Dynamische Vorgänge in Lipidmembranen (B10)

Christopher Bronner, Frank Essenberger (GB4)Freie Universität Berlin

Tutor: Dr. Otto

16. September 2007Versuchsdurchführung am 17. September 2007

1 Vorbereitung

1.1 Fluoreszenz-Spektroskopie1.1.1 Grundlagen der Spektroskopie

In diesem Versuch beschäftigen wir uns mit Fluoreszenz, einer Spektroskopie-Methode, die auf optischeAnregung und darauffolgender Lichtemission beruht. Bei der Art der uns vorliegenden organischen Mo-leküle sind die Anregungszustände niedrigster Energie die antibindenden π∗-Zustände. Wir betrachtenalso Übergänge der Art π → π∗, die wir durch elektromagnetische Strahlung induzieren. Sowohl fürdie Absorption als auch für die fluoreszierende Emission von Licht ist das Übergangsdipolmoment

~µi→f = −e 〈ψf |~r|ψi〉

von großer Bedeutung. Es repräsentiert (anschaulich betrachtet) den Unterschied in der Ladungsdichteeines Systems vor und nach einer Anregung von einem Zustand ψi in einen Zustand ψf . Sein Betragist dabei proportional zur Wahrscheinlichkeit, dass der Übergang tatsächlich stattfindet.

Weiterhin ist die Polarisationsrichtung von einfallendem Licht mit entscheidend für die Absorpti-onswahrscheinlichkeit, welche nämlich am höchsten ist, wenn die Polarisationsrichtung parallel zumÜbergangsdipolmoment ist und im Fall eines Winkels von 90◦ zwischen den beiden Größen verschwin-det.

Im Folgenden werden wir verschiedene elektronische und vibronische Zustände sowie Übergangezwischen diesen betrachten, die allerdings i.A. auf sehr kleinen Zeitskalen stattfinden, sodass wir vonder Born-Oppenheimer-Näherung Gebrauch machen können, welche eine Trennung von Kern- undElektronenbewegung vorschlägt, da die Kerne aufgrund ihrer großen Masse viel träger sind, als dieElektronen.

Löst man die Schrödingergleichung für ein Molekül unter Zuhilfenahme der Born-Oppenheimer-Näherung, erhält man neben den elektronischen Zuständen, die das Potential für die Kernbewegungdarstellen, äquidistante Vibrationszustände1. Bei einem elektronischen Übergang stehen also eine gan-ze Reihe von Endzuständen zur Verfügung, die aber unterschiedliche Übergangswahrscheinlichkeitenhaben. Diese werden durch die Franck-Condon-Faktoren beschrieben, welche schlicht den Überlappder Kern-Wellenfunktionen von Anfangs- und Endzustand,⟨

ψvf |ψvi⟩,

darstellen. Das Franck-Condon-Prinzip erklärt, welcher vibronische Endzustand für einen bestimmtenelektronischen Übergang wie wahrscheinlich ist, die Übergangswahrscheinlichkeit ist nämlich propor-tional zum zugehörigen Franck-Condon-Faktor. Anschaulich kann man sagen, dass ein Endzustand

1Normalerweise erhält man auch noch Rotationszustände, die aber in unserem Fall aufgrund der Größe der Moleküleund deren Umgebung (eine Flüssigkeit) nicht angeregt werden.

1

wahrscheinlicher ist, in dem die Kernwellenfunktion, also gewissermaßen die Bewegung der Kerne,dem Ausgangszustand möglichst ähnlich ist, sodass keine allzu großen abrupten Veränderungen derKern-Dynamik notwendig sind.

1.1.2 Relaxation in der Grundzustand

In unserem Experiment werden wir Moleküle zunächst mit Licht in einen höheren elektronischen Zu-stand anregen, von wo aus das System in den Grundzustand zu relaxieren sucht. Zu diesem Zweck ste-hen ihm verschiedene Prozesse zur Verfügung. Zunächst ist zwischen Singulett- und Triplettzuständenzu unterscheiden, je nach dem wie der Spin des angeregten Elektrons ausgerichtet ist. Im Grundzu-stand befinden sich die betrachteten Moleküle in einem Singulett-Zustand S0. Bei der Absorption sindÜbergänge in Triplett-Zustände quantenmechanisch verboten und die angeregten Zustände könnenalso mit S1, S2, usw. bezeichnet werden.

Abbildung 1: Anregung und Lumineszenz in einem Energiediagramm [1]

Aus einem angeregten Zustand oberhalb von S1 relaxiert das Molekül zunächst strahlungslos inden Zustand S1. Bei diesem Relaxationsprozess wird das System in einen Schwingungszustand glei-cher Gesamtenergie des elektronischen Zustandes S1 überführt. Durch Temperaturausgleich mit derUmgebung gelangt das System anschließend in den niedrigsten vibronischen Zustand von S1. Da die-se Art der Relaxation wesentlich schneller ist als Lumineszenz (s. unten), ist sie praktisch die einzigvorkommende. Aufgrund des höheren Energieunterschiedes zwischen S1 und S0 wäre dort jedoch eineMehrzahl von Schwingungsquanten anzuregen, weshalb Lumineszenz deutlich wahrscheinlicher wird.

