Dynamik und Strukturbildung vonSchleimpilzen

Ein Versuch im Fortgeschrittenenpraktikum betreut vonAdrian Fessel Prof. H.-G. DöbereinerChristina OettmeierErik Bernitt

Inhaltsverzeichnis

1 Motivation 1

2 Biologischer Hintergrund 12.1 Grundlagen der Zellmotilität . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12.2 Geschichtliche Einordnung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.3 Physarum polycephalum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22.4 Mikroplasmodien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

3 Versuchsvorbereitung und -durchführung 33.1 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33.2 Aufschwimmen und Schütteln . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53.3 Präparation der Proben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53.4 Bildaufnahme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

4 Datenauswertung 64.1 Kymograph . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74.2 Gaußsche Tiefpassfilterung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84.3 Binärisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94.4 Flächenanalyse mittels Autokorrelation oder Fouriertransformation 114.5 Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte . . . . . . . . . 12

12. Februar 2014

Motivation

1 Motivation

Schleimpilze sind einzellige, vielkernige Amöben und dienen der biologischen For-schung als Modellorganismen, um die Bewegung von tierischen Zellen zu unter-suchen: Wie fast alle Zellen nutzen Sie die Proteine Aktin und Myosin zur Fort-bewegung. Obwohl Einzeller, können Schleimpilze einige Zentimeter groß werden.Den intrazellulären Transport von beispielsweise Nährstoffen erreichen Sie durchrhythmische Kontraktionen und dadurch erzeugte Zellplasma- Strömungen. DieseOszillation ist die charakteristische Bewegungsform des Schleimpilzes.In diesem Versuch werden mit einem Lichtmikroskop Filme dieser Oszillationenaufgenommen und quantitativ ausgewertet. Hierbei sollen, unter Anleitung, eige-ne Bildanalyseroutinen entwickelt werden.Erlernt werden in diesem Versuch Grundlagen der Zellkultur, der Hellfeld- Mi-kroskopie, der automatischen Bildauswertung und der statistischen Analyse vonDaten durch Autokorrelationsfunktionen.Das beschriebene Verfahren ist eine typische Vorgehensweise in der biophysikali-schen Forschung. Die gewonnenen Daten dienen beispielsweise der Überprüfungvon Modellen und der Identifikation von zugrunde liegenden Prozessen.

2 Biologischer Hintergrund

2.1 Grundlagen der Zellmotilität

Lebende Zellen sind - rein physikalisch betrachtet - eine geordnete, strukturier-te Ansammlung von Ionen und organischen Molekülen in wässriger Lösung, ein-geschlossen von einer Hülle aus speziellen amphiphilen Molekülen, die die Zel-le begrenzen und die Kommunikation mit der Umgebung erlauben. Zur aktivenBewegung verwenden Zellen ein wässriges Gel aus faserförmigen Proteinen, denAktinfilamenten, und molekularen Motoren, den Myosinen, die die Filamente ver-binden und an ihnen entlangwandern können. Diese Bewegung wird angetriebendurch den zellulären Brennstoff, das Adenosintriphosphat (ATP). Eine lebendeZelle befindet sich also typischerweise in einem mechanisch und chemischen Nicht-gleichgewichtszustand. Die Materialeigenschaften des Gels werden bestimmt durcheine Vielzahl an weiteren Proteinen, die die Aktinfilamente untereinander und mitanderen Makromolekülen verbinden, die Polymerisation und Depolymerisations-geschwindigkeit der Filamente beeinflussen, sowie die Aktivität der Motorproteinesteuern. Die Gesamtheit der molekularen Wechselwirkungen des aktiven Gels wirdkontrolliert durch spezielle molekulare Signalkaskaden, die die Zelle an die Umge-bung ankoppeln, sowie kausale Verknüpfungen mit anderen Prozessen im Zellin-neren herstellen. Durch Daten der Art wie Sie im Praktikumsversuch gewonnenwerden lassen sich Rückschlüsse auf Beschaffenheit des Gels und der zellulärenSteuerungsmechanismen ziehen.

