbeute auf etwa 200

Klone/ng DNA erhöht und somit die Effizienz der Transposonmutagenese optimiert werden.

Zum Nachweis, dass das Transposon nur einmalig in das bakterielle Genom inseriert, wurde

eine Analyse mit dem Southern Blot durchgeführt. Bei den getesteten Mutanten ergab die

Analyse, dass jede Mutante nur eine Transposoninsertion besitzt.

4.2 Transposonmutagenese des WT 20265: Überprüfung auf

langsam wachsende Phänotypen

Transposonmutanten des WT 20265 (3.2.17) wurden nach langsam wachsenden Phänotypen

überprüft. Kleine Kolonieformen konnten von großen deutlich nach 48 Stunden Inkubation

bei 37 °C direkt nach der Transposonmutagenese auf LB-Agar (200 µg/ml Gentamicin)

39 ERGEBNISSE

voneinander unterschieden werden. Langsam wachsende Kolonien wurden mit einer Impföse

von der LB-Platte abgenommen, im 3-Ösen-Ausstrich auf Blutagar sowie Müller-Hinton-

Agar überführt und für mindestens 24 Stunden bei 37 °C inkubiert. So konnten mit der

Überprüfung im Verlauf dieser Arbeit rund 12000 Mutanten auf langsam wachsende

Phänotypen untersucht werden. Im direkten Vergleich zum WT und der SCV 20265 wurden

von 105 auf LB-Agar klein erscheinende Kolonien 32 eindeutig langsam wachsende

Phänotypen auf Blut- sowie Müller-Hinton-Agar identifiziert. Des Weiteren konnten 73

Mutanten, die im Gegensatz zum Müller-Hinton-Agar auf Blutagar einen schnell wachsenden

Phänotyp zeigten, von den 32 langsam wachsenden Mutanten abgegrenzt werden (s. Anhang:

Tab. 9).

Der Vektor pBBR1MCS-5 mit einer Gentamicin-Resistenz wurde neben den

Optimierungsversuchen für die Transformationseffizienz gleichzeitig als Kontrolle für

spontan auftretende phänotypische Wechsel verwendet und in den WT 20265 elektroporiert

(3.2.17; 8-13 ng/50 µl Bakteriensuspension). Nach erfolgter Elektroporation wurden die

Transformanten auf LB-Platten mit 200 µg/ml Gentamicin ausplattiert. Die Inkubation wurde

für 48 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Anschließend wurden klein erscheinende Kolonien im

3-Ösen-Ausstrich auf Blutagar überführt und der Phänotyp im Vergleich mit WT und SCV

20265 auf ein langsames Wachstum überprüft. Bei über 6700 untersuchten Transformanten

des WT 20265 trat mit diesem Vektor nur ein einziger langsam wachsender Phänotyp auf.

4.3 Transposonmutagenese der SCV 20265: Überprüfung auf

schnell wachsende Phänotypen

Transposonmutanten der SCV 20265 (3.2.17) wurden nach schnell wachsenden Phänotypen

überprüft. Da schnell wachsende Phänotypen selbst nach prolongierter Inkubation auf den

LB-Platten direkt nach der Transposonmutagenese nicht identifiziert werden konnten, wurden

die Mutanten auf Blutagar überführt. Dazu wurden die Mutanten von 3 bis 4 LB-Platten mit

einem sterilen Tupfer in 2 bis 3 ml Puffer A aufgenommen. Die Bakterienanzahl/ml wurde

aus der fotometrisch gemessenen optischen Dichte der Suspension bei 650nm mit Hilfe einer

durch lineare Regression erstellten Eichgrade geschätzt und anschließend auf Blutagar

40 ERGEBNISSE

ausplattiert. Die Blutplatten wurden für 24 Stunden und zur eindeutigen Identifizierung bis zu

48 Stunden bei 37 °C inkubiert. Groß erscheinende Kolonien wurden mit einer Impföse

abgenommen und erneut auf Blutagar ausgestrichen. Die Inkubation wurde wiederum für 24

bis 48 Stunden bei 37 °C vorgenommen. Es wurden rund 10000 Mutanten auf schnell

wachsende Phänotypen untersucht. Ein größeres Koloniewachstum als bei der SCV 20265

konnte bei 101 Mutanten festgestellt werden. Davon zeigten 67 Mutanten einen schnell

wachsenden Phänotyp ähnlich dem WT 20265, 6 Mutanten einen Phänotyp ähnlich der REV

20265 und 28 Mutanten einen intermediären Phänotyp (s. Anhang: Tab. 13).

Auch hier erfolgte die Kontrolle, ob allein die Transformation mit dem Vektor pBBR1MCS-5

mit einer Gentamicin-Resistenz zu einem phänotypischen Switch führt. Die Transformanten

wurden auf Blutagar wie oben beschrieben überführt und groß erscheinende Kolonien nach

erneutem Ausstrich auf Blutagar auf schnell wachsende Phänotypen überprüft. Bei etwa 5800

untersuchten Transformanten konnte kein einziger schnell wachsender Phänotyp verzeichnet

werden.

4.4 Charakterisierung der Transposonmutanten im Auto-

aggregations-Assay

Da eine große Subgruppe der klinischen SCVs ein autoaggregatives Verhalten zeigt

(HÄUSSLER et al. 2003a), wurden zur weiteren Charakterisierung die identifizierten

Transposonmutanten des WT und der SCV 20265 (4.2 u. 4.3) auf die Fähigkeit eines

autoaggregativen Wachstums im Vogel-Bonner-Medium untersucht. Der WT, die SCV und

die REV 20265 wurden als Vergleich herangezogen. Die SCV 20265 zeigt mit ihrer Fähigkeit

zur Autoaggregation im Vogel-Bonner-Medium nach 24 bis 48 Stunden im Gegensatz zum

klonalen WT und der REV eine erhöhte Produktion sichtbarer Bakterienaggregate mit

Bildung eines Randes am Glaskolben, während die Kultur des WT und der REV mit nur

vereinzelt sichtbar großen Aggregaten ohne die Entstehung eines Randes weitestgehend

homogen bleibt (Abb. 5).

41 ERGEBNISSE

WT SCV REV

WT SCV REV

Abbildung 5: Wachstum der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des P. aeruginosa-

Stammes 20265 in Flüssigmedium.

Autoaggegation der SCV im Vergleich zum homogenen Wachstum des klonalen Wildtyps (WT) und

der Revertante (REV) im modifizierten Vogel-Bonner-Medium nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C.

Die drei unteren Abbildungen sind vergrößerte Ausschnitte aus den entsprechenden oberen

Abbildungen.

Allerdings ist die Untersuchung auf Autoaggregation mit Schwierigkeiten verbunden. Es

zeigte sich im Verlauf der Arbeit, dass autoaggregatives Wachstumsverhalten sehr variabel

und vermutlich von der Inkubationstemperatur abhängig ist, d. h. kleinste Veränderungen

während der Inkubation (Brutschrank, Umgebungstemperatur ect.) können zu

unterschiedlichen Ergebnissen führen.

4.4.1 Wachstumsverhalten der Transposonmutanten des mutagenisierten WT

20265 in Flüssigmedium

Von den 32 langsam wachsenden Transposonmutanten des WT 20265, die wie die klinischen

SCVs nicht nur auf LB-Agar sondern auch auf Blutagar kleine Kolonien ausbilden, zeigten 13

Mutanten ein autoaggregatives Wachstumsverhalten. Dabei war der Ausprägungsgrad unter

den Mutanten sehr variabel (Tab. 1). Während bei 5 Mutanten (WT-Tn5-M 25/B3, WT-Tn5-

42 ERGEBNISSE

M 2C, WT-Tn5-M 24C, WT-Tn5-M 24E, WT-Tn5-M 41D) überhaupt kein Wachstum im

Vogel-Bonner-Medium zu verzeichnen war, zeigten 14 Mutanten eine homogene Kultur, wie

sie beim WT 20265 vorkommt (s. Anhang: Tab. 8).

Tabelle 1: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten auf autoaggregatives Wachstum nach 48 Stunden

Inkubation bei 37 °C.

WT-Tn5-Mutante Aggregate Randbildung

WT-Tn5-M 24/H4 +++ +++WT-Tn5-M 34C ++ +++WT-Tn5-M 24/F5 ++ ++WT-Tn5-M 37D ++ ++WT-Tn5-M 33C +++ ++WT-Tn5-M 25/C1 ++ +WT-Tn5-M 37B +++ -WT-Tn5-M 18F +++ -WT-Tn5-M 24/B1 +++ -WT-Tn5-M 43A +++ -WT-Tn5-M 14F ++ -WT-Tn5-M 24/E8 + +++WT-Tn5-M 24/E1 - +

Deutliche Aggregat- oder Randbildung: +++; kleine bis sehr feine Aggregate, geringe Randbildung:

++; 1-2 große Aggregate, sehr geringe Randbildung: +; keine Aggregat- oder Randbildung: -

Von den 73 Transposonmutanten, die nur auf Müller-Hinton-Agar einen SCV-Phänotyp

aufwiesen und auf Blutagar den Phänotyp des WT beibehielten, kamen 28 mit einem

autoaggregativen Phänotyp vor. Kein Wachstum in Vogel-Bonner-Medium war bei 15

Mutanten zu verzeichnen (s. Anhang: Tab. 10).

4.4.2 Wachstumsverhalten der Transposonmutanten der mutagenisierten

SCV 20265 in Flüssigmedium

Von den 67 Transposonmutanten mit einem schnell wachsenden Phänotyp ähnlich dem WT

20265 und 6 Mutanten mit einem Phänotyp ähnlich der REV 20265 aus der mutagenisierten

SCV 20265 zeigten 25 eine homogene Kultur ohne die Bildung eines Randes am Glaskolben.

43 ERGEBNISSE

Damit haben diese Mutanten nicht nur den langsam wachsenden, sondern ebenso den

autoaggregativen Phänotyp der SCV 20265 verloren. Bei 2 Mutanten konnte kein

vollständiger Verlust der Autoaggregation festgestellt werden. 46 Mutanten zeigten weiterhin

den autoaggregativen Phänotyp der SCV 20265 (s. Anhang: Tab. 13).

Von den 28 Mutanten, deren Koloniewachstum sich zwischen dem WT und der SCV 20265

befand, hatten 16 den autoaggregativen Phänotyp der SCV verloren (s. Anhang: Tab. 13).

4.5 Charakterisierung der Transposonmutanten im Twitching-

Motilitäts-Assay

Weiterhin sollte untersucht werden, ob das autoaggregative Wachstumsverhalten der

Transposonmutanten des WT 20265 mit der Ausbildung von Typ IV Pili in Verbindung steht,

wie es für die von HÄUSSLER et al. (2003a) identifizierte autoaggregative SCV-Subgruppe

gezeigt werden konnte, zu denen auch die SCV 20265 gehört. Außerdem wurde bei den

Transposonmutanten der SCV 20265 getestet, ob sie die Fähigkeit der Twitching-Motilität der

SCV 20265 verloren haben und die beeinträchtigte Motilität des WT 20265 zeigen.

Für die Untersuchung der Transposonmutanten dienten der WT 20265, die zum WT

klonale SCV 20265 und die in vitro generierte Revertante als Vergleich. Nach der Beimpfung

des Petrischalenbodens durch den Twitching-Agar formt die SCV 20265 bei 37 °C nach 48

Stunden eine größere Twitching-Zone (durchschnittl. 0.9 cm) als ihr klonaler WT

(durchschnittl. 0.14 cm), während die Revertante die größte Twitching-Zone bildet

(durchschnittl. 3.2 cm) (Abb. 6).

44 ERGEBNISSE

Abbildung 6: Motilitätsverhalten der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des P.

aeruginosa-Stammes 20265.

Twitching-Motilität der SCV und der Revertante (REV) im Vergleich zum Wildtyp (WT) nach 48

Stunden Inkubation bei 37 °C. Die Darstellung der drei Morphotypen wurde durch die Färbung des

Petrischalenbodens mit Kristallviolett erreicht.

Von den Transposonmutanten des WT 20265 wies nur die 25/C1 eine Twitching-Motilität

auf. Allerdings war die gebildete Zone deutlich kleiner als bei der SCV 20265, jedoch größer

als beim klonalen WT (Abb. 7).

WT

SCV

REV

45 ERGEBNISSE

Abbildung 7: Motilitätsverhalten der zwei Morphotypen Wildtyp und SCV des P. aeruginosa-

Stammes 20265 und der Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten Wildtyps 20265.

Twitching-Motilität der SCV und der Mutante 25/C1 im Vergleich zum Wildtyp (WT) nach 48 Stunden

Inkubation bei 37 °C. Die Darstellung der drei Morphotypen wurde durch die Färbung des

Petrischalenbodens mit Kristallviolett erreicht.

Die Transposonmutanten der SCV 20265 mit einem großen Koloniewachstum und fehlender

Autoaggregation zeigten interessanterweise eine sehr deutliche Twitching-Motilität. Die

gebildete Twitching-Zone war bei jeder Mutante deutlich größer als bei der SCV 20265 und

bei 8 Mutanten wurde sogar der Durchmesser der Revertante 20265 erreicht (ohne Abb.).

4.6 Molekularbiologische Charakterisierung der Transposon-

mutanten

Die Bestimmung der Transposoninsertion im bakteriellen Genom wurde mittels Ligation der

Transposon flankierenden Sequenz an einen Y-Linker nach Literaturangaben von KWON u.

RICKE (2000) durchgeführt. Aufgrund des langsam wachsenden Phänotyps, ähnlich der SCV

20265 wurden die identifizierten 32 Transposonmutanten des mutagenisierten WT 20265

(4.2) zur molekularbiologischen Charakterisierung ausgewählt. Erfolgreich sequenzieren

ließen sich 28 Mutanten (Tab. 2).

WTSCV

25/C1

46 ERGEBNISSE

Zur Auswahl der Transposonmutanten aus der Transposon-Bank der SCV 20265 wurden die

Kriterien wie großes Koloniewachstum und ein homogenes Wachstum in Flüssigmedium

herangezogen. Erfüllt wurden diese Kriterien von 25 der 73 schnell wachsenden Mutanten

ähnlich dem WT bzw. der REV 20265. Obwohl die Mutanten SCV-Tn5-M R5, SCV-Tn5-M

R7 und SCV-Tn5-M 1D der 73 schnell wachsenden Mutanten weiterhin ein autoaggregatives

Wachstumsverhalten zeigten, wurden sie aufgrund eines intermediären bzw. der REV 20265

ähnlichen Phänotyps auf Blutagar ebenfalls für die weitere molekularbiologische Analyse

ausgewählt. Während das Koloniewachstum von der SCV-Tn5-M R5 deutlich zwischen dem

WT 20265 und der Revertante 20265 liegt, zeigen die SCV-Tn5-M R7 und die SCV-Tn5-M

1D den Phänotyp der Revertante. Erfolgreich sequenzieren ließen sich 26 Mutanten (Tab. 3).

Die erhaltenen Sequenzen wurden zur computergestützten Identifizierung mit dem P.

aeruginosa-Stamm PAO1 über das Pseudomonas Genom-Projekt verglichen. Blieb die

direkte Datenbanksuche mit dem Pseudomonas PAO1 Genom-Projekt erfolglos, wurde die

Identifizierung des Gens mit GenomeNet, Blast durchgeführt.

Die Transposonmutanten mit dem jeweils identifizierten Gen, welches das Transposon

enthält, sind in den Tabellen 2 und 3 dargestellt. Sämtliche in den Tabellen aufgeführten

Informationen wie PA-Nummer, Genname, Protein, Funktion und Stoffwechselweg wurden

dem Pseudomonas PAO1 Genom-Projekt entnommen.

47 ERGEBNISSE

Tabelle 2: Mutanten aus der Transposonbank des WT 20265 mit einem phänotypischen Switch zum

SCV-Phänotyp.

Tn5-Mutante PA-Nummer Gen Protein Funktion Stoffwechsel-

wegWT-Tn5-M24/E7

PA1583 sdhA Succinat-Dehydro-genase (Unter-einheit A)

Energie-Metabolismus

WT-Tn5-M24/G11

PA5174 möglicheß-Ketoacyl-Synthase

Fettsäuren- u.Phospholipid-Metabolismus

WT-Tn5-M25/C1

PA1587 lpdG Lipoamid-Dehydro-genase-Glc

Energie-Metabolismus,Aminosäure-Biosynthese u.-Metabolismus

Citrat-Zyklus,Threonin- u.Pyruvat-Metabolis-musGlykolyse,Glukoneogenese

WT-Tn5-M 2C PA3164 still frameshift3-Phospho-Shikimat1-Carboxyvinyl-TransferasePrephenat-Dehydrogenase

Aminosäure-Biosynthese u.-Metabolismus

WT-Tn5-M 24C PA5277 lysA Diaminopimelat-Decarboxylase

Aminosäure-Biosynthese u.-Metabolismus

Lysin-Biosynthese

WT-Tn5-M34B*

AE004796zwischenPA3769 u.