Abbildung 2: Mögliche Relaxationsprozesse [2]

2

Vom niedrigsten Zustand von S1 aus gibt es nun eine Reihe von Prozessen, über die das Systemin den Grundzustand zurückfinden kann. Sowohl strahlungslose Übergänge, Entwicklung von Wärme,die Abgabe an einen sog. Quencher (s. Abschn. 1.2.3) oder den Übergang in den Triplett-ZustandT1(„intersystem crossing“) als auch strahlende Übergänge, Lumineszenz, sind möglich.

Lumineszenz bezeichnet allgemein den Übergang eines Systems in den Grundzustand unter Abgabevon Licht. Dabei unterscheidet man zwischen Fluoreszenz und Phosphoreszenz. Bei ersterer ist derAnfangszustand der Singulett-Zustand S1, bei letzterer der Triplett-Zustand T1.

1.1.3 Quantenausbeute

Als Quantenausbeute bezeichnet man die Größe

Φ =kf

kf + kic + kisc + kQ,

worin kf die Übergangsrate für Fluoreszenz, kic die für innere Umwandlung, kisc die für „intersys-tem crossing“ und kQ die für Quenching darstellt. Die Quantenausbeute ist ein Maß für die Anzahlfluoreszierender Übergänge, verglichen mit den einfallenden Photonen.

1.1.4 Lebensdauer

Die Lebensdauer eines angeregten Zustands kann auf zweierlei Weise charakterisiert werden; im Hin-blick auf die Fluoreszenz ist die „Strahlungslebensdauer“

τF =1kf

naheliegend, wenn auch die „tatsächliche Lebensdauer“ realistischer ist, da sie auch andere Übergängemitberücksichtigt:

τ =1

kf + kic + kisc + kQ

Diese Größen beschreiben jeweils eine exponentielle Abnahme der Besetzung des angeregten Zustandes.

N(t) = N0e− tτ

Unter Verwendung der Quantenausbeute gilt somit die Beziehung

τ = τFΦ.

1.1.5 Rotationsdiffusion

Regt man eine isotrop verteilte Menge von Molekülen mit polarisiertem Licht an, entsteht eine Ani-sotropie dadurch, dass die Übergangswahrscheinlichkeit mit dem Winkel θ zwischen Übergangsdipol-moment und einfallendem Licht wie cos2 θ abnimmt („Photoselektion“). Die angeregten Moleküle sindalso nicht mehr statistisch ausgerichtet, beginnen aber direkt nach der Anregung wegen der üblichenMolekülbewegung damit, sich statistisch zu verteilen. Dabei fluoreszieren sie natürlich ebenfalls undgeben entsprechend ihrer aktuellen Ausrichtung polarisiertes Licht ab, sodass man diese Rotationsdif-fusion durch Polarisationsmessungen zeitlich auflösen kann. Zur Beschreibung des emittierten Lichtsdienen Polarisationsgrad P und Anisotropie R.

P =I‖ − I⊥I‖ + I⊥

R =I‖ − I⊥I‖ + 2I⊥

3

1.1.6 Spektren

Die spektrale Verteilung der emittierten Strahlung (Fluoreszenz) ist unabhänig von der Anregungs-energie, da der niedrigste Zustand von S1 immer der Ausgangszustand ist. Im Anregungsspektrum2

können dagegen auch höhere Schwinungszustände angeregt werden, weshalb auch kleinere Wellenlängefür die Übergänge in Frage kommen. Für die Emission kommen aber abgesehen von dem Übergangzwischen den beiden niedrigsten Niveaus nur größere Wellenlängen vor. Die einzige Überlagerung derbeiden Spektren ist also dieser 0 → 0-Übergang. Sind die vibronischen Strukturen von S0 und S1

annähernd gleich, ergeben sich spiegelbildliche Spektren, wie in Abb. 3 zu sehen.

Abbildung 3: Absorptions- und Fluoreszenz-Spektrum (links, [1]) und energetische Übergänge (rechts,[2])

Abhängig davon, ob man die Anregungsenergie oder die (gemessene) Emissionsenergie variiert3,erhält man entweder ein Fluoreszenz-Anregungsspektrum oder ein Fluoreszenz-Emissionsspektrum.

