Eine einfache Apparatur fiir quantitative Mikroinjektion nebst Bemerkungen fiber plasmatische Injektion

V-on

Lothar Hofmeister, Wien

Mit 1 Textabbildung

(Eingelangt am 7..]~nner 1950)

Die Mikroinjektion, ds reizvolle Teildisziplin der Mikrurgie, ist bisher hiiufiger an zoologischen als an botanischen Objekten zur An- wendung gekommen. Dieses iilbergewicht zugunsten der Zoologie ist nicht deshalb entstanden, weil die Probleme auf botanischer Seite weniger zahl- reich oder weniger interessant wiiren, sondern ~eil die Austibung der Me- rhode an Pflanzenzellen anscheinend noch schwieriger ist als an tierischen.

D er diinne Plasmabelag tiber der grol3en, zentralen gakuole der er- wachsenen Pflanzenzelle, die nun einmal das meistverwendete u objekt der Zellphysiologie darstellt, ist gegen mechanische Beanspruchung und daher auch gegen das Einfiihren dickerer Pipettenmiindungen ziemlich empfindlich. Dart schon deshalb die Mtindung der Mikropipetten keinen grSl~eren Durchme,sser haben als 5--4/,, so sind Pipetten vo,1 hi~chstens 2 # Spitzendurchmesser (nach C h a m b e r s, 1937 yon 2 his 0,5 ~) niitig, wenn die Injektion auf das Plasma beschriinkt bleiben und nicht in die u gelangen soll. Bet so feinen Miindungen spielen die Kapillar- kr~ifte, wie yon P e t e r f i schon 1928 hervorgehoben, eine grol~e Rolle. Es dringen auf Grund dieser Krhfte Fliissigkeiten in die leere Pipettenmtin- dung -eo.n auften zuniichst rasch und fast unaufhaltsam ein, w~ihrend ihre Abgabe gewi~hnlich nicht his zum letzten Rest miSglich ist, besonders wenn der Spritzenkolben nicht ganz dicht schliel3t oder wenn gri~f~ere Luftblasen in dec mit Wasser als Drucktibertriiger gefiillten Einrichtung geblieben sind. Anderseits kommt bet ~bergaug yon einem Medium ins andere, z.B. ~on Luft in Wasser oder bet Bertihrung fester Kbrper (Deckglas, Zelle, Protoplast) leicht ein ungewollter und beziiglich der Menge unkontrollier- barer Austritt yon Injektionstliissigkeit vor. Diese Ereignisse gehen meist iiberraschend schnell vor sich und zu ihrer ~berwindung ist kr~iftiger Druck, bzw. kriiftig.e Saugung" ni3tig; doch bereitet jede solche Kompen- sation kapillarer Bewegungen durch Druck oder Saugung die niichste Un- regelm~il]igkeit vor, die sich beim i)bergang in ein anderes Medium oder b.ei Beriihrung neuer Oberfliichen auswirkt. ~ Besonders starker D'ruck,

Eine ausftihrliche Schilderung dieser S&wierigkeiten eriibrigt sich, da sie z. B. schon -con P e t e r f i (1928) beschrieben sind; auch sind sie jedem Ausiibenden zur Geniige bekannt.

22*

324 L. Hofmeister

bzw. Saugung sind nStig, wenn sieh die feinen Miindungen d u r & koagulie- J'endes P lasma mehr oder weniger verlegen, was in der Mehrzahl der F:dlle cintrit t , sobald die P ipe t te in das P lasma eingedrungen ist. Es ist deshalb ~ieht immer leicht, %inere In jekf ionen mit der an sieh sehr bew~ihrten, ein- %then Injekt ionseinr iehtung naeh C h a r a b e r s (1922 a) auszufiihren. Dies e ])esteht bekannt l ich aus ether In jekt ionsspr i tze mit Glaskolben, einem Weiehkupfer rShrehen und dem Pipe t tenha l te r ; das ganze System wird lnit Wasser als DruckiibertK, iger gefiillt. C h a m b e r s (1937) weist da rau f hin, daft m a n mit Vorteil an glqiI]eren Zellen mit einem Durehmesser yon 03 m m (wie AmiJben oder Seeigeleier) at'better, w e n n die Injekt ionsversuche re- p roduz ie rba r sein sollen. Doeh beriehten P e t e r f i und K o j i m a (1936) yon Exper i lnen ten an den Zel lkernen der Tradescantia-Staubfadenhaare, bet denen mit der In jek t ionse in r i&tung naeh C h a m b e r s Trbpfehen yon 16 #a an die K e r n w a n d appl iz ie r t und etwas griSt]ere (40 hta) a n & in den Kern in iiziert wurden. Dazu wurde yon den Autoren das Absetzen ~r T r o p f e n gewiinsehter GriSl]e auf die mit e twas Vaseline eingeriebene Deekglasfl~iehe e{ngeiibt und im Versueh die Abgabe einer ~ihnli& geringen Fliissigkeits- menge an die K e r n m e m b r a n dureh naeh dem Gefiihl gleiehstarken Druck auf den Spr i t zenko lben angestrebt . Wenn aueh das Gel ingen sgleher g e r - suehe als ]~esonderer Gliicksfall denkba r ist, so wi rd man im al lgemeinen mit d e r einfaehen Einriehiung die Abgabe eines genau bemessenen und r ep roduz ie rba ren Fli issigkeitsvolumens nieht erreiehen. Hiiufig genug ist man zufr ieden, wenn man das Ausmafi ungewoll ter Fl i issigkeitsbewegun- gen an der P ipe t t enmi indung soweK besehr~inken kann, dag es n'ieht zur Verniehtung des bearbei ie ten P r o m p l a s t e n kommt. - -