PA3770

guaA

guaB

GMP-Synthase

Inosin-5‘-Mono-phosphat-Dehydrogenase

Aminosäure- u.Nukleotid-Biosynthese u.-Metabolismus

Nukleotid-Biosynthese u.-Metabolismus

Glutamat-Metabolismus,Purin-Metabolismus

Purin-Metabolismus

WT-Tn5-M 41D PA3527 pyrC Dihydroorotase Nukleotid-Biosynthese u.-Metabolismus

Pyrimidin-Metabolismus

WT-Tn5-M25/B3

PA4756 carB Carbamoyl-Phosphat-Synthetase (großeUntereinheit)

Nukleotid-Biosynthese u.-Metabolismus,Biosynthese u.Metabolismus

Arginin- u. Prolin-Metabolismus,Glutamat-Metabolismus,Pyrimidin-Metabolismus

WT-Tn5-M24/F5

PA2615 ftsK Zellteilung-ProteinFtsK

Zellteilung

WT-Tn5-M24/E4

PA4480 mreC Stäbchen-FormbestimmendesProtein MreC

Zellteilung

48 ERGEBNISSE

Tn5-Mutante PA-Nummer Gen Protein Funktion Stoffwechsel-

wegWT-Tn5-M 14F PA5565 gidA Glukose

hemmendesTeilungsprotein A

Zellteilung

WT-Tn5-M 13AWT-Tn5-M 18AWT-Tn5-M 18CWT-Tn5-M 18F

PA3242 möglicheLauroyl-Acyltrans-ferase

ZellwandLPSKapsel

Lipopolysaccharid-Biosynthese

WT-Tn5-M24/A3

WT-Tn5-M24/E8

WT-Tn5-M24/H8

PA5161 rmlB DTDP-D-Glukose4,6-Dehydratase

Kohlenstoff-Verbindung,Katabolismus,Kapsel

Lipopolysaccharid-BiosyntheseMetabolismus

WT-Tn5-M 37BWT-Tn5-M 37DWT-Tn5-M 37E

PA3818 suhB extragenesSuppressor-Protein SuhB

Adaptation,ProtektionTranslation, post-translationaleModifizierung,Abbau

WT-Tn5-M24/H4

PA4265PA4277

tufAtufB

ElongationsfaktorTu

Translation, post-translationaleModifizierung,Abbau

WT-Tn5-M 3E PA 4275 nusG Transkriptions-Antiterminations-Protein NusG

Transkription,RNA-Prozessierung u.-Abbau

WT-Tn5-M24/E1

PA4497 möglicheProtein-bindendeKomponente einesABC Transporters

Transport kleinerMoleküle

WT-Tn5-M24/A11

WT-Tn5-M 34C

PA4729 panB 3-Methyl-2-OxobutanoatHydroxymethyl-Transferase

Biosynthese vonCo-Faktoren,prosthetischenGruppen u.Trägern

ein Kohlenstoff-Pool über FolatPantothenat u.CoA-Biosynthese

WT-Tn5-M 42B PA2963 konservierteshypothetischesProtein

WT-Tn5-M25/E1

PA2982 konservierteshypothetischesProtein

* Die Identifizierung des Transposon enthaltenen Gens mußte über GenomeNet, Blast durchgeführt

werden, da eine direkte Datenbanksuche mit dem Pseudomonas PAO1 Genom-Projekt erfolglos

blieb. Ein Vergleich der Sequenz auf Nukleotidebene ergab auf dieses Weise eine Identität von 100%

mit dem Gen AE004796. Weitere Analysen mit dem Pseudomonas PAO1 Genom-Projekt zeigten,

dass dieser Abschnitt sich zwischen den Genen PA3769 und PA3770 befindet.

49 ERGEBNISSE

Tabelle 3: Mutanten aus der Transposonbank der SCV 20265 mit einem phänotypischen Switch zum

WT-Phänotyp.

Tn5-Mutante PA-Nummer Gen Protein FunktionSCV-Tn5-M 1L PA0005 mögliche

AcyltransferaseFettsäuren- u.PhospholipidMetabolismus

SCV-Tn5-M 2E PA1119 mögliches Lipoprotein derAußenmembran

Membranprotein

SCV-Tn5-M 3F PA2129 cupA2 möglichesPili-AssemblierungsChaperon

Motilität u. Anheftung,Chaperone u.Hitzeschock Proteine

SCV-Tn5-M 3DSCV-Tn5-M 3ESCV-Tn5-M 3K

PA2130 cupA3 mögliches FimbrienBiogenese usher Protein

Motilität u. Anheftung

SCV-Tn5-M 1C PA3861 rhl ATP-abhängige RNAHelicase RhlB

Transkription,RNA-Prozessierung u.-Abbau

SCV-Tn5-M R2 PA3620 mutS DNA Reparatur-ProteinMutS

DNA-Replikation,-Rekombination,-Modifizierung u.-Reparatur

SCV-Tn5-M R1*SCV-Tn5-M R7*SCV-Tn5-M 11A*

PA4946 mutL DNA Reparatur-ProteinMutL

DNA-Replikation,-Rekombination,-Modifizierung u.-Reparatur

SCV-Tn5-M R4*SCV-Tn5-M R5*SCV-Tn5-M R6

PA4235 bfrA Bacterioferritin Adaptation, Protektion,Transport von Molekülen

SCV-Tn5-M 6E*SCV-Tn5-M 6F*SCV-Tn5-M 6G*SCV-Tn5-M 6MSCV-Tn5-M 6NSCV-Tn5-M 8A*SCV-Tn5-M 8BSCV-Tn5-M 8CSCV-Tn5-M 8DSCV-Tn5-M 8F

PA1120 konservierteshypothetisches Protein

hypothetisch, nichtklassifiziert, unbekannt,Membranprotein

SCV-Tn5-M 2L PA4601 konservierteshypothetisches Protein

hypothetisch, nichtklassifiziert, unbekannt,Membranprotein

SCV-Tn5-M 1D PA5227 konservierteshypothetisches Protein

hypothetisch, nichtklassifiziert, unbekannt

* Bei der Überführung der Mutanten vom LB-Agar auf Blutagar kam es bei der Überprüfung nach

schnell wachsenden Phänotypen zur Isolierung von klonalen Mutanten. Das Zeichen * kennzeichnet

von einander unabhängige Mutanten.

50 ERGEBNISSE

4.7 Komplementation von PA1587 in der Transposonmutante

25/C1

Die Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten WT 20265 ist mit ihren Eigenschaften wie

kleines Koloniewachstum, autoaggregatives Wachstum im Vogel-Bonner-Medium (Abb. 8)

sowie einer Twitching-Motilität, der klinischen SCV 20265 besonders ähnlich und wurde

deshalb für weiter führende Untersuchungen ausgewählt.

WT 25/C1

(A)

(B)

WT 25/C1

Abbildung 8: Wachstum vom Wildtyp des P. aeruginosa-Stammes 20265 und der

Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten Wildtyps 20265 auf Agarplatten und in

Flüssigmedium.

(A) Koloniemorphologie des Wildtyps (WT) 20265 und der Transposonmutation auf Columbia-Blutagar

nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C. (B) Autoaggregation der 25/C1 im Vergleich zum homogenen

Wachstum des WT im modifizierten Vogel-Bonner-Medium nach 48 Stunden bei 37 °C.

51 ERGEBNISSE

Das Gen mit einer Transposoninsertion in der 25/C1 wurde über das Pseudomonas Genom-

Projekt als PA1587 (Lipoamid-Dehydrogenase-Glc (lpdG))-Gen identifiziert. Die Lipoamid-

Dehydrogenase-Glc ist eine Untereinheit des aus drei Enzymen bestehenden

Multienzymkomplexes der im Citrat-Zyklus aktiven α-Ketoglutarat-Dehydrogenase. Mit der

in trans Komplementation von PA1587 in der 25/C1 sollte untersucht werden, ob die

Mutation im lpdG-Gen oder ein polarer Effekt für den langsam wachsenden und

autoaggregativen Phänotyp der Mutante verantwortlich ist. Mit spezifischen Primern wurde

PA1587 amplifiziert und in den Klonierungsvektor pUCP20 ligiert mit anschließender

Transformation in den E. coli DH5α. Nach Plasmidpräparation mehrerer Transformanten mit

folgender Restriktionsspaltung durch XbaI und HindIII wurde die Klonierung auf einen

Erfolg überprüft. Die nachfolgende Elektroporation des Vektors pUCP20::PA1587 in die

25/C1 führte zu Transformanten, die auf Antibiotikaplatten selektioniert wurden. Zur

Überprüfung des Phänotyps und Koloniewachstums wurde die komplementierte 25/C1 auf

Blutagar mit Antibiotikazusatz ausgestrichen. Nach 48 Stunden Inkubation war die

komplementierte 25/C1 im Koloniewachstum und Phänotyp wieder identisch mit dem WT

20265. Allerdings behielt die komplementierte 25/C1 weiterhin ihr autoaggregatives

Wachstum nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C im Vogel-Bonner-Medium mit

entsprechendem Antibiotikumzusatz bei. Als Kontrolle wurde der Vektor pUCP20 ohne

PA1587 in die 25/C1 transformiert. Im Gegensatz zur Komplementation wurde der Phänotyp

der Mutante alleine mit dem Vektor pUCP20 nicht komplementiert.

4.8 Untersuchung zur cupA1-Genexpression (PA2128) in den

Transposonmutanten des mutagenisierten WT 20265

Eine genomweite Expressionsanalyse der Transposonmutante 25/C1 mit P. aeruginosa

GeneChips (Affimetrix) (durchgeführt von F. v. GÖTZ 2003, Dissertation in Arbeitsgruppe

Häußler/ Steinmetz) zeigte eine gesteigerte Expression des chaperone/ usher pathway

(cupA1-A5)-Gene (PA2128-PA2133), der in der Ausbildung von Fimbrienstrukturen in vielen

gramnegativen Bakterien involviert ist (VON GÖTZ 2003, Tab. 6). Zur Bestätigung der

cup-Genexpression in der 25/C1, wurde in dieser Arbeit eine Analyse mit dem Northern Blot

durchgeführt. Dabei erfolgte die Herstellung der DIG-markierten Sonde mit der Gensequenz

52 ERGEBNISSE

des PA2128 (cupA1)-Gens. Dieses Gen zeigte in der Transkriptionsanalyse die höchste

Expression. Tatsächlich ergab die geblottete RNA der 25/C1 ein deutliches Signal, während

beim WT und bei der SCV 20265, die als Kontrollen eingesetzt wurden, kein Signal sichtbar

wurde (Abb. 9). So wurde das Ergebnis des DNA-Microarray von PA2128 mit dem Northern

Blot bei der 25/C1 eindeutig bestätigt.

1.517 kb

1.049 kb

0.575 kb

0.483 kb

0.310 kb

Abbildung 9: Northern Blot zur Darstellung der cupA1-Genexpression in der Transposon-

mutante 25/C1 im Vergleich zum Wildtyp und der SCV des P. aeruginosa-Stammes 20265.

RNA von der Transposonmutante 25/C1, Wildtyp (WT) und SCV 20265 wurde mit einer PA2128

(cupA1)-Sonde hybridisiert. Die RNA-Leiter ist ein DIG-markierter Größenstandard aus RNA-

Fragmenten von 0.310 bis 1.517 kb (3.1.5). Die 25/C1 des mutagenisierten WT 20265 zeigt ein

deutliches Signal im Gegensatz zu dem negativen WT und der SCV 20265.

RNA-Lei

ter

25/C

1

SCV 202

65

WT

2026

5

53 ERGEBNISSE

Zur Klärung, ob eine erhöhte cup-Genexpression auch in anderen z. T. autoaggregativen

Transposonmutanten mit einem SCV-Phänotyp auftritt und ein möglicher Zusammenhang

zwischen kleinem Koloniewachstum und Autoaggregation besteht, wurden weitere Northern

Blot-Analysen mit den restlichen sequenzierten Transposonmutanten des WT 20265

durchgeführt. Allerdings zeigte keine dieser Mutanten eine cupA1-Genexpression.

4.9 Ausbildung von Fimbrienstrukturen und Flagellen in

Transposonmutanten des mutagenisierten WT 20265

Der chaperone/ usher pathway (cupA1-A5), welcher für putative Fimbrienstrukturen kodiert,

wurde von VALLET et al. (2001) in P. aeruginosa identifiziert. Die Autoren konnten

nachweisen, dass die Fimbrienstrukturen vollkommen unabhängig von den Typ IV Pili für die

frühe Phase der Biofilmentwicklung in P. aeruginosa erforderlich sind. Das autoaggregative

Wachstumsverhalten der Transposonmutante 25/C1 in Flüssigmedium und die Induktion des

chaperone/ usher pathway (cupA1-A5) weisen auf eine mögliche Expression der vom

chaperone/ usher pathway kodierenden putativen Fimbrienstrukturen auf der Zelloberfläche

der Mutante hin. Zur Überprüfung dieser Vermutung wurde die 25/C1 mit der Transmissions-

Elektronenmikroskopie durch M. Rhode in der Gesellschaft für Biotechnologische Forschung

(GBF) in Braunschweig untersucht (3.2.26). Es zeigte sich, dass die Darstellung der

Fimbrienstrukturen von der Temperatur abhängig ist. Mit einer Inkubation der Mutante auf

Twitching-Agarplatten bei 28 °C und einer Inkubationszeit von 3 Tagen ließen sich zahlreiche

Fimbrienstrukturen auf der gesamten Zelloberfläche und einzelne Fimbrienfragmente in der

Umgebung der Bakterien darstellen (Abb. 10 u. 11). Bei 37 °C dagegen sank die Expression

der Fimbrienstrukturen deutlich, während bei 42 °C keine Fimbrien mehr dargestellt werden

konnten.

54 ERGEBNISSE

Abbildung 10: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zelloberflächen und Umgebung der

Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten P. aeruginosa-Wildtyps 20265.

Für die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden Zellen aus den äußeren Twitching-Zonen von

1%igen LB-Agarplatten, die zuvor mit einem sterilen Zahnstocher beimpft und bei 28 °C für 3 Tage

inkubiert worden waren, präpariert, auf ein Formvar Kupfergrid überführt und mit einer 2%igen

Uranylacetat-Lösung gefärbt. Pili: , Flagellen:

Da die RNA-Präparation für den Northern Blot zur Überprüfung ob noch weitere

Transposonmutanten des WT 20265 die cup-Gene hochreguliert haben, von Kulturen erfolgte,

die bei 37 °C inkubiert wurden, wurde ein Großteil der Transposonmutanten des WT 20265

elektronenmikroskopisch auf Fimbrienstrukturen durch M. Rhode (GBF, Braunschweig)

untersucht (3.2.26). Nach einer Inkubation bei 28 °C ließen sich bei weiteren 8

Transposonmutanten Fimbrienstrukturen darstellen (Tab. 5).

55 ERGEBNISSE

Tabelle 4: Elektronenmikroskopische Untersuchung von Transposonmutanten des WT 20265 mit

einer Inkubation der Mutanten auf Twitching-Agarplatten bei 28 °C.

WT-Tn5-Mutante Fimbrien Flagellen

24/A3 + -

24/A11 n. d. n.d.

24/E1 - -

24/E4 n. d. n. d.

24/E7 (+) +

24/F5 (-) +

24/G11 + +

24/H4 + +

25/B3 n.d. n. d.

25/C1 + +

25/C1 mit pED202 - -

25/E1 - +

WT-Tn5-M 2C + -

WT-Tn5-M 3E n. d. n. d.

WT-Tn5-M 14F - +

WT-Tn5-M 18A - -

WT-Tn5-M 18F (-) +

WT-Tn5-M 24C (-) kleine Stücke -

WT-Tn5-M 37B n. d. n. d.

WT-Tn5-M 41D n. d. n. d.

WT-Tn5-M 42B n. d. n. d.

Positiv: +, negativ: -, vereinzelt: (+), sehr vereinzelt: (-), n. d.: nicht durchgeführt

56 ERGEBNISSE

4.10 Ausbildung von Fimbrienstrukturen und Flagellen in

klinischen autoaggregativen SCVs

Die Expression von Cup-Fimbrien auf der Bakterienzelloberfläche könnte P. aeruginosa in

der chronisch infizierten CF-Lunge möglicherweise einen Selektionsvorteil bieten. Zur

Überprüfung dieser Hypothese wurden 7 klinische autoaggregative SCVs, isoliert aus dem

Respirationstrakt von CF-Patienten, elektronenmikroskopisch auf die Ausbildung von

Fimbrienstrukturen durch M. Rhode (GBF, Braunschweig) untersucht (3.2.26). Wie in

Tabelle 6 dargestellt, zeigten 6 der klinischen SCVs mit einem autoaggregativen Wachstum

deutlich sichtbare Fimbrienstrukturen wie die Transposonmutante 25/C1 (Abb.10 u. 11),

während bei einer SCV nur ganz vereinzelt Fimbrienstrukturen sichtbar waren. Die

Fimbrienstrukturen waren auf der gesamten Zelloberfläche lokalisiert. Es handelt sich daher

wahrscheinlich nicht um Typ IV Pili, die sich an den Polen der Bakterienzelle befinden.

Flagellen konnten bei 6 von 7 der SCVs elektronenmikroskopisch dargestellt werden.

Tabelle 5: Elektronenmikroskopische Untersuchung klinischer SCVs mit einem autoaggregativen

Phänotyp auf Fimbrienstrukturen und Flagellen mit einer Inkubation der Bakterien auf Twitching-Agar-

platten bei 28 °C.

Klinische SCVs Fimbrien Flagellen

10 + +

13 + +

32 + +

65 + -

8226 + +

74861 (-) +

75962 + +

Positiv: +, negativ: -, sehr vereinzelt: (-)

57 ERGEBNISSE

Abbildung 11: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von der Umgebung der Transposon-

mutante 25/C1 des mutagenisierten P. aeruginosa-Wildtyps 20265.