1

Geschichtliche Einordnung

2.2 Geschichtliche Einordnung

Im Laufe der letzten zwei Jahrzehnte ist es gelungen, einen Großteil der für dieZellbewegung verantwortlichen Proteine zu charakterisieren und ihre molekulareWechselwirkung untereinander zu verstehen, siehe [1]. Diese Entwicklung ermög-lichte gezielte biophysikalische Experimente an gut beschriebenen Zellsystemen.Weiterhin entbrannte ein lebhaftes Interesse an den physikalischen Prinzipien vonmolekularen Motoren [2]. Modelle aktiver Gele wurden experimentell und theore-tisch untersucht [3, 4].In der Literatur dokumentierte Experimente zur Morphologie der Zellbewegungwaren in der Vergangenheit vorwiegend qualitativer Natur. Erst in jüngster Zeitgelang mit Einzelzellexperimenten eine voll quantitative Beschreibung [5, 6]. Inden 70er und 80er Jahren war das Zugpferd der Forschung zur Zellbewegung derSchleimpilz Physarum polycephalum. Im weiteren Verlauf wurden dann in den letz-ten 20 Jahren wegen der einfacheren genetischen Handhabbarkeit hauptsächlichAmöben des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium discoideum und Mäusezellenuntersucht. In jüngster Zeit hat der Schleimpilz Physarum polycephalum durch sei-ne erstaunliche Netzwerkbildung [8] wieder die Aufmerksamkeit der wissenschaft-lichen Gemeinschaft erlangt [7].

2.3 Physarum polycephalum

Schleimpilze (lat. Myxomyceten) sind, trotz ihres deutschen Namens, keine Pilze.Sie gehören auch zu keinem anderen Reich der Systematik der Lebewesen, sindalso weder Pilze, noch Tiere oder Pflanzen. Sie bilden taxonomisch ihr eigenesReich, das der Amoebozoa. Sie kommen auf allen Kontinenten (außer der Ant-arktis) vor, und es gibt tausende Arten, die man meist nur an der Struktur ihrerSporen bestimmen kann. Man unterscheidet zelluläre und azelluläre Schleimpilze,wobei die zellulären Schleimpilze die meiste Zeit ihres Lebens als solitäre Amö-ben umherkriechen und sich nur zum Zweck der Fortpflanzung zusammen finden.Azelluläre Schleimpilze, wie unser Versuchsorganismus Physarum polycephalum,bestehen aus einer einzigen Zelle mit tausenden von Zellkernen. Damit sind Sie diegrößten Einzeller der Welt, siehe Abbildung 2.1. Physarum kann sogar mehr alseinen Quadratmeter groß werden.Schleimpilze haben einen vielfältigen Lebenszyklus, der in Abbildung 2.2 darge-stellt ist:Die dominierende Phase im Lebenszyklus ist das Plasmodium. Es ist bei Physa-rum leuchtend gelb pigmentiert, es gibt jedoch auch Arten in anderen Farben.Wie bereits erwähnt, ist es mehrere Quadratzentimeter groß. Es ernährt sich inder obersten Schicht des Waldbodens von totem organischem Material, d.h. vonabgestorbenen Blättern und Holz. Im Labor wird es auf Nähragar gezüchtet, derein Extrakt aus Hefezellen und fermentierten Proteinen enthält.Gerät der Schleimpilz in Gefahr, auszutrocknen, so bildet er das Sklerotium, eintrockenes und widerstandsfähiges Gebilde, aus dessen Inneren der Organismus beigünstigen Umweltbedingungen auch nach längerer Inaktivität wieder ausschlüpfenkann.

2

Mikroplasmodien

Abbildung 2.1: Plasmodium von Physarum polycephalum auf einer 9 cm-Petrischale mit Nähragar

Unter bestimmten Umständen, beispielsweise starker Lichtexposition, bildet derSchleimpilz Sporen, die mit dem Wind verbreitet werden. In den Sporen sindhaploide (d.h. nur mit einem Satz von Chromosomen ausgestattete) Amöben. Tref-fen sich Sporen verschiedenen Ursprungs, d.h. von unterschiedlichen Individuen(bei Schleimpilzen gibt es 13 Geschlechter), so können Sie nach dem Ausschlüpfenfusionieren und bilden wieder ein diploides (2 Kopien der Chromosomen) Plasmo-dium.

