16
1 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner National Center of Competence in Research “Nanoscale Science” PD Dr. Martin Hegner NCCR Nanoscale Science Institut für Physik Universität Basel Klingelbergstrasse 82 CH-4052 Basel Molekulare Erkennung Molekulare Erkennung Einzelnen Molekülen auf den Einzelnen Molekülen auf den Zahn gefühlt Zahn gefühlt Vorlesung zu finden auf: monet.physik.unibas.ch/~hegner/molrec.pdf 2 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Ligand Rezeptor Ligand/Rezeptor Interaktionen Protein Faltung AFM Federbalken Tip Molekulare Erkennung / Experimente Molekulare Erkennung / Experimente @ IfP @ IfP AFM Federbalken AFM Federbalken fluid chamber bead micropipette Dynamische Kraft Spektroskopie Optische Pinzetten Federbalken Arrays 3 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Ziel dieser Vorlesung Ziel dieser Vorlesung 1. Was für Fragestellungen beschäftigen uns? 2. Wie können wir die Probleme untersuchen? 3. Was können wir daraus lernen? 4 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Biophysik mit einzelnen Molekülen Biophysik mit einzelnen Molekülen Physik Chemie Biologie Nanoscience

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1 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

National Center of Competence in Research“Nanoscale Science”

PD Dr. Martin HegnerNCCR Nanoscale ScienceInstitut für PhysikUniversität BaselKlingelbergstrasse 82CH-4052 Basel

Molekulare ErkennungMolekulare ErkennungEinzelnen Molekülen auf den Einzelnen Molekülen auf den Zahn gefühltZahn gefühlt

Vorlesung zu finden auf:monet.physik.unibas.ch/~hegner/molrec.pdf

2 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Ligand

Rezeptor

Ligand/Rezeptor InteraktionenProtein Faltung

AFM Federbalken Tip

Molekulare Erkennung / Experimente Molekulare Erkennung / Experimente @ IfP@ IfP

AFM FederbalkenAFM Federbalken

fluid chamber

bead

micropipette

Dynamische Kraft Spektroskopie Optische Pinzetten

Federbalken Arrays

3 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Ziel dieser VorlesungZiel dieser Vorlesung

1. Was für Fragestellungen beschäftigen uns?

2. Wie können wir die Probleme untersuchen?

3. Was können wir daraus lernen?

4 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Biophysik mit einzelnen MolekülenBiophysik mit einzelnen Molekülen

Physik Chemie

Biologie

Nanoscience

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5 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

ÜbersichtÜbersicht• Molekulare Erkennung• Dimensionen und Kräfte• Moleküle und Grenzflächen• Oberflächen Funktionalisierung• Dynamische Kraft Spektroskopie• Optische Pinzetten• Einzel Molekül Anwendungen• Federbalken Array

6 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Was bedeutet molekulare Erkennung?Was bedeutet molekulare Erkennung?

“Unspezifische Erkennung” “Spezifische Erkennung”

7 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Was bedeutet molekulare Erkennung?Was bedeutet molekulare Erkennung?

Eukaryontische Zelle

Signale auf die eine Zelle reagiert

II

III

I

8 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Wie interagieren Moleküle?Wie interagieren Moleküle?• Ionische Kräfte z.B. Amino Säuren mit RestenR-NH3

+ <-> R-COO-

Typ. Energie in Wasser 4-7 kcal/mol (6-12 kBT)

• Wasserstoff Brücken z.B. DNATeilen eines H Atoms zwischen zwei Molekülen die elektro-negative Atometragen (meistens N und O)Starke Dipol-Dipol Interaktion mit gerichtetem Charakter•Typ. Enegie in Wasser: 3-6 kcal/mol (5-10 kBT)

• Van der Waals KräfteSchwache, lang-reichweitige Interaktion zwischennicht-polaren MolekülenTyp. Energie in Wasser ≤ 1 kcal/mol (≤ 2 kBT)

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9 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Wie gross ist ein einzelnes Wie gross ist ein einzelnes BiomolekülBiomolekül??