Für die elektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden Zellen aus den äußeren Twitching-Zonen von

1%igen LB-Agarplatten, die zuvor mit einem sterilen Zahnstocher beimpft und bei 28 °C für 3 Tage

inkubiert worden waren, präpariert, auf ein Formvar Kupfergrid überführt und mit einer 2%igen

Uranylacetat-Lösung gefärbt. Pili: , Flagelle:

58 ERGEBNISSE

4.11 Wachstumsverhalten der Transposonmutante 25/C1 unter

pvrR-Genexpression in trans

DRENKARD u. AUSUBEL (2002) identifizierten das Regulatorgen pvrR (phänotypischer

Variant-Regulator), welches den phänotypischen Switch einer antibiotikaresistenten und

autoaggregativen rauen SCV des P. aeruginosa-Stammes PA14 zur Wildtyp-Revertante

kontrolliert. Nach Tranformation des pED202 Vektors mit dem pvrR-Gen beobachteten sie

eine höhere Rate des phänotypischen Switches von der rauen SCV zur Wildtyp-Revertante.

Mit der Transformation des Vektors pED202 mit dem pvrR-Gen in die Transposonmutante

25/C1 sollte untersucht werden, ob eine pvrR-Genexpression auch in der 25/C1 zu einem

phänotypischen Switch führt, d. h. zu einem schnell wachsenden Phänotyp und zum Verlust

der Autoaggregation. Die auf Antibiotikaplatten selektionierten Transformanten der 25/C1

wurden zur genauen Untersuchung des Phänotyps und Koloniewachstums auf Blutagar mit

entsprechendem Antibiotikum überführt. Nach 48 Stunden Inkubation wurden die Kolonien

rau, flach und fingen an, geringfügig an den Rändern auszulaufen, während die Kolonien der

25/C1 ohne pvrR kugelig und glänzend sind. Untersuchungen auf Veränderungen des

autoaggregativen Wachstums der 25/C1 mit dem pvrR-Gen im Vogel-Bonner-Medium

führten zu keinen eindeutigen Aussagen. Zur Kontrolle, ob die phänotypischen

Veränderungen auf Blutagar auch wirklich vom pvrR-Gen verursacht werden und nicht

alleine durch das Vorhandensein des Vektors zustande kommen, wurde der Vektor pUCP20

ohne dem pvrR-Gen in die 25/C1 transformiert. Auf Blutagar zeigte die 25/C1 mit dem

Vektor pUCP20 jedoch dieselben Kolonieveränderungen wie mit dem pvrR-Gen. Die

Kolonien wurden rau, flach und am Rand leicht auslaufend.

4.12 Temperaturabhängiges Wachstum der mutagenisierten SCV

20265 mit einer Transposoninsertion in PA1120

Die Transposonmutante SCV-Tn5-M 6E der mutagenisierten SCV 20265 besitzt neben 9

anderen Mutanten eine Transposoninsertion im Gen PA1120, welches für ein mögliches

Membranprotein kodiert. Diese Mutante zeigt bei einer Inkubation von 48 Stunden bei 37 °C

auf Blutagar einen dem WT 20265 ähnlichen schnell wachsenden Phänotyp und in

Flüssigmedium ein homogenes Wachstum. Wird die Mutante allerdings bei 28 °C inkubiert,

59 ERGEBNISSE

zeigt sie auf Blutagar den langsam wachsenden Phänotyp der SCV 20265. Die Ausbildung

eines langsam wachsenden Phänotyps bei 28 °C weist auf die Expression von

Fimbrienstrukturen auf der Zelloberfläche der Mutante hin. Durch die elektronen-

mikroskopische Untersuchung der Mutante durch M. Rhode (GBF, Braunschweig) konnten

bei 28 °C Fimbrienstrukturen auf der gesamten Zelloberfläche dargestellt werden.

60 DISKUSSION

5. Diskussion

In der chronisch infizierten CF-Lunge ist P. aeruginosa einem sehr heterogenen und sich

ständig wechselnden Habitat ausgesetzt. In dieser Umgebung steht P. aeruginosa in hoher

Zelldichte einer Vielzahl von Umweltfaktoren gegenüber, wie z. B. dem Immunsystem des

Patienten, Entzündungsprozessen, Gewebszerstörung und Chemotherapeutika. Die

mikrobiologische Antwort des Erregers ist die Bildung morphologischer Varianten in der

CF-Lunge, obwohl die Mehrzahl der Patienten nur mit einem oder wenigen P. aeruginosa-

Klonen kolonisiert ist (RÖMLING et al. 1994). Dieses Verhalten wurde bei P. aeruginosa als

dissoziatives Verhalten beschrieben (ZIERDT u. SCHMIDT 1964). Beispiele für

morphologische Varianten aus der CF-Lunge sind: der am häufigsten beschriebene mukoide

Phänotyp (GOVAN u. DERETIC 1996) und die SCVs (HÄUSSLER et al. 1999a).

In vitro Studien konnten das Auftreten phänotypischer Varianten in einer heterogenen

Umwelt für P. fluorescens belegen. Es wurde gezeigt, dass die unterschiedlichen Phänotypen

von P. fluorescens durch Mutation entstehen und die Differenzierung durch natürliche

Selektion aufrecht erhalten wird (RAINEY u. TRAVISANO 1998). Tatsächlich wurden als

Ursache für die Entstehung des mukoiden Phänotyps von P. aeruginosa Punktmutationen

entdeckt, die zu einer Inaktivierung des mucA-Gens führen (MARTIN et al. 1993; GOVAN u.

DERETIC 1996; BOUCHER et al. 1997). Vor diesem Hintergrund entstand die Hypothese,

dass der Phänotyp der SCV durch Mutation aus dem schnell wachsenden Phänotyp (Wildtyp)

entsteht und aufgrund eines natürlichen Selektionsvorteils in dem sich ständig wechselnden

heterogenen Habitat der CF-Lunge erhalten bleibt. Ebenso wurden Mutation und Selektion für

die in vitro generierten Revertanten als Entstehungsmechanismus in den Vordergrund gestellt.

Denn unter bestimmten Bedingungen, wie z. B. dem Wegfall des Antibiotikadrucks und

reichhaltigen Kulturbedingungen können viele SCVs wieder zum schnell wachsenden

Phänotyp revertieren.

61 DISKUSSION

5.1 Molekulare Mechanismen beim phänotypischen Switch von

Pseudomonas aeruginosa

SCVs, die in einer Reihe von grampositiven und gramnegativen Erregern beschrieben

wurden, werden zunehmend mit persistierenden und rekurrierenden Infektionen in einen

ursächlichen Zusammenhang gebracht. So isolierten PROCTOR et al. (1995) bei 5 Patienten

mit chronischen Infektionen erstmals SCVs von Staphylococcus aureus. In einer Gruppe von

14 Patienten mit Osteomylitis erlitten diejenigen mit SCVs von S. aureus rekurrierende

Infektionen, während die anderen Patienten unauffällige klinische Verläufe zeigten (VON

EIFF et al. 1997). ROGGENKAMP et al. (1998) wiederum konnten eine chronische Infektion

des Hüftgelenks mit einer SCV von Escherichia coli dokumentieren.

Die SCVs von S. aureus sind die am besten untersuchten langsam wachsenden

bakteriellen Subpopulationen. Neben dem langsamen Wachstum zeigen die SCVs von

S. aureus ebenso wie die SCVs von P. aeruginosa eine erhöhte Resistenz gegenüber

Antibiotika und zusätzlich die Fähigkeit zur Persistenz in Endothelzellen auf (BALWIT et al.

1994). Die Ursache für diesen S. aureus SCV-Morphotyp scheint ein Auxotrophismus zu

sein, da exogenes Hämin oder Menadion den Wildphänotyp wieder herstellen konnte

(BALWIT et al. 1994; PROCTOR et al. 1995). Eine Supplementation mit Hämin, Menadion

oder Aminosäuren führte bei den SCVs von P. aeruginosa allerdings zu keinem

Phänotypwechsel (HÄUSSLER et al. 1999a). Des Weiteren sind die SCVs von P. aeruginosa

bei der Mukoviszidose im Gegensatz zu den nicht pigmentierten und keine β-Hämolyse

aufweisenden SCVs von S. aureus in ihrer Koloniemorphologie und Eigenschaften wie

Oberflächenhydrophobizität, Biofilmbildung, Schwimmbewegung und Assoziation mit

eukaryoten Zellen sehr heterogen (HÄUSSLER et al. 2003a). Eine Subgruppe von SCVs zeigt

z. B. neben dem langsamen Wachstum und der erhöhten Antibiotikaresistenz eine verstärkte

Expression von Typ IV Pili, die für erhöhte Motilität (Twitching-Motilität) und verstärkte

Adhärenz verantwortlich gemacht werden. Diese hyperpilierten SCVs weisen mit ihrem

gesteigerten autoaggregativen Wachstumsverhalten in Flüssigmedium eine besonders hohe

Fähigkeit zur Biofilmbildung auf. Die Biofilmbildung ist ein bedeutsamer Virulenzfaktor von

P. aeruginosa. Im Gegensatz zu den planktonischen Bakterienzellen ist der Erreger in der

Nische Biofilm vermutlich besonders gut vor den Umweltfaktoren der CF-Lunge geschützt

und kann somit zur Persistenz von P. aeruginosa beitragen.

62 DISKUSSION

Als Entstehungsursache für die in vitro isolierten SCVs der P. aeruginosa-Stämme 57RP

und PA14, die eine erhöhte Fähigkeit zur Biofilmbildung aufwiesen und deren

phänotypisches Erscheinungsbild unter geeigneten Bedingungen zu schnell wachsenden

Phänotypen wechselte, wurde ein Phasenvariationsmechanismus in den Vordergrund gestellt

(DÈZIEL et al. 2001; DRENKARD u. AUSUBEL 2002) (vergl. 2.7). Eine Phasenvariation

allein ist allerdings nach den Studien von HÄUSSLER et al. (2003a) als Ursache für die

Entstehung der SCVs in der CF-Lunge eher unwahrscheinlich. Denn außer einer erheblichen

Variabilität unter den verschiedenen klinischen SCV-Stämmen lagen die aus den SCVs in

vitro generierten Revertanten bei der Untersuchung der Oberflächenhydrophobizität, der

Biofilmbildung, der Assoziation mit eukaryoten Zellen und der Fähigkeit zur

Schwimmbewegung häufig zwischen den SCVs und den Wildtypen (HÄUSSLER et al.

2003a). Außerdem zeigen die Revertanten z. B. einen schnell wachsenden Phänotyp auf

Blutagar, der sich allerdings erheblich in der Koloniemorphologie von dem Wildtyp

unterscheidet (Abb. 3) sowie eine erhöhte Anzahl von Typ IV Pili. Außer einer

Phasenvariation ist es daher denkbar, dass Mutation und Selektion die treibenden Kräfte bei

der Entstehung der klinischen SCVs sind.

Die Ergebnisse aus der Transposonmutagenese des WT 20265 bzw. der SCV 20265, die

im Rahmen dieser Arbeit durchgeführt wurde, unterstützen die Hypothese der Mutation und

Selektion.Von rund 12000 Transposonmutanten des WT 20265 zeigen nur 32 Mutanten einen

langsam wachsenden Phänotyp. Mutationen in Genen des WT 20265, die den Stoffwechsel,

die Zellteilung, die Zellwandbiosynthese, die Proteinbiosynthese, den RNA-Stoffwechsel,

den Molekültransport und die Co-Faktoren-Biosynthese betreffen sowie eine Gruppe von

Genen mit noch unbekannter Funktion rufen langsam wachsende Subpopulationen hervor.

Genau wie die klinischen SCVs aus der CF-Lunge sind sie sehr heterogen, allerdings zeigt

auch hier eine große Subgruppe ein autoaggregatives Verhalten. Andersherum führen

Mutationen in Genen der SCV 20265, die den Fettstoffwechsel, die

Zellmembranbiosynthese, die Motilität und Adhäsion, den RNA-Stoffwechsel, die DNA-

Reparatur und den Molekültransport betreffen sowie eine Gruppe von Genen mit noch

unbekannter Funktion zu schnell wachsenden Phänotypen ähnlich dem WT 20265.

Die Transposonmutante 25/C1, mit einer Transposoninsertion im Gen PA1587 (Lipoamid-

Dehydrogenase-Glc (lpdG)), kristallisierte sich aus den 32 langsam wachsenden

63 DISKUSSION

Transposonmutanten des WT 20265 für weiterführende Untersuchungen als besonders

interessant heraus. Denn mit ihren Eigenschaften wie langsames Wachstum, Autoaggregation

in Flüssigmedium und Twitching-Motilität, ist sie der von HÄUSSLER et al. (2003a)

beschriebene SCV-Subgruppe, zu der die SCV 20265 gehört, besonders ähnlich. Außerdem

verdeutlichte die Komplementation der Mutante, dass die Mutation im lpdG-Gen für den

langsam wachsenden Phänotyp verantwortlich ist und nicht eine unzureichende Transkription

nachfolgender Gene. Allerdings behielt die komplementierte 25/C1 weiterhin ihr

autoaggregatives Wachstum (Inkubation bei 37 °C) in Flüssigmedium bei. Dieses Ergebnis

wurde möglicherweise durch kleinste Veränderungen während der Inkubation (häufiges

Öffnen des Brutschranks, Umgebungstemperatur ect.) verursacht. Denn im Verlauf dieser

Arbeit zeigte sich, dass autoaggregtives Wachstumsverhalten sehr variabel und vermutlich

von der Inkubationstemperatur abhängig ist.

Mit einer genomweiten Expressionsanalyse der 25/C1 mit P. aeruginosa GeneChips

(Affimetrix) (durchgeführt von F. v. GÖTZ 2003, Dissertation in Arbeitsgruppe Häußler/

Steinmetz) wurde deutlich, dass die 25/C1 keine Ähnlichkeit im Genexpressionsprofil zu der

klinischen SCV 20265 zeigt (VON GÖTZ 2003), obwohl die Mutante der SCV in ihren

Eigenschaften sehr ähnlich ist und aus der Transposonmutagenese des zur SCV klonalen WT

20265 stammt. Im Vergleich zum WT 20265 wurden mehr als 40 Gene in der 25/C1 induziert

und kein Gen zeigte sich transkriptionell herunterreguliert. Unter den regulierten Genen

befinden sich die Gene sdhC (PA1581), sdhD (PA1582) und sucA (PA1585), die unmittelbar

in der Nähe zum lpdG-Gen liegen sowie das lpd3 (PA4829)-Gen. Die Gene sdhC und sdhD

kodieren jeweils für eine Untereinheit der Succinat-Dehydrogenase und sucA für eine α-

Ketoglutarat-Dehydrogenase, während lpd3 für eine Dihydrolipoamid-Dehydrogenase 3

kodiert. Dieses Ergebnis spiegelt möglicherweise den Versuch der Mutante wider, den

Gendefekt im lpdG-Gen zu kompensieren. Interessanterweise zeigte die Transkriptions-

analyse der 25/C1 eine gesteigerte Expression des flagellaren Basalkörpers (flgB-flgE

(PA1077-PA1080), flgG (PA1082), flgK (AF332547), orfC (AF332547)) sowie des

chaperone/ usher pathway (cup) (PA2128-2133), der in der Ausbildung von Fimbrien-

strukturen in vielen gramnegativen Bakterien involviert ist (VON GÖTZ 2003, Tab. 6). Mit

einer in dieser Arbeit durchgeführten Northern Blot-Analyse konnte das Ergebnis der

erhöhten cupA1 (PA2128)-Genexpression, welches für ein Fimbrienprotein kodiert, eindeutig

bestätigt werden (Abb. 9).

64 DISKUSSION

Tabelle 6: Differenzielle Genexpression der Transposonmutante 25/C1 während der exponentiellen

Wachstumsphase (VON GÖTZ 2003).

Signalintensitäts- Gen Protein Verhältnissea

Citrat-Zyklus

PA1581 (sdhC) Succinat-Dehydrogenase (C Untereinheit) 3.2 (0.9)

PA1582 (sdhD) Succinat-Dehydrogenase (D Untereinheit) 2.6 (0.6)

PA1585 (sucA) α-Ketoglutarat-Dehydrogenase (E1 Untereinheit) 2.5 (0.2)

PA4829 (lpd3) Dihydrolipoamid-Dehydrogenase 30.2 (23.8)

PA1077 (flgB) flagellares Basal-Körper Protein 11.8 (3.7)

PA1078 (flgC) flagellares Basal-Körper Protein 17.9 (14.0)

PA1079 (flgD) flagellares Basal-Körper Modifizierungs-Protein 5.0 (2.8)

PA1080 (flgE) flagellares Haken Protein 3.3 (0.8)

PA1082 (flgG) flagellares Basal-Körper Protein 2.7 (0.2)

AF332547 (flgK) mit flagellarem Haken assoziertes Protein, PAK 2.1 (0.1)

AF332547 (orfC) mögliche 3-Oxoacyl-(Acyl-Transport-Protein) Synthase von 2.7 (0.3)

Glykosylierungsinsel, PAK

Cup-Fimbrien

PA2128 Fimbrien Protein 39.4 (8.7)

PA2129 mögliches Pili-Assemblierungs Chaperon 20.2 (13.8)

PA2130 mögliches Fimbrien Biogenese usher Protein 7.3 (4.7)

PA2131 hypothetisches Protein 11.4 (11.1)b

PA2132 mögliches Pili-Assemblierungs Chaperon 14.7 (1.0)

PA2133 mögliches Signal-Transduktions Protein, EAL Domäne 8.0 (1.8)c

Sonstige Gene mit Funktionszusammenhang

PA4843 möglicher Zwei-Komponenten-System Response Regulator, 2.4 (0.2)

GGDEF Domäne

PA-Nummer, Gen- und Proteinname wurden von dem P. aeruginosa PAO1 Genom-Projekt

übernommen. Für nicht-PAO1-Gene werden statt einer PA-Nummer der Genbank-Eintrag sowie eine

nähere Bezeichnung des einzelnen Gens angegeben.a Angegeben ist das arithmetische Mittel der Signalintensitäts-Verhältnisse aus vier Kreuzvergleichen.