I& selbst habe bet Arbeit mit der C h a m b e r s-Einri&tung und Verwendung ~on Yipettendurehmessern yon 5 ft abw~irts den Umstand als sehr stiSrend empfun- den, dag bet Auslibung stiirkeren Dru&es das zur Druekiibertragung verwendete Wasser (oder ParaffiniS1) neben dem mit Vaseline ge%tteten Spritzenkolben vor- beigleitet oder daft beim Ansaugen ant demselben Wege Luft in die Spritze kommt. Eine gewisse Abhilfe ergibt st&, wenn in die Verbindungsleitnng zwisehen Spritze und Pipetienhalter ein Dreiweghahn eingebaut wird, dessen dritte Bqhrung zu einem u mit Wasser oder ParaffinS51 fiihrt. Durch enispre&ende Be- tfitigung des Hahnes kann sodann der Spritzenkolben, bevor Druek angewendet wird, vorher miSglidlst weir herausgezogen werden, damit sein Weg ni&t glei& zu Ende ist, wenn etwas Fltissigkei{ neben ibm vorbeigleitet, und umgekehrt kann der Kolben s, or Saugung fief hineingesdmben werden, damit ni&t allzu leieht Luft eindringen kann. Eine yon Zei[~ um 1938/39 als Zusatzger~it zum Gleit- mikromanipulator entwiekelte Injektionseinriehtung besa~ Dreiweghahn und Vor- ratsgef~fi und an Sidle der tiblichen Spritze eine solehe mit sehr dieht passendem Kolben, der dur& eine steilg~ingige S&raube bewegt wurde; das Gerht wird his jetzt noch ni&t wieder erzeugt. Bekannt sind die iilteren, speziellen Injektions- einrichtungen ha&. P e t e r f i (1924, 1928), nhlnlidl die elekiris& heizbare Mikro- pipette und die H0dldrud~-Vakuum-PiPefte. Die letztere l,eistet Druek !rod Saugung in jeder beliebigen HiShe, da mittels Mehrweghahnes sow0hl eine Gasbombe wie au& eine Vakuumleitung angesehlossen werden kann; rascher 15bergang zwis&en Druek und Saugung ist miSgli&, feine Dosierung beider mag schwieriger sein. Aueh die mit Qneeksilber arbeitende Einriehtung x~on T a y 1 o r (1920) wiire hier zu erw'ahnen.

Eine einfaehe Apparatur fiir quantitative Mikroinjektion 325

In der Nachkriegszeit Yersuehte ich dem Ziele der quantitativen Mikro- injektion ngherznkominen; es gab dazu den einzigen Weg, eine Injektions- einriehtnng selbst herzustellen (Abb. 1). An die Stelle der Spritze setzte ieh eine elastisehe Dose naeh Art der Aneroiddosen, die yon innen durch eil~e Stahlfeder ausgesteift ist und die dureh eine Mikrometerschraube zu- sammengedriickt werden kann. Von der Dose ftihrt ein diinnes Kupferrohr S c h e m a de r I n j e k t i o n s e i n - r i c h t u n g. Der Metallwinkel, ant den die Einridltung montiert ist, wurde der Deutlid~keit halber weg- gelassen. Schraubventil und Vor- ratsgef/if~ stehen in Wirk]idlkeit tiefer und seitlich der Mikrometer- sehraube. -- Dosendurcbmesser 18mm, Volumen der Dose 138ram s. Eine Umdrehung der Mikrometerschraube um 360~ ~'ersdfiebt ein u yon 69ram s der zur Druckiibertragung ~'erwendeten Fltissigkeit. 1 Mikrometerschraube aus einem Rei-

chert-Mikroskop. 2 elastische Dose, dutch eine Blatt-

feder ausgesteift. 3 gewSlbter Stempel, der den Druek

der Mikrometersehranbe ant die Dose iibertr~igt.

4 Weichkupferrohr, fiihrt in ether Spirale zum Pipettenhalter.

5 Sehraubventil (Hahn). 6 Vorratsgef~il~ fiir Wasser oder Pa-

raffintil. 7 Ausatz eines diekwandigen Gummi-

s&laaehes, der am anderen Ende ein Mundstiiek tr~igt.