DNADNA--ProteinProtein KomplexeKomplexeDNA Durchmesser 2 nmDNA Durchmesser 2 nm

Menschliches HaarMenschliches HaarDurchmesser ~20 Durchmesser ~20 µµmm

10 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Cro ProteinCro Protein--DNA InteraktionDNA Interaktion(molekulare Erkennung einer DNA Sequenz)(molekulare Erkennung einer DNA Sequenz)

11 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Abbilden von NucleoAbbilden von Nucleo-- / Protein / Protein KomplexenKomplexen

Plasmid DNA geschnitten mit Restriktions Enzym HindIII

Protein filament (Titin)

Tip

2Rm

RcR’c

W

12 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Wo wirken Kräfte in Wo wirken Kräfte in PicoPico--NewtonNewton ??

1 nm3 Wasser (33 Moleküle) erfahren eine Gewichtskraft von FG=10-23 N = 0.00000000001 pN

Die Kraft, die zu einer chemischen Bindung führt, kann man ableiten als:Fchem= 1 eV / 0.1 nm = 1600 pN

Na Cl

Die Kraft, die der stärkste bio-molekulare Motor generieren kann beträgt ~ 60 pN

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13 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

WieWie misstmisst manman PicoPico--NewtonNewton ? ? InstrumenteInstrumenteKraftmikroskopieKraftmikroskopie

Positionsdetektor

Federbalken

Spitze

In Lösung

Optische PinzettenOptische Pinzetten

Der Kraft-Sensor ist einekleine Plastik Kugel,

die mit Licht festgehalten wird

0.05 – 10 µm

14 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Moleküle an GrenzflächenMoleküle an GrenzflächenMotivation:Abbilden einzelner Biomoleküle und Messen von kleinen Kräften zwischen Molekülen in einer natürlichen Umgebung (Lösung) ist möglich, wenn man Raster-Kraft Mikroskopie oder Optische Pinzetten benützt.

Was berücksichtigt werden muss:• Beeinflusst die Deposition eines Moleküls auf einer

Oberfläche die biologische Funktion?• Die Oberflächen müssen bio-kompatibel sein• Eine Methode für die spezifische Verankerung muss

entwickelt werden

15 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Chemische Aktivierung einer Chemische Aktivierung einer OberflächeOberfläche

16 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Oberflächen AktivierungOberflächen AktivierungInterketten Interaktionen(van der Waals,Elektrostatisch)

Oberflächen-aktive Kopfgruppe

Substrat

ω -funktionalisierte Interface Gruppe

X X XX

SiO

SiO

SiO

Si

SiO

SiO

SiO

SiO

O O OO

Monolayer mit einem kovalenten Poly-siloxane Netzwerk resultierend ausSilanisierung einer Glas Oberflächemit einem ω-funktionalisiertemOrganosilan.

S S S S S

X X X X X

Au(111)

Θ~30°

Chemisorption eines ω-funktionalisiertenAlkanthiols auf Au(111), führt zu einemdicht-gepackten MonolayerArrangement

SiO, Ta2O5, Au, Pt

STM Bild eines SAM

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17 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner MH, IfP Uni Basel

Synthese eines Synthese eines SAM MolekülsSAM Moleküls

OOHBr 1

OOHS

OHO S 3

I2

OOHSS

O

O

-O 2S2O32-

NHS/DCC oder MAL/DCC

DSUDMU SSNO

OOO

O

NO

O

O

DMU

S

HS

pH 6.5-7.5

DSU auf GoldWagner et al. Biophys. J. 70 (1996) 2052Hegner et al. J. Vac. Sci. Technol. B 14 (1996) 1418

18 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Messung der InteraktionenMessung der InteraktionenMotivationMotivation• Ist es möglich einzelne Interaktionen

von Biomolekülen zu detektieren?

• Können wir die Kraft einer einzelnenbiomolekularen Bindung quantifizieren?

• Besteht ein Zusammenhang zwischenden gemessenen Einzel-Molekül KraftMessungen und den thermodynamischen Daten?

• Ist es möglich neue Biosensorenbasierend auf dem EinzelmolekülExperiment zu entwickeln?