In der Klammer befindet sich die Standardabweichung. Hochregulierte Gene haben positive und

herunterregulierte Gene negative Werte.b Die Signalintensitäts-Verhältnisse waren nur in 3 von 4 GeneChips höher als 2-fach.c Die Expression war nur in 2 von 4 GeneChip Einzelvergleichen signifikant unterschiedlich.

65 DISKUSSION

Fimbrien oder Pili sind Haftungsorganellen der Bakterienzelle, die an der

zytoplasmatischen Membran der Bakterienzelle inserieren und durch die Zellhülle hindurch

ins Milieu hineinragen (HAHN et al. 1999). Mit ihnen besitzt das Bakterium die Fähigkeit, an

die eukaryotische Zellmembran zu adhärieren. Dabei wird die Adhäsion durch bestimmte

Komponenten der Fimbrien/ Pili vermittelt, die als Adhäsine bezeichnet werden und an

spezifische Rezeptoren der eukaryotischen Zellmembran binden (SOTO u. HULTGREN

1999). Fimbrien/ Pili sind somit bedeutende Virulenzfaktoren (THANASSI et al. 1998). Denn

nur eine erfolgreiche Adhäsion kann zu einer Kolonisation und/ oder Invasion der Wirtszelle

führen (SOTO u. HULTGREN 1999). Damit stellt die Adhäsion ein Schlüsselereignis in der

frühen Infektionsphase dar (HULTGREN et al. 1996).

Der chaperone/ usher pathway ist ein bedeutender Stoffwechselweg für den Aufbau von

Fimbrienstrukturen bei Enterobacteriaceae und umfasst zwei spezifische Klassen von

Proteinen: ein periplasmatisches Chaperon Protein und ein Außenmembran Usher Protein.

Das periplasmatische Chaperon Protein ist für die korrekte Faltung der strukturellen

Fimbrienuntereinheiten und den Transport dieser Untereinheiten zu dem Außenmembran

Usher Protein verantwortlich. Anschließend vermittelt das Außenmembran Usher Protein die

Translokation der Fimbrienstrukturen auf die Zelloberfläche, in dem es einen Kanal durch die

Außenmembran formt. Am besten wurde der chaperone/ usher pathway bei den P Pili und

Typ I Pili von Escherichia coli studiert (SOTO u. HULTGREN 1999). Des Weiteren wurde er

für die F17 Pili von E. coli beschrieben (BUTS et al. 2003). Während die uropathogenen

E. coli mit P Pili und Typ I Pili Harnwegsinfektionen verursachen, indem das PapG-Adhäsin

der P Pili und das FimH-Adhäsin der Typ I Pili an Zellen der Harnblase und Niere binden

(ROBERTS et al. 1994; LANGERMANN et al. 1997), vermittelt das F17G-Adhäsin der F17

Pili die Adhäsion an Mikrovilli des Intestinums. Dies führt z. B. beim Wiederkäuer zur

Diarrhoe und Septikämie (BUTS et al. 2003).

Fimbrien/ Pili befähigen die Bakterienzelle jedoch nicht nur zur Adhäsion an die Wirtszelle,

d. h. an eukaryotische Strukturen, sondern auch zur Adhäsion an eine abiotische Oberfläche

und somit in beiden Fällen auch zur Biofilmbildung. Studien von PRATT u. KOLTER (1998)

konnten für E. coli belegen, dass die Typ I Pili dem Bakterium eine stabile Adhäsion an eine

abiotische Oberfläche vermitteln und für eine erfolgreiche Biofilmentwicklung erforderlich

sind.

66 DISKUSSION

Während in bisherigen Studien über die Biofilmbildung bei P. aeruginosa die Typ IV Pili im

Vordergrund standen, konnten VALLET et al. (2001) zum ersten Mal zeigen, dass die cup-

Gene (cupA1-A5) für die frühe Phase der Biofilmentwicklung im Wildtyp von P. aeruginosa

notwendig sind und zwar unabhängig von den Typ IV Pili. Allerdings fehlten bisher

elektronenmikroskopische Aufnahmen über die Expression so genannter Cup-Fimbrien auf

der Zelloberfläche von P. aeruginosa. Die Fimbrienstrukturen auf der Zelloberfläche der

25/C1 (Abb. 10), die aufgrund ihrer besonderen Lokalisation von den Typ IV Pili abgrenzbar

waren, und die gleichzeitig erhöhte Expression der cup-Gene legen den Schluss nahe, dass es

sich bei den Fimbrienstrukturen um so genannte Cup-Fimbrien handelt. Interessanterweise

ließen sich außer bei der 25/C1 noch bei weiteren langsam wachsenden Transposonmutanten

und insbesondere auch bei klinischen autoaggregativen SCVs solche Fimbrienstrukturen

elektronenmikroskopisch darstellen. Es ist denkbar, dass langsames Wachstum und

Autoaggregation miteinander verknüpft sind. Da die klinischen autoaggregativen SCVs mit

den Fimbrienstrukturen in der CF-Lunge offensichtlich selektioniert wurden, scheinen die

Fimbrien bei P. aeruginosa für die Biofilmentwicklung und eventuell auch für die Virulenz in

vivo eine wichtige Rolle zu spielen.

Interessanterweise befinden sich unter den Transposonmutanten der SCV 20265 mit

einem phänotypischen Switch zum Wildtyp, Mutanten mit einer Transposoninsertion in den

cup-Genen PA2129 (cupA2) und PA2130 (cupA3). In der SCV 20265 sind die cup-Gene

gegenüber dem Wildtyp zwar nicht hochreguliert (VON GÖTZ 2003), trotzdem führt eine

Mutation in diesen Genen zu einem schnell wachsenden Phänotyp und zu einem Verlust der

Autoaggregation. Das Gen PA2129 kodiert für ein mögliches Pili-Assemblierungs Chaperon

und PA2130 für ein mögliches Fimbrien Biogenese Usher Protein. Mit einer Mutation im

PA2129-Gen werden die strukturellen Fimbrienuntereinheiten der Cup-Fimbrien

möglicherweise nicht mehr korrekt gefaltet und/ oder zur Außenmembran transportiert,

während bei einer Mutation im PA2130-Gen die Lokalisation der Fimbrienstrukturen auf der

Zelloberfläche nicht mehr möglich ist. Beide Mutationen heben die Bedeutung der cup-Gene

für ein autoaggregatives Wachstum hervor und die mögliche Rolle, die sie für den Biofilm-

Phänotyp spielen. Allerdings ist über die Regulation der cup-Gene bei P. aeruginosa bisher

nichts näheres bekannt.

67 DISKUSSION

5.1.1 Regulation eines autoaggregativen SCV-Phänotyps in Verbindung mit

einem phänotypischen Switch bei Pseudomonas aeruginosa

In einer Studie über Salmonella typhimurium wurde gezeigt, dass die Expression eines

multizellulären autoaggregativen Morphotyps bei 28 °C positiv reguliert wird (RÖMLING et

al. 2000). Gleiches konnten D’ARGENIO et al. (2002) für P. aeruginosa zeigen. In ihren

Untersuchungen wurde eine Autoaggregation durch hohe Inkubationstemperaturen

unterdrückt. Da sich in dieser Arbeit zahlreiche Fimbrienstrukturen nur nach einer Inkubation

der Bakterien bei 28 °C darstellen ließen, scheint die Expression der Cup-Fimbrien in

P. aeruginosa ebenfalls temperaturabhängig zu sein.

Allerdings wird der multizelluläre autoaggregative Morphotyp von S. typhimurium nicht

nur über die Temperatur, sondern auch über ein Transmembranprotein (AdrA) reguliert.

Interessanterweise besitzt dieses Protein eine GGDEF-Domäne und ist an der Regulation der

Zellulosebiosynthese beteiligt. Die Zellulose ist bei S. typhimurium für das

Aggregationsverhalten und die Biofilmbildung erforderlich (RÖMLING et al. 2000; ZOGAJ

et al. 2001).

Die GGDEF-Domäne ist eine konservierte Domäne (GALPERIN et al. 2001) und wurde

zuerst im Response Regulator PleD identifiziert, der die Zelldifferenzierung in Caulobacter

crescentus kontrolliert (HECHT u. NEWTON 1995). Aufgrund der konservierten

GG[DE][DE]F-Sequenz entstand der Name dieser Domäne. Die GGDEF-Domäne kommt

häufig in bakteriellen Proteinen vor und zeigt keine Ähnlichkeit zu bekannten DNA-

bindenden Domänen. Sie tritt einzeln oder zusammen in unterschiedlichen Kombinationen

mit anderen Domänen auf, z. B. mit der EAL-Domäne (Name aufgrund der konservierten

Sequenz) (GALPERIN et al. 2001; PEI u. GRISHIN 2001). Das Genom von P. aeruginosa

PAO1 kodiert 33 Proteine mit einer GGDEF-Domäne (http://www.sanger.ac.uk/

Software/Pfam/index.shtml).

Außer bei S. typhimurium wurde die Regulation der Autoaggregation über Proteine mit einer

GGDEF-Domäne bei weiteren Proteobakterien beschrieben. So konnte z. B. für Burkholderia

cepacia gezeigt werden, dass ohne das funktionsfähige Protein YciR mit einer GGDEF-

Domäne nur dünne Biofilme ohne die Entwicklung von Mikrokolonien ausgebildet werden

(HUBER et al. 2002). Bei Vibrio cholerae wurde ein Regulatorprotein (MbaA) mit einer

GGDEF-Domäne und zusätzlich einer EAL-Domäne gefunden, welches die Synthese von

Komponenten der Biofilmmatrix reguliert und damit für die Erhaltung des Biofilms

68 DISKUSSION

notwendig ist (BOMCHIL et al. 2003). Eine Mutation im mbaA-Gen führte zu einer

Überproduktion des Exopolysaccharidmaterials im Biofilm. SPIERS et al. (2002) wiederum

untersuchten einen autoaggregativen Morphotyp von P. fluorescens, der zur Biofilmbildung

ein Polymer (CLP) überproduziert, welches der Zellulose ähnlich ist. Dabei wurde ein Gen

(wspR) entdeckt, welches für das Protein WspR mit einer GGDEF-Domäne kodiert und an der

Regulation der CLP-Biosynthese beteiligt ist. Interessanterweise beschrieben D’ARGENIO et

al. (2002), dass die Autoaggregation von P. aeruginosa bei 23 °C von einem regulatorischen

Protein mit einer GGDEF-Domäne positiv kontrolliert wird und mit der Regulation der cup-

Gene in Verbindung steht. Dabei zeigte sich eine Homologie des regulatorischen Proteins von

P. aeruginosa zu dem WspR-Protein von P. fluorescens. In der 25/C1 konnte allerdings keine

erhöhte Expression des WspR-Proteins gefunden werden. Jedoch wurde in der Mutante das

PA4843-Gen differenziell exprimiert (Tab. 4). Dieses Gen kodiert für einen Response

Regulator mit einer GGDEF-Domäne (Abb. 12). Möglicherweise wird die Expression der

cup-Gene in der 25/C1 und damit ihr autoaggregativer Phänotyp über die GGDEF-Domäne

des Response Regulators PA4843 positiv reguliert.

Die Vermutung einer regulatorischen Funktion der GGDEF-Domäne auf einen langsam

wachsenden und autoaggregativen Phänotyp wird durch den Phänotyp der SCV 20265 mit

einer Transposoninsertion in den Genen PA1120 und PA4601 unterstützt. Zwar kodieren

beide Gene für Proteine mit noch unbekannter Funktion, jedoch besitzen diese Proteine

jeweils eine GGDEF-Domäne und PA4601 zusätzlich eine EAL-Domäne (Abb. 12). Mit einer

Mutation in diesen Genen verliert die SCV 20265 ihr autoaggregatives Wachstumsverhalten

in Flüssigmedium und zeigt bei 37 °C einen schnell wachsenden Phänotyp auf Blutagar

ähnlich dem WT 20265. Es ist erstaunlich, dass bei 28 °C der Phänotyp der SCV 20265 auf

Blutagar gezeigt wird und im Elektronenmikroskop Fimbrien dargestellt werden können. Es

scheint, dass bei 28 °C die Mutation eventuell über die Hochregulation anderer Gene, die

ebenfalls für Proteine mit einer GGDEF-Domäne kodieren, ausgeglichen wird.

Eine negative Regulation der Autoaggregation bei P. aeruginosa wurde dagegen von

DRENKARD u. AUSUBEL (2002) beschrieben. Die Autoren stellten einen

Phasenvariationsmechanismus in den Vordergrund, der einen phänotypischen Switch einer

antibiotikaresistenten und autoaggregativen SCV von P. aeruginosa PA14 zur Wildtyp-

Revertante verursacht. Es wurde vermutet, dass dieser Switch durch den phänotypischen

69 DISKUSSION

Variant-Regulator PvrR kontrolliert wird. Durch eine Überexpression des Regulatorproteins

konnte die Rate des phänotypischen Switch von der rauen SCV zum Wildtyp erhöht werden.

Allerdings wurde durch ein Knockout des pvrR-Gens kein phänotypischer Switch vom

Wildtyp zur rauen SCV erreicht. Es wurde von den Autoren vermutet, dass das Protein nicht

direkt am Switch beteiligt ist, sondern nur die für den Switch erforderlichen Faktoren

reguliert.

Eine in trans Expression des pvrR-Gens in der 25/C1 konnte zwar den Phänotyp des WT

20265 nicht wieder herstellen, jedoch ließen sich elektronenmikroskopisch keine

Fimbrienstrukturen mehr auf der Zelloberfläche der Mutante darstellen. Durch

Sequenzanalysen des pvrR-Gens wurde deutlich, dass das Protein PvrR eine EAL-Domäne

besitzt (Abb. 12). Die EAL-Domäne ist wie die GGDEF-Domäne eine konservierte Domäne

und wurde als Erstes in einer Studie des BvgR-Proteins in Bordetella pertussis beschrieben

(MERKEL et al. 1998). Die EAL-Domäne kommt wie die GGDEF-Domäne häufig in

bakteriellen Proteinen vor (GALPERIN et al. 2001). P. aeruginosa PAO1 besitzt 23 Proteine

mit einer EAL-Domäne (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml).

70 DISKUSSION

PvrR

PA4843

PA1120

PA4601

Abbildung 12: Darstellung der GGDEF-Domäne bzw. EAL-Domäne in den Proteinen PvrR,

PA4843, PA1120 und PA4601.

Der Response Regulator PA4843 eines Zweikomponentensystems ist in der Transposonmutante

25/C1 differenziell exprimiert. Seine GGDEF-Domäne beeinflusst möglicherweise die

cup-Genexpression in der 25/C1 positiv, während die EAL-Domäne im phänotypischen Variant-

Regulator PvrR den Biofilm-Phänotyp negativ kontrolliert. Mutationen in den Genen PA1120 und

PA4601 der SCV 20265 führen zu einem schnell wachsenden Phänotyp und zu einem Verlust der

Autoaggregation. Beide kodieren sie Proteine mit einer GGDEF-Domäne und PA4601 zusätzlich eine

EAL-Domäne. Die Abbildungen dieser vier Proteine wurden der Datenbank Pfam für Protein families

database of alignments and HMMs (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml) entnommen.

Untersuchungen über regulatorische Proteine mit einer GGDEF-Domäne und einer EAL-

Domäne zeigten, dass diese Proteine möglicherweise eine Diguanylat-Zyklase- bzw. eine

Phosphodiesterase A-Aktivität besitzen. Die Diguanylat-Zyklase und die Phosphodiesterase A

sind Enzyme im Zellulosebiosyntheseweg. In einer ausführlichen Studie über die

Zellulosebiosynthese (ROSS et al. 1991) am gramnegativen Bakterium Gluconacetobacter

xylinum wurde beschrieben, dass die Diguanylat-Zyklase und die Phosphodiesterase A für die

Umsetzung eines neu entdeckten Signalmoleküls verantwortlich sind: das zyklische di-GMP

http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml

71 DISKUSSION

(c-di-GMP). Das c-di-GMP besteht aus zwei Molekülen GMP mit zwei 5' zu 3'

Phosphorylbindungen (ROSS et al. 1987) und ist im Zellulosebiosyntheseweg ein spezifisch

positiver Nukleotidregulator, oder anders ausgedrückt, ein reversibler allosterischer Effektor

der β-1,4-Glucan (Zellulose)-Synthase (ROSS et al. 1991; TAL et al. 1998). Durch die

Bindung des c-di-GMP erhält die Zellulosesynthase die Fähigkeit, Glukose zu polymerisieren.

