Eine optische Methode zum Nachweis von Lipoiden in der lebenden Zelle

EINE OPTISCHE METHODE ZUM NACHWEIS VON LIPOIDEN IN DER LEBENDEN ZELLE

u JOSEF SPEK (Aus dem Zoologischen Institut de�9 Universit~t Heidelberg)

Mit Tafel 1

Eingegangen am 20. Mai 1942

Wie ich in frfiheren Abhandlungen (J. S p e k 1938 und 1940) dargelegt habe, kann man mit dem E n g e l m a n n s c h e n M i k r o s p e k t r a l p h o t o m e t e r von vitalgef~trbten Zellen schSne, scharfe Spektren erhalten. Vitalf~trbungen jeder Art sind d` einer genaueren optischen Analyse zugangli~h geworden. Bei dem geny Studium der Spektren einiger zu Vital�9 vielfach verwendeter Oxazinfarbstoffe konnte ich nun feststellen, dal~ das Spektrum angef~rbter lebender Zellen mit dem Spektrum der reinen w~6rigen LSsungen dieser ~~arbstoffe, auch abgesehen von der leichten Ve�9 aller Banden nach Rot., welche ich 1940 genauer beschrieben habe, nicht iibereinstimmt. Eine Bande erschien in der Zelle in auff/~lliger Weise verst/~rkt, eine andere dagegen war viel schw/icher als bei der intensiven Anf~rbung der Zellen zu er- warten war. Das St~trkeverh~tltnis der Banden war also in auf�9 Weise verschoben.

Die Erkl~rung fiir diese Erscheinung war leicht gefunden. Ich hat te schon in meiner Arbeit 1940 darauf hingewiesen, dal~ viele frit den Ze]l�9 sehr wichtige Oxazinfarbstoffe in w~l~riger L6sung schwach fluoreszieren, und dal3 die Fluoreszenz von bestimmten Strahlen des s i c h t b a r e n Lichtes am st~trksten erregt wird. Dementsprechend weisen die Farbstoffe an dieser Stelle des Spek- t rums eine Absorptionsb` auf, welche wir als Bande des fluoreszenzerregenden Lichtes bezeichnen k6nnen. In dem Wellenl~ngenbezirk der anderen Banden �9 entweder gar keine, oder nur sehr schwache Fluoreszenzerregung stat t . Diese ~ o�9 sehr sturken - - Banden haben also eine andere Bedeutung. In den erwahnten Vitalf~rbungsversuchen war es nun stets die ]~ande des fluoreszenzerregenden Lichtes, welche in der Zelle au�9 verst~rkt war, w~thrend die uner- w�87 schwache Bande die Bande des dissoziierten Farbsalzes war. Daraufhin vorgenommene Kontrollen durch Modellversuche lehrten, da6 die Fluoreszenz der betr. Farbstoffe in gewissen orgunischerl LSsungsmitteln, wie ()len und Lipoiden ira engeren Sinne des Wortes riel st~rker ist als ira Wasser, und dal~ entsprechend der Fluoreszenzsteigerung natiirlich auch jeweils die Bande des fluoreszenzerregenden Lic~htes betrgchtlich verstgrkt erscheint. Die Spektren der betr. Farbstoffe in den Lipoiden des Modellversuches schienen geeignet zn

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sein, eine eytologiseh besonders interessante Aufkl/trung der tiberraschenden Spektren der lebend gefgrbten Zellen zu geben. Was fiir Schliisse die Uberein- stimmung der Spektren von Zellen und Lipoiden zulieB, mugte aber erst dureh vielerlei Kontrollen geklgrt werden.

Dag die Fluoreszenz organiseher Verbindungen in versehiedenen LSsungs- mitteln sehr verschieden stark sein kann, ist schon lange bekannt. Ein auf- fglliges Beispiel daftir bietet ja die Fluoreszenz des Chlorophylls. Bœ manehen �9234 Substanzen geniigen schon kleine Zus/*tze gewisser Stoffe, um die Fluoreszenz stark zu beeinflussen. Dag aber die gleiche Erscheinnng aueh bel wiehtigen VitMfarbstoffen zu beobachten ist, und dag sich darans Itir den Cyto- logen die intercssantesten SchluBfo]gerungen ergeben, war bis dahin unbekannt. Ja, man hatte sogar bel eingehenden, speziell zu biologisehen Zweeken angestellten spektroskopisehœ AnMysen der wgBrigen L6sungen verwandter Farbstoffe ihre Fluoreszenz tiberhaupt fibersehen und sieh dadureh zu ganz fMsehen Deutungen ihrer Spektrœ verleiten lassen.

Das Programm zu dieser Untersuehung war sehon durch die ersten Befunde gegeben. Es gMt zuniohst zu untersuehen, ob die Steigerung der Fluorœ jener Farbstoffe eine spezifische Wirkung der Lipoide ist, wenn ja, wo bei LSsnngs- mitteln ghnlieher Zusammensetzung die Grenzen zu ziehen sind, nnd wie der Zellforscher sieh die Ersoheinung zunutze maehen kann. Umgekœ muBte auch gepriift werden, ob die Erseheinung in der gleichen oder einer ghnliehen Form auch bei anderen Oxazinen oder evtl. auch bei fluoreszierenden Farbstoffen anderer Farbstoffgruploen naehgewiesen werden kann. Fiir die Untersuchungen nach dieser Richtung bildete die Aussieht einen starken Ansporn, dag ein Farb- stoff gefunden werden kSnnte, bei dent die Erscheinung evtl. in riel stgrkerem Ausmag zu beobachten ist als bei den Farbstoffen, bei denen sie dureh Zufall zuerst erkannt w.orden ist.

Die Vorversuehe wurden in der Weise ausgeffihrt, dag die t~arbstoffe in {)len gelSst, oder reine, bus tierischen Organen gewonnene Lipoidsubstanzen mit ihnen angefgrbt wurden. An diesen gefgrbten Modellsubstanzen wurde nun gepriift, ob siœ eine stgrkere Fluoreszenz oder ein anderes S1oektrum zeigten als die reine wigrige LSsung. Bei positiven Befunden wurden dann noch zahlreiche andere organisehe L6sungsmittel ausprobiert. Die reinen Lipoidsubstanzen verdanke ich, soweit es nieht, kiufliehe Prgparate waren; Herrn Prof. Dr. E. K l e n k (K61n), die Cholesterinester Herrn Prof. W i n d a u s (G6ttiI~gen). Proben von Farbstoffen haben mir das t tauptlaboratorium der I. G. Farben- industrie in Ludwigshafen a. Rh., Herr Dr. K r g n z l e i n ira I. G. Farbenlabora- torium in Frankfurt a. M.-H6ehst und die !Virma Dr. K. t‡ u. SShne in Leipzig freundliehst zut Verftigung gestellt, wofiir ich aueh an dieser S tellœ meinen besten Dank aussprechen mSchte. Auch Herrn Prof. W i n d a u s und I{errn Prof. K l e n k bin ich fiir die wertvollen Lipoidpriparate zu grol~em Dank verlaflichtet.

Eine zweite Serie von Vorversuchen wurde bei vielen Farbstoffen parMlel zur ersten am lebenden Material ausgefiihrt, indem Gewebe vitMgefirbt und ihre Spektren mit denen der angefgrbten Modellsubstanzen vergliehen wurden.

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Wenn das Spektrum eines Farbsto�9 viele Absorptionsbanden aufweist (etwa vier oder gar fiinf), se beruht das meist darau�9 da6 er eine komplizierte Fluoreszenzerregung an mehreren Stellen des sichtbaren Spektrums aufweist, se dal~ dann zu der Absorptionsbande des Farbsalzes und einer etwa noch ver- handenen Bande der Farbbase bzw. Farbs~ture noch mehrere Banden des �9 zenzerregenden Lichtes dazukommen. Fiir den Cytologen k6nnen solche Farb- stoffe, wenn sie sich zur Vitalf~trbung verwenden lassen, oit besonders interessante Verh/~ltnisse bieten. In den Farbstofftabellen von G. S c h u l t z (neu herausgegeben von L. L e h m a n n 1931) sind bel vielen Farbstoffen die Absorp- t ionsbanden verzeichnet. Dort, und in der chemischen Spezialliteratur findet man gelegentlich auch Angaben ohne weiteren Kommentar , dal~ die Farbe der Fluoreszenz eines Farbstoffes in verschiedenen LSsungsmi0teln verschieden ist, oder dal~ er in einem Medium fluoresziert, w/~hrend in einem anderen niehts von einer Fluoreszenz zu sehen ist. Bel Versuchen mit neuen Farbstoffen boten mir solche Daten oft einen sehr wertvollen Fi~gerzeig.

Vorversuche zeigten, da6 Unterschiede zwischen dem Spektrum der LSsung in {)l bzw. Lipoiden ira engeren Sinne und der L5sung in Wasser, und Unter- schiede zwischen dem Spektrum der vitMgefgrbten Zelle und der LSsu~g in Wasser bel O x a z i n e n z i e m l i o h v e r b r e i t e t und bei manchen ganz enorm sind. Bei Farbstoffen anderer Farbstoffgruppen wurde die Erscheinung in ghn- licher Ferre bisher nur in einem Fall ge�9 nnd zwar beim O x y p h t h a l e i n R o s e b e n g a l e , Griibler. Bei allen anderen fluoreszierenden Farbstoffen verlie�9 die l~rfifung negativ, d. h. die Spektren in {)1 und in Wasser bzw. in der gef/irbten Ze]le und in Wasser waren (a, bgesehen von einer schwachen Verschiebung aller Absorptionsmaxima naeh Rot in den {)len und in der Zelle) gleich, oder doch fiir eytologische Ansprfiche nicht genfigend versehieden. Wie ich a. a. O. (J. S p e k 1940) darlegte, ist die Rotverschiebung der Maxima entweder au�9 eine LSsung des Farbstoffes in einem Medium anderer Lichtbreehung ira Sinne der K u n d t - schen Regel, oder aber auf eine Adsorption des Farbstof�9 an kolloidalen Adsor- bentien zuriickzufiihren. Zwisehen den beiden MSglichkeiten kann leider in vielen Fgllen nieht entschieden werden, da die Abweichung in den beiden Fgllen ungefghr von der gleichen GrSl3enordnung ist.

Ein negatives Ergebnis hat ten bisher die Versuehe mit folgenden Farb- stoffen: Mit den A m i d o p h t h a l e i n e n Rhoda~nin B extra, Rhodamin 6 G und Sul�9 mit den A c r i d i n f a . r b s t o f f e n Rhodulinorange NO, auch Acridinorange genannt, Auraein G, Benzoflavin und Trypaflavin, mit dem T h i a z o l � 9 2 3 9 Thioflavin TCN, mit dem B e n z o s a f r a n i n Irisviolett ( = Heliotrop 2 B), mit dem X a n t h e n f a r b s t o f f Pyronin, mit dem eigenartigen roten basischen V i n y l e n c a r b e n i u m f a r b s t o f f Astraphloxin und mit vier IG-Farbstoffen, welche noeh keinen Handelsnamen haben. Der Oxazinfarbstoff, bei welehem ich durch Zufall auf die Erscheimmg gestol~en war, dal~ die Spektren der vitalgefgrbten Zellen und der wg6rigen LSsung eine aufffillige Differenz zeigen, und daB die Fluoreszenz in {31en viel krgftiger ist als in Wasser, war 2 q i l b l a u s u l f a t B. Da ich bei weiteren Untersuchungen rand, dal3 ein anderes Oxazin, und zwar I r i s b l a u die Erscheinung viel stgrker zeigt, habe ich mit diesem

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Farbstoff besonders zahlreiche Versuche angestellt. Ihre t~esch�9 soli daher hier vorangestellt werden. Viele Eigenscha�9 des Farbstoffes verdienon vom Cytologen ganz besonders beachtet zu werden.

Irisblau ist die Handelsbezeichnung, welche die ehemalige Badische Anilin- und Sodafabrik fiir den Farbstoff verwondete. Von anderen Fabriken wurde der Farbstoff auch l ~ l u o r e s z i e r e n d e s B l a u oder R e s o r e i n b l a u genannt. Die Erfinder des Farbstoffes sind P. W e s e l s k y und t{. B e n e d i k t (1880). I)er Farbstoff ist ein Tetrabromresorufin. Meistens kommt er als Ammoniumsalz in den Handel. Er hat dann die Zusammensetzung:

Br Br

I q ~~\_o ~H~O--(~r__\/__~l-- ~0 - \ / - - ~r

In der vorliegenden Form ist also Irisblau ein s a u r e r l~arbstoff. R š selbst hat eine sehmutzig gelbrote Farbe. Durch Einfiihrung der vier Bromatomœ wird die Farbintensit/tt vertieft und der ]~'arbton verindert . Die konzentrierte (eigentlieh iibers/~ttigte - - s. weit. unten - - ) w~Brige L6sung des Ammonium- salzes hag eine suite ,,veilehenblaue" (blauviolette) Farbe. Dus t~arbsalz ist in kaltem Wasser nur schwer 16slieh. Bei Zimmertemperatur 16st sieh nnr ganz allmihlieh so -ciel davon auf, dag die L6sung blaB blauviolett wird. In heil~em Wasser 16st sieh dus Farbsalz rasch und in riel h6herer t™ Aus diesen blauvioletten L6sungen seheiden sich nur sehr allm/~hlieh ira Lanfe vieler Tage griinsehillernde Kristalle aus. Da es nieht ohne weiteres m6glieh ist, w/~Brige L6sungen von gleiehbleibender h6herer Konzentration herzustellen, wurde fiir gewisse teehnische Zweeke der Farbstoff aueh h/~ufig in l~orm einer sog. Paste in den t tandel gebraeht. Eine ,,Paste" ist in diesem FMle eine grobe, meist 6proz. Suspension des Farbstoffes in Wusser, aus der man dureh Verdiinnen und Aufkoehen auf verh/iltnism~13ig e�9 Weise Mare L6sungen fiir sofortigen Gebraueh herstellen kann. Auch sehr gleiehmiBige, reine, in der Hauptsache kolloidale Suspensionen des Farbstoffes, die mika~oskopiseh v611ig Mur sind, lassen sich dureh Zusatz geeigneter Sehutzkolloide herstellen. Diese kolloidMen L6sungen haben einen anderen Farbton uls die molekularen L6sungen, und zwar sind sie dunkel-erdbeerrot. Worauf diese eigenartige Versehiebung der Farbe bœ ergibt erst eine spektroskopische und eine ultramikroskopisehe Unter- suchung (s. sp~ter). Auch die Frage, welcher L6sung des Farbstoffes, der iiber- si~ttigten molekularen, der kolloidalen oder der Paste man in der Praxis des Zellforsehers den Vorzug geben soll, kann erst an sp~terer Stelle beantwortet werden.

In Alkohol 16st sieh Irisblau raseh auf. Die in Alkohol 16sliehe Menge des t~arbstoffes ist aber aueh nicht grol3. I)ie L6sungen sind im durchfMlenden Lieht blau. In Aeeton erfolgt momentane LSsung. In 01en ist die L6slichkeit sehr gering. Tupft nian etwas Farbpulver in oin Sehglchen mit 01, so bleibt es bei Zimmertemperatur ungel6st liegœ Auch bel langem Stehen ist eine An-

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f/irbung des 01s kaum erkennbar. Beim Erw/~rmen im Wasserbad entsteht eine in der Durehsieht hellblaue LSsung. (}le, die riel freie Fetts/~nre enthalten, fiihren den Farbstoff allm/s in die in LSsung rotgelbe Farbs/~ure liber. - - Eine weitere Diskussion der LSsliehkeitsverh/~ltnisse wollen wir erst von theo- retisehen Gesiehtspunkten vornehmen.

Setzt man der iibers/s w/~Brigen L6sung Seewasser zu, so erfolgt keine Ausf/illung odœ Ausseheidung von Krist/illehen. Konzentrat ionen des Farb- stoffes, wie siœ zu Vitalf/s ben6tigt werden, kSnnen in Seewasser ohne weiteres hergestellt werden. Bel Zusatz zu Seewasser erfolgt aueh kein Farben- umsehlag.

Eine Versehiebung der Wasserstof�9 bewirkt innerhalb des physiologischen pH-Bereiehs keine Ver/s des Farbtones der w/iBrigen LSsung. Frit die meisten eytologisehen Zweeke ist also Irisblau a l s I n d i k a t o r n i e h t v e r w e n d b a r . Bei st/~rkerer Ans/~uerung wird der Farbstoff unter Farbumsehlag in die F a r b s / i u r e iibergefiihrt. Der Umsehlagspunkt liegt etwa bei pg = 2,6, also sehr tief. Die FarbsSure ist sowohl in rein lipophilen organischen LSsungsmitteln wie Xylol und 01en, als aueh in solehen mit hydrophilen d- lipophilen Eigenseha�9 wie Milehs/~ure oder Aeeton gut 15slieh. Die L6sungen sind orange bis rotgelb. Bei Verdiinnung der zweiten Gruppe der L6sungsmittel mit Wasser f/s die Farbs/s in roten Floeken aus. - - Zusatz von 1/10 n-Natron- lauge zur w/~Brigen Irisblaul6sung bewirkt eine ganz allm/~hlieh fortsehreitende Entf/~rbung derselben. Es bleibt ein zarter rosa Farbton iibrig, was darauf hindeutet, da6 doeh aueh bei Ir isblau wie bei vielen anderen Oxazinen bel hohem p~ wenigstens Spuren einer rosa Farbbas e entstehen k6nnen.

Die Versuehe, welehe die bei Irisblau ganz enorme I)ifferenz der Fluoreszenzst/~rke in versehiedenen L6sungsmitteln zeigen, lassen sieh mit den ein�9 Mitteln ausfiihrœ H/~It man eine frisehbereitete ‡234 w/~Brige L6sung des Farbstof‡ vor eine Mikroskopierlampe-- etwa eine Stella- lampe von Lœ --, dann ist von der aueh in Wasser vorhandenen ™ nur ein schwaeher roter Sehimmer zu sehen. In der LSsung in Of dagegen erseheint vor der gleiehen relativ sehwaehen Liehtquelle ein flammendroter Fluores- zenzliehtkegel. ])ie gleiehe Steigerung der Fluoreszenzst~rke zeigen die L6sungen in Alkohol und Aeeton. Hier ist das Ph/~nomen insofern noeh seh6ner, als sieh in diesen Medien vom Farbstoff mehr 16st als in 01en. Die Fluoreszenz dieser LSsungen ist so stark, dal] siœ sehon bel Tageslieht au‡ das Auff/illigste in Er- seheinung tritt. I)ie Fluoreszenz der w/~Brigen L6sung ist aueh vor einer Nephelo- meterlampe nur ganz unau‡ diœ der L6sungen in l~len, Alkohol oder Aeeton wird hier so stark, dal] aie wohl zu den st/irkstœ Fluoreszenze‡ gereehnet werden kann, die es iiberhaupt gibt. -- In w/~l]rigen L6sungen, welehe gr6bere Farbteilehen enthalten, ist auBer der sehwaehen roten Fluoreszenz ein griines Streulieht zu sehen, welehes ira llodensatz am st/~rksten ist.