19 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

EnsembEnsemblele MessungenMessungenEinzelEinzel--MoleMolekükül Experimentl Experimentee

Ensemble Individuum

20 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

EnsembEnsemblele MessungenMessungenEinzelEinzel--MoleMolekükül Experimentl Experimentee

Mehr als eine Mesung ist nötig um Einblick in dieUntersuchten Eigenschaften zu ermöglichen (Statistik)Zugang zu Eigenschaften welche im gemittelten Resultatuntergehen

Ensemble Experimente:e.g. nM Konzentration (0,000000001M)Messung von 60’000’000’000’000 Moleküle / ZeitGemittelte Eigenschaften der Parameter werdengemessen

Einzel-Molekül Experimente:Messung an einem Molekül / Zeit

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21 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Mechanik + KinetikMechanik + Kinetik

FZell Adhesion

AFMF

Dissoziations KonstanteAB A + BKDiss = [A]*[B]/[A*B]Affinität:Chemische Anziehung; Biomolekulare Interaktion dieeine Spezifität zeigt

22 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Raster Kraft MikroskopRaster Kraft Mikroskop

Z

X

Y

A

B

Detektor

KraftBewegungAblenkung

Laser Quelle

Piezo Bewegung

Spitze

Oberfläche

A-B

23 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Dynamische Kraft SpektroskopieDynamische Kraft Spektroskopie

24 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Dynamische Kraft SpektroskopieDynamische Kraft Spektroskopie(Kraft Auflösung > 10 pN)(Kraft Auflösung > 10 pN)Motivation:• Ist es möglich einen Einblick in die Bindungs-Eigenschaften einer

einzelnen bio-molekularen Bindung zu gewinnen? • Hat das Experiment, das an einem Molekül gemessen wird einen

Bezug zu den Daten die wir am Ensemble messen?

50 nm

50 p

N

Forc

e

Piezo Position Einzel-Molekül Experimente korrelieren direkt mitthermodynamischen Experimenten (∆G; ∆H; ∆S)

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25 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Dynamische Kraft SpektroskopieDynamische Kraft Spektroskopie

Zeit die benötigt wird bis sich eine Bindung löst(Bell, Science 1978)

• Keine spezifische Stärkeeiner Interaktion

• τoff reduziert aufSekunden wenn externeKraft angelegt wird

( )

−∆=

TkWGW

BDoff expττ

Ziehen eines einzelnen Moleküls mit variierenden Geschwindigkeiten

F ∆x=W

∆x Reaktions-Koordinate

Ener

gie

26 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Dynamische Kraft SpektroskopieDynamische Kraft Spektroskopie

Wahrscheinlichste Kaft F* für Bindungs-Dissoziation(Evans and Ritchie, Biophys. J. 1997)

F*

0FxTkB =

offτ∝ rln(Beladungs-Rate)

- keine spezifische Kraft für die Dissoziation!- DFS misst makroskopische und mikroskopische Parameter

27 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Ist die gemessene Interaktion spezifisch?Ist die gemessene Interaktion spezifisch?

00.0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

50 100

spezifischunspezifisch

Kraft (pN)

Wah

rsch

einl

ichk

eit

Spezifische Verankerung der Moleküle auf Oberflächen

SubstratFunktionalität

Spacer

Bioreaktive Gruppe

Biomolekül

Wagner et al. Biophys. J. 70 (1996) 2052Hegner et al. PNAS 96 (1999) 10109

28 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Lebenszeit einer einzelnen BindungLebenszeit einer einzelnen Bindung

Steigung des linearen Fit : ∆H

TJ ~ 375 (±16) kJ/molDFM ~ 300 (±42) kJ/mol

3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7

-101234567

logτ (0

)[s ]

1/T x103 K-1][

DFMTJ

TATTAATATCAAGTTG

Lebe

nsda

uer

Schumakovitch et al. Biophys. J. 82 (2002) 517

∆G = ∆H - T∆S

Eine Bindung die man aufheizt hält weniger lang

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29 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Optische PinzetteOptische Pinzette Flüssigkeits-Kammer

∆830 nm

Laser

Mikropipette

OBJ O

BJ

EinzelnesMolekül resp.Rezeptor/Ligand

30 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

659 - 769455 - 390Violett

610 - 659492 - 455Blau

520 - 610577 - 492Grün

503 - 520597 - 577Gelb

482 - 503622 - 597Orange

384 - 482780 - 622Rot

Frequenz (THz)

Wellenlänge (nm)Farbe

Spektrum des LichtsSpektrum des LichtsUngefähre Wellenlänge (in Vakuum) undFrequenz Bereiche für die verschiedenen Farben

1 terahertz (THz) = 103 GHz = 106 MHz = 1012 Hz,1 nm = 10-3 µm = 10-6 mm = 10-9 m.Das weisse licht ist eine Mischung aller Farben des sichtbaren Spektrums.