1.2 Einflüsse der Umgebung1.2.1 Reabsorption

Steigt die Konzentration der Fluorophore in der Lösung an, steigt die Wahrscheinlichkeit, dass dieemittierten Photonen (sofern sie in dem Teil des Emissionsspektrums sind, der mit dem Absorptionss-pektrum überlappt) zur Anregung eines weiteren Fluorophors führen. Dieser Vorgang kann sich leichtviele Male hintereinander ereignen (n mal) und bei jedem Emissionsprozess steigt die Wahrscheinlich-keit, dass ein strahlungsloser Übergang einsetzt. Daher sinkt die Quantenausbeute auf Φn.

1.2.2 Dimere / Excimere

Die Fluorophore können Dimere ausbilden. Dimere im Grundzustand sind

A+A A2.

Durch diese Dimerbildung wird die Konzentration der Fluorophre verringert. Das Auftreten von Di-meren ist häufig mit einer Verschiebung des Absorptionsspektrums hin zu längeren Wellenlängen ver-bunden.

Das Emissionsspektrum wird nicht verändert, da Dimere im Allgemeinen nicht fluoreszieren. EineAusnahme stellen die Excimere dar. Sie entstehen aus einem Fluorophor im Grundzustand und einemangeregten Fluorophor.

A+A∗ A∗2.

Durch Excimere findet keine Veränderung des Absorbtionsspektrums statt. Im Emissionsspektrumtritt jedoch ein neuer Peak durch die Excimere auf.

2Es handelt sich natürlich um ein Absorptionsspektrum.3und dabei die jeweils andere konstant hält

4

Abbildung 4: Fluoreszenz-Spektrum mit Excimer-Peak [1]

1.2.3 Quenching

Eine weitere Form der Wechselwirkung mit der Umgebung ist das sog. Quenching, bei dem manzwischen dynamischem und statischem Fall unterscheidet.

Beim dynamischen Quenching gibt das angeregte Molekül Energie an ein Quencher-Molekül ab,welches nicht fluoreszieren kann und die Energie in Vibrations-, Wärmeenergie o.ä. umwandelt. Fürdas Verhältnis der Quantenausbeuten mit und ohne Quencher gilt4

Φ0

Φ=

kf + ki + kQkf + ki

= 1 +kQ

kf + ki.

Man definiert nun eine neue Lebensdauer τ0 = 1kf+ki

und nimmt an, dass die Übergangsrate durchQuenching, kQ, proportional zur Konzentration der Quencher ist, kQ = K · cQ. Daraus folgt die sog.Stern-Volmer-Gleichung.

Φ0

Φ− 1 = Kτ0cQ

Beim statischen Queniching handelt es sich um einen Energieübertrag auf einen Komplex aus demanzuregenden Molekül und dem Quencher. Analog zu oben erhält man hier ebenfalls eine Stern-Volmer-Gleichung,

Φ0

Φ− 1 = KacQ,

mit Ka der Komplexbildungskonstanten. Im Unterschied zu oben liegt in diesem Fall keine Abhängig-keit von der Lebensdauer des angeregten Fluorophors vor.

1.3 DPH in der DMPC-MembranIn unserem Fall ist das fluoreszierende Molekül das Diphenylhexatrien (DPH). Dieses wurde gewählt,da es von der Länge in die Membran eines Lipid-Vesikels (Doppelschichtkugel) passt. Außerdem istseine Quantenausbeute (siehe Abschn. 1.1.3) in Wasser sehr viel kleiner

(ΦmemΦH2O

≈ 1200

)als in der

Membran. Deshalb sehen wir bei den Messungen nur DPH-Moleküle, welche sich in der Membran desVesikels befinden. Die Fluoreszenz hängt dabei unter anderem von folgenden Parametern ab:

• Abstand zu anderen Molekülen(s. 1.3.1)

• Beweglichkeit des DPH-Moleküls in der Membran (s. 1.3.2)

• Temperatur→Phase der Membran (s. 1.3.3)4Verkürzend: ki = kic + kisc

5

Es ist möglich über alle diese Parameter Informationen zu gewinnen. Wie dies genau funktionierterklären wir in den folgenden Abschnitten.

Abbildung 5: Das DPH-Molekül in der aus DMPC-Molekülen bestehen Membran [Praktikumsskript]

1.3.1 Abstand zu anderen Molekülen

Hier macht man sich den Energieübertrag (Förster-Transfer) zu nutze. Dabei gibt ein DonormolekülEnergie an ein Akzeptormolekül ab. Dieser Energieübertrag lässt sich als Resonanzphänomen verste-hen. Man stellt sich die Moleküle als gekoppelte Pendel vor. Dann ist der Energieübertrag auf dasandere Pendel auch nur gut möglich, wenn die Eigenfrequenzen der Pendel nahe beieinander liegen.

In der Sprache der Quantenmechanik heißt dies nun, dass sich das Emissionsspektrum des Donatorsund das Absorbtionsspektrum des Akzeptors überlappen müssen.

