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Aus dem Pathologisch-Anatomischen Institut der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. Arndt Hartmann
____________________________________________________________________
Effekte einer salzreichen Diät auf die Progression der diabetischen
Nephropathie im tierexperimentellen Modell der ZDF-Ratte
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Anja Schwantzer
aus
Neuendettelsau
2010
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan: Prof. Dr. med. J. Schüttler
Referent: Prof. Dr. med. K. Amann
Korreferent: Prof. Dr. med. K. F. Hilgers
Tag der mündlichen Prüfung: 19.01.2011
Für meine Eltern, meine Oma und meine Schwester
Inhaltsverzeichnis
I. Zusammenfassung........................................................................................................... 1 II. Einleitung ......................................................................................................................... 4 2.1 Das Metabolische Syndrom............................................................................................. 4
2.2 Diabetische Nephropathie ............................................................................................... 5
2.3 Kochsalz .......................................................................................................................... 6
2.4 Fragestellung der Arbeit .................................................................................................. 9
III. Material und Methoden................................................................................................... 10 3.1 Versuchstiere................................................................................................................... 10
3.2 Haltung und Fütterung..................................................................................................... 11
3.3 Behandlung...................................................................................................................... 11
3.4 Versuchsaufbau............................................................................................................... 11
3.4 Laborparameter ............................................................................................................... 12
3.4.1 Urinuntersuchungen ..................................................................................................... 12
3.4.2 Blutentnahme................................................................................................................ 13
3.5 Histologische Gewebeaufarbeitung ................................................................................. 13
3.5.1 Perfusionsfixation ......................................................................................................... 13
3.5.2 Gewebeaufarbeitung .................................................................................................... 14
3.5.3 Herstellung der Schnittpräparate .................................................................................. 15
3.5.3.1 Paraffinschnitttechnik................................................................................................. 15
3.5.3.2 Semidünnschnitttechnik............................................................................................. 15
3.6 Auswertungen.................................................................................................................. 15
3.7 Semiquantitative Untersuchung der Niere auf Zeichen eines renalen Schadens............ 16
3.7.1 Glomeruloskleroseindex ............................................................................................... 16
3.7.2 Mesangiolyseindex ....................................................................................................... 17
3.7.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex ......................................................................... 17
3.7.4 Vaskulärer Schädigungsindex ...................................................................................... 18
3.8 Quantitative Untersuchung der Niere ............................................................................. 19
3.8.1 Stereologie und Morphometrie ..................................................................................... 19
3.8.2 Punkte-Zähl-Verfahren ................................................................................................. 19
3.9 Morphometrische und stereologische Untersuchungen der Glomeruli ............................ 20
3.9.1 Bestimmung der Ausdehnung von Nierenmark und Nierenrinde ................................. 20
3.9.2. Glomerulusgeometrie .................................................................................................. 21
3.9.3 Bestimmung der glomerulären Fläche, des glomerulären Volumens und des
minimalen und maximalen Durchmessers der Glomeruli ...................................................... 24
3.9.4 Bestimmung von absoluten Zellzahlen und Strukturverteilungen im Glomerulus......... 24
3.10 Statistik .......................................................................................................................... 29
IV. Ergebnisse...................................................................................................................... 30 4.1 Tierparameter .................................................................................................................. 31
4.2 Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme ............................................................................. 34
4.3 Urinparameter.................................................................................................................. 36
4.4 Blutparameter .................................................................................................................. 42
4.5 Schädigungsindices und Morphometrie der Nieren......................................................... 48
4.5.1 Glomeruloskleroseindex ............................................................................................... 50
4.5.2 Mesangiolyseindex ....................................................................................................... 51
4.5.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex ......................................................................... 51
4.5.4 Vaskulärer Schädigungsindex ...................................................................................... 52
4.5.5 Parameter des Kapillarkonvolutes ................................................................................ 52
4.6 Glomerulusgeometrie und Rinden/Mark-Verhältnis......................................................... 53
4.6.1 Anzahl der Glomeruli pro Fläche und pro Volumen...................................................... 54
4.6.2 Gesamtvolumen der Gomeruli einer Niere und mittleres glomeruläres Volumen......... 55
4.7 Zellzahlen und Strukturverteilungen im Glomerulus ........................................................ 55
4.7.1 Werte des Kapillarkonvolutes und der Kapillaren ......................................................... 60
4.7.2 Mittleres Glomeruläres Volumen .................................................................................. 62
4.7.3 Gesamtzahl der einzelnen Zellen pro Glomerulus........................................................ 62
4.7.4 Durchschnittsvolumen der einzelnen Zellen ................................................................. 64
4.7.5 Volumendichte der einzelnen Zellen............................................................................. 64
4.7.6 Gezählte Zellart pro Volumen....................................................................................... 65
4.7.7 Gezählte Zellart pro Fläche .......................................................................................... 65
4.7.8 Gesamtvolumen der einzelnen Zellen pro Glomerulus................................................. 66
4.8 Fotodokumentation der Befunde ..................................................................................... 67
V. Diskussion ....................................................................................................................... 69 5.1 Pathogenetische Grundlagen der diabetischen Nephropathie ........................................ 69
5.2 Auswirkungen einer erhöhten Salzzufuhr auf die Niere................................................... 70
5.3 Diskussion der eigenen Ergebnisse ................................................................................ 74
5.4 Schlußfolgerung............................................................................................................... 78
VI. Literaturverzeichnis ....................................................................................................... 80 VII. Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ 93 VIII. Danksagung.................................................................................................................. 95 IX. Lebenslauf ...................................................................................................................... 96
I. Zusammenfassung
1.1. Hintergrund und Ziele Die Auswirkungen einer erhöhten Salzaufnahme auf die Niere sind Gegenstand vieler
aktueller Studien. So zeigten vorausgehende Untersuchungen eine Progression der
diabetischen Nephropathie unter gleichzeitigem Vorliegen eines salzabhängigen
arteriellen Hypertonus. Diese Arbeit soll der Frage nachgehen, wie sich eine nutritive
Salzbelastung auf die Progression der diabetischen Nephropathie am tierexperimentellen
Modell des Metabolischen Syndroms und Diabetes mellitus Typ II, unabhängig von einer
möglichen hypertensiven Nierenschädigung, auswirken kann.
1.2. Methoden Als Tiermodell diente die männliche ZDF-Fatty Ratte, welche in den ersten
Lebenswochen Hypertonie, Fettleibigkeit, Insulinresistenz, Hyperinsulinämie und
Hyperglykämie, sowie später einen Abfall des Insulinspiegels entwickelt. Bei der
Kontrollgruppe handelte es sich um eine vom gleichen Modell abstammende ZDF-Lean
Ratte, die keinen Diabetes mellitus, jedoch ebenfalls einen arteriellen Hypertonus
entwickelt. Durch Randomisierung wurden die Tiere im Alter von 10 Wochen in 6 Gruppen
eingeteilt: 10 Wochen alte ZDF-Lean Ratten, 10 Wochen alte ZDF-Fatty Ratten, 24
Wochen alte ZDF-Fatty Ratten, 24 Wochen alte ZDF-Lean Ratten und schließlich 24
Wochen alte ZDF-Fatty-diet und ZDF-Lean diet Ratten, die einer zusätzlichen nutritiven
Salzbehandlung unterzogen wurden (0,2 % vs 8 % NaCl). Während dem 16-wöchigen
Behandlungszeitraum erfolgten regelmäßige Kontrollen von Urin- und Serumparametern
der Nierenfunktion, der Glucose- und Lipidstoffwechsellage sowie physiologischen
Parametern. Nach der Perfusionsfixation wurden das Ausmaß der renalen Schädigung
schließlich anhand von Paraffin- und Semidünnschnitten beurteilt und zwischen den
einzelnen Gruppen verglichen.
1.3 Ergebnisse Die nicht-diabetischen, schlanken Tiere zeigten unter Salzaufnahme eine Zunahme des
relativen Nierengewichtes. Es ergaben sich unter Salzbelastung, wie auch bei den
diabetischen Tieren, keine Unterschiede hinsichtlich der glomerulären Filtrationsrate, des
Serum-Kreatinins und der Podozytenzahl. Bei den diabetischen Tieren kam es unter der
Behandlung zu einer deutlichen Zunahme des tubulointerstitiellen Schädigungsindex, des
kapillären Volumens, der Albuminausschheidung und der Plasmalipide. Es kam unter
1
Salzbelastung zu einem Rückgang der Endothel- und Mesangialzellzahl, dieser war im
Verlgeich zu den nicht-diabetischen Tieren deutlich, jedoch nur zu den schlanken,
salzbelasteten Tieren signifikant. Des Weiteren wurde unter der Behandlung eine
deutliche Zunahme der Gomerulosklerose beobachtet, diese war nicht signifikant. Es
wurden unter der Salzbehandlung keine Veränderung hinsichtlich der Mesangiolyse und
der übrigen morphologischen Parameter beobachtet.
1.4 Schlußfolgerung Die Salzdiät führt im tierexperimentellen Modell der ZDF-Ratte zu einer Progression der
diabetischen Nephropathie im Sinne einer Zunahme tubulointerstitiellen Schädigung, der
Albuminausscheidung, der Lipidstoffwechselstörung und der glomerulären Hypertrophie,
während sich keine signifikanten Veränderungen hinsichtlich der Glomerulosklerose,
Mesangiolyse und der Zellverteilungen im Glomerulum ergaben.
1.5. Summary a. Background and objectives Considering renal implications of a high salt intake several studies have been performed
in the last decade. Some of them demonstrated a detrimental effect on diabetic
nephropathy, especially in the presence of salt-sensitive hypertension. In this study we
investigated possible effects of high salt diet on progression of diabetic nephropathy,
irrespective of hypertensive renal changes, in an animal model of metabolic syndrome.
b. Methods The male (ZDF-)„Zucker diabetic fatty- rat“ animal model was used in this study. The
animals develop high blood pressure, obesity, insulin resistance, hyperinsulinaemia,
hyperglycaemia, followed by a strong decrease in insulin-levels after several weeks. We
compared these ZDF-rats with their lean age-matched controls of the same strain, which
develop no diabetes but hypertension. At the age of 10 weeks the animals were
randomized into 6 groups: 10 week old ZDF-Lean rats, 10 week old ZDF-Fatty rats, 24
week old ZDF-Lean rats, 24 week old ZDF-Fatty rats, and 24 week old ZDF-Lean-diet rats
and ZDF-Fatty-diet rats with an additional nutritive salt-treatment (0,2 % vs. 8 % NaCl).
During the following 16 weeks of treatment regular blood- and urin samples of renal
function, metabolic status of glucose and lipids and physiological parameters have been
carried out. After perfusion fixation the kidneys were morphologically examined, the
2
degree of renal damage was determined histologically using paraffin und semi-thin
sections and compared among the different groups.
c. Results Under high salt intake the relative kidney weight was increased in the lean group. There
were no changes between all groups of salt treatment with respect to the glomerular
filtration rate, serum-creatinin and podocyte-number. The diabetic group showed a
conspicious increase considering the tubulointerstitial injury, capillary volume, albumine
excretion and plasma-lipids under salt-rich diet. In contrast to the lean animals we noticed
a decreasing number of endothel- and mesangium cells, under salt treatment this effect
was also considerable but not significant. Moreover, the glomerulosclerotic changes
showed a non significant increase under the treatment. We observed no changes in
mesangiolysis and glomerular cell distribution.
d. Conclusion High salt diet in the ZDF-rat leads to progression of diabetic nephropathy in terms of
increased tubulointerstitial injury, albumine excretion, the metabolic lipid status and
glomerular hypertrophy, whereas glomerulosclerosis, mesangiolysis and glomerular cell
distribution did not show significant changes.
3
II. Einleitung 2.1 Das Metabolische Syndrom
Das Metabolische Syndrom, 1989 von Kaplan [55] als das „deadly quartet“ bezeichnet,
beschreibt eine Koinzidenz von abdomineller Adipositas, gestörter Glucosetoleranz,
Hyperlipidämie und arterieller Hypertonie.
Während 1998 die WHO das Metabolische Syndrom in erster Linie über das Vorliegen
eines diabetischen Kriteriums (Nüchtern-Blutzucker >126 mg/dl, gestörte Glucosetoleranz,
postprandialer Blutzucker > 200 mg/dl, Insulinresistenz) und eines zusätzlichen Kriteriums
(erhöhter Blutdruck, erhöhte Triglyceride, erniedrigtes HDL-Cholesterin, Adipositas,
Albumin-Ausscheidung) definierte [7], liegt das Hauptkriterium gemäß dem aktuellen
Konsensus der International Diabetes Federation (IDF), der American Heart Association
(AHA) und des National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) auf der
(länderspezifischen) abdominellen Adipositas [82,87]. In Europa gilt ein Taillenumfang von
> 94 cm bei Männern und >80 cm bei Frauen als Grenzwert für abdominelle Adipositas,
als Nebenkriterien wurden erhöhte Triglyzeride (>150 mg/dl), erniedrigtes HDL-
Cholesterin (< 40 mg/dl bei Männern, >50 mg/dl bei Frauen), erhöhter Blutdruck (>130
mmHg systolisch und/oder >85 mmHg diastolisch) und ein erhöhter Nüchtern-
Blutzuckerspiegel (>100 mg/dl) festgelegt. Man ist sich darüber einig, dass es kein
obligatorisches Kriterium geben müsse, lediglich 3 von 5 Faktoren müssten zutreffen, um
ein Metabolisches Syndrom zu diagnostizieren, und dass überdies die Bestimmung des
Taillenumfangs eine gute Screeningmethode darstelle [6].
Betroffene haben ein zweifach erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen, das
Risiko für das Auftreten eines Typ 2 Diabetes ist um das 5-fache erhöht [39]. Eine
Metaanalyse zeigte kürzlich ein relatives Risiko von 1,78 für kardiovaskuläre Ereignisse
und Tod beim Metabolischen Syndrom, bei Frauen lag der Höchstwert sogar bei 2,63 [36].
Darüber hinaus verbindet man mit dem Metabolischen Syndrom folgende Komorbiditäten:
Steatosis hepatis, Cholesterin-Gallensteine, Schlaf-Apnoe-Syndrom, Gicht und
Depression [38]. Die verfügbaren Daten ergeben für die meisten Länder eine Prävalenz
des Metabolischen Syndroms bei Erwachsenen von 20-30%, diese zeigt eine
zunehmende Tendenz. Gemäß der International Diabetes Federation (IDF) liegt die
Prävalenz in Deutschland für Frauen bei 22,6% und für Männer bei 31,6% [39].
Erschreckende Ergebnisse ergab eine Untersuchung unter Jugendlichen zwischen 12-19
Jahren in den USA, diese zeigte eine Prävalenz des Metabolischen Syndroms von ca.
4
13% [19,23]. Übergewicht als wichtiges Merkmal des Metabolischen Syndroms ist auch
ein Risikofaktor für die chronische Nierenerkankung [14], Personen mit sehr hohem BMI
haben ein bis zu 5-fach erhöhtes Risiko. Es ist bekannt, dass Übergewichtige aufgrund
erhöhter Sympathikusaktivität, erhöhtem AT-II-Spiegel und Hyperinsulinämie (diese
fördert die tubuläre Natriumrückresorption) in der Regel unter glomerulärer Hypertonie
und Hyperfiltration leiden. Dies führt dauerhaft zu glomerulosklerotischer Schädigung,
zusätzlich stehen inflammatorische Zytokine aus Fettzellen im Verdacht, entzündliche
Umbauvorgänge in der Niere zu unterhalten [128]. Die Versuchstiere im Rahmen dieser
Arbeit waren sowohl der Adipositas-assoziierten als auch der diabetischen Belastung der
Nieren ausgesetzt, auf letztere soll in der Diskussion genauer eingegangen werden. Auf
dieser Grundlage soll nun der Effekt einer erhöhten Salzaufnahme untersucht werden.
2.2 Diabetische Nephropathie (DN)
Die diabetische Nephropathie als mikroangiopathische Folgeerkrankung der chronischen
Hyperglykämie ist eine der folgenschwersten Komplikationen des Diabetes mellitus. In
den westlichen Industrieländern ist sie die häufigste Ursache des terminalen
Nierenversagens und einer der führenden Risikofaktoren für die diabestes-assoziierte
Morbidität und Mortalität [27]. So liegt die kumulative Prävalenz der Mikroalbuminurie bei
Patienten mit Typ 2-Diabetes nach 10 Jahren bei ca. 25 % (ähnlich auch bei Typ 1-
Diabetes) [47]. Zwei Drittel der Patienten mit manifester Nephropathie versterben im
Rahmen des 5- bis 8-fach erhöhten kardiovaskulären Risikos bevor sie terminal
niereninsuffizient und damit dialysepflichtig werden [106]. Weiterhin versterben etwa 20 %
der dialysepflichtigen Patienten im 1. Jahr in erster Linie aufgrund des stark erhöhten
kardiovaskulären Risikos [121]. Bei manifester DN entwickeln innerhalb von 20 Jahren ca.
75 % der Typ 1-Diabetiker und 20 % der Typ 2-Diabetiker eine terminale
Niereninsuffizienz. In Europa und den USA sind bis zu 50 % aller Dialysepatienten
Diabetiker [47].
Klinisch äußert sich die glomeruläre Schädigung vorerst in einer Mikroalbuminurie, diese
hat einen hohen prädiktiven Wert für die chronische Nierenerkrankung [89]. Sie ist
definiert durch eine Albuminausscheidung von 30-300 mg/24h-Sammelurin oder 30-300
µg/mg Kreatinin in einer Urineinzelprobe. In diesem Stadium konnten durch
medikamentöse Senkung der Proteinurie (ACE-Hemmer, AT-II-Antagonisten, Statine,
Kombinationen) eine Reversiblität der zugrunde liegenden morphologischen
Nierenveränderungen belegt werden [4,50,87,88,90]. Mit dem Fortschreiten zu einer
echten Proteinurie kommt es schließlich zu einem irreversiblen renalen Schaden mit pro
5
Jahr um ca. 10-12 ml abnehmender glomerulärer Filtrationsrate und steigendem
Kreatinin-Wert [65].
Die klinischen Stadien der DN unter Berücksichtigung der Albuminausscheidung und der
glomerulären Filtrationsrate sind in Tabelle 1 [47] dargestellt.
Tabelle 1: Stadien der diabetischen Nephropathie
Stadien Albumin-
ausschei-
dung
(mg/24h)
Albumin-
Konzentration
(mg/l)
Kreatininclearance
(ml/min)
(= Stadien 1-5 der
chronischen
Niereninsuffizienz
[123])
Mikro-
albuminurie
30 – 300 17 – 173 1. Nieren-
schädigung mit
normaler
Nierenfunktion
Makro-
albuminurie
> 300 > 174
>90
Leichtgradig 60 – 89
Mäßiggradig 30 – 59
Hochgradig
> 300
15 – 29
2. Nieren-
schädigung mit
Nieren-
insuffzienz Terminal abnehmend < 15
Neben der Proteinurie wird die Progression der DN entscheidend durch weitere
Risikofaktoren des Metabolischen Syndroms (Hypertonie, Hyperglykämie,
Hyperlipidämie), erhöhte Eiweißzufuhr, Nikotinkonsum und genetischen Faktoren
beeinflusst [123]. Die Pathomechanismen der Entstehung und Progression des renalen
Schadens bei chronischer Hyperglykämie sind noch nicht vollständig verstanden. Auf die
bisherigen Erkenntnisse wird in der Diskussion näher eingegangen.
2.3. Kochsalz 2.3.1 Physiologische Bedeutung
Natrium und Chlorid sind als häufigste Ionen des Extrazellularraumes wesentlich an der
Regulation des Wasserhaushaltes und des osmotischen Drucks beteiligt. Die Niere als
zentrales Ausscheidungsorgan scheidet nur etwa 1 % der filtrierten Natriummenge (ca.
27000 mmol/d) aus. Im proximalen Tubulus werden ca. 65 % der filtrierten Na-Ionen
6
rückresorbiert, dies geschieht zum einen mittels eines durch die Na+/K+-ATPase
erzeugten Druckgradienten und konsekutivem passivem Na+-Einstrom, zum anderen über
Na+/H+-Antiporter und Na+-Symportcarrier (Na+/Glucose; Na+/Aminosäuren). In der
Henleschen Schleife erfolgen mittels Na+-2Cl—K+-Symport ca. 25 % der Na+-
Rückresorption. Schließlich kommt es im distalen Konvolut und in den Sammelrohren zu
einer Feinregulation der Na+-Rückresorption. Diese erfolgt über Na+/Cl--Symportcarrier
und passive Natriumkanäle, die durch Adiuretin(ADH)/Aldosteron aktiviert und durch
atriales natriuretisches Peptid (ANP) sowie Prostaglandine gehemmt werden [101].