Während die Synthese des c-di-GMP durch die Diguanylat-Zyklase katalysiert wird, erfolgt

der Abbau des c-di-GMP durch die Phosphodiesterase A. Neuere Studien zeigen, dass die

GGDEF-Domäne als Bestandteil der Diguanylat-Zyklase vermutlich für die Biosynthese des

c-di-GMP verantwortlich ist (TAL et al. 1998; PEI u. GRISHIN 2001), während die EAL-

Domäne die Aktivität der Phosphodiesterase A und damit den Abbau des c-di-GMP zu

beeinflussen scheint (GALPERIN et al. 2001). So gibt es zunehmend Hinweise, dass

regulatorische Proteine mit einer GGDEF-Domäne und einer EAL-Domäne für die

Umsetzung des c-di-GMP verantwortlich sind. Die weite Verbreitung dieser beiden Domänen

in regulatorischen Proteinen von Proteobakterien weist auf ein bedeutendes regulatorisches

System hin. So sind die GGDEF- und die EAL-Domäne nicht nur an dem

Zellulosebiosyntheseweg beteiligt, sondern scheinen, wie bereits erwähnt, eine bedeutende

Regulatorfunktion für die Exopolysaccharidproduktion, die Autoaggregation und

Biofilmbildung zu besitzen. Dem c-di-GMP kommt möglicherweise als intrazelluläres

Signalmolekül eine Schlüsselrolle zu. Vor diesem Hintergrund kann man spekulieren, dass

die cup-Genexpression und damit möglicherweise der autoaggregative Phänotyp von

P. aeruginosa durch die Domänen GGDEF und EAL über die Umsetzung des c-di-GMP

reguliert werden (Abb. 13).

72 DISKUSSION

Abbildung 13: Darstellung der intrazellulären Signalkaskade, die möglicherweise zu einem

Biofilm-Phänotyp bei P. aeruginosa führt.

Die GGDEF-Domäne in regulatorischen Proteinen, wie z. B. WspR oder PA4843 beeinflusst über die

Biosynthese des neuen Signalmoleküls zyklisches di-GMP (c-di-GMP) möglicherweise die

cup-Genexpression in P. aeruginosa positiv. Es werden Cup-Fimbrien auf der Zelloberfläche

exprimiert und ein autoaggregativer Phänotyp entsteht. Eine negative Regulation des Biofilm-

Phänotyps entsteht dagegen über den Abbau des c-di-GMP durch die EAL-Domäne z. B. im

phänotypischen Variant-Regulator PvrR. Das c-di-GMP spielt möglicherweise als intrazelluläres

Signalmolekül eine Schlüsselrolle beim phänotypischen Switch.

5.1.2 Mutationen in den Genen mutS und mutL führen zu einem schnell

wachsenden Phänotyp ähnlich der Revertante 20265

Unter den Transposonmutanten der SCV 20265 befinden sich Mutanten mit einer

Transposoninsertion in den Genen mutS (PA3620) und mutL (PA4946). Auffällig ist, dass

diese Mutanten den Phänotyp der in vitro generierten Revertante 20265 auf Blutagar zeigen

(Abb. 14).

Signale aus der Umwelt Temperatur?

GGDEF-Domäne(WspR, PA4843, andere Proteine?)

EAL-Domäne(PvrR, andere Proteine?)

putativeFimbrienstrukturen

autoaggregativer SCV-Phänotyp

c-di-GMP

c-di-GMP

73 DISKUSSION

SCV SCV-Tn5-M R 7 REV

Abbildung 14: Wachstum der zwei Morphotypen SCV und Revertante des P. aeruginosa-

Stammes 20265 und der Transposonmutante SCV-Tn5-M R7 der mutagenisierten SCV 20265

auf Agar-Platten.

Koloniemorphologie der SCV und der klonalen Revertante (REV) 20265 im Vergleich zur Mutante

SCV-Tn5-M R7 auf Columbia-Blutagar nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C.

Die Proteine dieser Gene gehören zum DNA-Reparatur-System, welches nach dem Einbau

falscher Basen bei der DNA-Synthese aktiviert wird. Besonders genau wurde dieser

Mechanismus bei Escherichia coli studiert. Mutationen in den Genen mutS und mutL führen

zu den so genannten Hypermutatoren, die eine erhöhte Mutationsrate genomweit aufweisen.

Untersuchungen mit klinischen P. aeruginosa-Isolaten von CF-Patienten zeigten, dass 36%

der Patienten mit Hypermutatoren kolonisiert sind, die für Jahre in den meisten Patienten

persistieren. Dagegen wurden keine Hypermutatoren in Patienten mit einer akuten

P. aeruginosa-Infektion gefunden (OLIVER et al. 2000). Die Hypermutatoren scheinen in

dem heterogenen Habitat der CF-Lunge gegenüber dem Wildtyp besondere Selektionsvorteile

zu besitzen. Mit einem defekten DNA-Reparatur-System ist die Wahrscheinlichkeit auch

vorteilhafte Mutationen zu erhalten, größer als mit einem funktionsfähigen System.

Es ist zwar denkbar, dass die alleinige Mutation in den Genen mutS und mutL in der SCV

20265 zu einem schnell wachsenden Phänotyp ähnlich der Revertante 20265 führt.

Wahrscheinlicher ist jedoch, dass die in vitro erzeugten Hypermutatoren durch ihr defektes

DNA-Reparatursystem offensichtlich sekundäre Mutationen aufweisen, die auf Blutagar ein

schnelles Wachstum zulassen. Da allein die Mutanten mit einem defekten DNA-

Reparatursystem den Phänotyp der Revertante 20265 zeigen, ist es denkbar, dass sekundäre

Punktmutationen, die durch Transposoninsertionen nicht erzeugt werden können, für den

Revertanten-Phänotyp verantwortlich sind.

74 DISKUSSION

5.2 Ausblick

Die mikrobiologische Besonderheit von P. aeruginosa, in der CF-Lunge morphologische

Varianten zu bilden, die sich als so genannte Nischenspezialisten besonders gut an ihr Habitat

anpassen, trägt maßgeblich zur Persistenz des Erregers in der CF-Lunge bei. Selbst eine

intensive Chemotherapie vermag den Erreger aus der chronisch infizierten CF-Lunge nicht

mehr zu eliminieren. In dieser Arbeit konnte in vitro gezeigt werden, dass Mutationen zu

einem phänotypischen Switch bei P. aeruginosa führen. Allerdings sollten zukünftige

Untersuchungen klären, welche Rolle die in dieser Arbeit beschriebenen Cup-Fimbrien in

vivo spielen, d. h. welche Bedeutung den Cup-Fimbrien bei der P. aeruginosa-

Biofilmentwicklung in der CF-Lunge zu kommt und ob die SCVs durch die Expression der

Cup-Fimbrien tatsächlich Selektionsvorteile erhalten. Des Weiteren sollte ihre mögliche Rolle

als Virulenzfaktoren bei P. aeruginosa nicht unbeachtet bleiben. Gegenwärtig werden in

unserer Arbeitsgruppe klinische SCVs von P. aeruginosa, die aus dem Respirationstrakt von

CF-Patienten isoliert wurden, mit einem polyklonalen Antikörper auf die Expression von

Cup-Fimbrien untersucht. Besonders interessant ist es, die Lokalisation der SCVs mit Cup-

Fimbrien direkt im Lungengewebe (Explantat) von transplantierten CF-Patienten zu

identifizieren und dadurch ihre Nische zu lokalisieren.

75 ZUSAMMENFASSUNG

6. Zusammenfassung

Verena Wild

Molekulare Charakterisierung von langsam wachsenden Subpopulationen (small

colony variants) von Pseudomonas aeruginosa isoliert aus dem Respirationstrakt von

Mukoviszidosepatienten

Pseudomonas aeruginosa trägt bei Patienten mit Cystischer Fibrose (CF) in Form einer

chronischen Lungeninfektion maßgeblich zur Morbidität und Mortalität bei. Obwohl die

Mehrzahl der Patienten nur mit einem P. aeruginosa-Klon kolonisiert sind, entsteht in dem

sehr heterogenen und sich ständig wechselnden Habitat der CF-Lunge eine große

morphologische Differenzierung des Erregers. So werden neben dem mukoiden

P. aeruginosa-Phänotyp, dessen exzessive Exopolysaccharidbildung (Alginat) eine wichtige

Rolle bei der Pathogenese der chronischen Lungeninfektion zugeschrieben wird, so genannte

small colony variants (SCVs) aus dem Respirationstrakt von CF-Patienten isoliert. Es konnte

gezeigt werden, dass das Auftreten von SCVs mit schlechten Lungenfunktionsparametern und

einer inhalativen Antibiotikatherapie korreliert und diese nach mehreren Passagen in

reichhaltigem Flüssigmedium zu einem schnell wachsenden Phänotyp revertieren.

Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung der molekularbiologischen Zusammenhänge, die zu

diesem phänotypischen Switch bei P. aeruginosa in der CF-Lunge führen und insbesondere

den SCV-Phänotyp entstehen lassen. Besondere Aufmerksamkeit wurde dabei einer

klinischen Subgruppe von autoaggregativen und hyperpilierten SCVs geschenkt, die

scheinbar mit ihrer erhöhten Fähigkeit zur Biofilmbildung in der einzigartigen Umwelt der

CF-Lunge selektioniert werden. Mit der Hypothese, dass Mutation und Selektion die

treibenden Kräfte der morphologischen Differenzierung sind, wurde eine

Transposonmutagenese mit einer SCV und einem Wildtyp eines klinischen P. aeruginosa-

Stammes durchgeführt. Einzelne Gene, deren Mutationen zu einem langsam oder schnell

wachsenden Phänotyp bei P. aeruginosa führen, sollten auf diesem Wege identifiziert

werden.

Im Wildtyp eines klinischen P. aeruginosa-Stammes führten 20 unterschiedliche Mutationen

zu einem langsam wachsenden Phänotyp und in der zum Wildtyp klonalen SCV führten 11

76 ZUSAMMENFASSUNG

unterschiedliche Mutationen zu einem schnell wachsenden Phänotyp. Beim Vergleich der

Transposonmutanten in ihrer Koloniemorphologie ließ sich insbesondere unter den langsam

wachsenden Mutanten eine erhebliche Variabilität feststellen. Allerdings scheint langsames

Wachstum und Autoaggregation bei P. aeruginosa miteinander verknüpft zu sein.

Die nähere Untersuchung einer langsam wachsenden und autoaggregativen

Transposonmutante (25/C1) zeigte eine Hochregulation der P. aeruginosa chaperone/ usher

pathway (cup)-Gene. Offensichtlich kodieren die (cup)-Gene für Fimbrienstrukturen auf der

Bakterienzelloberfläche und ihre Expression ist möglicherweise für einen autoaggregativen

Phänotyp von P. aeruginosa verantwortlich.

Die Ergebnisse in dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die cup-Genexpression und damit der

autoaggregative Phänotyp von P. aeruginosa möglicherweise durch Proteine mit einer

GGDEF-Domäne positiv reguliert wird, während eine negative Regulation der

cup-Genexpression in P. aeruginosa durch eine weitere Domäne und zwar durch die

EAL-Domäne im phänotypischen Variant-Regulator PvrR erfolgt. Die Expression der

Fimbrienstrukturen auf der Bakterienzelloberfläche bei P. aeruginosa könnte also in

antagonistischer Weise durch Regulatorproteine mit einer GGDEF-Domäne und einer EAL-

Domäne über die Umsetzung des neuen Signalmoleküls zyklisches di-GMP beeinflusst

werden. Das zyklische di-GMP spielt als intrazelluläres Signalmolekül dabei möglicherweise

eine Schlüsselrolle beim phänotypischen Switch von P. aeruginosa.

77 SUMMARY

7. Summary

Verena Wild

Molecular characterization of slow growing subpopulations (small colony variants) of

Pseudomonas aeruginosa isolated from the respiratory tract of cystic fibrosis

patients

Chronic Pseudomonas aeruginosa lung infection is the major cause of morbidity and

mortality in patients with cystic fibrosis (CF). Although most CF patients are colonised with

only one P. aeruginosa clone, the pathogen exhibits a substantial morphotypic diversity in the

heterogeneous and ever-changing habitat of the CF lung. Apart from the mucoid P.

aeruginosa phenotype whose excessive exopolysaccharide (alginate) production obviously

plays a major role in the pathogenesis of CF, it has been recognised that so called small

colony variants (SCVs) can be isolated from the respiratory tract of CF patients. The recovery

of SCVs correlates with poor lung function parameters and inhaled antibiotic therapy.

Another distinct feature of the SCVs was their reversion after several passages in rich medium

to a fast growing phenotype.

The aim of this study was to identify the molecular mechanism that lead to a phenotypic

switch of P. aeruginosa in the CF lung and particularly the emergence of SCVs. Attention

was focused on a clinical subgroup of autoaggregative and hyperpiliated SCVs with an

increased capability of biofilm formation, which apparently select in the unique environment

of the CF lung. With the aim to verify the hypothesis that mutation and selection are the

driving forces for morphologic diversity, a transposon mutagenesis of a SCV and wildtype P.

aeruginosa strain was carried out.

In the wildtype of a clinical P. aeruginosa strain 20 different mutations led to a slow growing

phenotype and 11 different mutations in the clonal SCV led to a fast growing phenotype.

Among the transposon mutants a substantial diversity in their colony morphology particularly

among the slow growing mutants occurred. Nevertheless, it seemed that slow growth and

autoaggregation in P. aeruginosa were linked.

The characterisation of an autoaggregative and slow growing transposon mutant (25/C1)

exhibited an upregulation of the P. aeruginosa chaperone/ usher pathway (cup) genes.

78 SUMMARY

Apparently the (cup) genes encode for fimbrial structures on the bacteria surface and their

expression may be responsible for the autoaggregative phenotype of P. aeruginosa.

The results of this study implicate the expression of the cup genes (and therefore the

autoaggregative phenotype of P. aeruginosa) might be positively regulated by proteins with a

GGDEF domain, whereas a negative regulation of the cup gene expression in P. aeruginosa

be caused by the EAL domain containing phenotype variant regulator (PvrR). The expression

of the fimbrial structures on the bacteria surface at P. aruginosa could be influenced by

regulator proteins containing a GGDEF domain and EAL domain in an antagonising way. The

novel intracellular signal molecule cyclic di-GMP might play a key role in the phenotypic

switch of P. aeruginosa.

79 LITERATURVERZEICHNIS

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102 ANHANG

9. Anhang

9.1 Chemikalien

• Agarose Seakem LE, Biozym

• Ampuwa (Wasser für Injektionszwecke), Bayer AG

• Borsäure, Merck

• Bromphenolblau, Sigma

• Calciumchlorid Dihydrat, Sigma

• Carbenicillin Na2-salz, Serva

• CDP-Star, Roche Diagnostics

• Citric acid (Zitronensäure), Sigma

• CSPD, Tropix/ PE Applied Biosystems

• DEPC, Applichem

• Ethanol absolut, J. T. Baker

• Ethidiumbromidlösung, Roth

• Formaldehyde (Formalin) für Molekularbiologie, Sigma

• Formamide für Molekularbiologie, Sigma

• Gentamicin Solution (Gentamicin-Lösung), Sigma

• Gluconic acid (Glukonsäure), Sigma

• Glycerol 99% für Molekularbiologie, Sigma

• Glyzerin absolut, Merck

• Isopropanol (2-Propanol), Merck

• Kaliumdihydrogenphosphat, Merck

• di-Kaliumhydrogenphosphat, Merck

• di-Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat, Merck

• Magnesiumchlorid-Hexahydrat, Merck

• Magnesiumsulfat, Sigma

• Maleic acid (Maleinsäure), Sigma

• 2-Mercaptoethanol, Sigma

• MOPS, Serva

103 ANHANG

• Natriumacetat für Molekularbiologie, Sigma

• Natriumammoniumhydrogenphosphat-Tetrahydrat, Fluka Chemie GmbH

• Natriumchlorid, Merck

• Natriumcitrat-Dihydrat, J. T. Baker

• Natriumhydroxid, Merck

• Nujol Mineral Oil, PE Applied Biosystems

• Salzsäure mind. 37%, Riedel-de Haën AG

• SDS, Sodium dodecyl sulfate für Molekularbiologie, Sigma

• Sucrose (Saccharose), Sigma

• Titriplex® III (EDTA), Merck

• TRIS, Serva

• Tween-20 (Polyoxyethylenesorbitan Monolaurate) für Molekularbiologie, Sigma

• Xylencyanol FF, Applichem

9.2 Gebrauchsmaterialien

• 0.5 und 1.5 ml Mikroreaktionsgefäße, Sarstedt

• 25 und 50 ml Polypropylen Falcons, Greiner bio-one, Cellstar

• Faltenfilter, Schleicher & Schull

• Filterpapier, Whatman

• 96-well-Platten für Suspensionskultur, Greiner bio-one

• Polystyrolröhrchen, Greiner

• Petrischalen, Sarstedt

• Küvetten für OD-Messung, Sarstedt

• Gene Pulser/ E. coli Pulser Cuvettes, Bio-Rad

• Nylonmembranen: Hybond-N für Southern Blot, Hybond-N+ für Northern Blot,

Amersham Biosciences

• Röntgenhyperfilm: MP Envelope, Amersham Biosciences

104 ANHANG

9.3 Geräte

• Brutschrank, Heraeus

• Easy Enhanced Analysis System (Easy RH-3, Videokamera 429K)

• Elektrophoresekammern: Bio-Rad; Mini M, Peqlab

• Gefriertruhen, Heraeus

• Gene Pulser, Bio-Rad

• Hybridisierungsofen, Biometra

• Inkubationsschüttler TH30, Edmund Bühler

• Labortiefkühlschrank, Liebherr

• Netzgeräte: Phero-stab. 500, Biotec Fischer; 200/ 2.0 Power Supply, Bio-Rad

• pH-Meter 761 Calimatic, Knicke

• Photometer Ultraspec III, Pharmacia LKB

• Schüttler Unimax 2010, Heidolph Instruments

• Sicherheitswerkbank HS 18/2, Heraeus

• SpeedVac-Concentrator, Savant

• Thermomixer 5436, Eppendorf

• Thermocycler Genius, Techne

• Thermocycler Landgraf

• UV Stratalinker 1800, Stratagene

• Waagen: PL 1200, Mettler; BP 211 D, Sartorius; 3719 MP, Sartorius

• Wasserbäder: 1002, GFL; 1003, GFL

• Zentrifugen: Biofuge 13 und fresco, Heraeus

Kühlzentrifuge Modell, J2-21, Beckmann

Minifuge GL, Heraeus

Tischzentrifuge Typ 1000, Hettich

105 ANHANG

9.4 Untersuchung der Transposonmutanten des WT 20265 auf

langsames Wachstum und Autoaggregation

Tabelle 7: WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Columbia-Blutagar und Müller-

Hinton-Agar.