Abbildung 6: Absorptions- und Emissionsspektren für Donator und Akzeptor [1]

Desweiteren muss das Donormolekül eine hinreichend lange Fluoreszenz-Lebensdauer aufweisenund darf nicht weiter als ≈ 10 nm vom Akzeptor entfernt sein. Deshalb ist die Transfereffizienz ET

6

mit den Abständen verknüpft.

ET =r60

r6 + r60

mit r dem Abstand zwischen Donator und Akzeptor sowie r0 dem Abstand, bei dem die Wahrschein-lichkeit für den Förster-Transfer gleich der Relaxation des angeregten Donators durch andere Effekteist.

Von der Energiebilanz ist dieser Effekt der Reabsorbtion eines emittierten Photons sehr ähnlich.Jedoch ist es ein völlig anderer Mechanismus, da er zum einen räumlich begrenzt ist und zum anderenschon erfolgt, bevor ein Photon emittiert wird (keine Lebensdauer).

1.3.2 Beweglichkeit in der Membran

Um hier Informationen zu gewinnen, schickt man einen polarisierten Laserpuls in die Probe. Dieserregt dann bevorzugt parallel gestellte Übergangsdipolmomente an. (s. 1.1.5). Wenn nun alle angeregtenMoleküle gleich wieder ein Photon emittieren würden, hätte das Emissionsspektrum fast die gleichePolarisation wie der Laserpuls.

Jedoch haben die angeregten Zustände eine endliche Lebensdauer und in dieser Zeit bewegen sichdie DPH-Moleküle und verdrehen so ihr Dipolmoment. Dies führt zur Depolarisierung des emittiertenLichts. So kann über die Geschwindigkeit der Depolarisierung auf die Beweglichkeit des DPH-Molekülsgeschlossen werden. In Formeln braucht man als erstes ein Maß dafür, wie gut das emittierte Lichtpolarisiert ist. Dies ist die Anisotropie R. Sie ist definiert als

R =I‖ − I⊥I‖ + 2I⊥

.

Abbildung 7: Messprinzip zur Bestimmung der Polarisation (links) und Verteilung der Übergangsdi-polmomente in einem isotropen Ensemble (rechts) [1]

In der Praxis hat sich gezeigt, dass sich der zeitliche Verlauf der Anisotropie durch zwei Exponen-tialfunktionen und vier Parameter gut darstellen lässt.

R(t) = R∞ + (R0 +R∞)[Re−t/φ1 + (1−R) e−t/φ2

](1)

Mit R = R1(R0−R∞) , R(0) = R0, R(∞) = R∞und R1 = R(φ1). Die Viskosität des Membranzwischen-

raumes ergibt sich dann als

η =kBT

6DVef.

7

Wobei sich die Diffusionkonstante D als D =(

1− R∞R0

)/6φder mit φder =

(Rφ1

+ 1−Rφ2

)−1

ergibt. Fürdas DPH-Molekül ist der Wert für Vef 5 bekannt und beläuft sich auf (1, 63± 0, 34) · 10−22 cm3.

1.3.3 Temperatur→Phase der Membran

Bei sich ändernder Temperatur kann ein Phasenübergang in der Membran stattfinden. Dieser Phasen-übergang kann über das Emissionsspektrum sehr genau bestimmt werden. In unseren Fall findet beietwa Tc = 23◦ ein Übergang von dem Gelzustand in die flüssig-kristalline Phase statt.

Nun könnte es sein, dass die DPH-Moleküle nur in die Membran eindringen können, wenn dieDMPC-Moleküle in der Membran einen bestimmten Aggregatzustand aufweisen. Da sie in Wasser einesehr geringe Quantenausbeute haben würde die Intensität des Emissionsspektrums bei Tc stark erhöht.

Dies ist jedoch nicht der Fall, dennoch lässt sich der Phasenübergang bestimmen. Die Zeiten, indenen die Anisotropie R in ihren Anfangswert (Isotrope-Verteilung) relaxiert, hängen stark vom Ag-gregatzustand ab. Die Beweglichkeit der Moleküle ändert sich bei einem Phasenübergang sprungartig.

Abbildung 8: Temperaturabhängigkeit des Polarisationsgrades [1]

1.4 van’t-Hoff-EnthalpieAus R(T ) lässt sich außerdem das Verhältnis der Phasen beim Phasenübergang bestimmen. Der Um-wandlungsgrad (M1 = Anzahl der Atome in Zustand 1 und M2 = Anzahl der Atome in Zustand 2)

θ =M2

M1 +M2,

welcher sich so wie in Abb. 9 aus R(T ) ergibt, gibt nämlich Aufschluss über die EnthalpieänderungδH beim Phasenübergang. Es gilt nämlich

∂θ

∂T

∣∣∣∣T=Tu

=δH

4R(Tu)T 2u

.

Die so bestimmte Enthalpieänderung δH für die Reaktion von Zustand 1 in Zustand 2 ist viel größerals die kalorimetrische Enthalpie von Hth = 30 kJ

mol .