7

I @

Abb. 1.

zum Pipettenhalter, ein anderes iJber einen Hahn (in meinem Falle em Schraub~Tentil) zu einem kleinen Vorratsgef~ifi, an dessen oberer Offnung ein Sehlaueh mit Mundstti& steekt. Das ganze System wird mittels Wasser- s{.rahlpmnpe mSglichst luftblasenfrei mit Wasser (oder ParaffinS1) gefiillt. bl die Mikropipette wird *nit feiner Kapillare "yon riickw~irts ein kleiner Queeksilbertropfen eingebracht (seine Rolle wird noch zu erw~ihnen seth), dann wird sie ebenfalls mit Wasser gefiillt und in den Pipettenhalter ein- gekittet oder einges&raubt (Halter der Chambers -Einr ieh tung) . Je weniger Luft in dem ganzen System bleibt, desto empfindlieher gehoreht die Fliissigkeit in der Pipetteniniindung den Bewegungen der Mikrometer- schraube. Grobe Fliissigkeitsbewegungen werden bet geSffnetem Hahn nfit dem Munde bewirkt (der Ansehlul~ ether Vakumnleitung ist ebenso mSglieh wie die Herstellung hSheren Druckes dutch Dru&luft, beides jedoch kaum notwendig), die feinen u fiir den eigentliehen Injektions- ~organg erfolgen bet gesehlossenem Hahn dutch Bet~itigung der Dose.

326 L. Hofmeister

Das Versuehsobjekt ist in meinen Yersuehen im h~ingenden Trop[en a'~ dem Deekglas einer feuchten Kammer festgemaeht, es ist yon Wasser oder L/Jsung umgeben und wird dureh einen dariiber ausgebreiteten Tropfen ParaffinS1 vor Verdunstung ges&titzt; ein Tropfen hjektionsfliissigkeit ist miter demselben ParaffinSltrSpfehen angebraeht.

Die winzigen, zur Injektion bestimmten L~sungsmengen werden m6g- liehsi im letzten Augenbliek in die Pipettenmiindung aufgenommen. Es ist nieht vorteilhaft, wenn nnmitfelbal- hinter d.er Injektionsfliissigkeit Luft in der Pipette liegt, da diese sonst im Ansehlul] an den Injektionstropfen austreten und dutch ihre Expansion den Protoplasten zerstiSren kann. Es hat sieh deshalb in meinen Yersuehen bew~ihrt, den sehon erw~ihnten Queeksilbertropfen an jene Stelle der Pipette zu bringen, wo sieh ihr Dnrehmesser yon 1 bis 1,5 mm auf 0,1 his 0,2 mm verjtingt. Dieser Que&- silbertropfen ~erhindert zun~iehst, daf~ Wasser vml innen her in die Spitze der Pipette vordringt; er wird naeh der Montage miSgliehst welt in den engen Spitzenteil hineingeirieben, da sein Gegendruck fiir die Steuerung des Injektionsvorganges yon Vorfeil ist, soil aber dabei nieht die Stellen bm'iihren, die sphter yon der Injektionsfliissigkeit Bespiilt werden. Dann wird etwas mehr ParaffinB1 in die Pipette aufgenommen, als dutch die Kapillar~r selbstiindig eindringt, so da[~ die Anfnahme oder' AbgaBe der ansehliel3end aufzunehmenden Injektionsfliissigkeit dur& diese Kr~ifte nieht mehr me rklieh beeinflufit wird und allein den u der Dose gehor&t. Dadureh f~illt sowohl das Entweiehen yon Lnft aus der Pipettenmiindung weg wie aueh der Fltissigkeitsverlnst Beim Passieren yon Fltissigkeiten oder Beriihren yon Oberfliiehen.

Zur Illustration der Rotle des Que&silbertropfens, der sieh Bet der At- beit sehr vorteilhaft auswirkt, win.de der in der Einriehtung herrsehende Druck naeh dem Volumen ether ira: parallelen Teil der Pipette eingesehlos- senen Luftblase be.urteili, Es waren ca. 0,6 at ntitig, um den Queeksilber- tropfen im konisehen Teil der Pipette Bet einem Pipettendurehmesser ,on 45# festzuhalten und ca. 0,78 at bet einem Durehmessm" x~on 25 }~. Wenn eine Ltisung yon auEen in die Miindung einzudringen strebt, muff sie eineu Teil dieses Gegendruekes aufheben, din: mit ihrem Vordringen noeh an- steigt; es ist daher leieht mtiglieh, diesem u dureh geringe ErhiJhung des Druckes zu begegnen. Da sehon Lbsung, Bzw. ParaftlniS1 die Miindung e~'fiillt, wird es sieh zmneist nieht um kapillares Eindringen, sondern nur nm die geringen Drneke handeln, die in den zu injizierenden Zdlen oder Protoplasten bestehen. Kleine Luftblasen zwisehen Paraffintil und Que&- silber und am breiten Pipettenmade sind kaum zu vermeiden und sind sogar fiir den Injektionsvorgang yon u Die komprimierte Luft be- ~ i rk t eine {?bersetzung der ilnmerhin groben Volumsver:4nderungen der ela- stisehen Dose in die feinen der Injektionsfliissigkeit; vor ether ungewollten Expansion der Luft sehiitzt der kapillar bedingte Gegendru& des Queck- silbertropfens.

