76 Berieht: Spezielle analytisehe Methoden.

25 ml Schwefels~ure geschiittelt. Man wiederholt dies, bis die Sehwefelsaure farblos bleibt. Hierauf waseht man die Chloroformphase mi t Wasser, bis keine saure l~eak- t ion mehr nachweisbar ist, behandel t wieder mi t Aktivkohle, filtriert und wiischt mi t Chloroform, das in gleicher Weise vorbehandel t worden war. Hierauf dampf t man das Chloroform langsam ab, t rocknet den Riickstand im Ofen und unterwirf t ihn der eolorimetrisohen Bes t immungL It . FREYTAG.

Eine colorimetrische Best immungsmethode yon Alkaloiden in Geweben mit- tels Methylorange, haben A.O. GETTLI~R und I. Su~s~Im~ 2 entwickelt. Man ext rah ier t die Alkaloide aus dem Gewebe mi t anges~uertem kochenden Wasser, ex t rahier t aus der fil trierten w~Brigen LSsung diese Alkaloide mi t Chloroform und stellt eine chloroformlSsliehe farbige Verbindung der Alkaloide mi t Methylorange her. Reagenzien: 1. Gesattigte Methylorangel6sung: Man miseht 500 mg Methyl- orange mi t 100 ml Wasser, h~ilt 20 rain auf 40 ~ und filtriert nach Abkiihlen au f Raumtempera tu r . 2. Ges~ittigte BorsaurelSsung. 3. Methylorange-Reagens: Mi- schung gleicher Volumina yon 1. und 2. 4. Phosphatpuffer pH 8: Mischung yon 25 ml 0,2 m prim. Kal iumphosphat-L6sung und 46,85 ml 0,1 n Natronlauge und auffiillen mit Wasser au f 100 ml. 5. Anges~uertes J~thanol: Mischung yon 100 ml absol. Athanol mi t 2 ml konz. H2SO 4. Methode: A. Ext rak t ion der Alkaloide. Man fiigt zu 500 g fein mazerier tem Gewebe, z .B . Hi rn oder Leber, in einer 2 1 Florent iner Flasche 500 ml Wasser und 2 ml gesattigte Weins~turel6sung, destilliert mi t Wasser- dampf etwa 150 ml ab (GefiiB in koehendem Wasser), wobei das Gewebeeiweil3 koaguliert, miBt das Gesamtvolumen des Materials, f i l tr iert noeh heiB und bes t immt das Volumen des w M]rigen Extraktes . Quantitative Bestimmung: Man br ingt 25 ml des w~iBrigen Extrdktes in eine 60 ml- Glasst5pse]flasche, br ingt mi t 4 n l~atronlauge den pH-Wert auf 7,5--8,2 (mit Indicatorpapier messen), ffigt 25 ml Chloroform zu und schiittelt die Misehung 20 rain in der Schiittelmasehine. Darau f t r enn t man die waBrige vonder Chloroformschicht dureh Zentrifugieren und Absaugen, br ingt die Chloroform - sohieht in eine GlasstSpselflasche, mischt mi t 0,7 ml Methylorange-Reagens und schiit telt abermals 10 min. Man t r enn t die Chloroformschicht sorgfMtig ab, pipet t ier t hiervon l0 ml in eine Kiivette, fiigt 1 ml anges~uerten Alkohol zu und photometr ier t bei 520 mtt, indem man die Reagenzien als Leerwert einsetzt. Bei extrem niedrigem Alkaloidgehalt schiittelt man l0 ml ChloroformlSsung, die die gef~rbte Alkaloid- Methylorange-Verbindung enthiilt, mi t 0,5 ml 1 n Salzs~iure aus und photometr ier t in einer entsprechenden Kiivet te bei gleicher Wellenl~nge. Die Empfindlichkeit wird dadurch 20 malso groB. Die Plasma-UntersuehungaufAlkaloide erfolgt nach der Meth- ode yon B. B. ~ BlaODIE und S. UDENFRI:ElqD 3. Zur Anlegung der Eichkurven 15st man 50 mg der freien Alkaloidbasen in 250 ml PhosphatpufferlSsung und verdi innt hiervon 5ml auf 100 ml mit Wasser, 1 ml ~ 10/~g. Man br ingt 2,5--15 ml dieser Verdiinnung mit Phosphatpuffer auf 25 ml und benutz t diese an Stelle des w~Brigen Extraktes in obiger Best immung. I m Bereich yon 1--6/~g Alkaloiden wird das B~E~sche Gesetz befolgt. Der mit t lere Fehler bei diesen Bes t immungen war 3%. Aueh Antihistamine sind best immbar, p-Aminobenzoesiiure und Morphin sind nieht best immbar. Ext rak te aus alkaloidfreien Geweben zeigten, dal~ bei Hirn keine !Korrektur n6tig ist, dab aber bei Leber ein Korrekturwer t abgezogen werden muB, wenn kleine Mengen Alkaloid vorhanden sind. Faulendes Gewebe st6r t die Reaktion. Folgende

1 TOMKINS, R. G., u. F. A. ISH~RWOOD : Analyst 70, 373 (1945) ; M. S. SCHECH- TER, M. A. POGORELSIKIN U. A. L. I-~ALLER: Anal. Chem. 19, 51 (1947); vgl. diese Z. 129, 306 (1949); 131, 323 (1950); 185, 146 (1952).