2.4 Mikroplasmodien

Der Schleimpilz Physarum polycephalum bildet in Flüssigkultur kleine kugelförmi-ge Gebilde, sogenannte Mikroplasmodien, die in der Natur nicht vorkommen. Sieentstehen durch die Kultivierung des Organismus in Flüssigkultur und die Scher-kräfte, die durch das Schütteln auf Sie einwirken. Mikroplasmodien haben einenDurchmesser von 100 bis über 1000 µm. Abbildung 2.3 zeigt ein solches Mikro-plasmodium.Charakteristisch ist für diese Lebensform von Physarum polycephalum, dass dieMikroplasmodien nach Aufbringen auf einen Nähragar in Form riesiger makrosko-pischer Zellen mit mehreren Kernen weiter wachsen, also zu adulten Plasmodienwerden und Netzwerke ausbilden.Ebenfalls charakteristisch ist die Motilität des Schleimpilzes: Die Mikroplasmodienzeigen zunächst interne Oszillationen, und sobald das Plasmodium eine bestimmteGröße erreicht hat, führt es sowohl Bewegungen des ganzen Organismus aus alsauch das sogenannte „shuttle streaming“, eine Art rhythmischer Plasmaströmungdurch die Adern des Netzwerks [10, 9].

3 Versuchsvorbereitung und -durchführung

3.1 Zellkultur

Physarum polycephalum wird in unserem Labor in zwei Formen kultiviert, als Mi-

3

Zellkultur

Abbildung 2.2: Lebenszyklus von Physarum polycephalum.

Abbildung 2.3: Links: Makroplasmodium. Rechts: Mikroplasmodium.

kroplasmodien in Schüttelkultur und als Makroplasmodien auf Petrischalen mitNährstoffagar. Übliche Arbeitsschritte sind das Umsetzen der Kulturen sobald vor-handene Nährestoffe aufgebraucht oder der Lebensraum ausgefüllt ist. Bei großenPlasmodien werden Stücke mit dem Skalpell herausgeschnitten oder von der Agar-Oberfläche abgeschabt. Im Versuch soll mit Mikroplasmodien gearbeitet werden.Die Handhabung und das Umsetzen der Flüssigkulturen wird im folgenden Ab-

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Aufschwimmen und Schütteln

schnitt beschrieben.Beim Umsetzen und Handhaben der Kulturen soll steriles Arbeiten unter der Si-cherheitswerkbank gelernt werden, das Verhalten in einem S1-Labor und generellder Umgang mit Mikroorganismen. Zudem sollen Präparate für das spätere Be-trachten unter dem Mikroskop angefertigt werden.

3.2 Aufschwimmen und Schütteln

Mikroplasmodien werden aus großen Plasmodien erzeugt, die mindestens drei Vier-tel der Petrischale bedecken. Zunächst wird Mikroplasmodien-Wachstumsmedium(WM) auf ca. 24◦C angewärmt, dann wird das Plasmodium mit etwa 10 ml WMbedeckt. Lässt man es nun ein paar Minuten stehen, so löst sich das Plasmodiumein wenig von der Agaroberfläche ab und kann vorsichtig mit einer Pipette auf-gesaugt werden. Die Fragmente werden dann in vorbereitete Erlmeyerkolben mitWM überführt und bei ca. 150 rpm auf den Schüttler gestellt. Ein bis zwei Tagespäter hat man eine Mikroplasmodien-Kultur mit Größen von 50 bis 500 µm. DieGeschwindigkeit des Schüttelns beeinflusst die Größenverteilung, daher kann mitverschiedenen Einstellungen gearbeitet werden.

3.3 Präparation der Proben

Im Labor werden stets mehrere Mikroplasmodienkulturen unterschiedlichen Alterserhalten. Neben der Objektdichte in der Lösung variieren auch Größe und Formder Mikroplasmodien. Während die Mikroplasmodien in den jüngeren Kulturenvon Form und Größe her eher den Anforderungen des Versuches entsprechen, sindhier jedoch auch meist deutlich weniger Mikroplasmodien vorhanden.Nach Auswahl der Kultur muss dieser unter der Sterilbank eine Probe entnommenund für die Bildaufnahme vorbereitet werden. Die Schritte sind im groben

Probenpräparation

• Entnahme einer Probe (2 ml)

• Zentrifugation zur Trennung von Mikroplasmodien und Stoffwechse-lendprodukten (1300 rpm, 3 min)

• Resuspension in frischem Wachstumsmedium (2 ml)

• Ausplattieren in einer Agarbedeckten Mikroskopieschale

Vor der Erstellung der Probe für die Filmaufnahme sollten die Plasmodien unterdem Labormikroskop auf Vitalität geprüft werden.