5Ve ist das effektive Volumen und f ist der Formfaktor

8

Abbildung 9: Verlauf von R(T ) und Definition von Tu.

1.5 Herstellung der LösungUm eine 1-millimolare Lösung DPH herzustellen würden wir 0, 232 g DPH abwiegen. Dies entspricht10−3 mol, da DPH eine molare Masse von 232, 3 g

mol hat.Diese 0, 232 g würden wir dann in einen Messkolben (100 ml) hineingeben und ihm bis zur 100 ml

Markierung mit THF füllen.

2 MessprotokollAls erstes haben wir mit der Gleichlicht-Apparatur einige Spektren aufgenommen. Dabei war nur dererste Ast in Betrieb. Der zweite kommt erst bei der Messung der Anisotropie zum Einsatz.

Abbildung 10: Aufbau zur Gleichlichtmessung

9

Als Lichtquelle wurde eine Hochdruck-Xenonlampe verwendet. Durch den Druck unter dem dasXenongas steht liefert es ein kontinuierliches Spektrum.

2.1 Anregungsspektrum von DPH in DMPCHier wurde im Wellenlängenbereich von 270 nm bis 420 nm angeregt und die Intensitäten der 450 nmLinie am Detektor gemessen. Der Messbereich am Photomultiplier betrug 1 µA.

Abbildung 11: Anregungsspektrum von DPH in DMPC

Für vier eingestrahlte Wellenlängen erhlaten wir eine erhöhte Intensität.

Wellenlänge in nmλ1 332± 11λ2 343± 6λ3 360± 8λ4 379± 6

Tabelle 1: Peaks im Anregungsspektrum von DPH in DMPC

2.2 Emissionsspektrum von DPH in DMPCNun wurde der Wellenlängenbereich am Detektor von 380 nm bis 530 nm durchgefahren und mit Lichtfester Wellenlänge von 360 nm angeregt. Die Intensitäten der emittierten Strahlung ist in Abb. (12)dargestellt. Der Messbereich am Photomultiplier betrug ebenfalls 1 µA.

10

Abbildung 12: Emissionsspektrum von DPH in DMPC

Die Peaks sind nicht so scharf wie beim Anregungsspektrum. Wir finden dennoch vier Linien.

Wellenlänge in nmλ5 405± 9λ6 427± 9λ7 450± 12λ8 474± 21

Tabelle 2: Peaks im Emissionsspektrum von DPH in DMPC

2.3 Emissionsspektrum von DPH in THFUm die Quantenausbeuten von DPH in DMPC und in THF vergleichen zu können wurde noch einEmissionsspektrum von DPH in THF aufgenommen. Der Messbereich am Photomultiplier betrug10 nA.

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IH / bel. Einh. ∆IH / bel. Einh. IV / bel. Einh. ∆IV / bel. Einh. Temperatur / ◦C5,8 0,1 2,3 0,1 7,36,3 0,1 2,8 0,1 9,15,9 0,1 2,8 0,1 15,05,8 0,1 2,9 0,1 17,85,4 0,1 3,1 0,1 21,25,5 0,1 3,2 0,1 22,15,9 0,1 3,5 0,1 22,45,7 0,1 3,7 0,1 23,05,8 0,1 3,9 0,1 23,45,7 0,1 3,9 0,1 24,05,9 0,1 4,0 0,1 24,44,7 0,1 3,4 0,1 25,04,6 0,1 3,3 0,1 26,14,5 0,1 3,3 0,1 26,93,7 0,1 2,8 0,1 30,53,6 0,1 2,9 0,1 34,3

Tabelle 3: IV und IH in Abhängigkeit der Temperatur

Abbildung 13: Emissionsspektrum von DPH in THF.

2.4 AnisotropiemessungNun wurde die Anisotropie in Abhängigkeit der Temperatur gemessen. Dazu wurde die Probe mittelseines Heizsystems temperiert. Desweiteren wurde gleichzeitig die vertikale Intensität am Ast 1 und diehorizontale Intensität am Ast 2 gemessen.

Da die Quantenausbeute der Detektoren polarisationsabhängig ist, mussten die Detektoren geeichtwerden. Dazu wurde im Monochromator Licht mit gleichen Teilen vertikal und horizontal polarisiertemLicht erzeugt und die Zählraten an den Detektoren mit den Blenden angeglichen. Diese Prozedur wurdevor jeder Anisotropiemessung wiederholt.

Während der Messung musste leider der Messbereich des Photomultipliers verändert werden, da wireinen Vollausschlag hatten. Außerdem veränderte sich die Temperatur während einer Messung immer

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ein wenig. Wir notierten immer den Mittelwert der Temperatur vor und nach der Messung.