Die Bestimmung des aus der Pipette ausgestogenen oder x-on ihr attfgenom- menen Vohmens erfolgt dureh Festlegung der Pipettenmafie und Bere&nung de~ betreffenden Kegelstumpfvolumens. Ein x*orteilhaftes Yerfahren des Ausmessen~:

Eine einfadle Apparatur fiir quantitative Mikroinjektion 327

der Pipettenspitze, kontrolliert durch vergleichende Messungen des Volumens yon Oltropfen, die einerseits in 70% Alkohol sellwebend und anderseits in der mit Alkohol benetzten Pipette vermessen wurden, haben M o r i e a r d und C o i g n a r d (1941) beschrieben. Sie verwenden ein Okularmikrometer mit drei parallelen Tei- lungen, zu denen eine vierte normal angeordnet ist, und vermiigen c[amit glei&- zeitig den Pipettendurchmesser an drei Punkten und die Lfinge der Fliissig- keitss~iule in der Pipette zu bestimmen. Die Pipettenmafle werden auf Millimeter- papier aufgetragen und erlauben dann die Feststellung von Durehmessern, die zwisdlen den drei Mikrometerieilungen liegen. Die Autoren fanden zwisehen den Volumina der. gleichen, in der Pipette und in Alkohol gemessenen O1- tropfen bet Mengen Yon 100 bis 3850/~ ~ Differenzen von 20%; diese miSgen zum gr61~eren Tell auf Messungsfehler infolge der Lichtbrechung, zu einem anderen (meines Erachtens) auf die doeh etwas weehselnde Di&e des Alkoholfilms zurii&- gehen, der die Pipettenwandung benetzt (und das Haften des Oles an derselben zu verhindern hat). In ~Tielen F~llen wird es geniigen, die GriJl~enordnung des abgegebenen Fliissigkeitsvolumens anzugeben, wozu versehiedene Autoren den Yer- gleich mit der GrSl~e der betreffenden Zellkerne ziehen (siehe aueh diesbeztigliell Literaturhinweise bet M o r i e a r d und C o i g n a r d, 1. e.).

Mit der ge,sehilderten Einrichtung und Arbeitsweise wurden Mikro- injektionsversuehe an plasmolysier ten Protoplas ten gemaeht. Es zeigte sieh, dal~ die Dosierung d.er abzugebenden Fliissigkeitsmenge und der Ubergang zwisehen Druek und Saugung raseh und sieher mbglieh sind; die Hand gew6hnt sieh leieht an die jeweils mit der Mikrorrretersehraube' zu leistende Drehung 2. Weggefal len sind ,:on den Unvol lkommenhei ten einfaeherer Einriehtungen vor allem die Behinderung dureh Undiehtigkeit des Spri tzen- kolbens, die Sehwierigkeit, im System Druek oder Unterdruck augenbliek- lieh herzustel len und die mangelnde Beherrsehung d.er Kapi l larkr i i f te an der Pipet tenmiindung.

Die Dosierung der abgegebenen Fliissigkeitsmenge hangf in ihrer Ge- nauigkei t hauptsiiehlieh ~r d.er verwendeten YergriSl3erung und Mikro- meter tei lung ab. In meinen Versuehen entspraehen bet 240faeher Ver- griS~erung ether Liinge der in der P ipe t tensp i tze l iegenden Fliissigkeits- sgule yon 1 Mikrometerteitstrieh etwa 50}t s, wenn auf 0 ,2 Teilstrieh ge- sehatzt wurde, konnten Mengen in der Gr~Sl~enordnung yon etwa 10 #3 be- rues,sen werden. Bet Verwendung diinner P ipe t tensp i tzen und Besehriin- kung der Injektionsfliissigkeit a u f deren vorders ten Teil und mit stiirkeren V.ergrbfierungen l~il~t sieh die Genauigkei t noeh steigern. Eine Eiehung der fast fiir jeden Versueh neu herzuste l lenden P ipe t ten wiird~e sieh nieht loh- i,.en, die abgegebene Menge wird jedesmal neu gemessen und bereehnet. 10Ld sind fiir eine In~ektion in die durehs&nitt l iehe Pflanzenzelle keine allzugrofle Menge; es wi rd auf die Angabe yon P e t e r f i und K o j i m a (1936) hingewiesen, wonaeh die Zellkerne .eines Tradescart~ia-Staubfaden- haares ein Volumen yon ca. 6060 fz 3 haben.