Sichtbares LichtRegion des Electromagnetischen

Spektrums

0.7µm

0.6µm

0.5µm

0.4µm

Infrarot

Ultraviolett

31 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Warum können wir Partikel mit Warum können wir Partikel mit Licht festhaltenLicht festhalten??

Anetto Kraft

StrahlIntensität

Strahl Achseθ

A) Ein Licht brechendes Kügelchen wird in das intensivere Zentrum des Strahls gezogen, wird aber vom Licht von der Lichtquelle weg bewegt.

(B) Ein konvergierender Laserstrahl, fokusiert durch ein Linse, hält ein Kügelchen in einer konstanten axialen Position

BNettoKraft

Reflektiert

Reflektiert

Linse

Mikroskop Linse mitGrosser Nummerischer Appertur

32 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Doppel Strahl Laser PinzetteDoppel Strahl Laser Pinzette

pbs obj obj

diode laser

diode laser

spatial filter

x-y-z transl.

ccd camera

psd

pbs pbspbs

x-y-z transl.

White light

Faraday isolator

L1 L1

Faraday isolator

psd

flow cham

ber

qwp qwp

0.1 atten.0.1 atten.

blue filter

Grange W. et al. Rev. Sci. Instr. 73 (2002) 2308

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33 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Manipulation von Mikro Kugeln mit Manipulation von Mikro Kugeln mit optischen Pinzettenoptischen Pinzetten

Kugel Plazierung aufPipette und in 1er Trap

3 µm

Kugel in derDoppel-Trap

Kugel in 3Dbeweglicher Trap

Kugel gehalten mit Saugkraft aufbeweglicher Pipette

34 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Experimente mit optischer PinzetteExperimente mit optischer Pinzette

fixiert in 3Dbeweglich in 3D

Pipette beweglichin 3D

2µm

Molekül

Protein mitAffinität zu DNA

Geeignet für Experimente mit Einzel-Molekülen, Mechanikund Motor Proteine

Ziehen eines einzelnen DNA Moleküls

DNA Molekül ist an den Enden an die Oberfläche der Polystyrol Kugel gekuppeltBewegliche PipetteKugel Durchmesser ~2 µm

Husale S. et al. Single Mol. 3 (2002) 91

35 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Strahl SteuerungStrahl Steuerung

Kippen der optischen Ebene innerhalb der Rück-Appertur

Bewegen des ganzen Strahls innerhalb der Rück-Appertur

Kein Verlust vonLicht (Energie)innerhalb derFalle

Verlust von Licht(Energie)innerhalb der Falle, asymmetrisches‚trapping‘

36 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Laufende Entwicklungen am InstrumentLaufende Entwicklungen am InstrumentMotivation:• Biosensor mit sub pN Sensitivität für biologische Untersuchungen

an einzelnen Molekülen in Puffer Lösungen• Optischer Weg des Instruments erlaubt Kombination mit

Licht Spektroskopie

Inter oder intra Protein Rearrangierung nach Ligand Interaktion innerhalb Filament Protein-Komplexes (Aktin; Intermediäre Filamente, Transport durchNPC,…)

Simultane Einzel-Molekül Mechanik undFluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET)gemessen mit optischen Pinzetten

A

Exitation

Emission

EmissionA

D

Exitation

A

D

A

F

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37 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Jedem Gerät seinen AufgabenbereichJedem Gerät seinen Aufgabenbereich

Optische Pinzetten (∆F ~ 200 fN)Mechanische EigenschaftenMolekulare MotorenAuffalten von einzelnen MolekülenOptische Spektroskopie

Raster Kraft Mikroskop (∆F ~ 10 pN)Molekulare ErkennungMechanische DeformationAuffalten von einzelnen Molekülen

Mechanische Eigenschaften von dsDNA

38 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Elastizität von einzelnen DNA Elastizität von einzelnen DNA FragmentenFragmenten