Zur genauœ Analyse der Fluoreszenz ist es nun noeh nStig zu ermitteln, welehe Wellenl/~ngœ das rote Fluoreszenzlieht hat, bei weleher Wellenl/~nge Fluoreszenzœ eintritt, und wiœ die Spektren der versehiedœ L6sungen aussehen. Die geringœ L6sliehkeit des FarbstoIfes in ~len, der weehselnde Gehalt

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der 0 le an �9 01s~uren und an ver~tnderlichen unges~t t ig ten K o m p o n e n t e n erschweren alle diese Versuche bei Verwendung von 01en Ms LSsungsmit te l in unerwi inschter Weise. Die Grundversuche wurden daher zun~chst alle an alkoholischen und w~l~rigen LSsungen ausgefiihrt.

Die Bestimmung der Luge der Absorptionsbanden der Farbstoffl0sangen habe ich meistens auch mit dem Mikrospektralphotometer von W. E n g e h n a n n (Hersteller Carl ZeiB, Jen~) uusgefiihrt, mit demselben Apparat, mit welchem aueh die Spektren der vitalgef~Lrbten Zelten entworfen wurden. Da bei diesem das ganze sichtbare Spektrum au�9 einen verhMtnis- m~ltig kleinen l~aum zusammengedr~ngt ist, sind die Lagebestimmungen der Absorptions- maximu nattirlieh nicht se genau, wie die mit einem grol~en Spektroskop, etwa dem von Loewe-Sehumm ermittelten. I)ie Luge eines Maximums zwischen den 10m/,-Strichen der Skal~ mu~ gesehi~tzt werden. IIinzu kommt, daB bei der mit zur Verfiigung stehenden Ausfiihrung des Enge lmannschen Apparates die Proiektien der Wellenl~ngenskalu auf dus Spektrum ftir die Enden des Spektrums nieht mehr ganz befriedigend ist. Stellt man z. B. die gelben Linien einer Natriumspektrallampe genau au�9 589 und 589,5 m# ein, se liegen die rote und die blauviolette Natriumlin-ie auf der Skala bel seharfer Einstellung etwas zu hoeh bzw. zu tie�9 Die Differenz betr~gt etwa 1--2 m#. Man kann diesen Fehler dudureh weitgehend aussehMten, dal3 man die SkMa, wenn es bel den Untersuehungen gerade auf Banden in l~ot oder ]~lauviolett ankommt, au�9 eine Spektrallinie dieses Spektralbezirkes genau einstellt, also In. a. W. fur jeden Spektralbezirk eine neue Eiehung der Skala vornimlnt. Wenn eine 2NTatriumlumpe ihre vo~le Leuehtkraft erreicht hat, se kommen ja aueh die schw~cheren Linien des ]Natriums mit gentigender Seh~rfe hervor, se dafi man sieh auch ihrer zur Eiehung bedienen kann. Andernfalls mtissen andere Spektrallalnpen verwendet werden, deren Licht SpektrMlinien in den gewiinsehten Bezirken aufweist. - - Ab~nderungen des Enge lmannsehen Mikrospektralphotometers konnten jetzt ira Krieg nicht in Auftrag gegeben werden.

Ftir die vorliegenden Untersuchungen war ira allgemeinei~ die Genauigkeit der Engelmannsehen Apparatur ausreichend. Einzelne Messungen habe ich mit freundlicher Erlaubnis von Herrn Prof. A. S e y b o 1 d ira Botanisehen Institut mit dem groften Spektreskop von Loewe-Schumm ausgefiihrt.

Uber die S p e k t r e n v o n I r i s b l a u ist folgendes e rmi t te l t worden: Die ges~Lttigte a l k o h o l i s c h e L 6 s u n g des Farbstoffes l~ftt bei einer Schichtdicke von 5 m m d r e i B` e rkennen : Eine auBerordentl ich scharfe und dunkle in Rot, die von etwa 600--615 mff geht u n d bei 608 m# ihr Maximum hat , eine zweite schw~chere, die von 584 bis 595 m# geht und ein Maximum bei 589 m# aufweist, und eine dr i t te breitere Bande, die unscherf begrenzt von etwa 552 bis 569 m# geht, ein M` bei 559 raff hat und noch wesentl ich blasser ist Ms die zweite Bande. Auch zwischen der zweiten und d r i t t en Bande ist dus Spek t rum ziemlich verdunkel t . I n der frt iheren Aufl~ge von G. S c h u I t z Farbs tof f tabel len war ftir diesen Bezirk noch ein Max imum bel 567 m# angegeben. Hierbei hande l t es sich aber h6chstens Uln eine aul~erordentlich schwache, kaum mi t Sicherheit e rkennbare Absorpt ionsvers t~rkung innerha lb des ohnehin schon diffus ziemlieh ve rdunke l t en Spektralbezirkes im oberen Griin. Bel hoher Schichtdicke der alkoholischen L6sung sieht man eine einzige t iefschwalze Bande, die von etwa 530 m # bis 630 m# zieht.

I n den Farb l6sungen in A c e t o n sind die gleichen Banden zu sehen wie in Alkohol. Auch ihre Luge ist ira wesentl ichen die gleiche.

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In der tibers/~ttigten w g B r i g e n L S s u n g sind zwei der fiir die Mkoholisehe L5sung charakteristisehen Banden wiederzuerkennen, nur liegen ihre Maxima der K u n d t s e h e n Regel entsprechend etwas niedriger, und zwar die erste Bande 1) mit einem Maximum bei 603 m# und die dritte Bande mit einem unseharf hervor- tretenden Maximum bel etwa 555 m/~, Die oben als zweite bezeichnete Bande ist nur bei hSherer Sehiehtdieke konzentriertester w/~Briger LSsungen bei etwa 588 m/~ zu sehen.

Trotz der entsprechenden Lage der Banden sieht das Spektrum der iiber- s~ttigten w~Brigen L6sung ganz anders aus als das der alkoholisehen. Die erste Bande ist n/~mlieh bei der wgBrigen L5sung ganz blaB und sehmal, die dritte dagegen wesentlieh kr/fftiger als die erste. Aus der versehiedenen St/~rke der Banden ergibt sieh aueh, weshalb die Farbe der konzentrierten wfigrigen LSsung von der L5sung in Alkohol oder in {)1 so sehr abweieht. Bei der w/~13rigen L6sung ist die Absorption in Griin am stgrksten, der l~arbton also rot mit nur ziemlieh sehwaehem Stieh in Blau. Bei der alkoholisehen L6sung dagegen ergibt sieh aus der so sehr starken Absorption ira unteren Rot und Gelb in der tIauptsaehe ein griinlichblauer Farbton mit nur sehr sehwaehem Stieh in t~ot, der fiir das Auge meist erst bei den h6ehsten Konzentrationen hervortri t t . In den 01en, in denen die Konzentration des Farbsalzes in allen Fgllen nur sehr gering b]eibt, ist dem- entspreehend meist nur die erste Bande, die aueh hier die st/~rkste ist, gut zu sehen, die andern sind gerade nur angedeutet, t t ieraus ergibt sieh ein blaB-blaugrfiner Farbton der LSsung.

])as umgekehrte St/trkeverh~tltnis der zwei Hauptbanden der konzentrierten w/~grigen nnd alkoholisehen LSsung maeht es sehon wahrseheinlieh, dag die erste Bande die Absorptionsbande des die rote Fluoreszenz erregenden Liehtes ist und entsprechend der ira Alkohol riel h5heren Fluoreszenz hier sehr verst~rkt erseheint. Ehe wir diese Annahme weiter priifen, mtissen wir noeh jenœ eigenartige "r Farbe der w/~Brigen L6sungen, die gr6bere Teilehen enthalten, spektroskopiseh analysieren.

Es wurde erw~thnt (s. S. 52), dag diese L6sungen einen mehr erdbeerroten Farbton hatten. Ihr Spektrum ist dadureh ausgezeiehnet, dal3 aul3er der 1. und 3. Bande noeh eine unseharf begrenzte "r breite, dunkle Bande in Griin mit einem Maximum etwas tiber 500 m# (bel etwa 504 m/~) auftri t t . Eine Dunkel- feldkontrolle der tibers/ittigten w/~13rigen LSsungen mit ausgesehiedenen l™ zeigt, dal3 die d/innen, gewundenen fadenISrmigen Kristalle sehr stark griin leuehten. Ein ebensolehes, nur matteres griines Leuehten zeigen aueh die Sub- mikronen der erdbeerroten kolloidalen Farbl6sungen. Im tIellfeldmikroskop erseheinen die fadent5rmigen Kristalle rot. Zwisehen diesen sehr zarten, haar- f6rmigen Kristallen sind allerdings aueh noeh diekere, kompaktere Kristall- pl/tttehen zu sehen, welehe im Itellfeld gelbliehgrau erseheinen, also keine rote Farbe bœ und im Dunkœ nieht griin leuehten, sondern nur ein grelles gelbliehweil3es Lieht reflektieren.

~) Die Numerierung der Banden will ich so, wie sie bei der alkoholisehen L6sung aufgez~hlt wurden, beibehalten.

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Das grtine Leuchten der Fadenkristalle, Submikronen und grSberen Flocken von Irisblau ira Dunkelfeld kSnnte auf Fluoreszenz beruhen oder durch Ab- beugung von mehr oder weniger monochromatischem Licht zustande kommen. I m ersteren Falle ws nicht nur die Farbe, sondern auch die Fluoreszenz der grSberen Farbteilchen von der der Farbl5sung verschieden, denn die klare LSsung zeigt ja keine griine Fluoreszenz, ws bei den Krist~llchen und Submikronen keine Spur einer roten Fluoreszenz zu sehen ist. Die Differenz k5nnte darauf beruhen, dal~ der Farbstoff in den LSsungen, die ja w. o. e. niemals hohe Kon- zentration besitzen, ganz dissoziiert ist, w~hrend Submikronen und Kristalle Molektilaggregate darstellen. ~onen und Molekiile haben aber bel vielen Farb- stoffen ganz verschiedene optische Eigenscha�9

Tyndall-Licht wird an den Submikronen nnd den Fadenkristallen auf alle Fg]le abgebeugt. Genau genommen lautet also die Frage, ob das griine Streulicht ausschliel~lieh abgebeugtes Licht ist oder ob in ihm aul~erdem noch Fluoreszenzlicht vorhanden ist. Diese Alternative ist bel den gegebenen Un�87 st~tnden mit einfacheren Mitteln sehwer zu entscheiden. Die Intensit~t des griinen Leu�99 der Kristalle spricht mehr ffir Fluoreszenz. Eine bevorzugte Abbeugung von griinem Licht kSnnte nur er�9 wenn die dispersen Gebilde eine best immte Teilchengr6Be hgtten, was offensichtlich nieht der Fall ist.

Die Beziehungen zwischen den Banden und der Fluoreszenz wurde durch B e l i c h t u j a g de r F a r b l S s u n g m i t m o n o c h r o m a t i s c h e m L i c h t be - k a n n t e r W e l l e n l g n g e geklgrt. Mit der s tark fluoreszierenden alkoholischen L5sung sind die Versuche leicht auszufiihren.

L'~Bt man auf eine in einem Becherglas befindliche a l k o h o l i s c h e L S s u n g von Irisblau mit Hilfe eines Zeil]schen Monochromators von der Seite einen Kegel von monoehromatischem Licht fa]leu, so sieht man, wenn man die LSsung ira dunklen Raum von oben betrachtet , bei Einstellung eines best immten Wellen- l~tngenbezirkes des sichtbaren Lichtes ein au~erordentlieh intensives rotes Streu- licht auftreten. Dieses starke Streulicht ist bei einer Bestrahlung mit rotera bzw. orangegelbem Licht von Wellenls 590 bis 625 m/~ zu sehen und wird innerhalb dieses Bezirkes besonders intensiv bei Einstel]ung von We]lenls 608 m/~ auf die Mitre der Skala. Ungef~hr bei dieser Wellenl~tnge liegt also der Schwerpunkt der AuslSsung des Streilichtes. Ver~ndert man die Wellen]s ganz alhn~hlich, so e�9 nieht gleich an der Grenze des Bezirkes von 590 bis 625 m/~ v511iges Erl5schen. Der Effekt nir~lmt vielmehr nur allms aber sehr deutlich ab, um in Griin bel 535 m# fast vSllig und in Rot bei etwa 650 bis 660 mtt plStzlich zu erlOschen. Das Streulieht selbst hat nach einer Messung, welche ich mit dem Spektroskop von Loewe-Schumm ausgefiihrt habe, eine Wellen!s von 6104 bis 6435 �94 mit einem Maximum bei 6305 A. Mit der benutzten Apparatur konnte man aber nur sts St�9 erkennen. I m vorliegenden Fall kSnnten sich noch schw~chere Streulichteffekte aul~erhalb des Bezirkes von 6104 bis 6435 A anschliel~en.

Da das ausgestrahlte Licht hShere Wellenlange besitzt als das die Strahlung erregende, liegt zweifellos Fluoreszenz vor, und da das Maximum der Fluoreszenzerregung bei der gleichen Wellenl~nge liegt wie das Maximum

Eine optische Methode zum Nachweis von Lipoiden in der ]ebenden Zelle 57

der intensiven œ A b s o r p t i o n s b a n d œ der alkoholischen L5sung, ist diœ234 als B a n d e des f l u o r e s z e n z e r r e g e n d e n L i c h t e s zu b œ Ber Wellenl/tngenbezirk des Fluoreszenzliehtes sehl�9 sich auch bei Irisblau se wie bei anderen Oxazinfarbstoffen unmittelbar an den der st/trksten Fluoreszenz- erregung an.

Die zweite, sehw/tchere Irisblaubande ist wahrscheinlich auch als œ BaRde des fluoreszenzerregœ234 Lichtes aufzu~assen. Ihr miil3te dann einœ lokale Verst/trkung dœ Fluoreszenzerregung zugrunde liœ Bei der alkoholischen LSsung 1/tl3t sieh dies durch Monochromatorversuehe nicht entschœ weil die Stœ zu nahe bei dem Wellenl/tngenbezirk der aul~erordentlich starken Erregung der roten Strahlung liegt, und ja auch noch unterhalb dieser Stelle reeht kr/tftige rote Fluoreszenz zu sehen ist. Bei den w/tl~rigen L 6 s u n g e n dagegen, bei denen "Fluoreszenzeffekte gerade nur in unmittelbarer N/the der Maxima der Fluoreszenzerregung wahrzunehmen waren, habe ich bei Bestrahlung in der Gegend von Wellenl/tnge 590 mit ein dentliehes gelbliehes Aufleuchten gesehen, und bei ErhShung der Wellen]/tnge œ dann erst ira Bezirk des roten Lichtes ein deutlieherer (aber hier ira ganzen doeh sehr sehwacher) roter Streu]ichtkege].

Im Wellenl/tngenbereich der dri t ten Bande, welche in den w/tBrigen LSsungen bei h6herer Konzentration, wie wir sahen, recht kr/tftig ist, erfo]gt iiberhaupt keine Fluoreszenzerregung, die mit dem Ange erkennbar ist. Diese Bande ist also im wesentliehen anderer Natur. Sie entspricht den Absorptions- banden nieht Iluoreszierender t~arbstoffe. Sie kommt, wie wir sehen werden, nur dem Fa rbsa l z von Irisblau zu. Die auf S. 56 angefiihrten Befunde machten es wahrscheinlich, dag Ionen und Mo]ekiile des tr verschiedene Absorp- tion zeigen, se daB dann die eben erw/thnte Farbsalzbande als Bande des disso- ziiertœ Farbsalzes aufzufassen w/tre, w/thrend die oben erw/thntœ Bande der kolloidalen L6sungen bel 504 m# a]s Bande der l~'arbsalzmolekiile gedeutet werden miiBte.

Die Wellenl/tnge des griinen Streuliehtes ko]loidaler L6sungen des Farb- stoffes konnte ieh mit der mir zut Verfiigung stehenden Apparatur nicht be- stimmen, da das griine Leuehten zu schwaeh ist, und auch Belichtung mit monoehromatischem Licht ergibt bei diesen dispersen Systemen kein eindeutiges Resu]tat, da ja bei ihnen, wie auf S. 56 erSrtert wurde, wenn › griine Fluores- zenz wirklieh besteht, zu ihr auf alle F/tlle durch TyndalleIfekte abgebeugtes Licht hinzukommt. Etwas Lieht wird von rien dispersen Teilehen in allen Spektralbezirken abgebeugt, und infolgedessen ist auch in al]en ein schwacher Streuliehtkegel vorhanden. Die Versuehe sind auch dadureh erschwert, dag sie mit ziemlich konzentrierten LSsungen ausgefiihrt werden miissen, da sich die Kolloidteilchen bei starker Verdiinnung zu einem grogen Teil aufl6sen. In konzentrierten t~arblSsungen wird aber r e m seitlieh einfallenden Lieht zu -ciel sehon an.der Oberfl/tche absorbiert.

Nachdem wir nun die Bedeutung der Banden der Irisblau]6sungœ ermittelt haben, miissen wir uns noch liber Fo]gendes Klarheit verschafIen: Wir haben gesehen, daB wir die Spektren der g e s / t t t i g t e n L6sungen in Alkohol (oder

58 Spek

einem andern organisehen LSsungsmittel) und in Wasser wegen des umgekehrten St~trkeverh/iltnisses von Bande 1 und 3 leicht voneinander unterscheiden k5nnen. In don w~l~rigen LSsungen bleibt nun aber das St~rkeverh~ltnis der Banden bei starker Verdfinnung nieht das gleiche. Bande 3 wird in ihnen mit abnehmender Konzentrat ion nach dem L a m b e r t - B e e r s c h e n Gesetz immer schw/~cher, Bande 1 dagegen ist bei s tarker Verdiinnung relativ stark, weil, wie schon S t o k e s rand, die Fluoreszenz in s tark verdfinnten LSsungen relativ r iel st~rker ist als in konzentrierten. So sehen wir in der Tat, dal] in sehr blassen w~l~rigen LSsungen Bande 1 schlie~lich st/irker wird als Bande 3. Datait k5nnen wir aber dann ihr Spektrum nach dem St~rkeverh~ltnis der Banden allein von dem der alkoholischen LSsung nieht mehr unterscheiden. Wir mfissen in solchen F/~llen zut Unterscheidung entweder ein Kri ter ium fier die a b s o l u t viol st~rkere ~luoreszenz (und datait auch die absolut vie! st'~rkere Absorption ira Gebiet der Bande 1) bel den LSsungen in Alkohol oder den anderen organischen Medien hinzuziehen, oder wir mfissen versuchen, durch mSglichste Steigerung der Inten- sit¤ der Anf/~rbung, d. h. also der Konzentration des Farbstoffes in den �9 Phasen die Sachlage zu kl~ren.