Tn5-Mutante Columbia-Blutagar Müller-Hinton-Agarsehrklein

klein(SCVs)

mittel groß sehrklein

klein(SCVs)

mittel groß

WT-Tn5-M24/A3

X X

WT-Tn5-M24/A11

X X

WT-Tn5-M24/B1

X X

WT-Tn5-M24/E1

X X

WT-Tn5-M24/E4

X X

WT-Tn5-M24/E7

X X

WT-Tn5-M24/E8

X X

WT-Tn5-M24/F5

X X

WT-Tn5-M24/G11

X X

WT-Tn5-M24/H4

X X

WT-Tn5-M24/H8

X X

WT-Tn5-M25/B3

X X

WT-Tn5-M25/C1

X X

WT-Tn5-M25/E1

X X

WT-Tn5-M2C

X X

WT-Tn5-M3E

X X

WT-Tn5-M13A

X X

WT-Tn5-M14F

X X

WT-Tn5-M18A

X X

WT-Tn5-M18C

X X

106 ANHANG


klein(SCVs)

mittel groß Sehrklein

klein(SCVs)

mittel groß

WT-Tn5-M18F

X X

WT-Tn5-M24C

X X

WT-Tn5-M24E

X X

WT-Tn5-M 33C

X X

WT-Tn5-M34B

X X

WT-Tn5-M34C

X X

WT-Tn5-M37B

X X

WT-Tn5-M37D

X X

WT-Tn5-M37E

X X

WT-Tn5-M41D

X X

WT-Tn5-M42B

X X

WT-Tn5-M43A

X X

Tabelle 8: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Columbia-

Blutagar und Müller-Hinton-Agar auf autoaggregatives Wachstum.

Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 24/A3 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/A11 Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/B1 Aggregate, kein Rand, klarWT-Tn5-M 24/E1 Keine Aggregate, leichter Rand, homogen molkigWT-Tn5-M 24/E4 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/E7 Homogen milchig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/E8 1-2 größere Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/F5 Kleine Aggregate, kleiner Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 24/G11 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/H4 Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 24/H8 3-4 Aggregate, kein Rand, molkig > eher wie WT 20265WT-Tn5-M 25/B3 Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/C1 Wenige Aggregate, sehr leichter Rand, molkigWT-Tn5-M 25/E1 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 2C Wächst nicht anWT-Tn5-M 3E Homogen wäßrig-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 13A Homogen milchig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 14F Viele sehr feine Aggregate, kein Rand, molkig

107 ANHANG

Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 18A Homogen milchig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 18C Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 18F Aggregate, kein Rand, molkigWT-Tn5-M 24C Wächst nicht anWT-Tn5-M 24E Wächst nicht anWT-Tn5-M 33C Aggregate, leichter Rand, molkigWT-Tn5-M 34B Homogen grün-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 34C Sehr feine Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 37B Aggregate, kein Rand, milchig-grünWT-Tn5-M 37D Kleine Aggregate, leichter Rand, milchigWT-Tn5-M 37E Homogen molkig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 41D Wächst nicht anWT-Tn5-M 42B Homogen molkig-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 43A Aggregate, kein Rand, milchig

Tabelle 9: WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Müller-Hinton-Agar und einem

schnellen Wachstum auf Columbia-Blutagar.


klein(SCVs)


klein(SCVs)

mittel groß

WT-Tn5-M24/A1

X X

WT-Tn5-M24/A12

X X

WT-Tn5-M24/B3

X X

WT-Tn5-M24/B5

X X

WT-Tn5-M24/B6

X X

WT-Tn5-M24/C3

X X

WT-Tn5-M24/C4

X X

WT-Tn5-M24/D7

X X

WT-Tn5-M24/D8

X X

WT-Tn5-M24/D9

X X

WT-Tn5-M24/E5

X X

WT-Tn5-M24/E11

X X

WT-Tn5-M24/F6

X X

108 ANHANG


klein(SCVs)


klein(SCVs)

mittel groß

WT-Tn5-M24/F7WT-Tn5-M24/F10

X X

WT-Tn5-M24/G6

X X

WT-Tn5-M24/G9

X X

WT-Tn5-M24/H2

X X

WT-Tn5-M24/H5

X X

WT-Tn5-M24/H6

X X

WT-Tn5-M24/H7

X X

WT-Tn5-M25/A2

X X

WT-Tn5-M25/A5

X X

WT-Tn5-M25/A9

X X

WT-Tn5-M25/A11

X X

WT-Tn5-M25/B2

X X

WT-Tn5-M25/B4

X X

WT-Tn5-M25/B5x

X X

WT-Tn5-M25/B5

X X

WT-Tn5-M25/B6x

X X

WT-Tn5-M25/B6

X X

WT-Tn5-M25/C6

X X

WT-Tn5-M25/C8

X X

WT-Tn5-M25/D1

X X

WT-Tn5-M25/D2

X X

WT-Tn5-M25/D12

X X

WT-Tn5-M1A

X X

WT-Tn5-M1B

X X

WT-Tn5-M1C

X X

109 ANHANG


klein(SCVs)


klein(SCVs)

mittel groß

WT-Tn5-M1D

X X

WT-Tn5-M1F

X X

WT-Tn5-M2D

X X

WT-Tn5-M2E

X X

WT-Tn5-M3D

X X

WT-Tn5-M4A

X X

WT-Tn5-M4C

X X

WT-Tn5-M4D

X X

WT-Tn5-M5C

X X

WT-Tn5-M5F

X X

WT-Tn5-M7C

X X

WT-Tn5-M7D

X X

WT-Tn5-M7F

X X

WT-Tn5-M8F

X X

WT-Tn5-M9C

X X

WT-Tn5-M9D

X X

WT-Tn5-M9E

X X

WT-Tn5-M10B

X X

WT-Tn5-M10C

X X

WT-Tn5-M12B

X X

WT-Tn5-M15A

X X

WT-Tn5-M15E

X X

WT-Tn5-M16B

X X

WT-Tn5-M16C

X X

WT-Tn5-M17E

X X

WT-Tn5-M28D

X X

110 ANHANG


klein(SCVs)


klein(SCVs)

mittel groß

WT-Tn5-M30F

X X

WT-Tn5-M31A

X X

WT-Tn5-M31C

X X

WT-Tn5-M32C

X X

WT-Tn5-M35B

X X

WT-Tn5-M39B

X X

WT-Tn5-M41E

X X

Tabelle 10: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Müller-Hinton-

Agar und einem schnellen Wachstum auf Columbia-Blutagar auf autoaggregatives Wachstum.

Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 24/A1 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/A12 Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/B3 Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/B5 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/B6 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/C3 3-4 Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/C4 Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/D7 Homogen molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/D8 Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/D9 Aggregate, kein Rand, grünWT-Tn5-M 24/E5 Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/E11 Leichte Aggregatbildung, kein Rand, türkisWT-Tn5-M 24/F6 Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/F7 Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/F10 Wächst nicht anWT-Tn5-M 24/G6 Wächst nicht anWT-Tn5-M 24/G8 Aggregate, leichter Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 24/G9 Wächst nicht anWT-Tn5-M 24/H2 Homogen > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/H5 Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 24/H6 Wenige Aggregate, leichter Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 24/H7 Wenige Aggregate, leichter Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 25/A2 Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 25/A5 Homogen molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 25/A9 Aggregate, Rand, molkigWT-Tn5-M 25/A11 Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/B2 Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/B4 Wächst nicht an

111 ANHANG

Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 25/B5x Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/B5 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 25/B6x Wächst nicht anWT-Tn5-M 25/B6 Wächst nicht anWT-Tn5-M 25C6 Einzelne kleine u. große Aggregate, leichter Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 25/C8 Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 25/D1 Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 25/D2 Aggregate, leichter Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 25/D12 Homogen molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 1A Homogen gelb-grün > wie WT 20265WT-Tn5-M 1B Sehr geringe Anzahl an kleinen Flocken, leichter Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 1C Aggregate, deutlicher Rand, gelb-grünWT-Tn5-M 1D Homogen gelblich > wie WT 20265WT-Tn5-M 1F Sehr kleine Aggregate, kein Rand, molkigWT-Tn5-M 2D Wenige kleine Aggregate, leichter Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 2E Kleine Aggregate, kein Rand, grün-wässrigWT-Tn5-M 3D Wenige Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 4A Homogen grün-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 4C Homogen grün-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 4D Homogen grün-molkig > wie WT 20265WT-Tn5-M 5C Wächst nicht anWT-Tn5-M 5F Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 7C Kleine Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 7D Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 7F Viele kleine Aggregate, kein Rand, grün-wässrigWT-Tn5-M 8F Homogen milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 9C Viele Aggregate, deutlicher Rand, grün-wässrigWT-Tn5-M 9D Wächst nicht anWT-Tn5-M 9E Wächst nicht anWT-Tn5-M 10B Wenige kleine Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 10C Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 12B Wenige kleine Aggregate, kein Rand, molkigWT-Tn5-M 15A Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 15E Sehr kleine zahlreiche Aggregate, Rand, grün-klarWT-Tn5-M 16B Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 16C Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 17E Homogen grün-milchig > wie WT 20265WT-Tn5-M 28D Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 30F Aggregate, leichter Rand, milchigWT-Tn5-M 31A Aggregate, leichter Rand, milchigWT-Tn5-M 31C Wächst nicht anWT-Tn5-M 32C Wächst kaum an > wie WT 20265WT-Tn5-M 35B Wächst nicht anWT-Tn5-M 39B Aggregate, kein Rand, molkigWT-Tn5-M 41E Wächst nicht an

112 ANHANG

Tabelle 11: Autoaggregative WT-Tn5-Mutanten mit einem intermediären bis schnellen Wachstum auf

Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar.


klein(SCVs)


klein(SCVs)

mittel groß

WT-Tn5-M24/A2

X X

WT-Tn5-M24/A4

X X

WT-Tn5-M24/A6

X X

WT-Tn5-M24/D10

X X

WT-Tn5-M25/B11

X X

WT-Tn5-M25/C9

X X

WT-Tn5-M25/D5

X X

WT-Tn5-M25/D8

X X

WT-Tn5-M5B

X X

WT-Tn5-M14C

X X

WT-Tn5-M17A

X X

WT-Tn5-M30D

X X

WT-Tn5-M31D

X X

WT-Tn5-M31E

X X

WT-Tn5-M33E

X X

WT-Tn5-M43D

X X

Tabelle 12: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem intermediären bis schnellen Wachstum

auf Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar auf autoaggregatives Wachstum.

Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 24/A2 Kleine Aggregate, deutlicher Rand, milchigWT-Tn5-M 24/A4 Kleine Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 24/A6 Wenige kleine Aggregate, sehr leichter Rand, molkigWT-Tn5-M 24/D10 Aggregate, deutlicher Rand, milchig-grünWT-Tn5-M 25/B11 Keine Aggregate, leichter Rand, gelb-grün milchikWT-Tn5-M 25/C9 Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 25/D5 Aggregate, deutlicher Rand, molkig

113 ANHANG

Tn5-Mutante AggregateWT-Tn5-M 25/D8 Aggregate, leichter Rand, molkigWT-Tn5-M 5B Kleine Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 14C Sehr kleine Aggregate, Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 17A Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 30D Kleine Aggregate, kein Rand, grün-molkigWT-Tn5-M 31D Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 31E Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 33E Aggregate, deutlicher Rand, molkigWT-Tn5-M 43D Kleine Aggregate, deutlicher Rand, grün-molkig

9.5 Untersuchung der Transposonmutanen der SCV 20265 auf

schnelles Wachstum und Autoaggregation

Tabelle 13: Untersuchung der SCV-Tn5-Mutanten auf ein schnelles Wachstum auf Columbia-Blutagar

und autoaggregatives Wachstum.

Tn5-Mutante Columbia-Blutagar BiofilmbildungSCV-Tn5-M 1A groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1C groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 1E groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1F groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1G groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1L groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 1O groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1P groß > ähnlich WT 20265 kein vollständiger Verlust der Biofilmb.SCV-Tn5-M 1Q groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1R groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1T groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2A groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2E groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 2F groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2H groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2J groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 2L groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 2M groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 3A groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 3B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 3D groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3E groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3F groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3K groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 4B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265

114 ANHANG

Tn5-Mutante Columbia-Blutagar BiofilmbildungSCV-Tn5-M 4C groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4H groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4I groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4J groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4K groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4L groß > ähnlich WT 20265 kein vollstäniger Verlust der Biofilmb.SCV-Tn5-M 4M groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5D groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5F groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5G groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5H groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5J groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5K groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6A groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6B groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6D groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6E groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6F groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6G groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6H groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6K groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6L groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6M groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6N groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6O groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6Q groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6R groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6S groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6T groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6V groß > ähnlich WT 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 7A groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8A groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8B groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8C groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8D groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8F groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R3 groß > ähnlich WT 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R4 groß > zwischen WT u. REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R5 groß > zwischen WT u. REV 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1D groß > ähnlich REV 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 11A groß > ähnlich REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R1 groß > ähnlich REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R2 groß > ähnlich REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R6 groß > ähnlich REV 20265 homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M R7 groß > ähnlich REV 20265 wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1H intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1I intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1J intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 1M intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 1N intermediär kein vollständiger Verlust der Biofilmb.SCV-Tn5-M 2C intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 2P intermediär homogen > wie WT 20265

115 ANHANG

Tn5-Mutante Columbia-Blutagar BiofilmbildungSCV-Tn5-M 3C intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3G intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3H intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3J intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3L intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3M intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 3N intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 4A intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 4F intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 4G intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 5A intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5C intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 5E intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5I intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5L intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5M intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 5N intermediär wie SCV 20265SCV-Tn5-M 6I intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 6U intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 8E intermediär homogen > wie WT 20265SCV-Tn5-M 9A Intermediär wie SCV 20265

9.6 Experimentell ermittelte Sequenzen: Transposonmutanten

des WT 20265

Mutante 24/A3:

CGAGCTTCGGGTTGAGAGTGTATAAGAGACAGGCCGCGCGCCGACGGCCGCAGCTATCGCGAGCAGATCACCTTC

GTCAAGGATCGTCCGGGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGACATCTGCATCGAGAC

CGGCGAGACCGTCTACATCCGTTCCAAGGCCGTGGTCCTGGCCACTGGCGGTGCCGGCCGTATCTACGCCTCCAC

CACCAACGCGCTGATCAACACCGGTGACGGCGTGGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGC

AGANA

Mutante 24/A11:

AGAGCTTCGGGTTGAGAGTGTATAAGAGACAGGGTCTGGGCCACGGAATGGCTGGATTCGAAGGCCAGGTCGGTG

ACGATCAGGGAACCTTTGTTACCGCGTTTCACGCAGGCCGTGTGATAGGCCATTTCCTCGTTGCTGACCGGCAGG

GTGCTGTCGTGACCCTGCAATACCATTCCGAGCGAATCTCCGACCAGAAGCACGTCCACGCCGGCCTGGCTGGCG

GTGTGGGCGAAGGTGGCGTCGTAGCAGGTCAGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAAATTCGAGCA

116 ANHANG

Mutante 24/E1:

GCATTCGACGCCTACTACGTGTTGTTCAGCTTCCAGCGCATGTGTCCCCGTACATTGTTTACAAGCTTGAATTCG

AGCAGGGTCCTTTTCTTTGGCGACAAGTTAGACTGTCAGGCAAAAAGAAGGGGCGGCGTCTTCCCGATGCCGGTT

TCGTGTAGCTGCGGATACTGGTCGCTGACCCGGTACCTGAAGCGGTCCCTGGTGGGCAGCTCGCGAGCCATGTGT

CCCCGTACATCGTGAGTACCTTGAATTCTTGCCGTTGCTCCCGTAACCTGCCATAAAACCCAGCGAAGCTTCTTC

GGCAGCCATTTTAGAAAAATATATTCCTTTAATTTCAATAAGTTACTTAAATTCACCGAGCGTTTTTTGTTATCC

TCCCGGGCATTTATCTACTTAGGCTCACACGCCGTGTAAGTTAATGCTTACAAGAGCAGACACAAAAAACCCGGC

GAACGCCGGGTCTTCAGTGGGTCTAAGGTTTTCCGTCACTGGAACAGCGCGTCACTCGACAGGCCATTCTTCTCC

AGGATCTCCCGCAGGCGCTTCAGCGCCTCGACCTGGATCTGACGAACCCGCTCGCGGGTCAGGCCGATTTCCTGG

CCGACCTCTTCCAGCGTGCTGCTTTCGTGCCCGCGCAAGCCGAAGCGGCGAATCACCACCTCACGCTGCTTGTCG

GTGAGTTCCGTCAGCCACTGGTCGATGCTTTCGCTGAGATCGTCATCCTGCAGCAGCTCGCACGGGTC

Mutante 24/E4:

ATTCTCGATGATGGTTGAGATGTGTATAAGACACAGGCACCGGGATACTGTGGGTGGTGTCGGTGAGCAGCAGGA

CCCGCGCGGTATAGGGCATCACCTCGACCACCTGGCCCATCAGGCCGCTGGCATCGAGCACCGGCTGGCCGACGA

AGACGCCGTCGTTCTCGCCCTTGTCGATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAAATTCGAGCAGAA

Mutante 24/E7:

ATGAACTTCAGGTTGAGATGGTATTAAAAACAGGTCTTGGACAGTTCGCAGATGCCGGGCAGGCGGCTGTGCAGG

ACTTCCTCGCCGAGGTGGTCGAGCTTCAGCAGCACGTGGTCCTTGTTCGGGCCCACGCCGTTGCCGGCCAGGACT

TCCTTGACCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACTGANAATTTCGAGCAGA

Mutante 24/E8:

AAGAAGTTAGGGTTGAGAGTGTATAAGAGACAGGCCGCGCGCCGACGGCCGCAGCTATCGCGAGCAGATCACCTT

CGTCAAGGATCGTCCGGGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAAATTCGAGCAGA

Mutante 24/F5:

AAGAGCTTAGGATTGAGATGGTTAAGAGAAGTCTCCGAAGTGCTGTCGTCGCCGGAGTACGACGAGCACAAGTCC

ACCGTGCCGCTGGCCCTGGGCCACGACATCGGCGGTCGGCCGATCATCACCGACCTGGCGAAGATGCCGCACCTG

CTGGTGGCCGGTACCACCGGCTCCGGTAAGTCGGTGGGGGTCAACGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACTG

ANATTTCGAGCAGA

117 ANHANG

Mutante 24/G11:

AGGCGCTGACCTTAAGGTTCTCGCCCAAGCAACTGCCCGAGCCGCTGCCGGCCAACTGGTCGATCGCTCCCGCGG

AGGACGGCGAGGTGCTGGTGAGCATCCACGAGCGCTGCGAGTTCAAGGTGGACAGCTACCGTGCGCTGACGGTGA

AGTCCGCCGGCCAGTTGCCCACCGGTTTCGAACCGGGCGAGCTGTACAACTCGCGCTTCCACCCGCGCGGCCTGC

AGATGTCGGTGGTCGCCGCGACCGACGCGATCCGCTCCACCGGCATCGACTGGAAGACCATCGTCGACAACGTCC

AGCCCGACGAGATCGCGGTATTCTCCGGCAGCATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAGTGAAATTTTTNNNAGA

Mutante 24/H4:

ACCCAGCGTGAAGCGTAGAGCGTGGCCAGGTACTGGCCAAGCCGGGCACCATCAAGCCGCACACCAAGTTCGAGT

GCGAAGTGTACGTGCTGTCCAAGGAAGAAGGTGGTCGTCACACCCCGTTCTTCAAGGGCTACCGTCCGCAGTTCT

ACTTCCGTACCACTGACGTGACCGGTAACTGCGAGCTGCCGGAAGGCGTAGAGATGGTAATGCCGGGCGACAACA

TCAAGATGGTTGTCACCCTGATCGCTCCGATCGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAAACTGAATTTTT

Mutante 24/H8:

ATAGAAACTTAGGGTTGAGATGTGTATTAAGAGAACAGACGCCGAGTAGGGACTTGTTCGGCTCGTAGCGGTTGT

TCTCGGTGAAGGCCGGATCGCTCGGTGCCAGCGAGCCATAGACTTCGTCGGTGGAGACATGTGTCCCCGTACATC

GTTAGAACTGGAAATTTCGAGCAGAAGNNNNTGC

Mutante 25/B3:

TACGGTGGACAGACCCCGCTGAAGCTCTGCCGCGCCCTCGAAGAGGCCGGCGTGCCGATCATCGGCACCAGTCCG

GACGCCATCGACCGTGCCGAAGACCGCGAGCGCTTCCAGCAGATGGTCCAGCGCCTGAACCTGCGCCAGCCGGCC

AACGCCACCGCGCGCAGCGAAGACGAGGCCCTGGCCGCGTCCAAGGCCATCGGATATCCGCTGGTGGTACGCCCG

TCCTACGTGCTGGGCGGGCGGGCGATGGAAATCGTCTACCAGGAAGAAGAACTCAAGCGCTACATGTGTCCCCGT

ACATCGTTAAANNAAAATTNNNAAGC

Mutante 25/C1:

TGAATGCCTTGAGTGTTCAGGACCTTCAGGGCTTCCTTGGCGATTTGCTCGTCGGCAGCCGGGAGGAACTTGTCC

AGGGCTTCCAGCACGGTCACCTCGGCACCCAGGCGGGCCCATACCGAACCCAGCTCCAGGCCGATGACGCCGGCG

CCGATCACACCCAGCTTCTTCGGCACGGCCTGGAATTCCAGGGCGCCGGTGGAGTCGACGATGATGTCGTCGGTC

AGCGGGGCCGGCGGGATCTCCACCGGGCGGGAGCCGGAAGCGATGATCACGTTCTCGGCTTCCAGGACCTGGGTC

TTGCCGTCCAGACCGGTCACTTCCACCTGCTTGTTGGCCAGCAGCTTGCCGTGGCCTTCGAAGGAGGTCACGCCG

TTGGCCTTGAACAGGGTAGCGATGCCGCCGGTCAGGTTCTTGACGATGTTGGCCTTGCGCGCAACCATCGCCGGA

ACGTCGATGGTGACGCCCTTGGCTTCGATACCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAATGAAATTTTTC

118 ANHANG

Mutante 25/E1:

ATTCTCGATGATGGTTGAGATGTGTATAAGAGAAGGGGTGAAGGTGGTACTGACCACGAAGAACAGCAGCAGGAC

GAAGATCACGTCGATCAGCGACGCCAGGTTGATGAAGACGTCTTCACGGGCGGCACCCGCCCGTCTGCGGCGGAA

TTTCACGCTTTGCCTTCCTCGACGTAGTCGACTTCACGATCGCCCTGCACCACTTCCACCAGCTTGATGGCCTCC

TGCTCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGGAATTTCGAGCAG

Mutante WT-Tn5-M 2C:

ATGAGTTAGGCTTGAGAATGGTATAAGAAACAGGGCCCAGCCGGGCGGCAGCCTGTCCGGAACCATCCGGGTACC

GGGCGACAAGTCGATTTCCCATCGCTCGATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGGAAATTCGAGCAGA

Mutante WT-Tn5-M 3E:

AAGAGCTTCAGGGTTGAGATGTGTATAAGAGACAGCACCATTGAAGTCGGCGAAAGGACCATCGATGACACGAAC

GGTCTCGCCCGGCTCGAACAGGGTCTTCGGCTTGGGCTTGTCGCCGCTATCGGCCACGCGACGCAGGATTGCATC

AGCCTCACGATCGGTGATCGGAGCCGGCTTGTCGGCAGTCCCGCCGATGAAGCCCATGTGTCCCCGTACATCGTT

AGAAGTGAAATATCCGAGCA

Mutante WT-Tn5-M 13A:

CTGACTCGCTCTCGCCGGGGAAGTCCTCCAGTGGCGGGTGGATGGTCAGGCGATAACCGCTGCCATCGGCCAGGC

GGCTCTGGGTGAACGGCAACACCCGCGCCCGGTCCAGGCGGACGAACTTGGTGGTGGCGGTGACGGTGGCCGCCG

GGATGCCGAACAGCGGCANNNAACAGGCTCTGCTTGGCGCCGTAGTCCTGGTCCGGTGCGTACCAGATGGCGCGG

CCGCCACGCAGCACCTTGAGCATCGAGCGCACGTCCTCGCGCTCGATGGCGGTGGCATCGAGGTTGTGCCGCTCG

CGGCCACGGCGCTGGACGTAGTCGAACACCGGGTTGTCGTGCTCACGGTANNNTGTGTCCCCGTACATCGTTAGA

ANNNAAATTCCNAAA

Mutante WT-Tn5-M 14F:

ATGAAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATTAAGAAGACAGCCCTGGGGCAGATGAGCTGCAACCCCGCCATCGGTGG

CATCGGCAAGAAGCCATCTGGTCAAGGAAATCGACGCCCTTGGCGGCGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAT

TGGAAATTTCGAGCAGANNTGNC

Mutante WT-Tn5-M 18A:

AAAACTTAGGCTTGAGATGGTATAAGAGACAGACCTTGAGCATCGAGCGCACGTCCTCGCGCTCGATGGCGGTGG

CATCGAGGTTGTGCCGCTCGCGGCCACGGCGCTGGACGTAGTCGAACACCGGGTTGTCGTGCTCACGGTACATGT

GTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGGAAATTTCGAGCAGA

119 ANHANG


AAGAACTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACATACCTTGAGCATCGAGCGCACGTCCTCGCGCTCGATGGCGG

TGGCATCGAGGTTGTGCCGCTCGCGGCCACGGCGCTGGACGTAGTCGAACACCGGGTTGTCGTGCTCACGGTACA

TGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGGAAATTTCGAGCAGANA

Mutante WT-Tn5-M 18F:

ACGTGCTTTCANGCTTGAGATGTGTATAAGAAACAGTACCTTGAGCATTCGAGCGCACGTCCTCGCGCTCGATGG

CGGTGGCATCGAGGTTGTGCCGCTCGCGGCCACGGCGCTGGACGTAGTCGAACACCGGGTTGTCGTGCTCACGGT

ACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAATTTCGAGCAGANNCTCGCACCCGCAAATGCCAATGCA


ATTCTCGATGATGGTTGAGATGGTATAAGAGAAGGGGTCTGGGCGTCCACGTCCGGGTTGACCCGCAGCGATACC

GGCGCTTTCACGCCGAGTTCCGCAGCTACCCGTTGCAGGCGCTCCAGCTCTTCGCCGGACTCGACGTTGAAGCAG

TGCACGCCGACTTCCAGGGCGCGGCGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACTGGAAATTCGAGCAGAA

Mutante WT-Tn5-M 34B:

ATGAAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATTAAGAAGACAGATTCAGCCCCCGTGTCGTTTTCGAATTCCGTAGCGAG

AGATGGCCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTGGAATTCGAGCAGANNC


ATGAACTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTCACGCAGGCCGTGTGATAGGCCATTTCCTCGTTGCT

GACCGGCAGGGTGCTGTCGTGACCCTGCAATACCATTCCGAGCGAATCTCCGACCAGAAGCACGTCCACGCCGGC

CTGGCTGGCGGTGTGGGCGAAGGTGGCGTCGTAGCAGGTCAGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACT


AAGAGCTTCAGGTTGAGATGGTTAGAGACAGATATCGGCCTGCGCGCCGCTCGCAGCGCCGGTGAACTGATTTTC

CGCTCCATCGAACGCCTGGATGTCATCTCGGTCAACGAGAAGGATGCCAAGGACTACGTCACCGAAGTCGATCGC

GCCGCCGAGCAGACCATCGTCGCCGCGCTGCGCAAGGCCTATCCGACTCACGCGATCATGTGTCCCCGTACATCG

TTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGA

Mutante WT-Tn5-M 37D:

TGTATAACAGACAGATATCGCCCTGCGCGCCGCTCGCAGCGCCGGTGAACTGATTTTCCGCTCCATCGAACGCCT

GGATGTCATCTCGGTCAACGAGAAGGATGCCAAGGACTACGTCACCGAAGTCGATCGCGCCGCCGAGCAGACCAT

CGTCGCCGCGCTGCGCAAGGCCTATCCGACTCACGCGATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTCC

GAG

120 ANHANG

Mutante WT-Tn5-M 37E:

GGCCTGAGATGTGTATAAGAGACAGATATCGCCCTGCGCGCCGCTCGCAGCGCCGGTGAACTGATTTTCCGCTCC

ATCGAACGCCTGGATGTCATCTCGGTCAACGAGAAGGATGCCAAGGACTACGTCACCGAAGTCGATCGCGCCGCC

GAGCAGACCATCGTCGCCGCGCTGCGCAAGGCCTATCCGACTCACGCGATCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAA

CTNNNATTTCCGAGCA

Mutante WT-Tn5-M 41D:

AAGAACTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGTGGCAGGCGCCCGCCAGCCTCCCCTTCGGCGACTTCGACG

TGGTGCCGCTGCGCGCCGGCGAGACACTCCGCTGGAAACTGCTGGAGGCCGGGGCATGTGTCCCCGTACATCGTT

AGAACTGGAAATTCGAGCAGAGCTGGTGCT


AAAGAACTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGACCCTGTATTTCGTGGCGCGCGGCGATGGCAGCCATGTG

TCCCCGTACATCGTTAGAAGTTTGAATTCGAGCAG

9.7 Experimentell ermittelte Sequenzen: Transposonmutanten der

SCV 20265

Mutante SCV-Tn5-M R1:

CAGAGGAACTCCTGGAAAACAGCCTTGACGCCGGATCCCGGCGCATTGATGTGGAGGTCGAGCAGGGCGGCATCA

AGTTGCTGCGAGTGCGCGACGACGGTCGCGGCATCCCCGCCGACGACCTGCCGCTGGCCCTGGCTCGCCACGCCA

CCAGCAAGATCCGCGAGCTGGAAGACCTGGAGCGGGTGATGAGCCTCGGCTTCCGTGGCGAGGCGCTGGCCTCGA

TCAGCTCGGTAGCGCGCCTGACCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTTCGAGCA


AAGAGCTTAGGGTTGAGATGGTATAAGAGACAGCAGAGGCTCTTGTGCGCCGAGTCGCGATCGAAGTCCCATGTG

TCCCCGTACATCGTTAGAAGCTTGAATTCGAGCAGAAAGTTGGCTAGTGCGTANTCGTTGACAA


CGGTTCACATCTGCGACTGCAGGCAGTTCTCCAGGCCCATCCTGGCGATCAGGCCAAGCTGTTGCTCCAACCAGT

AGGCGTGGTCTTCCTCGGTGTCGGCCAACTGGGCCTTGAGGATGTCGCGGCTGACGAAGTCCTTATGCTGCTCGC

AGAGGGCGATGCCCTTGGCCAGCGCGGCGCGGACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTTC

121 ANHANG


AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAACAAACAGGTTCACATCTGCGACTGCAGGCAGTTCTCCAGGCCCATCC

TGGCGATCAGGCCAAGCTGTTGCTCCAACCAGTAGGCGTGGTCTTCCTCGGTGTCGGCCAACTGGGCCTTGAGGA

TGTCGCGGCTGACGAAGTCCTTATGCTGCTCGCAGAGGGCGATGCCCTTGGCCAGCGCGGCGCGGACATGTGTCC

CCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATT


AAGAGCTTCAGGNTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTCAGATCTGCGACTGCAGGTAGTTCTCCAGGCCCATCC

TGGCGATCAGGCCAAGCTGTTGCTCCAACCAGTAGGCGTGGTCTTCCTCGGTGTCGGCCAACTGGGCCTTGAGGA

TGTCGCGGCTGACGAAGTCCTTATGCTGCTCGCAGAGGGCGATGCCCTTGGCCAGCGCGGCGCGGACATGTGTCC

CCGTACATCGTTAGAACTGNNAANTCCGAGCAGA


AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGCCGCACACCGCGCCGACCCGGCGCGCGCGGGCCAGCTCG

TCTCGCGCCTCGTGCAGGGCGAAGATGGTCTTGCCGTTGTGGCGCAGGTGGAAAGCCACGTCGAAGCGGGCCAGC

GCCAGGCGCTTGATGACCTCCTGCAGATGGTCGAACTCGGTCTTCTCGGCACGCAGGAACTTGCGCCGCGCCGGG

GTGTTGAAGAACAGGTCGCGAACCTCGACGCTGGTCCCCACCGGGTGCGCCGCCGGCTGTACCCGCGGCTGCATG

TGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAAATTTCGAGCA

Mutante SCV-Tn5-M 1C:

AAGAGCTTANGGTTGAGAGTGTATAAGAGAAGCATCGGCCGCGCCCAGACCGGCACCGGCAAGACCGCCGCGTTC

CTCATCTCGATCATCACCCAATTGCTGCAGACCCCGCCGCCGAAAGAGCGCTACATGTGTCCCCGTACATCGTTA

GAAGTGGAAATTCGAGCAGA

Mutante SCV-Tn5-M 1D:

AGCTTCGCGCCTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGAAAGCGCCGCCCGTTACCTGGACGGCAAGATGCGCGAGATC

CGCTCCAGCGGCAAAGTCATCGGCGCCGACCGGGTTGCCGTGATGGCCGCCCTCAACATCACCCACGACCTGCTG

CACCGCAAGGAGCGCCTGGACCAGGAAAGCAGCTCGACCCGCGAGCGCGTGCGCGAACTGCTCGATCGCGTCGAC

CGCGCCCTGGCGAATCCGGCCGATGCCGGCGAAGCCTGACCCGGGCGCGGCCAATTCGGGTATACTGGCCTCCGC

TCCCTGGTGTGTTGGCCAGTCGGTGATGTCCCTGAGCCGATAACTGCAACAACGGAGGTTGCCAGTTGGACCGGT

GTGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGCTGAATTTCCAAGCA

122 ANHANG

Mutante SCV-Tn5-M 1L:

TTGAGATGGTATAAGAGAAGGGCCAGGGCCCAGCCGAAGAACGGCACGTAGAGCAGCTCGCGCTTGAGTACCTGG

CTGAGTGGCTCGAAGAAGCCGGAGAGGAAGAAGGTTTCCCAGGTGCTCTGGTGCTTGGAGAGGATCACGCAGGGC

TTTTCCGGGATGTTCTCCAGTCCGCGCACCTCGTAGCGGATGCCGGCGACCACGCGGGTCAGCCAGATCGCGAAG

CGGCACCAGTTCTGTACCACGAAGCGGTAGCGGGCGCGGAACGGCAGGATCGGCGCGATGAAGAAGCTGAGGGTG

CCCCAGACGAACGCGCTGGCGGACAGCAGCAGGTAAAAGAGGACGGTTCTGATGGCCTGCACTGTCGACATGTGT

CCCCGTACATCGTTAGAAGTGAANNNTTCCAAG

Mutante SCV-Tn5-M 2E:

AAGAGCTTCAGGNTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGAGCAGGGCTTCGAACTCCGCGACGAAGGCTGGGAGTTCG

GCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTTTGAATTCGAGCAGA

Mutante SCV-Tn5-M 2L:

AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGCATCAGGACGATCCGCAGTTCGATGGGAATCTTGCGTCCG

TCGGCGCGCAGGCAGTCGAGGGCGAACAGATGCTGGCCAGGGTTTTCCCGCAGCTCGGCGAGCTTCTGGCGGTCG

CCGATGGCGTGCCGCACGCGGCGCAGCAGGCCGTTCAGGCGGCCGAGCTGGCGCGGGTTGGTGGCGGTCTGGTGG

AGGCCGTTGAGCAGCGCCCATTCCGGGCTGTAGCCGAACACGTGCTGTACCGAGGGGCTGACGTAGCTGGCGTTG

AGCTCGGCGTCGGTGGAGAAGATCACGTCGCTGATGTTTTCCGCCAGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTN

AGATTCCCCA


AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGATCCCAGGTGTCCCCGTGGCGCAGTGCGTCGCGCGAGCCG

AGCACGTCGCCGAGTTCGCGGTAGCCTTCGGTGGAATAGCGGTAGCCGGCCAGGGTCAGGGTAGTGCCGGTGGGC

TGGAAGGTCCGGCTGTAGTCGAGCCCGATGCGCCAGCCCTGCTTGCGCGCGCCATCCTCGACGCGTGCGCTGGAA

TAGGTGCTGTTCAGGCCGAAGGCGCCGAAGCGGGTGGCGAGGACGCCGCCGCCCAGCATGTGTCCCCGTACATCG

TTAGAAGTGAANNNTCCGAGCA


AAGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGATCCCAGGTGTCCCCGTGGCGCAGTGCGTCGCGCGAGCCG

AGCACGTCGCCGAGTTCGCGGTAGCCTTCGGTGGAATAGCGGTAGCCGGCCAGGGTCAGGGTAGTGCCGGTGGGC

TGGAAGGTCCGGCTGTAGTCGAGCCCGATGCGCCAGCCCTGCTTGCGCGCGCCATCCTCGACGCGTGCGCTGGAA

TAGGTGCTGTTCAGGCCGAAGGCGCCGAAGCGGGTGGCGAGGACGCCGCCGCCCAGCATGTGTCCCCGTACATCG

TTAGAAGCTGAATTTCCCAGCA

123 ANHANG

Mutante SCV-Tn5-M 3F:

AAGAGCTTNNNGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGCGAACGAGGCGTAGTAGCCGCTCGGGTTGTCCACCCGC

ACCGCCCAGCCGGCGCTGCGCCGGACCAGTGCGAAACGCAGTTGCCCGGGCAGGTCCTCGGGACGGCCCTGGATG

CCCGCCGGGCGGTAGAACAGCTTCAGGCGATTGCGCAGCATCAGCAGCATCTGGTTCCGATCCGCATGTGTCCCC

GTACATCGTTAGAAGCTGAAATATTCGAGCA

Mutante SCV-Tn5-M 3K:

GCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGATCCCAGGTGTCCCCGTGGCGCAGTGCGTCGCGCGAGCCGAGCA

CGTCGCCGAGTTCGCGGTAGCCTTCGGTGGAATAGCGGTAGCCGGCCAGGGTCAGGGTAGTGCCGGTGGGCTGGA

AGGTCCGGCTGTAGTCGAGCCCGATGCGCCAGCCCTGCTTGCGCGCGCCATCCTCGACGCGTGCGCTGGAATAGG

TGCTGTTCAGGCCGAAGGCGCCGAAGCGGGTGGCGAGGACGCCGCCGCCCAGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAG

AAGTGAAAATTTCGAGCA


ACGAGCTTCGCGCTTGAGATGTGTATAAGAGAAGGTGTCACCGATCAGCCCGGCGGCGTAATACCGAGACCAGCG

CCACGCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACGACGGTTCA

TCACGGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCGATGGAGTC

GAGATTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGC

TGANATATCCGAGCAGA


GACCAGCGCCACGCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACG

ACGGTTCATCACGGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCG

ATGGAGTCGAGATTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCG

TTAGAAGTGAAATATTCC

Mutante SCV-Tn5-M 6G:

ACGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTCACCGCCAGCCCGGCGGTGAATACCGCGACCAGCGC

CACGCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACGACGGTTCAT

CACGGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCGATGGAGTCG

AGATTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAGNNN

AAATTTTCAA

124 ANHANG

Mutante SCV-Tn5-M 6M:

ACGAGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTCACCGCCAGCCCGGCGGTGAATACCGCGACCAGCGC

CACGCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACGACGGTTCAT

CACGGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCGATGGAGTCG

AGATTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACNN

NATATTCCAAGCAG

Mutante SCV-Tn5-M 6N:

AGCTTCAGGCTTGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTCACCGCCAGCCCGGCGGTGAATACCGCGACCAGCGCCAC

GCCCAGGTGTGCGCGATAGAGCACCCGGCGCAGCGATGGATTGGAACCCGTATAGCGACGACGACGGTTCATCAC

GGAGTGGCCTGCCGCCTTGCCAGTTTCAATACGCTCGGGTGCACGCGTACGCCGCTGCGGGCGATGGAGTCGAGA

TTGGCCTCGAAGGTGATGCGCGGGCCGCCGACGTTGAGGCAGAACATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAANNAAAN

NNTCCCAAGC

Mutante SCV-Tn5-M 8A:

AAGAGCTTCGGCTTGAGAGTGTATAAGAGAAGCCGCTGCACCTGCTGGAACAGCAACTGGCGCACTGTGCTGCTC

AGCGCGCCGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGGC

AGCCTGCTGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGANATNTNCCGAG

CAGGA

Mutante SCV-Tn5-M 8B:

CGAGCTTCAGGTTGAGATGGTTAAGAGAAGCCGCTGCACCTGCTGGAACAGCAACTGGGCGCACTGTGCTGCTCA

GCGCGCCGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGGCA

GCCTGCTGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGAAATATTCNAGCA

GA

Mutante SCV-Tn5-M 8C:

AAGAGCTTCGGCTTGAGAGTGTATAAGAGACAGCCGCTGCACCTGCTGGAACAGCAACTGGCGCACTGGCTGCTC

AGCGCGCCGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGGC

AGCCTGCTGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGAAATATTCGAGC

AGA

125 ANHANG


AAGAGCTTCAGGTTGAGATGGTTAAGAGAAGCCGCTGCACCTGTCTGGAACAGCAACTGGGCGCACTGTGCTGCT

CAGCGCGCCGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGG

CAGCCTGCTGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGANAAATCCGAG

CAGGA


CAGGTTGAGAGTGTATAAGAGAAGCCGCTGCACCTGCTGGAACAGCAACTGGGCGCACTGTGCTGCTCAGCGCGC

CGACCGAACAACCGATCCTGCACGACGGCCAGAAGATCGGTTCGGTGGAGGTGAAGGGCTCCGGCGGCAGCCTGC

TGCGCTTCCTGCTCACAGGTTTCGCCGGCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAAGTGAAATATTCGAGC

Mutante SCV-Tn5-M 11A:

AAGAGCTTCAGGTTGAGATGGTTAAGAGACAGGGTGTAGGCGGAATAGCCGGAGGAGCCGCCGGAGGCCGATGAG

CCGCCACTCCAGCCCACCCGTGCCGCCGGACTCTCCAGCACGCTCTCGGCCAGGCGCATCTCGCCCTGCGGGCCG

AACTCGCCGGCAGCAGCGCCGGTCGGACGCGGCTCGGTCAGGCTGGTCGCCCCGGGCGGCGCGAGCTGGTCGTCG

GGACGGACCTCGCCCAGCGCACGATGCAGGGTGCCATAGAGGAAGTCATGTGTCCCCGTACATCGTTAGAACNNN

ATTTTCGAAAC

9.8 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis

Tab. 1: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten auf autoaggregatives Wachstum nach 48 Stunden

Inkubation bei 37 °C 42

Tab. 2: Mutanten aus der Transposonbank des WT 20265 mit einem phänotypischen

Switch zum SCV-Phänotyp 47

Tab. 3: Mutanten aus der Transposonbank der SCV 20265 mit einem phänotypischen

Switch zum WT-Phänotyp 49

Tab. 4: Elektronenmikroskopische Untersuchung von Transposonmutanten

des WT 20265 mit einer Inkubation der Mutanten auf Twitching-Agarplatten

bei 28 °C 55

Tab. 5: Elektronenmikroskopische Untersuchung klinischer SCVs mit einem

autoaggregativen Phänotyp auf Fimbrienstrukturen und Flagellen mit

einer Inkubation der Bakterien auf Twitching-Agarplatten bei 28 °C 56

Tab. 6: Differenzielle Genexpression der Transposonmutante 25/C1 während der

exponentiellen Wachstumsphase (VON Götz 2003) 64

126 ANHANG

Tab. 7: WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Columbia-Blutagar

und Müller-Hinton-Agar 105

Tab. 8: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf

Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar auf autoaggregatives Wachstum 106

Tab. 9: WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf Müller-Hinton-Agar

und einem schnellen Wachstum auf Columbia-Blutagar 107

Tab. 10: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem langsamen Wachstum auf

Müller-Hinton-Agar und einem schnellen Wachstum auf Columbia-Blutagar auf

autoaggregatives Wachstum 110

Tab. 11: Autoaggregative WT-Tn5-Mutanten mit einem intermediären bis schnellen Wachstum

auf Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar 112

Tab. 12: Untersuchung der WT-Tn5-Mutanten mit einem intermediären bis schnellen

Wachstum auf Columbia-Blutagar und Müller-Hinton-Agar auf autoaggregatives

Wachstum 112

Tab. 13: Untersuchung der SCV-Tn5-Mutanten auf ein schnelles Wachstum auf

Columbia-Blutagar und autoaggregatives Wachstum 113

Abb. 1: Modell einer Biofilmentwicklung (O’TOOLE et al. 2000) 12

Abb. 2: Wachstum der zwei Morphotypen Wildtyp und SCV des P. aeruginosa-

Stammes 20265 auf Agar-Platten 15

Abb. 3: Wachstum der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des

P. aeruginosa-Stammes 20265 auf Agar-Platten 21

Abb. 4: Agarosegel mit aufgereinigten PCR-Produkten 35

Abb. 5: Wachstum der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante des

P. aeruginosa-Stammes 20265 in Flüssigmedium 41

Abb. 6: Motilitätsverhalten der drei Morphotypen Wildtyp, SCV und Revertante

des P. aeruginosa-Stammes 20265 44

Abb. 7: Motilitätsverhalten der zwei Morphotypen Wildtyp und SCV des

P. aeruginosa-Stammes 20265 und der Transposonmutante 25/C1 des

mutagenisierten Wildtyps 20265 45

Abb. 8: Wachstum vom Wildtyp des P. aeruginosa-Stammes 20265 und der

Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten Wildtyps 20265 auf Agarplatten

und in Flüssigmedium 50

Abb. 9: Northern Blot zur Darstellung der cupA1-Genexpression in der Transposon-

mutante 25/C1 im Vergleich zum Wildtyp und der SCV des P. aeruginosa-

Stammes 20265 52

127 ANHANG

Abb. 10: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Zelloberflächen und Umgebung

der Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten

P. aeruginosa-Wildtyps 20265 54

Abb. 11: Elektronenmikroskopische Aufnahmen von der Umgebung der

Transposonmutante 25/C1 des mutagenisierten P. aeruginosa-Wildtyps 20265 57

Abb. 12: Darstellung der GGDEF-Domäne bzw. EAL-Domäne in den Proteinen PvrR,

PA4843, PA1120 und PA4601 70

Abb. 13: Darstellung der intrazellulären Signalkaskade, die möglicherweise zu

einem Biofilm-Phänotyp bei P. aeruginosa führt 72

Abb. 14: Wachstum der zwei Morphotypen SCV und Revertante des P. aeruginosa-

Stammes 20265 und der Transposonmutante SCV-Tn5-M R7 der

mutagenisierten SCV 20265 auf Agar-Platten 73

Erklärung

Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Molekulare Charakterisierung von langsam wachsenden

Subpopulationen (small colony variants) von Pseudomonas aeruginosa isoliert aus dem

Respirationstrakt von Mukoviszidosepatienten“ selbständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden keine Hilfen Dritter in Anspruch genommen.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder

anderer Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar

entgeltliche Leistungen für die Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der

vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der

Medizinischen Hochschule Hannover durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für

Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover angefertigt.

Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck

zur Beurteilung eingereicht.

Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit

entsprechend gemacht habe.

Hannover, den 23.08.2004

.........................................................

Verena Wild

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich herzlich bedanken bei Prof. Dr. Dieter Bitter-Suermann für die

Überlassung des Themas und für die stets freundliche Arbeitsatmosphäre, die unter seiner Leitung im

Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Medizinischen Hochschule

Hannover herrschte.

Ein großer Dank gilt Prof. Dr. Peter Valentin-Weigand für die Übernahme der Betreuung an der

Tierärztlichen Hochschule Hannover.

Ein ganz besonderes Dankeschön geht an Dr. Susanne Häußler für ihre immense Geduld, die sie

aufbrachte, um mich in die Welt von Pseudomonas aeruginosa und seinen SCVs einzuweihen sowie

für ihre ständige Ansprechbarkeit und Diskussionsbereitschaft. Erst ihre engagierte Betreuung und die

große Begeisterung ermöglichte das Gelingen dieser Arbeit.

Birgit Brenneke und Jessika Garlisch danke ich herzlich für ihre tatkräftigen Unterstützungen in allen

organisatorischen Angelegenheiten sowie bei kleinen und größeren Katastrophen im Laboralltag.

Bei Dr. Ralf-Peter Vonberg möchte ich mich nicht nur für seine regelmäßigen Dienste als Chauffeur

bedanken, sondern insbesondere auch für seinen Einsatz als Fotograf. Ohne diese Hilfe hätten die

Fotos nie diese Qualität erreicht.

Dr. Beate Fehlhaber danke ich für ihr biochemisches und vor allen Dingen mathematisches Wissen,

welches sie mir stets mit großer Begeisterung und Engelsgeduld zur Verfügung stellte.

Bei meiner Arbeitsgruppe möchte ich mich für die stete Hilfsbereitschaft, Unterstützung und für das

angenehme Arbeitsklima bedanken. Besonderer Dank gilt dabei Dagmar Löns; getrennt von der

restlichen Arbeitsgruppe haben wir gemeinsam die Höhen und Tiefen der Forschung erlebt, ohne die

Hoffnung und vor allen Dingen den Humor zu verlieren.

Neben allen anderen Doktoranden und Mitarbeitern der Medizinischen Hochschule möchte ich ein

besonderes Dankeschön an die Arbeitsgruppe von Dr. I. Steinmetz richten, mit denen ich nicht nur

während der Laborarbeit, sondern auch außerhalb des Labors sehr viel Spaß hatte.

Mein allerherzlichster Dank gilt meiner Familie für die jahrelange Unterstützung während meines

Studiums und der Promotion.

Documents

Durch das Institut für Mikrobiologie, Zentrum für ... · 4.7 Komplementation von PA1587 in der Transposonmutante 25/C1 50 4.8 Untersuchung zur cupA1-Genexpression (PA2128) in den