3.4 Bildaufnahme

Die Bildaufnahme findet an einem invertierten Mikroskop, dem Zeiss Axio Ob-server statt. Prinzipiell stehen Vergrößerungen von 2x bis 100x zur Verfügung.

5

Datenauswertung

Aufgrund der Agarschicht, die den Plasmodien Nährstoffe und Feuchtigkeit liefernsoll, sind jedoch Vergrößerungen jenseits des 10x Objektives nicht praktikabel, dadie Fokusebene bei höheren Vergrößerungen so dicht am Objektiv liegt, dass esnicht möglich ist die Agarschicht zu durchdringen ohne mit dem Objektiv an dieSchale zu stoßen, was unter allen Umständen vermieden werden muss.Die Computersteuerung des Mikroskops ermöglicht eine zeitgesteuerte Aufnahmeeiner oder mehrerer Positionen in der Probe. Wählen Sie ein geeignetes Mikroplas-modium aus (Lebend, ausreichend sphärisch, entfernt von Nachbarn) und nehmenSie eine Zeitreihe über etwa fünf Stunden auf. Verwenden Sie hierbei eine Bildrateunterhalb von 5 s je Bild. Die Begründung hierfür liegt in der erwarteten Oszilla-tionsfrequenz von ca. 1,5 min und dem Nyquist-Theorem.

BildaufnahmeInformieren Sie sich über...

• ... das Entstehen der Vergrößerung in einem Mikroskop,

• ... den prinzipiellen optischen Aufbau,

• ... die Funktionsweise eines CCD-Chips,

• ... die Auflösungsbegrenzung und die Rolle der numerischen Apertur,

• ... das Nyquist-Theorem.

4 Datenauswertung

Ziel des Versuches ist es, die Oszillation der Mikroplasmodien zu quantifizieren. Dadie gewonnen Daten in Bildform vorliegen, müssen konkrete physikalische Mess-größen zunächst noch gewonnen werden. Was mit dem Auge direkt ersichtlichist (Beispielsweise die Größenänderung bei der Oszillation, Helligkeitsänderungeno.Ä.) ist quantitativ am Computer oft schwierig zu erfassen. Die hohe Anzahl deraufgenommenen Bilder macht eine automatisierte Analyse jedoch notwendig. Ausdiesem Grund werden im folgenden Abschnitt Methoden aus Bildverarbeitung undSegmentierung vorgestellt, die im Versuch verwendet werden können und sollen.

It’s dangerous to go alone..Die Analyse kann in Matlab erfolgen, jedoch gibt es auch gute OpenSourceAlternativen. Speziell genannt seien:

• Fiji - is just ImageJ: Ein hervorragendes Programm zur Bildver-arbeitung und -analyse.

• GNU Octave: Ein Matlab Clon, der zwar auf die Annehmlichkeiteneines GUI verzichtet, dafür jedoch beinahe alle Funktion des Vorbildsbietet.

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Kymograph

Sie erhalten Ihre Meßergebnisse als einen Satz von .tif Bildern. Diese müssen siezunächst mit Matlab einlesen:

Einlesen der Bilder:Beginnen sie Ihre Auswertungsroutine mit dem Einlesen der Bilder.Nützliche Befehle:

uigetfile uigetdirimread imwritedoubleimshownum2str str2num

• Ist es sinnvoll, alle Bilder auf mal einzulesen? Was sind in diesemFalle die Probleme?

Sobald Sie die Bilder einlesen können sollen diese ausgewertet werden. In denfolgenden Abschnitten finden sie diverse Methoden, die Sie zur quantitativen Aus-wertung heran ziehen können. Ziel ist die Quantifikation der Flächenoszillationsowie die Berechnung einer Geschwindigkeitskarte wie unten beschrieben.