Die Anbringung ether ftihlbaren Marke am Bedienungsgriff der Sehraube (Siegellaektropfen ere.) oder auch eines damit gemeinsam zu greifenden, verstell- baren Index erleiehtert das Auffinden der jeweiligen Nullstellung; audl Beobach- tung einer im geraden Teil der Pipette belassenen Luftblase kann diesem Zweek dienen.

328 L. Hofmeister

Die Schwierigkeiten, wekhe der quantitativeJt Injektion yon seiten der Apparatur entg.egenstehen und deren iJberwindung erreieht werden soil. sind wohl zu unterseheiden yon denjenigen, wel&e im Versuchsobjekt ~iegen. C h a m b e r s hat sehon 1922 fiir tierisehe Eizellen besehrieben, dat~. sieh das Plasma mit unversehrter AuI~engrenzsehieht wie ein Handsehuh- finger tiber die Pipette stiilpt (hesonders wenn deren Miindung nieht allzu rein ist), so da[~ die Injekiionsfliissigkeit l~ings der Pipette wegfliel~t, ohne in die Zelle einzudringen. Dieselbe Erseheinung habe ich seinerzeit bet u an plasmolysierten Allium-Protoplasien photographiseh fest- gelegt (1940, Tafel u Abb. 2) :q Bet Injektion in plasmolysierte Protoplaste wird man stets auf solche Verluste aehten miissen, was dutch Vergleich des abgegebenen Fliissigkeitsvolumens mit der Volums~inderung des plasmolysierten Protoplasten m~iglieh ist, sofern nieht g ef~irbte Injektions- }iisung ihren Austritt selbst verr~it. Ieh nahm einige Volumsvergleiehe die- ser Art an plasmolysierien Zellen der iiufieren Epidermis -yon Allium- Zwiebelsehuppen -vor. Es wurde die plasmolysierende AuI~enl~isung (1,0 mol Glukose) in die u injiziert, so daft der osmotisehe Weft des Zellsaftes nieht -eeriindert wurde und die gesamte u mit der eingebraehten LiJsungsmenge iibereinstimmen mufite. Bet Injektion yon 4000 his 14.000 3~3 Zuckerl~Ssung traten Verlusie ~,ort 1000 his 2000 #a auf, ohne dal~ ieh das Yorbeigleiten der Li~sung bemerkt hiitte. Die Verlusie waren grbl~.er als die infolge ungenau bestimmter Zellform anzunehmel~den Versuehsfehler. Plasmolysierte Proloplaste mit ihrer verkleinerten und gewil~, dutch F~illungserseheinungen veriinderten Plasmaobert'liiehe sind nieht die vorteilhaftester~ Objekte zur Mikroinjektion; prall turgeszente Zellen sind sehwer zu "r solehe, die in hypotoniseher oder isoioni- seher LiSsung osmotiseh entspannt sind, diirften sieh besser dafiir eignen. Besonders Bewiihrt haben sieh bekanntlieh zu Injektionsversuehen bet K e r r (1933) die Wurzelhaare yon Limnobium und bet P e t e r f i und Ko- j i m a (1936) die Staubfadenhaare ~,-on Tradescantia, beides Ob~ekte, (lie ohne u untersueht werden konnten.

Meine seinerzeitigen (vgl. H o f me i s t e r, 1940) und seither fortgesetzten Versuehe tiber plasmatis&e Mikroirtjektion an plasmolysierten Zwiebel- zellen zeigten, dal~ deren Plasma Bet Einspritzung yon Wasser iiufierlieh besehen etwa in iihnlieher Weise aufquillt, wie dies naeh stundenlanger Einwirkung -con Alkalisalzl~isungen in der Kappenplasmolyse zustande komm{. Doeh wird die Einspritzung gri~l~erer Wassermengen (ein Viertei Protoptastenvolmnen und mehr) gewtihnlieh nieht gut vertragen, so dal~. bald Koagulation folgt. Weniger sehiidlieh ist I~jektion yon Glukose in der hSherer Konzentration (2,0 mol); naeh Injektion hypertoniseher Konzentra- tion sehwillt das Plasma dureh ansehliefiende osmotisehe Ansaugung yon Wasser stiirker an, als der injizierten Fliissigkeitsmenge entsprieht. Das

In der zitierten Abbildung ging die zarte Koniur, welche das Plasma iiber der 1/ings der Pipette abfliellenden und zu einer kleinen Blase aufgestautea Fliissig- keitsmenge bildete, bet der lleproduktion durch den Raster Yerloren un.d wurde bet der letzten Korrektur st~irker als der Vorlage entspraeh retusehiert.