2.5 Zeitaufgelöste MessungNun wechselten wir die Apparatur. Der Aufbau ist jedoch mit dem der ersten Messung vergleichbar.Nur die Lichquelle erzeugt nun Lichtpulse mit einer Frequenz von 40 kHz. Dabei wird zwischen zweiMetallspitzen eine Spannung von 6 kV angelegt. Es kommt zu einem Ladungsübersprung. Der Strom-fluss beträgt rund 1,5 mA. Als Füllgas zwischen den beiden Spitzen wird H2 verwendet. Über dieseWerte lässt sich die Pulsenergie von maximal 6 ·1, 5 W = 9 W abschätzen. Jedoch wird nur ein kleinerTeil der gesamten Energie in Strahlung umgewandelt.

Es wurde eine Probemessung mit einem reinen Streukörper als Probe durchgeführt, um die Lam-penfunktionen und Einflüsse der Elektronik auszufiltern. Es wurden drei Messungen durchgeführt bei10◦C, 23◦C und 35◦C. Außerdem geschieht die Messung über einen Vielkanalanalysator. Dieser istauf die Erzeugung eines Lichpulses getriggert und beginnt dann linear eine Spannung hochzufahren.Wenn dann ein Photon detektiert wird (single photon detection), wird es entsprechend seines Span-nungswertes in einen Kanal einsortiert.

Abbildung 14: Funktionsprinzip des Vielkanalanalysators

Deshalb muss eine Eichung zwischen Kanal und Zeit erfolgen, da die Steigung der Spannung Unicht bekannt ist. Dazu betrachten wir immer den Kanal mit maximaler Intensität und fügen einebekannte Zeitverzögerung über eine Delay-Schaltung ein.

Zeitverzögerung in ns Kanal mit maximaler Intensität32 1536 7140 12744 18348 240

Tabelle 4: Zeiteichung des Vielkanalanalysators

Auch hier sind die Quantenausbeuten der Photodetektoren abhängig von der Polarisation. Deshalbwurde jeweils eine Minute vom Detektor nur horizontales und dann vertikales Licht gleicher Intensitätgemessen.

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Counts pro MinuteIH 108529IV 80342

Tabelle 5: Eichung der Detektoren

3 Auswertung

3.1 Bestimmung von ω, k und x0

Als erstes werten wir das Anregungsspektrum aus. Hier gewinnen wir Informationen über die Energie-abstände im angeregten Zustand.

Abbildung 15: Anregungsspektrum: Der beobachtet Energiewert ist fest und die Anregungsenergie wirdvariiert.

Als Energiedifferenzen zwischen je zwei benachbarten Linien fanden wir im Mittel

∆E∗ = (2, 47± 1, 04) · 10−23 J.

Wenn wir nun ∆E∗ = ~ω∗ annehmen, ergibt sich

ω∗ = (2, 34± 0, 98) · 1014 1s.

Für das Emissionsspektrum gewinnt man Informationen über die Energieabstände im Grundzustand.

14

Abbildung 16: Emissionsspektrum:Der beobachtet Energiebereich wird variiert und die Anregungser-nergie ist fest.

Hier sind die analogen Größen:

∆E = (2, 38± 1, 02) · 10−23 J

ω = (2, 26± 0, 97) · 1014 1s.

Wir werden im Weiteren alles in Wellenzahlen ausdrücken. ( ω2πc

1100 = ω′ mit [ω′] = 1

cm ).

ω in 1cm k = mCω

2 in Nm x0 =

√~mω in 10−10m

Angeregter Zustand 1243± 522 1099± 653 0, 05± 0, 01Grundzustand 1200± 512 1025± 619 0, 05± 0, 01

Tabelle 6: Bestimmung der wichtigen Größen Kraftkonstante k, Nullpunktsschwingung x0 und ω fürden angeregten und Grundzustand

3.2 QuatenausbeuteUnter Berücksichtigung des Messbereichs am Photomultiplier ergibt sich als Summer aller Counts6≈ 2.410.000 beim Emissionsspektrum für DPH in DMPC und ≈ 9.700 für das Emissionsspektrum vonDPH in THF. Somit folgt für das Verhältnis der Quantenausbeuten:

ΦDMPC

ΦTHF≈ 2.410.000

9.700= 250.

3.3 Auswertung R(T )

Wir bestimmen zunächst R(T ) über die gemessenen Werte von IH und IV .6Als Fehler für die Counts n nahmen wir

√n an. Deshalb sind die letzten Stellen glatt.

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T / ◦C R(T ) ∆R(T )7,3 0,34 0,059,1 0,29 0,0415,0 0,27 0,0417,8 0,25 0,0321,2 0,20 0,0322,1 0,19 0,0322,4 0,19 0,0323,0 0,15 0,0223,4 0,14 0,0224,0 0,13 0,0224,4 0,14 0,0225,0 0,11 0,0326,1 0,12 0,0326,9 0,11 0,0334,3 0,07 0,03

Tabelle 7: Anisotropie R(T)

Grafisch ist dies in Abb. (17) dargestellt.