Photometrisch ermittelte Absorptionskurven der alkoho]ischen und der w~t~rigen L5sung des Farbsto�9 sind in Anbetracht der absoluten St~trke der Fluoreszenz und datait auch der Bande des fluoreszenzerregenden Lichtes der ersteren natfirlich bei allen Konzentrat ionen des Farbstof�9 versehieden, aber auch sie kSnnen wir zur Unterscheidung der beiden Typen von F~rbungen bei Zellen nicht verwerten, weil bei der Vitalf/~rbung, auf die wir ja unsere Methoden zuschneiden mfissen, sich leider die Konzentrat ion des Farbstoffes in don angef~trbten Substanzen und die Schiehtdicke von diesen nur sehr ungenau best immen lassen.

Ffir die alkoholisehen LSsungen von ][risblau gilt die Konzentrationsregel ebenfalls, aber bel ihnen ffihrt sie in der ganzen Konzentrationsreihe nicht zu einer Umkehr des St~rkeverh~ltnisses der Banden, weil, wie wir sahen, selbst in der ges~ttigten LSsung Bande 1 immer noch weit st~rker ist als Bande 3.

Die rotgelben LSsungen der F a r b s ~ u r e v o n I r i s b l a u haben nur e ine sebr breite Absorptionsbande, welche von der Mitre des Grfin bis tief in Violett geht. Das nicht deutlieh hervortretende Maximum der Absorption liegt in den organischen LSsungsmitteln zwischen 480 und 490 m~t. Die LSsung der Farbs~ure in Xylol ~luoresziert nicht. Die LSsung in Milehs~ure zeigt dagegen eine schwache blutrote t~luoreszenz, welehe am besten ira Dunkelfeldmikroskop demonstriert werden kann. In der Kfivette vor der Nephelometerlampe ist sie schleeht zu erkennen, weil die LSsung einen ganz ~huliehen Farbton bat. Wahrscheinlieh s t ammt diese schwache Fluoreszenz nur von minimalen Mengen ~on Farbsalz her, die auch bei der starken S~urekonzentration noch erhalten bleiben. Spektro- skopisch ist zwar Farbsalz selbst bei einer Schichtdicke von 2 cm nicht nach- weisbar, es t r i t t aber aul~er der auch in Xylol sichtbaren breiten Bande in der Milchs~ure auch keine andere, neue Bande auf, welche wahrscheinlich machen wfirde, dal~ der Farbs~ure in der Milchs~ture eine spezifische Fluoreszegz zukommt. Ffir den Zell�9 ist die Frage ohne Bedeutung, da Milehs~ure in


den Zellen nie in so hoher Konzentrat ion vorkommen kann. Bei Verdiinmmg der Milchs/turel6sung mit Wasser f/tllt die Farbs/~ure w. e. in roten Flocken aus. ---

Setzt man einer L6sung des Farbsalzes S/ture zu, so versehwindet oberhalb des Umsehlagspunktes sowohl die starke Bande des fluoreszenzerregenden Lichtes des Farbsalzes, als aueh Bande 2 und 3, und es t r i t t stattdessen, wenn die Farbs/~ure noch in L6sung oder gleichm/tBig verteilt bleibt, die breite Bande der Farbs/iure auf. Oberhalb des Umsehlagspunktes sehalten S/s dement- sprœ die Fluoreszenz des Farbsalzes ganz oder wie im er6rterten Falle fast ganz aus, unterhalb desselben beeinflussen sie das Fluoreszenzph/inomen des Farbsalzes iiberhaupt nieht.

Aus den bisher mitgeteilten Daten geht hervor, daB die Untersehiede in der Fluoreszenzst/trke von Ir isblau bei Verwendung versehiedener LSsungs- mittel so s tark sind, dag sie ohne besondere Hilfsmittel subjektiv erkannt werden k6nnen. Weiterhin hat sieh ergeben, dag das Vorhandensein hydrophiler Gruppen bei den organisehen LSsungsmitteln die Fluoreszenzsteigerung nieht aussehaltete. In Alkohol und Aceton war ja die Fluoreszenz sehr stark. Ja, diese LSsungs- mittel zeigten den Effekt insofern st/trker als Ole, ais sieh in ihnen vom Farbstoff mehr auflSste. Die so gewonnenen Gesiehtspunkte muBten nun zun/iehst noeh dureh Serienversuche mit andern organischen L6sungsmitteln gekl/irt werden. Bei diœ muBten auf die Intensit/~t der Fluoreszenz einerseits und au�9 die L6sliehkeit andererseits geaehtet werden, da eine starke Verminderung der L6sliehkeit bis zu fast vSlliger Unl6sliehkeit den Fluoreszenzeffekt ebenfalls fast v611ig aussehalten k6nnte, aueh wenn an sieh die Fluoreszenz in dem betr. Medium stark ist.

Ubersehiehtet man eine w~Brige LSsung "con Irisb]au mit X y l o l und schiittelt, so geht etwas vom Farbstoff als Farbs/iure ins Xylol iiber und f/~rbt dieses ge]blich. Bel weiterem Seh/itteln scheidet sieh aber die Farbs/iure bel Beriihrung mit Wasser wieder aus. Das Xylol wird dadureh wieder farblos. I m Xylol t r i t t k e i n e Fluoreszenz auf.

Ebenso bleibt P e n t a n naeh einem entspreehenden Sehfittelversueh mit einer w/~Brigen Farbl6sung farblos, und es t r i t t in ibm keine Fluoreszenz auf. Auch hier er�9 an der Grenzsehieht Ausseheidung r6tlieher Farbs/ture- Krist~]lchen. Aueh beim Erwarmen ira Wasserbad gœ in Xylol oder Pentan, dem etwas Farbpulver zugesetzt wird, niehts vom Farbstoff in LOsung. Das Xylol und Pentan werden aueh jetzt nicht fluoreszierend.

Die Versuehe mit den beiden Kohlenwasserstoffen zeigen, daB die L 6 s l i c h - k e i t de s F a r b s a l z e s v o n I r i s b l a u in o r g a n i s c h e n S u b s t a n z e n m i t n u r l i p o p h i l e n E i g e n s e h a f t e n g l e i e h N u l l i s t .

Hier sehlieBen sieh Versuehe mit F e t t e n und C h o l e s t e r i n an, welehe vom bio]ogisehen Standpunkt besonders wiehtig sind. L/il3t man s/~urefreies frisches Sehweinefett mit der w/iBrigen L5sung von Irisblau iiberschiehtet stehen, so er�9 aueh nach viœ Tage absolut keine Anfarbung. Auch wenn man dem Fœ etwas Farbpulver zufiigt und es auf dem Objekttr~ger fiber der Flamme sehmilzt, 16st sich der Farbstoff darin nieht auf. Aueh reines neutrales G l y z e r i n : s t e a r a t bleibt in der waBrigen FarblSsung vSllig unge�9 und wird nicht fluoreszierend.

60 S p e k

In einem Glyzerinester einer niederen Fettsi~ure, und zwar in dem synthetiseh her- gestellten T r i b u t y r i n von E. M e r e k ist aueh das Farbsalz von Irisbluu etwas 16slieh. Im ganzen 16sen sieh darin zwur nur sehr geringe Mengen desselben, aber diese treten doeh sehr in Erseheinung. Es geniigt ein leiehtes Sehiitteln des fliissigen Tributyrins mit einer verdiinnten L6sung von Irisbluu in dest. Wasser, um eine deutliehe bl~tuliehe Anf~rbung des Ferres zu e�9 Mit dem Spektroskop kann man ulsbald die ersten Bunden des Farb- salzes erkennen, und vor der Nephelometerlampe und im Dunkelfeldmikroskop ist ein kr/~ftiges hellrotes Streulieht zu sehen. Allm/~hlieh nimmt nun aber das Tributyrin immer mehr F a r b - s/~ure aus der L6sung uuf und wird naeh kurzer Zeit (je naeh Konzentmtion) tieforunge bis rotgelb; uueh das sehon gel6ste FarbsMz wird im Lauf von 1--2 Stunden fust v611ig zu Farbs~ure umgebildet, so dag die Furbsalzbande 1 in einer Sehiehtdieke von 1,5 cm kaum noeh ungedeutet ist, in geringerer Sehiehtdicke uber iiberhuupt nieht mehr zu sehen ist. Das definitive Ergebnis des Sehiittelversuehœ ist dunn t i e f o r a n g e g e l b e F a r b e des T r i b u t y r i n s u n d F e h l e n de r F a r b s a l z b u n d e n bel spektroskopiseher Betmehtung von Sehiehtdieken unter 1 cm, wobei aber die restliehen kleinen Mengen des Furbsulzes geniigen, eine immer noeh z i e m l i e h k r ~ f t i g e h e l l r o t e F l u o r e s z e n z zu verursaehen. I)ieser eigenartigen Kombination von Symptomen der ungef/~rbten Glyzerinester niederer Fetts~uren kommt, wie ein Vergleieh mit den Befunden bei underen Stoffgruppen lehren wird, eine hohe Spezifit~t zu. Es ist m6glieh, dag dus Gesamtergebnis beeinfluBt ist dureh Spuren freier Butters/~ure, die stark hydrophil ist, aber mit einer solehen Beimengung freier S/~ure nmg man ja bei dem gleichen oder ~hnliehen Estern aueh in der Zelle reehnen. - - Die t~luoreszenz des aus der w~grigen Farbl6sung angef~rbten Tributyrins ist r iel st~irker uls die uuf dieselbe Weise angef~rbter pflanzlieher 0le wie 01iven61 und Bergumott61. (Beide Ole sind etwas s~urehaltig und 15sœ wahrseheinlieh nur deswegen etwus Farbsulz.)

L6st man etwas Farbpulver dureh Erw~rmen in Tributyrin, so erh~lt man voriiber- gehend ein Spektrum mit relativ seharfen Farbsalzbunden. 1)le sehr dunkle Bande 1 liegt bei 605 m#, sehar�9 abgesetzt gegen Bande 2, deren Maximum bei 590 m# liegt. Bande 3 bei 558 m/~ ist kaum erkennbar. Aueh in diesem Fall wird aber dus Farbsalz alsbald in die Farb- s~ure umgebildet.

Sehlieglieh sei noeh erw~hnt, dag die Fa�9 in Oliven61 in einigen Tagen ent- f~rbt wird.

Re ines C h o l e s t e r i n v o n E . M e r e k b l e ib t in d e n w~tBrigen L 6 s u n g e n v o n

I r i s b l a u v611ig ungef/~rbt l) . E s w i r d n i e h t f luoresz ie rend . V o n den E s t e r n

d e s C h o l e s t e r i n s w e r d e n n i e h t e i n m a l die de r n i e d e r e n Fet ts /~urœ wie

C h o l e s t e r i n b u t y r a t v o n I r i s b l a u ange f~rb t . Es t r ig t dahe r a u e h in i h n e n

a u e h b e i m E r w ~ r m e n in de r F a r b l S s u n g k e i n e F l u o r e s z e n z auf .

I n ~ t h e r , be i d e m die l i poph i l en E i g e n s e h a f t e n s t a r k i iberwiegen , abe r

doeh sehon d e u t l i e h e h y d r o p h i l e E i g e n s e h a � 9 v o r h a n d e n sind, 16sen sich

S p u r e n des F a r b s t o f f e s be i ge l inde r E r w ~ r m u n g auf . E i n e F a r b e wi rd in der

1) In geschmolzenem Cholesterin l™ sieh in der tIitze etwas von dem Furbstoff auf, wenn er als Farbpulver zugefiigt wird. Der gel6ste Farbsto�9 zeigt dann die Fluoreszenz- steigerung, dus Spektrum eine kri~�9 erste Bande und eine sehwuche zweite. Die dritte Bande ist kaum erkennbar. AuBerdem ist uber eine Verdunkelung in Blau und dem unteren Grtin zu sehen, uls ob etwas Farbsi~ure gebildet worden wi~re. Dies 1/~gt vermuten, dag dem Cholesterinpri~parat doeh Spuren einer S~ure - - etwa einer Fettsi~ure - - beigemengt waren, Welche den Farbstof�9 teilweise in die Farbs~ure iiberftihren und uuch die L6slichkeitsver- h~ltnisse beeinflussen k6nnen.


LSsung kaum erkennbar, aber die geringe Farbsto�9 geniigt schon, um eine deutliche rote Fluoreszenz auftreten zu lassen.

Lehrreich ist das Verhalten des Farbstoffes in den verschiedenen A l k o h o l e n . Die leichte LSslichkeit des Farbsto�9 in X t h y l a l k o h o l und die starke Fluoreszenz der LSsungen wurde schon beschrieben. M e t h y l a l k o h o l verh/~lt sich nicht merklich anders als Athylalkohol. Auch in Alkoholen aus der Mitre der homologen Reihe 10st sich der Farbstoff noch ziemlich gut. Es entstehen tiefhimmelblaue LSsungen mit sehr starker Fluoreszenz, Das gilt z. B. �9 P r o p y l - u n d B u t y l a l k o h o l . Es/~ndert sich auch kaum etwas, wenn man s ta t t eines ges/~ttigten Alkohols einen mit einer d o p p e l t e n B i n d u n g verwendet. I n A l l y l a l k o h o l ist die Farbintensit/~t und Fluoreszenzst/~rke der ges/~ttigten L5sung so, wie in Propylalkohol. Beim O c t y l a l k o h o l , bei dem wir nun schon eine lange lipophile Ket te mit der einen hydrophilen I-Iydroxylgrnppe vor uns haben, ist die LSsliehkeit von Irisblau schon betr/~chtlich herabgesetzt. Selbst wenn man nur Spuren vom Farbpulver dem Alkohol zusetzt, 15sen sie sich in der K/~lte nur teilweise und nur langsam auf. Beim Erw~rmen erh/~lt man aber noch schSne himmelblaue LSsungen. Auch sie zeigen die starke Fluoreszenz.

Vermehrt man nun andererseits bei schon gui ausgepr/~gter Lipophilie die hydrophilen Eigenseha�9 des L8sungsmittels dadurch, da6 man einen mehr- wertigen Alkohol, etwa G l y z e r i n , verwendet, so ergibt sieh eine auffgllige Steigerung der LSslichkeit des Farbsalzes. In kaum einem L8sungsmittel habe ich so dunkelblaue LSsungen von Irisblau erhalten, wie in Glyzerin.

Die Fluoreszenz der L5sung des Farbstoffes in Glyzerin ist wesentlich schw/~cher als die aller bisher genannten Alkohole. W/~hrend der Fluoreszenzkegel bei diesen fiir unser Auge flammendhellrot erscheint, ist der von der Glyzerin- 15sung nur dunkelro0. Es liegt nahe, aus diesem Befund zu folgern, dal~ es die Vermehrung der hydrophilen Gruppen ist, welche den starken Abfall der Fluores- zenzst/~rke herbeifiihrt. Aber diese Auslegung ist nieht richtig. Wir kOnnen n/~mlieh auch in L5sungsmitteln eine sehr starke Fluoreszenz erhalten, die noch st/~rkere hydrophile Eigensehaften haben als Glyzerin, s o f e r n sie n u r w a s s e r - � 9 s ind . Ein gutes Beispiel hier�9 ist der s tark hydrophile Methylalkohol, in dem der Farbstoff bei Abwesenheit von Wasser w. e. auch sehr stark fluoresziert. Ffigt man aber dem gef/~rbten Methylalkohol Wasser zu, so erfolgt sofort ein au6erordentlicher Abfall der Fluoreszenz. Auch alle iibrigen organischen L8sungsmittel des Farbstoffes zeigen, so�9 sie mit Wasser mischbar sind, das gleiche Verhalten. t~ei schwachem Zusatz von Wasser wird die vorher hellrote Fluoreszenz dunkelrot, um dann bei weiterem Zusatz noeh riel st/~rker zuriiek- zugehen. Da aber das k/~ufliche Glyzerin ca. 12 ~o Wasser enth/~lt, ist jedenfalls dieses daran schuld, da6 die Farbl•sungen in ihm schw/~cher fluoreszieren als in den iibrigen Alkoholen.

D ie s t a r k e l ~ l u o r e s z e n z v o n I r i s b l a u b l e i b t n u r in w a s s e r - � 9 M e d i e n , in k o m p l i z i e r t e r e n S y s t e m e n , wie K o l l o i d e n n u r an w a s s e r f r e i e n O r t e n e r h a l t e n .

6~ Spek

Von manchen beschr~nkt wasserl6slichen organischen LSsungsmitteln, in denen der Farbstoff stark fluoresziert, wie etwa von Oetylalkohol, lassen sieh dureh Schiitteln in Wasser leieht Emulsionen mikroskopiseher TI6pfehen herstellen. Die Tr6pfehen des vorher angef/~rbten Alkohols behalten ihre starke rote Fluoreszenz ira w~Brigen Dispersionsmittel ann/s unver/~ndert bel. Gelingt es, von diesem oder andern organischen L6sungsmitteln naeh Anf/s noeh feinere, kolloidale Aufschwemmungen herzustellen, so ergibt sich, dag auch die Wolken kolloiddispe�9 gefhrbter Teilchen ira Wasser se~r stark ftuores- zierend b]eiben. Teilchen kolloider Gr6Benordnung bieten also, sofern sie genfigend lipophile Gruppen besitzen, dem Farbstoff noeh Schutz genug vor dem Wasser, so dag seine starke ]~~luoreszenz erhalten bleibt. Nur die ]ipophilen Gruppen kSnnen in diesen Systemen die wasserfreien Orte darstellen, in denen der Farbstoff mit voller St/~rke fluoresziert. An die hydrophilen Gruppen wird sich im w/~grigen Dispersionsmittel Wasser anlagern und den Fluoreszenzeffekt der Farbteilehen, �9 diese an die gleiehen Gruppen herantreten so]lten, weitgehend aussehalten. Dieser Befund ist wiehtig, da ja alle Lipoide (im engeren Sinne) in der tierisehen Zelle als Kolloide mit w~13rigem Dispersionsmittel vorliegen, und da uns mit ihm wieder ein wertvolles Unterseheidungsmittel in die Hand gegeben ist: Sind bei einer organisehœ Substanz die hydrophilen Eigen- sehaften so stark, dag sie sieh in Wasser - - etwa so, wie niedere Alkohole - - leieht molekular auflSst, dann wird in der Zelle infolge der starken Verdfinnung im w/~Brigen Dispersionsmittel, mit der dort zu reehnen ist, diese Substanz keine Fluoreszenzsteigerung von Irisblau hervorrufen k6nnen. Wird aber die Zahl der lipophilen Gruppen vergr6flert, ohne daB gleiehzeitig aueh die der hydrophilœ Gruppen zunimmt, dann wird sehon dureh Vergr6Berung der Molekfile die Chance immer grSger, daB die Farbteilehœ sieh an wasserfreie Orte anhgern kSnnen, und wenn nun infolge der verminderten WasserISstiehkeit keine mole- kulare Aufl6sung mehr mSglieh ist, sondern im Wasser h5ehstens Kolloidteilehen gebildet werden, wird fiir die ]?arbteilchen noeh bessere Gelegenheit gesehaffen sein, trotz des w~Brigen Dispersiensmittels, an und zwfsehen den lipophilen Gruppen die volle Fluoreszenzst~rke zu entwiekeln. Dag andererseits die Molekfile dieser Substanzen doeh aueh hydrophile Gruppen besitzen mfissen, sei aueh in diesem Zusammenhang noehmals erw/~hnt. D[ese hydrophilen Gruppen beeinflussen die LSsliehkeitsverh~ltnisse des Gesamtmolekiils. Erst dureh sie wird eine geniigende L6sliehkeit vom Irisblau in der Substanz erreieht.