Bei erhöhter Kochsalzaufnahme steigt die Plasmaosmolalität, infolge einer vermehrten
ADH-Ausschüttung kommt es zu einer Wasserretention und erhöhtem
Extrazellularvolumen. Ein daraus resultierender Blutdruckanstieg führt über Barosensoren
in der Macula densa zu einer Reduktion der Renin-Ausschüttung und darüber zu einer
gegenregulatorischen Inhibition des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS). Bei
erhöhtem Vorhofdruck wird aus dem Vorhofmyokard vermehrt ANP sezerniert, dies hat
eine zusätzliche Hemmung des RAAS sowie eine Steigerung der renalen Na+-
Ausscheidung zur Folge [101]. Diese Rückkoppelungsmechanismen der
Salzausscheidung sind Ausgangspunkt für die genauere Untersuchung der
Zusammenhänge zwischen erhöhter Salzaufnahme und Bluthochdruck. In früheren
Studien zeigte sich, dass einem salzinduzierten Hypertonus ein gestörte RAAS-
Downregulation zugrunde liegen kann [62,98]. Des Weiteren ist bekannt, dass Insulin
über eine direkte Wirkung am distalen Tubulus und über sympathische Nerven in der
Niere die Na+-Rückresoption erhöht [22]. Dies könnte ein häufigeres Vorliegen eines
salzinduzierten Hypertonus bei Personen mit Metabolischem Syndrom und
Hyperinsulinämie bedingen.
2.3.2 Konsumverhalten
Während der Evulotion hatte der Mensch für sehr lange Zeit nur Zugang zu einer
Nahrung, die einen geringen Salzgehalt aufwies, so dass die tägliche Natriumzufuhr
Schätzungen zufolge unter 1g/Tag lag [29]. Erst seit einigen Jahrtausenden fügt der
Mensch seiner Nahrung Salz hinzu und seit der starken Zunahme von verarbeiteten
Lebensmitteln im den letzten Jahrhunderten nahm der Salzkonsum stetig zu. Daher ist
davon auszugehen, dass physiologische Mechanismen in Bezug auf Retention des
aufgenommenen Salzes eine größere kompensatorische Breite besitzen als auf dessen
Ausscheidung. Der durchschnittliche tägliche Salzkonsum liegt heutzutage in den
Industrieländern bei etwa 9-10g/Tag. Dieser stammt zu 75 % aus verarbeiteten
Lebensmitteln (Brot, Käse, Wurstwaren, Suppen, Snacks, Pizza, Saucen, Würzmittel), 15-
7
20 % aus unverarbeiteten Lebensmitteln und zu einem kleineren Teil aus der direkten
Salzbeigabe. Bezüglich einer Einschränkung des Salzkonsumes gibt es zahlreiche
offizielle Empfehlungen, unter anderem empfiehlt die American Heart Assoziation und die
Europäischen Hypertoniegesellschaft [16] eine Einschränkung der Salzzufuhr auf <
6g/Tag, die WHO [33] sogar auf > 5g/Tag.
2.3.3 Salzsensitivität
Der Begriff der Salzsensitivität beschreibt die Erhöhung des arteriellen Blutdrucks bei
längerfristig gesteigerter Kochsalzaufnahme, demgegenüber bezeichnet man eine
Unabhängigkeit des arteriellen Blutdruckes als Salzresistenz [58,118]. Der
wissenschaftliche Nutzen dieser Begrifflichkeiten ist umstritten, da es bislang keine
sicheren Zuordnungskriterien gibt und zahlreiche Studien belegen, dass die
Salzsensitivität bzw. -resistenz in der Gesamtbevölkerung und auch bei Tieren sehr
heterogen verteilt ist [15,26,58].
In der großen INTERSALT-Querschnittstudie mit über 10000 Probanden aus 32
verschiedenen Ländern (davon 8344 Normotoniker) konnte eine Korrelation zwischen
dem Blutdruck und der Natriumausscheidung im 24-h-Urin nachgewiesen werden. So
zeigte sich bei einer im Vergleich um 100 mmol/d höheren Natrium-Ausscheidung ein
Blutdruckanstieg von 3-6/0-3 mmHg. Die steigende Salzsensitivität mit dem Alter zeigte
sich in einem Blutdruckanstieg vom 25- zum 55-Jahre-Kollektiv von 10-11/6 mmHg [102].
Einige betrachten diese Studie als klaren Nachweis für die Korrelation zwischen Blutdruck
und Salzkonsum, während andere weiterhin der Ansicht sind, dies sei vor allem aufgrund
von methodischen Problemen nicht stichhaltig belegt worden. Beispielsweise geriet die
nur einmalige Messung des 24-h-Urins aufgrund der Veränderlichkeit von Tag zu Tag,
sowie die Tatsache, dass Hypertoniker möglicherweise absichtlich weniger Salz zu sich
nehmen in die Kritik. Beide Faktoren führen jedoch eher zu einer Unterschätzung
(regression dilution bias) der Korrelation. Grenzt man die Gesamtbevölkerung jedoch auf
bestimmte Personengruppen ein, zeigt sich ein signifikant häufigeres Auftreten von
Salzsensitivität bei Patienten mit essentieller Hypertonie, Übergewichtigen,
postmenopausalen Frauen, älteren Menschen [5,43,122] und bei der diabetischen
Nephropathie [103,113]. Auch Patienten mit niedrigen Reninwerten wie Afroamerikaner
und Diabetiker reagieren empfindlicher auf Veränderungen der Natriumzufuhr [118]. Eine
Studie mit Kindern und Jugendlichen in England mit über 1600 Teilnehmern zeigte einen
klaren Zusammenhang zwischen Salzkonsum und Blutdruckanstieg [42]. Weiterhin
konnte bei erhöhter Kochsalzzufuhr, gemessen über die Natriumausscheidung im 24-h-
8
Urin, auch bei fehlender Salzsensitivität des Blutdrucks eine deutliche Erhöhung der
kardiovaskulären Mortalität und der Gesamtmortalität belegt werden [43,109,117].
2.4 Fragestellung der Arbeit
Der aggravierende Einfluß des Metabolischen Syndroms hinsichtlich des Verlaufes einer
diabetischen Nephropathie bei häufiger Komorbidität ist seit vielen Jahren intensiver
Forschungsgegenstand, nicht zuletzt aufgrund der erheblichen volkswirtschaftlichen
Relevanz. Die in unserer Kultur verbreitete, erhöhte Kochsalzaufnahme hat beim
Metabolischen Syndrom und anderen Risikogruppen einen deutlichen Einfluß auf die
kardiovaskuläre Mortalität und die Gesamtmortalität. Diese Situation macht es
erforderlich, durch eine umfassende Identifikation von Einflussfaktoren,
Risikokonstellationen zu erkennen und diesen Patienten baldmöglichst eine adäquate
Therapie und Beratung zugänglich zu machen.
Die in dieser Studie untersuchte ZDF-Ratte ist ein anerkanntes Tiermodell zur
Untersuchung des NIDDM und entwickelt zudem die Charakteristika des Metabolischen
Syndroms [84,111]. Daher ist gemäß oben genannter Studien [43] davon auszugehen,
dass unter den untersuchten Tieren Salzsensitivität mit großer Wahrscheinlichkeit
aufgetreten ist. Die Frage, ob bei den untersuchten Tieren ein Hypertonus oder eine
hypertensive Nierenschädigung entstanden ist, steht jedoch nicht im Vordergrund.
Vielmehr ist zu erwarten, dass die adipösen und schlanken ZDF-Ratten gleichermaßen
hohe Blutdruckwerte entwickelten [20].
Die Fragestellung dieser Arbeit ist demnach, ob eine nutritive Salzbelastung bei
tierexperimentellem Diabetes mellitus Typ II der ZDF-Ratte einen zusätzlichen
Risikofaktor für die Progression der diabetische Nephropathie darstellt.
9
III. Material und Methodik
3.1 Versuchstiere
Für die nachfolgend beschriebene Versuchsreihe diente die männliche ZDF(„Zucker-
diabetic-fatty“)-Ratte als Versuchstier. Es handelt sich dabei um ein weitverbreitetes
Tiermodell zur Untersuchung des nicht insulinabhängigen Diabetes mellitus und anderer
Effekte des metabolischen Syndroms [84,100,108].
1961 erforschten das Ehepaar Zucker ein Gen in einem fettleibigen Rattenstamm, einer
Kreuzung von Sherman und Merck Stock M Ratten, das für die Ausbildung der
Fettleibigkeit kodiert. Sie bezeichneten als erste dieses Allel als „fatty“ (fa)-Gen, während
das Wildtyp-Allel Fa genannt wurde [129]. Diese ausschließlich männliche Tiere
betreffende Spontanmutation wurde mit normalgewichtigen Schwester-Ratten (+/fa)
gepaart. Es konnte ein konstanter männlicher Phänotyp mit diabetischer Stoffwechsellage
herausgezüchtet werden. Die weiblichen Nachkommen bilden trotz Fettleibigkeit und
Insulinresistenz keinen Diabetes aus [84]. Genotypisch liegen unabhängig voneinander
autosomal rezessiv vererbte Mutationen auf zwei verschiedenen Genen zugrunde. Durch
einen auf dem fa-Locus kodierten Leptinrezeptordefekt kommt es infolge einer
hypothalamisch bedingten Hyperphagie mit Adipositas zu einer daraus resultierenden
peripheren Insulinresistenz. Im Gegensatz zu anderen Tieren sind diese Ratten in der
Lage, die Zahl ihrer Fettzellen im fortgeschrittenen Alter noch zu vermehren [130]. Auch
bei lebenslanger Nahrungsbeschränkung entwickeln sie einen Körperfettanteil von bis zu
50 %, der normale Körperfettanteil von Ratten liegt bei unter 20 % [18]. Des Weiteren
führt ein auf einem separaten Gen liegender pankreatischer ß-Zell-Genexpressionsdefekt
im Insulin-Gen-Promoter zu niedrigeren Insulin mRNS-Spiegeln [37]. Dieser sowohl bei
fettleibigen als auch bei schlanken Tieren vorliegende Defekt wird jedoch bei letzteren
posttranskriptional kompensiert. Diese Kompensation gewährleistet ein adäquates
Insulinangebot unter normalen Bedingungen, steigt jedoch der Insulinbedarf, kann es
auch hier zu einer relativen Insulindefizienz mit Hyperglykämie kommen [37]. Das
Versagen der pankreatischen β-Zellen aufgrund der exzessiven Anhäufung von
Triglyceriden im Pankreas kommt erschwerend hinzu (sog. Lipid-Toxizitäts-Hypothese)
[99,125].
Die homozygoten (fa/fa) Tiere entwickeln bereits ab der vierten Lebenswoche eine
Insulinresistenz mit daraus resultierender Hyperinsulinämie, ab der siebten bis achten
Lebenswoche kommt es dann zu einem anhaltenden Abfall des Insulinspiegels mit
10
nachfolgender Hyperglykämie. Des Weiteren kommt es zu einer Hyperlipidämie,
moderaten Hypertonie und zunehmender Thrombozytenaggregation [51,56,111]. HbA1c,
freie Fettsäuren, Triglyceride und Cholesterin im Serum dieser Tiere zeigten sich
signifikant höher als bei den Kontrolltieren [84]. Bei den homozygoten (fa/fa) Tieren findet
mit zunehmendem Lebensalter eine Hypertrophie und Hyperplasie des Fettgewebes statt.
Als Kontrolltiere dienten in dieser Studie männliche heterozygote ZDF-Ratten (,,lean“), um
eine alternde, nicht-diabetische Population zu repräsentieren. Diese Geschwistertiere der
diabetischen ZDF-Ratten sind heterozygot für das fa-Gen, bleiben dünn und
euglykämisch, entwickeln also keinen Diabetes, jedoch einen Hypertonus. Somit kann
sichergestellt werden, dass renale Veränderungen der Versuchstiere im Vergleich zur
Kontrollgruppe auf den Diabetes und nicht auf eine hypertensive Schädigung
zurückzuführen sind.
3.2 Haltung und Fütterung
Die zu Beginn des Experiments 6 Wochen alten Tiere wurden in durchsichtigen
Einzelkäfigen aus Kunststoff gehalten. Unter standardisierten Bedingungen, einer
konstanten Raumtemperatur von 21-24°C und einer relativen Luftfeuchtigkeit von 45-60%
wurden sie bei einem Tag-Nacht-Rhythmus von jeweils 12 Stunden gehalten. Das Licht
wurde um 06.00 Uhr morgens eingeschaltet und um 18.00 Uhr abends ausgeschaltet.
Nach einer Eingewöhnungsphase von einer Woche begann das Experiment.
3.3 Behandlung
Das Futter der Firma KLIBA/NAFAG (Nr.3433) enthält 0,2% NaCl und wurde für die
ausgesuchten Tiere auf 8% Kochsalz angereichert. Die übrigen Tiere bekamen das
unveränderte Futter (Zusammensetzung: Proteingehalt 18,5 %, Rohfaser und Fettgehalt
4,5 %, Energiegehalt 12,5 MJ/kg).
3.4 Versuchsaufbau
Im Rahmen dieses Versuches wurden insgesamt 60 männliche ZDF-Ratten untersucht.
Dabei dienten 20 Tiere (10-fatty/10-lean), die bereits nach 2 Wochen Versuchszeit, also
mit 8 Wochen, getötet wurden, zur Erhebung von Ausgangswerten der Parameter der
Nierenmorphologie.
11
Die übrigen 40 Tiere setzten sich zur Hälfte aus ZDF-fatty und ZDF-lean- Tieren
zusammen. Nach dem Zufallsprinzip wurden je 10 Tiere der beiden Gruppen einer
zusätzlichen Salzbelastung (= Fatty-Diet, bzw. Lean-Diet) unterzogen. Während der 16-
wöchigen Behandlungszeit wurden in regelmäßigen Abständen Urin- und
Körpergewichtsbilanzierungen und zu den beiden letzten Terminen auch
Blutuntersuchungen vorgenommen. Schließlich wurden die Tiere in einem Alter von 24
Wochen getötet (Tabelle 1). Während des Versuches verstarben je ein Tier der Gruppe
ZDF-fatty und ZDF-fatty-diet.
Beide Versuchsreihen starteten ab einem Alter der Tiere von 6 Wochen.
Tabelle 2: Übersicht des Versuchsaufbaus
Versuchsende im
Alter von
Gruppe ZDF- n - Beginn n - Ende des
Versuches
Behandlungs-
zeitraum
Lean 10 10 8 Wochen
Fatty 10 10
2 Wochen
Lean 10 10
Fatty 10 9
Lean_Diet 10 10
24 Wochen
Fatty_Diet 10 9
16 Wochen
ZDF-Lean = Tiere ohne metabolisches Syndrom und ohne salzreiche Diät ZDF-Lean-Diet = Tiere ohne metabolisches Syndrom mit salzreicher Diät ZDF-Fatty = Tiere mit metabolischem Syndrom und ohne salzreiche Diät ZDF-Fatty-Diet = Tiere mit metabolischem Syndrom und mit salzreicher Diät 3.4. Laborparameter
3.4.1 Urinuntersuchungen
Durch die Haltung in metabolischen Käfigen war eine stuhlfreie Sammlung des 24h-Urins
möglich. Im Urin wurden ab dem Alter von 8 Wochen in 4-wöchentlichen Abständen nach
Zentrifugation bei 4°C folgende Parameter bestimmt:
• Elektrolyte (Natrium,Kalium,Calcium,Chlorid)
• Kreatinin
• Harnstoff
• Harnsäure
• Albumin
12
• Glucose
• Osmolalität
3.4.2 Blutentnahme
Für die retrobulbäre Blutentnahme, die nach 12 und 16 Wochen Behandlung erfolgte,
wurden die Tiere in eine Inhalationsnarkose mit Isofluran versetzt. Durch Druck auf die
Halsgefäße staute sich der retrobulbäre Plexus, so dass über eine Punktion im nasalen
Augenwinkel etwa 2 ml Vollblut gewonnen werden konnten. Daraus wurden umgehend
folgende Parameter bestimmt:
• Elektrolyte (Natrium,Kalium,Calcium,Chlorid)
• Kreatinin
• Harnstoff
• Harnsäure
• Glucose
• Insulin
• Triglyceride
• Cholesterin gesamt
• HDL
• LDL
• Aldosteron
• Corticosteroide
3.5 Histologische Gewebeaufarbeitung 3.5.1 Perfusionsfixation
Nach einem Behandlungzeitraum von 2 bzw. 16 Wochen wurde das Experiment mittels
Perfusionsfixation der Tiere und der Entnahme der Organe beendet. Die
Perfusionsfixation ist ein methodisch etabliertes Verfahren zur Gewinnung von fixierten
Organen von Versuchstieren und wurde nach einem im Labor des Pathologischen
Instituts der Universität Erlangen-Nürnberg standardisierten Verfahren wie folgt
durchgeführt [9]:
13
Die Tiere wurden mittels einer leichten Äthernarkose zunächst vornarkotisiert. Im
Anschluss wurde mit 4x200 mg/kg Thiopental s.c. eine Vollnarkose durchgeführt. Danach
wurde der Bauchraum der Tiere über einen medianen Längsschnitt eröffnet
(Laparotomie). Anschließend erfolgte die Eröffnung des Peritoneal- und
Retroperitonealraumes sowie die Freilegung der Aorta abdominalis und der Vena cava
inferior. Nach dem Abklemmen der Aorta infrarenal und einer Inzision von etwa 2 mm
wurde über eine an dieser Stelle eingebrachte Kanüle das Gefäßsystem für etwa zwei
Minuten mit Dextran 40 (Rheomakrodex®) unter Zusatz von 0,5% Procainhydrochlorid
gespült. Dextran 40 sollte einer eventuellen thrombotischen Verlegung der perfundierten
Gefäße entgegenwirken und als hyperosmolare Lösung die Ausbildung eines artifiziellen
Ödems des Interstitiums verhindern. Nach der Behandlung mit Dextran 40 erfolgte für 12
Minuten eine erneute Spülung der Gefäße mit dreiprozentigem Glutaraldehyd in 0,2
molarer Phosphat-pufferlösung. Unmittelbar nach Beginn der Perfusionsbehandlung
wurde, um einem übermäßigen Druckanstieg im Gewebe vorzubeugen, das Gefäßsystem
über eine Inzision der Vena cava drainiert. Nachdem die Perfusionsfixation
abgeschlossen war, wurden die Organe entnommen, gewogen und in 3%igem
Glutaraldehyd und 0,2 molarer Phosphatpufferlösung eingelagert [67].
3.5.2 Gewebeaufarbeitung
Zunächst wurden die in Pufferlösung eingelagerten Nieren einzeln gewogen und unter
Hinzunahme des vor der Fixation gemessenen Körpergewichtes anhand folgender Formel
das relative Nierengewicht (rNG) bestimmt:
rNG = NG x 100 % (1)
KG
Daraufhin wurden die Nieren von ihrer Faszie gereinigt und senkrecht zu ihrer Interpolar-
Achse halbiert. Dann wurde eine Hälfte der Niere in 1,5-2 mm dicke Scheiben
aufgeschnitten. Aus den sich hierbei ergebenden fünf bis sieben Nierenscheiben wurden
zur Herstellung von Semidünnschnitten pro Niere je 10 kleine Rindenstücke mit Hilfe der
„Area weighted sampling“-Methode [82] gewonnen wurden. Auf ein Gitter mit 99 Punkten
wurden die 10 Nierenscheiben zufällig platziert und diejenigen Rindenanteile bestimmt,
die auf Gitterpunkte zufällig gezogener Koordinaten fielen. Hieraus wurden mit einer
scharfen Rasierklinge sektorförmige Rindenanteile (ca. 2x2x2 mm³) geschnitten. Die so
bestimmten Rindenteile wurden mit einer Rasierklinge sektorförmig entnommen und für
14
die Einbettung in Epon-Araldit vorbereitet, um später für die Semidünnschnitttechnik zur
Verfügung zu stehen. Die verbleibenden Gewebsstücke wurden in Paraffin eingebettet.
3.5.3 Herstellung der Schnittpräparate
3.5.3.1 Paraffinschnitttechnik
Die wie oben beschrieben gewonnenen Nierenscheiben wurden zur Herstellung der
Paraffinschnitte in Sörensenpuffer (pH 7,2-7,4) gewaschen und anschließend in
aufsteigender Ethanol-Reihe (70-100%iger Ethanol) dehydriert. Die Präparate wurden
danach mit Paraffin ausgegossen, auf einem Minot-Mikrotom (Reichert-Jung, Heidelberg)
in 1μm dicke Scheiben geschnitten. Diese wurden schließlich mittels Hämatoxylin und
Eosin (HE), Periodic-Acid-Schiff-Reaktion (PAS) sowie Siriusrot, einer speziellen
Bindegewebsfärbung gegengefärbt.
3.4.3.2 Semidünnschnitttechnik
Die durch das oben erläuterte „area weighted sampling“- Verfahren gewonnenen
Gewebsstücke wurden in gleicher Weise wie auch die Paraffinschnitte gewaschen,
entwässert und anschließend in 1%igem Osmiumtetroxid nachfixiert. Nach der darauf
folgenden Einbettung in Epon-Araldit härteten die Präparate bei einer Temperatur von
70°C für 18 bis 20 Stunden im Brutschrank aus. Im Anschluss daran wurde eine zufällige
Auswahl 5 fertiger Eponblöcke bis zum Erreichen des ersten Gewebes getrimmt, um dann
mittels eines Ultra-Mikrotoms (Reichert-Jung, Heidelberg) Schnitte mit einer Dicke von
0,35 μm anzufertigen. Zuletzt wurden diese hitzefixiert und auf einem Objektträger mit
Fuchsin und Methylenblau gefärbt.