Abbildung 17: Anisotropie R(T )

Damit lässt sich so wie in Abb. (9) dargestellt der Umwandlungsgrad bestimmen.

16

Abbildung 18: Umwandlungsgrad θ(T )

So finden wir∂θ

∂T

∣∣∣∣Tu

= (0, 14± 0, 02)1◦C

und fürTu = (22± 2) ◦C.

Somit ergibt sich die van’t Hoff-Enthalpie:

δH = (405± 60)kJmol

.

3.4 Zeitaufgelöste MessungHier muss der Computer zunächst mit dem Zusammenhang zwischen Zeit und Kanal gefüttert werden.Aus Tab. (4) folgt sofort, dass

∆t∆Kanal

= 0, 071ns

Kanal.

Für die Gewichtung der Intensitäten G− Faktor erhlaten wir

G =IVIH

= 0, 74.

Nun kann die Datenanalyse beginnen. Zunächst muss man sich klarmachen, wie sich das gemesseneSignal zusammensetzt. Dazu stellt man sich vor, dass die Lampenfunktion aus vielen beliebig dünnenperfekten Lichtblitzen besteht. Jeder dieser Lichtblitze erzeugt dann eine mit der Zeit abnehmendeIntensität E(t). Die Summe alle dieser Funktionen ist dann die gemessene Intensität.

17

Abbildung 19: Lampenfunktion L(t) erzeugt Überlagerung von vielen Einzelfunktionen E(t)

Oder in Formeln:

I⊥(t) =∫ t

t=0

L(t′) · E⊥(t− t′)dt′.

Für die Anisotropie ergibt sich nun:

R(t)gemessen =I‖(t)− I⊥(t)I‖(t) + 2I⊥(t)

=

∫ tt=0

L(t′) ·(E‖(t− t′)− E⊥(t− t′)

)︸ ︷︷ ︸=h1(t−t′)

dt′

∫ tt=0

L(t′) ·(E‖(t− t′) + 2E⊥(t− t′)

)︸ ︷︷ ︸=h2(t−t′)

dt′.

Die Auswertung erfolgt nun in zwei Schritten. Unser Ziel ist es nun aus der Überlagerung der Funk-tionen den Verlauf von h1(t−t′)

h2(t−t′)

∣∣∣t′=const

zu extrahieren (dies wird als Entfaltung bezeichnet). Da diesdem Intensitätsverlauf eines perfektem Lichblitzes entspricht.

R(t)theo =h1(t− t′)h2(t− t′)

∣∣∣∣t′=const

Als erstes wird nun für h2(t − t′) ein Zusammenhang der Art αe−t−t′τ angenommen und gefittet mit

Hilfe der bekannten Lampenfunktion.

Abbildung 20: Fit von h2(t − t′) mit αe−t−t′τ . Man sieht einen leichte Oszillation in der Korrelation.

Mehr e-Funktionen wären also besser gewesen.

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Abbildung 21: Fit durch den die Parameter r∞,φ und β bestimmt werden. Hier ist die Korrelationnahezu perfekt.

Dies führt zu folgenden Werten.

Temperatur in ◦C α in I τ in ns χ2

10 0,071 8, 88± 0, 03 1,8423 0,090 8, 4± 0, 02 1,2435 0,106 7, 38± 0, 02 1,58

Tabelle 8: Werte für die erste Anpassung. Ein Wert von χ2 = 1 bedeutet perfekte Übereinstimmung.

Nun wird die Funktion h1 angepasst. Dabei geht man davon aus, dass wir für R(t)theo = h1(t−t′)h2(t−t′) =

βe−t−t′φ + r∞ erhalten. Also ein einfacherer Zusammenhang als in Gl. (1) angenommen. Es wird also

h2(t− t′) ·(βe−

t−t′φ + r∞

)= h1(t− t′)

gefittet und wir erhalten folgende Werte.

Temperatur in ◦C φ in ns r∞ r0 < r > χ2

10, 0± 0, 2 2, 7± 0, 3 0, 271± 0, 003 0,3625 0, 292± 0, 003 1,0723, 0± 0, 2 2, 6± 0, 1 0, 153± 0, 002 0,3266 0, 194± 0, 003 1,1135, 0± 0, 2 1, 6± 0, 5 0, 032± 0, 001 0,3215 0, 084± 0, 002 1,25

Tabelle 9: Resultate für die wichtigen physikalischen Größen.

Für die Mikroviskosität ergibt sich mit dem einfachen Zusammenhang ( 12φ = D, Vef = (1, 63± 0, 34)·

10−28 m3):

η =kT

VeD= 2

kTφ

Vef.

Und für den Öffnungswinkel θc im „wobbling in cone Modell“ ergibt sich:

r∞r0

=(

cos θc (1 + cos θc)2

).