Aus allen bisherigen ~'eststellungen ergibt sich, daB be i E i n f f i h r u n g von I r i s b l a u in die l e b e n d e Ze l l e N e u t r a l f e t t e h 6 h e r e r F e t t s / ~ u r e n , r e i n e s C h o l e s t e r i n , C h o l e s t e r i n e s t e r u n d t ~ e t t s s k e i n e ~Huores- zenz z e i g e n w e r d e n , d a g a l l e m o l e k u l a r in W a s s e r 16s l i ehen or- g a n i s e h e n S u b s t a n z e n w e g e n de r V e r d i i n n u n g in de r Ze l le k e i n e s t ~ r k e r e F l u o r e s z e n z z e i g e n k S n n e n , u n d dal3 ~ueh in a l l e n s t a r k h y d r a t i s i e r b a r e n K o l l o i d e n wie E i w e i B k S r p e r n u n d K o h l e h y d r a t e n bei G e g e n w a r t -con W a s s e r n u r œ g an z s e h w a c h e F l u o r e s z e n z z u s t a n d e k o m m e n w i r d , d a g d a g e g e n d ie k o l l o i d d i s p e r s e n L i p o i d e m i t l i p o p h i l e n @ h y d r o p h i l e n E i g e n s e h a f t e n d e m F a r b s t o f f je n a e h


dem M e n g e n v e r h g l t n i s von l i p o p h i l e n und hydro loh i len Grulopen mehr oder weniger gu te G e l e g e n h e i t b i e t e n werden , seine F luo re s - zenz an w a s s e r f r e i e n Or ten vol l zu e n t l a l t e n , aueh wenn sie in e in- wgBriges D i s p e r s i o n s m i t t e l e i n g e b e t t e t sind. Zur Priifung dieser Vorstellungen wurde noch eine groBe Zahl von Modellversuehen an Lipoiden, in der Hauptsache solchen, die ira Tierk5rl0er vorkommen, an reinen EiweilL kSrpern, Kohlehydraten und Seifen ausgefiihrt.

Von L i p o i d e u wurden auBer den schon oben genannten untersucht: L e e i t h i n aus H f i h n œ L e e i t h i n aus S o j a b o h n e n (beide ,con E. Merck), ein L e b e r p h o s p h a t i d , ein I™ S p h i n g o m y e l i n , C e re b ron und ein anderes Cerebros id . Die Versuehe wurden zuerst in der Weise ausgeftihrt, dal3 etwas von den Substanzen in ein Sehglehen gebraeht und wie in einem Vitalfgrbungsversuch mit einer wgl3rigen LSsung von Irisblau iibergossen wurde. Die Sch/tlchen wurden zugedeckt im Eisschrank gehalten. Sobald sieh �9 Stunden oder Tagen eine Anfgrbung zeigte, wurde versueht, -con dœ Broeken oder Trop�9 ein S10ektrum zu entwer�9 und die Stgrke ihrer l~'luoreszenz subjektiv ira Dunkelfeld zu erlnitteln. Es zeigte sieh aber bald, dal3 einem bei diesem Verfahren die beste BeobaehtungsmSglichkeit entgeht. I)ie Leeithine, das Kephalin und das untersuehte Leberphosphatid nehmen ngmlich aus der wgl3rigen FarblSsung sofort Wasser auf, und es kommt in einiger Entfernung von der Oberfl~che der Lipoidmasse zu einer Ausscheidung von Unmengen feinster Tr6p�9 welehe eine starke T1iibung hervorrufen, ira Dunkelfeld dureh ihr weil3es Leuehten die Fluoreszenz verdeeken und aueh die Spektren dureh diffuse Liehtablenkung dunkel und unseharf maehen. In die festen Broeken von Sphingomyelin, welehe waehsartige Besehaffenheit haben, und in die sehr diehten stark liehtbreehenden KSrnehen der reinen Cere- brosidsubstanzen, die beide in der K~lte nieh~ au•quellen, werden die groBen Farbteilehen veto Irisblau beim besehriebenen Ver�9 kaum aufgenommen. Es erfolgt nur eine blasse Aufgrbung, die wahrseheinlieh nur auf oberfl/iehlieher Adsorption des Farbstoffes beruht. Nun is~ aber bekanjqt, daB viele Lipoid- substanzen bei Beriihrung mit Wasser phan~astiseh gestaltete Myelinsehlguehe bilden. Bei Lecithin, Kephalin und dem Leberphosphatid entstehen diese sofort bei Bertihrung der reinen Substanz mit Wasser, bei Sphingomyelin kommt es nur bei Erwgrmung der Substanz in Wasser zu mgBiger Myelinbi-ldung, und bei den Cerebrosiden erfolgt sie ebenfalls erst beim Erwgrmen, wird aber dann ganz besonders stark, stgrker als bei irgendeinem der andern Lipoide. Die h'iseh gebildeten Myelinsehlguehe sind glasklar nnd liegen bel den viskos-fltissigen Lilooiden (Leeithin, KephMin, Leberphosphatid) aul3erhalb der obert erwghnten Triibungszone. L/tBt man aber die Myelinbildung statt in Wasser in einer ge- sgttigten wgBrigen L6sung vert Irisblau erfolgen, dann wird mit dem Quellungs- wasser aueh der Farbstoff gleieh in das Lipoid eingelagert. Beim Leeithi!~, Kephalin und dem Leberphosphatid wird auf diese Weisœ sehon in wenigen Minuten eine Anfgrbung sgmtlieher Myelinsehlguehœ erreieht. Betraehtet man dann das Prgparat dieser Lipoide gleieh naeh dem Einsetzen in die Farbl6sung im Dunkelfeldmikroskop, dann bietet sieh einem sehon naeh 10 Minuten ein

64 Spek

Bild von einzigartiger Sch6nheit dar: Da das Bild der Myelinschls von keinerlei Trfibungseffekten gest6rt, und die Anfs schon ausreichend ist, e r s t r a h l e n a l l e S c h l ~ u c h e u n d K u g e l n in e i n e m p r a c h t v o l l e n s i e g e l l a c k r 0 t e n F l u o r e s z e n z l i c h t v o n e n o r m e r I n t e n s i t s ])er Farbstoff mul~ also in diesen Lipoiden vom Wasser irgendwie geschfitzt an oder in den lipophilen Gruppen sitzen.

Nach l~ngerem Liegen in der ws l~arbl6sung nimmt die rote Fluores- zenz der Myelingebilde wieder ab. Da gleichzeitig in der umgebenden FarblSsung eine immer sts werdende l~luoreszenz auftr i t t , die in kleinen Tropfen schon der der Myelinschli~uche selbst nahekommt, beruht die Abnahme des Effektes in den Myelinformationen auf einem Ausdiffundieren des gef/~rbten Lipoides in die umgebende LSsung.

Beim S p h in g o m y e 1 in zeigen von den in der W~rme entstandenen Myelin- schls die hohl zu sein scheinen, die etwas unter der Oberfls des Gesamt- prs gelegenen das starke rote Leuchten. Rie ara st~rksten gequollenen i~uBersten Schl~uche leuchten nicht mehr oder nur sehr schwach.

Bel den C e r e b r o s i d e n erfolgt in der Wi~rme gleich eine sehr starke Ver- quellung und der Farbstoff kann dann bel ~liesen Lipoiden o�9 nicht mehr an die lipophilen Stellen der Substanz heran. ]�9 M y e l i n s c h l i ~ u c h e f i~rben s ich in de r v i o l e t t e n F a r b e de r ws F a r b l S s u n g an und ira Dunkelfeld ist auch nur diese und kaum etwas -con der roten ~luoreszenz zu sehen. Sollte es auf andere Weise gelingen, nur ganz schwach hydratisierte Myelinschl/iuche von den Cerebrosiden herzustellen, miiBte die Fluoreszenz in Irisblau nochmals fiberl0riift werden. Bis auf weiteres roui3 die R e a k t i o n be l d e n C e r e b r o s i d e n a ls n e g a t i v bezeichnet werden, und es ist im Sinne des auf S. 61ff. Gesagten sehr interessant, da6 es gerade diese eigenartigen Lipoide, die einen sehr hydrophilen Baustein, n~mlich die Galaktose enthalten, sind, bei denen die Fluoreszenzsteigerung nicht mehr gelingt, wenn Wasser an- wesend ist.

Dal~ die starke Steigerung der l~luoreszenz des Irisblau in den Phosphatiden gerade in den ~r163 so sch6n zu sehen ist, ist besonders bemerkenswert, weil sie hier mit Sicherheit bel A~lwese~lheit -;on vie1 Wasser in dem System erfolgt. In den Phosphatiden bleibt demnach das starke rote Leuchten se, wie wir es theoretisch voraussahen, auch in Anwesenheit von riel Wasser erhalten. Bas ist es, was die Reaktion frit best immte Gruppen von Lipoiden spezifisch macht.

Man dari es keineswegs iiir selbstversti~ndlich halten, dal~ man das rote Fluoreszenzlicht in den ~r welche eine Steigerung der ~luoreszenz bewirken, nach Anf~rbung ira Dunkelfeld so s tark sieht. Vergleiche mit andern fluoreszierenden Farbstof�9 lehren n~mlich, daB fiir gewShnlich schon bel blasser Anf~rbung die wirkliche Farbe des Objektes (welche man ira Dunkel�9 auch sieht), schws Fluoreszenzeffekte im ]�9 vSllig oder �9 v611ig fiberdeckt. Es gehSrt schon eine enorme Fluoreszenz dazu, dal~ das Fluores-

1) Kephalin und das Leberphosphatid, welche beide den F]uoreszenzeffekt besonde�9 sch6n zeigen, wurden zu dem Versuch zugeschmolzenen R6hrchen �9 entnommen.


zenzlicht naeh Anf~trbung von Tropfen oder sonstigen Gebilden mikroskopiseher Dimension ira Dunkelfeld mit soleher St/~rke alles iiberstrahlt.

Auch bei langer Anf~rbung mit Irisblau wird bei don Phosphatiden der Farbton niemals so tief, daB er die rote Fluoreszenz verdeekt. Im durchfallenden Lieht erscheinen die angef~rbten Pr~parate nur blaBblau. Die schwaehe Anf• barkeit der Lil0oide ira Farbstoff ist ein Umstand, der fiir das Entstehen des einzigartigen Dunkelfeldbildes besonders giinstig ist und die S10ezifits der Reaktion mitbodingt. Alles in allem ergibt sieh aus dem Gesagten, dal3 die Dunkel- Ieldkontrolle uns ein bequemes Mittel in die I-Iand gibt, die uns interessierenden Substanzen, in denen der Farbsto�9 stark fluoresziert, gegen die, in denen er nur schwach fluoresziert, praktisch abzugrenzen, t rotzdem der Unterseheidung nur ein relativer Unterschied zugrunde liegt : Kolloide, in denen das Irisblau so, wie bel don Phosphatiden an den lipol0hilen Gruppen sitzt, zeigen trotz ihrer Anf~rbung ira Dunkelfeld ein starkes rotes Fluoreszenzlieht, I™ dagegen, in denen der Farbstoff im Wasser oder an den hydratisierten hydrophilen Gruppen sitzt, zeigen bei geniigender Anf• ira Dunkelfeld die blauviolette Farbe der w~6rigen FarblSsung, gegen die das schwache rote Fluoreszenzlicht nicht (oder kaum) erkennbar ist.

Die oben erwš sehr sehwache (wahrscheinlich nur oberfl• Anf~rbung der nicht gequollenen Sphingomyelinbroeken bewirkt schon eine gegeniiber Wasser sehr versti~rkte Fluoreszenz des Farbstoffes. Dieser Fall dfir�9 aber nur von theoretischem Interesse sein. Gar nicht hydratisiertes Sphingomyelin wird wohl in der Zelle gar nicht vorkommen.

Will man von den angef~rbten Lipoiden ein Spektrum erhalten, dann �9 man 'ein Stadium abpassen, auf dem die Anf/~rbung mSgliehst stark und eine etwaige Triibung noch mSgliehst sehwaeh ist. Bei den sich i~l Wasser sehr leieht triibenden z~hfl5ssigen Phosphatiden kann man aueh so verfahren, daB man der wasserfreien Substanz etwas Farbpulver beimengt und durch leichtes Erw~rmen auf dem Objekttr~ger zur LSsung bringt. Es t r i t t sofort enorme Fluoreszenz auf, und die Pr~parate geben vorziigliehe, klare Spektren. Zu unserer obigen Beweisffihrung (vg]. S. 61ff.) wfirde dieser Versuch allerdings nicht ausreiehen. In wasser f re iem Zustand geben ja auch noeh andere organische LSsungsmittel dio starke F]uoreszenz. Bei Gegenwart von Wasser wird diese erst ffir die Phosphatide zu einer spezifischen ,,l%eaktion". - - Aueh von den schwach angef~rbten, nieht gequollenen Sphingomyelinbroeken konnte ein Spektrum erhalten werden.

In allen Lipoiden, bei denen eine Anf~rbung gelang, zeigte Irisblau ein sehr /~hnliches Spektrum, welehes dureh eine stark hervortretende, sehr dunkle erste Bande (Bande des fluoreszenzerregenden Liehtes) und dureh eine aueh in der Sehiehtdicke dieker mikroskopiseher Pr/~parate gerade nur angedeutete dritte Bande (Bande des Farbsalzes) eharakterisiert war. Die zweite Bande ist mehr oder woniger scharf erkennbar. An ihrer Stelle ist aber wenigstens eine diffuse Verdunkelung immer vorhanden. Dio vierte Bande fehlt stets ganz. Die Ver- schiebung der Banden nach Rot im Sinne der K u n d t s c h e n Regel ist nieht bei allen Lipoiden gleieh stark. Tabelle 1 gibt hierfiber Auskunft.

Pr0toplasma. XXXVII 5

66 Spek

T a b e l l e 1

Banden von Irisblau in Lipoiden

Sphingomyelin C h o 1 e s t e r i ni) Banden in Leeithin angef~rbte Farbpulver

in geschmolzenem Myelinschlauehe Cholesterin gelSst

Sehr kr~ftig 610---620 Sehr kriftig 611--619 Krhftig 615--623 Bande 1 Maximum 614 Maximum 614 Maximum 619--620

Gut erkennbar 590--600 Deutlieh 590--600 Bande 2 Maximum ca. 595 Maximum 601

Bande 3 Blal~, schw~eher als 2 Sehr bl~i~ Kaum erkennbar Maximum ca. 563 Maximum ca. 563 Maximum 571

Bei Riickschliissen von diesen Daten auf die Lage der gleiehen Banden in angefirbten Zellen mult bedacht werden, dal~ in den Zellen auch Gemische mehrerer Lipoide ~orliegen kSnnen.

Die Schw•che der dritten Bande erklart sieh zum Teil schon aus der be- grenzten LSsliehkeit des Farbsto�9 in den Lipoiden. Wird die Bande nur dureh Farbstoffionen erzeugt, dann wiire ihre Schwi~che aber aueh dadurch erkl~rlieh, daB an den wasser�9 Orten die Dissoziation geringer ist:

Bei sehr geringer Schichtdicke oder bei schwacher Anfirbnng zeigt das Spektrum der mit Irisblau ge�9 Lipoide nur noch eine Bande, und zwar ist es die Bande des fluoreszenzerregenden Lichtes. Selbst bei dfinnsten mikroskopischen Pr~paraten ist aber diese Bande bel den Phosphatiden immer noch sehr seharf. H i e r d u r c h u n d d u r c h die h e l l b l a u e F a r b e l a s s e n s ich die a n g e f a r b t e n P h o s p h a t i d e v o n T r o p f e n v o n F e t t e n n i e d e r e r F e t t s a u r e n , d ie bei o r a n g e g e l b e r A n i i r b u n g im D u n k e l f e l d a u c h e i n - - z u m m i n d e s t e n m i t t e l s t a r k e s - - r o t e s L e u e h t e n z e i g e n k S n n e n (vgl. die Daten fiber das Tributyrin auf S. 60), l e i e h t u n t e r s c h e i d e n .

Das Gegenstiiek za den Modellversuchen mit Lipoiden stellen die entsprechenden Versuche mit Eiweifisubstanzen und Kohlehydraten dar. Von Eiwei~kSrpern und ihren Bausteinen wurden untersucht: Einige P r o t a m i n e , H i s t o n s u l f a t , E i e r a l b u m i n , Case in , e in G l i a d i n , ein Eiweil~ aus K f i r b i s s a m e n u n d G e l a t i n e .

Vielfaeh ist die Fi~rbbarkeit der denaturierten Eiwei~kSrper in Irisblau so wie aueh in andern sauren Farbsto�9 nur gering. Wenn man auch in mikro- skopisehen Dimensionen gut erkennbare Farbst i rke erhalten will, rouit unter Umst inden einige Tage gef~rbt werden. Geht man auf eine spektroskopische Unterseheidung aus, dann kommt es ira Sinne des auf S. 58 Gesagten auf die Erreichung hSherer Konzentrationen an, ffir die Dunkelfelddiagnose genfigen auch die blassesten Firbungen. Die starken Fluoreszenze�9 in den Myelin-

i) Wie auf S. 60 mitgeteilt wurde, war in diesem Cholesterin auch eine Farbsiure- bande erkennbar.


formationen der Phosphatide sind ja auch zu sehen/ wenn die Anf~rbung so blal] ist, dal] sie im Hell�9 kaum erkannt werden kann.