3.6 Auswertungen
Sämtliche Messungen wurden in Unkenntnis der Gruppenzugehörigkeit der
Schnittpräparate und immer von derselben Person durchgeführt. Alle Untersuchungen
wurden lichtmikroskopisch durchgeführt. Hierzu diente ein Tubusmikroskop (Olympus BH-
2) mit einem 10er Okular, und abhängig von jeweiligen Messparametern, einem 20er,
40er bzw. einem 100er Objektiv, für welches zusätzlich Immersionsöl verwendet wurde.
15
3.7 Semiquantitative Untersuchung der Niere
3.7.1 Glomeruloskleroseindex (GSI)
Anhand des Glomeruloskleroseindex lässt sich das Ausmaß der Schädigung des
Glomerulums in Form von Proliferation der Mesangiumzellen und Vermehrung der
mesangialer Matrix quantifizieren. Die Paraffinschnitte (PAS-Färbung) wurden
mäanderförmig abgefahren, und jedes 5. Glomerulum (insgesamt pro Tier 100 Glomeruli)
in 400-facher Vergrößerung unter dem Lichtmikroskop (Standard 25 der Firma Zeiss,
Oberkochen, Deutschland) beurteilt. Dies erfolgte nach der Methode von El Nahas et al.
[32], der die Schädigung der Glomeruli in 5 verschiedene Stadien unterteilte (Tab. 2).
Tabelle 3: Stadieneinteilung der Glomerulosklerose
Stadium Histologische Veränderungen Anteil der Veränderungen am Konvolut
0 Normales Glomerulum 0%
1 Mesangiale Verdickung mit und ohne Proliferation
von Mesangiumzellen. Keine Kapillarbeteiligung
< 25%
2 Mesangiale Proliferation mit partieller
Gefäßwandbeteiligung. Segmentale Sklerose
<50%
3 Große Teile der Kapillaren sind durch mesangiale
Proliferation oder Narbenformation obliteriert, diffuse
Sklerose
< 75%
4 Totale Obliteration der Kapillaren mit oder ohne
Kapillarthrombose, globale Sklerose mit
Kapillarkollaps
100%
Da nur jedes 5. Gesichtsfeld zur Beurteilung der Glomeruli in Betracht kam, konnten im
Schnitt ca. 100 Glomeruli pro Niere analysiert werden. Mit Hilfe der unten stehenden
Formel ließ sich aus den 100 ermittelten Einzelwerten der Index der Glomerulosklerose
(GSI) pro Niere berechnen:
(0xn0) + (1xn
1) + (2xn
2) + (3xn
3) + (4xn)
4 (2)
GSI =
n0 + n
1 + n
2 + n
3 + n
4
(n
0, n
1, n
2, n
3 und n
4 stehen für die Anzahl der Glomeruli mit Stadium 0 bis 4)
16
3.7.2 Mesangiolyseindex (MSI)
Auch der Mesangiolyse-Index dient, ähnlich dem GSI, der Quantifizierung des
glomerulären Schädigungsausmaßes. Im Gegensatz zur mesangialen Proliferation wurde
der Verlust an Mesangiumzellen und die damit einhergehenden Kapillaraussackungen
beurteilt. Die Vorgehensweise der Untersuchung entsprach der für die Beurteilung
Glomerulosklerose (Tab. 3).
Tabelle 4: Stadien der Mesangiolyse
Stadium Histologische Veränderungen
0 keine Veränderungen der Kapillaren
1 Erweiterung einzelner Kapillaren < 25% des Kapillarkonvoluts
2 Erweiterung von Kapillaren > 25% des Kapillarkonvoluts ODER
Kapillaraneurysma bis 50% des Kapillarkonvoluts
3 Kapillaraneurysma 50% - 75% des Kapillarkonvoluts
4 Kapillaraneurysma > 75% des Kapillarkonvoluts
Aus den 100 Einzelwerten lässt sich der Mesangiolyseindex (MSI) wie folgt berechnen:
(0xn0) + (1xn
1) + (2xn
2) + (3xn
3) + (4xn)
4 (3)
MSI =
n0 + n
1 + n
2 + n
3 + n
4
(n0, n1, n2, n3, n4: Anzahl der Glomeruli mit Stadium 0 bis 4)
3.7.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex (TSI)
Der tubulointerstitielle Schädigungsindex dient der Beurteilung von Veränderungen des
Tubulussystems sowie des umgebenden Interstitiums. Die Auswertung erfolgte, indem
anhand Sirius-gefärbter Präparate in der 200fachen Vergrößerung pro Tier jeweils 40
Gesichtsfelder im Bereich der Mark-Rinden-Grenze beurteilt wurden. Die Einteilung
orientierte sich an dem in Tabelle 4 aufgeführten Schädigungsmuster. Die
Gewebsschnitte in Hämatoxylin-Eosin-Färbung dienten hierbei vor allem zur Beurteilung
der interstitiellen Entzündung während die Siriusfärbung eine genauere Darstellung der
17
interstitiellen Fibrose ermöglichte. Die Gradeinteilung erfolgte nach Veniant et al. 1994
[112].
Tabelle 5: Stadien der tubulointerstitiellen Schädigung
Stadium
Histologische Veränderungen
Anteil der Schädigung am Gesamtkonvulot
0 normales Tubulussystem, 0%
1 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und
Fibrose, tubuläre Atrophie <25%
2 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und
Fibrose, tubuläre Atrophie und Dilatation 25-50%
3 Zeichen einer interstitiellen Entzündung und
Fibrose, tubuläre Atrophie und Dilatation >50%
Aus den 40 Einzelwerten lässt sich der tubulointerstitielle Schädigungs-index (TSI)
wiefolgt berechnen:
(0xn0) + (1xn
1) + (2xn
2) + (3xn
3)
(4)
TSI =
n0 + n
1 + n
2 + n
3
(n0, n1, n2, n3: Anzahl der bestimmten Gesichtsfelder mit Stadium 0 bis 3)
3.7.4 Vaskulärer Schädigungsindex (VSI)
Der vaskuläre Schädigungsindex erfasst morphologische Veränderung im Sinne einer
Gefäßwandverdickung und fibrinoiden Nekrose. Hierzu wurden die Aa. arcuatae, Aa.
interlobulares und Kapillaren im Nierenrindenbereich beurteilt. Pro Tier wurden in
200facher Vergößerung 40 Gesichtsfelder in Hämatoxylin-Eosin- und Sirius-Färbung
anhand der Stadien nach Veniant et. al [112] eingeteilt (Tab.5).
18
Tabelle 6: Stadien der vaskulären Schädigung
Stadium Histologische Veränderungen Gefäßwandverdickung
0 normale Gefäße 0%
1 geringe Gefäßwandverdickung <25%
2 moderate Gefäßwandverdickung 25-50%
3 schwere Gefäßwandverdickung >50%
4 fibrinoide Nekrose der Gefäße
Der vaskuläre Schädigungsindex errechnet sich aus den folgenden Werten wiefolgt:
(0xn0) + (1xn
1) + (2xn
2) + (3xn
3) + (4xn)
4 (5)
VSI =
n0 + n
1 + n
2 + n
3 + n
4
(n0, n1, n2, n3, n4: Anzahl der Gefäße mit Stadium 0 bis 4)
3.8 Quantitative Untersuchung der Niere
3.8.1 Morphometrie und Stereologie
Die Stereologie (von griechisch stereos = fest, körperlich) im ursprünglichen Wortsinn ist
die räumliche Interpretation von Schnitten. Sie beschäftigt sich mit dem Verhältnis von
Schnitten durch den Körper zu den Körpern selbst. Die Umrechnung charakteristischer
Parameter der ebenen Fläche ermöglicht Rückschlüsse zur Erfassung der
dreidimensionalen Struktur [68,114,115]. Die Morphometrie (griech.: „Gestalt“, „Messung“)
befasst sich hingegen mit der quantitativen Analyse von Strukturelementen und Partikeln
[83]. Es können somit anhand histologischer Schnittpräparate Aussagen über die
räumliche Struktur eines untersuchten Gewebes gemacht werden.
3.8.2 Punkte-Zähl-Verfahren
Ein in dieser Arbeit angewandtes stereologische Verfahren ist das Punkte-Zähl-Verfahren,
basierend auf dem Delesse`schen Prinzip [25]. Dieses besagt, dass die volumetrische
Ausdehnung eines Gewebes direkt anhand der Flächenzusammensetzung der
Schnittflächen und unabhängig von der räumlichen Orientierung des Gewebes bestimmt
19
werden kann. Nach diesem Prinzip lässt sich mithilfe des Punkte-Zähl-Verfahrens einem
Flächenanteil AA ein bestimmter Volumenanteil VV zuordnen. Somit gilt:
VV = AA (6)
Hierzu wurde ein 10er Okular mit Integrationsplatte (Fa.Olympus) verwendet, dessen
integriertes quadratisches Gitter sich mit 121 symmetrisch angelegten Punkten auf den
jeweiligen histologischen Schnitt projiziert. Daraus lässt sich folgern, dass die Anzahl der
gezählten Punkte PP eines Messgitters, die sich zufällig auf die zu messende Struktur
projizieren, dem Flächenanteil dieser Struktur entspricht [41,45]:
PP = AA (7)
Aus diesen beiden Formeln ergibt sich somit:
PP = AA = VV (8)
Somit entspricht der Volumenanteil VV dem Anteil der Trefferpunkte, auf die
Gesamtpunktzahl des Meßgitters bezogen.
Zur Auswertung der in PAS bzw. HE gefärbten Schnitte diente ein Lichtmikroskop
(Integrationsplatte II, Fa. Zeiss, Oberkochen, Deutschland) mit einem 10er Okular und
oben genanntem Integrationsgitter mit 121 Punkten.
3.9 Morphometrische und stereologische Untersuchungen der Glomeruli
3.9.1 Bestimmung der Ausdehnung von Nierenrinde und Nierenmark
Anhand oben erläuterter Gitterzählung wurden in 100facher Vergrößerung mit PAS-
gefärbten Schnitte die Parameter Anzahl der Glomeruli, Punkte auf Nierenrinde und
Nierenmark ermittelt. Diese wurden mäanderförmig abgefahren und dabei jedes
Gesichstfeld beurteilt. Dies ermöglichte die spätere Berechnung der Volumenfraktionen
von Nierenrinde und Nierenmark.
Nach der Perfusionsfixation der Organe wurde das Nierengewicht (m) ermittelt. Durch
Einsetzen von (m) in folgende Formel ergibt sich das Gesamtvolumen der Niere VN:
20
VN = ρm
x 1000 {mm³} (9)
ρ steht hier für die Dichte der Niere. Hierfür wurden der empirische Wert g/cm3 eingesetzt
[10].
Zur Ermittlung der Volumenfraktionen der Nierenrinde VVR und des Nierenmarkes VVM
wurden folgende Formeln verwendet:
VVR = N
R
PP
x 100 {%} (10)
VVM = M
R
PP x 100 {%} (11)
Unter Miteinbeziehung des Gesamtvolumens der Niere aus Gleichung (6) konnten
schließlich die absoluten Volumina von Nierenrinde VR und Nierenmark VM berechnet
werden:
VR = VN x VVM {mm³} (12)
VM = VN x VVR {mm³} (13)
3.9.2 Glomerulusgeometrie
Im Rahmen des in Punkt 3.6.2.3 beschriebenen Zählverfahrens wurde auch die Anzahl
der Glomeruli ermittelt. Anschließend wurden die Punkte auf Glomeruli bestimmt, indem
unter mäanderförmigem Abfahren des Schnittes in 200facher Vergrößerung jedes zweite
Gesichtsfeld beurteilt wurde.
21
Volumendichte der Glomeruli in der Nierenrinde Die Volumendichte der Glomeruli (VVGlom) in der Nierenrinde lässt sich mithilfe folgender
Formel ermitteln:
VVGlom = R
Glom
PP
x 100 {%} (14)
Anzahl der Glomeruli pro Fläche
Unter Verwendung einer 200fachen Vergrößerung wurde durch eine Bestimmung der
Integrationsplattenfläche anhand der Eichskala die Berechnung der Nierenrindenfläche
(AN) durch die folgende Formel ermöglicht:
AN = PR x 0,9801mm2/121 {mm²} (15)
Nun konnte die Anzahl der Glomeruli pro Fläche NAGlom berechnet werden:
NAGlom = (1,08)²) x (A
n N
Glom {1/mm²} (16)
(1,08)² = Schrumpfungsindex der Niere durch Organfixation
Numerische Dichte der Glomeruli
Anhand der Werte aus (16) und der Volumendichte der Glomeruli aus (14) konnte
schließlich die Numerische Dichte der Glomeruli NVGlom in der Nierenrinde bestimmt
werden:
NVGlom = βκ
x 1/2 VGlom
3/2AGlom
0,01)x (VN
{1/mm³} (17)
22
Der hier angewandte Größenverteilungskoeffizient k der untersuchten Komponenten
entspricht dem Wert 1,04. Der Koeffizient ß entspricht dem Formfaktor, welcher die
Gestalt der gemessenen Komponenten beschreibt. Er beträgt für die annähernd
sphärische Form der Glomeruli 1,38 [12]. Das Verhältnis zwischen den Teilchen in der
Volumeneinheit und der Querschnittszahl in der Fläche einer angeschnittenen Oberfläche
ist unabhängig von einer Größenänderung der Teilchen, vorausgesetzt ihre Gestalt (ß) ist
geometrisch ähnlich [116].
Absolute Anzahl der Glomeruli Die absolute Anzahl der Glomeruli NGlom ergab sich aus folgender Formel:
NGlom = NV x VR (18)
Gesamtvolumen der Glomeruli der Niere Für das Gesamtvolumen der Glomeruli der Niere VNGlom gilt somit schließlich:
VNGlom = 100
Vx V VGlom R {mm³} (19)
Mittleres glomeruläres Volumen Mit den vorhergehenden Gleichungen als Grundlage konnte nun das mittlere glomeruläre
Volumen VGlom bestimmt werden:
VGlom = Glom
NGlom
NV x 106 {10³μm³} (20)
23
3.9.3 Bestimmung der glomerulären Fläche, des glomerulären Volumens und des minimalen und maximalen Durchmessers der Glomeruli
Mithilfe eines halbautomatischen Bildanalysesystems (Analysis Pro, SIS, Münster)
wurden weitere planimetrische Untersuchen an den Glomeruli vorgenommen. Dabei
wurde über ein Spiegelsystem des Mikroskops ein Leuchtpunkt der Steuerungsmaus in
den Strahlengang projiziert. Somit ließen sich auf den Bildschirm übertragene Strukturen
manuell umfahren und markieren. Unter mäanderförmigem Umfahren der HE-gefärbten
Paraffinschnitte wurden pro Tier jedes 5. und insgesamt 40 Glomeruli ausgewählt und auf
oben beschriebene Weise die Parameter glomeruläre Fläche, glomeruläres Volumen
sowie minimaler und maximaler Durchmesser des Glomerulus bestimmt. Unter
Einbeziehung der glomerulären Fläche (A) in folgende Formel konnte schließlich das
jeweilige glomeruläre Volumen berechnet werden:
V = κβ
x A2/3 {mm³} (21)
Mit ß=1,38 und κ=1,04 als Koeffizienten der Form und der Größe
3.9.4 Bestimmung von absoluten Zellzahlen und Strukturverteilungen im Glomerulus
An den gemäß Abschnitt 3.4.3.2 angefertigten Semidünnschnitten wurden quantitative
Untersuchungen der glomerulären Zellen durchgeführt. Unter dem Lichtmikroskop wurden
pro Tier zufällig 20 Glomeruli ausgewählt und in 1000facher Vergrößerung unter
Verwendung von Immersionsöl ausgewertet. Zunächst wurde die Anzahl folgender Zellen
und Strukturen ausgezählt:
• Podozyten
• Mesangiumzellen
• Endothelzellen
• Parietalzellen
• Kapillaranschnitte
24
Weiterhin wurden mithilfe des in Punkt 3.8.2 erläuterten Punktezähl-verfahrens, pro
Glomerulum die Anzahl der Gitterpunkte des Zählgitters ermittelt, die sich pro
Gesichtsfeld auf folgenden Strukturen abbildeten:
• Podozyten
• Mesangiumzellen
• Endothelzellen
• Parietalzellen
• Kapillaranschnitte
• Bowman-Kapselraum
• Mesangiale Matrix
Um beim mäanderförmigen Versetzen des Gesichtsfeldes Doppelauszählungen zu
verhindern, wurden nur jeweils zwei der vier Außenränder des Gitters in die Zählung mit
einbezogen. Überschritt die Größe des Glomerulus die des Gitters, wurde das Gitter auf
der Überschnittsfläche erneut angesetzt bis alle Anteile erfasst waren. Die Addition aller
gezählten Gitterpunkte lieferte somit Rückschlüsse auf die Größe des Glomerulus. Nach
den oben erwähnten Messungen konnten des weiteren mit Hilfe der in den folgenden
Abschnitten dargestellten Formeln die morphometrischen Eigenschaften der Glomeruli
und der einzelnen Zelltypen ermittelt werden. Die Fläche der dabei verwendeten
Integrationsplatte mit 121 (11x11) Gitterpunkten betrug entsprechend der 1000-fachen
Vergrößerung 9,801 × 10³ mm².
Längendichte der Kapillaren
Die Gesamtlänge der Kapillaren pro Fläche wird als Längendichte bezeichnet. Zur
Berechnung der Längendichte der Kapillaren wird die Anzahl der Kapillaranschnitte (nkap)
ins Verhältnis zur Fläche des gesamten Kapillarkonvoluts (Akon) gesetzt. Diese wird
ermittelt aus der Gesamtzahl der Gitterpunkte, die auf das Kapillarkonvolut entfallen
(Pkapkon), und der Gitterfläche:
Akon = (Pkapkon /121) × 9,801 × 10³ { mm²} (22)
Pkapkon entspricht der Summe alle Gitterpunkte, die auf Endothelzellen (ez), Podozyten
(pz), Mesangiumzellen (mz), Kapillaranschnitte (kap) und mesangiale Matrix (mm)
entfallen. Es ergibt sich somit:
25
Pkapkon = Pez + Ppz + Pmz + Pkap + Pmm (23)
Nun konnte die Längendiche der Kapillaren LV folgendermaßen berechnet werden:
QA = nkap / Akon {1/mm²} (24)
LV = 2 x QA {1/mm²} (25)
Volumendichte der Kapillaren Das Verhältnis von Gitterpunkten, die auf Kapillaranschnitte entfielen (Pkap), zur
Gesamtzahl der Gitterpunkte, die auf dem Kapillarkonvolut zu liegen kamen, entspricht
der Volumendichte der Kapillaren (Vvkap ).
Es ergibt sich somit folgende Formel:
VVkap = (Pkap/ Pkapkon) × 100 {%} (26)
Mittlere Kapillarquerschnittsfläche Die mittlere Kapillarquerschnittsfläche a kann aus der Volumen- und Längendichte der
Kapillaren ermittelt werden. Da VVkap in Prozent angegeben wird, ist eine Multiplikation mit
0,01 erforderlich.
a = (VVkap / LVkap) × 0,01 × 106 {μm²} (27)
Gesamtvolumen und Gesamtfläche der Kapillaren Aus der Volumendichte und dem mittleren glomerulären Volumen (Vglomsemi) lässt sich
nun das Gesamtvolumen (Vgeskap) der Kapillaren pro Konvolut errechnen:
Vgeskap = VVkap x Vglomsemi x 0,01 {10³µm³} (28)
26
Vglom semi wurde dabei wie folgt ermittelt:
Vglomsemi = κβ
x (Akon)3/2 x 106 {10³ μm³} (29)
Dabei ist κ der Größenkoeffizient der untersuchten Strukturen und hat, in Abhängigkeit
von Form und Volumendichte, in diesem Fall den Wert 1,04. Der Koeffizient β dient als
Formfaktor, der die Gestalt der gemessenen Partikel beschreibt und der für die annähernd
sphärische Form der Glomerula 1,38 beträgt [77].
Aus der Volumendichte und der Konvolutfläche kann man auf die gleiche Weise die
Gesamtfläche der Kapillaren Ageskap berechnen:
Ageskap = VVkap x Akon x 0,01 x 106 {µm²} (30)
Volumendichte der jeweiligen Zellart Aus dem Verhältnis der Gitterpunktzahl, die auf die jeweilige Zellart entfallen (PZellen) zu
der sich auf das gesamte Konvolut projizierenden Gitterpunktzahl (Pkon) ergab sich die
Volumendichte der jeweiligen Zellart pro Glomerulum (VVZellen):
VVZellen = PZellen / Pkon × 100 {%} (31)
Die Volumendichte wurde für Podozyten (VVPod), Mesangiumzellen (VVMes) und
Endothelzellen (VVEnd) bestimmt.
Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart Aus der Volumendichte der jeweiligen Zellart (VVZellen) und dem wie in (29) angewandtem
mittleren glomerulären Volumen (Vglomsemi) kann das Gesamtvolumen der jeweiligen Zellart
(VgesZellen) bestimmt werden. Da die Volumendichte in Prozent angegeben wird, muss auch
hier der Faktor 0,01 in die Formel einfließen:
VgesZellen = VVZellen × Vglom semi × 0,01 {10³μm³} (32)
27
Es wurde das Gesamtvolumen von Podozyten, Mesangiumzellen und Endothelzellen
berechnet.
Nummerische Dichte der jeweiligen Zellart pro Konvolutvolumen Folgende Gleichung gilt für die Berechnung der nummerischen Dichte einer Zellart pro
Konvolutvolumen (NVZellen):
NVZellen = βκ
x 1/2 ZellenV
3/2ZellenA
0,01) x (VN
{1/mm³} (33)
Der Koeffizient κ hat stets den Wert 1,04, während β für Mesangium- und Endothelzellen den Wert
1,4 und für Podozyten den Wert 1,5 besitzt.
Gesamtzahl der jeweiligen Zellart Aus der nummerischen Dichte der Zellen (NVZellen) und dem mittleren glomerulären
Volumen (Vglomsemi) kann die Gesamtzahl der jeweiligen Zellart (NgesZellen) ermittelt werden:
NgesZellen = NVZellen × Vglom semi / 106 (34)
Gesamtzahl der Zellen pro Glomerulum Aus der Addition der Zellzahlen aller Zellarten (Podozyten, Mesangium-zellen und
Endothelzellen) ergibt sich die Anzahl aller Zellen eines Glomerulums:
NgesGlom = NgesPod + NgesMes + NgesEnd (35)
28
Gezählte Zellart pro Fläche Die Anzahl der gezählten Zellen pro Glomerulumfläche (NAZellen) wird wie folgt berechnet:
NAZellen = NZellen /Akon {1/mm²} (36) NZellen steht hierbei für alle gezählten Zellen der jeweiligen Zellart (Podozyten,
Mesangiumzellen und Endothelzellen) pro Glomerulum.
Durchschnittliches Volumen der jeweiligen Zellart Das durchschnittliche Volumen (VZellen) der jeweiligen Zellart wird folgendermaßen
berechnet:
VZellen = VgesZellen/ NgesZellen {10³μm³} (37)
3.10 Statistik
Von sämtlichen gemessenen und errechneten Parametern aller sechs Versuchsgruppen
wurden zunächst Mittelwerte und Standardabweichungen ermittelt. Diese wurden
computergestützt mit Hilfe des Statistikprogramms SPSS (Version 17.0, SPSS Inc.,
Chicago, Illinois, USA) verglichen und auf signifikante Unterschiede hin untersucht. Dabei
wurden die Messwerte zunächst mit dem Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung
und anschließend auf Homogenität der Variablen getestet. Lag keine Normalverteilung
vor, so wurde der Kruskal-Wallis-Test bzw. einzeln der U-Test von Mann-Whitney und
Wilcoxon angewandt. Waren die Daten homogen, wurde die einfaktorielle ANOVA
angewandt und bei gegebener Signifikanz zwischen den Gruppen der entsprechende
post-hoc-Test (LSD-Test) durchgeführt. Waren die Daten inhomogen, wurde der Welch-
Test benutzt und bei gegebener Signifikanz der dazugehörige post-hoc-Test (Tamhane-
Test) durchgeführt. Ein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen wurde für eine
Irrtumswahrscheinlichkeit (p) ein Wert von kleiner als 0,05 angenommen.
29
IV. Ergebnisse
Die im Verlauf des Versuches erhobenen Laborparameter und metabolischen
Untersuchungsparameter wurden für diese Arbeit von der Firma Merck® (Darmstadt
Deutschland) zur Verfügung gestellt. Die eigenen Auswertungen der histologischen
Schnitte erfolgten dann wie oben beschrieben anhand von Paraffin1 - und
Semidünnschnitten2. Für die jeweiligen Untersuchungsreihen wurde die folgende Anzahl
an Tieren ausgewertet:
Tabelle 7: Anzahl der ausgewerteten Tiere pro Untersuchungsreihe
24 Wo ZDF-lean
ZDF-fatty
ZDF-lean-diet
ZDF-fatty-diet
n=10
n=8
n=10
n=7
Schädigungsindices
(MSI,GSI,TSI,VSI)
8 Wo ZDF-lean
ZDF-fatty
n=10
n=10
Verteilung Nierenmark/Nierenrinde, Glomerulusgeometrie n=5 pro Gruppe
1
Planimetrische Vermessungen am Glomerulus n=5 pro Gruppe
2 Absolute Zellzahlen und Strukturverteilungen im Glomerulus n=3 pro Gruppe
Der Unterschied zwischen der Gruppengröße bei den 24 Wochen alten Tieren (n=40) bei
Versuchsbeginn und den tatsächlich ausgewerteten Tieren (n=35) entstand durch den
vorzeitigen Tod von Versuchstieren sowie durch Organpathologien und Artefakte bei der
Gewebeaufbereitung, die eine adäquate Auswertung verhinderten.
Für eine bessere Übersichtlichkeit der graphischen Darstellungen wurden jeweils nur die
zwischen allen 24 Wochen alten Tieren bestehenden Signifikanzen veranschaulicht. Die
Werte und Signifikanzen der 8 Wochen alten Tiere sind jeweils den vorausgehenden
Tabellen zu entnehmen.
30
4.1 Tierparameter 4.1.1 Körpergewicht, Nierengewicht und relatives Nierengewicht
Tabelle 8: Körpergewicht (KG), Nierengewicht (NG) und relatives Nierengewicht (NG/KG), 8 Wochen
Tierparameter ZDF-Lean ZDF-Fatty ANOVA1/Welch-Test2
KG in [g] 209±5
a-d,f
276±4
a-e
p<0,0012
NG in [g] 0,95±0,09
a-d,f
1,2±0,1
b-e
p<0,0011
NG/KG in [mg/g] 4,42±0,07
a,c,d
4,36±0,29
a,d
p<0,0012
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean24W b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty24W c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet24W d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet24W e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
Tabelle 9: Körpergewicht (KG), Nierengewicht (NG) und relatives Nierengewicht (NG/KG), 24 Wochen
Tier-
Parameter
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ANOVA1/ Welch- Test2
KG in [g] 432±24
d,e,f
425±61
d,e,f
409±25
d,e,f
591±34
a-c,e,f
p<0,0012
NG in [g] 1,34±0,13
b-e
1,92±0,36
a.c,e,f
1,62±0,06
a,b,d-f
2,05±0,19
a,c,e,f
p<0,0011
NG/KG in
[mg/g]
3,12±0,27
c,e,f
4,61±1,16
n.s.
3,97±0,15
a,d,e
3,45±0,29
c,e,f
p<0,0012
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean24W b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty24W c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet24W d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet24W e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
31
Körpergewicht
0100200300400500600700800
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
[g] 24w8w
p<0,01
Abb.1: Körpergewicht in [g]
Die Tiere der Gruppe ZDF-Fatty-diet wiesen ein signifikant höheres Körpergewicht auf als
alle anderen Tiergruppen (Abb.1). Die Gruppe ZDF-Lean-diet zeigte zuletzt im Vergleich
zu seiner Kontrollgruppe ZDF-Lean ein niedrigeres Körpergewicht, das jedoch nicht
signifikant ist.
Tabelle 10: Körpergewicht im zeitlichen Verlauf [g]
Körpergewicht ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
7.Wo 193±17
b,d
239±10
a,c
195±16
b,d
241±12
a,c
8.Wo 228±16
b,d
288±11
a,c
230±17
b,d
286±13
a,c
10.Wo 278±19
b,d
362±13
a,c
273±21
b,d
349±16
a,c
12.Wo 311±20
b,d
396±19
a,c
300±26
b,d
406±21
a,c
16.Wo 365±22
b,d
428±49
a,c,d
349±26
b,d
498±22
a,b,c
20.Wo 403±23
b
413±62
d
382±23
d
551±29
a,b,c
24.Wo
432±24
d
425±61
d
409±25
d
591±34
a,b,c Varianzanalyse P<0,05 p<0,05 p<0,05 p<0,05
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean24W b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty24W c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet24W d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet24W
32
Körpergewicht im Verlauf
0
100
200
300
400
500
600
700
7 8 10 12 16 20 24Wochen
[g]
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
Abb.2: Körpergewicht im Verlauf in [g]
Die Tiere der Gruppe ZDF-Fatty besaßen ein deutlich höheres Ausgangsgewicht und ein
auch im Verlauf signifikant höheres Gewichtsniveau als die ZDF-Lean-Tiere (Abb. 2 und
Tab. 10). Die Gruppe ZDF-Fatty-diet zeigte nach etwa 12 Wochen einen signifikant
steileren Gewichtsverlauf als die ZDF-Fatty-Tiere, wohingegen sich die Gruppen ZDF-
Lean und ZDF-Lean-diet kaum unterschieden. Somit scheint die salzreiche Ernährung nur
bei bereits übergewichtigen Tieren eine schnellere Gewichtszunahme zu begünstigen.
Nierengewicht
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
[g] 24w8w
p<0,01
Abb.3: Nierengewicht in [g]
Wie in Abb. 3 zu erkennen, unterschied sich das Nierengewicht signifikant zwischen allen
Gruppen. So kam es zu einem deutlichen Anstieg sowohl zwischen den Gruppen Lean
und Fatty als auch zwischen deren salzbelasteten Vergleichsgruppen. Das Nierengewicht
33
hat demnach sowohl bei den adipösen als auch bei den schlanken Tieren unter
Salzbelastung signifikant zugenommen.
relatives Nierengewicht
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mg/g]
24W8W
p<0,01p<0,05
Abb. 4: relatives Nierengewicht in [mg/g]
Aus Abbildung 4 läßt sich in Bezug auf das relative Nierengewicht ein signifikanter
Unterschied zwischen den Gruppen ZDF-Lean und Lean-diet im Sinne einer Zunahme
erkennen. Die Gruppe ZDF-Fatty-diet zeigt zu ZDF-Fatty eine deutliche Abnahme des
relativen Nierengewichtes, die jedoch nicht signifikant war. Weiterhin bestand ein
signifikant niedrigeres relatives Nierengewicht der Gruppe ZDF-Fatty-diet im Vergleich zu
ZDF-Lean-diet. Bei den 8 Wochen alten, schlanken Tieren der ZDF-Lean-Gruppe zeigte
sich erwartungsgemäß ein signifikant höheres relatives Nierengewicht wohingegen sich
dieses Verhältnis bei der ZDF-Fatty-Gruppe aufgrund der Organhypertrophie umgekehrt
hatte.
4.2 Nahrungsaufnahme- und Flüssigkeitsaufnahme
Tabelle 11: Nahrungs- und Flüssigkeitsaufnahme
ZDF-Lean
ZDF-Fatty
ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ZDF-Lean
ZDF- Fatty
Anova1/ Kruskal-Wallis2
Gruppe 24 Wo 8 Wo
Nahrungs-aufnahme in g/Tag
19,3
±1,6
b,d,f
35,9
±4,5
a,c-f
20±
1,1
b,d,e
28,7
±1,9
a-c,e
17,3±
1,1
b,d,f
26,9
±0,7
a-c,e
p<0,011
Flüssigkeits-aufnahme in ml/Tag
23,6 ±1,7 b-d,f
104,7 ±32,6 a,e,f
78,8±4 a,b,d-f
120,4±15 a,c,e,f
23,5±2,3 b-d,f
32,1 ±2,4 a-e
p<0,012
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean24W b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty24W
34
c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet24W d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet24W e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
Die Nahrungsaufnahme und die Flüssigkeitsaufnahme unterschieden sich quantitativ
sowohl zwischen beiden ZDF-Lean- und ZDF-Fatty-Gruppen als auch zwischen ZDF-
Lean/Lean-diet und ZDF-Fatty-Diet signifikant (Tab.9). Erwartungsgemäß nahmen die
Fatty-Tiere im Vergleich zu den Lean-Tieren mehr Nahrung zu sich. Die Tiere mit
salzreichem Futterangebot zeigten im Vergleich zu ihrer Kontrollgruppe bei den Lean-
Tieren nur einen gering höheren Wert, die Fatty-Tiere nahmen unter salzreicher Diät
insgesamt weniger zu sich (Abb.5).
Bei der Flüssigkeitsaufnahme zeigten sich signifikant unterschiedliche Werte zwischen
allen Gruppen, die salzreiche Ernährung führte jeweils zu einer sehr starken Zunahme der
Trinkmenge im Vergleich zur den Kontrollgruppen. Des weiteren nahmen die Fatty-Tiere
im Vergleich zu den Lean-Tieren stetig mehr Flüssigkeit zu sich (Abb.6).
Nahrungsaufnahme im Verlauf
15
20
25
30
35
40
45
50
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Alter [Wochen]
Nah
rung
sauf
nahm
e [g
/Tag
ZDF-Lean
ZDF-Fatty
ZDF-Lean-Diet
ZDF-Fatty-Diet
Abb.5: Nahrungsaufnahme im Verlauf in [g/Tag]
35
Flüssigkeitsaufnahme im Verlauf
20
40
60
80
100
120
140
160
180
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Alter [Wochen]
Flüs
sigk
eits
aufn
ham
e [m
l/day
ZDF-Lean
ZDF-Fatty
ZDF-Lean-Diet
ZDF-Fatty-Diet
Abb.6: Flüssigkeitsaufnahme im Verlauf in [ml/Tag]
4.3 Urinparameter Tabelle 12: Nierenfunktionsparameter, 8 Wochen
Nierenfunktions-parameter
ZDF-Lean ZDF-Fatty Anova1/ Welch-Test2/ Kruskal- Wallis3
Diurese (ml/24h) 5,18±0,9
a-d
25,8±9,4
b-d
p<0,012
Albumin- Ausscheidung (mg/24h)
0,02±0,006
a-d,f
0,21±0,07
a-e
p<0,013
Kreatinin-Ausscheidung (µmol/24h)
47,7±8,04
a-d
58,4±11,2
a-d
p<0,011
S-Kreatinin (μmol/l) 11,9±1,6
a-c
11,8±3,4
a-c
p<0,012
Kreatinin-Clearance (ml/min)
2,87±0,78 3,93±1,81 n.s
Harnstoff-Ausschei-dung (mg/24h)
400±46,1
a-d,f
1179±138 b,e p<0,012
36
U-Albumin-Kreatinin-Ratio
0,008±0,002
a-d,f
3,9±1,8
b,e,f
p<0,001³
Natrium-Ausscheidung (mmol/l)
213±18 a-c
110±38 c-e
p<0,052
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean24W b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty24W c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet24W d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet24W e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W Tabelle 13: Nierenfunktionsparameter, 24 Wochen
Nieren-funktions-parameter
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-Diet
ZDF-Fatty-Diet
Anova1/ Welch-Test2/ Kruskal- Wallis3
Diurese (ml/24h)
10,5±2,2
b-e
130±42,2
a,c,e,f
65,1±10,8
a,b,d-f
140±48,9
a-e
p<0,012
Albumin-Ausscheidung (mg/24h)
2,23±4,1
b,d-f
131±145
a,c-f
1,34±1,24
b,d-f
433±256
a-c,e,f
p<0,013
Kreatinin-Ausscheidung (µmol/24h)
164±16,4
b,e,f
124±26,3
a,c-f
172±25,7
b,d-f
146±23,1
b,c,e,f
p<0,011
S-Kreatinin (μmol/l)
34,4±10,4
e,f
31,2±12,5
e,f
28,1±9,1
n.s.
27,9±30,5
n.s.
p<0,012
Kreatinin-Clearance (ml/min)
3,8±1,6
3,63±2,51 5,09±2,67 3,44±0,83 n.s
Harnstoff-Ausscheidung (mg/24h)
874±122
b,d,e
1796±409
a,c,e,f
901±181
b,d,e
1421±187
a,c,e
p<0,012
U-Albumin-Kreatinin-Ratio
0,21±0,37
b,d,e
16,5±18,1
a,c,e,f
0,13±,11
b,d,e
42,5±42,5
a,c,e,f
p<0,001³
Natrium-Ausscheidung (mmol/l)
123,2±26,2
b-e
28±7
a,c-e
373±17
a,b,d-f
265±61
a,b,c,f
p<0,011
37
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean24W b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty24W c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet24W d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet24W e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8
Die in Tabelle 10 enthaltenen Parameter werden im Folgenden einzeln aufgeführt.
4.3.1 Diurese
Diurese
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ml/24h
24W
8W
p<0,01p<0,05
Abb.7: Diurese in ml/24h
Die 24 Wochen alten Tiere der Gruppe ZDF-Lean zeigten zuletzt eine signifikant höhere
Diurese als die Tiere der Gruppe ZDF-Lean-diet. Auch die Diurese der Gruppe ZDF-Fatty-
diet stieg im Vergleich zu ZDF-Fatty um ca. 10 ml/24h, es ergab sich jedoch keine
Signifikanz (Tab.14 und Abb.8).
Tabelle 14: Diurese im Verlauf in[ ml/24h]
Gruppe ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ANOVA
8. Woche 6,33±1,3
b,d
26,1±12,1
a,c
6,6±1,4
b,d
23,3±8,8
a,c
p<0,001
12. Woche 8,47±1,3
b,c
81,2±46,8
a
56,3±6,7
a,d
98,6±6,9
a,c
p<0,001
16. Woche 7,97±1,3
b,c
116±61,2
a
55,7±6,6
a,d
111±10,4
a,c
p<0,001
20. Woche 7,28±2,6
b-d
116±24,8
a,c
53,8±10,9
a,b,d
136±33,2
a,c
p<0,001
38
24. Woche 10,5±2,2
b-d
130±42,2
a,c
65,1±10,8
a,b,d
140±48,9
a,c
p<0,001
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet
Diurese im Verlauf
020406080
100120140160
8w 12w 16w 20w 24w
ml/24h
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
Abb.8: Diurese im Verlauf in [ml/24h]
Im zeitlichen Verlauf der Salzbehandlung kam es schon ab der 12. Woche zu einer
Steigerung der Diurese der schlanken Tiere um den Faktor 8. Die Ausscheidung blieb bis
zum Versuchsende auf diesem Niveau annähernd konstant (Abb.8). Die Gruppen ZDF-
Fatty und –Fatty-diet zeigten untereinander bezogen auf die Diurese einen ähnlichen
Verlauf. Es konnte eine kontinuierliche Zunahme der Diurese bis zuletzt um den Faktor 5
des Ausgangswertes beobachtet werden.
4.3.2 Albumin-Ausscheidung
Albumin-Ausscheidung
0
100
200
300
400
500
600
700
800
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mg/24h]
24 Wop<0,01
*
Abb.9: Albumin-Ausscheidung [µg/24h]
39
* Ein signifikanter Unterschied (p<0,05) besteht zu allen anderen Gruppen
Eine signifikant höhere Albuminausscheidung zu allen anderen Gruppen zeigte sich bei
den Tieren der Gruppe ZDF-Fatty-diet (Abb.9). Ebenso ließen sich signifikante
Unterschiede zwischen ZDF-Fatty und ZDF-Lean bzw. ZDF-Lean-diet feststellen.
Zwischen den Gruppen ZDF-Lean und ZDF-Lean-diet nahm die Albuminausscheidung
sogar von 2,23 zu 1,34 µg/24h ab. Gegen einen Verdünnungseffekt spricht hier die sich
gleichermaßen verhaltende Albumin-Kreatinin-Ratio im Urin (s.Tab.10).
4.3.3 Kreatininausscheidung und Serum-Kreatinin
Kreatinin-Ausscheidung
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[µmol/24h]
24W
8W
Abb.10: Kreatinin-Ausscheidung in [µmol/24h]
Es ergaben sich hinsichtlich der Kreatininausscheidung Signifikanzen zwischen allen
Vergleichsgruppen mit Ausnahme der Lean- zur Lean-diet-Gruppe (Abb.10). Die mit Salz
belasteten Gruppen zeigten jeweils eine leichte Zunahme der Kreatinin-Ausscheidung.
Aus den Werte der Serum-Kreatinin-Bestimmmung ergaben sich keine signifikanten
Unterschiede.
4.3.4 Kreatinin-Clearance
Die Kreatinin-Clearance zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen.
40
4.3.6 Harnstoff-Ausscheidung im Urin
Harnstoff-Ausscheidung
0,00
500,00
1000,00
1500,00
2000,00
2500,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
mg/24h24W
8W
p<0,05
Abb.11: Harnstoffausscheidung im Urin [mg/24h]
Die Tiere der Gruppen ZDF-Fatty schieden kontinuierlich signifikant mehr Harnstoff aus
als ihre Vergleichsgruppe ZDF-Lean (Abb.11). Hierbei spielt sicherlich der
Eiweißkatabolismus der diabetischen Fatty-Tiere die entscheidende Rolle. Zwischen
deren salzbelasteten Vergleichsgruppen kam es jeweils zu einer Abnahme der
Harnstoffexkretion, die nicht signifikant war.