4.1 Kymograph

x

t

x

t

Abbildung 4.1: Entstehung eines Kymographen

Um Veränderungen entlang einer definierten Linie (üblicherweise eine Gerade senk-recht zur Kante des Plasmodiums) sichtbar zu machen, ist der Kymograph geeig-net. Wie in Abb. 4.1 gezeigt, können die Grauwerte entlang eines Profils zeitlichangeordnet werden. In der Darstellung ist bereits die Periodizität zu erkennen.Nachteil dieser Methode ist, dass Informationen über eventuelle Asymmetrien derOszillationen entlang der Kontur verloren gehen.

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Gaußsche Tiefpassfilterung

Erstellung eines Kymographen:

Fiji: Befehl reslice unter image/stacks

Matlab: Ein Profil lässt sich bequem mittels improfile erstellen. Auch eineAusgabe der Grauwerte ist mit diesem Befehl möglich

4.2 Gaußsche Tiefpassfilterung

Auch wenn man bei Bildgebungsmethoden üblicherweise auf eine möglichst hoheAuflösung bzw. einen möglichst hohen Detailgrad abzielt ist für manche Technikeneine geringere Informationsdichte nützlich. Zu diesem Zweck bietet die Signalver-arbeitung diverse Filter, z.B. Hoch-, Tief- oder Bandpass.Exemplarisch vorgestellt werden soll der Gaußsche Tiefpassfilter, welcher hilfreichbei der Rauschreduzierung und Glättung eines Signals ist. Am einfachsten kannder Filter über seine spektrumsmodifizierendeWirkung im Fourierraum verstandenwerden. In 4.2 ist im rechten Panel das Spektrum F = F(f) eines Grauwertprofils f

0 20 40 60 80 100

100

120

140

160

180

200

x [µm]

Gre

y Le

vel

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2f [1/µm]

Pow

er

Abbildung 4.2: Links: Grauwertprofil entnommen einem Beispielbild(blau), geglättetes Profil (rot). Rechts: Fourier-Spektrum des Profils(blau), Anteil des Spektrums, der die geglättete Kurve ergibt (rot).

gezeigt. Ein simpler Tiefpassfilter erzeugt durch abschneiden höherer Frequenzenden in rot dargestellten Anteil. Die Rücktransformierten der beiden Datensätze(linkes Panel) zeigen die Veränderung in der Bildinformation. Die Frequenzmo-difikation erfolgte durch Multiplikation des Spektrums mit einer FensterfunktionG = F(g):

F̄ = F ·G (4.1)

Es gilt das Faltungstheorem

F(f ∗ g) = F(f) · F(g) (4.2)

und somit für die Rücktransformierte des modifizierten Spektrums f̄

f̄ = F−1(F̄ ) = F−1(F(f) · F(g)) = f ∗ g . (4.3)

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Binärisierung

Im Falle von Abb. 4.2 wurde als Fensterfunktion eine Heaviside-Funktion gewählt,deren scharfes Abschneiden zu Gibbschen Ringing führt. Eine bessere Wahl istüblicherweise eine normierte Gaußsche Glockenfunktion.

Gaußscher Tiefpass:In 2 Dimensionen ist die Glockenkurve gegeben als

g(x, y) =1

2πσ2e−

x2+y2

2σ2 (4.4)

→ Warum ist diese besser geeignet? Was ist ihre Fouriertransformierte?

→ Welcher Parameterzusammenhang besteht zwischen der Funktionund ihrer Transformierten?

→ Überzeugen Sie sich, dass die Faltungsdarstellung

f ∗ g =

∫f(τ)g(x− τ) dτ (4.5)

einem gleitenden Mittelwert entspricht. Was bedeutet dieser Begriff?

Implementation eines Gauß-Filters:Sie können zur Implementation eines Gauß-Filters die Faltungsdar-stellung, die Fourierdarstellung oder bereits vorimplementierte Befehleverwenden. Nützliche Befehle in Matlab:

conv2fft2 fftshift

fspecial imfilter

4.3 Binärisierung

Ein Großteil der zur Auswertung benötigten Informationen kann gewonnen werden,wenn das Bild in die Sinnzusammenhänge ’Hintergrund’ und ’Objekt’ eingeteiltwird. Eine Darstellung, in welcher jeder Pixel mittels der Werte ’1’ (Ja) und ’0’(Nein) die Frage "Gehört dieser Pixel zum Objekt?"beantwortet, bezeichnet manals Binärbild. Eine solche Darstellung kann auf diversen Wegen erreicht werden.Die simpelste Methode ist eine Grauwertschwelle (Schwellenwert). Hierbei muss ei-ne Zahl definiert werden, anhand derer entschieden werden kann, ob der Grauwerteines Pixels zum Hintergrund oder zum Objekt gehört. Beispielhaft: Ein dunklesObjekt (Grauwerte geringer höhe) kann vom hellen (hohe Grauwerte) Hintergrunddurch eine Schwelle, welche zwischen diesen Werten liegt, abgetrennt werden. DieSchwierigkeit besteht also in der Wahl des Schwellenwertes. Im einfachsten Fallekann durch betrachten des Histograms (Grafik 4.3) ein Wert ’per Hand’ gewähltwerden, welcher dann für alle Bilder einer Serie gültig ist. Was ist aber, wenn sich

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Binärisierung

0 1 2 3 4 5 6 7x 104

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

Grey Scale Value

Num

ber o

f Pix

els

Histogram DataSegmentation Threshold

Abbildung 4.3: Bildsegmentierung durch eine Grauwertschwelle: Die imGraustufen-Histogramm (rechts) erkennbaren Peaks lassen sich Objektund Hintergrund des Bildes (links oben) zuordnen. Indem man einenSchwellenwert wählt, der zwischen diesen Peaks liegt (hier als rot ge-strichelte Linie), nimmt man die Segmentierung vor. Das fertig segmen-tierte Bild (links unten) ist vom Datentyp ’logic’: Es enthält nur nochWerte, die quasi die Frage "gehört der Pixel zu dem Objekt?"mit ’ja’(weiß) oder ’nein’ (schwarz) beantworten.

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Flächenanalyse mittels Autokorrelation oder Fouriertransformation

das Histogram verändert? In diesem Falle muss der Schwellenwert automatisiertgewählt werden. Eine Methode ist es, die Grauwerte der Bildanteile (in diesemFall Objekt und Hintergrund) als normalverteilt anzunehmen und das Histogramautomatisiert mittels einer Mixtur von Gauß-Funktion anzufitten (→ GaussianMixture Model).Einfacher in der Implementation ist die Methode nach [12], welche auf die Berech-nung des Histograms verzichtet und von dessen Beschaffenheit unabhängig ist. DerSchwellenwert berechnet sich hier nach der Formel

T =

∑i

∑j eijaij∑

i

∑j eij

(4.6)

wobei aij die Grauwertmatrix (also das Bild) und eij die Matrix der Beträge desGrauwertgradienten darstellt.Die Binärisierung kann durch Tiefpassfilterung erheblich vereinfacht werden, fallsneben dem Plasmodium auch andere Bereiche (Schmutz) also Objekt erkannt wer-den (siehe Profil in Grafik 4.2), oder das Objekt sehr inhomogen erscheint. Ach-tung: Bei starker Filterung verliert auch die tatsächliche Grenze des Plasmodiumsan Genauigkeit.Unter Umständen können Fehler in der Binärisierung nicht vermieden werden.Solche Fehler (wie z.B. Löcher im Objekt) können durch geeignete Methoden amBinärbild korrigiert werden.

Binärisierung und Korrektur:In Matlab ist es nicht nötig, (beispielsweise durch zwei for-Schleifen) denSchwellenwert für jeden Pixel einzeln anzuwenden. Die korrekte vektori-sierte Syntax einer solchen logischen Abfrage lautet:

Logical = Bild ≤ Threshold; (4.7)

Nützliche Befehle:

hist imhistsum gradientimfill bwmorphbwlabel regionprops find

4.4 Flächenanalyse mittels Autokorrelation oder Fourier-transformation

Ergebnisse erster Ordnung können aus der Veränderung der vom Mikroplasmo-dium überdeckten Fläche gewonnen werden. Überlegen Sie sich, wie Sie aus demBinärbild die Fläche des Mikroplasmodiums berechnen können. Um die Flächein physikalischen Einheiten zu berechnen, benötigen Sie die im Labor verwendeteVergrößerung. In der verwendeten CCD-Kamera ist die Kantenlänge eines Pixels

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Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte

stets gegeben durch 6.45µm. Stellen Sie sicher, dass ihr Ergebnis mit der erwar-teten Größe eines Mikroplasmodiums übereinstimmt!