Die ersten schwachen Anf/~rbungen erscheinen auch bei den Eiweil]kSrpern blau, weil bei ihnen die Bande 3 noch riel schw/icher ist als Bande 1 und 2. Bande 1 und 2 sind hier so, wie in verdiinnten w~~rigen L5sungen relativ s tark (vgl. S. 58). Mit zunehmender F~rbung wird Bande 3 immer st~rker und gleichzeitig n immt die St/~rke von 1 und 2 relativ immer mehr ab, so dal] dann sebliel]lieh ira Gegensatz zum Verhalten des Farbstoffes in Lipoiden die Bande 3 sehr dunkel wird und die ersten Banden an St/~rke weit ~ibertrif�9 Da die dritte Bande in Grfin liegt, wird der ~'arbton immer r5ter, im ganzen also violett oder rotviolett. ]~ei dem Eiweil3 aus Kfirbissamen, welehes sieh von allen Eiweil3kSrpern ara rasehesten und st~rksten anf~trbte, l~il]t sich das Gesagte ara leiehtesten demonstrieren. Schon naeb einer halben Stunde ist der ailfangs auch hier blaue Farbton oin tiefes Rotviolett , ein F~rbton, der bei Lipoiden ~iberhaupt nicht vorkommt und aueh riel sat ter ist als alle die Lipoidfarbungen, und das St~rkenverh~ltnis der Bande 3 und 1 ist, verglichen mit dem bei den Lipoiden, schon umgekehrt. ]~ei dem aueh noeh relativ gut �9 Uistonsulfat vollzieht sieh die Versehiebung des St~rkeverhs der Banden in etwa 48 Stunden. L~l]t sieh bei einer Anf~rbung eine solehe ~arbst~irke und mit ihr ein rotvioletter Farbton und das umgekehrte St~rkeverh/~ltnis erreichen, dann ist datait auch schon bewiesen, dal~ eine Eiweil]f~rbung oder eine F~rbung einer andern hydrophilen Substanz vorliegen mul]. Blasse noeh blaue F~rbungen und ihr Spektrum besagen ffir sieh allein noch niehts. Diese zeigen nur dann ein Lipoid, und zwar ein Phosphatid an, wenn wir aueh eine hohe absolute St~trke der Fluoreszenz naehweisen kSnnen. Dal] aber die St~rke der FIuoreszenz bei allen Graden der F~rbstoffspeicherung in Eiweil]k~rpern, bel sehw~chen, wie bel starken ~ueh absolut viol sehw~eher ist als bei den Lipoiden, kann ara leichtesten wieder dureh die Dunkelfeldkontrolle demonstriert werden. E i n o p t i s c h e r E f � 9 d e r s i eh a u e h n u r e i n i g e r m a l ] e n m i t d e m s i e g e l l a e k r o t e n L e u e h t e n de r a n g e f ~ r b t e n P h o s p h a t i d e v e r g l e i e h e n l ie l ]e , g i b t es be i k e i n e m e i n z i g e n E i w e i l ] k S r p e r . Ja in Eiwei~prs welehe ira Wasser nur oin klein wenig aufquellen, ist ira Dunkel_~eld sogar iiberhaupt kein rotes Streulieht mehr zu sehen. Wenn eine Farbe an ihnen zu sehen ist, ist es nur die Eigenfarbe des Farbstoffes. Eiweil]pr~parate, welehe beim Einiegen in Wasser dehydriert bleiben, d. h. keine Quellungoder LSsung erleiden, kSnnen, wenn sie don Farbstoff aufnehmen, im Dunkelfeld einen sehwaehen roten Sehimmer zeigen.

Dal] bei einer Einlagerung des Farbstoffes in sehr wasserarme Eiweil]- kSrper, w[e auoh naeh don Ausfiihrungen von S. 61 erwartet werden mul], ein gegeniiber Wasser verst~rktes rotes Leuehten auftreten kann, kann aueh so demonstriert werden, dal] man Gelatinefolien in der l~arblSsung quellen und sich anf~rben 1/~~t und sie dann naehhsr wieder trocknet. Die Anf~rbung wird nieht intensiv, ist aber ffir den Versueh ausreiehend. Die friseh gef~rbten Folien zeigen in Wasser nur ein ~ul]erst schwaehes rStliehes Leuchten. L~l]t man sie nun eintroeknen, bleibt der Farbstoff in der feinen Dispersit~t, in der er adsorbiert war, verteilt, und wird in ein wasser�9 Medium fibergefiihrt. Es t r i t t eine

5*

68 Spek

gegeniiber w~6rigœ Farbl5sungen deutlich versti~rkte Fluoreszenz auf, die aber freilich weit unter der der ange�9 Phosphatide zuriickbleibt. Die Befunde an den dehydrierten oder wasserfrei gem~chten Eiweil3kSrpern zeigen, d~13 man bel einer Ubertragung unserer auf die Verh~ltnisse ira lebenden Protoplasma zugeschnittenen Unterscheidungsverf~hren ~uf Schnitte von �9 MateriM etwas vorsiehtig sein mul3. Aueh wasser�9 Kutikulen von Eiwei•kSrpern kSnnten sich wie die getroeknete Gelatine verhMten. Ira lebenden Protoplasma ~ber diirfte sich kaum jemMs ein Eiweil3kSrper in einem physikMischen Zust~nd befinden, der sich auch nur einigermM3en mit dem von denaturierten, entl~denen und z .T . gar D_icht mehr hydratisierbaren Eiwei~prs vergleichen liei~e. D~s lebende Protoplasm~ kann bel seinem enormen WassergehMte kaum ~ndere wasserfreie Stellen aufweisen Ms die lipophilen Gruppen beschr~tnkt hydratisier- barer Lipoide.

F r i s e h e s E i w e i B u n d � 9 D o t t e r von Vogeleiern (verwandt wurden Zwerghuhneier) �9 sieh in Irisblau griinlichblau an. Das mit dem Farbsto�9 versetzte k]are ,,EiweiI~" zeigt ira Dunkelfelds einem hohen GehMt an Phosphatiden entsprechend eine sehr starke rote Fluoreszenz. Bei Dotter- pri~paraten beeintr~tchtigt die starke Reflexion von wei]3em Licht an den Grenz- fli~ehen der zahllosen TrSp�9 natiirlich den Fluoreszenzeffekt stark. Man kann dies dadurch bis zu einem gewissen Grade ~usschalten, ~lM3 man das l~r~ - parat etwas eindunsten l~fit, bis die TrSpfchen zusammenzuflieften beginnen. Dann wird aueh erst schSn erkennbar, wie sturk viele Tropfen ira Bot ter rot leuchten. Eiweil3 und Dotter (durch Eindunsten etwas gekl~trt) zeigen das typische reine Lipoidspektrum mit sehr scharfer und dunkler Bande 1 und minimMer Bande 3. Beim Dotter ist die Bande 1 noch kri~ftiger Ms beim ,,Eiweil~". In beiden geht der ~~arbstoff nach dem Spektrum zu schliel3en ganz in die Lipoide.

Auch in sehr konzentrierten LSsungen von R o h r z u c k e r fluoresziert Irisblau nicht st~trker als in Wasser. Auch angef~rbte AgargMler te zeigt keine Steigerung der Flnoreszenz.

In hochkonzentrierten Solen oder Gelen von S e i f e n h S h e r e r F e t t - s i~uren erfolgt bei Zusatz von Irisblau eine mit telstarke Steigerung der Fluores- zenz des Farbstoffes. Tropfen der konzentrierten Sole zeigen ira Dunke]feld eiu schSnes rotes Leuehten. Ffigt man aber dest. Wasser zu, so erlischt die Fluores. zenz unter den Augen des Beobaehters in kiirzester Zeit �9 vollst~ndig. Nach wenigen Sekunden ist sie wie �9 In wasserarmen Seifen findet Mso der Farbstoff noeh genfigend wasserfreie Stellen, an denen er eine starke Fluores- zenz ent�9 kann. Bei freiem Zutri t t von Wasser werden dagegen die Sei�9 teilchen so sehr hydratisiert , dM3 zum Unterschied vom VerhMten der Phos- phatide eine starke Fluoreszenz nirgend mehr erfolgen kann. - - Die anfi~ngiich hellblaue Fs konzentrierter Seifensole wird sehr bMd rot. Dies beruht auf einer Ausseheidung von roten ]?locken der Farbs~ure. Aueh in LSsungen von N ~ t r i u m b u t y r a t wird der Farbstof �9 alsbald in die Farbs~ure iibergeffihrt.

Zum Schlul3 unserer Betrachtungen liber Modellfs seien hier noch einige erggnzende Daten liber das VerhMten von Irisblau zu organischen S~uren mitgeteilt.

Eine optische Methode zum ~achweis von Lipoiden in der lebenden Zelle 69

Von Interesse sind die LSslichkeitsverhaltnisse. In hShere Fettsauren tr i t t der als Farbsalz dargebotene Farbstoff aus der wal~rigen LSsung n i e h t liber. Brocken von P a ] m i t i n s a u r e bleiben z. B. in der wal~rigen FarblSsung vSllig ungef/irbt. Die FarblSsung bleibt blauviolett. Nur ara Boden findet man winzige F15ckehen der Farbsaure, die wohl bei Berfihrung des Farbstoffes mit der Palmitinsaure entstanden und dann zu Boden sanken. In geschmolzener Palmitinsaure 15st sieh etwas Farbpulver mit rStlichgelber Farbe. In konzen- trierteren niederen Fettsauren wie B u t t er s a ur e ist die Farbsaure gut lSslich, ebenso in M i l e h s a u r e . Wird Phosphatiden, die so viel freie Saure enthalten, dag sie an sieh ausreicht, den Farbstoff in die Farbsaure zu fiberfiihren, der l%rbstoff als Farbsalz aus waSriger LSsung geboten, so geht dieses zunachst als solehes quantitativ an das Phosphatid selbst. Erst ganz allm/~hlich erfolgt teilweise Umbildung in die rote Farbsaure. Tritt aus so œ System eine wasserlSsliehe Saure in die wal~rige Umgebung iiber, so flockt sic hier den Farb- stoff sofort in Form der Farbsaure aus. Ist also in der waBrigen Phase des l�87 - plasmas eine Saure vorhanden, so wird dies die Irisblaufarbung iiber dem Um- sehlagspunkt anzeigen. Liegen die Flocken der Farbsaure dicht genug, dann kann man von ihnen, auch wenn sie nur mikroskopische Dimensionen haben, ein Spektrum erhalten. Bei r5tlichen Ausflockungen des Farbstoffes muB nach MSgliehkeit kontrolliert werden, ob es sich nicht um eine Ausscheidung von Krista]len oder Ultrateilchen des Farbsalzes handelt. Wie oben erwahnt wurde, haben diese ein Absorptionsmaximum bel 504 m/~, wahrend das der ]?arbsaure bei 480 490 mtt liegt.

Weitere Beispiele fiir das Verhalten des Farbstoffes in sauer reagierenden organischen Substanzen, welche in Zellen vorkommen kSnnen, finden sich auf S. 71.

~ber das V e r h a l t e n l e b š Ze l l en u n d Gewebe zu I r i s b l a u ]aftt sich zurzeit folgendes sagen: Irisblau dringt in viele lebende Zellen und Gewebe leicht ein und farbt sic in kurzer Zeit an, so dag sich die Ausfiihrung der Prfifung auf Phosphatide bei ihnen aul~erst einfach gestaltetl).

Die Anfarbung erfolgt sowohl in saurera NaC1, als auch in alkalisehen RingerlSsungen. Die gefarbten Zellen sind gegen helle Beleuehtung empfindlich. Im Dunkeln vertragen sic den Farbstoff gut. In fast allen Fallen (eine Ausnahme s. weit. unten) b]ieb der Farbton der angefarbten Zellen ein blasses Griinlichblau, nur naeh sehr langer (mehrt~giger) Anfarbung kSnnen dickere Gewebe einen Stich in Violett zeigen. Sehon diese blal3-grfinlichblau bleibende Farbe machte

~) Kolloidale oder noeh gr~bere Farbstoffteilchen dringen in die lebenden Zellen nicht ein. Fiigt man Tropfen der kolloidalen L~sung von Irisblau den sa]zhaltigen Kultur- medien zu, so bleiben die Farbteilchen kolloidal oder werden noch gr5ber, und es erfolgt so gu~ wie gar keine AnfArbung. Kocht man aber die kolloidale L5sung mit destilliertem Wasser auf, so lOsen sich die grSberen Teilchen zuln Teil auf. Diese L5sungen f~rben d~nn Zellen an. Kolloidteilchen des Farbstoffes lagern sich in grol]en Mengen auf den Grenzfl~chen der Zellen ab und stSren das Dunkelfe]dbild g~nz betr~Lchtlich. Die kolloidalen L0sungen enthalten Zus~tze, welche auf die Zellen, wie Zellinjektionen zeigten, ungfinstig wirken. Die Verwendung der ko]loidalen L~sungen bietet also dem Cytologen keinerlei Vorteile.

70 Spek

es wahrscheinlich, dal] eine Lipoidfgrbung vorliegen miisse. Ira Spektrum der blal]blauen Gewebe war jeweils fiberhaupt n u r e ine gut ausgepr~gte Bande zu sehen, und zwar die des fluoreszenzerregenden Lichtes.

Auch dieser Be�9 beweist nach dem Gesagten noch nicht mit Sicherheit, dal] es sieh um eine Lipoidf~trbung handelt. Um dies mit Sicherheit entscheiden zu k6nnen, miissen wir uns erst durch die Dunkelfeldkontrolle eine Vorstellung von der absoluten St~trke der Fluoreszenz verscha�9239 Erst auf diesem Wege k6nnen wir die M6gliehkeit ausschalten, da6 es sich um eine sehr blasse Eiweil]- f~trbung handelt.

Das Resultat der Dunkelfeldkontrolle ist iiberwgltigend. Trotz ihrer schwaehen F~rbung bieten die Objekte ein pr~chtiges Bild dar: Alles, was gefgrbt ist, erstrahlt in siegellaekrotem Licht, das sehr intensiv ist, vielfach dem Fluoreszenzlicht der reinen Phosphatide nieht nachsteht und den gleichen Farb ton hat. Einzigartig sch8n ist das rote Fluoreszenzlicht bel den M a r k - s e h e i d e n des N e r v u s i s c h i a d i c u s des F r o s c h e s (vgl. Fig. 1, Taf. I). Die Achsenzylinder erscheinen viel dunkler, ob sic aueh rot leuehten, blieb unsicher, da man ja dureh die sehr s tark �9 Markseheiden durch- sehen mule. Ara sch6nsten sind die Pr~parate der Nervenfase~n ira Dunkelfeld, wenn dos Deckglas vorsichtig ein wenig angedrfickt wird, so dal] die st6rende Reflexion von weil]em Licht an den vielen Oberfl~chen verschwindet oder zuriiek- gedr~ngt wird. Sonst ist es im allgemeinen d a s k l a r e H y a l o p l a s m a , welehes - - bei nieht irgendwie spezifisch differenzierten Zellen - - gleichm~t6ig im ganzen KSrper rot erstrahlt. Dies gilt z .B. ffir die Epithelzellen der Speicheldriisen von C h i r o n o m u s , aus denen unter dem Deekglas hgufig klare rotleuchtende Hyaloplasmapapillen basalw~rts austreten, ffir s~mtliche Zellelemente junger Ov` von Blattaamericana, fiir junge Oocyten von S i i l ] w a s s e r f i s c h e n , fiir Muskelzellen vom Frosch, von Blatta ay und Mstacus flut, iatili.s. Bei den Cytophoren der Samenzellen des Regenwurms ist die rote Strahlung auf eine diinne Schicht u n t e r der Membran besch~~nkt, w~hrend die iibrigen Regionen schwarz sind. In den Kernen der genannten Ovarialeier und Epithel- zellen leuehtet der Kernsaft gar nicht. Bel isolierten Kernbl~tschen kleiner Ovarial- eier des ~rosehes zeigten Kernsaft und Kernmembran auch naeh l~ngerem Liegen in der Farbl6sung iiberhaupt kein rotes Leuchten, Nucleolen zeigten dagegen eine schwaehe rote Strahlung. Das einzige Objekt mit hellrot leuch- tenden Kernen, welches ieh bisher vorgefunden habe, waren die roten Blut- k6rperchen des Frosches (vgl. Fig. 2, Taf. I). Das Plasma der roten Blutk5rpereheu zeigt ein schSnes dunkelrotes Leuchten~), welches betr~ehtlich schw~eher ist als etwa das der Nervenfasern des Frosehes. Ich mSchte aber aus der relativ schwaehen Leuehtkra�9 des Plasmas der roten Blutk8rperchen des Frosches nieht schlie6en, dal] sie viel geriJ~gere Mengen von Phosphatiden enttmlten miissen, denn schon sehr geringe Mengen von Leeithin oder gar Kephalin, welches

~) Es sei erwghnt, dal~ die roten Blutk6rperchen alter Fr6sche, welche schon einige Zeit in Gefangenschaft gehalten worden waren, gegen Irisblau ziemlich empfindlich waren. Blutzellen junger, kleiner Tiere liel~en sich dagegen stets sch6n anfgrben und hielten sich ira Eisschrank einige Tage.


in Erythrocyten auch vorkommt, kSnnen in einer w~6rigen LSsung von Irisblau viel intensivere Leuchteffekte erzeugen. Es ist vielmehr anzunehmen, da6 diese Lipoide in den ]~roscherythrocyten mit hydrophilen Substanzen in intimer Weise gekoppelt, und dadurch ihre lipophilen Gruppen teilweise blockiert sind.

Ira Dunkelfeld wei6 leuchtende Strukturen, Granulen, TrS10fchen oder Fibrillen stSren den Fluoreszenzeffekt erheblich. Die ira Dunkelfeld ungetriibt erscheinenden Muskelzellen von Arthropoden zeigen ihn vielleicht deswegen auffgllig schSn (wenn auch nieht so stark wie die Nerven des Frosches). Auf Grund dieses Befundes machte ich, als ich zu Beginn meiner Versuche die Ur- sachen der variierenden Intensit~t des roten Leuchtens noch nicht ganz fibersah, auch einige Kontrollen mit organischen Substanzen, die ira Muskel standig vorkommen. Es ergab sieh, dal3 Kreatin, Inosin (untersucht wurde ein Ba- Inosat) und Adenylsi~ure in w~I3riger LSsung die Fluoreszenz von Irisblau nicht zu steigern vermSgen. Adenyls~ture verh~lt sich so, wie andere saure Substanzen. Sie �9 den Farbstoff in die Farbsi~ure iiber.