Eine einfache Apparatur fiir quantitative Mikroinjektion 329

Konzentration der plasmolysierenden Aul]enl~isung (meist 1,0mol) oder in Plasma verlninderte in meinen Versuehen, wenn es dureh eine grtil]ere Menge injizierten Wassers zur Quellung gebracht wurde, sein Volmnen nicht mehr, obwohl Abgabe des iibersehiissigen Wassers zu erwarten w~re. Dieses wird also naeh plasmatiseher Injektion im Plasma festgehalten 4. Es miissen demnach tiefergreifende Ver~inderungen stattgefunden haben. Auch die dureb Zuckereinspritzung erreiehte Zunahme des Plasmavolmnens bleibt bestehen, und da beide Plasmagrenzschiehten fiir den Zucker sehwer durehl~issig sind, ist dies nieht wetter befremdend. ]n beiden F~illen wird der Kern zu ether gro~en Blase (wenn' aueh nicht so hyalin wie bet der Einwirkung yon Alkalisalzen); wenn Zueker injiziert wurde, entstehen im Plasma nach und naeh zahlreiehe winzige Vakuolen, so dal] es triibe aus- sieht.

Man muff sieh fragen, ob die )~hnliehkeif zwisehen der besehriebenen Erseheinung und der Kappenplasmolyse in Salzen nur ~iul]erlieh ist und weleher Meehanismus ihr zugrunde lie gf; ferner auch, w ie das Beobaehtete nfit den heutigen Vorstellungen fiber den Feinbau des Plasmas in Einklang Zu bringen ist.

Daft die u des Plasmas bet Kappenplasmoiyse dutch in das Plasma eingedrungenes Alkali hervorgerufen wird und eine eehte Quellungserseheinung darstellt, isf bekannt (H (i f 1 e r 1928; 1939, S. 573). Der Zuekerlbsung dagegen kann eine quellende Wirkung wohl niehf zugesehrie- ben werden. Ieh habe (19~8) auf die Mbgliehkeit hingewiesen, dal] be[ st~rkerer Plasmaquellung (z. B. dureh Vitalf~irbung mif Chrysoidin, dutch hohe Intrabilit~t liir Methylharnstoff oder Sulfoharnstoff und eben aueh dureh plasmatisehe Injektion yon Wasser oder Lbsungen) Bindungen des Eiweif~gerfistes in dem naeh der Haftpunkttheorie ( F r e y - W y s s l i n g 1948) aufgebaut gedaehten Plasma getrennt werden. Diese Auflbsung yon Bindungen w~re rein meehaniseh zu denken: die zwisehen den EiweiI~- ketten des Plasmas liegende Phase nimmt stark an Menge zu und mu[~. notwendig das Eiwei~geriisf auseinanderriieken; dabei ktinnten weniger feste Bindungen zuerst geltist werden. H b f l e r (1959) betont, da[~ es sehwierig ist, die hoehgradige und dennoeh reversible Plasmaquellung der Kappenplasmolyse im Sinne der Haftpunkttheorie F r e y - W y s s l i n g s zu interpretieren. Nimmt man nun die Trennung bestimmter Gruppen yon Bindungen an, so stehen meines Eraehtens einer Deutung weniger Sehwie- rigkeiten entgegen als etwa dem gerst~ndnis der Plasmastr~bmung, bei der .ia danernde und in raseher Folge ablaufende Ltisung und Wiederherstel- lung soleher Bindungen angenommen wird 5. Bei sorgfiittiger Bemessung

Nach vakuol~irer Injektion yon Wasser erfolgt dagegen im Plasmolytikum osmotisclle Volumsverkleinerung und Einstellung auf osmotisehes Gleichgewieht.

5 Ich babe wiederholt die besonders gro~e Empfindtiehkeit der zu Rotations- strtimung bef~ihigten Plasmen yon Elodea und Vallisneria gegen mikrurgische Be- handlung feststellen ktinnen; diese Eigenheit wiire vielleicht dahin zu deuten, daa der Zusammenhang des Eiweiltgeriistes bei diesen Objekien eben deshalb weniger stabil ist, weil eine grtiflere Menge yon Bindungen bei ihnen leicht ltisbar ist.

330 L. Hofmeister

yon in das P lasma in~izierten Wasser- oder L~isungsmengen mkit~,te es m6glieh seth, eine Grenze der Volums~TergriSfierung zu linden, unterhalb der die SchwelIung reversiBel ist. Derar t ige Versuehe, zu deren Ausfiih- rung die oben gesehilderte Injekt ionseinr iehtung ja zuniiehst hergestellt wurde, haben ihr Ziel noeh nieht erreieht und werden fortgesetzt.