Flächenanalyse:Der Flächenverlauf A(t) zeigt rhythmische Oszillationen. CharakterisierenSie den Verlauf! Welche Aussage können Sie über die Amplituden machen?Analyse mittels FFT:Sie können die Frequenz(en) der Oszillation mittels Fouriertransformationbestimmen. Die notwendigen Befehle sind unten aufgelistet:fft fftshift

• Wie lässt sich das Ergebnis der fft-Funktion vernünftig darstellen?Fragen Sie sich, auf welchen Zahlenraum das Fourierintegral abbil-det.

• Welche Aussage macht das Nyquist-Theorem über die maximal auf-lösbare Frequenz? Gegen welche Frequenzen können Sie das berech-nete Spektrum also auftragen?

• Testen Sie ihre Berechnung anhand von Testdaten bekannter Fre-quenz!

Analyse mittels Autokorrelation:Die Autokorrelationsfunktion einer Funktion gibt die Ähnlichkeit einerFunktion zu sich selbst bei Verschiebung um einen Parameter τ an:

Ψ =

∫f ∗(t)f(t− τ) dτ (4.8)

Mathematisch entspricht Sie also einer Faltung. Nützliche Befehle:xcorr corrcoeff

• Sollte ihre Autokorrelationsfunktion stark einer Dreiecksfunktiongleichen, führen Sie sich vor Augen, wie die Autokorrelation einesRechteckspulses aussieht. Welche Relevanz hat dies für ihre Daten?

• Wie groß sollten Sie die maximale Verschiebung wählen?

Hinweis: Sollte die Gesamtfläche sich während der Sequenz stark ändern,sollten Sie in Betracht ziehen einen das gleitende Flächenmittel abzuziehen(siehe Abschnitt zur Filterung).

4.5 Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte

Die Änderung der Fläche gibt keine Aufschluss über Formveränderungen bei glei-cher Fläche, wie z.B. abwechselnde Kontraktionen der beiden Kompartimente einesHantelförmigen Objektes oder laterale Wellen entlang der Begrenzung. Daher soll

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Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte

im letzten Auswertungsschritt die Veränderung der Kontur mithilfe einer soge-nannten Geschwindigkeitskarte untersucht werden. Eine solche ist exemplarisch inAbb. 4.4 gezeigt. Die Kontur (Abb. 4.5) eines Objektes kann vereinfacht definiert

Abbildung 4.4: Darstellung der Schleimpilz-Oszillation durch eine Ge-schwindigkeitskarte. Die Normalengeschwindigkeit vn der Kontur ist,als Funktion der Konturlänge und der Zeit, farblich dargestellt. Hierbeistehen positive (rote) Werte für eine Bewegung nach außen, währendnegative (blaue) Werte für eine nach innen gerichtet Bewegung stehen.

werden als die Menge der Objektpixel, welche einen Hintergrundpixel in ihrer 3x3Umgebung haben (andere Definitionen sind möglich).

Abbildung 4.5: Mikroplasmodium mit eingezeichneter Berandung oder’Kontur’.

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Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte

Finden der Konturpositionen:Die Koordinaten der Konturpixel können gefunden werden, indem dieUmgebungen der Objektpixel einzeln untersucht werden, oder indemvorgefertigte Befehle verwendet werden:

bwboundaries regionprops findcell

• Finden Sie zu jedem Bild die Kontur des Objektes als Satz von x-und y-Koordinaten der einzelnen Pixel.

• Wieso können die gesuchten Geschwindigkeiten nicht direkt durchDifferenzbildung dieser Koordinaten gebildet werden? Lesen Sie hier-zu auch [10].

Die gefunden kartesischen Koordinaten sind nicht direkt zur Geschwindigkeits-berechnung durch Differenzbildung geeignet. Es bietet sich an, zunächst in einSchwerpunktssystem überzugehen und anstelle von kartesischen Koordinaten mitPolarkoordinaten zu arbeiten. Vereinfacht kann die lokale Veränderung der Konturals rein radial angenommen werden - dies ermöglicht es, die Geschwindigkeit alsÄnderung der Radialkomponente in Polarkoordinaten zu betrachten.