4.3.7 Natrium-Konzentration im Urin
Natrium-Konzentration im Urin
050
100150200250300350400450
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
mmol/ l24 Wo
8 Wo
*
*
*
*
Abb.12: Natrium-Konzentration im Urin [mmol/l] *Signifikanzen zu allen anderen Gruppen, p<0,05
Hinsichtlich der Natrium-Ausscheidung wiesen die ZDF-Lean-diet Tiere die höchsten Urin-
Konzentrationen auf, diese waren signifikant höher zu allen anderen Gruppen. Die Werte
41
der ZDF-Fatty-diet Tiere zeigten eine im zeitlichen Verlauf abnehmende Tendenz und
waren zum Ende des Versuches signifikant niedriger als die der ZDF-Lean-diet Gruppe.
Ebenso zwischen den beiden Kontroll-Gruppen kam es zu einer signifikanten Abnahme
der Natrium-Konzentration.
4.4 Blutparameter Tabelle 15: Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsels, 8 Wochen
Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsels
ZDF-Lean ZDF-Fatty Kruskal-Wallis-Test1/ Anova2
Serum-Glucose (mg/dl)
139±37
b,f
288±35,7
a-c,e
p<0,0011
Glucose-Konzentration im Urin (mg/dl)
45,4±12,9
b-d,f
7017±2467
a,c-e
p<0,0011
Serum-Insulin (ng/ml)
0,69±0,08
a,b,d,f
26,6±3,19
a-e
p<0,0011
HbA1c (%)
5,2±1,4
a-c
6±1
a-c
p<0,0011
Serum-Natrium (mmol/l)
143,1±0,8
b,f
139,7±0,8
a-f
p<0,001²
Serum-Kalium (mmol/l)
6,08±0,22
a-d
6,07±0,12
a-d
p<0,001²
Serum-Calcium (mmol/l)
2,81±0,03
a-d,f
2,99±0,05
a-e
P<0,001²
Serum-Chlorid (mmol/l)
101,7±0,9
b,d,f
96,1±0,9
a-c,e
p<0,0011
Serum-Harnsäure (µmol/l)
44,8±3,1
a-d,f
21,8±1,7
a,b,d,e
p<0,001²
Serum-Harnstoff (mmol/l)
4,4±0,5
b,f
7±0,7
a,c-e
p<0,001²
Serum-Cholesterin (mg/dl)
111,8±5,1
b-d,f
153,2±8,9
a,c-e
p<0,0011
Serum-LDL (mg/dl)
48,8±2,9
a,b,d,f
71,3±6,8
a-e
p<0,0011
42
Serum-HDL (mg/dl)
33,8±1,8
b,d,f
52,9±4,7
a-e
p<0,0011
Triglyceride (mg/dl)
99,8±39,6
b,d,f
672±105
a,c,e
p<0,0011
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
Tabelle 16: Blutparameter und Werte des Glucosestoffwechsels, 24 Wochen
Blutparame-ter und Werte des Glucosestoff-wechsels
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
Kruskal-Wallis-Test1/ Anova2
Serum-Glucose (mg/dl)
151±28,9
b,f
547±102
a-f
136±15,2
b,f
218±114
b
p<0,0011
Glucose-Konzentration im Urin (mg/dl)
57,4±36,5
b-d,f
9845±1663
a,c-e
7,82±4,46
a,b,d-f
1146±1164
a-c,e,f
p<0,0011
Serum-Insulin (ng/ml)
1,33±0,42
b-f
2,68±0,9
a,c-f
0,94±0,44
a,b,d,f
8,45±4,37
a-c,e,f
p<0,0011
HbA1c (%) 3,9±0,6
b,e,f
10±1,6
a,c-f
4,4±2,8
b,e,f
4,6±1,4
b
p<0,0011
Serum-Natrium (mmol/l)
143,9±1,3
a,f
135,7±1,9
a-f
143,6±1
b,f
142,4±02,2
b,f
p<0,001²
Serum-Kalium (mmol/l)
5,11±0,28
c-f
5,26±0,38
c-f
4,64±0,17
a,b,e,f
4,61±0,16
a,b,e,f
p<0,001²
Serum-Calcium (mmol/l)
2,63±0,05
d,e,f
2,65±0,05
e,f
2,61±0,06
d-f
2,71±0,13
a,c,e,f
P<0,001²
Serum-Chlorid (mmol/l)
102,3±1,1
b,d,f
91,9±2
a,c-f
101,7±1
b,d,f
97,2±2
a-c,e
p<0,0011
Serum-Harnsäure (µmol/l)
31±7,1
b,d-f
12,9±3,8
a,d,e,f
26,3±6,1
b,d,e
9,9±6,5
a,c,e,f
p<0,001²
Serum-Harnstoff (mmol/l)
5,2±0,7
b,d,f
7,5±1,3
a,c-e
4±1,3
b,f
3,1±2,1
a,b,f
p<0,001²
43
Serum- Cholesterin (mg/dl)
104,1±14,2
b,d,f
205,1±52,7
a,c-e
95,4±14,1
b,d-f
323,9±90,6
a-c,e,f
p<0,0011
Serum-LDL (mg/dl)
57,5±6,4
b,d,f
105,3±21,2
a,c-f
53,2±8
b,d,f
173,8±62,7
a-c,e,f
p<0,0011
Serum-HDL (mg/dl)
37±7,3
a,d,f
83,7±19,2
a,c-f
38,7±10,9
b,d,f
144,9±50
a-c,e,f
p<0,0011
Triglyceride (mg/dl)
81,7±58,4
b,d,f
535±257
a,c-e
71,8±33,5
b,d,f
994,3±364,2
a-c,e
p<0,0011
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
4.4.1 Parameter des Glucosestoffwechsels
Serum-Glucosespiegel
0,0
100,0
200,0
300,0
400,0
500,0
600,0
700,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
mg/dl 24W
8 W
p<0,001
Abb.13: Serum-Glucosespiegel [mg/dl]
Die Werte des Blutzuckerspiegels befanden sich sowohl bei den 8 als auch bei den 24
Wochen alten Tieren der Gruppe ZDF-Lean erwartungsgemäß im Normbereich. Zwischen
den Gruppen ZDF-Lean und ZDF-Fatty kam es ebenso in beiden Fällen zu einer
signifikanten Zunahme. Die salzbelasteten Tiere zeigten jeweils eine Abnahme des
Blutzuckerspiegels, die bei den Gruppen ZDF-Lean-diet zu ZDF-Lean nur geringfügig, bei
ZDF-Fatty-diet zu ZDF-Fatty signifikant war (Abb.13).
44
Serum-Glucose im zeitlichen Verlauf
0,0100,0200,0300,0400,0500,0600,0700,0800,0900,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
mg/dl8W
20W
24W
Abb.14: Serum-Glucosespiegel im zeitlichen Verlauf [mg/dl]
Im zeitlichen Verlauf beobachtete man einen Höchstwert der Serum-Glucose nach 20
Wochen Behandlung, der gegen Ende des Versuches bei allen Gruppen rückläufig wurde.
Die Glucosurie zeigte bei den ZDF-Fatty-Tieren mit Abstand die höchsten Werte, die ZDF-
Fatty-diet Tiere dahingegen entwickelten insgesamt eine weniger ausgeprägte
diabetische Stoffwechsellage.
Serum-Insulinspiegel
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
mg/dl 24W
8 W*
p<0,01p<0,05
Abb.15: Serum-Insulinspiegel in [mg/dl] *Es besteht Signifikanz (p<0,05) zu allen anderen Gruppen
Für die Serum-Insulinspiegel ergaben sich Signifikanzen zwischen ZDF-Lean und ZDF-
Fatty im Sinne einer Zunahme des Insulinspiegels, ZDF-Lean zu –Lean-diet zeigte eine
leichte Abnahme und ZDF-Fatty zu –Fatty-diet eine deutliche Zunahme. Ebenso der
Unterschied zwischen ZDF-Lean-diet und -Fatty-diet war signifikant (Abb.15). Die Werte
45
der 8 Wochen alten Fatty-Tiere spiegeln die starke Hyperinsulinämie bei beginnender
Insulinresistenz wider.
HbA1c
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
%24W
8W
p<0,001p<0,05
Abb.16: HbA1c in [%]
Die HbA1c-Werte der Lean-Tiere blieben erwartungsgemäß im Normbereich. Die
höchsten Werte zeigte die Gruppe ZDF-Fatty und unterschied sich damit signifikant zu
den salzbelasteten Gruppen. Zusammenfassend konnten bei den salzreich ernährten
Tieren weniger hohe Blutzuckerwerte, Insulinwerte und Urin-Glucosewerte gemessen
werden.
4.4.2 Elektrolyte
Serum-Natrium
130,0
132,0
134,0
136,0
138,0
140,0
142,0
144,0
146,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mmol/l] 24W
8W
p<0,001
Abb.17: Serum-Natrium in [mmol/l]
46
Die mittleren Natrium-Konzentrationen unterschieden sich unter den ZDF-Lean- und ZDF-
Lean-diet Tieren kaum (Abb.16). Die Tiere der Gruppe ZDF-Fatty zeigte überraschend
niedrige Natriumwerte und unterschied sich damit signifikant zu allen anderen Gruppen.
Alle Tiere lagen mit ihren Serum-Natrium-Werten im Normbereich (135-145 mmol/l).
Serum-Chlorid
86,088,090,092,094,096,098,0
100,0102,0104,0106,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
mmol/l
24W8W
p<0,001
Abb.18: Serum-Chlorid
Die Chloridwerte verhielten sich ähnlich dem Natrium, bis auf eine zusätzliche signifikante
Abnahme bei den ZDF-Fatty-diet Tieren zu allen anderen Gruppen.
Serum-Kalium
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mm
ol/l]
24W
8W
p<0,001Serum-Calcium
2,30
2,40
2,50
2,60
2,70
2,80
2,90
3,00
3,10
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mmol/]l 24W
8W
p<0,01p<0,05
Abb.19: Serum-Kalium in [mmol/l] Abb.20: Serum-Calcium in [mmol/l]
Das Serum-Kalium zeigte signifikant niedrigere Werte der salzbehandelten Tiere zu ihren
Kontrollgruppen. Hierbei lagen alle 24 Wochen alten Tiere im Normbereich (4,3-5,6
mmol/l), die 8 Wochen alten Tiere geringfügig darüber. Die Gruppe ZDF-Fatty-diet zeigte
die höchsten, leicht über normwertigen (2,2-2,6 mmol/l) Calciumwerte und unterschied
sich damit von den übrigen Gruppen z.T. signifikant, die untereinander ähnliche Werte
aufwiesen.
47
4.4.3 Parameter des Fettstoffwechsels
Serum-Cholesterin
0,050,0
100,0150,0200,0250,0300,0350,0400,0450,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mg/dl] 24W
8Wp<0,001p<0,05
Serum-LDL
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mg/dl] 24W
8Wp<0,001p<0,05
Abb.21a: Serum-Cholesterin Abb.21b: Serum-LDL
Serum-HDL
0,0
50,0
100,0
150,0
200,0
250,0
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mg/dl]
24W
8W
p<0,001p<0,01
Triglyceride
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
1200,00
1400,00
1600,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[mg/dl]24W
8Wp<0,001p<0,05
Abb.21c: Serum-HDL Abb.21d: Triglyceride
Wie in den Abbildungen 21 a-d zu erkennen, lagen alle diabetischen Tiere in allen
Fettstoffwechselwerten außerhalb des Normbereiches. Die Tiere der Gruppe ZDF-Lean-
diet zeigten kaum Unterschiede zu ihrer Vergleichsgruppe ZDF-Lean, sie lagen ebenfalls
im Normbereich. Im Gegensatz dazu zeigten sich die höchsten Werte bei allen
Parametern bei der Gruppe ZDF-Fatty-diet, diese sind signifikant höher zu allen anderen
Gruppen. Die Salzbelastung zeigt hier einen aggravierenden Einfluss auf die
Fettstoffwechsellage der Tiere.
4.5 Schädigungsindices und Morphometrie der Nieren
Die Schädigungsindices wurden anhand von Paraffinschnitten erhoben.
Tabelle 17: Schädigungsindices und Morphometrie der Nieren, 8 Wochen
Schädigugnsindices Und Morphometrie
ZDF-Lean ZDF-Fatty Kruskal-Wallis1/ Anova
GSI1 0,92±0,16
a
1,26±0,23
a-c
p<0,001²
MSI2 0,34±0,11 0,33±0,11 n.s.
48
TSI3 0,77±0,17
d
0,81±0,1
d
p<0,0011
VSI4 0,09±0,1 0,42±0,55 n.s.
Umfang des Kapillar- konvoluts (µm)
334,3±8,9
a-d,f
363,2±5,6
a-e
p<0,001²
Fläche des Kapillar- konvoluts (µm²)
6205±294
a-d,f
7293±198
a-e
p<0,001²
Volumen des Kapillar- konvoluts (10³µm³)
621±48,9
a-d,f
791±35,2
a-e
p<0,001²
Größter Durchmesser des Kapillar- konvoluts (µm)
82,4±1,3
a-d,f
88,7±0,9
a-e
p<0,001²
Kleinster Durchmesser des Kapillar- konvoluts (µm)
100,1±2,9
a-d,f
108,8±0,9
b-e
p<0,001²
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean GSI1=Glomeruloskleroseindex (Score) b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty MSI2=Mesangiolyseindex (Score) c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet TSI3=Tubulointerstitieller Schädigungs- d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet index (Score) e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W VSI4=vaskulärer Schädigungs- f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W index (Score) Tabelle 18: Schädigungsindices und Morphometrie der Nieren, 24 Wochen
Schädigugnsindices und Morphometrie
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean- diet
ZDF-Fatty-diet
Kruskal-Wallis1/ Anova²
GSI1 0,63±0,37
b,d-f
0,98±0,24
a,f
0,78±0,28
d,f
1,3±0,32
a,c
p<0,001²
MSI2 0,46±0,25
0,44±0,2 0,44±0,19 0,53±0,09 n.s.
TSI3 0,92±0,34
d
0,9±0, 29
c,d
0,77±0,09
d
1,6±0,55
a-e
p<0,0011
VSI4 0,35±0,35 0,72±0,51 0,38±0,4 0,7±0,36 n.s.
Umfang des Kapillar-konvoluts (µm)
415±26,1
b,d-f
454,7±21,1
a,c,e,f
403,7±14,6
b,d-f
464±21,9
a,c,e,f
p<0,001²
49
Fläche des Kapillar-konvoluts (µm²)
8430±924
b,d-e
10578±666
a,c,e,f
8564±141
b,d-f
11338±519
a,c,e,f
p<0,001²
Volumen des Kapillarkonvoluts (10³µm³)
976±162,4
b,d-f
1367±126,8
a,c-f
994±24,8
b,d-f
1515±105
a-c,e,f
p<0,001²
Größter Durchmesser des Kapillarkonvoluts (µm)
94,1±6,5
b,d-f
104,9±4,8
a,c,e,f
96,2±1,7
b,d-f
109±2,4
a,c,e,f
p<0,001²
Kleinster Durchmesser des Kapillarkonvoluts (µm)
114,4±6,1
b,d-f
126,9±5,8
a,c-f
115,5±1,6
b,d-f
134,4±2,4
a-c,e,f
p<0,001²
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean GSI1=Glomeruloskleroseindex (Score) b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty MSI2=Mesangiolyseindex (Score) c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet TSI3=Tubulointerstitieller Schädigungs- d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet index (Score) e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W VSI4=vaskulärer Schädigungs- f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W index (Score)
4.5.1 Glomeruloskleroseindex (GSI)
0,000,200,400,600,801,001,201,401,601,80
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
score
24 W
8W
p<0,01p<0,05
Abb.22: Glomerulärer Schädigungsindex
Die glomeruläre Schädigung war bei allen Tieren der Gruppe ZDF-Fatty signifikant stärker
ausgeprägt als bei der Gruppe ZDF-Lean. Die salzbelasteten Tiere zeigten einen
deutlichen jedoch nicht signifikanten Anstieg des glomerulären Schädigungsindex im
Vergleich zu ihren Kontrollgruppen (Abb.22).
50
4.5.2 Mesangiolyseindex (MSI)
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
score
24 W8W
Abb.23: Mesangiolyseindex
Das Ausmaß der Mesangiolyse war insgesamt niedrig und nahm bei der Gruppe Fatty-
diet leicht zu. Die übrigen Gruppen unterschieden sich untereinander kaum. Es ergaben
sich keine Signifikanzen (Abb.23).
4.5.3 Tubulointerstitieller Schädigungsindex
score
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
24 W
8W
p<0,01
Abb.24: Tubulointerstitieller Schädigungsindex
Der tubulointerstitielle Schaden war am deutlichsten bei der Gruppe ZDF-Fatty-diet
ausgeprägt. Wie in Abb. 24 deutlich zu sehen, besteht Signifikanz zu allen anderen
Gruppen. Ähnlich den mesangialen Veränderungen sind die übrigen Gruppen
untereinander annähernd konstant.
51
4.5.4 Vaskulärer Schädigungsindex
Die vaskulären Veränderungen zeigten eine nicht signifikante Zunahme zwischen den
Gruppen ZDF-Lean zu ZDF-Fatty. Im Hinblick auf die salzbelasteten Tiere ergab sich ein
geringer Anstieg des vaskulären Schädigungsindex zu deren Kontrollgruppen, jedoch
keine Signifikanzen (Tab.13).
4.5.5 Parameter des Kapillarkonvolutes
Größter Durchmesser des Kapillarkonvoluts
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[µm] 24W
8W
p<0,001p<0,01
Kleinster Durchmesser des Kapillarkonvoluts
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[µm] 24W
8W
p<0,001p<0,01
Abb.25a: Größter Durchmesser des Kapillarkonvoluts Abb.25b: Kleinster Durchmesser des Kapillarkonvoluts
Die Durchmesser des Kapillarkonvoluts nahmen zwischen den ZDF-Lean und den
diabetogenen ZDF-Fatty-Tieren signifikant zu. Außerdem wies die Gruppe ZDF-Fatty-diet
hinsichtlich des maximalen Durchmessers des Kapillarkonvoluts signifikant höhere Werte
auf als ihre Kontrollgruppe ZDF-Fatty (Abb.25a).
Ähnlich dem minimalen Durchmesser (Abb.25b) verhielten sich die Ergebnisse für die
Fläche des Kapillarkonvoluts (Abb.26).
Fläche des Kapillarkonvoluts
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[µm²] 24W
8W
p<0,001Volumen des Kapillarkonvoluts
0,00200,00400,00600,00800,00
1000,001200,001400,001600,001800,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[µm
³x10
³]
24W
8W
p<0,001p<0,05
Abb.26: Fläche des Kapillarkonvoluts Abb.27: Volumen des Kapillarkonvoluts
Die gleichen Verhältnismäßigkeiten wie für den maximalen Durchmesser ergaben sich
auch für das Volumen des Kapillarkonvolutes (Abb.27). Bei den salzbelasteten Tieren ließ
sich ein verstärkender Einfluss auf die glomeruläre Größenzunahme demnach nur bei den
diabetischen Tieren erkennen.
52
4.6 Glomerulusgeometrie und Rinden/Mark-Verhältnis
Die Ermittlung der nun beschriebenen Werte erfolgte anhand von Paraffinschnitten den
unter 3.9.1 und 3.9.2 beschriebenen Formeln.
Tabelle 19: Glomerulusgeometrie und Rinden/Mark-Verhältnis, 8 Wochen
Parameter ZDF-Lean ZDF-Fatty Kruskal-Wallis1/ Anova²
Volumenfraktion von Nierenrinde VVR [%]
65,3±2,1 64,1±2,5 n.s.
Volumenfraktion von Nierenmark VVM [%]
34,7±2,1 32,3±4,4 n.s.
Volumenfraktion der Glomeruli VVGlom [%]
18,8±0,6 14,2±1,3 n.s.
Anzahl der Glomeruli NGlom 39731±5652 40372±4283 n.s.
Anzahl der Glomeruli pro Fläche NGlom/A [1/mm²]
10,7±0,91
a-c,f
9,18±0,48
a-e
p<0,001²
Anzahl der Glomeruli pro Volumen NGlom/V [1/mm³]
71±8,35
a-d,f
55,9±4,39
a-e
p<0,001²
Gesamtvo-lumen der Glomeruli einer Niere VNGlom [mm³]
77,2±8
a-d,f
102±11,7
e p<0,051
Mittleres glomeruläres Volumen VGlom [10³µm³]
1965±231
b,d
2556±378
b,d
p<0,05²
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W Tabelle 20: Glomerulusgeometrie und Rinden/Mark-Verhältnis, 24 Wochen
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean- diet
ZDF-Fatty- diet
Kruskal-Wallis1/ Anova²
Volumenfraktion von Nierenrinde VVR [%]
67,7±2,2 67,3±3,8 67,8±2,8 70,3±5,3 n.s.