Die Bestimmung machen wir numerisch.

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Abbildung 22: Bestimmung der θc für die drei Temperaturen.

Temperatur in ◦C η in kgms θc

10 0, 13± 0, 02 44± 223 0, 13± 0, 01 52± 235 0, 08± 0, 03 70± 2

Tabelle 10: Mikroviskosität η und Öffnungswinkel θc.

4 DiskussionAls erstes sollen die vom Computer ausgegebenen Werte für < r > mit den Werten von R(T ) aus derAufgabe (2.4) verglichen werden.

Erster Wert für < r > 10◦C und 9,1◦C 23◦C und 23◦C 35◦C und 34,3◦C< r > 0, 292± 0, 003 0, 194± 0, 003 0, 084± 0, 002R(T ) 0, 29± 0, 04 0, 15± 0, 04 0, 07± 0, 03

Tabelle 11: Vergleich < r > aus Tab. (9) und R(T ) aus Tab. (7)

Die Werte für 23◦C sind noch verträglich. Die anderen beiden Werte sind uneingeschränkt gleich.Um 23◦C fand der Phasenübergang statt. Deshalb fallen Fehler bei der Temperatureinstellung hierbesonders stark ins Gewicht.

Bei Vergleich der gemessen van’t Hoff-Enthalpie mit der kalorimetrischen Enthalpie stellt man einesehr große Abweichung fest.

δH = (405± 60)kJmol

Hth = 30kJmol

.

Diese kann man dadurch erklären, dass sich R(T ) erst ändert, wenn schon fast alle DPH-Moleküle ihrenAggregatzustand gewechselt haben. Dann geht die Änderung aber rasant von statten. Im Gegensatzdazu werden bei der kalorimetrische Enthalpie jedes DPH-Molekül berücksichtigt, auch die ersten

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Moleküle, die den Aggregatzustand wechseln. Diese ändern aber noch nichts an R(T ). Folglich verläuftR(T ) viel steiler als die kalorimetrische Enthalpie und die über die Steigung definierte van’t Hoff-Enthalpie ist zu groß.

Nun soll die Temperaturabhängigkeit von τ , φ, r∞ und η diskutiert werden.

Temperatur in ◦C τ in ns φ in ns r∞ η in kgms

10, 0± 0, 2 8, 88± 0, 03 2, 7± 0, 3 0, 271± 0, 003 0, 13± 0, 0223, 0± 0, 2 8, 4± 0, 02 2, 6± 0, 1 0, 153± 0, 002 0, 13± 0, 0135, 0± 0, 2 7, 38± 0, 02 1, 6± 0, 5 0, 032± 0, 001 0, 08± 0, 03

Tabelle 12: Übersicht über die wichtigsten Größen bei den drei Temperaturen.

τ nimmt wie erwartet ab. Es handelt sich jedoch um eine nicht so wichtige Größe. Die Viskositätnimmt mit steigender Temperatur ab. Dies war zu erwarten, da ja ein Phasenübergang stattfindet.Passend dazu sinkt auch φ, da sich die angeregten DPH-Moleküle während ihrer Lebenszeit stärkerbewegen können. Mit Hinblick darauf ist es ebenfalls sinnvoll, dass r∞ sinkt.

Aus der Tabelle (6) wird ersichtlich, dass der angeregte und Grundzustand ähnlich Vibrations-niveaus haben. Es findet also keine große Veränderung in der Potentialform statt. In harmonischerNäherung haben die beiden Zustände die gleiche Krümmung.

Leider standen uns keine Literaturwerte zum Vergleich mit den gemessen Werten zur Verfügung.Die vom Computer ausgegeben Fehler sind teilweise sehr klein und erscheinen uns daher zweifelhaft.Die single photon detection könnte zu einer systematischen Verfälschung in Bereichen hoher Intensitätführen, da von zwei schnell aufeinander folgende Photonen nur das erste detektiert wird. Jedoch liefertedie Lichtquelle keine besonders große Intensität.

Auch die herstellung von perfekt polarisiertem Licht ist schwierig, da nur parallele Strahlenbündelvom Polarisator vollständig senkrecht zur Ausbreitungsrichtung polarisiert werden. Um diesen Effektzu minimieren haben wir mit sehr kleinen Blenden gearbeitet. Jedoch mussten wir auf Grund dergeringen Intensität der Pulsquelle in diesem Aufbau darauf verzichten, was die Polarisationsmessungverfälschte.

Durch ein besseres Heizsystem (vor allem beim Gleichlichtaufbau) könnte man die Stabilität derTemperatur und damit die Genauigkeit der Messung verbessern.

Literatur[1] H.-J. Galla: Spektroskopische Methoden der Biochemie.

[2] A. G. Lee: Membrane Studies using Fluorescence Spectroscopy.

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