Auch in Cholin l~13t sich eine starke Fluoreszenz des Farbstoffes nur erreichen, wenn man ihn in der wasserfreien oder nur wenig Wasser enthaltenden Substanz 15st. Verwendet wurde zu den Versuchen das Cholinchlorid. L~~t man die Kristallmasse von Cholinehlorid soviel Wasser au�9 bis sie zerfliel~t, dann kann man darin eingetupftes Farbpulver durch Erw~rmen auf- 15sen. Die blaue LSsung fluoresziert stark. Setzt man nun aber Wasser hinzu, so erfolgt der starken Hydrophilie des Cholins entsprechend (vgl. S. 61) sofort ein fast vSlliges ErlSschen der Fluoreszenz. In den Geweben kann mit konzen- tr ierten LSsungen von Cholin nicht gerechnet werden, und bel diesen roui3 auBer- dem noch beachtet werden, daB sie sich in der K~tlte auch durch zugesetztes Farbpulver nieht anf~rben lassen. Das Farbpulver bleibt darin ungel5st liegen. - - Auch die sehwache Fluoreszenz von Irisblau in Milchsi~ure li~I3t sieh nur in konzentrierter Milchs~ure beobaehten. In verdiinnter Milchs~ure flockt der Farb- stoff aus.

Den leicht fs Objekten stehen solche gegentiber, in denen auch bei langem Verweilen in den IrisblaulSsungen keinerlei An�9 auftritt . Hierzu gehSren viele Protozoen (z. B. Amoeba 19roteus und Paramaecium) und braune Hydren. Aus der Niehtf~trbbarkeit darf man keineswegs gleich auf ein Fehlen von Phosphatiden scbliel3en. Der Fluoreszenze�9 t r i t t ja nur ein, wenn der Farbstoff an die lipol0hilen Gruppen der Phosphatide herankommt. Hieran kann er gehindert werden 1. durch eine undurchli~ssige Membran, 2. dureh eine Umhiillung der 1)hosphatide im Protoplasma mit nicht�9 Eiweil]- kSrpern oder evtl. Cholesterin. Die erste MSgliehkeit kann durch Injektion des Farbstoffes ausgeschaltet werden, bezfigl, der zweiten m5chte ich zun~ehst nur auf einige Erfahrungen mit Rose bengale, die auf S. 83 besehrieben werden, hinweisen. Die F~lle, in denen Irisblau gar keine Lipoidreaktion gibt, scheinen mit, sofern nicht Undurchli~ssigkeit der iiuBeren Grenzfls der Zellen daran sehuld ist, besonders beachtenswert, weil sie auf die wichtige Frage der Beziehung zwischen Lipoiden und Eiweil~kS�9 hinfiihren.

72 Spek

Rotleuthtendt Mtmbranen in nichtleuchtenden ZellkSrpern wurden nirgend beobachtet.

Eine F~rbung, welehe n i c h t den ™ Lipoidt eharakteristischen bla$- griinlichblauen, sondern rotviolttten Harbton hatte, und bti der im Dunktlfeld k e i n t rote (und auch keine griine) Fluoreszenz zu erkennen war, habe ich bisher nur in einem einzigen Hall btobachttt, und zwar bei C o l p i d i t n , dit schon ttwas abgerundet, also nicht mthr ganz intakt waren und nur noch schwachen Cilien- sehlag ztigten. Raschbewegliche normale Tiere wtrden wie Paramaeeien vom Irisblau nicht angef~rbt, so dal3 ich eine einwandfreit v i t a l e Anf~rbung von EiwtiSkSrptrn durch Irisblau bisher fiberhaupt noch nieht vorgefunden habe. Solltt sieh an Hand eines grSSeren Beobachtungsmaterials, als es mir bis jetzt zur Verffigung steht, aussagen lassen, dag in intakten l t b e n d e n Zellen eine An�9 von EiweiSkSrpern dureh Irisblau gar nieht erfolgt, dann wiirde sich dit Diagnose auf Lipoide btim Irisblau noeh weiter vereinfaehen.

Durch die so leieht ausfiihrbaren spezifischen Anfs bestimmttr Gruppen von Lipoidtn wtrden zahlreiche wichtige eytologischt Hroblemt von einer neuen Stite angreifbar, so etwa die Frage, welche Rolle den Lipoiden beim Aufbau und der Funktion bestimmttr Zellorgant wie des Golgiapparates und der Mitochondrien zukommt, wie sieh dit Lipoide bei Differenzitrungsvorg~ngtn verhalttn, bel dtnen fine gtsttzm~i~igt Sondtrung der verschitdenen Zt]l- kompontnttn trfolgt (wit etwa bel dtr bipolaren Di�9 der Eiztllen), odtr ob bel der experimtnttllen Trtnnung von Hrotoplasmakomponenttn durch starke Zentrifugierung etwa Komponenten, welehe fih. dit ~)tterminations- vorgKnge von spezifisehtr Bedtutung sind, oder in andertn F~llen solehe, wt]che eint Btzithung zu Zellfermenttn haben, bestimmtt Lipoide enthalten. Auf Vtrsuehe mit solchen sptzielltn Hragestellungtn mSchte ieh hier in diesem trsten Bericht, auch soweit sit sehon zu interessanten Ergebnissen gefiihrt haben, noch nicht genauer eingehen.

Wir wtrdtn sthen, dal3 Lipoidfi~rbungtn mit anderen Farbstoffen uns mtthodiseh noch einen Schritt weiterfiihren, und da$ bel ihnen gewisse schwache Seiten der Irisblauf~rbung gar nieht existitren. Bei all diesen Fi~rbungen mus man nur btherzigen, da$ sit nieht ehemische Reaktionen auf bestimmte Lipoide sind, sondern dag es sieh um physikalische Vtrsuche handelt, die von bestimmten ,,Versuchsbedingungen" abhi~ngig sind. Das bringt Nachteile mit sich, biete~ aber andtrerseits vitllticht doch auch Vorteile, sobald man die ,,Vtrsuchs- bedingungen" allm~hlich analysieren lernt.

Ich gehe nun zur Btschreibung der Vtrsuche mit ~ilblausulfat B fiber. Einiges wurde fiber den ~arbstoff schon auf S. 49 gesagt. ~n bezug auf die ~ndtrung der Fluoreszenz in den verschiedtnen LSsungsmitttln zeigt der Farbstoff prinzil)iell gleiche Vtrh~ltnisse wie Irisbtau. Da aber dit Dingt bel Nilblau- sulfat B in quantitativer Hinsicht etwas anders liegen, und die ~ilblau- verbindungen b a s i s c h t ~arbstof�9 sind, bitten sie doch manche wertvolle Ergi~nzungen zu den Bt�9 an Irisblau.


Auch Nilblau ist š Oxazin�9 Nilblausulfat B bat die Formel:

so.H

/o~~~/~~_�9 o t N \ /

~ ~ - - N I ~ �9 C 7 H 7

Nilblausulfat A unterscheidet sich von B dadurch, dag bei ihm die rechts ein- getragene NH2-Gruppe nicht substituiert ist. Bei Nilblausulfat B schli~gt der Farbton bel P i = 7,2 von Blau in ein helles Rot um, bei Nilblausulfat A erst bel einem riel hSheren Pli. Die Farbbase ist bel beiden Farbstoffen rot. Bel Nilblausulfat B liegen die zwei Banden, welcbe der Farbstoff aufweist, bei 656 m# (Bande 1) und bei 600 m# (Bande 2). Die obere Bande (Bande 1) ist die Bande des �9 Lichtes, die untere die Bande des dissoziierten ~arb- salzes. Bande 2 liegt nur bei sehr verdiinnten LSsungen bel 600 m#. In konzen- tr ierteren L5sungen verschiebt sich ihr Maximum so, wie bel andern metachro- matischen Oxazin�9239239 etwas naeh unten. Das kommt daher, daB die Bande 2 in sehr verdiinnten L6sungen relativ stark fiberschnitten wird "con den randlichen Zonen des fluoreszenzerregenden Lichtes. (Die Fluoreszenz ist ja bel s tarker Verditnnung relativ stark.) Bel h6heren Konzentrationen enthi~lt die L6sung immer mehr rote Farbstoffmolekiile, deren Absorption dann die Bande 2 von Gri in her immer sts iiberschneidet. In tiefhimmelblauen LSsungen liegt Bande 2 sehon bei 585 m#.

DaG Bande 1 die Bande des fluoreszenzerregenden Lichtes ist, ergibt sich wieder eindeutig aus der Bestrahlung der FarblSsung mit monochromatischem Licht. Zwischen 650 und 660 rote leuchtet ein besonders intensives dunkelrotes Fluoreszenzlicht auf, welehes nach beiden Seiten allmithlieh abklingt. Ira lang- welligen Rot erlischt es schon bei 690--700 m# vSllig. ])as Maximum des aus- gestrahlten Fluoreszenzlichtes wurde mit dem Spektroskop von Loewe-Schumm bei einer alkoholischen LSsung bei 663 m# gefunden. Der Wellenl~ngenbereieh schliegt sich also nach dem li~ngerwelligen Ende unmittelbar an den des �9 zenzerregenden Lichtes an.

Der Fluoreszenzkegel der w~Grigen LSsung ist ~tuGerst sehwach (Nephelo- meterlampe). In der L6sung in absolutem Alkohol oder in BergamottS1 (altes fast �9 ™ erscheint dagegen ein prachtvoller roter Streulichtkegel, der ~ber �9 die Intensit~tt des Fluoreszenzlichtes von Irisblau nicht erreicht. Die Unterschiede der Fluoreszenz in Wasser und in wasserfreien L6sungsmitteln folgen den gleichen Gesetzm~gigkeiten wie bei Irisblau. Dementsprechend ist in den wasserfreien Medien die Bande 1 sehr dunkel und breit, und auch die weitere Umgebung dieses Spektralbezirkes ziemlich verdunkelt, die Farbsalz- bande dagegen so sehwach, dafi sie kaum noch als Bande in Erscheinung tr i t t . Sic sieht �9 nur noch wie ein schwacher Ausli~ufer der Absorption in der Zone der Fluoreszenzerregung aus. Umgekehrt ist in einer w~grigen LSsung schon bel einer Konzentration, bel der bei einer Schichtdicke mikroskopischer Objekte

74 Spek

nur ein ganz blaBblauer Farb ton zu sehen ist, das St8rkenverhgltnis der Banden s c h o n v S l l i g z u g u n s t e n v o n B a n d e 2 v e r s c h o b e n . B a n d e 2 t r i t t bei diesen waBrigen LSsungen in ganz auffSlliger Weise hervor. Sie reicht bei einer SchichthShe von 1 cm etwa von 580--615 m/~. Dagegen sieht Bande 1 nur wie eine schwache dunklere Linie aus, die von etwa 650 (655)--670 m/~ geht. Auch bei Nilblausulfat wird bei sehr starker Verdiinnung Bande 2 schlieBlieh schwacher als die Bande des �9 Lichtes. Da a b e r d ie a b s o l u t e S t a r k e de r F l u o r e s z e n z ( u n d d a m i t a u e h de r B a n d e l ) be i N i l b l a u s u l f a t w e s e n t l i e h g e r i n g e r i s t a l s be i I r i s b l a u , l i e g t d ie G r e n z k o n z e n t r a t i o n , v o n de r a b be i w a B r i g e n L S s u n g e n d ie F a r b - s a l z b a n d e s t a r k e r w i r d , be i N i l b l a u r i e l t i e f e r . Da sieh bel Vital- �9 mit Nilblausulfat meist eine fast beliebig starke Anfarbung der Objekte erzielen und damit auch ohne weiteres eine Konzentrat ion erreichen laBt, die liber der Grenzkonzentration liegt, ist auch das Rezept �9 die spektroskopische Diagnose bel Nilblansulfat B-Farbungen i~uBerst ein�9 Is t bei einer Farbung oberhalb der Grenzkonzentration die Farbsalzbande (Bande 2) kri~ftig und Bande 1 schwach oder gar nicht zu sehen, so muB der Farbstof �9 im Protoplasma von Wasser umgeben an hydrophilen Gruppen oder Substanzen sitzen, ist dagegen im Spektrum eine dunkle breite Bande des fluoreszenzerregenden Liehtes (Bande 1) zu sehen und Bande 2 nur andeutungsweise erkennbar, so muB der Farbstoff in einem wasserfreien Medium gelSst oder einer wasser�9 hydrophoben (lipophilen) Gruppe angelagert, bzw. eingelagert sein. Die oben definierte Grenzkonzentration laBt sieh durch einen kolorimetrischen Vergleich mit einer spektroskopisch geprfiften Konzentrationsreihe wi~Briger LSsungen leicht ermitteln. Praktiseh ]iegen alle Vitalfarbungen der fibliehen Starke iiber ihr. Ganz blasse Fgrbungen pflegt man ja, wenn es nicht aus besonderen Griinden sein muB, ohnehin nicht zu verwenden.

In welche hydrophoben Substanzen oder Gruppen sich der Farbstoff einlagern kann, ergibt wieder eine Reihe von Modellversuchen: R e i n e s Cho- l e s t e r i n und N e u t r a l f e t t (Schweinefett, Glyzerinstearat) farben sich mit dem Farbsalz nieht an. I m N e u t r a l f e t t ist aber, wie schon friiher bekannt war, die LSslichkeit der roten Farbbase sehr grol~. Das Fet t entzieht daher der w~6rigen FarblSsung, auch wenn es sieh um eine blaue FarblSsung in destilliertem Wasser handelt, Farbbase und �9 sieh rosa, ohne daf~ dies eine alkalische Reaktion anzeigt. Ranziges, saurehaltiges Fet t nnd pflanzliche 0 l e , die ja wohl immer etwas Saure enthalten, z .B . Bergamott61, farben sich im Farbton des Farbsalzes an. Sie zeigen dann vor der Nephelometerlampe, wie schon erwi~hnt wurde, starke rote Fluoreszenz und eine starke erste Bande, wahrend die zweite kaum erkennbar ist. P h o s p h a t i d e �9 sich selbst in Farbl6sungen, die r iel Farbbase enthalten, leieht und s tark mit dem b l a u e n F a r b s a l z an.

Auch die LSslichkeit von Nilblausulfat ist also in den Phosphatiden eine andere als in rein lipophilen Substanzen. Das Farbsalz ist in ihnen riel stiirker 15slich als in den rein lipophilen Substanzen. Eine spezifisehe hohe LSslichkeit der Farbbase gilt fiir die Phosphatide nieht. Aueh bei diesen Versuchen wurden in Kontrollen etwaige Spuren von Fettsi~uren durch Behandlung mit Ammoniak- dampfen entfernt. Die LSslichkeitsverhaltnisse wurden dadurch nicht verandert.


Dit angef/s Phosphat id t zeigtn t in Spektrum wie in absolutem Alkohol oder 01en mit sehr verst/s Bande des fluoreszenzerregenden Lichtes (Bande 1) und sehr schwaeher Bande 2. Di t Mytlinbildung erfolgt in der LSsung des basischen Farbstoffes in anderer Form als beim Irisblau. Gltich nach dem Bonetzen dos Phosphatids mit dor FarblSsung 15sen sich Myriaden bert i ts angef/s TrSpfchtn aus der Oberfl/s des Lipoids heraus und erffillen di t ganze LSsung. Alle dieso Kiigelchen leuchten ira Dunkelfeld sehSn rot. Lange Myelin- sehl/~uehe bilden sich nirgends. Nur ira Lebtrphosphat id tn ts tanden aueh oinzelne grSl~ert Kugeln, die zun/~chst aueh rot leuchteten. Bald abt r wird die Anf/~rbung des Lipoids so intensiv, dal~ die blaue Farbe ira Dunkelfeld das rote Strtulicht vSllig iiberdtckt. Vom Irisblau unterscheidet sich das Nilblausulfat B dadureh, dal~ das rote Streulicht d t r gequollenen Phosphatide zwei�9 wesentlich sehw/s istl), und da$ ihre Anf/s alsbald riel intensiver wird, als sie ira Ir isblau jemals werdtn kann. Diese Umst/s aber maehen die Dunkelfeld- kontrolle, die b t im Irisblau so eindrucksvoll ist, beim Nilblau in don meisten F/~llen unm5glich odtr problematisch. Die leichtt spektroskopischt Diagnose maeht sit ja aber bei di tsem Farbstoff auch iiberfliissig.

C e r e b r o s i d e f/s sich im Nilblausulfat B sowohl ira nichtgequollenen (wohl noeh wasserfreitn), als aueh in dem durch Erw/~rmen in Wasser s tark hydratisierten Zustand an. Die niehtgequollenen KSrnchen sind fiir ein Ent- werfen von Spektren wonig geeignet. Es war an ihnen aber immerhin zu orkennen, dal~ sie sowohl eine starke Bande 1, als auch eine gut ausgepr/igto Farbsalzbande besitzen. Der Farbstoff mu$ also aueh schon an ihnen z. T. an hydratisierbaren Gruppen sitzen. Naeh der starken Hydratisierung durch Erw/~rmen dos Tropfons zeigen sie nach Anf/~rbung so wio im Irisblau t in reines Wasserspektrum mit s tarker Farbsalzbando und sehwacher B~nde 1.

Der leiehton An�9 der Phosphatide einerseits und dot guton Adsorbierbarkeit an EiweiI~kSrpern andererseits entspreehend kommt bol Vital- f/irbungen mit Nilblausulfat B je nach dem Objekt beides vor, sowohl Lipoid- f/~rbungen als auch Eiweii~f/s Bei manchon lipoidreichen Objekten, wie Nervenfasern oder jungen Oocyten vom Frosch, geht dot Farbstoff sohr rasch und quant i ta t iv in die Lipoide hinein und f/s sit griinlichblau. Das Spektrum zeigt dann eine starke Bande des fluortszenzerregenden Lichtes und eine ganz sehwache Farbsalzbande. Nach dom Gesagten rouit es sich bei den Lipoiden um Phosphatido handeln. Bei den klare Sptktren gebendon kleinen Ooeyten des Frosehes lag die dunkle l. Bande bei 645--670 m/~, dio 2. bei 580--600 m/~. Die rote Fluoroszenz t r i t t bel den Nilblauf/~rbungen nur lokal an relativ schwach gef~trbten Stellen hervor und ist jeweils viel sehw/~cher als die der Iris- blauf/~rbungen.

Mit Nilblausulfat B angof/~rbte saure EiweiBkSrper zeigen bei st/s Anf/~rbung einen Stich in Violott, woil di t Farbsalzbande immer mehr auf Griin iibergreift.

1) In wasserfreiem Lecithin z› auch Nilblausulfat starke rote Fluoreszenz. Erst bel der Hydratation wird sie betr/~chtlich schw/~cher. Der Farbstoff bleibt aber noch an der lipophilen Gruppe. Er tritt nicht in Wasser iiber.