Ausdehnung [µm]0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0

Kraft [pN]

05

101520253035404550556065707580

inextensibleworm like chain(WLC)

elastischer Modulusvon B-DNA

S-DNAÜbergang

extensible WLC

ssDNAextensible WLC

41)1(4

1 2 −−+= −

Lx

Lx

TkFAB

A: Molekül Persistenz LängeL: Kontur Länge

Inextensibles ‚worm like chain‘ Modell:

3/12*

41

=

ATSkF B

S: Stretch modulus

Kleine Moleküle die an die DNA binden,verändern ihre mechanische Eigenschaftgrundlegend

39 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

COOHmodifiziert

NH2modifiziert

BiotinNH2

EDCS-NHS

S-SMCC

DNAmodifiziert

DNAmodifiziert

b

bb

b

b

b

9931 bp

10456 bp

HS Biotin

DNA Kupplung an Polystyrol KugelnDNA Kupplung an Polystyrol Kugeln

Hegner, M. Single Mol. 1 (2000) 139

Kenntnisse von Oberflächen und Chemie

Auslenkung [µm]0 1 2 3 4 5 6 7

Kraf

t[pN

]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

*

ds DNA

ss DNA ssDNA-RecAFilament

Kraft – Auslenkung Graph von ssDNA-RecA Filament

Hegner, M., Smith, S. & Bustamante, C. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 96 (1999)10109

Mechanische Eigenschaften von Mechanische Eigenschaften von Protein Protein –– NukleinNuklein--Säuren KomplexenSäuren Komplexen

P

RecA Filament: Nano Feder mitmolekularem Griff

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41 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Molekulare Motoren (Molekulare Motoren (z.B.z.B. KinesinKinesin))

R. Milligan, Scripps Institute, http://www.scripps.edu/milligan

Kraft~ 4 pN

42 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Der stärkste bekannte BioDer stärkste bekannte Bio--MotorMotor((BacteriophageBacteriophage DNA packaging DNA packaging Motor)Motor)

43 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

DNA DNA packaging packaging motormotor

Tans, S. et al. Nature 2001

44 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

ZusammenfassungZusammenfassungTechniken Kraft-Regime Beispiele

10

100

Kraf

t [p

N]

1000Au-S

Si-C

Kova

lent

eBi

ndun

gen

AFM

Bio

mem

bran

Mik

ropi

pett

eO

ptis

che

Pin

zett

enM

agn

etis

che

Ku

geln

Poly

mer

Def

orm

atio

n

DextranHeparinAmylose

ssD

NA/

dsD

NA/

PEG

Poly

mer

Ela

stiz

ität

ssD

NA-

ssD

NA

Antig

en-A

ntik

örpe

r

Dis

sozi

atio

ns K

räft

era

ten

Abhä

ngig

!

Biot

in-(

Stre

pt)-

avid

in

Prot

ein

/ RN

A

Konf

orm

atio

nelle

Fal

tung

Rat

en A

bhän

gig!

MyosinKinesin

RNAP

Mol

ekul

are

Mot

oren

DNAP

PagenMotor

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45 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

(Bio(Bio--) Chemische Sensoren) Chemische Sensoren

opticalelectricalmagneticalthermalchemicalmechanical Signal

RekorderTransducerSensor Schicht

Analyte

Polymer Schicht

Immobilisierte Rezeptoren

MolekulareErkennung

Affinität

Bindungkonvertiert

in Signal

Verstärkungund Auslesen mit PC

46 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Federbalken ArraysFederbalken ArraysMotivation:• Biomolekulare Detektion mittels Federbalken Arrays• Brauchbar für Genomics (SNPs), Proteomics?• Echt Zeit Detektion am Spital Bett?