Gewisse gemeinsame Ziige mit der Quel lung dutch Wasser in jekt ion zeigt ein Degenerat ionsvorgang, der abliiuft, wenn die iiul~ere Plasina- grenzsehieht plasmolysiert .er Zellen dutch eine Mikronadel oder P ipe t te mehrmals beriihrt , gezerrt oder sonst meehaniseh insult iert wird (Plasmo- ly t ikum: Glukose). Das P lasma wi rd in der be i re f fenden Gegend triibe, quil l t l angsam um den ganzen Pro top las ten he rum auf, es ents tehen dar in ~4ele, sehr kleine, farBlose Vakuolen, und der Kern zeigt deutliehe Netz- s i ruktur . De r u k a n n in dies.era S tad ium siehenbleiben, es kann abe t aueh die Verquel lung und Yerw~isserung wei tergehen und das P lasma sieh ,,aufl6sen ~176 Dabei wird die iiul3er.e P ro top las t enkon tu r zuniiehst we- niger deutlieh, das P lasma wi rd immer wiisseriger und versehwindet lang- sam, wiihrend die Plasmaaul~enhaut in sehr viele feine, an der Grenze der Siehtbarkei t l iegende TriJpfehen zerfiillt, die n o & liinger in ihrer Lage ble iben und das weitere Bestehen der Plasmagrenzschieht vortliusehen, ob- wohl die Stoffe des sieh dahin te r aufl/Ssenden P lasmas zmn iiberwiegende~:t Teil Bereits durehdiffundiert sind. Dieses l angsam yon Wass.er iiber- sehwemmte P lasma gerinn{ also nieht, sondern li3st sieh auf und wird un- sichtbar.

In ganz anderer Weise sah ich in anderen u die innere Plasmagrenz- s&ieht, also die Hiille eines isolierten und ~om Plasma befreiten Tonoplasten des- selben Objektes zergehen. C h a m b e r s und t t iJ f 1 e r (19M) haben beschrieben, dal~ TonoplasIen an der Grenzfl~iche LiSsung/Luft ohne Hinterlassung yon Spuren zerflieflen. Wird nun ein isolierter Tonoplast in GlukoseRisung sehwebend durdl Beriihrung oder dutch einen Fltissigkeitsstrom aus der Mikropipette sehr vorsid~tig insultiert, so liSst er sich yon der bertihrten Stelle her langsam auf. Die sdtwin- dende Tonoplastenhaut bleibt his zuletzt in der Form der Kugeloberfliiche. Handelt es sieh um Zelleu mit rote m Zellsaft,. so diffnndiert derselbe so ab, daft die Grenze der F~irbung jeweils mit dem Rande der Tonoplastenhaut etwa zusammenf~llt. Gleiehzeitig hebt sich ein iiberaus zarter Schleier yon der Tonoplastenhaut nach aul~en ab, d e r m i t der Aufl~Ssung derselben im gleichen Marie zuriiekweicht. Das Tonoplastenhiiutchen lbst sich bis zum letzten Rest und nur Spuren des Schleiers blei- ben schliel~li& erhalten. Anscheinend stellt dieser den Eiweifibestandteil yon Plasmaresten dar, die auf der Tonoplastenoberfl~che zuriickgeblieben waren (vgl. die Tonoplastens&eide yon L e d e re r, 1935). Diese Beobach{ungen stimmen mit der herrsehenden Ansicht iiberein, nadt der die Aufiengrenzschicht des Plasmas mehr Eiweiltbestandteile enth~ilt als die innere.

Die gesehilderten BeoBaehtungen ~egen dazu an, wenigstens innerhalb der P lasmapathologie eine gewisse ]~inschr~nkung des klassisehen Satzes zu erw~igen, naeh dem leJ~endes P lasma mi t Wasser nieht misehbar ist. Mit un- versehr ter Grenzsehieht ~eersehenes P lasma miseht sieh mi~ Wasser nieht, dagegen n immt d as B innenp la sma in meinen Yersuehen Wasser oder L(i- sungen, wenn es dami t d i rekt in B eri ihrung kommt, ohne weiteres auf; his zu weleher Grenze dies ohne Seh:~idigung miSgli& ist, wird imeh zu unter-

Eine einfa&e Apparatur ftir quantitative Mikroinjektion 331

suchen sein. Ein Beispiel yon Plasma, das Wasser nahezu unbegrenzt auf- nimmt und sieh im tJberschul~ desselben aufliSst, ist das fetter, lebender }%llenki3rner. Dieses platzen bekanntlich vielfaeh in Wasser und verdiinn- fen LSsungen, worauf ihr plasmatiseher Inhalt austritt; andernfalls kann die Offnung durch Deckglasdruck oder mikrurgiseh durehgeffihrt werden. Das freigelegte Plasma weist in Ca-freier Lbsung (zumindest in versehie- denen "con mir untersuehten F~illen) weder in Hell- noeh im Dunkelfeld eine Aul~engrenzsehieht oder bestimmte huEere Kontur auf; es 15st sieh vom Rande her allmiihlieh auf, wetter innen bleibt es noeh l~inger in konzentrier- ier Form erhaltem Zwisehen den aufgel~isfen Randpartien und der noeh kamn ver~inderten Mitte konnte ieh eine Grenze oder unierseheidbare ~ber- gangsstufe bisher nieht feststellen. Ieh glaube, dal~ dieser Vorgang als Misehung zwisehen Plasma und Wasser bezeichnet werden dart. -41anlieh wie das ,,'on PollenkiSrnert -r sieh das Plasma der Triehoblasten (Wur- zelhaaranlagen) yon Hpdrocharis, das ebenfalls in Wasser zergehf, wenn die Zellen geSffnet werden, wiihrencl das}enige der daneben liegenden Zellen der Wurzelpidermis im gleiehen Falle koaguliert. Pollenkiirner und Triehoblasten haben miteinande.r gemein, daft ihr Plasma noeh die Stoffe enth~ilt, die sp~iter in die Vakuole iiberzugeherl bestimmt sind und daft ihr Plasma in einem spiiteren Stadium zu lebhafter Strbmung befiihigt ist; ,delleieht liegen aueh da andere VeThiiltnisse bezfiglieh der Bindungen im Plasma- eiweil~ vor als in Plasmen, die bet Beriihrung mit Wasser koagulieren.