76 Spek

N i l b l a u s u l f a t A hat vor Nilblausulfat B keine Vorzfige. Seine Fluoreszenz ist in w/issrigen LSsungen etwas st/irker. Das erschwert wie bei Irisblau die spektroskopische Unterseheidung, da man bei LSsungen in einem w/iSrigen Medium mit der Konzentration hSher hinaufgehen muS, um ein Uberwiegen der Farbsalzbande iiber die Bande des fluoreszenzerregenden Lichtes zu erzielen. Bei einer Farbst/irke, bel der in ~ilblausulfat B die e�9 Bande neben einer sehr kr/iftigen Farbsalzbande nur andeutungsweise zu sehen ist, sind bei ~qilblau- sulfat A die /ihnlieh gelegenen Banden noch fast gleieh stark. Andererseits ist aueh bel Nilblausulfat A die Fluoreszenzsteigerung in den Phosphatiden nieht so stark, dal3 sie wie bei Irisblau im Dunkelfeld unter allen Umst/inden ein starkes rotes Leuchten erzeugen wiirde. Im Modellversuch ist ein kr/iftiges rotes Streu- lieht nur bei blasser Anf/irbung und m/iSiger Hydrata t ion des Phosphatids zu sehen.

SehlieBlieh sei noeh erw/ihnt, daB aueh die Fluoreszenz des Oxazinfarb- stoffes C a p r i b l a u in Phosphatiden eine deutliche Steigerung erf/ihrt. In Wasser fluoresziert Capriblau nur sehr schwaeh. Gegenfiber den bisher besprochenen Farbstoffen bietet es keine Vorteile, sodaS man es wohl nur in F/illen verwenden wird, in denen jene aus irgendeinem Grunde versagen.

DaS es bei Nilblausulfat mSglich ist, au�9 Grund des Spektrums der damit vitalgef/irbten Zelle auszusagen, ob das Farbsalz des Farbstoffes in einem Lipoid oder in einem Eiweil~kSrper sitzt, ist deswegen von doppelter Bedelltung, weil Nilblausulfat B ein fiir cytologisehe Zweeke (wenigstens in vielen F/illen) gut brauchbarer pH-Indikator ist. Fiir die Probleme der Reaktion des lebenden 1)rotoplasmas ist es vielfaeh von groSer Bedeutung zu wissen, ob bestimmte Farbumschl/ige in einer lipophilen 1)hase oder bel Gegenwart von Wasser er- �9 Um dies mit unseren Methoden bel Nilb]ausulfat B nicht nur bei einer blauen l~/irbung, sondern auch bei allen anderen FarbtSnen entscheiden zu kSnnen, miiSte man allerdings aueh noch wissen, wo jeweils aueh die Farbbase sitzt, ob in einer lipophilen Substanz bzw. Gruppe oder in bzw. an einer hydrophilen. Denn mit Nilblausulfat B f/irben sich ja manche Zellen oder Zellbezirke sch6n im Farbton der roten Farbbase oder in violetten Ubergangst6nen an. Bei Nilblau hat aber die Farbbase in lipophilen und hydrophilen Substanzen das gleiche Spektrum. Bei ihr versagt also die spektroskopische Diagnose.

Ob das griingelbe Streulicht der L6sungen von der Nilblaubase Fluoreszenz- oder nur Tyndall-Lieht ist, ist schwer zu entscheiden, da die LSsungen zu einem groSen Teil kolloidal sind und ihre Teilchen auf alle F/ille aueh r iel Lieht ab- beugen. Bel vielen anderœ Oxazinen sind aber die Farbbasen mit Sicherheit fluoreszierend, und so lag die MSgliehkeit auf der Hand, dal~ bel irgendeinem dieser Farbstoffe doch auch die Farbbase in den beiden Gruppen roi1 LSsungs- mitteln ein verschiedenes Spektrum zeigt. Auch wenn - - umgekehrt wiœ bei Nilblausulfat B - - n u r die Farbbase irgendeines dieser Indikatoren zwei differentœ Spektren besitzen wiirde, w/ire dies von hohem Interesse. Gerade gegen einigœ aufi/illige ~/irbungen ira Farbton der Farbbasen gewisser Oxazine wurde ja n/imlieh der Einwand erhoben, daS sie gar nicht durch eine alkalische Reaktion

Eine optische Methode zum l~achweis von Lipoiden in der lebenden Zelle 7 7

verursacht seien, sondern dadurch, dal~ diese Farbbasen auch in andern ,,neu- tralen Lipoiden", so, wie etwa die Nilblaubase in rein ]ipophilen Substanzen eine hohe LSslichkeit hi~tten und daher in hoher Konzentration in sie hinein- gingen, wi~hrend das Farbsalz nicht in sie eintrete. Liil~t sieh nachweisen, dal~ jene Farbbasen in der Zelle gar nieht in einer lipophilen Phase sitzen, dann bricht dieser ganze Einwand zusammen.

Auch bel der Farbbase von Brillantkresylviolett, mit der so sch6ne Vitalfi~rbungen erzielt werden kSnnen, konnte keine Differenz der Sl0ektren in Wasser und Lipoiden festgestellt werden. Bel B�9 hat man zwar den Eindruek, als ob der griine Streuliehtkegel der iluoreszierenden rosa Farbbase in 01 im Dunkel�9 st~rker sel als in Wasser, aber den gleiehen E�9 und zwar noeh sts beobachtet man auch bei Aufsehwemmung der Farbbase in kolloidalen Medien wie Wasserg]as oder Gelatine. In keinem dieser Medien geht die Steigerung des Streulichtes Hand in I-Iand mit einer Versti~rkung der Lande des fluoreszenzerregenden Lichtes (vgl. J. Spek 1940). Wahrscheinlich beruht der subjektive Eindruck blol~ darauf, dal~ die an sich schon ziem]ich grol~en Farbbaseteilchen ira 01 oder den Kolloiden noch von Hfillen umgeben werden und dann dieser GrSl~enzunahme entsprechend eine verst~rkte Reflexion des griinen Fluoreszenzlichtes erfo]gt. ])as Streulicht ist hier gar kein reines Fluoreszenzlicht, sondern z. T. abgebeugtes Licht. --Oie Farbbase von Kresy]- echtviolett fluoresziert nicht.

Nach I/~ngerem Suchen wurde dann sch]ie]~lich ein Farbstoff gehmden, dessen Farbbase in ihrem optischen Verhalten ein vSlliges Gegenstfick zu dem Farbsalz von Ni]blau darstellt, und zwar ist das Eehtneublau, anch Meldolas B]au genannt. Auch dieser Farbstoff ist ein Oxazin. Er bat die Zusammen- setzung :

CI

i /\ (CHs)sN - / \ \ - 0

\ / - - N \ / \

\ / Es ist zu beachten, dal~ die in Handel kommenden Prs oft Chlorzink enthalten. Es sind aber auch ZnC12-freie Prapara te erhaltlich.

Das lVarbsalz von Eehtneublau 15st sich sowohl in Wasser, als auch in Alkohol mit schmutzig-blauvioletter Farbe. Die LSsungen zeigen keine Fluores- zenz und haben die gleichen Banden. I m physiologischen pwBereich schlagt der Farbstoff nicht um. Bei Zusatz 1/10-n NaOH wird die LSsung gelb. Dem- entsprechend h a t d i e w~tI~rige LSsung eine unscharfe Lande in Blau. Sehiittelt man sie nun mit Xylol aus, so geht der ]Varbstoff fast vSllig in das Xylol. t t ierbei geht der Farbton in ein Rotorange iiber und die LSsung in Xylol f~tngt an, or an g e- g e l b zu � 9

Das Fluoreszenzlicht zeigt im Spektroskop griines, gelbes und rotes Licht. Die Lande des fluoreszenzerregenden Lichtes sehliel~t sich gleieh an die Lande

78 Spek

der Farbbase in Wasser an und geht von hier bis Mitre Grfin. Die Bande der Farbbase in Xylol erscheint m. a. W. gegenfiber der in Wasser nach Gifin be- tri~chtlich verbreitert . - - Auch in 01en ist die Farbbase gut 16s]ich und fluoresziert orangegelb. In 01en 16st sich das Farbsalz nicht.

In Schweinefett 15st sich ebenfalls nur die Farbbase. Das Fet t fi~rbt sich in der w~tl3rigen Farbl6sung langsam rot und wird stark fluoreszierend. Cho]esterin bleibt v611ig ungefs Bel den Phosphatiden und Cerebrosiden liegen die LSslichkeitsverh~ltnisse auch bei diesem Farbstoff wesentlich anders als bei den ganz ]ipophilen Substanzen. Alle Phosphatide und Cerebroside f~rbeu sieh im mittleren p~-Bereich in der blauvioletten Farbe des Farbsalzes an, nirgends ist eine elektive Au�9 der Farbbase oder das Auftreten ora~gegr Fluores- zenz zu sehen. Auch wenn man die Tropfen oder Broeken der Modellsubstanzen erst kurz Ammoniakd~mpfen aussetzt, um etwaige Spuren von S~ure zu neutrali- sieren und sie dann vor der l~~trbung erst griindlich ws bleibt das :Resultat das gleiche. Die Myelin bildenden Substanzen nehmen das Farbsalz sehr gierig und in hoher Konzentration auf. Man darf also beim Echtneublau ebenso wie bel Nilblausulfat B von der elektiven LSslichkeit der Farbbase in rein lipophilen Substanzen unter keinen Umst~nden Rfickschliisse auf die Phosphatide und Cerebroside machen. Die Gefahr, daB die in den tierischen Zellen die Haupt- rolle spielenden Lipoide, die Phosphatide, sich in den Oxazinen aus besonderen Griinden und unabh~ngig vom Pli in der Farbe der Farbbasen an- f~rben k6nnten, ist auf Grund falscher Riieksehliisse offensieht]ieh fibersch~ttzt worden.

Um diese Frage weiter zu verfolgen, habe ich auch eine ganze Reihe von Zellen oder Geweben, bei denen schon bekannt war, dal~ sie grolle Mengen von Phosphatiden enthalten, oder bei denen dies die Irisblaureaktion offenbarte, mit Eehtneublau angef~rbt. Wfirde den in ihnen enthaltenen Lil0oiden unter den in den lebenden Zellen herrsehenden Bedingungen die Eigenschaft zukommen,aus den Echtneublaufs elektiv die Farbbase aufzunehmen, dann miiBten sich alle diese Zellen r6tlichgelb fs und orangegelbe Fluoreszenz zeigen. Wfirde die Eigenschaft unter den Bedingungen in der lebenden Zelle auch Lecithin zukommen, dann mfiBte man in Anbetraeht der weiten Ver- breitung von Lecithin bei Vital�9163 mit Eehtneublau ~iberhaupt auf Schritt und Tri t t rStlichgelbe F~rbungen erhalten. In Wirkliehkeit habe ich bisher i i b e r h a u p t n o c h k e i n e g e l b e o d e r r S t l i c h g e l b e F~ t rbung des P r o t o - p l a s m a s be i d e n m i t E e h t n e u b l a u v i t a l g e f ~ t r b t e n Z e l l e n o d e r G e w e b e n v o r g e f u n d e n . Junge Oocyten, Nervenfasern vom Isehiadicus nnd Muskelzellen vom Frosch f~trbten sieh durchweg graublau oder tiefblau 1) an, ebenso Muskeln, 1Yervenfasern und Eischl~uche von Blatta americana. Nirgends

1) Echtneublau hat neben einer schwachen diffusen Absorption in Griin mit Maximum bei 533 mit eine kr~ftige Absorptionsbande am oberen Ende von Grtin mit eine�9 Maximum bel 573 m#. Erfolgt bel einer Adsorption des Farbstoffes oder bei L(isung in einem st~rker lichtbrechenden Me dium eine mehr oder weniger weitgehende Verschiebung der Bande nach Rot, so wird der Farbton immer blauer und fast rein blau, wenn die Bande gerade das ganze Gelb einnimmt.

Eine optische Methode zum Nachweis von Lilooiden in der lebenden Zelle 7 9

war bei ihnen im Dunkelfeld eine orangefarbige Fluoreszenz zu sehen. Anderer- seits ergab sich, da$ sich auch das beriihmte Objekt, bel dem Indikatoren jeder Art (auch Oxazine) so auff/illige An�9 in dem etwa PH ---- 7,8 entsprechenden Farbton ergeben, n/s das animale Protoplasma der bipolar differenzierten T e l e o s t i e r e i e r und die Zellen der Keimscheibe der spiiteren Stadien sich mit Echtneublau b lau f/irben, und auch hier keine Spur einer orangegelben Fluoreszenz zu sehen ist. Die Versuche wurden an Eiern der Regenbogenforelle ausgefiihrt. Auch bei diesem Objekt war der Verdacht ausgesprochen worden, da$ alle die F/~r- bungen mit Oxazinen ira Farbton der Farbbase auf einer vom Pu unabhiingigen elektiven Aufnahme dieser Farbbasen in irgendwelche Lipoide beruhen kSnnten. Dieses Lipoid wiirde dann hSchstwahrscheinlich auch die Echtneublanbase elektiv aufnehmen, was, wie wir sehen, nicht der Fall ist. AuSerdem hat sich auch ergeben, dal3 bel der bipolaren Differenzierung des Fischœ iiberhaupt nur ganz geringe Mengen von Phosphatiden in das animale Plasma hineingehen, und dal3 sie iiberdies -con EiweiSkSrpern umhiillt werdenl), wahrend gerade der Dotterabschnitt , der sich stets im Farbton des Farbsalzes anf/~rbt, an freien Phos- phatiden sehr reich wird. Auch der alte Befund, dal3 auch l i p o i d u n l S s l i c h e saure Indikatoren, wenn man sie in das animale Protoplasma injiziert, in diesem augenblicklich nach der alkalischen Seite umschlagen, hatte eigentlich schon zur Genfige gezeigt, da$ sich der Umschlag nicht in einem Lipoid vollziehen kann. Der Farbton jener Eibezirke kann also, da Metachromasie auch nicht vorliegt, auf nichts anderem als der alkalischen Reaktion bestimmter Plasmasubstanzen beruhen. Da$ Echtneublau in diesen nicht umschl/igt, beruht einfach darauf, da$ sein Umschlagspunkt vie1 zu hoch liegt.

das Tetrajoddichlorfluorescein und erstere h a t d i e Formel:

Wie eingangs erw/ihnt wurde, konnte noeh bei dem Oxyphthalein Rose bengale von G r i i b l e r festgestellt werden, dal~ seine Fluoreszenz von dem je- weiligen LSsungsmittel stark beeinflul3t wird. Die Differenz der Spektren ist sehr erheblich, ihre Ver/inderungen folgen aber dem andersartigen chemisehen Bau des Farbstoifes entsprechend etwas anderen Gesetzm/s

Unter dem Namen Rose bengale, Bengalrosa oder Bengalisch I~osa kommen eine ganze Reihe verwandter Farbstoffe in den Handel. Die bekanntesten sind

das Tetrajodtetrachlorfluorescein. Das

J

I Ko:~ J

o / \ = o c I j I % / - -

Cl- (/\] -- COOK

/ /j__C,

1) Der ausfiihrliche Bericht iiber diese Versuche folgt in einer der n~ichsten Mit- teilungen.

80 Spek

Meist werden die Natr ium- oder die Kaliumsalze dieser sauren Farbstoffe hergestellt. Die Spektren der verschiedenen Rose bengale-Farbstoffe sind ~hnlich, aber nicht iibereinstimmend. In der Literatur werden z. T. sogar fiir Rose bengale- Pr~parate von gleicher Konstitu~ion, die von verschiedenen Fabriken stammen, differente Spektren angegeben. Das a r e Rose bengale-Pr~parat von G r i i b l e r ist mit dem jetzt von H o l l b o r n u. SShne erh~tltlichen Bengalisch Rosa leider nicht identisch. Letzteres bat ein anderes Spektrum und eine andere Farbe. Ffir unsere Versuche ist es nicht verwendbar. Die chemisehe Zusammensetzung des Gr i i b l e r s ehen Farbstoffes konnte ich nach seinem Spektrum naeh den vorliegenden Li teraturdaten bis jetzt nicht ermitteln.

Rose bengale G r i i b l e r hat zwei Banden, von denen in der w~t6rigen LSsung die eine ihr Maximum bei 548 in#, die zweite bei 516 m# hat. Die erste Bande ist in Wasser sehr schwach, die zweite r iel stgrker und sehr dunkel. In absolutem Alkohol zeigt dieser Farbstoff ein entsprechendes Spektrnm wie in Wasser, nur sind die Maxima etwas nach Rot verschoben. Das der ersten Bande liegt bei 552 m/~, das der zweiten etwa bei 523 m/t. Auch hier ist Bande 1 sehr blair, Bande 2 sehr kr~ftig.

Der Farbstoff fluoresziert griin, und b e i d e B a n d e n s ind a l s B a n d e n des f l u o r e s z e n z e r r e g e n d e n L i c h t e s zu b e z e i c h n e n . Ihr St~rkever- h•ltnis bleibt dementsprechend im gleichen LSsungsmittel bei allen I™ trat ionen des Farbstofles das gleiche, es sel denn, dag in ganz hohen Xonzen- trationen, die biologisch nicht mehr in Frage kommen, in ganz Griin vSllige AuslSschung erfolgt. Die bei andern Farbstoffen zu beachtenden Kompli- kationen, die dadureh entstehen, daB fiir sehr verdiinnte LSsungen ein anderes Stgrkeverhgltnis der Banden vorliegt, fallen bei Rose bengale G r f i b l e r voll- stgndig fort. - - Man kann sich durch einen einfachen, aber sehr eindrucksvollen Versuch davon fiberzeugen, dag beide Absorptionsbanden unseres Rose bengale von einem Absorptionsph~nomen herriihren miissen, welches nicht dem L a m b e r t - Beerschen Gesetz folgt: Sehr verdiinnte LSsungen des Farbstoffes sind rosa, etwas konzentriertere sind mehr erdbeerrot. In einer L6sung der ~)bergangsfarbe sind die Banden bei geringer Schichtdicke aufs beste zu erkennen, d. h. sie sind f/ir die spektroskopische Betrachtung nicht zu schwach und nicht Zu stark. Verdiinnt man aber jetzt die LSsung auf das f~nffache Volum mit Wasser und entwirft vom jetzigen Gesamtvolum der FarblSsung bei gleiehbleibendem Durch- messer der Cylinderkfivette ein Spektrum, so erweisen sich jetzt beide Banden augerordentlich v e r st ~ rk t . Die Erkl~rung da�9 ist sehr einfach: Die Fluores- zenz des Farbstoffes n immt ira Sinne der Xonzentrationsregel gerade in diesem Konzentrationsbereich bel Verdiinnung augerordentlich zu (Kontrolle Fluores- zenzkegel vor Nephelometerlampe!) nnd dementsprechend wird aueh die Ab- sorption 'des �9 Lichtes st~rker.