2 Analytic. Chemistry 28, 779 (1951). New York Universi ty, New York, N.Y. 3 j . of Biol. Chem. 158, 705 (1945).

4. Auf Physiologie und Pathologie beziigliche. 77

Alkaloide und synthet ische Basen wurden untersucht : Atropin, Benzedrin (Cocain), Codein, Demerol, Dilaudid, Heroin, iVeohetramin, Nicotin, Nupercain, Pontocain, Chinin, Strychnin. Die Methode eignet sich ebenfalls zur Isolierung und IdentLi- zierung von Alkaloiden, wobei m an die Chloroformsehieht (100 ml) eindampft , den Rest der Mikrosubtimation unterwirf t und dann Mikroreaktionen, z .B . nach KOFL~R, anstellt . W. HE-~IG.

Pyramidon kann man nach FR. LoI~ss und E. KABLLEE1 im Serum direkt mi t einer Diazoreaktion best immen, wenn das EiweiB zuni~chst mi t Pikrinsi~ure gefi~llt wird. Der gebildete Farbstoff bes teh t aus mindestens 6 versehiedenen Komponenten, wie chromatographiseh ermi t te l t wurde. B~i der quant. Best immung sind die auBeren Faktoren aussehlaggebend, und man muB sich genau an die Vorschrift hal ten. 3 ml Serum werden mi t 9 ml ges~ttigter Pikrinsi~urelSsung gemischt, ad 25 ml aufgeffillt und filtriert. 7,0 ml Fi l t ra t versetz t man mi t 2,5 ml Citronens~ure- Sa]zsaurepuffer, 1,2 ml 0,75% iger Sulfanilsi~urel6sung und 0,2 ml 0,75% iger NaNO 2- L6sung, erhi tz t 5 m i n i m Wasserbad, l~l]t abkiihlen und eolorimetriert. Als Leer- wert dient dasselbe Serum vor Pyramidon-Applikat ion, um den Bilirubinfehler aus- zuschalten. Citratpuffer: 21,008 g Citronens~ure ~ 200 ml n NaOK-LSsung werden ad 1000 ml verdi innt . Davon werden 16 Teile ml t 7 Teilen n Salzs~ure gemiseht. Die ]~eaktion ist n icht mehr anwendbar au f Antipyrin, Salipyrin, Saridon Butazo- lidin, Melubrin und 4-Acetylamino-antipyrin. Quant i ta t iv bes t immbar sind Pyramidon, _Yovalgin, Vaditon, Aneuxol, Irgapyrin und 4-Amino-antipyrin. Novalgin ist nach i. v. Inj . naeh 2 Std noch nicht voltstandig aus dem Blur ver- sehwunden.

Zur Bes t immung yon Propyl th iourac i l verwendet t~. A. MCALLISTE~t 2 eine 0,4% ige LSsung yon 2, 6-Dichlorchinon-Chlorimid in aldet~ydfreiem Alkohol, weiter einen Boratpuffer, der 0,2 m Borsiiure, 0,2~m KC1 und 3,97 ml 0,2 n NaOH, 100 ml 20~ NaC1-LSsung in 200 ml Gesamtvolumen en th~ l t und mit 0,1 n NaOH- LSsung auf PH 8,0 eingestellt wird. Als S tandard dient eine L6sung yon 25 mg Propylthiouraci l in 5 ml aldehydfreiem Alkohol und Wasser ad 25 ml. Der Komplex des Reagenses mi t Uracil ist Gelb und kann mit CttC18 ausgeschiittelt werden 3. Vom Tagesharn n immt man 100 ml mit etwa 5 mg Thiouracil, stellt au f pH 6 ein und extrahier t wiederholt mi t je 100 ml peroxydfreiem _~ther. Die Ext rak te werden ein- real mi t 100 ml Wasser gewaschen, dann v611ig zur Trockne eingedampft, der l~fick- s tand wird in 2 ml Alkohol gelSst und mi t Wasser auf 100 ml aufgeffiUt. Zu ali- quoten Teilen van 2,0 oder 1,0 ml gibt m an Wasser ad 5,0 ml, 5,0 ml Boratpuffer und 0,1 ml Ch]orimidoreagens. Naeh 45 rain wird der Farbstoff mi t CHC13 extrahier t und mi t Violettfilter colorimetriert. Die Reakt ion ist spezifisch fiir Anti thyroid- verbindungen vom Thiouraciltyp. Eine S tandardkurve mit 10--100 #g wird in der gleichen Weise angelegt. Die Ausbeute betr~gt etwa 85~o, wenn der Ha rn bei pH 6 extrahier t wird. Sie f~llt auf 64~ bei pH 7,0 und auf 53% bei p~ 8,0. Bei uracil- freien Harnen wurde niemals eine Farbe beobachtet , so dal~ mit St6rsubstanzen nicht zu rechnen ist. Verschiedene organische Verbindungen die gepriift wurden, gaben entweder keine l~eaktion oder das Kondensat ionsprodukt war in CI-[C13 nicht 15slich.

Zu r Bes t imnmng des Gentisinsiiurestoffweehsels verwenden S. ROS~MAN und A. DORFMAN 4 die l~eduktion des Phenolreagenses yon FOLI~-CmCALTEV. Man

1 Arch. exper. Pa th . u. Pharmakol . 214, 202 (1952). 2 J. Clin. Pa th . 4, 432 (1951) .Biochem.Labor . , l~oyalSamari tanHospi ta l , Glasgow. 3 Vgl. R. A. McALHsTER, Nature (Lond.) 166, 789 (1950).

J. of Biol. Chem. 192, 105 (1951). Depts. of Pedlar. a. Biochem. Univ. of Chicago, Chicago, IlI.