Mikro fabriziert(skalierbar), schnelleAntwort, autonomNächste GenerationBio-Sensor?Minimum von 2 Federbalken auf einem Chip

cantilever array

47 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

GeneGene--Chip Chip vonvon AffymetrixAffymetrix

~4000 sFr. / chip

Probe Molekülemüssen markiert sein

48 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Federbalken Array Sensor AufbauFederbalken Array Sensor Aufbau

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49 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

DNA Hybridisation gemessen mit DNA Hybridisation gemessen mit Federbalken ArraysFederbalken Arrays

Federbalken array Sensorfunktionalisiert mit verschiedenen12 mer Oligonukleotiden

Injektion von komplementären 12 mer Oligonukleotiden Bio B1C in die Flüssigkeits-Zelle ergibt ev. Hybridisation

Der korrespondierende Federbalken Bio B1 verbiegt sich und ein Ablenkung-Signal wird messbar

Injektion von Mittel das die Interaktion löst (e.g. H2O pur) löst die Bindung und der Federbalken bieg sich zurück

Injektion von Bio B2C biegt den Federbalken Bio B2

McKendry et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) 9783 50 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Detektion von Zielsubstanz in Detektion von Zielsubstanz in Überschuss von ‚junk‘ MolekülenÜberschuss von ‚junk‘ Molekülen

Injektion von250 nM B1Cund 20 µM B7C

51 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Schnelle (mobile) Diagnose am Spitalbett für Intensiv-Station Patienten

Verschiedene Parameter (Herz Schlag Rate, ECG, Atmung, ...) werden ‚online‘ überwacht mit verschiedenen Instrumenten in der Intensiv Station.

Y. Arntz et al. Nanotechnology 14 (2003) 86-90

CardiovaskulCardiovaskulääre re ApplikationApplikation

52 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Herz Infarkt Symptome: Brust Schmerzen, Schwierigkeiten beim AtmenMögliche Diagnose: Abnormitäten im ECG, Blut Test (Biomarker Expression), etc.

• Biomarker Detektion: Ausschüttung von Creatine Kinase, Troponin, Myoglobin~ 1-2 Std. nach der Beschädigung der Herz Muskulatur (tote Muskel Zellen) Konzentration indiziert Ausmass des Herz Infarkts

Heutige Test werden mittels ELISA durchgeführt (enzyme linked immuno sorbentassay)

Ein Federbalken array Gerät würde eine ‚online‘ Überwachung ermöglichen. Labor Test würde entfallen.

Diagnose mittels Federbalken ArraysDiagnose mittels Federbalken Arrays

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53 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Proteomics mittels Federbalken Proteomics mittels Federbalken Arrays?Arrays?

Antikörper

Crosslinker

20nm Au 2nm Ti

Si

Silanisierung

NHS PEG

Ablenkungs Mechanismus

Ablenkung resultiert aus Stress induziertdurch die Interaktion des Analytsmit der sensitiven Schicht

Mehrere Schrittefür Funktionalisierung einzelner

Federbalken

Funktionalisierung des Federbalkens

Mikro-Kapillare

54 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Mehrfach Antikörper Federbalken ArrayMehrfach Antikörper Federbalken Array

Myoglobin 50 µg/mlCreatine Kinase 50 µg/mlHintergrund 100 µg/ml BSA

Schnelle Diagnostik?

-80

-60

-40

-20

0

20

40

Dif

fere

nti

elle

Abl

enku

ng

[nm

]

0 5000 10000 15000

Zeit [s]

Myo proBuffer Buffer CK pro Buffer

55 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Federbalken Federbalken -- SchlussfolgerungenSchlussfolgerungen• Wir können DNA und Proteine detektieren, die spezifisch an

die Federbalken Oberfläche binden. Die Interaktion bewirkteine mechanische Ablenkung der Federbalken. Die Ablenkungist proportional zu der Menge Moleküle die wir einspritzen.

• Ein differentielles Auslesen des Signals ist nötig

• Statischer Modus (Oberflächen Stress): Verbiegen des FederbalkenAsymmetrisches Funktionalisierung notwendigdicht gepackter Bio-Moleküle Monolayer notwendig

• Dynamischer Modus: Eine Massenzunahme wird detektiertFrequenz/Phasen Verschiebung der resonanz Frequenz

• Federbalken Bio-Sensoren werden wichtige Sensoren für dieBio-Diagnostik

56 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Cantilever

xxx xxx xxxxxxxxx xxxxxxxxxxx x x x xxx xx x x

K+

Top Nano 21 Programm:Top Nano 21 Programm:Funktionalisierte Federbalken ArraysFunktionalisierte Federbalken Arrays