Bei Betrachtung einer alkoholisehen FarblSsung in monochromatischem Licht leuchtet in der Gegend um 525 m# der st~trkste grfine Streulichtkegel auf. Dies ist der Spektralbezirk der starken zweiten Bande von Rose bengale Gr/ i b 1 e r , deren Maximum wir bei 523 m# fanden. (Die subjektive Ermit t lung der Maxima im Monoehromatorversueh hat nicht die Genanigkeit von einzelnen m/~. Unter-

Eine optische Methode zum Nachweis von Lipoiden in der lebenden Zellœ 81

schiede kann man meist erst bel einer Verschiebung der Wellenlange um etwa 5 m/t erkennen.) Eine Verst•rkung des Streulichtkegels in dem Bezirk der blassen ersten Bande konnte nicht mit Sieherheit erkannt werden. Dazu ist die Verst~rkung der Erregung hier zu schwach.

Der gesetzmagige Einflug des L6sungsmittels auf die Fluoreszenz des Rose bengale Gr f i b l e r besteht nun darin, dag in m a n c h e n L 6 s u n g s m i t t e l n d ie e r s t e , in a n d e r n d ie z w œ B a n d e seh r v e r s t / ~ r k t e r s c h e i n t , w/~hrend j e w e i l s d i e a n d e r e g a n z s c h w a c h ist . Die spektroskopische Analyse ist bei diesem Farbstoff so einfach und nnkompliziœ dal3 sie sich in zwei Minuten ausfiihren lagt. Es braueht nur noeh gekl•rt zu werden, wieweit die verstarkte Fluoreszenzerregung ira einen oder andern Spektralbezirk im biologischen Experiment fiir bestimmte Stoffgruppen ausreichend spezifisch ist. Dazu wurden wieder Serien von M o d e l l v e r s u e h e n ausgefiihrt.

In X y l o l und pflanzlichen ~ l e n bleibt wenigstens der grSl~te Teil von eingestrœ Farbpulvœ ungel6st liegen. Das L6sungsmittel bleibt ungef~rbt. Dies beruht aber nieht blog auf der Sehwerl6sliehkeit des Farbsalzes in dem betr. LSsungsmittel, sondern z. T. aueh auf der Entstehung einer farblosen Farbsiture. l~bersehichtet man eine verdiinnte w/tgrige FarblSsung mit Xylol und schiittelt sie, so entfarbt sich die FarblSsung sehr rasch. Wahrscheinlich ist diœ farblose Farbss wie bei andern verwandten ]~arbstoffen in Xylol leicht 15slich, und es wird zuerst di• der w/~l~rigen LSsung entzogen und vom Fa rbsg]z nachgeliefert, bis die ganze LSsung entfgrbt ist. Ira entsprechenden Versuch mit Ol ivenS1 erfolgt zuerst blasse Rosafgrbung des {)les und dann allm~hliche Entf~rbung. Die F~rbung des ~)les war zu schwach zur Entwer�9 eines Spektrums. (MSglicherweise beruhte die F~trbung auf der zweiten, rStlich gef~rbten Farbsaure. Vgl. hierzu aueh S. 82.)

C h o l e s t e r i n und S c h w e � 8 fgrben sich nieht an. Aus allem ergibt sich, daB rein lipophile L6sungsmittel von Rose bengale

Gr iib le r nicht angef~rbt werden, und dal? auch bel den etwas S~ure entlmltenden 01en keine sich l~tngere Zeit haltende oder in mikroskopischen Schichtdicken erkennbare Anf~rbung erfolgt. Alle diese Substanzen scheiden also fur eine Reaktion aus.

Bel den P h o s p h ~ t i d e n mit ihren lipophilen d- hydrophilen Gruppen ist auch bel diesem Farbstoff die LSslichkeit eine ganz andere als in den rein lipophilen. Alle Phosphatide f~rben sich mit unserem Rose bengale leicht und stark an. Bei der Aufqueltung der Substanzen in der FarblSsung werden aile M y e l i n s e h l ~ u e h e s a t t r o s a angefgrbt, und in allen F~llen erseheint dann e in S p œ w e l e h e s das u m g e k e h r t e S t /~ rkeverh /~ l tn i s dœ B a n d e n z e i g t , wie das der w/~Brigen t~arbl6sung: Die e r s t e B a n d e is t sehr d u n k e l , d ie z w œ ganz s e h w a e h . Aueh die ungequollenen Spingo- myœ fgrben sieh Ieieht tiefrosa und geben ohne alle Komplikation seharfbandige Spektren. Die erste Bande liegt (im Sinne der K u n d t s e h e n l~egel naeh P~ot versehoben) bel 562--578 m~ und ist sehr stark, die zweite bei 520 mff und ist sehr sehwaeh. Enthalten die PhosphatidlJr/~10arate etwas S5.ure, so wird diese aus den oberfl~chliehen Schiehten von der ws l%rbl6sung

Protoplasma. XXXVII 6

82 Spek

herausgewasehen und stSrt die Anf~rbung hier nicht. Diese Zonen zeigen stets das Lipoidspektrum und einen sattrosa Farbton. Im Zentrum eines grSl~eren s~urehaltigen Tropfens erfolgt dagegen nur eine blasse Anf~rbung, vielleicht diffundiert der Farbstoff nur ein, ohne in dieser Zone in die Lipoidteilchen ein- zutreten. Diese Regionen zeigen ein Spektrum wie in Wasser.

Dal3 Rose bengale Gr f i b l e r in Substanzen wie absolutem Athylalkohol nicht ein Spektrum wie in den Phosphatiden zeigt, sondern ein solehes wie in Wasser, lehrt, daB bel diesem Farbstoff nicht sehon die Abwesenheit von Wasser an sieh zut Entstehung eines Spektrums wie in den Lipoiden ffihrt. Wahrsehein- lich mul~ es zu einer direkten Anlagerung des Farbstoffes an lipophi]e Gruppen kommen, damit eine Versts der Bande 1 erfolgt, ws andererseits eine Anlagerung an hydrophile Gruppen und eine Anlagerung an Wassermolekfile zu einer Versts der zweiten Bande ffihrt. Im Athylalkohol miil]ten demnaeh die Farbteilehen an die hydrophile OH-Gruppe angelagert sein. Verl~ngert man aber die Kohlenstoffkette, dann wird Bande 1 des ira Alkohol gelSsten l~ose bengale versts und ist bei wasserfreiem O e t y l a l k o h o l schon ein wenig st• als Bande 2. Danaeh w~tre also hier die Anlagerung der Farbsto�9 an hydrophile und lipophile Gruppen ungef~thr gleich. Bei den Phosphatiden wiirde schliel~lich die letztere weitaus fiberwiegen.

Hydratisierte C e r e b r o s i d e zeigten interessanterweise ~hnliche Ver- h~tltnisse wie Oetylalkohol. Aueh bei ihnen war die zweite Bande kr~t�9 die erste dagegen doeh noch etwas st~rker. Die Anf~rbung erfolgte nur sehr langsam, wurde dann aber auch recht intensiv.

Bemerkenswert ist noch, daB sieh Rose bengale Gr f ib l e r als Farbpulver zugesetzt in reinem, durch Au�9 von etwas Wasser zer�9 Cho l in - c h l o r i d in hoher Konzentration 15st~ und dal~ die LSsung eine seh r s t a r k e z w e i t e B a n d e zeigt, w~hrend die e r s t e vS l l ig f eh l t . Da ein Verschwinden der ersten Bande auch zu beobachten ist, wenn man die wš FarblSsung schwach anss diirfte die Ver~nderung im Cholinchlorid aueh auf einer durch hydrolytisehe Spaltung verursachten sauren Reaktion des Pr~parates beruhen. Setzt man der l~ose bengale-L5sung etwas 1/10-n Salzss zu, so wird sie sofort entfš Auch bei Zusatz gr5Berer Mengen verdfinnter Milchs~ure erfolgt noch Entf~h'bung. Fiigt man diese aber vorsiehtig tropfenweise zu, dann erleidet die LSsung eine unauff~llige Farb~tnderung. Sie wird �9 und weist eine Ver~nderung des Spektrums auf, die darin besteht, dal~ Bande I verschwunden ist. Auch bei l~ngerer Beriihrung der FarblSsung mit ungeschfitzten Korken kann die Ver~nderung beobaehtet werden. In sauren Natriumcitrat-Salzs~ure- puffern t r i t t der Farbumsehlag bei PE = 3,0 deutlich in Erscheinung. Das allm~hliehe Verschwinden der Bande 1 ist aber spektroskopisch sehon von Pli 3,8 abw• zu erkennen. Es mul~ sich um eine Vers der Farbmolekiile handeln. In Frage kommt ein Ersatz des Alkali-Ions der Phenolgruppe durch H'.

Angef~rbte E i w e i l ~ k S r p e r zeigen ein Spektrum wie in Wasser. (Versuch sehSn ausffihrbar z. B. mit Gelatine.) Auch in getrockneter, wasserfreier Gelatine zeigt der Farbsto�9 das ,,Wasserspektrum".


Viele Gewebe f~trben sich in Rose bengale G r i i b l e r nach kurzer Zeit tiefrosa und geben dann ein sehSnes klares Spektrum. In allen bisher untersuchten, noch nicht allzu zahlreichen Fi l len erwies es sich als ein typisches Phosphatid- spektrum. Die F~rbung erscheint jeweils eigentfimlich gleichm~l~ig und lfickenlos. Es ist meist das klare Hyaloplasma, welches sich an �9 Tri t t es irgendwo in Form glasiger Bapillen aus dem ZellkSrper hervor, dann erweisen sie sich gefi~rbt, ws die gr5beren Zelleinlagerungen oft ungef~rbt bleiben. SehSn sind solche rosa Papillen an der Basalfl~che von Chironomus-Speicheldriisen zu beobachten. Bei diesem Objekt farben sich auch die /qucleolen der Kerne tiefrosa. (Spektrum noch nicht einwandfrei ermittelt.) - - Manche Objekte wie P a r a m a e c i e n bleiben im Farbstoff ungef~rbt. Werden sie aber durch Deck- glasdruck abget5tet , dann f~rben sie sich an und zeigen das Phosphatidspektrum. Bel den lebenden Tieren muB also eine nicht aus Phosphatiden bestehende Zellmembran oder Hiille, welehe ira Zellinnern die Phosphatidteilchen umgibt und aus einer nichtfi~rbbaren Substanz besteht, die Phosphatide vor einer An- f i rbung bewahren.

In Tabelle 2 ist von einigen vitalgefi~rbten Geweben die Lage der Banden zusammengestellt und ihre Sti~rke verzeichnet.

T a b e l l e 2

Lage der Banden bei mit Rose bengale (Griibler) vitalgefi~rbten Geweben

Banden Speicheldrfisen Ischiadicus Beinmuskeln von Chironomus Rana esculenta J~ana esculenta

sehr kri~ftig sehr kriftig sehr scharfe, dunkle Bande Bande 1 552--572 mit 548--568 m# 540--568 mg

Maximum 562 Maximum 554 Maximum 554

sehr schwach sehr schwach

Bande 2 518--527mg

Maximum 525 Maximum 518

nur andeutungsweise zu sehen

511--522m# Maximum 518

Kurze Zusammenfassung der Hauptergebnisse

I)ie Oxazinfarbstoffe I r i s b l a u , N i l b l a u s u l f a t B und N i l b l a u - s u l f a t A zeigen in wasserffeien organischen L6sungsmitteln eine auBerordentlich starke rote Fluoreszenz, ws ihre ws L6sungen nur ganz schwach fluoreszieren. Die starke Fluoreszenz des Farbstoffes bleibt auch in ws Solen oder G• hochmolekularer Stoffe erhalten, wenn an den Molektilen dieser Stoffe genfigend groBe lipophile Gruppen sitzen, in oder an denen dann der Farbstoff offensichtlich einen von Wasser geschiitzten Platz findet. Bei Gegen- wart von Wasser zeigen von den in l~rage kommenden Zellsubstanzen nur die Phosphatide nach Anfirbung die starke Fluoreszenz. Bel Irisblau ist diese so stark, dal~ angefirbtes Lecithin, Kephalin, Sphingomyelin und ein Leberphos- phatid im Dunkelfeld auch schon bel Beleuchtung mit einer gew5hnlichen Mikro-

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84 Spek

skopierlampe in intensivstem siegellackrotem Lieht erstrahlen. Besondels seh6n ls sich dies an den Myelinformationen dieser Phosphatide demonstrieren. Phosphatidhaltige Zellen oder Zellareale zeigen bel Irisblauf• ira Dunkel- feld das gleiche intensive rote Streulieht. Neutralfette h6herer Fetts/~uren, Cholesterin und Cholesterinester zeigen das Ph~nomen nicht, da sieh in ihnen das Farbsalz von keinem der Farbstoffe 16st. Glyzerinester niederer Fettss zeigen eine ziemlich starke rote Fluoreszenz, fs sich aber mit Irisblau im Farbton der l%rbs~Lure orangegelb an, w~hrend die Phosphatide hellblau gef~trbt sind. Gequollene Cerebrosid~ sind schon zu stark hydratisiett, um die Reaktion zu geben. In SeifenlSsungen zeigt Irisblau nur dann starke Fluoreszenz, wenn sie sehr konzentriert, also wasserarm sind. Bei Verdtinnung erlischt sie augenblicklich. Fettss ftihren obœ des Umschlagspunktes Irisblau in die Farbss iiber, die in roten Krist/tllchen ausfloekt. In verdiinnteren Sguren ist die Fluoreszenz von Irisblau so wie in Wasser. In hydratisielten Eiweig- kSrpern und in LSsungen von Kohlehydraten (aueh sehr konzentrierten) ist die Fluoreszenz sehr schwaeh, oft kaum zu sehen.

Bei Nilblauf/trbungen der Phosphatide t r i t t die gesteigerte Fluoreszenz im Dunkelfeld nicht so auff~llig in Erseheinung, 1/~gt sich aber spektroskopisch noeh leieht naehweisen. Der Fluoreszenzsteigerung entspricht n~mlieh immer eine Verst~rkung der bei den genannten Oxazinen ira siehtbaren Teil des Spektrums liegenden Bande des fluoreszenzerregenden Liehtes. Im Spektrum der angefs Phosphatide ist bei allen Konzentrationen der drei Farbstoffe (aueh bei den hSehsten) die Bande des fluoreszenzerregenden Liehtes sehr stark und die Bande des Farbsalzes sehwach. In Wasser, Eiweigk6rpern, Kohle- hydraten usw. wird von einer Grenzkonzentration an die Farbsalzbande sehr kr~ftig und die Bande des fluoreszenzerregenden Liehtes schwaeh (bei Nilblau- sulfat sehr blag). Bel Vitalfgrbungen mit Nilblausulfat B l~Lgt sieh die hier sehr tief liegende Grenzkonzentration sehr leieht erreiehen, so dag dann das ,,Phosphatid"- und das ,,Wasser-Spektrum" hier leicht zu unterseheiden sind. Bei Irisblaufgrbungen spielt diese Unterscheidung eytologiseh wahrseheinlich keine Rolle, weil naeh den bisherigen Erfahrungen in den lebenden Zellen Eiwei6- kSrper und andere rein hydrophile Substanzen von Irisblau gar nieht angefs werden, und das starke Leuehten im Dunkelfeld sehon die Lipoidf~Lrbungen geniigend kennzeiehnet. In Modœ mit Irisblau waren kr~Lftig angefs EiweigkSrper wegen der in Grtin gelegenen starken Farbsalzbande dureh rotvioletten Farbton ausgezeichnet und sehon dadureh von den blag- blaugef~rbten Phosphatiden leieht zu unterseheiden. - - Die Spektren der vital- gefs Zellen wurden mit dem Mikrospektralphotometer von Engelmann entworfen, dessert Wellenlgngenbereieh von 420 bis 700 m/~ geht.

Die fiir den Zellforseher sehr bemerkenswerten Eigensehaften von Ilisblau werden besehrieben.

Bei E e h t n e u b l a u , einem anderen Oxazin, fluoresziert die Farbbasœ in rein lipophilen Substanzen, in denen sie sieh leieht 16st, orangegelb, w/~hrend sie in Wasser gar nieht fluoresziert. Wenn also in einer Zelle eine lipophile Sub- stanz die Ursaehe einer AnfKrbung im Farbton der Farbbase w~re, so w/~re das


bel diesem Farbstoff leicht nachzuweisen. Das Protoplasma aller bisher untersuehten Zellen f~rbte sieh blau (ira Farbton des Farbsalzes), enthielt a l s o - - abgesehen von F e t t t r S p f e h e n - keine Substanzen, welehe sich elektiv mit der Farbbase anf~rben. - - Phosphatide fgrben sieh im mittleren pn-Bereieh mit Eehtneublau blauviolett. Cholesterin b]eibt ungefs

Bei dem Oxyphthalein Rose bengale Gr i ib le r ist das Spektrum der damit angef~rbten Phosphatide auffgllig versehieden von dem der w~Brigen LSsungen und der F~rbungen rein oder iiberwiegend hydrophiler Substanzen. Aueh hier handelt es sich nm einen spezifisehen EinfluB auf die Fluoreszenz, die aber etwas anderen Gesetzms folgt. Viele Zellen lassen sich mit Rose bengale Gr i ib le r sehSn anf~rben, und ihre mit dem Mikrospektra]photometer ent- worfenen Spektren lassen an Schs nichts zu wtinsehen tibrig.

Bel einer Reihe der untersuehten Farbsto�9 wurde gefunden, daB ihre LSslichkeit in den verschiedenen Haupt typen der Lipoide sehr beachtenswerte Unterschiede aufweist. Diese Befunde werfen ein ganzes Programm zu einer t~evision der Lipoidtheorien auf.

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E r k l g r u n g der T a f e l I

Fig. 1. Dunkelfeldbild der mit �9 vital gefgrbten Nervenfasern des N. ischiadicus -con Rana esculenta.

Fig. 2. Dunkelfeldbild der mit Irisblau vital gef~rbten roten Blutk5rperchen von Rana esculenta.

~ a c h t r a g bei der K o r r e k t u r : ~euerdings hat S. S t r u g g e r (Flora 35, l l l f f . , 1941) eine spezifisehe Fluoreszenz der Zelllipoide im ultravioletten Lieht bel mit Pyronin gefarbten Pflanzenzellen beschrieben. Im Prinzip scheint die Methode daranf zu beruhen, dal~ dnrch ein sehr hohes Pn der FarblOsung (10,5--11,5 !) eine Anf~rbung der Lipoide mit der anders fluoreszierenden Farb- base erzwungen wird. Da tierische Zellen so ein hohes Pli meist nicht vertragen, im mittlš pn-Bereich aber auch Pyronin die Phosphatide als Farb- sa lz anf~trbt, diirfte die Methode bei tierischem Material nicht anwendbar sein.

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Eine optische Methode zum Nachweis von Lipoiden in der lebenden Zelle