Z u s a m m e n f a s s u n g -

E s wird eine Mikroinjektionseinrichtung beschrieben, welche an Stelle der iiblichen Recordspritze eine elastische Dose als wesentlichen Be stand- teil enth~ilt, deren Votumen mittels Mikromete~schraube ~-erhndert wird. Zwei einfache Arbeitsvorte~le erleichtern die reproduzierbare Abgabe (oder Aufnahme) meflbarer Flfissigkeitsmengen: es sind dies die Anbringung eines Quecksilbertropfens knapp innerhalb der Pipettenmiindung und die Aufnahme yon ParaffinS1 in die Pipeftenspitze vor Ansaugen der Injek- tionslSsung. Dfe bewegten Mengen werden durch Yermessen des u bestimmt, welches sie in der Pipettenspitze einnehmen. Die Schwierig- keiten, welehe quantitativer ]njektion yon seiten der Apparatur entgegen- stehen, lassen sieh in der angegebenen Art iiberwinden.

Einige Beobaehtungen fiber Plasmaquellung und Misehbarkeif des Plas- mas mit Wasser, die bet Mikroinjektion eine Rolle spielen, werden kurz besproehert.

L i t e r a t u r

C h a m b e r s, R., 1922 a, New apparatus and methods for the dissection and injec- tion of living cells. Anat. Record 24, 1.

-- 1922 b, A micro-injection study on the permeability of the starfish egg. J. Gen. Physiol. 5, 189.

- - and tti3 f 1 e r, K., 1931, Mierurgical studies on the tonoplast of Allium cepa. Protoplasma 12, 338.

-- K osae, M. I., and Grand, C. G., 1937, The Living Cell, Physical Properties and Microchemicat Reactions. Industrial and Engin. Chem. 9, 143.

232 L. Hofmeister: Eine e infa&e Appara tu r f. quant i ta t . Mikroinjekt ion

F r e y - W y s s l i n g , A., 1948, Submicroscopic morphology of protoplasm and its derivatives. Elsevier Publ . Comp., New York.

t t 5 f 1 e r, K., 1928, Ether Kappenplasmolyse . Bet. deutsch. Bot. Ges. 46, 73. - - 1939, Kappenplasmolyse und Ionenantagonismus . Pro toplasma 33, 545. II o f m e i s t e r, L., 1940, Studien tiber Mikroinjekt ion in Pflanzenzellen. Zeitsd~r.

wiss. Mikr. 57, 274. - - 1 9 4 8 , Vitalf / i rbungsstudien mit Chrysoidin. Sitzungsber. Osterr. Akad. Wiss..

mathem.-nat . K1., Abt. I, 157, 55. K c r r, Th., 1933, The inject ion of certain salts into the protoplasm and vacuoles

of the root hairs of Lirnuobiurn .spongia. Protoplasma 18, 420. L e d e r e r, B., 1935, F~rbung, F ix ie rung urtd Mikrodissektion yon Tonoplasten.

Biologia generalis 11, 211. 5'I o r i e a r d, R., et C o i g a r d, J., 1941, Micro-inject ion quant i ta t ive avee mesure

de volume por tan t stir le miHioni~me de m m . e . C . r . Soc. Biol. Paris 135, 667. P c t e r f i, T., 1924, Neue mikrnrg i sd le Nebenappara te . Zeitschr. wiss. Mikr. 41,263. - - 1928, Methodik der wissensehaftlichen Biologic. Springer, Berlin. - - und K o j i m a, H., 1936, Die Wi rk u n g mikrurgiseher Eingriffe auf den Ruhe-

kern der Pflanzenzellen. II. Injektionsversuehe. Pro toplasma 25, 501. T a y 1 o r, C. V., 1920, An accura te ly control lable micro-pipette. Science 51, 617.

(Zit. nach P e t e r f i 1928.)

Druck yon Adolf Holzhausens NacMolger, Wien VII.