Ibuprofin

Modul 2:Protein FederbalkenArray

Modul 3:Schnelle Mikro-organismenDetektion

Modul 4:Verstärkung mitDendrimeren

Modul 5:Enantio spezifischeDetektion

Modul 6: Beschichtungs-Prozeduren

Modul 7:Molekulares Imprinting

Modul 8:Ökonomie: MarktForschung

Modul 1:SAM und PlasmaDeposition

Leitung M. Hegner Start 9/02Leitung M. Hegner Start 9/02

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57 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Biophysik Gruppe am Institut für Biophysik Gruppe am Institut für PhysikPhysik

Personen die diese Resultate ermöglicht haben:Dr. Y. ArntzDr. P. BertonciniDr. T. BraunDr. G. BumbuDr. K. GfellerDr. W. GrangeDr. E. RebourtDr. N. NugaevaDr. J. ZhangA. BreedekampS. Husale

PI M. Hegner

58 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Herzlichen Dank für Eure Herzlichen Dank für Eure AufmerksamkeitAufmerksamkeit

‘Nano’ Smiley (DNA-protein co deposition)

59 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

AnhangAnhang

60 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

FlussFluss derder genetischengenetischen InformationInformation

DNA

RNA

Protein

Transkription

Translation

Replikation DNA Polymerase

RNA Polymerase

Ribosom

Molekulare MotorenPrionen

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61 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Grenzflächen Grenzflächen z.B.z.B. GoldGold

Gold mittlere Rauheit ca. 4 - 5 Å über 100 µm2

1.2.

3.

4.

5.

GlimmerGold

Silizium WaferOder Deckglass

Epoxy-Leim (EPO-TEK 377)

Ultraflaches Gold

STM Bilder: Tunnel Strom(Itun) 1 nA und Spitzen

Spannung (Vbias) - 200 mV

Hegner et al. Surf. Sci. 291 (1993) 39Wagner et al. Langmuir11 (1995) 3867

vorher

2 µm

2 µmnachher TSG

Z = 50 nm

Z = 50 nm Z = 5 nm

Auf Gold können wir Biomoleküle spezifisch verankern

62 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Momentum eines PhotonsMomentum eines PhotonsF = dP/dT

P = h/λ

Bead∆P

P1

P2Θ

Sammel-Linse transformiert Austrittswinkel in Strahlen Offset(nach Abbe sine Bedingungen): Xi = RL nb sinΘi

Positions-sensitiver Licht Detektor summiertüber alle Licht Strahlen und ergibt ein Signal

S = ΣXiWi

Externe Kraft wird berechnet nach:F = S/RLc

Reaktions Kraft auf Kügelchen: |F| = (W/c) nb sinΘ

Unabhängig von Partikel Grösse, Form oder Brechungsindex des Puffers

P = Momentum des PhotonW = Energie des Lasersc = Lichtgeschwindigkeitnb= Refraktiver Index des MediuRL= Fokal Länge der Linse

63 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Kraft Messung mittels Momentum des Kraft Messung mittels Momentum des LichtsLichts

Wellenlänge: 830 nmIntensität: 200mW (per Laserdiode)

OBJOBJPuffer Luft

OBJOBJ

ExterneKraft ∆X R

EX

2RL

Detektor Detektor

Maximum Kraft der Falle (~220 pN @ IfP)F =(W/c)/(r -r )/R LMax Rück-Appertur Strahl

Diese Art Messung sollte nicht benützt werden in einer Einzel-StrahlFalle, weil ein solch schmaler Licht Konus (wie oben gezeigt) ein Objekt nicht effizient festhalten kann. Wenn man die Rück-Appertur komplett ausfüllt, dann hat man einen grossen Gradienten der einObjekt festhalten kann, aber dann kann man nach einer Ablenkung nicht alle Photonen auf dem Detektor einsammeln.

64 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

Layout des ‚Herz‘ des InstrumentsLayout des ‚Herz‘ des Instruments

Flüssigkeits-Kammer:Zwei Deckgläser mitParafilm; Kanal für Mikro-Pipette

Olympus 1,2 N.A.60xWasser ImmersionWD 280 µm

Flüssigkeits-Zufuhr

Expansions-FlaschenVakuum-Druck Automatische

Spritze