53
Volumenfraktion von Nierenmark VVM [%]
32,3±2,2 32,7±3,8 32,2±2,8 29,7±5,3 n.s.
Volumenfraktion der Glomeruli VVGlom [%]
12,7±0,4 16,2±2,6 12,9±1,9 14,8±2,7 n.s.
Anzahl der Glomeruli NGlom
39118±4555
42676±4728 47218±6429 47011±4881 n.s.
Anzahl der Glome-ruli pro Fläche NGlom/A [1/mm²]
7,4±0,38
e,f
7,58±0,51
e,f
7,68±0,77
e,f
6,96±0,87
e,f
p<0,001²
Anzahl der Glome-ruli pro Volumen NGlom/V [1/mm³]
43,2±4,3
d,e,f
39,5±4,74
e,f
44,97±5,98
e,f
36,5±6,11
a,e,f
p<0,001²
Gesamtvolumen der Glomeruli einer Niere VNGlom [mm³]
117±1,7
b,d,e
189±36,5
a,c,e 137±24,2
a,b-e
192±34,8
a,c,e
p<0,051
Mittleres glomeruläres Volumen VGlom [10³µm³]
3161±299
b,d
4514±986
a,c,e,f
2965±786
b,c
4184±1069
a,c,e,f
p<0,05²
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
Im Folgenden sind die signifikanten Parameter einzeln aufgeführt (Tab.14):
4.6.1 Anzahl der Glomeruli pro Fläche und pro Volumen
Anzahl der Glomeruli pro Fläche
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
12,0
14,0
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
[1/mm²] 24W
8W
Anzahl der Glomeruli pro Volumen
0,010,020,030,040,050,060,070,080,090,0
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
[1/mm³]24W
8W
p<0,05
Abb.28a: Anzahl der Glomeruli pro Fläche Abb. 28b: Anzahl der Glomeruli pro Volumen
54
In der Anzahl der Glomeruli pro Fläche und pro Volumen ergaben sich signifikante
Unterschiede zwischen den beiden 8 zu allen 24 Wochen alten Tieren. Die behandelten
Gruppen liessen keine relevanten Veränderungen erkennen (Abb.28a+b).
4.6.2 Gesamtvolumen der Glomeruli einer Niere und mittleres glomeruläres Volumen
Gesamtvolumen der Glomeruli einer Niere
0
50
100
150
200
250
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
[mm³] 24W
8W
p<0,01p<0,05
Mittleres Glomeruläres Volumen
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Lean Fatty Lean-diet Fatty-diet
[µm
³x10
³]
24W
8W
p<0,05
Abb.29a: Gesamtvolumen der Glomeruli einer Niere Abb.29b: Mittleres Glomeruläres Volumen
Bezüglich des Gesamtvolumens der Glomeruli ließ sich bei den diabetogenen Tieren eine
signifkante Zunahme im Verlgeich zu den Kontrollgruppen erkennen. Zwischen den
salzreich behandelten Gruppen und ihren Kontrollgruppen kam es in beiden Fällen zu
einer Zunahme, die allerdings nicht signifikant war. Diese Verhältnismäßigkeiten gelten in
gleicher Weise für das mittlere glomeruläre Volumen (Abb.29a+b).
4.7 Zellzahlen und Strukturverteilungen im Glomerulus
Die folgenden Parameter wurden anhand von Semidünnschnitten sowie mithilfe den unter
3.9.4 beschriebenen Formeln ermittlelt.
Tabelle 21: Parameter der glomerulären Kapillaren, 8 Wochen
ZDF-Lean ZDF-Fatty ANOVA
Längendichte der Kapillaren [1/mm²]
15316±409
a-c,f
13015±786
b,d,f
p<0,001
Volumendichte der Kapillaren [%]
30,7±3,8
f
29,9±2,7
a,c,e
p<0,05
Kapillarquerschnittsfläche [μm²]
20,03±2,37
a-c
23,13±2,9
b,d
p<0,001
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
55
Tabelle 22: Parameter der glomerulären Kapillaren, 24 Wochen
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ANOVA
Längendichte der Kapillaren [1/mm²]
13765±308
b,d,e
10190±267
a,c,e,f
13803±621
b,d,e
10850±738
a,c,e,f
p<0,001
Volumendichte der Kapillaren [%]
35,5±0,97
f
33,4±0,84
n.s.
37±1,8
d,f
31,7±2,3
d
p<0,05
Kapillarquerschnitts-fläche [μm²]
25,8±1,2
b,e
32,8±1,2
a,c,e,f
26,9±2,1
b,e
29,3±2,7
e,f
p<0,001
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
Tabelle 23: Parameter der glomerulären Zellen, 8 Wochen
Podozyten ZDF-Lean ZDF-Fatty ANOVA1/Welch²
Volumendichte der Podozyten [%]
5,54±0,13
a,b,d,f 5,55±1,14
c,e p<0,001²
Gesamtvolumen der Podozyten [10³ μm³]
25,98±2,13
n.s. 34,2±4,5
n.s. p<0,05²
Podozyten pro Fläche [1/mm²]
2058±90
a-d,f 1713±301
a,c,e p<0,0011
Podozytenzahl pro Volumen [1/mm³]
116985±6920
a-d,f 88935±8658
b,d,e p<0,0011
Gesamtzahl der Podo-zyten pro Glomerulum
54,7±3,19
a,b,d 55,6±7,24
a,b,d p<0,051
Durchschnittsvolumen eines Podozyten [μm³]
475±28,2 627±124 n.s.
Tabelle 24: Parameter der glomerulären Zellen, 24 Wochen
Podozyten ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ANOVA1/Welch²
Volumendichte der Podozyten [%]
3,6±0,29
n.s. 3,36±0,25
n.s. 3,83±0,11
f 3,28±0,3
f p<0,001
²
56
Gesamtvolumen der Podozyten [10³ μm³]
24,9±2,15
n.s. 38,1±1,87
n.s. 28,1±2,37
n.s. 34,8±5,95
n.s. p<0,05²
Podozyten pro Fläche [1/mm²]
1377±35,8
b,d,e,f 1009±31
a,e,f 1289±84,3
e,f 1006±26,7
a,e,f p<0,0011
Podozytenzahl pro Volumen [1/mm³]
98597±10959
b,d,e 66108±9490
a,c,e,f 83684±6592
a,b,d,e 67942±
4986
a,c,e,f
p<0,0011
Gesamtzahl der Podo-zyten pro Glomerulum
67,6±7,68
e,f 75,2±6,65
c,e,f 61,2±6,24
b 71,4±4,77
e,f p<0,051
Durchschnittsvolumen eines Podozyten [μm³]
376±71,4
508±61,8 461±33
488±74,3
n.s.
Tabelle 25: Parameter der glomerulären Zellen, 8 Wochen
Mesangiumzellen ZDF-Lean ZDF-Fatty ANOVA1/Welch²
Volumendichte der Mesangiumzellen [%]
4,96±0,2
a,b 5,26±0,97
a,b,d p<0,051
Gesamtvolumen der Mesangiumzellen [10³ μm³]
23,2±0,48
b,d 32,4±4,05
e p<0,051
Mesangiumzellen pro Fläche [1/mm²]
19297±1215
a,d,f 7695±1936
c,e p<0,0011
Mesangiumzellzahl pro Volumen [1/mm³]
8978751±
101972
a,b,d,f
2264827±
812565
c,e
p<0,011
Gesamtzahl der Mesangium-zellen pro Glomerulum
423±75
f 147±63
b,c,e p<0,051
Durchschnittsvolumen einer Mesangiumzelle [μm³]
5,6±0,8 28±15,3 n.s.
Tabelle 26: Parameter der glomerulären Zellen, 24 Wochen
Mesangiumzellen ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ANOVA1/Welch²
Volumendichte der Mesangiumzellen [%]
3,4±0,11
e 3,39±0,1
e 4,17±0,64
d,f
3,9±0,55
c,e
p<0,051
57
Gesamtvolumen der Mesangiumzellen [10³ μm³]
23,3±0,19
b,d 38,7±0,16
a,e 30,4±4,53
d 41,5±8,86
a,c,e p<0,051
Mesangiumzellen pro Fläche [1/mm²]
10487±2390
e 9521±2070
e 13836±4431
d,e,f 6946±833
c,e p<0,0011
Mesangiumzellzahl pro Volumen [1/mm³]
3773553±
1254556
e
6206459±
2785041
e
2180549±
254245
d,f
8978751±
1019720
c,e
p<0,011
Gesamtzahl der Mesangiumzellen pro Glomerulum
299±93
n.s. 436±81
F 444±178
f 232±46
n.s. p<0,051
Durchschnittsvolumen einer Mesangiumzelle [μm³]
15,6±3,89 17,3±3,37 8,98±5,69 17,9±1,58 n.s.
Tabelle 27: Parameter der glomerulären Zellen, 8 Wochen
Endothelzellen ZDF-Lean ZDF-Fatty ANOVA1/Welch²
Volumendichte der Endothelzellen [%]
6,79±0,52
a,b,d
6,41±0,68
b,d p<0,0011
Gesamtvolumen der Endothelzellen [10³ μm³]
31,97±4,51
40,2±6,13
n.s.
Endothelzellen pro Fläche [1/mm²]
27250±1375
b,d,f
12056±3078
A,c,e p<0,0011
Endothelzellzahl pro Volumen [1/mm³]
12847093±
902790
b,d,f
4026943±
1569133
A,c,e
p<0,011
Gesamtzahl der Endothel-zellen pro Glomerulum
601±48
n.s. 263±124
a-c p<0,051
Durchschnittsvolumen einer Endothelzelle [μm³]
5,31±0,56
f 19,47±10,15
a,b,c,e p<0,051
58
Tabelle 28: Parameter der glomerulären Zellen, 24 Wochen
Endothelzellen ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ANOVA1/Welch²
Volumendichte der Endothelzellen [%]
5,45±0,42
b,e
4,0±0,37
a,c,e,f 6,32±0,69
B,d 4,66±0,63
c,e,f p<0,0011
Gesamtvolumen der Endothelzellen [10³ μm³]
37,4±3,59
45,4±3,11
46,1±5,07
49,4±9,32
n.s.
Endothelzellen pro Fläche [1/mm²]
21447±5131
d,f
14169±4443
c,e 26519±6155
b,d,f 10921±
1529
a,c,e
p<0,0011
Endothelzell-zahl pro Volumen [1/mm³]
10374485±
4118447
d,f
6338124±
3566680
c,e
13109193±
4457948
b,d,f
3948001±
686909
a,c,e
p<0,011
Gesamtzahl der Endothelzellen pro Glomerulum
705±267
f 734±231
f 943±278
d,f 422±111
c p<0,051
Durchschnitts-volumen einer Endothelzelle [μm³]
6,26±2,61
f
6,67±2,26
f 5,63±2,6
f 12,07±2,33
p<0,051
Tabelle 29: Parameter der glomerulären Zellen, 8 Wochen
ZDF-Lean ZDF-Fatty ANOVA1/Welch²
Gesamtzahl aller Zellen pro Glomerulus
10302±1010
f
4159±1863
b,c,e
p<0,051
Mittleres glomeruläres Volumen VVglomsemi
[10³µm³]
469±29
a-d,f
629±83
a-e
p<0,0011
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W
59
Tabelle 30: Parameter der glomerulären Zellen, 24 Wochen
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet
ZDF-Fatty-diet
ANOVA1/Welch²
Gesamtzahl aller Zellen pro Glomerulus
10110±3602
n.s
11774±3120
F
13932±4555
d,f
6615±1582
c
p<0,051
Mittleres glomeru-läres Volumen VVglomsemi [10³µm³]
686±20
b,d,e
114±17
a,c,e,f
731±43
b,d,e
1054±88
a,c,e,f
p<0,0011
a signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean b signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty c signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean-diet d signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty-diet e signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Lean8W f signifikanter Unterschied zur Gruppe ZDF-Fatty8W 4.7.1 Werte des Kapillarkonvolutes und der Kapillaren
Längendichte der Kapillaren
0,002000,004000,006000,008000,00
10000,0012000,0014000,0016000,0018000,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[1/m
m²]
24W
8W
p<0,001
Abb.30: Längendichte der Kapillaren
Die Längendichte der Kapillaren war bei allen Tieren der Gruppen ZDF-Fatty sigifikant
niedriger als in den Gruppen ZDF-Lean. Zwischen den salzbehandelten Tieren und deren
Kontrollgruppen ergab sich ein geringer Zuwachs der Längendichte, wie in Abb. 30 zu
erkennen jedoch ohne Signifikanz.
60
Kapillarquerschnittsfläche
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[µm²]
24W
8W
p<0,05
Abb.31: Kapillarquerschnittsfläche
Die Werte für die Kapillarquerschnittsfläche unterschieden sich zwischen allen Tieren der
Gruppen ZDF-Lean zu ZDF-Fatty in einer leichten Zunahme (Abb.31). Diese war
allerdings nur zwischen ZDF-Lean-diet und ZDF-Fatty-diet signifikant. Die ZDF-Lean-
Tiere blieben bezüglich ihrer salzbelasteten Kontrollgruppe annähernd konstant, ZDF-
Fatty zeigte unter Salzbehandlung einen leichten Anstieg in der
Kapillarquerschnittsfläche.
Volumendichte der Kapillaren
0,005,00
10,0015,0020,0025,0030,0035,0040,0045,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[%]
24W
8W
p<0,01
Abb.32: Volumendichte der Kapillaren
Bezüglich der Volumendichte der Kapillaren hatten die Tiere der Gruppen ZDF-Lean eine
Tendenz zu höheren Werten als die ZDF-Fatty-Tiere. Wie auch bei der
Kapillarquerschnittsfläche war dieser Unterschied lediglich zwischen den Gruppen ZDF-
Lean-diet und ZDF-Fatty-diet signifikant, in diesem Fall jedoch im Sinne einer Abnahme
der Volumendichte (Abb.32).
61
4.7.2 Mittleres Glomeruläres Volumen
Mittleres glomeruläres Volumen
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[10³µm³]
24W
8W
Abb.33: Mittleres glomeruläres Volumen
Im mittleren glomerulären Volumen unterschieden sich die Gruppen ZDF-Fatty und ZDF-
Fatty-diet jeweils signifikant von den ZDF-Lean- und –Lean-diet-Tieren (Abb.33). Die
glomeruläre Hypertrophie war bei der Gruppe ZDF-Fatty-diet etwas geringer ausgeprägt
als bei deren Kontrollgruppe ZDF-Fatty während es zwischen ZDF-Lean zu ZDF-Lean-
diet zu einer leichte Zunahme kam.
4.7.3 Gesamtzahl der einzelnen Zellen pro Glomerulus
Gesamtzahl der Podozyten pro Glomerulus
010203040
5060708090
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
24W
8W
p<0,05Gesamtzahl der Endothelzellen pro
Glomerulus
0
500
1000
1500
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
24W
8W
p<0,05
Abb.34a:Gesamtzahl der Podozyten pro Glomerulus Abb.34b:Gesamtzahl der Endothelzellen pro Glomerulus
Gesamtzahl der Mesangiumzellen pro Glomerulus
0100200300400500600700
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
24W
8W
Abb.34c: Gesamtzahl der Mesangiumzellen pro Glomeruus
62
Bei der Betrachtung der Anzahl der Podozyten pro Glomerulus (Abb.30a) fällt auf, dass es
zu einer Abnahme der Zellzahl bei den mit Salz belasteten Tieren im Vergleich zu deren
unbehandelten Kontrollgruppen gekommen ist. Diese war nicht signifikant. Jedoch war
der Unterschied zwischen der Gruppe ZDF-Fatty zu den salzbelasteten schlanken Tieren
signifikant. Die Endothelzellzahl pro Glomerulum nahm bei der Gruppe ZDF-Lean-diet im
Vergleich zu den unbehandelten Tieren zu (Abb.34b). Dahingegen unterschieden sich die
Gruppen ZDF-Fatty zu Fatty-diet in einer Abnahme der Endothelzellzahl, jedoch ebenfalls
nicht signifikant. Hier zeigte sich des weiteren ein signifikanter Unterschied zwischen den
Gruppen ZDF-Lean-diet zu ZDF-Fatty-diet. Eine ähnliche Wertekonstellation wie die der
Endothelzellzahl ergab sich hinsichtlich der Mesangiumzellen (Abb.34c).
Gesamtzahl der Zellen pro Glomerulus
02000400060008000
100001200014000160001800020000
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
24W
8W
p<0,05
Abb.35: Gesamtzahl der Zellen pro Glomerulus
Die Gesamtzellzahl pro Glomerulus hatte bei den ZDF-Lean-Tieren unter Salzdiet
zugenommen, umgekehrt verhielt es sich bei den ZDF-Fatty-Tieren. Schliesslich war der
Unterschied der beiden salzbelasteten Gruppen signifikant im Sinne einer Abnahme
zwischen ZDF-Lean-diet zu –Fatty-diet (Abb.35). Bei der Betrachtung der einzelnen
Zellzahlen pro Glomerulum (Abb 34 a-c) wird ersichtlich, dass die Erhöhung der
Gesamtzellzahl bei der Gruppe ZDF-Lean-diet in erster Linie auf der Zunahme der
Endothelzellen und auch der Mesangiumzellen beruht. Bei den Podozyten war es zu einer
leichten Abnahme der Zellzahl gekommen. 4.7.4 Durchschnittsvolumen der einzelnen Zellen
Hinsichtlich der Durchschnittsvolumina der Podozyten, Mesangiumzellen und
Endothelzellen konnten zwischen den einzelnen Gruppen keine signifikanten
Unterschiede festgestellt werden (Tab.15).
63
4.7.5 Volumendichte der einzelnen Zellen
Die Volumendichte der Podozyten und Mesangiumzellen erreichte die höchsten Werte im
Vergleich zu allen anderen Gruppen jeweils in der Gruppe ZDF-Fatty-diet (Tab 15). In
beiden Fällen konnten keine Signifikanzen ausgemacht werden.
Volumendichte der Endothelzellen
0
1
2
3
4
5
6
7
8
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[%] 24W
8W
p<0,05p<0,01
Abb.36: Volumendichte der Endothelzellen
Der Anteil der Endothelzellen am glomerulären Volumen zeigte bei allen salzbelasteten
Tieren deutlich höhere Werte, jedoch ohne Signifikanz zu den Kontrollgruppen. Die
Gruppe ZDF-Fatty liess im Vergleich zu ZDF-Lean eine signifikant niedrigere
Volumendichte erkennen. Weiterhin ergaben sich signifikant höhere Werte der Gruppe
ZDF-Fatty-diet verglichen mit ZDF-Lean-diet.
4.7.6 Gezählte Zellart pro Volumen
Anzahl der Podozyten pro Volumen
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[1/m
m³]
24W
8W
p<0,001p<0,05
Anzahl der Mesangiumzellen pro Volumen
0
2000000
4000000
6000000
8000000
10000000
12000000
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[1/m
m³]
24W
8W
p<0,05
Abb.37a: Anzahl der Podozyten pro Volumen Abb.37b: Anzahl der Mesangiumzellen pro Volumen
64
Anzahl der Endothelzellen pro Volumen
02000000400000060000008000000
100000001200000014000000160000001800000020000000
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[1/m
m³]
24W
8W
p<0,01p<0,05
Abb.37c: Anzahl der Endothelzellen pro Volumen
Bei der Betrachtung der gezählten Zellen pro Volumeneinheit fällt auf, dass sowohl im
Falle der Mesangiumzellen als auch der Endothelzellen die Gruppe ZDF-Lean-diet
gegenüber ihrer Kontrollgruppe eine Zunahme erkennen lässt und von allen 24 Wochen
alten Tieren die höchsten Werte aufweist (Abb.37b+c). Dahingegen kam es zwischen
ZDF-Fatty und –Fatty-diet zu einer Abnahme dieser Zellzahlen. Signifikanz besteht bei
der Mesangiumzellzahl pro Volumen zwsichen ZDF-Lean-diet und –Fatty-diet, bei der
Endothelzellen zusätzlich zu ZDF-Fatty. Die Podozytenzahl veränderte sich unter
Salzbelastung bei der Gruppe ZDF-Lean-diet in Form einer leichten Abnahme, die der
Gruppe ZDF-Fatty, die stets deutlich unter den Werten der schlanken Tieren lag,
veränderte sich kaum (Abb.37a).