Schwerpunkt und Polarkoordinaten:

• Wie berechnet man den Schwerpunkt einer beliebig geformten Flä-che, deren Punktmenge (x,y) bekannt ist?

• Welche Vorteile bringt ein Schwerpunktssystem mit sich?

Transformation in Polarkoordinaten:

ρ =√x2 + y2 (4.9)

θ = tan−1(y/x) (4.10)

Nützliche Befehle:unique sort cart2pol

• Transformieren Sie ihre Koordinaten in das Polarkoordinatensystem.

• Ist es bereits möglich, die Änderung des Radiusvektors abhängig vonder Winkelposition zu berechnen? Worin bestehen die Probleme?

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Erstellung und Analyse einer Geschwindigkeitskarte

Interpolation in einer Dimension:Bevor die Änderung des Radiusvektors berechnet werden kann, muss nocheine Interpolation auf ein äquidistantes Winkelgitter vorgenommen wer-den. Interpolationen werden üblicherweise verwendet um den Wert einerFunktion an Positionen zu bestimmen, an denen diese eigentlich gar nichtbekannt ist. Die Radiuskomponente des Polarkoordinatenpaares kann auf-gefasst werden als eine Funktion des Winkels: ρ(θ).Soll die Änderung der Radialen Komponente bestimmt werden, muss diesan bekannten Kontur- bzw. Winkelpositionen geschehen. Die ermitteltenWerte für θ weichen sind jedoch gemessen und daher nicht wohldefiniert.Mithilfe einer Interpolation kann die Funktion ρ(θ) jedoch an gewähltenPositionen ausgewertet werden. Nützliche Befehle:interp1 sort unique

• Informieren Sie sich über das Prinzip der Interpolation. Genaue ma-thematische Kenntnis ist nicht notwendig.

• Machen Sie sich klar, weshalb eine Interpolation von Nöten ist.

Darstellung der Geschwindigkeitskarte:Sobald Sie die Konturpositionen geeignet interpoliert haben, können siemithilfe des diff oder gradient Befehls die Zeitliche Veränderung bestim-men. Fügen Sie die Ergebnisvektoren zu einer Matrix zusammen, welchein x-Richtung die Zeit und in y-Richtung den Winkel oder die Konturposi-tion als Achse verwendet. Zur Darstellung eignet sich der Befehl imagesc,welcher ein Falschfarbenbild eines Datensatzes erzeugt. Die Farbdarstel-lung kann mithilfe einer geeigneten colormap angepasst werden. Es bietetsich die colormap redblue.m an, welche Sie online schnell finden.Achten sie auf eine vernünftige Darstellung und skalieren Sie die Geschwin-digkeitswerte entsprechend der Meßparameter hin zu physikalischen Grö-ßen. Diskutieren Sie die in Ihrer Geschwindigkeitskarte erkennbaren Struk-turen!

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LITERATUR

Literatur

[1] T. D. Pollard and G. G. Borisy, Cellular motility driven by assembly anddisassembly of actin filaments, Cell 112, 453 (2003).

[2] F. Jülicher, Statistical Physics of Active Processes in Cells, Physica A 369,185 (2006)

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[6] H.-G. Döbereiner, B.J. Dubin-Thaler, J. M. Hofman, H. S. Xenias, T. N.Sims, G. Giannone, M. L. Dustin, C. H. Wiggins, and M. P. Sheetz, LateralMembrane Waves Constitute a Universal Dynamic Pattern of Motile Cells,Phys. Rev. Lett. 97, 38102 (2006).

[7] http://www.spiegel.de/wissenschaft/natur/0,1518,673295,00.html

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[9] T.Saigusa, A. Tero, T. Nakagaki and Y. Kuramoto, Amoeba anticipate Peri-odic Events, Phys. Rev. Lett. 100, 018101 (2008)

[10] E. Bernitt, C. Oettmeier, and Hans-Günther Döbereiner, Microplasmodiumdynamics of physarum polycephalum, C.T. Lim and J.C.H. Goh (Eds.): WCB2010, IFMBE Proceedings 31, 1133-1136 (2010).

[11] http://www.mikroskopie.de/pfad/grundlagen/main.html

[12] J. Kittler, J. Illingworth, and J. Föglein. Threshold selection based on a simpleimage statistic, Computer Vision, Graphics, and Image Processing, 30:125-147, (1985).

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