4.7.7 Gezählte Zellart pro Fläche
Anzahl der Podozyten pro Fläche
0
500
1000
1500
2000
2500
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[1/m
m²]
24W
8W
p<0,05
Anzahl der Mesangiumzellen pro Fläche
0
5000
10000
15000
20000
25000
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[1/m
m²]
24W
8W
p<0,05
Abb.38a: Anzahl der Podozyten pro Fläche Abb.38b: Anzahl der Mesangiumzellen pro Fläche
Anzahl der Endothelzellen pro Fläche
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[1/m
m²]
24W
8W
p<0,01p<0,05
Abb.38c: Anzahl der Endothelzellen pro Fläche
65
Ähnliche Verhältnismäßigkeiten wie bei der Anzahl der Zellen pro Volumen zeigten sich
auch im Bezug auf die Fläche. Hier ergaben sich für die Mesangium- und Endothelzellen
Signifikanzen zwischen den Gruppen ZDF-Fatty und –Lean-diet wobei ZDF-Lean-diet
erneut die höchsten Werte aufwies. Die Podozytenzahl pro Fäche nahm zwischen ZDF-
Lean zu ZDF-Fatty signifikant ab.
4.7.8 Gesamtvolumen der einzelnen Zellen
Gesamtvolumen der Mesangiumzellen
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
ZDF-Lean ZDF-Fatty ZDF-Lean-diet ZDF-Fatty-diet
[10³
µm³]
24W
8W
p<0,01p<0,05
Abb.39: Gesamtvolumen der Mesangiumzellen
Nach 16 Wochen salzreicher Behandlung zeigten sich im Gesamtvolumen der
Mesangiumzellen eine signifikante Zunahme zwischen den Gruppen ZDF-Lean-diet zu –
Fatty-diet. Ebenso stiegen die Werte zwischen den unbehandelten Gruppen von ZDF-
Lean zu ZDF-Fatty signifikant an. Ähnliche Konstellationen ergaben sich auch für die
Podozyten und Endothelzellen, jedoch ohne erkennbare Signifikanzen.
66
4.8 Fotodokumentation der Befunde Die glomerulosklerotischen Veränderungen im Sinne einer Zunahme der mesangialen
Matrix und glomerulären Obstruktion zeigten sich jeweils in einem signifikant höheren
Glomeruloskleroseindex der Gruppe Fatty im Vergleich zur Gruppe Lean. Das Ausmaß
der glomerulären Sklerose war bei den Tieren der Gruppe Fatty-diet am stärksten zu
beobachten.
4.8.1 Glomerulusklerose
Abb.40: ZDF-Lean, 24 W Abb.41: ZDF-Fatty, 24 W
(PAS-Färbung, 400fache Vergrößerung) (PAS-Färbung, 400fache Vergrößerung)
GruppenMW: GSI 0,63 GruppenMW: GSI 0,98
Abb.42: ZDF-Lean-diet, 24 W Abb.43: ZDF-Fatty-diet, 24 W
(PAS-Färbung, 400fache Vergrößerung) (PAS-Färbung, 400fache Vergrößerung)
GruppenMW: GSI 0,78 GruppenMW: GSI 1,27
67
Abb.44: ZDF-Lean, 8 W Abb.45: ZDF-Fatty, 8 W
(PAS-Färbung, 400fache Vergrößerung) (PAS-Färbung, 400fache Vergrößerung)
GruppenMW: GSI 0,92 GruppenMW: GSI 1,26
4.8.2 Tubulointerstitielle Schädigung Der tubulointerstitielle Schädigungsindex berücksichtigt Atrophie und Dilatation der Tubuli
sowie die Zeichen der interstitiellen Fibrose. Sehr eindrücklich waren diese
Veränderungen an der Gruppe Fatty-diet zu erkennen, die hier den annähernd eine
Verdopplung des Schädigungsindex im Vergleich zu allen anderen Gruppen aufwiesen.
Abb.46: ZDF-Lean, 24 W Abb.47: ZDF-Fatty 24W
(PAS-Färbung, 200fache Vergrößerung) (PAS-Färbung, 200fache Vergrößerung)
GruppenMW: TSI 0,92 GruppenMW: TSI 0,90
68
Abb.48: ZDF-Lean-diet 24W Abb.49: ZDF-Fatty-diet 24W
(PAS-Färbung, 200fache Vergrößerung) (PAS-Färbung, 200fache Vergrößerung)
GruppenMW: TSI 0,77 GruppenMW: TSI 1,60
Abb.50: ZDF-Lean, 8 W Abb.51: ZDF-Fatty, 8 W
(PAS-Färbung, 200fache Vergrößerung) (PAS-Färbung, 200fache Vergrößerung)
GruppenMW: TSI 0,77 GruppenMW: TSI 0,81
69
V. Diskussion
In dem vorliegenden Versuch wurde am Modell der „Zucker-Diabetic-Fatty“- Ratte der
Effekt einer salzreichen Diät auf die Progression diabetischer Folgeschäden der Niere
untersucht. Hierzu erfolgten die Bestimmung von Körpergewicht, Nierengewicht, Serum-
und Urinparametern sowie die lichtmikroskopische Untersuchung der Nierenmorphologie.
Zu Beginn der Diskussion soll auf die pathogenetischen Grundlagen und
histomorphologischen Charakteristika der diabetischen Nephropathie näher eingegangen
werden. Im Anschluß daran werden bereits bestehende Erkenntnisse bezüglich der
Zusammenhänge zwischen nutritiver Salzbelastung und Nierenschädigung aufgegriffen
und diese im Zusammenhang mit den erzielten Ergebnissen diskutiert.
5.1. Pathogenetische Grundlagen der diabetischen Nephropathie
Zu den die diabetische Nephropathie (DN) beeinflussenden Faktoren gehören neben der
Hyperglykämie die Faktoren des metabolischen Syndroms (arterielle Hypertonie,
Dyslipidämie, Adipositas), Nikotinkonsum, genetische Faktoren, Alter und die ethnische
Zugehörigkeit [30]. Die jeweilige Einflussnahme dieser Faktoren wird unter 5.1.1 genauer
dargestellt. Auf zellulärer Ebene ist das Fortschreiten der DN geprägt durch eine
Infiltration von Entzündungszellen, (Myo-)Fibroblastenaktivierung, Aktivierung von
Endothel- und Tubulusepithelzellen und eine Rarefizierung von interstitiellen Kapillaren
[86]. Diese Zellaktivierungen bedingen sich gegenseitig und führen zu einer weiteren
lokalen Ausschüttung von inflammatorischen und profibrotischen Faktoren wie z.B. PAI-1,
Endothelin-1, NF-κB, Proteasen, Wachstumsfaktoren (TGF-ß, TF, CTGF, PDGF, VEGF-
A) und Angiotensin II [2,30,31,85] und schlußendlich zur glomerulären ind interstitiellen
Fibrose.
Aktuelle Studien haben gezeigt, dass inflammatorische und oxidative Prozesse den
gemeinsamen Endpunkt der verschiedenen Pathogenesefaktoren der diabetischen
Nephropathie bilden. So konnte beispielsweise ein PPAR-Y-Agonist in niedriger
Dosierung durch seine antiinflammatorische, antifibrotische und auch antihypertensive
Wirkung die glomeruläre Sklerose und tubulointerstitielle Fibrose (durch deutliche
Senkung der Fibrosefaktoren TGFß, PAI-1 und des Myofibroblastenmarkers α-SMA)
postitiv beeinflussen, ohne dabei die Hyperglykämie oder das Körpergewicht zu
verändern [107]. Dass die diabetische Nephropathie unabhängig von der Hyperglykämie
entstehen kann, zeigte auch eine weitere Studie, innerhalb dieser Diabetikern Nieren von
Nicht-Diabetikern transplantiert wurden, welche trotz guter Hyperglykämie-Kontrolle eine
Nephropathie entwickelten [69].
70
Ebenso geht das Verständnis der Rolle des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems
(RAAS) in der Pathogenese der diabetischen Nephropathie inzwischen weit über die
systemische, hämodynamische Wirkung hinaus gegangen. So wurde Angiotensin II als
lokal proinflammatorisches und profibrotisches Agens identifiziert [78,91]. Dies bestätigte
eine weitere Untersuchung, innerhalb dieser eine medikamentöse RAAS-Blockade den
profibrotischen Effekt des Angiotensin II antagonisiert, indem diese dessen TGF-ß
Stimulation reduziert [48]. Eine weitere Studie an einem der ZDF-Ratte sehr ähnlichen
Rattenmodell, der „obese zucker rat“ (OZR), erbrachte den Beleg, dass unter RAAS-
Blockade sogar bei etablierter diabetischer Nephropathie die Glomerulosklerose
aufgehalten, Mesangiolyse reversibel und einem Podozyten- und Endothelzellverlust
vorbeugt werden kann [4,97]. Es ist anzunehmen, dass die lokal schädigende Wirkung
des RAAS im verwendeten Rattenmodell eine entscheidende Rolle gespielt hat,
besonders unter Berücksichtigung der Tatsache, dass auch die nicht-adipösen Tiere
einen Hypertonus entwickelten und sich somit die hämodynamische Wirkung zwischen
beiden Gruppen nicht wesentlich unterschied.
5.1.1 Auswirkungen von Hyperglykämie, Albuminurie und Dyslipidämie auf die Niere
Eine dauerhafte Hyperglykämie führt durch Induktion einer Reihe von pathologischen
Stoffwechselvorgängen (Produktion von AGE „advanced glycation endproducts“,
Aktivierung der Proteinkinase C, Hexosamin-Pathway, Polyol-Pathway) zu einer gestörten
intrazellulären Proteinfunktion, endothelialer Dysfunktion durch verminderte NO-Synthese,
Hyperpermeabilität und Entzündungsreatkion der Kapillarwand durch Freisetzung von
Zytokinen und Wachstumsfaktoren (IGF-1, IL-1, TNF-α, PDGF, TF, VCAM-1, NF-κB,
VEGF, TGF-ß, PAI-1). Diese Mechanismen bedingen schließlich die progrediente
vaskuläre Mikro- und Makroangiopathie und die Nierenschädigung in Form von
mesangialer Matrixproliferation, Glomerulosklerose, tubulointerstitieller Fibrose und die
irreversible Podozytenschädigung [13,53,54,95].
Die Albuminurie ist Ausdruck der gestörten glomerulären Barrierefunktion für Proteine und
zugleich verantwortlich für die fortschreitende Glomerulosklerose und
Podozytenschädigung [1]. Neuere Daten weisen darauf hin, dass die Endozytose-
vermittelte Proteinüberladung der proximalen Tubulusepithelzellen zu einer intrarenalen
Komplementaktivierung und Zytokinausschüttung führt und dadurch den entscheidenden
Pathomechanismus für die tubulointerstitielle Entzündung und Fibrose darstellt [1,2].
71
Störungen des Lipidstoffwechsels treten häufig als Komorbidität des Diabetes mellitus Typ
II auf. Im Rahmen einer hyperglykämischen Stoffwechsellage mit Insulinresistenz wird die
hormonsensitive Lipase des Fettgewebes stimuliert, somit kommt es zu einem vermehrten
Anfall von freien Fettsäuren im Blut [3]. Neuere Studien haben gezeigt, dass es aufgrund
von Metaboliten der freien Fettsäuren (z.B. Ceramide, Diacylglycerol, Acyl-CoA) im
Skelettmuskel und der Leber zu Störungen des Insulin-Signalweges und
Glucosetransportern, demnach zu einer Verstärkung der Insulinresistenz kommt [24]. Die
Akkumulation von unveresterten intrazellulären freien Fettsäuren oder Trigylceriden führt
darüber hinaus zu erheblichen Beeinträchtigungen der Zellfunktion, Inflammation und
oxidativem Stress bis hin zur Apoptose. Diese sogenannte Lipotoxizität kann unter
anderem auch die insulinproduzierenen ß-Zellen des Pankreas und Kardiomyozyten
betreffen [64]. Des Weiteren ist bekannt, dass ein großer renaler Albuminverlust mit einer
überkompensatorisch bedingten Hypercholesterinämie einhergeht [52], und dass
weiterhin ein renaler Verlust von Apolipoproteinen zu einer mangelhaften Aktivierung der
endothelständigen Lipoproteinlipase und damit einem verminderten Lipidabbau führt [70].
Ähnlich dem Pathomechanismus der Arteriosklerose kann es in den glomerulären
Kapillaren zu zellulären Lipideinschlüssen mit Makrophageneinwanderung sowie nach
deren Phagozytose von oxidierten LDL-Partikeln zur Schaumzellbildung kommen, dies
unterhält gleichermaßen oxidative Prozesse und führt zu vermehrter Vasokonstritktion
[59].
5.1.2 Pathophysiologie und Pathohistologie der diabetischen Nephropathie
Eine frühe funktionelle Veränderung bei der diabetischen Nephropathie zeigt sich in der
eingeschränkten Autoregulationsfähigkeit der afferenten und efferenten Arteriolen. Hierbei
ist der Gefäßwiderstand der afferenten mehr noch als der der efferenten Artierolen
herabgesetzt, dies führt zu einer Hyperperfusion und Hyperfiltration. Induziert durch eine
Reihe von vasoaktiven Mediatoren, wie z.B. Prostanoide, NO, VEGF-A, TGF-ß, AT II
(induziert Vasokonstriktion v.a. am Vas efferens), führt diese intraglomeruläre
Drucksteigerung neben mechanisch bedingter lokaler Zytokinausschüttung schließlich zu
einer Steigerung der Albumin-Leckage, Basalmembranverdickung, Überproduktion von
mesangialer Matrix und Podozytenschädigung [120,127,95]. Die Hyperfiltration wird beim
gleichzeitigen Vorliegen einer Adipositas aufgrund der hohen Sympathikusaktivität,
hohem AT II-Spiegel, Hyperinsulinämie und erhöhter Natriumrückresorption im proximalen
Tubulus noch verstärkt [50,110]. Infolgedessen ist die Natriumkonzentration im Bereich
der Macula densa herabgesetzt und bewirkt wiederum eine Vasodilatation des Vas
afferens und eine Steigerung der Reninsekretion.
72
Die histologischen Charakteristika der diabetischen Nephropathie sind die Expansion der
mesangialen Matrix, Verdickung der Basalmembran, Erweiterung des Interstitiums und
Podozytenschädigung. In späteren Stadien kommt es zu einer Hyalinisierung der
Arteriolen mit vaskulärer Insuffizienz aufgrund der zunehmenden Gefäßokklusion, zur
tubulären Degeneration und schließlich zu einem irreversiblen Podozytenuntergang
[61,80,81].
5.2 Pathophysiologie der salzabhängigen arteriellen Hypertonie
Bei erhöhter Salzaufnahme steigt das Durstgefühl, die Trinkmenge und die
Plasmaosmolalität. Letzteres führt zu einer vermehrten Ausschüttung des hypophysären
antidiuretischen Hormons (ADH) und dadurch zu einem Anstieg des intravasalen
Volumens. Infolgedessen wird aufgrund der erhöhten Vorhofdehnung das atriale
natriuretische Peptid (ANP) freigesetzt, welches die Natrium-Rückresorption in der Niere
hemmt und somit zu einer Elimination des überschüssigen Natriums führt. Der durch das
erhöhte intravasale Volumen bedingte Blutdruckanstieg wird in der Niere durch eine
abnehmende Reninfreisetzung und schießlich ein Absinken des vasoaktiven Angiotensin
II beantwortet [101]. Diese physiologischen Rückkoppelungsmechanismen sind die
Grundlage aller Überlegungen zu den Pathomechanismen des salzinduzierten
Hypertonus und auch möglicher blutdruckunabhängiger toxischer Organschäden.
Die Ursachen einer dauerhaften Blutdruckerhöhung unter erhöhtem Salzkonsum sind
noch nicht vollständig verstanden. Vor mehr als dreißig Jahren wurde der Zusammenhang
zwischen Blutdruck und Natriumausscheidung zur Aufrechterhaltung des
Volumenverhältnisse im extrazellulären Flüssigkeitsraum beschrieben. Die Unfähigkeit
der Niere, das anfallende Natrium auszusscheiden, wird mit einer Volumenzunahme und
einem Blutdruckanstieg beantwortet, um die Natriurese zu steigern [40]. Die
Volumenzunahme scheint in erster Linie den intravaskulären Raum zu betreffen, so wurde
in eine Studie mit jungen Männern unter Salzbelastung lediglich eine Umverteilung von
Flüssigkeit aus dem Interstitium nach intravasal ohne Gewichtszunahme beobachtet [44].
Inzwischen gibt es viele Hypothesen bezüglich der unzureichenden Fähigkeit der Niere
zur Natriumausscheidung. Diese betreffen genetische Ursachen [11], gestörte RAAS-
Aktivierung [96], kongenitale oder erworbene herabgesetzte Nephronenzahl [60].
Bestehende Daten weisen darauf hin, dass eine mangelhafte, verlangsamte
Downregulation des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (RAAS) für einen
salzabhängigen Hypertonus mitverantwortlich sein könnten [53,54]. Ein aktuelles
Pathogenesemodell [35] beschreibt eine initial funktionstüchtige Niere, im Verlauf kommt
es aufgrund von oben genannten Zuständen zu einem Blutdruckanstieg.
73
Hat dieser die Autoregulationsmechanismen der renalen Arteriolen überschritten, kommt
es zu einer hypertensiven glomerulären und tubulointerstitiellen Schädigung [93],
reflektorische Vasokonstriktion führt zu Gewebsischämien mit Ausschüttung von
Zytokinen, oxidativ wirksamen Molekülen, Infiltration von Entzündungszellen und lokaler
Synthese von AT II [74]. Eine Prädisposition zur hypertensiven Nierenschädigung geht
demnach dem salzsensitiven Hypertonus voraus. Für die Rolle des Angiotensin II als
Verursacher dieser Prädisposition spricht die Beobachtung, dass während einer AT II –
Infusion das immunsuppresive Mycophenolat Mofetil (MMF) zwar den Blutdruckanstieg
nicht beeinflusste, jedoch den inflammatorischen und mikrovaskulären Schaden, die
renalen Angiotensin II -Konzentrationen und schließlich auch die nachfolgende
Salzsensitiviät verhindern konnte [34]. Untersuchungen haben zudem gezeigt, dass ein
salzabhängiger Hypertonus zu größerem renalem Schaden führt als ein spontaner
Hypertonus bei gleich hohen Blutdruckwerten, dies bestätigt die Rolle des RAAS als
unabhängigem Risikofaktor für eine renale Schädigung bei Salzsensitivität [49].
Vielversprechende Strategien, den salzinduzierten Hypertonus zu behandeln, liegen
demnach in der Reduktion von infiltrierenden Entzündungszellen, Blockade der
intrarenalen AT II-Synthese und der oxidativen Prozesse.
5.3 Auswirkungen einer erhöhten Salzzufuhr auf die Niere Es ist bekannt, dass Salzrestriktion einen präventiven Einfluss auf die Progression der
diabetischen Nephropathie und der chronischen Nierenerkrankung im Allgemeinen hat
[8,28]. Dementsprechend wurde gezeigt, dass eine erhöhte Salzzufuhr zu strukturellen
Schäden an der Niere führen kann. In einem Tierexperiment mit einem der ZDF-Ratte
ähnlichen Rattenmodell, der OZR (obese Zucker rat), welche eine stärkere Adipositas und
weniger starke Hyperglykämie und Hypoinsulinämie entwickelt, führte erhöhte
Salzaufnahme zu progredienter tubulointerstitieller, glomerulosklerotischer und vaskulärer
Schädigung [72]. In beschriebenem Versuch wurde mittels DOCA-(Deoxycorticosteron-
Acetat)-Injektionen ein salzabhängiger Hypertonus induziert [73]. In der vorliegenden
Arbeit soll ein stärker an die nutritive Salzaufnahme anlehnendes Versuchsprotokoll die
renalen Veränderungen, die über eine hypertensive Schädigung hinaus entstehen,
beobachten. Diese nähere Betrachtung scheint lohnenswert, da viele Untersuchungen
darauf hinweisen, dass die Effekte von Salz auf die Niere weit über die hypertensive
Schädigung hinausgehen [17,105]. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine RAAS-Blockade
unter erhöhter Salzaufnahme einen renoprotektiven Effekt trotz fehlender
Blutdrucksenkung haben kann [104]. Weitere Studien beschreiben den
74
blutdruckunabhängigen Zusammenhang zwischen Salzaufnahme, TGF-ß-Transkription
[94] und renaler Fibrose [46].
Wie oben beschrieben scheint das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System eine
vordringliche Rolle in der Toxizität einer erhöhten Salzaufnahme für die Niere
einzunehmen. Im vorliegenden Tiermodell des metabolischen Syndromes kommt die
Tatsache, dass Adipositas, essentielle Hypertonie und diabetische Nephropathie mit einer
erhöhten RAAS-Aktivität assoziiert sind [50] erschwerend hinzu. Des Weiteren ist
bekannt, dass eine Insulinresistenz häufig mit Salzempfindlichkeit assoziiert ist, dass
Hyperinsulinämie durch direkte Wirkung auf den Tubulus über symphatische Nerven die
Natrium-Rückresorption erhöht [92] und damit der physiologischen ANP-Regulation
entgegenwirken könnte. Je stärker die Insulinresistenz, desto geringer die fraktonierte
Natrium-Ausscheidung während einer salzreichen Diät [63]. Weiterhin ist glomeruläre
Hypertrophie und Sklerose mit einer Stimulierung des Na/H-Austauschers im proximalen
Tubulus assoziiert, dies führt bei erhöhter Salzaufnahme zu einer zusätzlichen
Natriumretention [76]. Ein weiterer interessanter Pathomechanismus, der wiederum die
lokal schädigende Komponente des RAAS auf die Niere unter zusätzlicher Salzbelastung
bestätigt, betrifft eine Aktivierung des die Aktivierung des RAAS via Aldosteron-Rezeptor
[126]. In einem Rattenmodell des metabolischen Syndroms führte ein Salzbelastung
neben stark erhöhten Blutdruckwerten und erheblichen Nierenschäden zu einem
Absinken der Aldosteronspiegel, jedoch zu einer erhöhten nukleären Mineralkortikoid-
Rezeptor-/PAI-1- und TGF-ß- Expression in der Niere, die durch oxidativen Stress bedingt
zu sein scheint [75].
All diese Untersuchungen legen nahe, dass es sich bei dem durch erhöhte Salzzufuhr auf
die Niere schädigenden Faktoren, über eine mögliche Salzsensitivität des Blutdrucks
hinaus, um Komponenten des RAAS handelt, die inflammatorische und profibrotischen
Prozesse in der Niere unterhalten.
5.4 Diskussion der eigenen Ergebnisse 5.4.1 Gewichtsverlauf, Serum- und Urinparameter
Zu Beginn des Experiments zeigen die Tiere der Gruppen ZDF-Fatty erwartungsgemäß
ein deutlich höheres Ausgangsgewicht. Ab der zwölften Woche fällt bei den ZDF-Fatty-
Tieren eine Stagnation der Gewichtszunahme auf, dies lässt sich am ehesten durch eine
diabetisch bedingte katabole Stoffwechsellage [21] erklären. Dahingegen nehmen die
75
ZDF-Fatty-diet Tiere bei im Vergleich geringerer Nahrungsaufnahme bis zuletzt konstant
an Gewicht zu.
Das Nierengewicht als Ausdruck der pathologischen Organhypertrohpie ist im Vergleich
zu den ZDF-Lean-Tieren bei der ZDF-Fatty Gruppe erwartungsgemäß signifikant erhöht.
Zusätzlich ergab sich ein signifikant höheres Nierengewicht der salzbelasteten ZDF-Lean-
Tiere im Vergleich zu ihrer Vergleichsgruppe, die höchsten Werte zeigten die
salzbelasteten ZDF-Fatty Tiere. Die Salzbehandlung hatte keinen wesentlichen Einfluß
auf die glomeruläre Filtrationsrate und das Serum-Kreatinin. Die Albuminurie, als
wichtigster Indikator einer frühen glomerulären Schädigung, war bei den salzbelasteten
adipösen Tieren um das 1,5fache der unbehandelten diabetischen Tiere erhöht und somit
am stärksten ausgeprägt. Des Weiteren ließ sich bei dieser Gruppe eine im Verlauf
deutlich abnehmende Konzentrierungsfähigkeit des Urins für Natrium (erhöhte
fraktionierte Natriumausscheidung) beobachten, dies spricht für eine zusätzliche tubuläre
Schädigung und ist konsistent mit den lichtmikroskopischen Beobachtungen (s.u.). Die
ZDF-Fatty Tiere hatten zuletzt einen im Vergleich zu den salzbelasteten Tieren um mehr
als das zweifache erhöhten Blutglucosespiegel (218/547 mg/dl). Die Plasmainsulinspiegel
zeigten bei den ZDF-Fatty-Tieren bereits nach 8 Wochen ihren Höchstwert (25,4 ng/ml),
der in den folgenden 4 Wochen rasch absank (5 ng/ml), gefolgt von stark erhöhten
Serum-(max. 711 md/dl)/Urin-Glucose- und HbA1c-Werten (max. 12,4%). Die
salzbelasteten ZDF-Fatty-Tiere hingegen hatten ab der 12. Woche annähernd konstant
hohe Insulinspiegel, diese zeigten erst zum Ende des Versuches eine leicht abnehmende
Tendenz, es kam daher zu vergleichsweise mäßig erhöhten Blutglucosewerten (max. 328
mg/dl), einer unwesentlichen Glucosurie, die HbA1C-Werte lagen im Normbereich.
Während die Tiere der Gruppe ZDF-Fatty bei ausgeprägter Glucosurie eine gesteigerte
osmotische Diurese aufwiesen, konnte bei den salzbelasteten ZDF-Fatty-diet Tieren
ebenfalls ein im Vergleich zu ZDF-Lean-diet größeres Harnvolumen beobachtet werden,
dies allerdings am ehesten im Rahmen einer gesteigerten Druckdiurese und einer
abnehmenden Konzentrierungsfähigkeit für Natrium. Erwartungsgemäß wiesen die ZDF-
Lean-Tiere beider Gruppen eine normwertige Lipidstoffwechsellage auf, bei den ZDF-
Fatty-Tieren ließ sich ein kontinuierlicher Anstieg der Blutfettwerte beobachten. Die
signifikant höchsten Werte für Gesamtcholesterin, LDL und Triglyceride fanden sich
wiederum bei den salzbelasteten ZDF-Fatty Tieren.
Die Plasmaosmolalität, die physiologischerweise in sehr engen Grenzen konstant
gehalten wird (280-298 mosmol/kg), zeigte im Rahmen der Hyperglykämie bei den ZDF-
Fatty-Tieren Höchstwerte von bis zu 321 mosmol/kg, bei den ZDF-Fatty-diet Tieren sind
die erhöhten Werte von bis zu 309 mosmol/kg am ehesten als Folge der Hyperlipidämie
und dem im Vergleich höheren Serum-Natrium zu bewerten.
76
5.4.2 Nierenschädigungsindices, Glomerulusgeometrie
Die Glomerulosklerose ist ein histologisches Hauptmerkmal der diabetischen
Nephropathie. Sie beinhaltet Mesangialzellproliferation und Matrixexpansion,
Basalmembranverdickung, Hyalinisierung der Arteriolen und Einengung des kapillären
Gefäßlumens [80]. Die glomeruläre Sklerose war bei den ZDF-Fatty Tieren
erwartungsgemäß deutlich stärker ausgeprägt als bei den Lean-Tieren. Die salzbelasteten
Gruppen liessen eine deutliche jedoch nicht signifkante Zunahme hinsichtlich des
Glomeruloskleroseindexes erkennen.
Die Mesangiumzellen bilden das Gerüst des Kapillarkonvoluts und sind zur Bildung und
zum Abbau extrazellulärer mesangialer Matrix fähig. Im Falle einer dauerhaften
diabetischen Schädigung der Niere kann es zur Nekrose und Apoptose von
Mesangiumzellen gefolgt von einer Abnahme der mesangialen Matrix und einer
Erweiterung der glomerulären Kapillaren bis hin zu großen Kapillaraneurysmen kommen.
Diese Veränderungen werden als Mesangiolyse bezeichnet [71]. Ist es aufgrund einer
glomerulären Schädigung zu einer Matrix- und Mesangiumzellproliferation gekommen,
findet ein sog. Remodelling statt, im Rahmen dessen v.a. die Matrix-Metalloproteinase-2
(MMP-2) Typ IV-Collagen, Fibronectin, Laminin und Proteoglykane abbaut und dadurch
das mesangiale Turnover steigert. In einer Studie fand man heraus, dass bei Patienten
mit diabetischer Nephropathie Mesangiolyse mit erhöhten MMP-2-Spiegeln im Serum
assoziiert war [66]. Bei allen Tieren zeigten sich gleichermaßen nur geringgradige
mesangiolytische Veränderungen am Glomerulum.
Die glomeruläre Okklusion und konsekutive vaskuläre Insuffizienz führt neben
inflammatorischen und profibrotischen Faktoren zu einer Degeneration des
Tubulussystems und einer Erweiterung des Interstitiums [80]. Anhand des
tubulointerstitiellen Schädigungsindex lässt sich die tubuläre Fibrose, Dilatation und
Atrophie gut bewerten. Es zeigte sich bei den salzbelasteten diabetogenen Tieren ein um
annähernd 2fach erhöhtes tubulointerstitielles Schädigungsausmaß zur Vergleichsgruppe
ZDF-Fatty. Zeichen der vaskulären Schädigung waren bei den diabetischen Tieren stärker
ausgeprägt und zeigten unter Salzbelastung jeweils eine Zunahme, es ergaben sich hier
jedoch keine Signifikanzen.
Das planimetrisch erhobene Volumen des Kapillarkonvoluts ließ zwischen diabetischen
und schlanken Tieren eine Zunahme erkennen, diese war zwischen der Gruppe ZDF-
77
Fatty und ZDF-Fatty-diet signifikant. Somit hatte die Salzbelastung einen verstärkenden
Einfluß auf die glomeruläre Hypertrophie.
Hinsichtlich des Nierenrinden-Nierenmark-Verhältnisses und der Glomerulusgeometrie
ergaben sich unter Salzbelastung keine signifikanten Unterschiede. Das Gesamtvolumen
der Glomeruli einer Niere unterschied sich zwischen den Fatty- und Lean-Tieren
signifikant, unter Salzbelastung ließ sich eine deutliche aber nicht signifikante Zunahme
erkennen.
5.4.3 Glomeruläre Zellen und Kapillaren
Die Längendichte der Kapillaren bezeichnet die Gesamtlänge der Kapillaren pro Volumen.
Sie ist ein Maß für die Kapillaradaptation durch Neoangiogenese und Längenwachstum,
wie man sie bereits in späten Phasen der diabetischen Nephropathie beobachten konnte
[79,124]. Die ZDF-Fatty-Tiere zeigten signifikant niedrigere Werte für die Längendichte
der Kapillaren als die ZDF-Lean-Gruppen, es ergab sich unter Salzbelastung jedoch kein
Unterschied. Daher muss im vorliegenden Stadium der diabetischen Veränderungen eher
von einer Einengung des Kapillarlumens ohne kompensatorische Neovaskularisation
ausgegangen werden. Die Kapillarquerschnittsfläche und das mittlere glomeruläre
Volumen war, Beobachtungen vorhergehender Studien entsprechend, bei den
diabetischen Tieren erhöht [81], die Salzbelastung zeigte hierauf keinen Einfluss. Zu
Beginn des Experiments fand man bei den ZDF-Fatty und –Lean Tieren eine
vergleichbare Gesamtzahl an Podozyten pro Glomerulum, diese erhöhte sich bis zum
Alter von 24 Wochen signifikant, der erwartete Verlust an Podozyten unter stark
hyperglykämischer Stoffwechsellage konnte nicht beobachtet werden. Die salzreich
ernährten Tiere zeigten im Verlgeich zu ihren Kontrollgruppen eine leichte, nicht
signifikante Abnahme der Podozytenzahl. Die Gesamtzahlen der Endothel- und
Mesangiumzellen waren bei den diabetischen Tieren nicht signifikant erhöht. Zwischen
der salzbelasteten ZDF-Lean-Gruppe und den salzbelasteten diabetischen Tieren kam es
zu einer signifikanten Abnahme dieser beiden Zellzahlen und auch der Gesamtzellzahl.
Unter der Hypothese, dass Salzbelastung einen renalen Schaden auf dem Boden einer
diabetischen Nephropathie begünstigt, ließe sich annehmen, dass die salzreich ernährten
Lean-Tiere funktionell-kompensatorisch mit einer Zellvermehrung reagierten, wohingegen
es bei den salzbelasteten Fatty-Tieren bereits zu einem Überwiegen des glomerulären
Zelluntergangs gekommen ist. Dieser ist umso ausgeprägter bei den stärker diabetischen
ZDF-Fatty-Tieren. Betrachtet man hingegen das Gesamtvolumen der einzelnen Zellarten,
fällt auf, dass die Salzbelastung bei den diabetischen im Vergleich zu den schlanken
Tieren zu einem signifikant höheren Volumen der Mesangiumzellen geführt hat.
78
5.5 Schlussfolgerung
Unter der Salzdiät kam es bei den diabetischen Tieren zu einer deutlichen Zunahme der
vorbestehenden Fettstoffwechselstörung und der Albuminausscheidung, diese Effekte
konnte bei den euglykämischen Tieren nicht beobachtet werden. Histomorphologisch ließ
sich ein nur geringer verstärkender Einfluß der Salzdiät auf die Progression von
Glomerulosklerose, Mesangiolyse und vaskulären Veränderungen feststellen.
Dahingegen war der Salzeffekt auf die Zunahme der tubulointerstielle Schädigung bei den
diabetischen Tieren deutlich. Die tubuläre Schädigung spiegelt sich ebenfalls in der
abnehmenden Konzentrierungsfähigkeit des Urins für Natrium wider. Dieser
Zusammenhang ist unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die salzreich ernährten
ZDF-Fatty Tiere eine ausdauerndere Insulinproduktion und daher eine weniger stark
ausgeprägte diabetische Stoffwechsellage aufwiesen, umso interessanter. Wie oben
beschrieben korreliert die Schwere der diabetischen Stoffwechsellage mit einer
salzabhängigen Blutdruckerhöhung. Demzufolge liessen sich die Beobachtungen an den
salzbelasteten Tieren vor dem Hintergrund einer im Vergleich weniger starken
hypertensiven Beeinträchtigung des Nierengewebes sehen. Dafür spräche auch, dass im
Modell der ZDF-Ratte eine Induktion der Stickstoffmonoxid(NO)-Synthase durch Insulin
vorbeschrieben ist, und so möglicherweise einer Blutdruckerhöhung entgegengewirkt
wurde [57]. Dies würde erklären, dass sich entgegen der anzunehmenden
Blutdruckerhöhung unter Salzeinfluss keine wesentlich stärkere Glomerulosklerose
beobachten liess. Die salzreiche Diät führte überdies bei den diabetischen Tieren zu einer
Zunahme des Volumens des Kapillarkonvolutes. Es zeigte sich kein Einfluß der
Behandlung auf die Podozytenzahl, das mittlere glomeruläre Volumen und die
Kapillarquerschnittsfläche. Weiterhin lässt sich schlussfolgern, dass es unter
Salzbelastung in bei den diabetischen Tieren zu einem Fortschreiten der
Nierenveränderungen im Sinne einer abnehmenden Mesangial- und Endothelzellzahl
gekommen ist.
Zusammenfassend beeinflusste die Salzbelastung bei den Lean-Tieren das relative
Nierengewicht im Sinne einer Zunahme, die erhobenen Nierenfunktionsparameter,
Schädigungsindices und Zellzahlen zeigten bei diesen Tieren keine pathologischen
Veränderungen. Bei den diabetischen Tieren kam es unter Salzeinfluß zu einer Erhöhung
der Albuminausscheidung, Verstärkung der tubulointerstitiellen Schädigung, Erhöhung der
Plasmalipide, Zunahme des Kapillarvolumens und zu einer im Vergleich zu den schlanken
79
Tieren signifikanten Abnahme der Mesangial- und Endothelzellzahl. Die salzreiche Diät im
vorliegenden Tiermodell hatte somit auf die Progression der diabetischen Nephropathie,
insbesondere die tubulointerstitielle Schädigung und der Proteinurie betreffend, einen
verstärkenden Einfluss.
Diese Beobachtung bekräftigt erneut die Notwendigkeit eines bewußteren
Konsumverhaltens für Kochsalz bei Patienten mit Diabetes mellitus, insbesondere auch
ohne der Koinzidenz eines arteriellen Hypertonus.
80
VII. Literaturverzeichnis
1. Abbate M, Zoja C, Morigi M, Rottoli D, Angioletti S, Tomasoni S, Zanchi C, Longaretti L,
Donadelli R, Remuzzi G (2002). Transforming growth factor beta-1 is up-regulated by
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161:2179-2193
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93
VII. Abkürzungverzeichnis ACE Angiotensin-Converting-Enzyme
ADH antidiuretisches Hormon, Adiuretin
AGE Advanced glycosilation end product
ANP antinatriuretisches Peptid
AT-II Angiotensin II
α-SMA alpha-smoth muscle actin
ß Formfaktor
CTGF connective tissue growth factor
DN Diabetische Nephropathie
DOCA deoxycorticosteron-acetat
GFR Glomeruläre Filtrationsrate
GSI Glomeruloskleroseindex
HDL high density lipoproteins
HE Hämatoxylin Eosin
IDF International Diabetes Foundation
IGF-1 Insulin-like growth factor-1
IL-1 Interleukin-1
k Größenverteilungskoeffizient
KG Körpergewicht
LDL low density lipoproteins
MMF Mycophenolat Mofetil
MSI Mesangiolyseindex
NG Nierengewicht
NHBLI National Heart Blood and Lung Institute
NF-κB nuclear factor-kappa Beta
NO Nitrit oxid
n.s. nicht signifikant
OZR obese zucker rat PAI-1 plasminogen activator inhibitor-1
PAS „Periodic Acid Schiff“-Reaktion
PDGF platelet-derived growth factor
PKC Proteinkinase C
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
TF tissue factor
TGF-β transforming growth factor beta
94
TNF-α Tumor-Nekrose-Faktor alpha
TSI Tubulointerstitieller Schädigungsindex
VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1
VEGF-A vascular endothelial growth factor A
VLDL very low density lipoproteins
VSI Vaskulärer Schädigungsindex
WHO World Health Orginisation
ZDF zucker diabetic fatty (Ratten-Tiermodell)
95
VIII. Danksagung
Ich möchte mich in erster Linie bei Frau Prof. Dr. med. Kerstin Amann für die
Bereitstellung des interessanten Themas und die gute Betreuung während der gesamten
Dauer dieser Arbeit bedanken.
Herrn Prof. Dr. med. A. Hartmann, Direktor des Pathologisch-Anatomischen Instituts der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg, danke ich für die Bereitstellung der
Räumlichkeiten und der personellen Kapazitäten, sowie die Möglichkeit am
Pathologischen Institut zu promovieren.
Besonders bedanken möchte ich mich bei den Mitarbeitern der AG Amann, allen voran
Monika Klewer, Stefan Söllner, Miriam Reutelshöfer und Romy Böhme, die mich durch
ihre große Hilfsbereitschaft und Geduld in vielen Fragestellungen und Arbeitsschritten
unterstützen und eine entspannte und herzliche Arbeitsatmosphäre möglich machten.
Auch die Mitdoktoranden trugen durch die gute Einweisung in die Methodik und ihre
Hilfsbereitschaft maßgeblich zum Gelingen dieser Arbeit bei.
96
IX. Lebenslauf Anja Maria Schwantzer Geburtsdatum: 22.12.1980
Geburtsort: Neuendettelsau
Eltern: Peter Schwantzer, Zahntechniker
Erika Schwantzer, Bürokauffrau
Geschwister: Sandra Schwantzer, Disponentin
Schulausbildung: 08/86- 06/90 Grundschule Großhabersdorf
08/90- 05/99 Dietrich-Bonhoeffer-Gymnasium in Oberasbach
Abschluss: Abitur, Note: 2,7
Hochschulbildung: 2003-2009 Studium der Humanmedizin, Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen
2005 1. Abschnitt der ärztlichen Prüfung, Gesamtnote: 2,66
2009 2. Abschnitt der ärztlichen Prüfung (neue AO), Gesamtnote: 2,5
Berufsausbildung: 03/00-03/03 Ausbildung zur Krankenschwester, Berufsfachschule des
Klinikum Nürnberg
Abschluss: staatlich Prüfung der Krankenpflege, Note: 1,3
Praktisches Jahr:
Innere Medizin Prof. Wilhelm, Klinik für Innere Medizin und Hämato-Onkologie, Klinikum
Nürnberg
Chirurgie Prof. Rupprecht, Chirurgische Abteilung des Klinikum Fürth
Hals-Nasen- Prof. Iro, Klinik für Hals-Nasen-Ohrenheilkunde, Universitätsklinik
Ohrenheilkunde Erlangen
97
Famulaturen:
03/2006 Klinik für Innere Medizin, Abt. für Endokrinologie, Klinikum Nürnberg
04/2006 Klinik für Innere Medizin, Abt. für Gastroenterologie, Klinkum Nürnberg
09/2005 Klinik für Innere Medizin, Abt. für Hämatoonkologie, Klinikum
Nürnberg
03/2007 Dareda Hospital/Catholic Diocese of Mbulu, Tansania, Abt. für
Pädiatrie und Geburtshilfe
08/2007 Klinikum Traunstein, Abt. für Kardiologie
09/2007 Chirurgische Gemeinschaftspraxis Dr. B.-M. Lang, Erlangen
Berufliche Tätigkeiten: 1996-2008: Aushilfstätigkeit als Sachbearbeiterin, Fa. Quelle, Abteilung für
Werbung/Fotografie
04/03-12/03: Pflegerische Nebentätigkeit, Klinikum Fürth, Intensivstation
2004-2009: Teilzeitbeschäftigung als Krankenschwester, Ambulante Alten- und
Krankenpflege Erler
03/08-12/08: Aushilfstätigkeit als Schreibkraft, Schreibbüro der Medizinischen
Klinik 5, Klinikum Nürnberg
seit 10/09 Assistenzärztin, Medizinische Klinik 5, Klinikum Nürnberg
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